WO2004083860A1 - 生体関連分子固定化担体用ブロッキング剤、それを用いたブロッキング方法およびそれからなる生体関連分子検出用キット - Google Patents

生体関連分子固定化担体用ブロッキング剤、それを用いたブロッキング方法およびそれからなる生体関連分子検出用キット Download PDF

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Kouichi Hirayama
Hiroshi Okamura
Shuuichi Kamei
Michifumi Tanga
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Toyo Kohan Co. Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • a blocking agent for a bio-related molecule-immobilized carrier, a blocking method using the same, and a kit for detecting a bio-related molecule comprising the same
  • the present invention provides a method for immobilizing a bio-related molecule such as a protein and a nucleic acid on a carrier.
  • Bio-related molecules to prevent non-specific adsorption of bio-related molecules on a carrier
  • the present invention relates to a blocking agent for an immobilized carrier, a blocking method using the same, and a kit for detecting a bio-related molecule comprising the same.
  • an antigen protein is immobilized on a carrier, and an antigen-specific antibody (primary antibody) is bound to the antigen protein.
  • a labeled anti-primary antibody is bound to the primary antibody, and fluorescence Detection is performed by visualizing the secondary antibody binding site with a label such as.
  • a method is also known in which a biotinylated secondary antibody is bound instead of a labeled secondary antibody, and a complex of a biotinylated chromogenic enzyme and avidin is further bound thereto to amplify a signal.
  • the binding of the antigen to the primary antibody and the binding of the primary antibody and the secondary antibody are both specific reactions, but the primary antibody and the secondary antibody also bind to the surface of the carrier on which the antigen protein is not immobilized. Many nonspecifically adsorb. Non-specifically adsorbed labeled antibodies, etc., generate signals in the same manner as those adsorbed by specific reaction. To lower the detection sensitivity. A similar phenomenon is observed in the detection of specific binding of other proteins and nucleic acids.
  • a carrier whose surface is negatively charged for example, a carrier having a carboxyl group on its surface or a carrier having a group obtained by further active esterification of the carbonyl group (WO 00/22108, WO 02/1 289)
  • Non-specific adsorption of positively charged proteins is a problem, but it is difficult to prevent non-specific adsorption because BSA is negatively charged.
  • blocking agents containing other components are known, but these also have problems such as insufficient adsorption to carriers. (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2002-82116).
  • An object of the present invention is to effectively suppress non-specific adsorption of bio-related molecules to a carrier, enable highly sensitive detection of bio-related molecules, and prevent non-specific adsorption.
  • An object of the present invention is to provide a blocking agent for a carrier, a blocking method using the same, and a kit for detecting a bio-related molecule comprising the blocking agent. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, have found that using a blocking agent for a bio-related molecule-immobilized carrier containing a silane coupling agent, the zeta potential of the carrier for immobilizing the bio-related molecule can be reduced. It has been found that the above problem can be solved by adjustment, and the present invention has been completed. . That is, the present invention includes the following inventions.
  • a blocking agent for a bio-related molecule-immobilized carrier which comprises a silane coupling agent.
  • the blocking agent for a bio-related molecule-immobilized carrier has a meaning usually used in this technical field. That is, in a system in which a bio-related molecule is immobilized on a carrier and the specific binding between the immobilized molecule and another bio-related molecule is detected, non-specific adsorption of the bio-related molecule and a labeled molecule to the carrier is performed. Means the reagent used to prevent. Examples of a detection system using the above system include, for example, a DNA chip, Western blotting, Southern blotting, Northern blotting, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), and immunoagglutination (Japanese Patent Laid-open No. 10-19). No. 7530) and immunoprecipitation.
  • the silane coupling agent means an organic silicon compound having both a functional group capable of chemically bonding to an inorganic material and a functional group capable of chemically bonding to an organic material. Specifically, it means a compound represented by the following formula (1).
  • the rest of X, to 3 are selected from an alkoxy group, a halogen (chlorine, fluorine, bromine, etc.), an aryloxy group, an amino group and a hydrocarbon group.
  • the hydrocarbon group is preferably an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, particularly an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, and a pentyl group.
  • Y represents a functional group reactive with an organic substance, preferably a polar functional group.
  • the polar functional group means a group having a positive or negative charge in a solution.
  • Such functional groups include cationic groups and zwitterionic groups.
  • R represents a divalent organic group optionally having a hetero atom.
  • Hetero atoms include ⁇ , ⁇ and S.
  • non-specific adsorption is prevented by adjusting the zeta potential of the carrier for immobilizing the biomolecule using the silane coupling agent.
  • Zeta One potential means the part of the potential difference at the interface between a solid and a liquid that effectively acts on the electrokinetic phenomenon.
  • the zeta potential of the carrier can be measured by an electrophoretic light scattering measurement method by measuring an electroosmotic flow reflecting the surface potential of the surface of the unit.
  • Such a silane coupling agent is a silane coupling agent in which the group in the above formula I is a cationic group, for example, an amino group, an imide group, preferably an amino group.
  • the amino group may be substituted.
  • a Y group include an alkylamino group [methylamino group, ethylamino group, etc.], a phenylamino group, an aminoalkylamino group [aminomethylamino group, aminoethylamino group, bis (aminomethyl) amino group, Bis (aminoethyl) amino group, etc.], 1,3-dimethylbutylideneamino group, ureido group and the like.
  • a solid support with a zeta potential of 0 or a positive bio-related molecules that are negatively charged in solution, e.g., bio-related molecules with an isoelectric point lower than ⁇ Easy to adsorb. Therefore, when it is desired to prevent such non-specific adsorption of bio-related molecules, the zeta potential of the solid support is adjusted in a negative direction. That is, a blocking agent containing a silane coupling agent having a ⁇ group that is negatively charged in the solution to be used is used.
  • a silane coupling agent is a silane coupling agent in which the ⁇ group is an aionic group, for example, a carboxyl group or a sulfo group in the above formula I.
  • the anionic group may be substituted. Specifically, it is preferable to use 3-carboxypropylmethyldimethoxysilane, 3-carboxypropyltrimethoxysilane, 3-carboxypropyltriethoxysilane, 3-sulfopropyltrimethoxysilane, and 3-sulfopropyltriethoxysilane.
  • These silane coupling agents can be used alone or in combination.
  • the blocking agent of the present invention can be produced by dissolving the above silane coupling agent in a solvent.
  • the solvent examples include, but are not limited to, water, PBS (Phosphate-Buffered Saline), phosphate buffer, Tris buffer, glycine buffer, borate buffer, Good buffer, Clark-Lubs buffer, Walpole buffer or the like can be used.
  • the pH of the solution is appropriately selected depending on the bio-related molecule used, but is generally preferably in the range of pH 5 to 9.
  • the concentration of the silane coupling agent in the blocking agent of the present invention is not particularly limited, but is usually 0 to 100% by weight, preferably 0.01 to 10% by weight.
  • the desired zeta potential can be adjusted.
  • the desired zeta potential is preferably as close to OmV as possible, more preferably 0 ⁇ 5 mV.
  • the neutral polymer means a polymer having no charge in the aqueous solution used.
  • examples of such a polymer include polyacrylamide, polyethylene oxide, polysaccharide, and polyvinyl alcohol, and it is preferable to use polyacrylamide.
  • Polyacrylamide having a molecular weight of 100 to 1,000,000 is preferred, and those having a molecular weight of 1,000 to 50,000 are more preferred.
  • a known blocking agent component may be added to the blocking agent of the present invention in addition to the above-mentioned silane coupling agent and polymer.
  • Such blocking agent components are not particularly limited, but include, for example, BSA, casein, skim milk and the like.
  • the carrier on which the method and the blocking agent of the present invention can be used is not particularly limited as long as it can immobilize a bio-related molecule, and those generally used in the art can be used.
  • the blocking agent of the present invention is suitably used for a solid support having a structure having a carbon layer and / or an electrostatic layer on a substrate, if necessary.
