WO2002012891A1 - Coffret d'activation de substrat et procede de detection d'adn ou similaire a l'aide dudit coffret - Google Patents

Coffret d'activation de substrat et procede de detection d'adn ou similaire a l'aide dudit coffret Download PDF

Info

Publication number
WO2002012891A1
WO2002012891A1 PCT/JP2001/005246 JP0105246W WO0212891A1 WO 2002012891 A1 WO2002012891 A1 WO 2002012891A1 JP 0105246 W JP0105246 W JP 0105246W WO 0212891 A1 WO0212891 A1 WO 0212891A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
substrate
solution
protein
spotting
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/005246
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hiroshi Okamura
Michifumi Tanga
Kaoru Yamakawa
Mitsuyoshi Ohba
Kenichi Takagi
Original Assignee
Toyo Kohan Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Kohan Co., Ltd. filed Critical Toyo Kohan Co., Ltd.
Priority to KR1020037001769A priority Critical patent/KR100544850B1/ko
Priority to EP01941108A priority patent/EP1310793A4/en
Priority to JP2002517524A priority patent/JP4730808B2/ja
Priority to US10/344,166 priority patent/US7078172B1/en
Priority to AU2001274560A priority patent/AU2001274560A1/en
Publication of WO2002012891A1 publication Critical patent/WO2002012891A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica

Definitions

  • the present invention relates to a kit for activating a substrate which is useful in the medical field, research fields such as biochemistry and molecular biology, and a method for detecting DNA or protein using the kit.
  • Gene analysis is useful in the fields of molecular biology and biochemistry, and has recently been used in the medical field, such as disease detection.
  • DNA can be immobilized on a substrate by applying a polymer such as poly-V gin to the surface of a slide glass or silicon substrate and then immobilizing the DNA, or by synthesizing DNA on the substrate using a semiconductor technology such as photolithography. Etc.
  • the immobilized state of the DNA was unstable, so that a problem occurred when the DNA was peeled off in the hybridization step or the washing step.
  • a method of using a semiconductor technology is the complexity of the manufacturing process to be very expensive, earthenware pots
  • the present inventors have already modified the surface of a substrate and activated it with an activated ester group such as N-hydroxysuccinimide ester or p- 12-nitrophenolenate. Then, they found that DNA could be fixed stably. However, such chemical modification required complicated operations involving several chemical reactions.
  • an extra active site may remain even after spotting DNA on the substrate.
  • the present invention solves the above-mentioned conventional problems in the immobilization of DNA and the like, and provides a method for immobilizing DNA and the like on a substrate simply and with high density and firmness as in the conventional method, and an accurate method. And a method for detecting DNA and the like. . DISCLOSURE OF THE INVENTION
  • the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, have found that the substrate can be easily activated simply by mixing two types of solutions.
  • the kit for activating a substrate of the present invention comprises a solution A comprising a phosphate buffer (pH 6) and N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide), 1- [3- (dimethylamino) propyl] 3 -Ethylcarbodimid (1- [3- (dimethylamino) propyl] 3-ethylcai-bodiimide)
  • the main component is a force and a solution B.
  • the solution A contains a phosphate buffer (pH 6): 0.0 :! N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide):
  • An aqueous solution of 1 to 50 OmM (0.115 to 57.5 g L) is a second feature.
  • the solution B has a 1- [3- (dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide (1- [3- (dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide) power S 0. .05-:
  • the third feature is that it is a 10M (9.59-19-18 g / L) dioxane solution.
  • the fourth feature of the substrate activation kit of the present invention is that solution B: 1 to 50% by volume is blended with solution A: 50 to 99% by volume.
  • the method for detecting DNA or protein of the present invention is a method for hybridizing a fluorescently-labeled DNA to a spotted DNA or protein after spotting DNA or protein on a substrate activated using an activation kit. Prior to performing the hybridization, a pre-hybridization for masking the substrate surface other than the spotting site is performed.
  • the DNA or protein detection method of the present invention is characterized in that the prehybridization immobilizes a DNA or protein different from the DNA or protein spotted on the substrate surface.
  • the method for detecting a DNA or protein of the present invention comprises the steps of activating a substrate using an activation kit, spotting a DNA or protein on the activated substrate, incubating the substrate after spotting, or Drying step, pre-hybridization step of masking the substrate surface other than the spotting site, hybridization step of fluorescently labeled DNA to spotted DNA or protein, and fluorescent site detection step of the hybridization site
  • the process consists of the following steps.
  • the DNA or protein detection method of the present invention is characterized in that the pre-hybridization step is a step of immobilizing a DNA or protein different from the DNA or protein spotted on the substrate surface.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a substrate whose surface is active-esterified.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a reaction for immobilizing DNA on a substrate surface.
  • FIG. 3 is a diagram showing a spotting process.
  • Figure 4 is a sectional view of the tight box.
  • FIG. 5 is a diagram showing a pre-hybridization process.
  • FIG. 6 is a diagram showing a cleaning step.
  • FIG. 7 is a diagram showing a hybridization process.
  • the substrate used in the present invention is formed by forming a surface treatment layer on a support such as glass, plastic, or silicon, and further subjecting the substrate to a biological modification such as a DNA probe, a protein, or a peptide by carrying out a chemical modification. It is characterized in that DNA fragments, proteins, peptides, etc. are firmly fixed without being washed away even when the substrate is washed, and the fluorescent spot becomes clear when irradiated with fluorescent light.
