JP2002365293A

JP2002365293A - 表面処理層が形成された固体支持体

Info

Publication number: JP2002365293A
Application number: JP2001174865A
Authority: JP
Inventors: Michifumi Nika; 通文丹花; Hiroshi Okamura; 浩岡村; Hironao Okayama; 浩直岡山; Keigo Ebara; 啓吾江原
Original assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Current assignee: Toyo Kohan Co Ltd
Priority date: 2001-06-08
Filing date: 2001-06-08
Publication date: 2002-12-18

Abstract

(57)【要約】【課題】遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生体物質サン
プルが結合していても、スポットが不明瞭で観察しにく
いという問題点を解決すること。【解決手段】オリゴヌクレオチド断片を表面に担持可
能な固体支持体において、ダイヤモンド、ダイヤモンド
ライクカーボン等の表面処理層が形成されていることを
特徴とする固体支持体。また、表面処理層の被膜上に、
オリゴヌクレオチド断片を担持させた固体支持体及び固
体支持体の表面に遺伝子を担持させて遺伝子を解析する
方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子解析、診
断、治療等に使用される遺伝子あるいは蛋白質等の生体
物質解析用等に用いられる固体支持体、及び該固体支持
体を用いて遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生体物質等を
解析する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、遺伝子解析用等に用いられる固体
支持体として、ガラスチップのスライドグラスであっ
て、表面に１万以上のＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）等
の遺伝子を載せうるように加工がされているものが広く
用いられれている。

【０００３】前記のようなチップを用いて例えば、ある
ＤＮＡサンプルの塩基配列を知りたい場合には、該スラ
イドグラス上に、予め塩基配列が解明されており、互い
に異なる塩基配列を有する数万本のＤＮＡ断片を、位置
がわかるように結合させておいたものを用意し、これに
蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮＡ断片は、
該スライドグラス上につけたＤＮＡ断片（プローブ）の
うちの相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズ
する。ハイブリダイズ部分は、スライドグラスを蛍光測
定することによりスポットとして識別でき、ＤＮＡサン
プル中に含まれるＤＮＡ断片の配列を解明することがで
きる。このように、遺伝子解析用固体支持体は、あるＤ
ＮＡに含まれる塩基配列を簡単に特定することができる
ことから、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリン
グ、ゲノムミスマッチング等の遺伝子解析等に利用され
るほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検出等遺伝子診
断や医薬品の開発等に応用されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記遺伝子解析用固体
支持体を利用して蛍光標識したＤＮＡサンプルを増幅し
て、固体支持体に蛍光照射することによるスポットの解
析により判断される。しかし、従来の遺伝子解析用固体
支持体は、前記スポットの解析をするにあたり、ガラス
の洗浄等の前処理を行うため、スポットしたＤＮＡ断片
が洗い流されてしまい、スポットが明瞭に検出できない
場合が多かった。本発明は、このような従来の遺伝子解
析用固体支持体の有する蛍光検出の不明瞭さという問題
点を解決することを目的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明において用いる基
板はガラス、プラスチック、シリコンなどの支持体に表
面処理層を形成し、更に、化学修飾を施し、固体支持体
のＤＮＡプローブ、蛋白質、ペプチド等の生体物質等を
載せることによって、固体支持体を洗浄してもスポット
したＤＮＡ断片が洗い流されずに強固に固定化されてお
り、蛍光照射した際に、蛍光スポットが明瞭となること
に特徴を有する。

【０００６】本発明の固体支持体は、固体基板上の表面
に表面処理層が形成されたものであることを特徴とす
る。

【０００７】これらの固体支持体は、前記固体基板が、
ガラス、プラスチックあるいはシリコンであることが望
ましく、前記プラスチックが、ポリエチレン樹脂、ポリ
プロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹
脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン
樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン
樹脂、エポキシ樹脂、あるいは塩化ビニル樹脂であるこ
とが望ましい。

【０００８】また、これらの固体支持体は、前記表面処
理層が、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、
炭素系物質のいずれか、それらの混合物、又はこれらを
積層させたものであることが望ましい。