  • Examples of the material of the substrate in such a solid support include silicon, glass, fiber, wood, paper, ceramics, and plastics (eg, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), Nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, butyl chloride resin), and metals (for example, stainless steel, nickel, titanium, and aluminum).
  • plastics eg, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), Nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin, butyl chloride resin
  • metals for example, stainless steel, nickel, titanium, and aluminum.
  • the carbon layer may be any of synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, soft diamond (for example, diamond-like carbon), amorphous carbon, and carbon-based materials (for example, graphite, fullerene, carbon nanotube). It is preferable to use a mixture thereof, or a laminate thereof. Further, carbides such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide may be used.
  • soft diamond is a general term for imperfect diamond structures that are a mixture of diamond and carbon, such as so-called diamond-like carbon (DLC), and the mixing ratio is not particularly limited. .
  • DLC diamond-like carbon
  • a substrate having a carbon layer is a substrate in which soft diamond is formed on a slide glass.
  • a substrate is made of diamond-like carbon It is preferable to be prepared by ionization vapor deposition in a mixed gas containing 0 to 99% by volume of hydrogen gas and 100 to 1% by volume of methane gas remaining.
  • the thickness of the surface treatment layer is preferably from 1 nm to 10 ⁇ m.
  • the formation of the carbon layer on the substrate is performed by a known method, for example, a microwave plasma CVD (Chemical Vaoor Deposit) method, an E-R method, a DiElectric Cvclotron Resonance Chemical Al Vapor Deposit method, an ICP (Inductive Coupled Plasma) method, DC sputtering, ECR (Electric Cyclotron Resonance) sputtering, ion plating, arc ion plating, EB (Electron Beam) evaporation, resistance heating evaporation, ionization evaporation, arc evaporation, laser evaporation, etc.
  • Examples of the solid support used in the present invention include not only a structure in which a carbon layer is formed on a substrate as described above, but also a synthetic diamond, a high-pressure synthetic diamond, a natural diamond, a soft diamond (for example, a diamond).
  • amorphous carbon Like carbon
  • gold, silver, copper, aluminum, tan Metals such as gustene and molybdenum
  • plastics eg, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin, ABS resin, nylon, acrylic resin, fluororesin, polycarbonate resin, polyurethane resin, methylpentene resin, phenol resin, melamine resin, epoxy resin
  • Examples thereof include those sintered at a high temperature, and may be a laminate or a composite of the above materials (for example, a composite of diamond and another substance (for example, a two-phase body)).
  • the electrostatic layer may be formed without being covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer, or may be formed to be covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer.
  • the electrostatic layer When the electrostatic layer is formed without being covalently bonded to the substrate or the surface treatment layer, the electrostatic layer is formed on the substrate in order to increase the affinity, that is, the adhesion between the electrostatic layer and the substrate or the surface treatment layer. It is preferable to introduce a functional group capable of covalently bonding to a nucleic acid molecule after depositing the compound having an unsubstituted or monosubstituted amino group and the carbon compound.
  • the carbon compound used here is not particularly limited as long as it can be supplied as a gas. For example, methane, ethane, and propane, which are gases at normal temperature, are preferable.
  • ionization vapor deposition As the method of vapor deposition, ionization vapor deposition is preferable, and the conditions of ionization vapor deposition are as follows: operating pressure: 0 l to 50 Pa, and accelerating voltage: 200 to 100 V It is preferable.
  • the organic peracid include peracetic acid, perbenzoic acid, diperoxyphthalic acid, formic acid, and trifluoroperacetic acid.
  • the formyl group can be introduced by, for example, reacting daltaraldehyde with the carbon layer aminated as described above.
  • the introduction of the hydroxyl group can be carried out, for example, by reacting the chlorinated carbon layer with water.
  • the introduction of the carposimid group can be carried out, for example, by reacting the carbon layer aminated as described above with a carposimid.
  • the introduced carboxyl group is a compound of N-hydroxysuccinimide and a dehydrating condensing agent such as cyanamide ⁇ carbodiimide (eg, 11- [3- (dimethylamino) propyl] -13-ethylcarboimide).
  • cyanamide ⁇ carbodiimide eg, 11- [3- (dimethylamino) propyl] -13-ethylcarboimide.
  • the biologically relevant molecules to be immobilized and detected are molecules existing in a living body and derivatives thereof.
  • the bio-related molecules include single- and double-stranded nucleic acids such as DNA and RNA, polypeptides, sugars and the like.
  • Interactions between bio-related molecules include antigen-antigen Body reaction, avidine-biotin binding reaction, enzyme-substrate binding reaction, hybridization between nucleic acid complementary strands, ligand-receptor binding reaction, nucleic acid-transcription factor binding reaction, cell adhesion factor binding Reaction and the like.
  • labels commonly used in the art.
  • labels include radioisotopes, enzymes such as alkaline phosphatase, acid phosphatase, peroxidase, ⁇ -galactosidase, glucose-16-phosphate dehydrogenase and luciferase, and fluorescent agents such as fluorescein, rhodamine, Cy 3, Cy5, chemiluminescent molecules and the like.
  • the solid support after the interaction can be directly analyzed by laser desorption / ionization / time-of-flight mass spectrometry.
  • a matrix assisted laser desorption (MALD I) method is preferable.
  • a solid support obtained by introducing a carboxyl group into a 25 mm ⁇ 75 mm glass substrate and performing active esterification was used as a carrier.
  • the solid support was prepared as follows
  • the plate was washed with PBS (Phosphate-Buffered Saline) for 20 minutes, dried by centrifugation, and a fluorescent image was observed using a fluorescent imager FLA800 (Fuji Photo Film).
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • the plate was washed with 2 ⁇ SSC / 0.2% SDS solution for 20 minutes, dried by centrifugation, and a fluorescent image was observed using a fluorescent imager FLA800 TM (manufactured by Fuji Photo Film).
  • a solid support obtained by introducing a carboxy group into a 25 mm ⁇ 75 mm stainless steel substrate and performing active esterification was used as a carrier.
  • the solid support was prepared as follows.
  • a stainless steel substrate was puff-polished, and further subjected to electrolytic polishing, and a DLC layer was formed by an ionization vapor deposition method.
  • an amino group was introduced to the substrate surface using ammonia gas as a raw material.
  • a carboxyl group was introduced using a polyvalent carboxylic acid solution (butanetetrahydrosulfonic acid).
  • the solid support is immersed in a solution of N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride in ion-exchanged water for 20 minutes. Activated by doing.
  • the solid support thus prepared was immersed in an aqueous solution containing 0.1% polyacrylamide and 0.1% 3-aminopropyltriethoxysilane, and shaken at room temperature for 1 hour. Washed with water, centrifuged and dried at 80 ° C for 20 minutes.
  • the plate was washed with PBS (Phosphate-Buffered Saline) for 20 minutes, centrifuged and dried, and a fluorescent image was observed using a fluorescent imager FLA800 (manufactured by Fuji Photo Film).
  • PBS Phosphate-Buffered Saline
  • the plate is immersed in an aqueous solution containing 0.1% polyacrylamide and 0.1% 3-aminopropyltriethoxysilane, shaken at room temperature for 1 hour, washed with water, centrifuged and dried. Dried for 20 minutes at ° C.
  • This solid support is immersed in an aqueous solution containing 0.1% polyacrylamide and 0.1% 3-aminopropyl pyrtriethoxysilane, shaken at room temperature for 1 hour, washed with water, centrifuged and dried. And dried at 80 ° C for 20 minutes.
  • the plate was washed with PBS for 20 minutes, dried by centrifugation, and a fluorescent image was observed using a fluorescent imager FLA800 (manufactured by Fuji Photo Film).
  • non-specific adsorption of a bio-related molecule to a carrier is effectively suppressed, and highly sensitive detection of a bio-related molecule becomes possible.