  • the surface treatment layer is preferably made of any one of diamond, soft diamond, and carbon-based material, a mixture thereof, or a laminate of them.
  • carbides such as hafnium carbide, niobium carbide, silicon carbide, tantalum carbide, thorium carbide, titanium carbide, uranium carbide, tungsten carbide, zirconium carbide, molybdenum carbide, chromium carbide, and vanadium carbide may be used.
  • soft diamond is a general term for imperfect diamond structures, such as so-called diamond-like carbon (DLC), which are a mixture of diamond and carbon, and the mixing ratio is not particularly limited.
  • DLC diamond-like carbon
  • An example of such a substrate is a substrate in which soft diamond is formed on a slide glass.
  • the thickness of the surface treatment layer is 1 nm to 100 nm.
  • Such a substrate is preferably prepared by ionization vapor deposition in a mixed gas containing the diamond-like carbon containing 1 to 99% by volume of hydrogen gas and 99 to 1% by volume of the remaining methane gas.
  • a single layer of Ti, Au, Pt, Nb, WC, etc. or a composite film thereof may be formed as a reflective layer on the front and back surfaces of such a substrate.
  • the thickness of the reflective layer is preferably 100 nm or more, since the thickness of the reflective layer must be evenly covered. It is more preferably at least 100 nm.
  • the surface of the glass substrate is intentionally roughened with Ra (JISB 0601) in the range of lnm to 100Onm. Such a roughened surface increases the surface area of the substrate, and is convenient for immobilizing a large amount of DNA probes and the like at a high density.
  • Ra JISB 0601
  • the surface treatment layer of the substrate is manufactured by a known method, for example, a microwave plasma CVD method, an ECR CVD method, an IPC method, a DC sputtering method, an ECR sputtering method, an ion plating method, an arc ion plating method, an EB evaporation method, Resistance heating evaporation, ionization evaporation, arc evaporation, laser evaporation, and the like can be used.
  • a microwave plasma CVD method for example, a microwave plasma CVD method, an ECR CVD method, an IPC method, a DC sputtering method, an ECR sputtering method, an ion plating method, an arc ion plating method, an EB evaporation method, Resistance heating evaporation, ionization evaporation, arc evaporation, laser evaporation, and the like can be used.
  • the substrate not only has a structure with a surface treatment layer formed on the support, but also synthetic diamond, high-pressure synthetic diamond, natural diamond, metals such as gold, silver, copper, aluminum, and tungsten, plastics such as polycarbonate and fluorine resin, Alternatively, a resin may be mixed with a metal powder or a ceramic powder as a binder to form a bond. Alternatively, raw materials such as metal powders and ceramic powders may be compacted using a press forming machine and then sintered at a high temperature. Also, the composite of diamond with other substances It may be a body (for example, a two-phase body).
  • the shape of the substrate is not particularly limited, such as a flat plate, a thread, a sphere, a polygon, and a powder.
  • the surface of the substrate is further chemically modified to fix DNA and proteins.
  • a group in which an activated ester group is bonded to the terminal of a hydrocarbon group is immobilized on the surface of the support via an amide bond.
  • Such chemical modification facilitates immobilization of biological substances such as DNA, proteins, and peptides on the surface of the substrate.
  • Other chemical modifications are based on replacing the surface of the solid support with a hydrocarbon group having a polar group at the end, for example, a hydroxyl group, a carboxyl group, an epoxy group, an amino group, a thiol group, an isocyanate group, or the like.
  • hydrocarbon group those having 1 to 12 carbon atoms, particularly those having 1 to 6 carbon atoms are preferable.
  • monocarboxylic acids such as formic acid, acetic acid, and propionic acid
  • dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, and fumanoleic acid
  • polycarboxylic acids such as trimellitic acid.
  • oxalic acid and succinic acid are preferred.
  • Chemical modification methods include, for example, irradiating the support with ultraviolet light in chlorine gas to chlorinate the surface, then irradiating the support with ultraviolet light in ammonia gas to amination, and then using an appropriate acid chloride or acid anhydride. To lipoxylation.
  • the surface is not chlorinated, but is aminated by plasma in ammonia gas, and then carboxylated using acid chloride or acid anhydride.
  • Activation kit of the present invention a phosphate buffer (p H 6) and N- human Dorokishisu Kushin'imi de (N-hydroxysuccinimide) consisting of a solution A (solution), 1- [3- (dimethyl Chiruamino) propyl] 3 - It consists of solution B (dioxane solution), which consists of ethyl carposimide (l- [ 3- (dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide).
  • N-hydroxysuccinimide instead of N-hydroxysuccinimide, N-hydroxysuccinimide can also be used.
  • a soft diamond having a carboxyl group introduced into the substrate surface A slide glass coated with mond (soft diamond-coated slide glass) or the like is activated with N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide) to obtain a substrate as shown in Fig. 1.
  • phosphate buffer (pH6) in solution A (aqueous solution) is 0.01 to 5 M, whereas that of N-hydroxysuccinimide is 1 to 50 M.
  • OmM 0.1 15-57.5 g / L).
  • phosphate buffer for example, prepare a 0.1M potassium dihydrogen phosphate solution and a 0.1M dihydrogen phosphate phosphate solution, and monitor the ⁇ of the dihydrogen phosphate phosphate solution. Can be adjusted by adding dihydrogen phosphate solution until pH 6
  • dioxane solution dioxane solution
  • dioxane is added with 1- [3- (dimethylamino) propylinole] 3-ethylcarbodiimide (1- [3- (dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide).