【０００９】上記の構成により、本発明の固体支持体
は、従来と同様の装置や方法を用いて、ＤＮＡの塩基配
列を従来よりも格段に明瞭に解析、特定することができ
る。また、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリン
グ、ゲノムミスマッチング等の遺伝子あるいは蛋白質等
の生体物質の解析等に有効利用できる。さらに、ガン遺
伝子の突然変異の検出等遺伝子診断や医薬品の開発等に
有用である。

【００１０】さらに、本発明の固体支持体は、前記表面
処理層の厚みが、１ｎｍ〜１０００ｎｍであることが好
ましく、前記ダイヤモンドライクカーボンが、水素ガス
０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積％を含
んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作製したもの
であることが好ましい。

【００１１】本発明の固体支持体は、固体基板上の裏面
に反射層が形成されたものであることを特徴とする。こ
れらの固体支持体は、前記表面処理層上に、化学修飾を
施し、オリゴヌクレオチド断片を担持させたものである
ことが好ましく、前記表面処理層上に、化学修飾を施
し、蛋白質又はペプチドを担持させたものであることが
好ましい。

【００１２】本発明の解析する方法は、前記の固体支持
体を用いて、遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生体物質を
解析する方法であることを特徴とする。本発明の蛍光強
度の差を比較する方法は、前記固定固体支持体上にオリ
ゴヌクレオチド断片を担持させ、該オリゴヌクレオチド
に、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと、測定しよう
とするオリゴヌクレオチドとをそれぞれ反応させ、両者
から発生する蛍光強度の差を比較する方法であることを
特徴とする。このような比較する方法は、１箇所しか違
わないオリゴヌクレオチド同士でも、大きな蛍光強度の
差として表れ、ＳＮＰｓ検出にも有効である。

【００１３】

【発明の実施の態様】本発明の固体支持体は、ガラス、
プラスチック、シリコンなどの支持体の最表面上に適当
な表面処理層を形成した後に、化学修飾を施すと、遺伝
子、蛋白質、ペプチド等の生体物質と強固に結合するの
で、生体物質を載せて様々な解析用に用いると好まし
い。これらのプラスチックが、ポリエチレン樹脂、ポリ
プロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹
脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン
樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン
樹脂、エポキシ樹脂、あるいは塩化ビニル樹脂であるこ
とが好ましい。

【００１４】このような表面処理としては、ダイヤモン
ドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファ
イト等の炭素系元素を被覆したものが好ましい。ダイヤ
モンドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラ
ファイト等の炭素系元素からなる表面処理層を形成させ
た固体支持体は、ＤＮＡプローブを強固に固定化させる
ことができる。

【００１５】すなわち、炭素は化学安定性に優れてお
り、その後の化学修飾や、ＤＮＡプルーブ等を載せる際
の反応等に耐えることができる。その理由は、炭素上に
化学修飾し、ＤＮＡなどのプローブを固定化させたとき
に図１に示すように炭素原子との共有結合の状態を示す
ので、ＤＮＡプローブを固体支持体表面に強固に固定化
することができるためである。

【００１６】さらに、上記のダイヤモンドライクカーボ
ン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファイト等の炭素系
物質と他の物質との混合体、例えば金属やセラミックス
等との混合体も表面処理層として用いることができる。
さらに、上記のダイヤモンドライクカーボン（ＤＬ
Ｃ）、ダイヤモンド、グラファイト等の炭素系物質と他
の物質との積層体も表面処理層として用いることができ
る。

【００１７】固定化されたプローブは、図１に示すよう
に固体支持体上に垂直に林立させることができるので、
固体支持体表面の単位面積あたりの固定化密度を上げる
ことができる。

【００１８】上記表面処理層のダイヤモンドの素材とし
ては、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、或い
は天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。また、
それらの構造が単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差
し支えない。生産性の観点よりマイクロ波プラズマＣＶ
Ｄ法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンド
を用いることが好ましい。