  • highly sensitive detection using TOF.-MS becomes possible.

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Abstract

本発明の課題は、生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制し、生体関連分子の高感度な検出を可能にする、非特異的吸着を防止する生体関連固定化担体用ブロッキング剤、それを用いたブロッキング方法及びそれからなる生体関連分子検出用キットを提供することを目的とする。ｼﾗﾝｶｯﾌﾟﾘﾝｸﾞ剤を含むことを特徴とするブロッキング剤。

Description

生体関連分子固定化担体用プロッキング剤、 それを用いたプロッキング方法およ びそれからなる生体関連分子検出用キット
技術分野
本発明は、 タンパク質及び核酸等の生体関連分子を担体上に固定化し、 固定化 明
された生体関連分子とその他の生体関連分子との特異的結合に基づいて検出を行 糸田 1
う系において、 生体関連分子の担体上への非特異的吸着を防止する生体関連分子 書
固定化担体用ブロッキング剤、 それを用いたプロッキング方法及びそれからなる 生体関連分子検出用キットに関する。
背景技術
現在、 核酸、 糖鎖、 タンパク質などの生体関連分子を担体上に固定化し、 それ にターゲットとなる生体関連分子を反応させて両分子の相互作用を研究する方法 が広く使われている。 例えば、 分子間の相互作用として抗原抗体反応を利用する ィムノプロッティングの一例を以下に示す。 まず、 抗原タンパク質を担体上に固定化し、 抗原特異的抗体 （一次抗体） を抗 原タンパク質へ結合させ、 続いて、 標識抗一次抗体 （二次抗体） を一次抗体に結 合させ、 そして、 蛍光などの標識によって二次抗体結合部位を可視化することに より検出を行う。 また、 標識二次抗体の代わりにビォチン化二次抗体を結合させ 、 さらにこれにビォチン化発色酵素とアビジンの複合体を結合させてシグナルを 増幅する方法も知られている。 ここで、 抗原と一次抗体及び一次抗体と二次抗体 の結合はどちらも特異的な反応であるが、 一次抗体、 二次抗体等は、 抗原タンパ ク質の固定化されていない担体表面にも数多く非特異的に吸着する。 非特異的に 吸着した標識抗体等は、 特異的反応によって吸着したものと同様にシグナルを発 して検出感度を低下させる。 同様の現象が、 その他のタンパク質及び核酸等の特 異的結合の検出においても観察される。
従って、 この非特異的な吸着を抑えることが、 高感度検出のためには重要にな る。 このような非特異的な吸着を防止するため、 従来、 担体上に固定化された生 体関連分子にこれと相互作用する分子を反応させる前に、 生体関連分子が結合し ていない担体上にプロッキング剤を吸着させて、 非特異的吸着を抑制していた。 このようなブロッキング剤として、 B S A (ゥシ血清アルブミン） など相互作 用に無関係なタンパク質が用いられてきた （新生化学実験講座 1、 1 994年、 東京化学同人発行） 力 非特異的吸着が十分に抑制できない場合もあった。 特に 、 表面が負に帯電した担体、 例えば、 表面にカルボキシル基を有する担体又は該 力ルポキシル基をさらに活性エステル化した基などを有する担体等を用いる場合 (WO 00/22108, WO 02/1 289, 特開 2002— 821 16号公 報） 、 正に帯電したタンパク質の非特異的吸着が問題となるが、 B SAは負に帯 電しているため、 非特異的吸着を防止することが困難であった。 また、 その他の 成分を含むブロッキング剤についても知られているが、 これらも担体への吸着が 不十分であるなど問題点を有していた。 （特開 2002— 821 16号公報） 。 本発明の課題は、 生体関連分子の担体への非特異的吸着を効果的に抑制し、 生 体関連分子の高感度な検出を可能にする、 非特異的吸着を防止する生体関連分子 固定化担体用プロッキング剤、 それを用いたプロッキング方法及びそれからなる 生体関連分子検出用キットを提供することである。 発明の開示
本発明者らは、 前記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 シランカツプリ ング剤を含む生体関連分子固定化担体用プロッキング剤を用いて、 生体関連分子 を固定化する担体のゼーター電位を調整することによって、 前記課題を解決でき ることを見出し本発明を完成させるに至った。 . すなわち、 本発明は以下の発明を包含する。
( 1 ) シランカップリング剤を含むことを特徴とする生体関連分子固定化担体用 プロッキング剤。
(2) 前記シランカップリング剤が極性官能基を有するものである （1) に記載 の生体関連分子固定化担体用プロッキング剤。
(3) 前記極性官能基がアミノ基である （2) に記載の生体関連分子固定化担体 用ブロッキング剤。
(4) 中性ポリマーをさらに含む （1) 〜 （3) のいずれかに記載の生体関連分 子固定化担体用ブロッキング剤。
(5) 前記中性ポリマーがポリアクリルアミドである （4) に記載の生体関連分 子固定化担体用プロッキング剤。
(6) (1) 〜 （5) のいずれかに記載のブロッキング剤を用いて、 担体のゼー ター電位を調整することにより、 担体への生体関連分子の非特異的吸着をプロッ キングする方法。
(7) 前記ゼーター電位を、 非特異的吸着を防止すべき生体関連分子が溶液中で 有する電荷と反対の方向に調整する （6) に記載のブロッキング方法。
(8) 前記担体が、 表面にカーボン層を有する固体支持体である （6) 又は （7 ) に記載のブロッキング方法。
(9) (1) 〜 （5) のいずれかに記載のブロッキング剤及び表面にカーボン層 を有する固体支持体を含む生体関連分子検出用キット。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 6で、 抗体を固定化したサンプルに標識抗原を相互作用させた 後、 蛍光画像スキャナー FLA8000 (富士写真フィルム製） で固体支持体を 撮影した結果である。 発明を実施するための最良の形態
本発明において生体関連分子固定化担体用プロッキング剤とは、 当技術分野に おいて通常用いられる意味を有する。 すなわち、 担体に生体関連分子を固定化し 、 この固定化分子と別の生体関連分子との特異的な結合を検出する系において、 生体関連分子及び標識分子等の担体への非特異的な吸着を防止するために使用さ れる試薬を意味する。 上記のような系を用いる検出系としては、 例えば、 D NA チップ、 ウェスタンブロッテイング、 サザンブロッテイング、 ノーザンブロッテ イング、 E L I S A (酵素免疫検定法） 、 免疫凝集法 （特開平 1 0— 1 9 7 5 3 0号公報） 及び免疫沈降法などが挙げられる。
本発明において、 シランカップリング剤とは、 無機材料と化学結合できる官能 基及び有機材料と化学結合できる官能基の双方を持つ有機ケィ素化合物を意味す る。 具体的には、 以下の （1 ) 式で表される化合物を意味する。
Figure imgf000006_0001
Y - R a - S i - X 2
X s ( 1 ) 式
式中 X,〜のうちの少なくとも 1つは、 無機質と反応性の加水分解性の置換基 で、 例えば、 アルコキシ基、 ハロゲン （塩素、 フッ素、 臭素など） 、 ァリールォ キシ基、 アミノ基などから選ばれる。 好ましくは、 炭素数 1〜1 0のアルコキシ 基、 特に、 炭素数 1〜5のア^^コキシ基、 例えば、 メ トキシ基、 エトキシ基、 プ 口ポキシ基、 プトキシ基、 ペンチロキシ基である。 X ,〜3のうちの残りは、 アル コキシ基、 ハロゲン （塩素、 フッ素、 臭素など） 、 ァリールォキシ基、 アミノ基 並びに炭化水素基などから選ばれる。 炭化水素基は、 好ましくは、 炭素数 1〜1 0のアルキル基、 特に、 炭素数 1〜 5のアルキル基、 例えば、 メチル基、 ェチル 基、 プロピル基、 ブチル基、 ペンチル基である。 式中 Yは、 有機質と反応性の官能基、 好ましくは極性官能基を表す。 極性官能 基とは、 溶液中において、 正又は負の荷電を有する基を意味する。 そのような官 能基としては、 カチオン性基及ぴァ-オン性基がある。
