KR100544850B1

KR100544850B1 - 기판의 활성화 키트 및 이를 사용한 ｄｎａ 등의 검출 방법

Info

Publication number: KR100544850B1
Application number: KR1020037001769A
Authority: KR
Inventors: 오까무라히로시; 단가미찌후미; 야마까와가오루; 오바미쯔요시; 다까기겐이찌
Original assignee: 도요 고한 가부시키가이샤
Priority date: 2000-08-08
Filing date: 2001-06-20
Publication date: 2006-01-24
Also published as: AU2001274560A1; JPWO2002012891A1; JP4730808B2; US7078172B1; WO2002012891A1; KR20030031145A; CN1606693A; EP1310793A1; EP1310793A4; CN1284972C

Abstract

기판에 DNA 를 간편하게, 게다가 종래의 방법과 동일하게 고밀도로 또한 강고하게 고정화하기 위한 방법 및 정확하게 DNA 를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 인산 버퍼 (pH 6) 및 N-히드록시숙신이미드로 이루어지는 용액 A (수용액) 와, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드로 이루어지는 용액 B (디옥산 용액) 로 이루어지는 기판의 활성화 키트, 및 상기 활성화 키트를 사용하여 활성화된 기판에 DNA 를 스폿팅하고, 스폿팅된 DNA 에 대한 형광표식 DNA 의 혼성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 의 검출 방법이다.

DNA 검출 방법

Description

기판의 활성화 키트 및 이를 사용한 ＤＮＡ 등의 검출 방법 {SUBSTRATE ACTIVATION KIT AND METHOD OF DETECTING DNA OR THE LIKE BY USING THE SAME}

본 발명은 의료 분야, 생화학이나 분자생물학 등의 연구 분야에서 유용한 기판의 활성화 키트 및 상기 키트를 사용하여 DNA 또는 단백질 등을 검출하는 방법에 관한 것이다.

유전자 해석은 분자생물학, 생화학 분야에서 유용하고, 최근에는 병의 발견 등을 위해 의료 분야에서도 이용되고 있다.

최근 DNA 를 고정화한 기판이 개발되어 유전자 해석에 있어서의 해석 속도가 현저하게 빨라지고, 이것을 응용하여 의료 분야에서는 질병 진단 등도 실행되고 있다.

기판 상에 DNA 를 고정하는 방법으로는, 슬라이드 글라스 또는 실리콘 기판 표면에 폴리라이신 등의 고분자를 도포한 후에 고정하는 방법, 포토리소그래피 (photolithography) 등의 반도체 기술을 이용하여 기판 상에 DNA 를 합성하는 방법 등이 있다.

그러나 폴리라이신 등의 고분자를 도포하여 DNA 를 고정하는 방법에서는 DNA 의 고정화상태가 불안정하기 때문에, 하이브리드 형성 공정이나 세정 공정에서 DNA 가 박리되는 문제가 발생하였다.

또 반도체 기술을 이용한 방법은 제조 공정이 번잡하고 매우 고가라는 문제가 있다.

이와 같은 과제를 해결하기 위해 본 발명자들은 이미 기판 표면을 화학적으로 수식하여 N-히드록시숙신이미드 에스테르 또는 p-니트로페놀 에스테르 등의 활성화 에스테르기로 활성화하면 DNA 를 안정적으로 고정할 수 있는 것을 발견하였다.

그러나 이와 같은 화학적 수식에는 몇가지의 화학 반응을 거치는 번잡한 조작이 필요하였다.

또 화학적으로 수식하여 활성화된 기판은 기판 상에 DNA 를 스폿팅 (spotting) 한 후에도 여분의 활성점이 그대로 남아 있는 경우가 있었다.

이 때문에 스폿팅된 DNA 에 검출하고자 하는 DNA 를 혼성화시키려고 하면 여분의 활성점에도 DNA 가 부착되어 정확한 DNA 검출을 할 수 없다는 문제도 있었다.

본 발명은 DNA 등의 고정화에 있어서의 상기 종래의 문제점을 해결하여 기판에 DNA 등을 간편하게, 게다가 종래의 방법과 동일하게 고밀도로 또한 강고하게 고정화하기 위한 방법 및 정확하게 DNA 등을 검출하는 방법의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 검토한 결과, 2 종류의 용액을 혼합하는 것만으로 간단하게 기판의 활성화가 가능한 것을 발견하였다.

또 기판을 활성화하여 DNA 또는 단백질을 스폿팅한 후, 혼성화하기 전에 예 비혼성화 공정에 의해 여분의 활성점을 차단함으로써, 정확한 DNA 또는 단백질 등의 검출이 가능해지는 것을 발견하고 본 발명에 도달하였다. 또 이 차단은 스폿팅 후의 후처리 공정에서 건조 및 세정을 실행하여 활성기가 충분히 실활된 경우에는 실시하지 않아도 되는 것도 발견하였다.

또한 혼성화 공정 전 또는 예비혼성화 공정 전의 인큐베이션 공정에서 겔 용액을 사용함으로써, 보다 정확한 DNA 또는 단백질 등의 검출이 가능해지는 것을 발견하였다.

본 발명의 기판의 활성화 키트는 인산 버퍼 (pH 6) 및 N-히드록시숙신이미드로 이루어지는 용액 A 와, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드로 이루어지는 용액 B 를 주성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 기판의 활성화 키트는 용액 A 가 인산 버퍼 (pH 6) 0.01∼5 M 및 N-히드록시숙신이미드 1∼500 mM (0.115∼57.5 g/ℓ) 의 수용액인 것을 제 2 특징으로 한다.

본 발명의 기판의 활성화 키트는 용액 B 가 1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드가 0.05∼10 M (9.59∼1918 g/ℓ) 의 디옥산 용액인 것을 제 3 특징으로 한다.

본 발명의 기판의 활성화 키트는 용액 A 50∼99 용량% 에 대해, 용액 B 1∼50 용량% 를 배합하여 사용하는 것을 제 4 특징으로 한다.