【００１９】また、表面処理層としては、ダイヤモンド
と同等の性能を有し経済的にも有利な点で、非晶質のダ
イヤモンドライクカーボン（ＤｉａｍｏｎｄＬｉｋｅ
Ｃａｒｂｏｎ）膜をガラス表面に形成するこもでき
る。ダイヤモンドライクカーボンは、ダイヤモンドやグ
ラファイトと同様に炭素原子から構成され、ダイヤモン
ドに類似した特性を有することからＤＬＣ（Ｄｉａｍｏ
ｎｄＬｉｋｅＣａｒｂｏｎ）と呼ばれている。ＤＬ
Ｃ膜の結晶構造は、アモルファス（非晶質）である。

【００２０】上記表面処理層としては、グラファイト等
の炭素系物質も好適に用いられる。ダイヤモンドは、中
心及び四角に炭素原子をもつ正四面体構造で、ｓｐ３混
成軌道を形成するきわめて硬い立方晶系の結晶である。
本発明の炭素系物質としては、グラファイトや無定形炭
素を挙げることができる。グラファイトは、ｓｐ２混成
の六角形網面がπ電子を介して層状に積み重なった構造
の六方晶系結晶である。無定形炭素は明瞭な結晶構造を
示さない。無定形炭素には結晶程度の低い微小質炭素も
含まれる。

【００２１】また、結晶の大小やその配列の度合いなど
によって、無定形炭素からグラファイトに至る中間的な
構造の炭素系物質が存在するが、これらの間には明瞭な
変態点が存在しない。本発明の炭素系物質とは、グラフ
ァイト又は無定形炭素の単体、グラファイトと無定形炭
素との混合物、これらに無定形炭素及びグラファイトの
中間構造を示すものが含まれる。

【００２２】本発明の表面処理層は、上記のダイヤモン
ドライクカーボン（ＤＬＣ）、ダイヤモンド、グラファ
イト等の炭素系物質が混合されたものも用いることがで
きる。また、本発明の表面処理層は、ダイヤモンドライ
クカーボン（ＤＬＣ）膜、ダイヤモンド膜、炭素系物質
とが交互に積層されたものも用いることができる。

【００２３】本発明の表面処理層の厚みは、特に限定す
るものではないが、１ｎｍ〜１０００ｎｍの厚みがあれ
ばよい。１ｎｍ未満では、あまりに薄すぎて表面処理層
の厚みが均一にはならずに、下地のガラスが露出してし
ま部分が存在するので好ましくない。一方、１０００ｎ
ｍを超える被覆は形成中に表面処理層の中に応力が生
じ、剥離が生じやすくなるので好ましくない。工業上の
生産性からすると、表面処理層の厚みは、１０ｎｍ〜５
００ｎｍである。さらに好ましくは、３０〜２００ｎｍ
である。

【００２４】表面処理層のダイヤモンドの形成割合は、
上記プラズマＣＶＤ法で形成する場合には、反応槽内の
圧力、バイアス電圧や基板温度等の条件により適宜設定
することができる。ガラス基体へのダイヤモンド、ダイ
ヤモンドライクカーボン、グラファイト等の表面処理層
形成は、高周波プラズマＣＶＤ法、イオン化蒸着法、ア
ーク式蒸着法、レーザ蒸着法等により形成することがで
きる。

【００２５】高周波プラズマＣＶＤ法では、１３．５６
ＭＨｚの高周波によって電極間に生じるグロー放電によ
り原料ガス（メタン）を分解し、基体上にＤＬＣ膜を合
成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメン
トで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼ
ン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基体上
に成膜する。また、水素ガス０〜９９体積％と残りメタ
ンガス１００〜１体積％からなる混合ガス中で、イオン
化蒸着法によりダイヤモンドライクカーボンを形成して
も良い。

【００２６】上記のイオン化蒸着法とは、Weissmantel
らによって提案された方法で、炭化水素ガスソースＤＬ
Ｃ製膜法の一種であり、イオン源は陰極である熱フィラ
メントと対向する陽極グリットとそれらを取り囲む金属
円筒からなる。アーク式蒸着法では、固体のグラファイ
ト原料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電
圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして
陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさ
らに負のバイアス電圧を基体に印加することにより基体
に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速し成膜を行
う。