式中 Rは、 複素原子を有していてもよい二価の有機基を表す。 複素原子として は、 Ν、 Ο及び Sなどが挙げられる。 好ましくは、 炭素数 1〜1 0、 特に炭素数 1〜5の直鎖状又は分枝状の置換されていてもよいアルキレン基、 例えば、 メチ レン基、 エチレン基、 プロピレン基、 ブチレン基、 イソブチレン基、 ペンチレン 基である。 置換基としては、 特に限定されないが、 アルキル基、 アミノ基、 ヒド 口キシル基、 カルボキシル基、 エポキシ基、 メルカプト基、 ビエル基、 スチリル 基、 ホルミル基、 イミド基、 シァノ基、 メタクリロキシ基、 アタリロキシ基、 ゥ レイ ド基、 クロ口プロピル基、 イソシァネート基、 活性エステル基などが挙げら れる。
本発明では、 上記シランカップリング剤を用いて、 生体関連分子を固定化する 担体のゼーター電位を調整することによって、 非特異的吸着を防止する。 ゼータ 一電位とは、 固体と液体の界面における電位差のうち界面動電現象に有効に作用 する部分を意味する。 担体のゼーター電位は、 電気泳動光散乱測定法により、 単 体表面の表面電位を反映した電気浸透流を測定することによって測定することが できる。
ゼーター電位が 0又は負の担体を用いる場合は、 溶液中で正に荷電する生体関 連分子、 例えば、 使用する溶液の ρ Ηよりも高い等電点を有する生体関連分子が 非特異的に吸着しやすい。 従って、 このような生体関連分子の非特異的吸着を防 止したい場合は、 固体支持体のゼーター電位を正の方向に調整する。 すなわち、 使用する溶液中で正に荷電する Υ基を有するシラン力ップリング剤を含むプロッ キング剤を使用する。 そのようなシランカップリング剤は、 上記式 Iにおいて Υ 基が、 カチオン性基、 例えば、 アミノ基、 イミド基、 好ましくは、 アミノ基であ るシランカップリング剤である。 当該アミノ基は、 置換されていてもよい。 この ような Y基としては、 例えば、 アルキルアミノ基 [メチルァミノ基、 ェチルアミ ノ基など] 、 フエニルァミノ基、 アミノアルキルアミノ基 [アミノメチルァミノ 基、 アミノエチルァミノ基、 ビス （アミノメチル） アミノ基、 ビス （アミノエチ ル） アミノ基など] 、 1 , 3—ジメチルブチリデンァミノ基、 ウレイド基等が挙 げられる。
具体的には、 Ν—ビス （アミノエチル） 一 3—ァミノプロピルメチルジメ トキ シシラン、 Ν—ビス （アミノエチル） ー3—ァミノプロビルトリメ トキシシラン 、 Ν—ビス （アミノエチル） _ 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン、 3—ァ ミノプロビルトリメ トキシシラン、 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン、 3 —トリエトキシシリル _ Ν— （1， 3—ジメチルプチリデン） プロピルァミン、 Ν—フエニル一 3—ァミノプロビルトリメ トキシシラン、 3—ゥレイ ドプロピル トリエトキシシランを用いるのが好ましい。 これらのシランカツプリング剤は、 単独で又は組み合わせて使用することができる。
ゼーター電位が 0又は正の固体支持体を用いる場合は、 溶液中で負に荷電する 生体関連分子、 例えば、 使用する溶液の ρ Ηよりも低い等電点を有する生体関連 分子が非特異的に吸着しやすい。 従って、 このような生体関連分子の非特異的吸 着を防止したい場合は、 固体支持体のゼーター電位を負の方向に調整する。 すな わち、 使用する溶液中で負に荷電する Υ基を有するシランカップリング剤を含む プロッキング剤を使用する。 そのようなシランカツプリング剤は、 上記式 Iにお いて、 Υ基が、 ァ-オン性基、 例えば、 カルボキシル基、 スルホ基であるシラン カップリング剤である。 当該ァニオン性基は、 置換されていてもよい。 具体的に は、 3 _カルポキシプロピルメチルジメ トキシシラン、 3—カルボキシプロピル トリメ トキシシラン、 3—力ルポキシプロピルトリエトキシシラン、 3—スルホ プロビルトリメ トキシシラン、 3—スルホプロピルトリエトキシシランを用いる のが好ましい。 これらのシランガップリング剤は、 単独で又は組み合わせて使用 することができる。 本発明のプロッキング剤は、 溶媒に上記のシランカップリング剤を溶解するこ とによって製造できる。 溶媒としては、 特に限定されないが、 例えば、 水、 PB S (Phosphate-Buffered Saline) 、 リン酸緩衝液、 トリス緩衝液、 グリシン緩衝液 、 ホウ酸緩衝液、 グッド緩衝液、 Clark-Lubs緩衝液、 Walpole緩衝液等を使用でき る。 溶液の pHは用いる生体関連分子によって適宜選択されるが、 一般的には p H 5〜 9の範囲であるのが好ましい。 本発明のブロッキング剤におけるシラン力 ップリング剤の濃度は、 特に限定されないが、 通常、 0〜100重量％、 好まし くは 0. 01〜10重量％でぁる。 ブロッキング剤の濃度を調整することによつ て、 所望のゼーター電位に調節することもできる。 所望のゼーター電位として、 できるだけ OmVに近い方が好ましいが、 より好ましくは 0 ± 5mVである。 本発明においては、 シランカップリング剤に加えて、 さらに、 中性ポリマーを 含むプロッキング剤を使用するのが好ましい。 本発明において中性ポリマーとは 、 使用する水溶液中で荷電を有しないポリマーを意味する。 このようなポリマー としては、 ポリアクリルアミド、 ポリエチレンォキシド、 ポリサッカライド、 ポ リビュルアルコール等が挙げられ、 ポリアクリルアミ ドを使用するのが好ましい 。 分子量 100〜： 1,000,000のポリアクリルアミドが好ましく、 分子量 1,000〜50，000 のものがさらに好ましい。
上記のようなポリマーを添加する場合、 プロッキング剤におけるその濃度は、
100重量％以下、 好ましくは 0. 01〜10重量％である。 シランカップリン グ剤対ポリマーの重量比は、 通常、 1 : 99〜 99 : 1、 好ましくは 1 : 1. 5 〜1. 5 : 1、 特に好ましくは 1 ： 1である。
本発明のプロッキング剤には、 上記のシランカツプリング剤及びポリマーに加 えて、 公知のブロッキング剤成分を添加してもよい。 そのようなブロッキング剤 成分としては特に限定されないが、 例えば、 B SA、 カゼイン、 スキムミルク等 が挙げられる。
シランカツプリング剤に加えて、 このような中性ポリマーを添加することによ り、 正及び負に荷電した生体関連分子のいずれについても、 非特異的吸着を防止 することができる。
本発明の方法及びプロッキング剤を使用することができる担体としては、 生体 関連分子を固定化できるものであれば特に制限されず、 当技術分野で通常用いら れるものを使用できる。 特に、 本発明のブロッキング剤は、 基板上に、 必要に応 じて、 カーボン層及び/又は静電層を有する構造の固体支持体に好適に使用され る。