본 발명의 DNA 또는 단백질의 검출 방법은 활성화 키트를 사용하여 활성화된 기판에 DNA 또는 단백질을 스폿팅한 후이고, 스폿팅된 DNA 또는 단백질에 대한 형 광표식 DNA 의 혼성화를 실시하기 전에, 스폿팅 부위 이외의 기판 표면을 차단하는 예비혼성화를 실시하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 DNA 또는 단백질의 검출 방법은 예비혼성화가 기판 표면에 스폿팅된 DNA 또는 단백질과는 상이한 DNA 또는 단백질을 고정화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 DNA 또는 단백질의 검출 방법은 활성화 키트를 사용한 기판의 활성화 공정, 활성화된 기판에 대한 DNA 또는 단백질의 스폿팅 공정, 스폿팅 후의 기판의 인큐베이션 공정 또는 건조 공정, 스폿팅 부위 이외의 기판 표면을 차단하는 예비혼성화 공정, 스폿팅된 DNA 또는 단백질에 대한 형광표식 DNA 의 혼성화 공정 및 혼성화 부위의 형광 부위 검출 공정의 각 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 DNA 또는 단백질의 검출 방법은 예비혼성화 공정이 기판 표면에 스폿팅된 DNA 또는 단백질과는 상이한 DNA 또는 단백질을 고정화하는 공정인 것을 특징으로 한다.

도면의 간단한 설명

도 1 은 표면이 활성 에스테르화된 기판의 모식도이다.

도 2 는 기판 표면에 DNA 를 고정화하는 반응의 개략을 나타낸 도면이다.

도 3 은 스폿팅의 프로세스를 나타낸 도면이다.

도 4 는 타이트 박스의 단면도이다.

도 5 는 예비혼성화의 프로세스를 나타낸 도면이다.

도 6 은 세정 공정을 나타낸 도면이다.

도 7 은 혼성화의 프로세스를 나타낸 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 대해 이하에 상세하게 설명한다.

(1) 기판의 준비

본 발명에서 사용하는 기판은 유리, 플라스틱, 실리콘 등의 지지체에 표면처리층을 형성하고, 다시 화학적 수식을 실시함으로써 DNA 프로브, 단백질, 펩티드 등의 생체 물질 등을 얹은 경우에, 기판을 세정해도 DNA 단편, 단백질, 펩티드 등이 씻겨나가지 않고 강고하게 고정화되어, 형광조사했을 때에 형광 스폿이 뚜렷해지는 것을 특징으로 한다. 표면처리층으로는 다이아몬드, 연(軟)다이아몬드, 탄소계 물질 중 어느 하나, 이들의 혼합물, 또는 이들을 적층시킨 것이 바람직하다. 또 탄화하프늄, 탄화니오븀, 탄화규소, 탄화탄탈럼, 탄화토륨, 탄화티탄, 탄화우라늄, 탄화텅스텐, 탄화지르코늄, 탄화몰리브덴, 탄화크롬, 탄화바나듐 등의 탄화물이어도 된다. 여기에서 연다이아몬드란 이른바 다이아몬드-라이크 카본 (DLC) 등의, 다이아몬드와 카본의 혼합체인 불완전 다이아몬드 구조체를 총칭하며, 그 혼합비율은 특별히 한정되지 않는다.

이와 같은 기판의 일례로는 슬라이드 글라스에 연다이아몬드를 막형성한 기판을 들 수 있다.

이와 같은 기판은 상기 표면처리층의 두께가 1 ㎚∼1000 ㎚ 인 것이 바람직하다.

이와 같은 기판은 상기 다이아몬드-라이크 카본이 수소 가스 1∼99 체적%, 나머지 메탄 가스 99∼1 체적% 를 함유한 혼합 가스 중에서 이온화 증착법에 의해 작성한 것이 바람직하다.

또 이와 같은 기판의 표리면에 반사층으로서 Ti, Au, Pt, Nb, WC 등의 단층 또는 이들의 복합막을 형성해도 된다. 반사층의 두께는 전체적으로 균일하게 피복되어야 하기 때문에 100 ㎚ 이상이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 1000 ㎚ 이상이다.

또한 유리 기판의 표면은 Ra (JIS B 0601) 로 1 ㎚∼1000 ㎚ 의 범위에서 의도적으로 조면화되어 있는 것도 바람직하다. 이와 같은 조면화 표면은 기판의 표면적이 증가되어 다량의 DNA 프로브 등을 밀도를 올려 고정화하는데 바람직하다.

기판의 표면처리층의 제조는 공지된 방법, 예컨대 마이크로파 플라스마 CVD 법, ECRCVD 법, IPC 법, 직류 스퍼터링법, ECR 스퍼터링법, 이온 플레이팅법, 아크 (arc) 이온 플레이팅법, EB 증착법, 저항 가열 증착법, 이온화 증착법, 아크식 증착법, 레이저 증착법 등에 의해 제조할 수 있다.

기판은 지지체에 표면처리층을 형성한 구조 뿐만 아니라, 합성 다이아몬드, 고압 합성 다이아몬드, 천연 다이아몬드, 금, 은, 구리, 알루미늄, 텅스텐 등의 금속, 폴리카보네이트, 불소 수지 등의 플라스틱, 또 금속 분말이나, 세라믹 분말 등에 수지를 바인더로서 혼합하여 결합 형성한 것이어도 된다. 또 금속 분말이나 세라믹 분말 등의 원료를 프레스 형성기를 사용하여 압분 (壓粉) 한 것을 고온에서 소결해도 된다. 또 다이아몬드와 다른 물질의 복합체 (예컨대 2 상체) 이어도 된다.

기판의 형상은 평판상, 사상, 구상, 다각형상, 분말상 등 특별히 한정되지 않는다.

기판체 표면에는 DNA 나 단백질을 고정시키기 위해 추가로 화학적 수식을 실시한다. 화학적 수식의 일례로는 탄화수소기의 말단에 활성화 에스테르기가 결합된 기를, 지지체 표면에 아미드 결합을 통해 고정화하는 것을 말한다. 이와 같은 화학적 수식은 DNA, 단백질, 펩티드 등의 생체 물질을 기판의 표면에 고정화하기 쉽게 한다. 그 외의 화학적 수식은 말단에 극성기, 예컨대 수산기, 카르복실기, 에폭시기, 아미노기, 티올기, 이소시아네이트기 등을 갖는 탄화수소기로 고체 지지체 표면을 치환하는 것에 의한다.