  • ⁇ A mixture added with a concentration of L0M (9.59-1918 g / L) is used.
  • the mixing ratio of the solution A and the solution B is preferably 50 to 99% by volume of the solution A, and preferably 1 to 50% by volume of the solution 8.
  • the substrate is immersed in the mixed solution, and reacted at 4 to 50 ° C for 5 to 120 minutes, preferably with stirring.
  • Carboxyl groups on the surface of a substrate such as a soft diamond-coated slide glass are activated with N-hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide). That is, after activating the diamond surface, primary amino contained in the base of DNA is activated. It can be amide-bonded to a group (Fig. 2).
  • the activated substrate is washed with sterilized water or the like.
  • DNA can be detected through the following steps using the substrate activated by the activation kit as described above.
  • DNA is attached to a substrate activated by the activation kit of the present invention as follows (spotting).
  • a DNA solution using ultrapure water so that the concentration will be 0.01 to 10 g / ⁇ L.
  • SSC or TE can also be used as a spotting buffer.However, if a 1 to 5% 0% formamide solution, or a 1 to 50% glycerin solution, or a 1 to 50% DMSO solution is used, the viscosity increases. The spot can be stably formed, and the evaporation can be further suppressed.
  • a spotting solution is spotted on the activated substrate using a spotter.
  • the spotting solution may be heat-denatured or denatured to turn the DNA double strand into a single strand, followed by rapid cooling.
  • the spotting solution is absorbed with a spotter needle (a in Fig. 3), pressed against the substrate (b), and the DNA solution is pressed against the substrate (c). .
  • spotter needle a in Fig. 3
  • Incubation is desirably performed at high humidity.
  • the incubation can be performed using a tight box shown in FIG. Fill the tight box with a saturated NaC1 solution, and adjust the humidity to a constant level. For example, place in an incubator set at 0 to 80 ° C and wait until the entire tight box is around 0 to 80 ° C. By leaving it in. Preferably it is about 45 to 70 ° C.
  • the saturated NaCl solution can be, for example, a 50% aqueous solution of formamide.
  • water or a potassium chloride solution can also be used.
  • the temperature of the incubator can be in the range of 0 to 80 ° C, but it is preferably about 45 to 70 ° C in order to further promote the immobilization reaction.
  • the substrate is not exposed to NaC 1 saturated water or a 50% aqueous solution of formamide.
  • it can be placed on a raised floor as shown in Fig. 4.
  • the incubation is preferably performed for about 0.1 to 24 hours.
  • the mixture After the incubation, it is preferable to leave the mixture in a constant temperature room at 65 to 90 ° C for 1 hour or more to dry it.
  • a more stable and more accelerated immobilization reaction can be obtained.
  • a water-absorbing polymer such as agarose, gelatin, or cross-linked polyethylene oxide is preferable.
  • those having a blocking effect such as proteins such as albumin, salmon sperm DNA, deoxyribonucleotide triphosphate, and Denhardt's solution are preferable.
  • the concentration of the gel solution is preferably in the range of 0.01 to 99%. More preferably, the range is 0.3 to 3%.
  • the prepared gel fragment is placed on the spot where DNA is spotted, and the reaction can proceed in a humidity control chamber set at 0 to 80 ° C. At this time, it is desirable to dry the substrate in a constant temperature room at 40 to 80 ° C before loading the gel in order to suppress the flow of DNA.
  • the substrate is cleaned.
  • the substrate is immersed in a vat filled with a cleaning solution (eg, 2 X SSC, 0.2% SDS).
  • a cleaning solution eg, 2 X SSC, 0.2% SDS.
  • a thin washing solution eg, 0.1 X SSC
  • the next pre-hybridization step is not required.
  • pre-hybridization for masking extra active sites is performed on the substrate after the incubation as a pre-treatment for hybridization.
  • bovine serum albumin BSA
  • casein salmon sperm DNA
  • Denhardt's solution etc.
  • 20 XSSC 20 XSSC, SDS, formamide, etc.
  • a solution for pre-hybridization When DNA such as salmon sperm DNA is contained in the solution for prehybridization, heat and quench to make the two strands into one strand by heat denaturation.
  • a prehybridization solution is a solution obtained by adding Denhardt's solution and formamide to a solution (5X denhanolate solution, 50% formamide). A solution for prehybridization is dropped onto the spot where the DNA has been spotted in advance on the substrate, and the cover glass is gently placed so that air bubbles do not enter.
  • the pre-hybridization is preferably performed for 0.1 to 24 hours. It is desirable that the pre-hybridization is performed at a high humidity so that the pre-hybridization solution does not dry out. (4) The humidity control chamber as described in the section of the incubation can be used.
  • the soft box is coated with soft diamond so as not to touch NaC1 saturated water or 50% formamide solution. Insert the slide glass (put it up on the bottom) and put it back into the incubator. Thus, the surface of the slide glass other than the spot is masked with DNA unrelated to DNA spotted on the substrate (Fig. 5). Next, cleaning is performed. For example, put the substrate in 0.1 XSSC solution and remove the cover glass. Next, after washing with sterilized water using a shaker or the like, the substrate is dried using a centrifuge or a blower.
  • the substrate is dried in a constant temperature chamber at 30 ° C to 80 ° C for 0.1 to 24 hours, and then a washing solution (for example, 2 ⁇ SSC Wash thoroughly in a vat with 0.2% SDS), rinse with a rinse solution (eg, 0.1 X SSC), dry, and do not perform if the activated ester is completely hydrolyzed and deactivated. May be. However, if the inactivation is insufficient, the DNA will be immobilized to a part other than the spot in the subsequent hybridization step, so the prehybridization step should be performed to obtain reliable results. Is preferred.