このような固体支持体における基板の材料としては、 例えば、 シリコン、 ガラ ス、 繊維、 木材、 紙、 セラミックス、 プラスチック （例えば、 ポリエステル樹脂 、 ポリエチレン樹脂、 ポリプロピレン樹脂、 A B S樹脂 （Acrylonitrile Butadiene Styrene樹脂)、 ナイロン、 アクリル樹脂、 フッ素樹脂、 ポリカーボネート樹脂、 ポリウレタン樹脂、 メチルペンテン樹脂、 フエノール樹脂、 メラミン樹脂、 ェポ キシ樹脂、 塩化ビュル樹脂） 、 金属 （例えば、 ステンレス、 ニッケル、 チタン、 アルミニウム） が挙げられる。
カーボン層には、 合成ダイヤモンド、 高圧合成ダイヤモンド、 天然ダイヤモン ド、 軟ダイヤモンド （例えば、 ダイヤモンドライクカーボン） 、 アモルファス力 一ボン、 炭素系物質 （例えば、 グラフアイト、 フラーレン、 カーボンナノチュー ブ） のいずれか、 それらの混合物、 又はそれらを積層させたものを用いることが 好ましい。 また、 炭化ハフユウム、 炭化ニオブ、 炭化珪素、 炭化タンタル、 炭化 トリウム、 炭化チタン、 炭化ウラン、 炭化タングステン、 炭化ジルコニウム、 炭 化モリブデン、 炭化クロム、 炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。 ここで 、 軟ダイヤモンドとは、 いわゆるダイヤモンドライクカーボン （D L C : Diamo nd Like Carbon) 等の、 ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤ モンド構造体を総称し、 その混合割合は、 特に限定されない。
カーボン層を有する基板の一例としては、 スライドガラスに軟ダイヤモンドを 製膜した基板が挙げられる。 このような基板は、 ダイヤモンドライクカーボンが 、 水素ガス 0〜 9 9体積％、 残りメタンガス 1 0 0〜 1体積％を含んだ混合ガス 中で、 イオン化蒸着法により作成したものであることが好ましい。 表面処理層の 厚みは、 1 n m〜 l 0 Ο μ ι であることが好ましい。
基板へのカーボン層の形成は、 公知の方法、 例えば、 マイクロ波プラズマ C V D (Chemical Vaoor Deposit)?£、 E し Rし " DiElectric Cvclotron Resonance Chemic al Vapor Deposit)法、 I C P (Inductive Coupled Plasma)法、 直流スパッタリング法 、 E C R (Electric Cyclotron Resonance)スパッタリング法、 イオンプレーティング 法、 アークイオンプレーティング法、 E B (Electron Beam)蒸着法、 抵抗加熱蒸着 法、 イオン化蒸着法、 アーク蒸着法、 レーザ蒸着法などにより行うことができる 本発明に用いる固体支持体としては、 前記のように基板の上にカーボン層を形 成した構造だけでなく、 合成ダイヤモンド、 高圧合成ダイヤモンド、 天然ダイヤ モンド、 軟ダイヤモンド （例えば、 ダイヤモンドライクカーボン） 、 ァモルファ スカーボン；金、 銀、 銅、 アルミニウム、 タングステン、 モリブデン等の金属； プラスチック （例えば、 ポリエステル樹脂、 ポリエチレン樹脂、 ポリプロピレン 樹脂、 A B S樹脂、 ナイロン、 アクリル樹脂、 フッ素樹脂、 ポリカーボネート樹 脂、 ポリウレタン樹脂、 メチルペンテン樹脂、 フエノール樹脂、 メラミン樹脂、 エポキシ樹脂、 塩化ビュル樹脂） ；前記金属粉末、 セラミック粉末等に、 前記樹 脂をバインダーとし,て混合、 結合形成したもの；前記金属粉末やセラミックス粉 末等の原料をプレス成形機で圧粉したものを高温で焼結したものが挙げられ、 ま た、 前記の材料の積層体や複合体 （例えば、 ダイヤモンドと他の物質との複合体 、 （例えば 2相体） ） であってもよい。
基板の形状及びサイズは特に限定されないが、 形状としては、 平板状、 糸状、 球状、 多角形状、 粉末状などが挙げられ、 サイズは、 平板状のものを用いる場合 、 通常、 幅 0 . 1 〜 ： L 0 0 mm、 長さ 0 . 1 〜 1 0 0 111111、 厚み0 . 0 1〜 1 0 mm程度である。 本発明のプロッキング剤は、 核酸分子又はタンパク質等の生体関連分子を静電 的に引き寄せるための静電層を有する固体支持体に使用することもできる。 この ような静電層を有する固体支持体は、 目的とする生体関連分子を強固に固定化す ることができる反面、 非特異的吸着を起こしやすいが、 本発明のブロッキング剤 により非特異的吸着を効果的に防止することができる。
静電層としては、 核酸分子又はタンパク質等を静電的に引き寄せ核酸分子又は タンパク質等の生体関連分子の固定化量を向上させるものが用いられ、 例えば、 ァミノ基含有化合物など正荷電を有する化合物を用いて形成することができる。 前記アミノ基含有化合物としては、 非置換のアミノ基 （一 N H2) 、 又は炭素 数 1〜6のアルキル基等で一置換されたァミノ基 （一 N H R ； Rは置換基） を有 する化合物、 例えばエチレンジァミン、 へキサメチレンジァミン、 n—プロピル ァミン、 モノメチルァミン、 ジメチルァミン、 モノェチルァミン、 ジェチルアミ ン、 ァリルァミン、 アミノアゾベンゼン、 ァミノアルコール （例えば、 エタノー ルァミン） 、 アタリノール、 ァミノ安息香酸、 アミノアントラキノン、 アミノ酸
(グリシン、 ァラニン、 バリン、 ロイシン、 セリン、 トレオニン、 システィン、 メチォニン、 フエ二/レアラニン、 トリプトファン、 チロシン、 プロリン、 シスチ ン、 グルタミン酸、 ァスパラギン酸、 グルタミン、 ァスパラギン、 リシン、 アル ギニン、 ヒスチジン） 、 ァ-リン、 又はこれらの重合体 （例えば、 ポリアリルァ ミン、 ポリリシン） や共重合体； 4， 4 ' , 4 " —トリアミノ トリフエニルメタ ン、 トリアムテレン、 スペルミジン、 スペルミン、 プトレシンなどのポリアミン
(多価ァミン） が挙げられる。
静電層は、 基板又は表面処理層と共有結合させずに形成してもよく、 基板又は 表面処理層と共有結合させて形成してもよい。
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、 例えば、 表面処理層を製膜する際に前記ァミノ基含有化合物を製膜装置内に導入すること によって、 アミソ基を含有する炭素系皮膜を製膜する。 製膜装置内に導入する化 合物として、 アンモニアガスを用いてもよい。 また、 表面処理層は、 密着層を形 成した後にァミノ基を含有する皮膜を形成するといった、 複層であってもよく、 この場合もァンモユアガスを含んだ雰囲気で行ってもよい。
また、 静電層を基板又は表面処理層と共有結合させずに形成する場合には、 静 電層と基板又は表面処理層との親和性、 即ち密着性を高める点で、 基板上に、 前 記の非置換又は一置換されたアミノ基を有する化合物及び炭素化合物を蒸着させ た後、 核酸分子と共有結合しうる官能基を導入することが好ましい。 ここで用い る炭素化合物としては、 気体として供給することができれば特に制限はないが、 例えば常温で気体であるメタン、 ェタン、 プロパンが好ましい。 蒸着の方法とし ては、 イオン化蒸着法が好ましく、 イオン化蒸着法の条件としては、 作動圧が 0 • l〜5 0 P a、 そして加速電圧が 2 0 0〜1 0 0 0 Vの範囲であることが好ま しい。
静電層を基板又は表面処理層と共有結合させて形成する場合には、 例えば、 基 板又は表面処理層を施した基板に、 塩素ガス中で紫外線照射して表面を塩素化し 、 次いで前記アミノ基含有化合物のうち、 例えば、 ポリアリルァミン、 ポリリシ ン、 4， 4， ， 4 " _トリアミノ トリフエ-ルメタン、 トリアムテレン等の多価 アミンを反応させて、 基板と結合していなレ、側の末端にァミノ基を導入すること により、 静電層を形成することができる。