상기 탄화수소기로는 탄소수가 1∼12 인 것, 그 중에서도 1∼6 인 것이 바람직하다. 예컨대 포름산, 아세트산, 프로피온산 등의 모노카르복실산; 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸말산 등의 디카르복실산; 트리멜리트산 등의 다가 카르복실산을 들 수 있다. 그 중에서도 옥살산, 숙신산이 바람직하다.

화학적 수식의 방법으로는 예컨대 염소 가스 중에서 지지체에 자외선 조사하여 표면을 염소화하고, 이어서 암모니아 가스 중에서 자외선 조사하여 아민화한 후, 적당한 산 클로리드 또는 산 무수물을 사용하여 카르복실화한다. 또 다른 화학적 수식 방법으로서 표면을 염소화하지 않고 암모니아 가스 중에서 플라스마에 의해 아민화한 후, 산 클로리드 또는 산 무수물을 사용하여 카르복실화한다.

(2) 활성화 키트

본 발명의 활성화 키트는 인산 버퍼 (pH 6) 및 N-히드록시숙신이미드로 이루어지는 용액 A (수용액) 와, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드로 이루어지는 용액 B (디옥산 용액) 의 2 종류로 이루어진다.

N-히드록시숙신이미드 대신에 p-니트로페놀을 사용할 수도 있다.

본 발명의 활성화 키트에 의해, 기판 표면에 카르복실기를 도입한 연다이아몬드를 코팅한 슬라이드 글라스 (연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스) 등을 N-히드록시숙신이미드로 활성 에스테르화하여, 도 1 과 같은 기판을 얻을 수 있다.

즉 다이아몬드 표면을 활성화한 후에 DNA 의 염기에 함유되는 제 1 급 아미노기와 아미드 결합시킬 수 있다 (도 2 참조).

용액 A (수용액) 중에 차지하는 농도는 인산 버퍼 (pH 6) 는 0.01∼5 M 인 것에 대해, N-히드록시숙신이미드는 1∼500 mM (0.115∼57.5 g/ℓ) 로 할 수 있다.

인산 버퍼 (pH 6) 는 예컨대 0.1 M 인산이수소칼륨 용액 및 0.1 M 인산수소이칼륨 용액을 준비한 후에, 인산이수소칼륨 용액의 pH 를 모니터하면서 pH 6 이 될 때까지 인산수소이칼륨 용액을 첨가함으로써 조정할 수 있다.

용액 B (디옥산 용액) 에 대해서는 디옥산에 1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드를 0.05∼10 M (9.59∼1918 g/ℓ) 의 농도로 첨가한 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 활성화 키트에 있어서 용액 A 와 용액 B 의 배합비율은 용액 A 가 50∼99 용량% 인 것에 대해, 용액 B 는 1∼50 용량% 로 하는 것이 바람직하다.

비이커 등의 용기 내에서 용액 A 와 B 를 혼합한 후, 혼합 용액 중에 기판을 침지하고, 바람직하게는 교반하면서 4∼50℃ 에서 5∼120 분간 반응시킨다. 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스 등의 기판 표면의 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드로 활성 에스테르화, 즉 다이아몬드 표면을 활성화한 후에, DNA 의 염기에 함유되는 제 1 급 아미노기와 아미드 결합시킬 수 있다 (도 2). 활성화된 기판은 멸균수 등으로 세정한다.

활성화 후의 기판은 활성이 떨어지지 않도록 가능한 한 빨리 사용하는 것이 바람직하다. 보관하는 경우는 건조 후 데시케이터 내에서 보관하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 상기와 같이 활성화 키트로 활성화된 기판을 사용하여, 이하의 공정을 거침으로써 DNA 를 검출할 수 있다.

(3) 스폿팅 공정

본 발명의 활성화 키트에 의해 활성화된 기판에 이하와 같이 하여 DNA 를 접착시킨다 (스폿팅).

먼저 농도가 0.01∼10 ㎍/㎕ 가 되도록 초순수를 사용하여 DNA 용액을 제조한다. 또 스폿팅용 버퍼로서는 SSC 나 TE 등도 사용할 수 있으나, 1∼50% 포름아미드 용액 또는 1∼50% 글리세린 용액, 1∼50% DMSO 용액을 사용하면, 점성이 높아져 안정적으로 스폿팅할 수 있고, 또한 증발을 억제할 수 있다.

이어서 스폿팅용 용액을 활성화된 기판 상에 스폿터를 사용하여 스폿팅한다. 이 때 스폿팅용 용액을 열 변성 또는 알칼리 변성시켜 DNA 2 개 사슬을 1 개 사슬로 하여 급냉시켜도 된다. 이 스폿팅용 용액을 예컨대 도 3 에 나타낸 바와 같 이 스폿터의 바늘로 액을 빨아 들이고 (도 3 의 a), 기판에 눌러 붙여 (동 b), DNA 액을 기판에 눌러 붙인다 (동 c). 이와 같이 하여 슬라이드 글라스 표면에 여러 종류의 DNA 를 붙인다 (동 d).

(4) 인큐베이션 공정

다음에 스폿팅된 DNA 가 기판 표면에 고정되는 반응을 진행시키기 위해 인큐베이션을 실행한다. DNA 의 기판에 대한 고정화는 화학 반응에 의한 공유 결합이기 때문에, 반응을 확실하게 진행시키기 위해 스폿팅 후에 신속하게 인큐베이션을 실행할 필요가 있다.

인큐베이션은 고습 하에서 실시하는 것이 바람직하지만, 예컨대 도 4 에 나타낸 타이트 박스를 사용하여 실시할 수 있다. 타이트 박스에는 포화 NaCl 용액을 넣고, 습도를 일정하게 조정한 조습 (調濕) 챔버로 한다. 예컨대 0∼80℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고, 타이트 박스 전체가 0∼80℃ 전후로 될 때까지 방치함으로써 할 수 있다. 바람직하게는 45∼70℃ 정도이다. 또 포화 NaCl 용액은 예컨대 50% 포름아미드 수용액으로 할 수 있다. NaCl 용액 이외에도 물이나 염화칼륨 용액을 사용할 수도 있다.