【００２７】また、レーザ蒸着法では、例えばＮｄ：Ｙ
ＡＧレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲッ
ト板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆
積させることによって形成することができる。さらに、
本発明の表面処理層を形成させた固体支持体は、その裏
面に例えば金属蒸着のような反射層が形成されているこ
とが好ましい。

【００２８】このような反射層をスライドグラスの裏面
に形成させると、表面から蛍光照射をした場合の蛍光の
反射効率を高める効果を有し、蛍光分析装置の感度を高
めることができる。すなわち、蛍光スポットを明瞭に観
察することができ、微量サンプルの解析を行うことがで
きる。

【００２９】固体支持体の裏面に形成させる反射層の種
類としては、Ｔｉ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｎｂ、ＷＣ等の単層又
はこれらの複合層が好ましい。反射層の厚みは、固体支
持全体に均一に被覆されなければならないことから１０
０ｎｍ以上が好ましい。さらに、好ましくは１０００ｎ
ｍ以上である。このような反射層を形成するには一般に
真空蒸着法を用いることができる。その他、スパッタリ
ング法、イオンビーム蒸着法などの上記の反射層を形成
させるのに適した従来技術を適宜選択して用いることが
できる。

【００３０】本発明の固体支持体の基体となるガラス
は、ＤＮＡプローブ等の遺伝子あるいは蛋白質等の生体
物質を多数載せることができるものである。従って、固
体支持体の表面上に複数の微小区分が設けられ、１つの
区分に多数のオリゴヌクレオチド断片を担持可能となっ
ているものも好ましく採用される。微小区分のそれぞれ
において、ＤＮＡプローブ等の種類を変えることについ
ては特に制限はなく、用途に応じて適宜変化させること
ができる。

【００３１】固体支持体の形状は特に限定されず、例え
ば、フィルムまたはシートのような平板状のものであっ
てもよく、また円盤状等のものであってもよい。また、
固体支持体の厚さ、大きさ等にも特に制限はなく、通常
用いられるのと同様の範囲とすることができる。固体支
持体の基体となるガラスの特性についても特に限定され
るものではないが、基体表面につける反応性物質との親
和性等の種々の特性を考慮して適宜選択できる。

【００３２】なお、下地のガラスの表面は、ＲＡ（ＪＩ
ＳＢ０６０１）で１ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲で意
図的に粗面化されていることも望ましい。このような粗
面化表面は基体の表面積が増えて多量のＤＮＡプローブ
等を密度を上げて固定させることに好都合であるからで
ある。

【００３３】基体表面には、DNAや蛋白質を固定するた
めに、更に化学修飾を施す。化学修飾の一例としては、
炭化水素基の末端に活性化エステル基が結合した基を、
支持体表面にアミド結合を介して固定化することをい
う。このような化学修飾によって、DNA、蛋白質、ペプ
チド等の生体物質を基体の表面に固定化しやすくする。
その他の化学修飾は、末端に極性基、例えば、水酸基、
カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基、チオール基、
イソシアネート基等を有する炭化水素基で固体支持体表
面を置換することによる。

【００３４】前期炭化水素基としては、炭素数が1〜12
のもの、中でも1〜6のものが好ましい。例えば、蟻酸、
酢酸、プロピオン酸などのモノカルボン酸；シュウ酸、
マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などのジカ
ルボン酸；トリメリト酸等の多価カルボン酸が挙げられ
る。中でも、シュウ酸、コハク酸が好ましい。化学修飾
方法としては、例えば、塩素ガス中で支持体に紫外線照
射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外
線照射してアミノ化した後、適当な酸クロリドあるいは
酸無水物を用いてカルボキシル化する。