  • the target DNA sample is fluorescently labeled using the force or reverse transcriptase reaction performed according to the fluorescent labeling kit.
  • the spotting step if the spotting solution is not denatured by heat or alkali and spotted with double strands, the DNA on the substrate is denatured by heat.
  • the substrate After completion of the pre-hybridization step (5), the substrate is immersed in hot water for 3 to 5 minutes, and then cooled with ice. This step is not necessary if spotting is performed after denaturing the spotting solution with heat or alkali.
  • the prepared hybridization solution is dropped onto the DNA spot where the DNA was spotted, and the cover glass is gently placed to prevent air bubbles from entering.
  • the fluorescently labeled DNA hybridizes to the DNA pre-spotted on the substrate.
  • cleaning is performed.
  • remove the cover glass of the substrate with 0.1 XSSC solution and then wash it twice in a vat with a cleaning solution (for example, 2 X SSC, 0.2% SDS), and then rinse it with a rinse solution (for example, 0.1 X SSC) and dry using a centrifuge or a blower.
  • a cleaning solution for example, 2 X SSC, 0.2% SDS
  • a rinse solution for example, 0.1 X SSC
  • Detection can be carried out by reading the fluorescent label of DNA hybridized with DNA on the substrate surface using a fluorescent image reading scanner or the like.
  • a gas mixture of 95% by volume of methane gas and 5% by volume of hydrogen gas was used as a raw material by ionization deposition to obtain a DLC film.
  • a slide glass having a thickness of 25 nm was prepared.
  • the glass substrate surface was aminated by irradiating it with a high-pressure mercury lamp in an ammonia atmosphere for 10 minutes, and further immersed in a solution of succinic anhydride in N_methylpyrrolidone for 60 minutes.
  • a soft diamond coat slide glass having a carboxyl group on the substrate surface was obtained.
  • the immobilization of DNA on a soft diamond-coated slide glass is achieved by adding N-hydraxysuccinimide to the canolepoxyl group on the surface. And after the activated esterification.
  • An amide bond is formed between the N-hydroxysuccinimide active ester group on the diamond surface and the primary amino group contained in the DNA base.
  • Activation is performed using an activation kit.
  • the following solution composition was used for the activation kit.
  • a phosphate buffer (pH 6) was prepared as follows.
  • the activated substrate it is preferable to use the activated substrate as soon as possible so that the activity does not decrease.
  • the substrate can be activated without using the activation kit.
  • it is performed as follows.
  • the substrate surface is activated. Prepare the following:
  • active esterification N-hydroxysuccinimide active esterification of the carboxyl group
  • the composition of the activating solution was as follows.
  • DNA was attached to the activated substrate (so-called spotting).
  • spotting the following items were prepared.
  • the DNA sample was dissolved in a 10% formamide solution (spotting buffer) to a concentration of 1 ⁇ g / zz L to prepare a spotting solution.
  • the spotting solution was heat denatured at 95 ° C for 5 minutes and quenched to 4 ° C.
  • the solution was absorbed with a spotter needle (a in Fig. 3), pressed against the surface of a soft diamond-coated slide glass (b), and the DNA solution was pressed against the substrate (f). In this way, a large number were attached to the slide glass surface (d).
  • a soft diamond coat slide glass, a saturated NaCl aqueous solution, a tit box, and an incubator were prepared. Place the tight box containing the saturated NaCl solution (eg, water + formamide (1: 1) solution) in an incubator set at 4 ° C until the entire box is at 4 ° C. It was left for 1 hour to prepare a humidity control chamber.
  • saturated NaCl solution eg, water + formamide (1: 1) solution
  • Soft diamond-coated slide glass cover glass, salmon DNA, 20XSSC, 1XSSC, 10% SDS, formamide, sterile water, 1.5mL reaction tube, 200 / L
  • the following operations were performed using an Ezbendorf tube, a knot, a shaker, a 20-mL beaker, a blower, a saturated NaC1 aqueous solution, a tit box, and an incubator.
  • Salmon DNA (DNA not related to the sample) Weigh the sample into a lmg reaction tube and dissolve in 500 ⁇ L sterile water. Then, add 250 ⁇ L of 20X SSC and 50% of 10% SDS, and add 200 ⁇ L of formamide. After stirring, the required amount was placed in an eppendorf tube to prepare a solution for prehybridization.
  • the ratio is set to 15 / L per substrate.
  • the prehybridization solution was heat denatured at 95 ° C for 5 minutes and rapidly cooled to 4 ° C.
  • a solution for prehybridization was dropped onto a place where DNA was previously spotted on a soft diamond-coated slide glass, and a cover glass was gently placed so that air bubbles did not enter.
  • the surface of the slide glass other than the spot was masked with salmon DNA (see Fig. 5).
  • Soft diamond-coated slide glass pre-hybridized
  • cover glass target DNA
  • 20 XSSC 1 XSSC
  • 10% SDS ⁇ formamide sterile water
  • 200 ⁇ L eppendorf tube vat
  • shaker A 20 OmL beaker, a blower, a fluorescent labeling kit, a saturated NaCl aqueous solution, a tit box, and an incubator.
  • the DNA sample was fluorescently labeled.
  • Fluorescent labeling can be performed using force performed according to the fluorescent labeling kit or reverse transcriptase reaction.