인큐베이터는 0∼80℃ 의 범위로 할 수 있으나, 고정화 반응을 더욱 진행시키지 위해서는 45∼70℃ 정도로 하는 것이 바람직하다.

타이트 박스가 조습 챔버가 되면, 스폿팅이 완료된 기판을 넣고, 일정 습도로 조정하여 인큐베이션을 실행한다.

기판은 NaCl 포화 수용액 또는 50% 포름아미드 수용액에 접촉하지 않도록 하 는 것이 바람직하다. 예컨대 도 4 와 같이 바닥을 올린 후에 얹을 수 있다.

인큐베이션은 0.1∼24 시간 정도 실시하는 것이 바람직하다. 또 인큐베이션 후, 65∼90℃ 의 항온실 내에 1 시간 이상 방치하여 건조시키는 것이 바람직하다.

상기와 같이 인큐베이션을 고습도 분위기 중에서 실시하는 방법 이외에, 겔 용액을 사용함으로써, 보다 안정적으로 보다 촉진된 고정화 반응을 얻을 수 있다. 예컨대 겔 용액의 성분으로서 아가로스, 젤라틴, 가교 폴리에틸렌 옥사이드 등의 흡수성 고분자가 바람직하다. 첨가제로서 알부민 등의 단백질, 연어 정자 DNA, 데옥시리보뉴클레오티드 3 인산, 덴하르트액 등 블록킹 효과가 있는 것이 바람직하다. 겔 용액의 농도는 0.01∼99% 범위가 바람직하다. 보다 바람직하게는 0.3∼3% 범위이다.

작성한 겔 단편을 DNA 를 스폿팅한 장소에 얹고, 0∼80℃ 로 설정한 조습 챔버 내에서 반응을 진행시킬 수 있다. 이 때 DNA 의 유출을 억제하기 위해 겔을 얹기 전에 40∼80℃ 의 항온실 내에서 기판을 건조시키는 것이 바람직하다.

기판을 조습 챔버에서 빼낸 후에 기판을 세정한다. 먼저 세정액 (예컨대 2 ×SSC, 0.2% SDS) 을 넣은 배트 (vat) 내에 기판을 담근다. 이 때 DNA 를 스폿팅한 면을 위로 하여 넣는다. 그 후 진탕기 등을 사용하여 진탕 세정하고, 다시 한번 세정액을 바꿔넣어 세정한다. 다시 묽은 세정액 (예컨대 0.1 ×SSC) 으로 세정한 후, 원심기나 블로어 (blower) 를 사용하여 기판을 건조시킨다.

또한 단백질 등의 첨가제를 함유한 겔 용액을 사용하여 인큐베이션 공정을 실시한 경우에는, 다음의 예비혼성화 공정은 필요없다.

(5) 예비혼성화 공정

다음에 인큐베이션 후의 기판에 혼성화의 전처리로서 여분의 활성점을 차단하기 위한 예비혼성화를 실행한다. 예비혼성화로는 소 혈청 알부민 (BSA), 카제인, 연어 정자 DNA, 덴하르트액 등을 사용할 수 있으며, 이들에 20 ×SSC, SDS, 포름아미드 등을 첨가하여 용액을 제조하여 예비혼성화용 용액으로 한다. 예비혼성화용 용액 중에 연어 정자 DNA 등의 DNA 가 함유되는 경우, 열 변성에 의해 2 개 사슬을 1 개 사슬로 하기 위해 가열하여 급냉시킨다.

예비혼성화용 용액의 일례로는 용액에 덴하르트액과 포름아미드를 첨가한 것 (5 ×덴하르트액, 50% 포름아미드) 을 들 수 있다.

기판 중의 미리 DNA 를 스폿팅한 장소에 예비혼성화용 용액을 적하하고, 기포가 들어가지 않도록 커버 글라스를 살짝 얹는다.

예비혼성화는 0.1∼24 시간 실행하는 것이 바람직하다.

예비혼성화는 예비혼성화 용액이 건조되지 않도록 고습에서 실행하는 것이 바람직하고, (4) 인큐베이션의 항목에서 서술한 바와 같은 조습 챔버를 이용할 수 있다.

타이트 박스가 0∼80℃ 로 설정된 인큐베이터 내에서 조습 챔버가 된 상태에서, (4) 와 동일하게 NaCl 포화 수용액 또는 50% 포름아미드 수용액에 접촉하지 않도록 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 넣고 (바닥을 올린 후에 얹음) 다시 인큐베이터에 넣는다. 이렇게 하여 기판 상에 미리 스폿팅한 DNA 와는 관계없는 DNA 로 스폿 부위 이외의 슬라이드 글라스 표면이 차단된다 (도 5).

다음에 세정을 한다. 예컨대 기판을 0.1 ×SSC 용액에 넣고, 커버 글라스를 떼어낸다. 다음에 진탕기 등을 사용하여 멸균수로 세정한 후에, 원심기나 블로어를 사용하여 기판을 건조시킨다.

또한 이 예비혼성화 공정은 인큐베이션 공정 후에 30℃∼80℃ 의 항온실 내에서 0.1∼24 시간 기판을 건조시키고, 그 후 세정액 (예컨대 2 ×SSC, 0.2% SDS) 을 넣은 배트 내에서 충분히 세정하고, 린스액 (예컨대 0.1 ×SSC) 으로 세정하여 건조시키고, 활성화 에스테르가 완전히 가수분해되어 실활된 경우에는 실시하지 않아도 된다. 단 실활이 불충분한 경우, 이후의 혼성화 공정에서 스폿 이외의 부분에 대한 DNA 의 고정화가 일어나기 때문에, 확실한 결과를 얻기 위해서는 예비혼성화 공정을 실시하는 것이 바람직하다.

(6) 혼성화 공정

타겟이 되는 DNA 샘플을 형광표식 라벨 키트에 따라 실시하거나, 또는 역전사 효소 반응을 이용하여 형광표식한다.