【００３５】本発明の固体支持体に載せることができる
オリゴヌクレオチド断片（プロ―ブ）については、１本
鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ断片等、塩基数にも特に
制限はない。オリゴヌクレオチド断片の固定は、固体支
持体の表面への化学結合等により行うことができる。例
えば、ダイヤモンドライクカーボンによる表面処理層を
形成させた固体支持体を用いる場合、表面を活性化、す
なわちＤＮＡと化学結合しやすくした後に、ＤＮＡの末
端塩基のアミノ基を結合することができる。

【００３６】この場合の表面処理層を形成した固体支持
体の化学修飾および活性化の一例を挙げると、該固体支
持体を塩素ガス中で固体支持体に紫外線照射してダイヤ
モンドライクカーボン膜表面を塩素化し、次いでアンモ
ニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、適当な酸
クロリドを用いてカルボキシル化し、末端のカルボキシ
ル基を脱水縮合剤であるカルボジイミド或いはジシクロ
ヘキシルカルボジイミド、１ー［３−（ジメチルアミノ
プロピル）］３−エチルカルボジイミドを用いて、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合する。この処理に
より、アミド結合を介して炭化水素基の末端にＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドエステル基等の活性エステル基が
結合した基を固定化することができる。

【００３７】このようにして、固体支持体表面を活性化
させておけば、例えば、塩基配列が既に解明されている
数万本のＤＮＡ断片（プローブ）を担持させることがで
きる。また、該固体支持体上にオリゴｄＴプライマーを
結合させておき、逆転写反応等で目的のｃＤＮＡを伸張
させると同時に固体支持体に結合することもできる。さ
らに、ＰＣＲ等を用いて固体支持体上で多数のＤＮＡ鎖
を伸張させ、かつ結合させることもできる。

【００３８】このようにして、ＤＮＡ断片を結合させた
後、これに蛍光標識したＤＮＡサンプルを流すと、ＤＮ
Ａサンプルは、該固体支持体上に結合させたＤＮＡ断片
（プローブ）のうちの相補的な配列を有するプローブと
ハイブリダイズするので、蛍光スポットとしてＤＮＡサ
ンプルの配列を解明することができる。

【００３９】このように、本発明の固体支持体は、ある
ＤＮＡの塩基配列を従来と同様の方法をそのまま使いな
がら従来よりも格段に明瞭に解析、特定することができ
ることから、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリ
ング、ゲノムミスマッチング等の遺伝子解析等に利用さ
れるほか、さらにガン遺伝子の突然変異の検出等遺伝子
診断や医薬品の開発等に有用である。

【００４０】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに説明す
る。なお、比較例１として、基板として、従来の表面処
理層のないスライドグラスを用いた。

【００４１】（実施例１）以下のようにして、遺伝子解
析用に用いるための固体支持体を用意した。まず、固体
支持体として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１
ｍｍ（厚み）のポリプロピレン樹脂を用いた。このポリ
プロピレン樹脂の表面に、イオン化蒸着法により、メタ
ンガス９５体積％、水素ガスを５体積％を混合したガス
を原料として、ＤＬＣ膜を２５ｎｍ厚みに形成した固体
支持体を作成した。

【００４２】次に、この固体支持体表面を化学修飾し、
活性化させた。すなわち、ポリプロピレン樹脂表面を１
分間塩素化した後、１０分間アミノ化し、さらにコハク
酸クロリド溶液へ１０分間直接浸漬した。次に、超純水
で洗浄後、活性化液へ浸漬して直接活性化を行った。活
性化液の組成は、１，４−ジオキサン１ｍＬ、ハイドロ
ゲンシアナミド２５ｍｇおよびＮ−ヒドロキシスクシン
イミド１５０ｍｇであり、これらを溶解したものであ
る。さらに超純水で洗浄後、６５℃で乾燥して活性化し
た。

【００４３】前記のようにして作成した固体支持体表面
に、５００ｐｏｍｏｌ／ｍＬ濃度のＦＡＭｄＡ１７溶液
２μＬを滴下した（スポット）。この際、バッファーと
して超純水或いは１％ホルムアルデヒド、１０％グリセ
リン、５０％ＤＭＯを用いた。次に、インキュベーショ
ンを行った。条件は、水／ホルムアミド＝１／１雰囲気
中６５℃で１時間とした（乾燥）。