  • the hybridization solution was dropped on a soft diamond-coated slide glass, and the cover glass was gently placed on the slide glass to prevent air bubbles from entering. Then removed Thailand Tobo' box from the incubator, the scan so as not to touch the N a C 1 saturated aqueous Put the glass in the glass (put it on the bottom), put it in the incubator again, and let it stand for 1 hour. In this way, the fluorescently labeled DNA was hybridized to the DNA spotted on the substrate in advance (see FIG. 7).
  • the substrate was removed from the incubator and the power bar glass was removed in a 1 ⁇ SSC solution containing 200 mL of vial. Next, it was placed in a vat with 1 ⁇ SSC and 0.2% SDS face up, and shaken for 5 minutes using a shaker. After washing with 1 ⁇ SSC and 0.2% SDS again, the substrate was lightly rinsed with 0.1 ⁇ SSC and the solution on the substrate surface was removed using a blower.
  • Detection was performed by preparing a fluorescent image reading scanner and reading the fluorescent image of the fluorescent label of the DNA hybridized with the DNA on the surface of the soft diamond-coated slide glass.
  • Example 1 Using the same soft diamond-coated slide glass as in Example 1, activation was performed in the same manner as in Example 1. For spotting, 10% glycerin was used instead of formamide in the solution used in Example 1.
  • Soft diamond-coated slide glass pre-hybridized
  • cover glass target DNA
  • 20 XSSC 1 XSSC
  • 10% SDS formamide
  • sterile water 200 ⁇ L eppendorf tube
  • knot knot
  • shaking A 20 OmL beaker, a blower, a fluorescent labeling kit, a saturated NaCl aqueous solution, a tit box, and an incubator.
  • the tight box containing the saturated NaC1 solution was placed in an incubator set at 45 ° C, and left for about 1 hour until the entire tight box reached 45 ° C to prepare a humidity control chamber. . Subsequent processing was performed in the same manner as in Example 1.
  • Detection was performed in the same manner as in Example 1. Although detection of DNA has been described, it is also possible to detect protein instead of DNA.
  • Example 1 Using the same soft diamond-coated slide glass as in Example 1, activation was performed in the same manner as in Example 1. For spotting, 10% glycerin was used instead of formamide in the solution used in Example 1.
  • Example 1 After washing with a buffer solution containing 2xSSC and 0.2% SDS, further wash with O.lxSSC Was. Finally, it was washed with a 70% ethanol solution. The pre-hybridization performed in Example 1 was not performed.
  • Soft diamond-coated slide glass pre-hybridized
  • cover glass target DNA
  • 20 XS SC 1 XS SC
  • 10% SDS formamide
  • sterile water 200 ⁇ L Etpendorf tube
  • notch A shaker a 20 OmL beaker
  • blower a fluorescent labeling kit
  • saturated NaC1 aqueous solution a tit box
  • an incubator an incubator
  • the tight box containing the saturated NaC1 solution was placed in an incubator set at 45 ° C, and left for about 1 hour until the entire tight box reached 45 ° C to prepare a humidity control chamber. . Subsequent processing was performed in the same manner as in Example 1.
  • Detection was performed in the same manner as in Example 1. Although detection of DNA has been described, detection of protein instead of DNA is also possible.
  • Example 1 Using the same soft diamond-coated slide glass as in Example 1, activation was performed in the same manner as in Example 1. Spotting was performed using only ultrapure water without adding the formamide used in Example 1.
  • a prehybridization solution (5X Denhardt's solution, 50% formamide) is dropped onto the substrate, and the cover ballast is gently placed on the substrate to prevent air bubbles from entering. You.
  • the tight box was taken out of the incubator set at 60 ° C, and the substrate was placed so that it did not touch 50% formamide.
  • the tight box containing the substrate was placed in an incubator set at 60 ° C, and pre-hybridization was performed for 1 hour.
  • the coverslip was washed off with 0.1 X SSC and washed with sterile water for 15 minutes. Thereafter, the ice salt solution was blown off with a blower.
  • Soft diamond-coated slide glass pre-hybridized
  • cover glass target DNA
  • 20XSSC 1XSSC
  • 10% SDS formamide
  • sterile water 200 ⁇ L Eppendorf tube, knot, shaker A spinner, a 20-mL beaker, a blower, a fluorescent labeling kit, a 50% formaldehyde aqueous solution, a tit box, and an incubator were prepared.
  • solution A and solution B can be adjusted and the substrate can be activated by only one-step reaction, so that the substrate can be easily and quickly activated.
  • the method for detecting DNA or protein of the present invention since prehybridization is performed, accurate DNA detection is possible without attaching DNA to extra active sites.