이 형광표식 DNA 샘플에 멸균수, 20 ×SSC, SDS, 포름아미드 등을 첨가하고, 교반하여 혼성화용 용액을 제조한다.

이 때 스폿팅 공정에서 스폿팅용 용액의 열 변성 또는 알칼리 변성을 실시하지 않고 2 개 사슬의 상태로 스폿팅한 경우에는, 기판 상 DNA 의 열 변성을 실시한다. (5) 의 예비혼성화 공정이 종료된 기판을 3∼5 분간 열수에 침지하고, 그 후에 빙냉한다. 스폿팅 용액을 열 변성 또는 알칼리 변성한 후 스폿팅한 경우 에는 이 공정은 필요하지 않다.

작성한 혼성화용 용액을 기판의 DNA 를 스폿팅한 장소에 적하하고, 기포가 들어가지 않도록 커버 글라스를 살짝 얹는다.

혼성화도 고습에서 실시하는 것이 바람직하고, (4) 인큐베이션의 항목에서 서술한 바와 같은 조습 챔버를 이용할 수 있다.

타이트 박스가 0∼80℃ 로 설정된 인큐베이터내에서 조습 챔버가 된 상태에서, (4) 와 동일하게 NaCl 포화 수용액 또는 50% 포름아미드에 접촉하지 않도록 기판을 넣고 (바닥을 올린 후에 얹음), 다시 인큐베이터에 넣는다.

이렇게 하여 도 7 과 같이 형광표식된 DNA 가 기판 상에 미리 스폿팅된 DNA 와 혼성화시킨다.

마지막에 세정을 한다. 세정은 기판을 0.1 ×SSC 용액을 사용하여 커버 글라스를 떼어내고, 그 후 세정액 (예컨대 2 ×SSC, 0.2% SDS) 을 넣은 배트 내에서 2 번 반복하여 세정하고, 린스액 (예컨대 0.1 ×SSC) 으로 세정하여 원심기나 블로어를 사용하여 건조시킨다.

(7) 형광 부위 검출 공정

검출은 기판 표면의 DNA 와 혼성화된 DNA 의 형광표식을 형광 화상 판독용 스캐너 등을 사용하여 판독함으로써 실시할 수 있다.

(실시예 1)

연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스의 사용 프로토콜에 대해 설명한다.

(1) 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스의 준비

먼저 25㎜ (폭) ×75㎜ (길이) ×1㎜ (두께) 의 유리 표면에, 이온화 증착법에 의해, 메탄 가스 95 체적% 와 수소 가스를 5 체적% 를 혼합한 가스를 원료로 하여, 25㎚ 의 두께로 DLC 막을 형성한 슬라이드 글라스를 작성하였다.

다음에 이 슬라이드 글라스 표면을 화학적으로 수식하였다.

즉 유리 기판 표면을 암모니아 분위기 하에서 고압 수은등을 10 분간 조사하여 아민화하고, 다시 무수숙신산의 N-메틸피롤리돈 용액 중에 60 분간 침지하였다. 이와 같이 하여 기판 표면에 카르복실기를 갖는, 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 얻었다.

연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스에 대한 DNA 의 고정화는, 도 1 과 같이 표면의 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드로 활성 에스테르화한 후에 실시하였다.

다이아몬드 표면의 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르기를 DNA 의 염기에 함유되는 제 1 급 아미노기와 아미드 결합시켰다 (도 2).

(2) 활성화

활성화는 활성화 키트를 사용하여 실시하였다. 활성화 키트의 용액 조성은 이하의 것을 사용하였다.

ㆍ용액 A (수용액)

인산 버퍼 (pH 6) 0.1 M

N-히드록시숙신이미드 22 mM (2.5 g/ℓ)

ㆍ용액 B (디옥산 용액)

1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드 1 M (191.8 g/ℓ)

다음에 인산 버퍼 (pH 6) 는 다음과 같이 하여 작성하였다. 먼저 0.1 M 인산이수소칼륨 용액 (13.6 g/ℓ) 및 0.1 M 인산수소이칼륨 용액 (17.4 g/ℓ) 을 준비하였다. 인산이수소칼륨 용액의 pH 를 pH 계로 측정하여, pH 를 모니터하면서 pH 6 이 될 때까지 인산수소이칼륨 용액을 첨가하였다.

활성화 후의 기판은 활성이 떨어지지 않도록 가능한 한 빨리 사용하는 것이 바람직하다. 보관하는 경우는 65℃ 에서 30 분 건조 후, 데시케이터 내에서 보관하는 것이 바람직하다.

용액 A 를 90 ㎖ 비이커에 넣고, 추가로 용액 B 를 10 ㎖ 첨가하였다. 액을 잘 교반한 후에, 이 용액을 샬레에 넣고, 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 용액에 침지하여, 30 분간 실온에서 방치하였다 (진탕기 등의 교반 장치가 있는 경우는 교반을 실시함). 활성화 후의 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 멸균수에 의해 2 회 세정하였다.

한편 활성화 키트를 사용하지 않고 기판을 활성화할 수도 있다. 이 경우는 이하와 같이 하여 실시하였다.

먼저 기판 표면을 활성화하였다. 이하의 것을 준비하였다.

ㆍ연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스

ㆍ1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드

ㆍN-히드록시숙신이미드

ㆍ인산이수소칼륨

ㆍ인산수소이칼륨

ㆍ멸균수

먼저 활성 에스테르화 (카르복실기의 N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르화) 를 실시하였다. 활성화액의 조성은 다음과 같은 것을 사용하였다.

ㆍN-히드록시숙신이미드 20 mM

ㆍ1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드 0.1 M

ㆍ인산 버퍼 (pH 6) 0.1 M

200 ㎖ 비이커에 1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드 959 ㎎ 과, N-히드록시숙신이미드 115 ㎎ 을 넣고, 50 ㎖ 의 인산 버퍼 (pH 6) 로 용해하고, 이것에 슬라이드 글라스를 침지하여 상기 활성화 키트를 사용한 경우와 동일하게 반응시켜 세정하였다.

(3) 스폿팅

다음에 활성화한 기판에 DNA 를 접착하였다 (소위 스폿팅).

먼저 다음의 것을 준비하였다.