本発明のプロッキング剤は、 カーボン層及び/又は静電層を有する基板に生体 関連分子と共有結合しうる官能基が導入されてなる固体支持体に好適に使用でき る。 このような官能基は、 生体関連分子の固定化を促すものとして、 当業者であ れば適宜選択することができ、 特に制限されないが、 例えば、 アミノ基、 カルボ キシル基、 エポキシ基、 ホルミル基、 ヒドロキシル基、 カルポジイミド基、 活性 エステル基、 スルホ基、 イミ ド基が挙げられる。
ァミノ基の導入は、 例えば、 カーボン層を塩素ガス中で紫外線照射して塩素化 した後、 アンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。 又は、 メチ レンジァミン、 エチレンジァミン等の多価アミン類を、 塩素化したカーボン層と 反応させることによって実施することもできる。 あるいは、 アンモニアプラズマ 、 エチレンジァミンプラズマでカーボン層表面を処理することによつても実施す ることができる。
カルボキシル基の導入は、 例えば、 上記のようにァミノ化したカーボン層に適 当な多価カルボン酸を反応させることにより実施できる。
エポキシ基の導入は、 例えば、 上記のようにァミノ化したカーボン層に適当な 多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。 あるいは、 カーボン 層が含有する炭素 =炭素 2重結合に有機過酸を反応させることにより得ることが できる。 有機過酸としては、 過酢酸、 過安息香酸、 ジペルォキシフタル酸、 過ギ 酸、 トリフルォロ過酢酸などが挙げられる。
ホルミル基の導入は、 例えば、 上記のようにァミノ化したカーボン層に、 ダル タルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
ヒ ドロキシル基の導入は、 例えば、 上記のように塩素化したカーボン層に、 水 を反応させることにより実施できる。
カルポジイミ ド基の導入は、 例えば、 上記のようにァミノ化したカーボン層に 、 カルポジイミ ド類を反応させることにより実施できる。
活性エステル基の導入は、 例えば、 塩素ガス中でカーボン層に紫外線を照射し て表面を塩素化し、 ついで、 アンモニアガス中で紫外線を照射してァミノ化した 後、 適当な酸クロリ ド又はジカルボン酸無水物を用いてカルボキシル化し、 末端 のカルボキシル基をカルポジィミ ド又はジシク口へキシルカルポジィミ ド及び N ーヒ ドロキシスクシンイミ ドと脱水縮合することにより実施できる。 この処理に より、 アミ ド結合を介して炭化水素基の末端に、 N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド エステル基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる。
静電層が施された基板に、 ジカルボン酸又は多価カルボン酸を用いてカルボキ シル基を導入する場合には、 予め N—ヒドロキシスクシンイミド及び 又はカル ポジイミド類で活性化させたり、 あるいは、 反応を N—ヒドロキシスクシンイミ ド及び/又はカルボジィミド類の存在下に行うことが好ましい。
導入されたカルボキシル基は、 シアナミドゃカルポジイミド （例えば、 1一 [ 3 - (ジメチルァミノ） プロピル] 一 3—ェチルカルポジィミ ド） などの脱水縮 合剤と N—ヒ ドロキシスクシンイミ ドの化合物で活性エステル化 （スクシンイミ ジル化） することができる。
本発明のブロッキング剤は、 カーボン層、 好ましくは D L C層を有する固体支 持体、 及び該カーボン層にカルボキシル基を導入した後活性ェステル化してなる 固体支持体における非特異的吸着の防止に好適に使用することができる。
上記のような固体支持体において、 ゼーター電位が負となる場合としては、 官 能基として、 例えば、 活性エステル基、 カルボキシル基、 スルホ基、 ヒドロキシ ル基を導入した場合、 あるいは負荷電を有する静電層を形成した場合が挙げられ る。 一方、 ゼーター電位が正となる場合としては、 官能基として、 例えば、 アミ ノ基、 イミド基を導入した場合、 あるいは上記のようなアミノ基含有化合物など 正荷電を有する化合物で静電層を形成した場合が挙げられる。
本発明において、 固定化及び検出の対象となる生体関連分子は、 生体中に存在 する分子及びその誘導体である。 生体関連分子としては、 例えば、 一本鎖及び二 本鎖 D N A及ぴ R N Aなどの核酸、 ポリペプチド、 糖などが挙げられる。 P N A
(ペプチド核酸） 等も包含される。 ペプチド核酸とは、 D N Aや R N Aなどの核 酸類のデォキシリボースゃリポースからなる骨格に代えてぺプチド骨格又は偽ぺ プチド骨格、 例えば、 アミノエチルダリシン主鎮、 並びにポリアミド、 ポリチォ アミド、 ポリスルフィンアミド及ぴポリスルホンアミドを含む他の同様の主鎖を 有する核酸擬似体であって、 該主鎖に結合した核酸塩基を有する化合物を意味す る。 本発明において、 ポリペプチドには、 ペプチド及びタンパク質も包含される 。 本発明の方法に好適なタンパク質として、 各種抗原及び抗体、 酵素、 並びにァ ビジン、 ピオチン等が挙げられる。 生体関連分子間の相互作用としては、 抗原抗 体反応、 アビ'ジン一ピオチンの結合反応、 酵素と基質の結合反応、 核酸相補鎖間 のハイブリダィゼーシヨン、 リガンドとレセプターの結合反応、 核酸と転写因子 の結合反応、 細胞接着因子の結合反応などが挙げられる。
核酸を構成するヌクレオチドは、 塩基とリン酸基が電離して荷電を帯ぴやすい 。 二本鎖 D N Aの場合、 塩基の電荷は相補鎖間の水素結合で互いにうち消し合つ ているため、 分子全体としてはリン酸基の負チャージのみが主となる。 また、 二 重らせん構造をとらない R NAや一本鎖 D N Aの場合は、 A、 C、 G、 T、 4種 類の塩基の電荷が相補鎖によってキャンセルされないため、 塩基の組成が分子全 体の電荷に影響を与える。
溶液中で正に荷電しやすい生体関連分子としては、 例えば、 アビジン、 リゾチ ーム、 プリオン、 T F IIB (transcription initiation factor IIB)等が挙げられる。
溶液中で負に荷電しやすい生体関連分子としては、 例えば、 ニ本鎮 D NA、 β —ガラタトシダーゼ、 ひーァクチン、 β—ァクチン、 ]3—カゼイン、 R NAポリ メラーゼ III等が挙げられる。
本発明におけるプロッキング剤は、 当技術分野において一般に使用されている ブロッキング剤と同様に使用することができる （例えば、 分子生物学実験プロト コール、 平成 9年、 丸善株式会社発行参照） 。 一実施形態として、 担体にタンパ ク質を固定化してこれと相互作用するタンパク質を検出する方法を以下に説明す る。
まず、 タンパク質溶液を、 タンパク質の固定化に好適な担体上にプロッティン グすることにより固定化する。 その後、 当該担体を自然乾燥又は減圧乾燥し、 室 温で約 1時間静置する。 続いて、 ポリアクリルアミド及びシランカップリング剤 を含むプロッキング剤に浸して 1時間ほど振とうする。 このときの浸漬温度は、 0〜1 0 0 °C、 好ましくは 2 0〜6 0 °Cである。 その後、 水で洗浄し、 遠心乾燥 して、 通常、 0〜1 0 0 °C、 好ましくは 6 0〜1 0 0 °Cで乾燥させる。 または、 通常、 1 0〜6 0 °C、 好ましくは 1 5〜3 0 °Cで減圧乾燥させる。 このようにブ 口ッキング処理をした後、 担体上に固定化されたタンパク質と相互作用するタン パク質を含有する溶液を添加する。