  • the present invention is useful in various fields such as disease diagnosis in the medical field, biochemistry, and research in the field of molecular biology.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Description

明 細 書 基板の活性化キット及びこれを用いた D N A等の検出方法 技術分野
本発明は、 医療分野、 生化学や分子生物学等の研究分野において有用な基板の 活性化キット、 および、 前記キットを用いて D N A又は蛋白質等を検出する方法 に関する。
遺伝子解析は分子生物学、 生化学の分野で有用であり、 近年では病気の発見等 医療分野でも利用されている。
近年 D N Aを固定化した基板が開発され、 遺伝子解析における解析速度が著し く速くなり、 これを応用して、 医療分野においては疾病診断等も行われている。 基板上に D N Aを固定する方法としては、 スライドガラス或いはシリコン基板 表面にポリ Vジン等の高分子を塗布した後に固定する方法、 フォトリソグラフ等 の半導体技術を用いて基板上に D N Aを合成する方法等がある。
- しかし、 ポリリジン等の高分子を塗布して D N Aを固定する方法では、 D N A の固定化状態が不安定なため、 ハイブリッド形成工程や洗浄工程において、 D N Aが剥離するといつた問題が生じていた。
また、 半導体技術を用いた方法は、 製造工程の煩雑さから非常に高価であると レ、う |¾題力 sある。
このような課題を解決すべく、 本発明者らは既に、 基体表面を化学修飾して N ―ヒ ドロキシスクシンィミ ドエステノレ或いは p一二トロフエノーノレエステノレ等の 活性化エステル基で活性化すると、 D N Aを安定して固定可能なことを見いだし ている。 しかし、 このような化学修飾には、 いくつもの化学反応を経る煩雑な操作が必 要であった。
また、 化学修 して活性化された基板は、 基板上に D N Aをスポッティングし た後も余分な活性点がそのまま残っていることがあった。
そのために、 スポッティングした D N Aに、 検出したい D N Aをハイブリダィ ズさせようとすると、 余分な活性点にも D N Aが付着してしまレ、、 正確な D NA 検出ができないという問題もあった。 '
本発明は、 D N A等の固定化における上記従来の問題点を解決し、 基板に D N A等を簡便に、 しかも従来の方法と同様に高密度で且つ強固に固定化するための ' 方法および、 正確に D NA等を検出する方法の提供を目的とする。. 発明の開示
本発明者らは、 上記目的を達成すべく鋭意検討の結果、 2種類の溶液を混合す るだけで簡単に基板の活性化が可能なことを見出した。
また、 基板を活性化して D N A又は蛋白質をスポッティング後、 ハイプリダイ ゼーシヨンする前に、 プレハイブリダイゼーション工程により余分な活性点をマ スキングすることにより、 正確な D N A又は蛋白質等の検出が可能となることを 見出し、 本発明に到達した。 また、 このマスキングはスポッティング後の後処理 工程で乾燥および洗浄を行い、 活性基が十分に失活した場合には、 行わなくても 良いことも見出した。
更に、 ハイブリダイゼーシヨン工程前あるいはプレハイブリダィゼーションェ 程前のインキュベーション工程において、 ゲル溶液を使うことにより、 より正確 な D N A又は蛋白質等の検出が可能となることを見出した。
本発明の基板の活性化キットは、 リン酸バッファー （p H 6 ) 及び N—ヒ ドロ キシスクシンイミ ド (N-hydroxysuccinimide) からなる溶液 Aと、 1- [3- (ジメチル アミ ノ）プロ ピル] 3-ェチルカルボジィ ミ ド （ 1- [ 3- ( dimethylamino) propyl] 3-ethylcai-bodiimide) 力、らなる溶液 Bとを主成分とすることを特徴とする。
本発明の基板の活' I生化キットは、 溶液 Aが、 リン酸バッファー （pH6) ： 0. 0：！〜 5 M及ぴ N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド （N-hydroxysuccinimide) ： 1〜 5 0 OmM (0. 1 1 5〜57. 5 gノ L) の水溶液であることを第 2の特徴とす る。
本発明の基板の活性化キットは、溶液 Bが、 1-[3- (ジメチルァミノ）プロピル] 3- ェチルカルボジイミ ド （1- [3- (dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide) 力 S 0. 05〜： 10M (9. 5 9〜1 91 8 g/L) のジォキサン溶液であることを第 3 の特徴とする。
本発明の基板の活性化キットは、 溶液 A： 50〜99容量％に対し、 溶液 B ： 1〜50容量％を配合して用いることを第 4の特徴とする。
本発明の DNA又は蛋白質の検出方法は、 活性化キットを用いて活性化した基 板に DNA又は蛋白質をスポッティング後であって、 スポッティングされた DN A又は蛋白質への蛍光標識 DN Aのハイブリダィゼーションを行う前において、 スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダイゼーショ ンを行うことを特徴とする。
本発明の DNA又は蛋白質の検出方法は、 プレハイプリダイゼーションが、 基 板表面にスポッティングされた DN A又は蛋白質とは異なる DN A又は蛋白質を 固定化することを特徴とする。
本発明の DNA又は蛋白質の検出方法は、 活性化キットを用いた基板の活性化 工程、 活性化された基板への DNA又は蛋白質のスポッティング工程、 スポッテ ィング後の基板のィンキュベーシヨン工程或いは乾燥工程、 スポッティング部位 以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダィゼーション工程、 スポッティ ングされた DN A又は蛋白質への蛍光標識 DN Aのハイプリダイゼーションェ 程、 及び、 ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検出工程の各工程からなるこ とを特 ί敷とする。 本発明の D N A又は蛋白質の検出方法は、プレハイブリダィゼーション工程が、 基板表面にスポッティングされた D N A又は蛋白質とは異なる D N A又は蛋白質 を固定化する工程であることを特徴とする。 . 図面の簡単な説明 .