ㆍ연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스 (활성화 완료)

ㆍDNA 샘플

ㆍ포름아미드

ㆍ멸균수

ㆍ스폿터

DNA 샘플을 농도가 1 ㎍/㎕ 가 되도록 10% 포름아미드 용액 (스폿팅용 버퍼) 에 용해하여 스폿팅용 용액을 준비하였다. 스폿팅용 용액을 95℃ 에서 5 분 열 변성하고, 4℃ 까지 급냉하였다. 도 3 에 나타낸 바와 같이 스폿터의 바늘로 액을 빨아내 (도 3 의 a), 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스 표면에 붙이고 (동 b), DNA 액을 기판에 붙였다 (동 c). 이와 같이 하여 슬라이드 글라스 표면에 다수 접착하였다 (동 d).

(4) 인큐베이션

연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스, 포화 NaCl 수용액, 타이트 박스 및 인큐베이터를 준비하여 실시하였다. 포화 NaCl 수용액 (예컨대 물 + 포름아미드 (1:1) 용액) 을 넣은 타이트 박스를 4℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고, 타이트 박스 전체가 4℃ 가 될 때까지 약 1 시간 방치하여 조습 챔버를 준비하였다.

타이트 박스가 조습 챔버로 된 상태로 인큐베이터에서 꺼내 NaCl 포화 수용액에 접촉하지 않도록 타이트 박스 내에 연다이아몬드 코팅 글라스를 넣었다 (바닥을 올린 후에 얹음). 타이트 박스를 다시 인큐베이터에 넣고 1 시간 방치하였다. 이 동안에도 습도를 높게 유지하기 위해 온도를 조정하였다. 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 넣은 상태의 타이트 박스를 도 4 에 나타낸다. 그 후 80℃ 의 오븐 속에서 3 시간 건조시켰다.

(5) 예비혼성화

연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스 (스폿팅 및 인큐베이션 완료), 커버 글라스, 연어 DNA, 20 ×SSC, 1 ×SSC, 10% SDS, 포름아미드, 멸균수, 1.5㎖ 반응 튜브, 200㎕ 에펜도르프 튜브, 배트, 진탕기, 200 ㎖ 비이커, 블로어, 포화 NaCl 수용액, 타이트 박스 및 인큐베이터를 준비하여 아래의 조작을 실시하였다.

먼저 상기 (4) 인큐베이션의 경우와 동일하게 포화 NaCl 용액을 넣은 타이트 박스를 37℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고, 타이트 박스 전체가 37℃ 가 될 때까지 약 1 시간 방치하여 조습 챔버를 준비하였다. 이것과는 별도로 예비혼성화용 용액을 제조하였다.

연어 DNA (샘플과는 관계가 없는 DNA 를 말함) 샘플을 1㎎ 반응 튜브에 재어넣고, 500㎕ 멸균수로 용해하였다. 그 후 20 ×SSC 를 250㎕, 10% SDS 를 50㎕, 포름아미드를 200㎕ 첨가하였다. 교반 후, 필요한 양을 에펜도르프 튜브에 넣고, 예비혼성화용 용액으로 하였다.

본 실시예에서는 스폿팅 범위가 1 ㎝ ×1 ㎝ 인 경우, 기판 1 장당 15 ㎕ 로 하였다.

이어서 예비혼성화용 용액을 95℃ 에서 5 분간 열 변성하고, 4℃ 까지 급냉하였다. 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스 중의 미리 DNA 를 스폿팅한 장소에, 예비혼성화용 용액을 적하하고, 기포가 들어가지 않도록 커버 글라스를 살짝 얹었다. 이렇게 하여 연어 DNA 로 스폿 부위 이외의 슬라이드 글라스 표면을 차단하였다 (도 5 참조).

다음에 타이트 박스를 인큐베이터에서 꺼내 NaCl 포화 수용액에 접촉하지 않 도록 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 넣고 (바닥을 올린 후에 얹고), 다시 인큐베이터에 넣어 반응을 진행시키기 위해 1 시간 방치하였다.

다음에 세정하였다. 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 인큐베이터에서 꺼내고, 200 ㎖ 비이커에 넣은 1 ×SSC 용액 중에서 커버 글라스를 떼어냈다. 다음에 1 ×SSC 와 0.2% SDS 를 넣은 배트 내에 표면을 위로 하여 넣고, 진탕기를 사용하여 5 분간 진탕하였다 (도 6). 그 후 1 ×SSC 와 0.2% SDS 를 버리고 다시 한번 1 ×SSC 와 0.2% SDS 를 넣고 5 분간 진탕하였다. 다시 한번 동일하게 1 ×SSC 와 0.2% SDS 로 세정한 후, 0.1 ×SSC 로 가볍게 린스하고, 블로어를 사용하여 기판 표면의 용액을 제거하였다.

(6) 혼성화

연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스 (예비혼성화 완료) 커버 글라스, 타겟 DNA, 20 ×SSC, 1 ×SSC, 10% SDS, 포름아미드, 멸균수, 200㎕ 에펜도르프 튜브, 배트, 진탕기, 200 ㎖ 비이커, 블로어, 형광표식 키트, 포화 NaCl 수용액, 타이트 박스, 인큐베이터를 준비하였다.

먼저 포화 NaCl 수용액을 넣은 타이트 박스를 37℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고, 타이트 박스 전체가 37℃ 가 될 때까지 약 1 시간 방치하여 조습 챔버를 준비하였다.

다음에 DNA 샘플의 형광표식을 실시하였다. 형광표식은 형광표식 라벨 키트에 따라 실시하거나, 또는 역전사효소 반응을 이용하여 형광표식할 수 있다.

이어서 1 ㎍/㎕ 의 형광표식 DNA 샘플 2 ㎕ 을 반응 튜브에 넣고, 48 ㎕ 의 멸균수를 첨가하였다. 그 후 20 ×SSC 를 25 ㎕, 10% SDS 를 5 ㎕, 포름아미드를 20 ㎕ 첨가하고 교반하여 혼성화용 용액을 제조하였다.