生体関連分子間の相互作用は、 当技術分野で通常用いられる標識によって検出 することができる。 このような標識としては、 放射性同位元素、 酵素、 例えば、 アルカリホスファターゼ、 酸性ホスファターゼ、 ペルォキシダーゼ、 β—ガラク トシダーゼ、 グルコース一 6—リン酸デヒドロゲナーゼ及びルシフェラーゼ、 並 びに蛍光剤、 例えば、 フルォレセイン、 ローダミン、 Cy 3、 Cy 5、 化学発光 分子等が挙げられる。
あるいは、 相互作用した後の固体支持体を、 そのままレーザ脱離 イオン化一 飛行時間型質量分析で分析することもできる。 イオン化法の様式としては、 マト リックス補助レーザ脱着 （MALD I) 法が好ましい。
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施 例に限定されるものではない。 実施例
(実施例 1 )
担体として、 25mmX 75 mmのガラス基板にカルボキシル基を導入して活 性エステル化した固体支持体を用いた。 当該固体支持体は以下のように作成した
25 mm (幅） X 75 mm (長さ） X 1 mm (厚み） のスライドガラスに、 ィ オン化蒸着法によって、 メタンガス 95体積％と水素 5体積％を混合したガスを 原料として、 加速電圧 0. 5 k Vで DLC層を 10 nmの厚みに形成した。 その 後に、 メタンガスをキャリアーガスとして 5 cm3/分の割合で 15°Cに保温し たエチレンジァミン中を通してチャンバ一に導入した。 作動圧を 2 P aとして加 速電圧 0. 5 k Vでメタンとエチレンジァミンを原料として C、 N及ぴ Hからな る層を 10 nraの厚みに形成した。 その後、 基板表面のァミノ基に多価カルボン酸として無水ブタンテトラカルボ ン酸を縮合した後に、 0. 1Mリン酸緩衝液 （p H 6) 3 0 0m lに 0. 1 Mの 1一 [3— (ジメチルァミノ） プロピル] — 3—ェチルカルポジイミドと 2 Om Mの N—ヒドロキシスクシンイミドを溶解した活性化液中に 3 0分間浸漬するこ とによって活性化した。
この固体支持体を 0. 1 % ポリアクリルアミド、 0. 1 % 3—ァミノプロピ ルトリエトキシシランを含む水溶液に浸し、 室温で 1時間振とうした後、 水で洗 浄し、 遠心乾燥して、 8 0°Cで 20分間乾燥した。
その後、 蛍光標識したタンパク質 （C y 3—アビジン、 C y 3— β—ガラク ト シダーゼ） を固体支持体上にそれぞれ 1 0 /i L滴下し、 カバーガラスを被せた。 その固体支持体を調湿タッパーに入れ、 3 7 °Cで 1時間保温した。
その後、 P B S (Phosphate-Buffered Saline) で 2 0分間洗浄したのち、 遠心乾 燥して、 蛍光画像装置 F LA 8 00 0 (富士写真フィルム製） を用いて蛍光画像 を観察した。
比較として、 ブロッキング操作をしてない固体支持体、 および市販ブロッキン グ剤 （ロッシュ製） を用いたもので同様の操作を行った。
その結果、 プロッキング操作をしていない固体支持体ではアビジンの吸着が多 く見られたのに対して、 ポリアクリルアミ ド、 3—ァミノプロピルトリエトキシ シランで処理した固体支持体では、 アビジン、 —ガラクトシダーゼどちらも吸 着を抑制することができた。
また、 3—ァミノプロピルトリエトキシシランのみで処理した固体支持体では /3 _ガラクトシダーゼの吸着が多かったが、 ポリアクリルアミドを追加すること によりその吸着を抑制することができた。 表 1 蛍光強度に及ぼすプロッキング剤の種類の影響
Figure imgf000019_0001
(実施例 2)
担体として、 実施例 1と同様に、 25mmX 75mmのガラス基板にカルボキ シル基を導入して活性エステル化した固体支持体を用いた。
この固体支持体にスポッターを用いて DNAをスポットし、 80°Cで 1時間乾 燥した。 この固体支持体を 2 X S S C/0. 2 % S D S溶液で洗浄した後、 0 - 1 % ポリアクリルアミ ド及び 0 · 1 % 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン を含む水溶液に浸し、 室温で 1時間振とうした後、 水で洗浄し、 遠心乾燥して、 80°Cで 20分間乾燥した。
その後、 Cy 3で蛍光標識したオリゴヌクレオチド溶液を固体支持体に 10 β L滴下し、 カバーガラスを被せた。 その固体支持体を調湿タッパーに入れ、 60 °Cで 1晚保温した。
その後、 2 X S SC/0. 2%SD S溶液で 20分間洗浄したのち、 遠心乾燥 して、 蛍光画像装置 FLA800◦ (富士写真フィルム製） を用いて蛍光画像を 観察した。
比較として、 ブロッキング操作をしてない固体支持体で同様の操作を行った。 その結果、 ブロッキング操作をしていない固体支持体ではオリゴヌクレオチド の吸着が多く見られたのに対して、 ポリアクリルアミド、 3—ァミノプロビルト リエトキシシランで処理した固体支持体では吸着を抑制することができた。 表 2 蛍光強度に及ぼすプロッキング剤の種類の影響
Figure imgf000020_0001
(実施例 3 )
担体として、 2 5 mm X 7 5 mmのステンレス基板にカルボキシノレ基を導入し 活性エステルイ匕した固体支持体を用いた。 当該固体支持体は以下のように作成し た。
まず、 ステンレス基板をパフ研磨した後、 さらに電解研磨を施し、 イオン化蒸 着法によって D L C層を形成した。 その際、 アンモニアガスを原料として、 基板 表面にァミノ基を導入した。 さらに、 多価カルボン酸溶液 (無水ブタンテトラ力 ルボン酸)を用いてカルボキシル基を導入した。 続いて、 イオン交換水に N—ヒ ドロキシスクシンィミド及ぴ 1—ェチルー 3 - ( 3—ジメチルァミノプロピル） カルポジィミドハイドロクロリ ドを溶解した溶液に、 固体支持体を 2 0分間浸漬 することにより活性化した。
作成した固体支持体を 0 . 1 % ポリアクリルアミド及び 0 . 1 % 3—ァミノ プロピルトリエトキシシランを含む水溶液に浸し、 室温で 1時間振とうした後、 水で洗浄し、 遠心乾燥して、 8 0 °Cで 2 0分間乾燥した。
その後、 蛍光標識したタンパク質 （C y 3—アビジン、 C y 3— ]3—ガラタト シダーゼ） を固体支持体にそれぞれ 1 0 Z L滴下し、 カバーガラスを被せた。 そ の固体支持体を調湿タッパーに入れ、 3 7 °Cで 1時間保温した。
その後、 P B S (Phosphate-Buffered Saline) で 2 0分間洗浄したのち、 遠心乾 燥して、 蛍光画像装置 F L A 8 0 0 0 (富士写真フィルム製） を用いて蛍光画像 を観察した。
比較として、 ブロッキング操作をしてない固体支持体、 および巿販ブロッキン グ剤 （ロッシュ製） を用いたもので同様の操作を行った。
その結果、 ブロッキング操作をしていない固体支持体ではアビジンの吸着が多 く見られたのに対して、 ポリアクリルアミド、 3—ァミノプロピルトリエトキシ シランを含むブロッキング剤で処理した固体支持体では、 アビジン、 ーガラタ トシダーゼどちらも吸着を抑制することができた。
表 3 蛍光強度に及ぼすプロッキング剤の種類の影響
蛍光強度
ブロッキング剤の種類
アビジン β一ガラクトシダ一ゼ 未処理 3850 102
ポリアクリルアミドのみ 3900 60
シランカップリング剤のみ 220 1020
市販ブロッキング剤 3462 120
0.1 %ポリアクリルアミド +
50 92
0,1 %シランカップリング剤 (実施例 4)
担体として、 3 mmX 3 mmのシリコン基板にダイヤモンドを成膜して、 カル ポキシル基を導入し活性エステル化した固体支持体を用いた。 当該固体支持体は 以下のように作成した。