【００４４】こうして得られた遺伝子解析用として用い
る固体支持体につき、蛍光強度を測定した。測定時間は
１分とし、装置はＬＡＳ−１０００Ｐｌｕｓを用いて、
スポット後および乾燥（６５℃）後の蛍光強度を測定し
たが、従来用いられているスライドよりも優れた値であ
った。

【００４５】本発明の固体支持体であるポリプロピレン
樹脂は、スポット後および乾燥後の蛍光強度は、１３４
０で、従来のスライドグラス上のスポット後および乾燥
後の蛍光強度８０３よりも優れていた。すなわち、本発
明の固体支持体は、スポットしたＤＮＡあるいは蛋白質
等の生体物質断片が洗い流されずに固体支持体上に残留
しており、スポットが明瞭に検出できた。これに対し
て、従来のスライドグラスは、スポットしたＤＮＡある
いは蛋白質等の生体物質の断片が洗い流されてしまった
ためと考えられる。

【００４６】（実施例２）（１）以下のようにして、遺伝子解析用に用いるための
固体支持体を用意した。まず、固体支持体として、２５
ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のＳｉ
を用いた。このＳｉ基体の表面に、厚さ５００ｎｍのダ
イヤモンド膜を合成した。ダイヤモンド膜の合成はレー
ザーアブレージョン法を用いて行い、酸素ガス雰囲気中
でダイヤモンドを含有するターゲットから炭素を飛散さ
せて基板に堆積させた。

【００４７】次に、このダイヤモンド膜表面に実施例１
と同様に化学修飾し、活性化させた。こうして得られた
遺伝子解析用として用いるダイヤモンドを付着させたＳ
ｉ基板につき、実施例１と同様にして蛍光強度を測定し
たところ、１４２０であり、従来用いられているスライ
ド８０３に比べてスポット後、乾燥後ともに従来のスラ
イドグラスよりも優れた値を示した。

【００４８】（実施例３）以下のようにして、遺伝子解
析用に用いるための固体支持体を用意した。まず、固体
支持体として、２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１
ｍｍ（厚み）のスライドグラスを用いた。このガラス基
体の表面に、スパッタリング法によりグラファイト膜を
形成させた。アルゴンガス雰囲気中で、グラファイトを
含有するターゲットから炭素を飛散させて基板上に堆積
させ、厚さ２０ｎｍのグラファイト膜を形成させた。

【００４９】次に、このスライドグラス表面に実施例１
と同様に化学修飾し、活性化させた。こうして得られた
遺伝子解析用として用いるスライドグラスにつき、実施
例１と同様にして蛍光強度を測定したところ１７１１で
あり、、従来用いられているスライドの８０３に比べて
スポット後、乾燥後ともに従来のスライドグラスよりも
優れた値を示した。

【００５０】（実施例４）基体として、２５ｍｍ（幅）
×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚み）のスライドグラス
を用いた。このガラス基体の表面に、イオン化蒸着法に
より、メタンガス体積１００％のガスを原料として、加
速電圧２ｋＶでＤＬＣ膜を５０ｎｍの厚みに形成した。

【００５１】次に、このスライドグラス表面を化学修飾
し、活性化させた。ガラス基体表面を塩素ガス中で１分
間紫外線照射して塩素化した後、アンモニアガス中で１
０分間アミノ化し、さらに無水コハク酸溶液に２０分間
浸漬した。無水コハク酸溶液は、Ｎーメチルー２−ピロ
リドンに無水コハク酸を１４０ｍＭ／Ｌ、ホウ酸ナトリ
ウム（ｐＨ８）を０．１Ｍ／Ｌを溶解させて作成した。