혼성화용 용액을 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스에 적하하고, 기포가 들어가지 않도록 커버 글라스를 살짝 얹었다. 다음에 타이트 박스를 인큐베이터에서 꺼내, NaCl 포화 수용액에 접촉하지 않도록 상기 슬라이드 글라스를 넣고 (바닥을 올린 후에 얹고), 다시 인큐베이터에 넣고 1 시간 방치하였다. 이와 같이 하여 형광표식된 DNA 가 기판 상에 미리 스폿팅된 DNA 를 혼성화시켰다 (도 7 참조).

마지막으로 세정하였다. 기판을 인큐베이터에서 꺼내고, 200 ㎖ 비이커에 넣은 1 ×SSC 용액 중에서 커버 글라스를 떼어냈다. 다음에 1 ×SSC 와 0.2% SDS 를 넣은 배트 내에 표면을 위로 하여 넣고, 진탕기를 사용하여 5 분간 진탕하였다. 다시 한번 동일하게 1 ×SSC 와 0.2% SDS 로 세정한 후, 0.1 ×SSC 로 가볍게 린스하고, 블로어를 사용하여 기판 표면의 용액을 제거하였다.

(7) 검출

검출은 형광 화상 판독용 스캐너를 준비하여, 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스 표면의 DNA 와 혼성화한 DNA 의 형광표식의 형광화상을 판독함으로써 실시하였다.

또한 상기 설명에서는 DNA 의 검출에 대해 설명하였으나, DNA 대신에 단백질의 검출을 실시하는 것도 동일하게 가능하다.

(실시예 2)

실시예 1 과 동일한 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 사용하여 실시예 1 과 동일한 활성화를 실시하였다. 스폿팅은 실시예 1 에서 사용한 용액 중, 포름아미드 대신에 10% 글리세린을 사용하였다.

(4) 인큐베이션

인큐베이션은 NaCl 포화 수용액을 넣은 타이트 박스를 4℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고 타이트 박스 전체가 4℃ 로 될 때까지 약 1 시간 방치하였다. 타이트 박스를 인큐베이터에서 꺼내, NaCl 포화 수용액에 접촉하지 않도록 기판을 넣고 (바닥을 올린 후에 얹고), 다시 인큐베이터에 넣고 1 시간 방치하였다. NaCl 포화 수용액을 넣은 타이트 박스를 65℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고 1 시간 방치하여 건조시켰다. 건조 후, 20 ×SSC 와 10% SDS 를 함유한 버퍼액으로 세정하였다. 또한 실시예 1 에서 실시한 예비혼성화는 실시하지 않았다.

(6) 혼성화

연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스, 커버 글라스, 타겟 DNA, 20 ×SSC, 1 ×SSC, 10% SDS, 포름아미드, 멸균수, 200㎕ 에펜도르프 튜브, 배트, 진탕기, 200 ㎖ 비이커, 블로어, 형광표식 키트, 포화 NaCl 수용액, 타이트 박스, 인큐베이터를 준비하였다.

먼저 포화 NaCl 용액을 넣은 타이트 박스를 45℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고 타이트 박스 전체가 45℃ 가 될 때까지 약 1 시간 방치하여 조습 챔버를 준비하였다. 이후의 처리는 실시예 1 과 동일하게 실시하였다.

검출도 실시예 1 과 동일하게 실시하였다. 또한 DNA 의 검출에 대해 설 명하였으나, DNA 대신에 단백질의 검출을 실시하는 것도 마찬가지로 가능하다.

(실시예 3)

(4) 인큐베이션

인큐베이션은 NaCl 포화 수용액을 넣은 타이트 박스를 4℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고 타이트 박스 전체가 4℃ 로 될 때까지 약 1 시간 방치하였다. 타이트 박스를 인큐베이터에서 꺼내, NaCl 포화 수용액에 접촉하지 않도록 기판을 넣고 (바닥을 올린 후에 얹고), 다시 인큐베이터에 넣고 1 시간 방치하였다. NaCl 포화 수용액을 넣은 타이트 박스를 65℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고 1 시간 방치하여 건조시켰다. 기판 표면에 농도 0.5% 의 아가로스 겔을 얹은 후, 기판을 타이트 박스 내에 넣고, 타이트 박스를 45℃ 인큐베이터에 12 시간 넣었다.

2 ×SSC 와 0.2% SDS 를 함유한 버퍼 용액으로 세정한 후, 다시 0.1 ×SSC 로 세정하였다. 마지막에 70% 에탄올 용액으로 세정하였다. 또한 실시예 1 에서 실시한 예비혼성화는 실시하지 않았다.

(6) 혼성화

먼저 포화 NaCl 수용액을 넣은 타이트 박스를 45℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고 타이트 박스 전체가 45℃ 가 될 때까지 약 1 시간 방치하여 조습 챔버를 준비하였다. 이후의 처리는 실시예 1 과 동일하게 실시하였다.

검출도 실시예 1 과 동일하게 실시하였다. 또한 DNA 의 검출에 대해 설명하였으나, DNA 대신에 단백질의 검출을 실시하는 것도 마찬가지로 가능하다.

(실시예 4)

실시예 1 과 동일한 연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스를 사용하여, 실시예 1 과 동일한 활성화 키트를 실시하였다. 스폿팅은 실시예 1 에서 사용한 포름아미드를 첨가하지 않고 초순수만으로 제조하였다.

(4) 인큐베이션

인큐베이션은 50% 포름아미드 수용액을 넣은 타이트 박스를 60℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고, 타이트 박스 전체가 60℃ 가 될 때까지 약 1 시간 방치하였다. 타이트 박스를 인큐베이터에서 꺼내고, 50% 포름아미드 수용액에 접촉하지 않도록 기판을 넣고 (바닥을 올린 후에 얹고), 다시 인큐베이터에 넣어 3 시간 방치하였다. 2 ×SSC 와 0.2% SDS 를 함유한 버퍼 용액으로 세정한 후, 다시 0.1 ×SSC 로 세정하고, 멸균수로 세정한 후에 블로어로 건조시켰다. 다음에 예비혼성화 용액 (5 ×덴하르트액, 50% 포름아미드) 을 기판에 적하하고, 기포가 들어가지 않도록 커버 글라스를 살짝 얹었다. 타이트 박스를 60℃ 로 설정한 인큐베이터에서 꺼내, 50% 포름아미드에 접촉하지 않도록 기판을 넣었다. 기판이 들어간 타 이트 박스를 60℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고, 1 시간 예비혼성화를 실시하였다.