図 1は、 表面が活性エステル化された基板の模式図である。 図 2は、 基板表面 に D N Aを固定化する反応の概略を示す図である。 図 3は、 スポッティングのプ 口セスを示す図である。 図 4は、 タイ トボックスの断面図である。 図 5は、 プレ ハイプリダイゼーシヨンのプロセスを示す図である。 図 6は、 洗浄工程を示す図 である。 図 7は、 ハイブリダィゼーシヨンのプロセスを示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明について以下詳細に説明する。
( 1 ) 基板の準備
本発明において用いる基板は、 ガラス、 プラスチック、 シリコンなどの支持体 に表面処理層を形成し、 更に化学修飾を施すことによって、 DNAプローブ、 蛋 白質、 ペプチド等の生体物質等を載せた場合に、 基板を洗浄しても DNA断片、 蛋白質、 ペプチド等が洗い流されずに強固に固定化され、 蛍光照射した際に、 蛍 光スポットが明瞭となることを特徴とする。表面処理層としては、ダイヤモンド、 軟ダイヤモンド、 炭素系物質のいずれか、 それらの混合物、 又はそれらを積層さ せたものであることが望ましい。 また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、 炭化タンタル、 炭化トリウム、 炭化チタン、 炭化ウラン、 炭化タングステン、 炭 化ジルコニウム、 炭化モリブデン、 炭化クロム、 炭化バナジゥム等の炭化物でも よい。 ここで、 軟ダイヤモンドとは、 いわゆるダイヤモンドライクカーボン （D L C ) 等の、 ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造 体を総称し、 その混合割合は、 特に限定しなくても良い。 このような基板の一例としては、 スライドグラスに軟ダイヤモンドを製膜した 基板が挙げられる。
このような基板は、 前記表面処理層の厚みが、 lnm〜 lOOOnmであることが好 ましい。
このような基板は、 前記ダイヤモンドライクカーボンが、 水素ガス 1 〜 99体 積％、 残りメタンガス 99 〜 1 体積％を含んだ混合ガス中で、 イオン化蒸着法に より作成したものであることが好ましい。
また、 このような基板の表裏面に、 反射層として Ti、 Au、 Pt、 Nb、 WC、 等の 単層又はこれらの複合膜を製膜しても良い。 反射層の厚みは、 全体に均一に被覆 されなければならないことから、 lOOnm以上が好ましい。 さらに好ましくは lOOOnm以上である。
なお、 ガラス基体の表面は、 Ra ( J I S B 0 6 0 1 ) で lnm〜 lOOOnmの 範囲で意図的に粗面化されていることも望ましい。 このような粗面化表面は基体 の表面積が増えて、 多量の DNAプローブ等を密度を上げて固定化することに好 都合である。
基板の表面処理層の製造は、 公知の方法、 例えば、 マイクロ波プラズマ C V D 法、 E C R C V D法、 I P C法、 直流スパッタリング法、 E C Rスパッタリング 法、 イオンプレーティング法、 アークイオンプレーティング法、 E B蒸着法、 抵 抗加熱蒸着法、 イオン化蒸着法、 アーク式蒸着法、 レーザ蒸着法などによること ができる。
基板は支持体に表面処理層を形成した構造だけではなく、 合成ダイヤモンド、 高圧合成ダイヤモンド、 天然のダイヤモンド、 金、 銀、 銅、 アルミニウム、 タン ダステン等の金属、 ポリカーボネート、 フッ素榭脂等のプラスチック、 また、 金 属粉末や、 セラミック粉末等に樹脂をパインダ一として混合して結合形成したも のでもよい。 また、 金属粉末やセラミック粉末等の原料をプレス形成機を用いて 圧粉したものを高温で焼結してもよい。 また、 ダイヤモンドと他の物質との複合 体 （例えば、 2相体） であってもよレ、。
基体の形状は平板状、 糸状、 球状、 多角形状、 粉末状など特に問わない。
基体表面には、 DNAや蛋白質を固定するために、 更に化学修飾を施す。 化学 修飾の一例としては、 炭化水素基の末端に活性化エステル基が結合した基を、 支 持体表面にアミ ド結合を介して固定化することをいう。 このような化学修飾によ つて、 DNA、 蛋白質、 ペプチド等の生体物質を基体の表面に固定化しやすくす る。 その他の化学修飾は、 末端に極性基、 例えば、 水酸基、 カルボキシル基、 ェ ポキシ基、 アミノ基、 チオール基、 イソシァネート基等を有する炭化水素基で固 体支持体表面を置換することによる。
前期炭化水素基としては、 炭素数が 1〜 12のもの、 中でも 1〜 6のものが好 ましい。 例えば、 蟻酸、 酢酸、 プロピオン酸などのモノカルボン酸；シユウ酸、 マロン酸、 コハク酸、 マレイン酸、 フマノレ酸などのジカルボン酸； トリメリ ト酸 等の多価カルボン酸が挙げられる。 中でも、 シユウ酸、 コハク酸が好ましい。 化学修飾方法としては、 例えば、 塩素ガス中で支持体に紫外線照射して表面を 塩素化し、 次いでアンモニアガス中で紫外線照射してァミノ化した後、 適当な酸 クロリ ドあるいは酸無水物を用いて力ルポキシル化する。 また、 別の化学修飾方 法として、 表面を塩素化しないで、 アンモニアガス中でプラズマによりアミノ化 した後、 酸クロリ ドあるいは酸無水物を用いてカルボキシルイヒする。
( 2 ) 活性化キット
本発明の活性化キットは、 リン酸バッファー （p H 6 ) 及び N—ヒ ドロキシス クシンイミ ド （N-hydroxysuccinimide) からなる溶液 A (水溶液） と、 1- [3- (ジメ チルァミノ）プロピル] 3-ェチルカルポジィ ミ ド （l- [3- (dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide) からなる溶液 B (ジォキサン溶液） の 2種類からなる。