【００５２】次に、活性化液に浸漬して直接活性化を行
った。活性化液は、２００ｍＬ入りのビーカーに、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドを１１５ｍｇと１−［３−
（ジメチルアミノ）プロピル］３−エチルカルボジイミ
ドを９５９ｍｇをリン酸バッファー（ｐＨ６）５０ｍＬ
に溶解させて作成した。この活性化液にスライドグラス
を浸漬して反応させ、洗浄した。

【００５３】次に、活性化した基板にＤＮＡをスポッテ
ィングした。ＤＮＡサンプルを濃度が０．３μｇ／μＬ
になるように５０％ＤＭＳＯ溶液（スポッティングバッ
ファー）に溶解してスポッティング用溶液を準備した。
次に、スポッティング装置を用いて、スライドグラスに
ＤＮＡ溶液を押しつけた。このようにして、スライドグ
ラス表面にＤＮＡサンプルを多数貼り付けた。

【００５４】次に、ＤＮＡ固定化のためにインキュベー
ションを行った。まず、水とホルムアルデヒドを１：１
に混合した溶液をタイトボックスに入れ、調湿チャンバ
ーとした。次に、溶液に触れないようにスライドグラス
を調湿チャンバーに入れ、３時間放置した。その後、洗
浄液（２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）で２度洗浄し、更
に、０．１％ＳＳＣと減菌水でリンスし、遠心乾燥し
た。

【００５５】次に、プレハイブリダイゼーション溶液
（５０％ホルムアミド、５×デンハルト液）でブロッキ
ングした。ブロッキング溶液を基板に滴下し、気泡が入
り込まないようにカバーグラスを静かにのせた。その
後、基板を調湿チャンバーに入れ、６０℃で１時間ブロ
ッキングを行った。その後、０．１×ＳＳＣでカバーグ
ラスを洗い落とし、減菌水で１５分間洗浄してから遠心
乾燥した。

【００５６】それから、ＤＮＡサンプルを蛍光標識ラベ
ルキットで蛍光標識した後、標準化したＤＮＡをアルカ
リ変性した。標識ラベルをハイブリダイゼーションバッ
ファー（２０％ＳＳＣ、２０％ホルムアミド、０．５％
ＳＤＳ）に溶解して０．３μｇ／μＬに調整し、ハイブ
リダイゼーション溶液とした。ＤＮＡを固定したスライ
ドグラスを熱水に５分間浸漬した後、ハイブリダイゼー
ション溶液を基板に滴下し、気泡が入り込まないように
カバーガラスを静かに載せた。その後、調湿チャンバー
中で１２時間ハイブリダイゼーションした。その後、
０．１×ＳＳＣでカバーグラスを洗い落とし、洗浄液
（２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ）で２度洗浄し、更に
０．１％ＳＳＣと減菌水でリンスしてから遠心乾燥し
た。

【００５７】こうして得られた基板を、富士写真フィル
ム製フルオロイメージアナライザーＦＬＡー８０００で
観察を行った。表面処理層のない従来のスライドグラス
を基板とした場合、蛍光強度は８０３であったが、表面
処理層を有する本発明は下記に示すように１５４２で従
来の基板より高い値を示した。

【００５８】また、この表面処理層を有するスライドグ
ラスと、従来の２種類の表面処理層のないスライドグラ
ス（比較例２と比較例３）に、オリゴヌクレオチドＡ
（配列表の配列番号1参照）とオリゴヌクレオチドＢ
（配列表の配列番号2参照）をそれぞれ固定化した基板
に、オリゴヌクレオチドＡと相補的なオリゴヌクレオチ
ドＣ（配列表の配列番号3参照）を反応させた。

【００５９】その結果、同じ基板での、オリゴヌクレオ
チドＡ（配列表の配列番号1参照）を固定化した基板の
蛍光強度とオリゴヌクレオチドＢ（配列表の配列番号2
参照）を固定化した基板の蛍光強度との差を表２に示
す。表２に示すように、比較例２と３に比べて、実施例
４のサンプルは蛍光強度の差が５８０と強いことが判明
した。このように、本発明は、１箇所しか違わないオリ
ゴヌレオチド同士でも、大きな蛍光強度の差として表
れ、ＳＮＰｓ検出にも有効であった。