0.1 ×SSC 로 커버 글라스를 세정하고 멸균수로 15 분간 세정하였다. 그 후 블로어로 표면 용액을 제거하였다.

(6) 혼성화

연다이아몬드 코팅 슬라이드 글라스 (예비혼성화 완료), 커버 글라스, 타겟 DNA, 20 ×SSC, 1 ×SSC, 10% SDS, 포름아미드, 멸균수, 200㎕ 에펜도르프 튜브, 배트, 진탕기, 200 ㎖ 비이커, 블로어, 형광표식 키트, 50% 포름알데히드 수용액, 타이트 박스, 인큐베이터를 준비하였다.

먼저 50% 포름알데히드 수용액을 넣은 타이트 박스를 45℃ 로 설정한 인큐베이터에 넣고, 타이트 박스 전체가 45℃ 가 될 때까지 약 1 시간 방치하여 조습 챔버를 준비하였다. 이후의 처리는 실시예 1 과 동일하게 실시하였다.

본 발명의 활성화 키트를 사용함으로써 A 액과 B 액을 제조하여 한 단계의 반응만으로 기판을 활성화할 수 있으므로, 기판을 간편하고 또한 신속하게 활성화할 수 있다.

또 본 발명의 DNA 또는 단백질의 검출 방법에 의하면 예비혼성화를 실시하므로, 여분의 활성점에도 DNA 가 부착되지 않아 정확한 DNA 검출이 가능하다.

또한 겔 용액을 사용하여 인큐베이션을 실시하면 안정적이고 촉진된 고정화 반응이 실시되므로, 정확한 DNA 또는 단백질의 검출이 가능하다.

따라서 본 발명은 의료 분야에서의 질병진단, 생화학, 분자생물학 분야에서의 연구 등 각 분야에서 유용하다.

Claims

인산 버퍼 (pH 6) 및 N-히드록시숙신이미드로 이루어지는 용액 A 와, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드로 이루어지는 용액 B 를 주성분으로 하는, 유리, 플라스틱, 실리콘 등의 지지체에 표면처리층을 형성하고, 다시 화학적 수식을 실시한 기판의 활성화 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 용액 A 가 인산 버퍼 (pH 6) 0.01∼5 M 및 N-히드록시숙신이미드 1∼500 mM (0.115∼57.5 g/ℓ) 의 수용액인 활성화 키트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 용액 B 가 1-[3-(디메틸아미노)프로필]3-에틸카르보디이미드가 0.05∼10 M (9.59∼1918 g/ℓ) 의 디옥산 용액인 활성화 키트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 용액 A 50∼99 용량% 에 대해, 용액 B 1∼50 용량% 를 배합하여 사용하는 활성화 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 기판이 다이아몬드-라이크 카본의 표면처리층을 갖는 슬라이드 글라스에 화학적 수식을 실시한 기판인 것을 특징으로 하는 기판의 활성화 키트.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 화학적 수식이 말단에 수산기, 카르복실기, 에폭시기, 아미노기를 갖는 것을 특징으로 하는 기판의 활성화 키트.
제 1 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 화학적 수식이 기판을 암모니아 가스 중에서 플라스마에 의해 아민화하는 것을 특징으로 하는 기판의 활성화 키트.
제 1 항에 기재된 활성화 키트를 사용하여 활성화한 기판에 DNA 또는 단백질을 스폿팅한 후이고, 스폿팅된 DNA 또는 단백질에 대한 형광표식 DNA 의 혼성화를 실시하시 전에, 스폿팅 부위 이외의 기판 표면을 차단하는 예비혼성화를 실시하는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 8 항에 있어서, 예비혼성화가 기판 표면에 스폿팅된 DNA 또는 단백질과는 상이한 DNA 또는 단백질을 고정화하는 것에 의한 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 1 항에 기재된 활성화 키트를 사용한 기판의 활성화 공정, 활성화된 기판에 대한 DNA 또는 단백질의 스폿팅 공정, 스폿팅 후의 기판의 건조 공정, 스폿팅 부위 이외의 기판 표면을 차단하는 예비혼성화 공정, 스폿팅된 DNA 또는 단백질에 대한 형광표식 DNA 의 혼성화 공정 및 혼성화 부위의 형광 부위 검출 공정의 각 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 1 항에 기재된 활성화 키트를 사용한 기판의 활성화 공정, 활성화된 기판에 대한 DNA 또는 단백질의 스폿팅 공정, 스폿팅 후의 기판의 인큐베이션 공정, 스폿팅 부위 이외의 기판 표면을 차단하는 예비혼성화 공정, 스폿팅된 DNA 또는 단백질에 대한 형광표식 DNA 의 혼성화 공정 및 혼성화 부위의 형광 부위 검출 공정의 각 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 10 항에 있어서, 예비혼성화 공정이 기판 표면에 스폿팅된 DNA 또는 단백질과는 상이한 DNA 또는 단백질을 고정화하는 공정인 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 1 항에 기재된 활성화 키트를 사용한 기판의 활성화 공정, 활성화된 기판에 대한 DNA 또는 단백질의 스폿팅 공정, 스폿팅 후의 기판의 인큐베이션 공정, 스폿팅된 DNA 또는 단백질에 대한 형광표식 DNA 의 혼성화 공정 및 혼성화 부위의 형광 부위 검출 공정의 각 공정으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 공정이 겔로 이루어지는 용액으로 처리하는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 겔로 이루어지는 용액이 흡수성 고분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 흡수성 고분자가 아가로스, 젤라틴, 가교 폴리에틸렌옥사이드인 것을 특징으로 하는 DNA 또는 단백질의 검출 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 겔로 이루어지는 용액이 단백질, 연어 정자 DNA, 데옥시리보뉴클레오티드 3 인산, 덴하르트액을 함유하는 것을 특징으로 하는 DNA 또는 단백질의 검출 방법.