シリコン基板にィォン化蒸着法によって、 メタンガス 95体積％と水素 5体積 %を混合したガスを原料として、 加速電圧 0. 5 k Vで DLC層を 10 nmの厚 みに形成した。 その後に、 アンモニアガスを 5 c;m3Z分の割合でチャンバ一に 挿入した。 作動圧を 2 P aとしてアンモニアプラズマで DLC表面を処理するこ とによりアミノ化した。 その後、 表面処理層のアミノ基に多価カルボン酸として 無水ブタンテトラカルボン酸を縮合した後に、 0. 1Mリン酸緩衝液 （pH6) 300m lに 0. 11^の1ー [3— （ジメチルァミノ） プロピル] 一 3 _ェチル カルポジィミドと 2 OmMの N—ヒドロキシスクシンィミドを溶解した活性化液 中に 30分間浸漬することによって活性エステル基を有する固体支持体を得た。 続いて 0. 1 % ポリアクリルァミド及び 0. 1 % 3—ァミノプロビルトリエ トキシシランを含む水溶液に浸し、 室温で 1時間振とうした後、 水で洗浄し、 遠 心乾燥して、 80°Cで 20分間乾燥した。
その後、 蛍光標識したタンパク質 （Cy 3—アビジン、 Cy 3— ]3—ガラタト シダーゼ） を固体支持体にそれぞれ 10 μ L滴下し、 カバーガラスを被せた。 そ の固体支持体を調湿タッパーに入れ、 37°Cで 1時間保温した。
その後、 PB Sで 20分間洗浄したのち、 遠心乾燥して、 蛍光画像装置 FLA 8000 (富士写真フィルム製） を用いて蛍光画像を観察した。
比較として、 ブロッキング操作をしてない固体支持体、 およぴ巿販ブロッキン グ剤 （ロッシュ製） を用いたもので同様の操作を行った。
その結果、 プロッキング操作をしていない固体支持体ではアビジンの吸着が多 く見られたのに対して、 ポリアクリルアミド、 3—ァミノプロピルトリエトキシ シランを含むブロッキング剤で処理した固体支持体では、 アビジン、 /3—ガラク トシダーゼどちらも吸着を抑制することができた。 蛍光強度に及ぼすプロッキング剤の種類の影響
Figure imgf000023_0001
(実施例 5 )
担体として、 実施例 4と同じ固体支持体を用いた。
この固体支持体を、 0 . 1 % ポリアクリルアミド及ぴ 0 . 1 % 3—アミノプ 口ピルトリエトキシシランを含む水溶液に浸し、 室温で 1時間振とうした後、 水 で洗浄し、 遠心乾燥して、 8 0 °Cで 2 0分間乾燥した。
その後、 蛍光標識したタンパク質 （C y 3—アビジン、 C y 3— ーガラクト シダーゼ） を固体支持体にそれぞれ 1 0 L滴下し、 カバーガラスを被せた。 そ の固体支持体を調湿タッパーに入れ、 3 7 °Cで 1時間保温した。
その後、 P B Sで 2 0分間洗浄したのち、 遠心乾燥して、 蛍光画像装置 F L A 8 0 0 0 (富士写真フィルム製） を用いて蛍光画像を観察した。
比較として、 ブロッキング操作をしてない固体支持体、 および市販ブロッキン グ剤 （ロッシュ製） を用いたもので同様の操作を行った。
その結果、 プロッキング操作をしていない固体支持体ではアビジンの吸着が多 く見られたのに対して、 ポリアクリルアミド及び 3—ァミノプロピルトリエトキ シシランを含むブロッキング剤で処理した固体支持体では、 アビジン、 ]3—ガラ クトシダーゼどちらも吸着を抑制することができた。 蛍光強度に及ぼすプロッキング剤の種類の影響
Figure imgf000024_0001
(実施例 6 )
担体として、 実施例 1で作成したものと同じ固体支持体を用いた。
この固体支持体に、 2 μ Lピペットマンでプローブタンパク質 （抗体） をスポ ットし （サンプルについては表 6参照） 、 室温で 2 0分間乾燥した。 次に、 0 . 1 % ポリアタリルァミ ド及び 0 . 1 % 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン を含むプロッキング剤に固体支持体を浸漬して 1時間振とうし、 プロッキングを 行った。 また、 比較として、 市販されているブロッキング剤 （ロッシュ製、 日本 油脂製） でもブロッキングを行った。 ブロッキング処理後、 3 0分間減圧乾燥し た。
その後、 蛍光標識したターゲットタンパク質 （C y 3—アビジン又は C y 3— β—ガラクトシダーゼ） を 1 0 μ L滴下し、 カバーガラスを被せ 3 7 °Cで 1時間 ィンキュベートし、 P B Sで 2 0分間洗浄した。 固体支持体を、 遠心乾燥した後 、 蛍光画像スキャナー F L A 8 0 0 0 (富士写真フィルム製） で固体支持体を観 察した。 観察された蛍光画像を図 1に、 固体支持体上にスポッティングすること により固定化した抗体、 固体支持体に添加して相互作用させた標識タンパク質、 使用したブロッキング剤及ぴそれぞれのスポットで観測された蛍光強度を表 6に 示す。
本発明のプロッキング剤を使用し、 スポット後の固体支持体に C y 3ーァビジ ンを添加すると、 その抗体である抗ァビジン抗体が固定化されたスポッ ト （表 6 におけるスポット番号 1及び 7 ) でシグナルが観察された。 また C y 3— j3—ガ ラタトシダーゼを添加すると、 その抗体である抗 ]3 _ガラクトシダーゼが固定化 されたスポット （表 6におけるスポット番号 2及び 8 ) でシグナルが観察された
蛍光強度に及ぼすブロッキング剤の種類の影響
Figure imgf000025_0001
市販のブロッキング剤 （日本油脂製） を使用し、 スポット後の固体支持体に C y 3—アビジンを添加すると、 アビジンが非特異的に固体支持体に吸着し、 明確 なシグナルを検出することができなかった。 C y 3— β —ガラクトシダーゼを添 加すると、 本発明のブロッキング剤を使用した場合と同様に、 その抗体である抗 /3—ガラクトシダーゼが固定化されたスポット （表 6におけるスポット番号 2及 び 8 ) でシグナルが検出された。 産業上の利用可能性
本発明により、 生体関連分子の担体への非特異的吸着が効果的に抑制され、 生 体関連分子の高感度な検出が可能になる。 また、 表面にカーボン層を有する固体 支持体と本発明のプロッキング剤を併用することにより、 T O F .— M Sを用いた 高感度な検出も可能になる。

Claims

請求の範囲
1 . シランカップリング剤を含むことを特徴とする生体関連分子固定化担体用 プロッキング剤。
2 . 前記シランカップリング剤が極性官能基を有するものである請求項 1に記 載の生体関連分子固定化担体用プロッキング剤。
3 . 前記極性官能基がァミノ基である請求項 2に記載の生体関連分子固定化担 体用プロッキング剤。
4 . 中性ポリマーをさらに含む請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の生体関連 分子固定化担体用ブロッキング剤。
5 . 前記中性ポリマーがポリアクリルアミドである請求項 4に記載の生体関連 分子固定化担体用プロッキング剤。
6 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のブロッキング剤を用いて、 担体のゼ —ター電位を調整することにより、 担体への生体関連分子の非特異的吸着をプロ ッキングする方法。
7 . 前記ゼーター電位を、 非特異的吸着を防止すべき生体関連分子が溶液中で 有する電荷と反対の方向に調整する請求項 6に記載のブロッキング方法。
8 . 前記担体が、 表面にカーボン層を有する固体支持体である請求項 6又は 7 に記載のブロッキング方法。
9 . 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載のプロッキング剤及ぴ表面にカーボン 層を有する固体支持体を含む生体関連分子検出用キット。
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