【００６０】

【表１】

【００６１】

【表２】

【発明の効果】本発明の固体支持体は、従来と同様の装
置や方法を用いて、ＤＮＡの塩基配列を従来よりも格段
に明瞭に解析、特定することができる。本発明の固体支
持体は、生体ゲノムの解析、遺伝子発現のモニタリン
グ、ゲノムミスマッチング等の遺伝子あるいは蛋白質等
の生体物質の解析等に有効利用できる。さらにガン遺伝
子の突然変異の検出等遺伝子診断や医薬品の開発等に有
用である。本発明は、１箇所しか違わないオリゴヌクレ
オチド同士でも、大きな蛍光強度の差として表れ、ＳＮ
Ｐｓ検出にも有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の固体支持体上にプローブを固定化する
場合の概略説明図である。

【符号の説明】

１・・・固体支持体

【配列表】

SEQUENCE LISTING ＜110＞ Toyo Kohan Co., Ltd. ＜120＞表面処理層が形成された固体支持体＜130＞P ＜160＞3 ＜210＞1 ＜211＞配列の長さ＜212＞DNA ＜213＞artifical sequence ＜400＞1 aaa cgc ata cga tta cgt 18 ＜210＞2 ＜211＞配列の長さ＜212＞DNA ＜213＞artifical sequence ＜400＞2 aaa cgc ata tga tta cgt 18 ＜210＞3 ＜211＞配列の長さ＜212＞DNA ＜213＞artifical sequence ＜400＞3 acg taa tcg tat gcg ttt 18

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ 37/00 １０２Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者岡山浩直山口県下松市東豊井1296番地の１東洋鋼鈑株式会社技術研究所内 (72)発明者江原啓吾山口県下松市東豊井1296番地の１東洋鋼鈑株式会社技術研究所内Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 CA04 CA09 HA14 4B029 AA07 CC03 FA12 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR55 QS34 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】固体基板上の表面に表面処理層が形成さ
れた固体支持体。
【請求項２】前記固体基板が、ガラス、プラスチック
あるいはシリコンであることを特徴とする請求項１記載
の固体支持体。
【請求項３】前記プラスチックが、ポリエチレン樹
脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アク
リル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウ
レタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メ
ラミン樹脂、エポキシ樹脂、あるいは塩化ビニル樹脂で
あることを特徴とする請求項２記載の固体支持体。
【請求項４】前記表面処理層が、ダイヤモンド、ダイ
ヤモンドライクカーボン、炭素系物質のいずれか、それ
らの混合物、又はこれらを積層させたものである請求項
１〜３のいずれか記載の固体支持体。
【請求項５】前記表面処理層の厚みが、１ｎｍ〜１０
００ｎｍである請求項１〜４のいずれか記載の固体支持
体。
【請求項６】前記ダイヤモンドライクカーボンが、水
素ガス０〜９９体積％、残りメタンガス１００〜１体積
％を含んだ混合ガス中で、イオン化蒸着法により作製し
た請求項４〜６のいずれか記載の固体支持体。
【請求項７】固体基板上の裏面に反射層が形成された
固体支持体。
【請求項８】前記表面処理層上に、化学修飾を施し、
オリゴヌクレオチド断片を担持させた請求項１〜７のい
ずれか記載の固体支持体。
【請求項９】前記表面処理層上に、化学修飾を施し、
蛋白質又はペプチドを担持させた請求項１〜８のいずれ
か記載の固体支持体。
【請求項１０】請求項１〜９のいずれかに記載の固体
支持体を用いて、遺伝子、蛋白質、ペプチド等の生体物
質を解析する方法。
【請求項１１】請求項１〜９のいずれかの固体支持体
上にオリゴヌクレオチド断片を担持させ、該オリゴヌク
レオチドに、完全に相補的なオリゴヌクレオチドと、測
定しようとするオリゴヌクレオチドとをそれぞれ反応さ
せ、両者から発生する蛍光強度の差を比較する方法。