N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド （N-hydroxysuccinimide) の代わりに： — - ト 口フエノールを使用することもできる。
本発明の活性化キットにより、 基板表面にカルボキシル基を導入した軟ダイャ モンドをコーティングしたスライドグラス （軟ダイヤモンドコートスライドグラ ス） 等を N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド （N-hydroxysuccinimide) で活性ェステ ル化し、 図 1のような基板を得ることができる。
すなわち、 ダイアモンド表面を活性化した後に、 DNAの塩基に含まれる第 1 級ァミノ基とアミ ド結合させることができる （図 2参照）。
溶液 A (水溶液） 中に占める濃度は、 リン酸バッファー （pH6) は、 0. 0 1〜 5 Mであるのに対し、 N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド (N-hydroxysuccinimide) は、 1〜50 OmM (0. 1 1 5— 57. 5 g/L) とすることができる。
リン酸バッファー （PH6) は、 例えば 0. 1M リン酸二水素カリウム溶液 および 0. 1M リン酸水素二力リゥム溶液を用意した上で、 リン酸ニ水素力リ ゥム溶液の ρΗをモニターしながら p H6になるまでリン酸水素二力リゥム溶液 を添加することにより調整することができる
溶液 B (ジォキサン溶液) については、 ジォキサンに、 1- [3- (ジメチルァミノ) プ ロ ピノレ ] 3-ェチルカ ルポ ジイ ミ ド （ 1-[ 3-( dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide) を 0. 05〜： L 0M (9. 59〜 1 918 g/L) の濃度で 添カ卩したものが用いられる。
本発明の活性化キットにおいて、 溶液 Aと溶液 Bとの配合割合は、 溶液 Aが 5 0〜99容量％でぁるのに対し、溶液8が1〜50容量％とすることが好ましい。 ビーカー等の容器中で溶液 Aと Bとを混合後、 混合溶液中に基板を浸漬し、 好 ましくは撹拌しながら、 4〜50°Cで 5〜1 20分間反応させる。 軟ダイヤモン ドコートスライドグラス等の基板表面のカルボキシル基を N—ヒ ドロキシスクシ ンイミ ド （N-hydroxysuccinimide) で活性ェステル化、 すなわち、 ダイアモンド 表面を活性化した後に、 DNAの塩基に含まれる第 1級ァミノ基とアミ ド結合さ せることができる （図 2)。 活性化した基板は、 滅菌水等により洗浄する。
活性化後の基板は、 活性が落ちてしまわないように、 なるべく早く使用するこ とが望ましい。 保管する場合は、 乾燥後、 デシケータ中で保管することが望まし い。
本発明においては、 前記のように活性化キットで活性化した基板を用いて、 以 下の工程を経ることにより、 DNAを検出することができる。
(3) スポッティング工程
本発明の活性化キットにより活性化した基板に、 以下のようにして DNAを貼 り付ける (スポッティング）。
まず、 濃度が 0.01〜 10 g/μ Lとなるように超純水を用いて DNA溶液を 調製する。 また、 スポッティング用バッファ一としては S S Cや TE等も用いる ことができるが、 1〜 5' 0 %ホルムァミ ド溶液あるいは 1 〜 50%グリセリン溶 液、 1〜 50 % DMSO溶液を用いると、 粘性が高くなり安定してスポットでき、 更に蒸発を抑制することが出来る。
続いてスポッティング用溶液を、 活性化された基板上にスポッターを用いてス ポットする。このとき、スポッティング用溶液を熱変性またはアル力リ変性して、 DN A 2本鎖を 1本鎖とし、 急冷してもよい。 このスポッティング用溶液を、 例 えば、 図 3に示すようにスポッターの針で液を吸取り （図 3の a)、 基板に押し 付けて （同 b)、 DNA液を基板に押し付ける （同 c)。 このようにしてスライ ドグラス表面に多種類の DNAを貼り付ける （同 d)。
(4) インキュベ一ション工程
次に、スポッティングした D N Aが基板表面に固定する反応を進行させるベく、 インキュベーションを行う。 DNAの基板への固定化は、 化学反応による共有結 合であるため、 反応を確実に進めるべく、 スポット後に速やかにインキュベーシ ョンを行う必要がある。
インキュベーションは、 高湿化で行うことが望ましいが、 例えば、 図 4に示す タイ トボックスを用いて行うことができる。 タイ トボックスには飽和 N a C 1溶 液を入れ、 湿度を一定に調整した調湿チャンバ一とする。 例えば 0〜 80 °Cに設 定したインキュベーターに入れ、 タイ トボックス全体が 0〜 80 °C前後になるま で放置することによる。 好ましくは 45〜70 °C程度である。 また、 飽和 N a C l 溶液は、 例えば 50%ホルムアミ ド水溶液とすることができる。 N a C 1溶液以 外にも、 水や塩化カリゥム溶液を用いることもできる。
インキュベータ一は 0〜 80 °Cの範囲とすることができるが、 固定化反応をよ り進行させるためには、 45〜 70 °C程度とすることが好ましい。
タイトボックスが調湿チヤンバーとなったら、 スポッティング済みの基板を入 れ、 一定湿度に調整してインキュベーションを行う。
基板は、 N a C 1飽和水あるいは 50 %ホルムァミ ド水溶液にふれないように することが好ましい。例えば図 4のように底上げをした上に載せることができる。 インキュベーションは、 0 . 1〜2 4時間程度行うことが好ましい。
また、 インキュベーション後、 6 5〜9 0 °Cの恒温室の中に 1時間以上放置して 乾燥することが好ましい。
上記のようにィンキュベーシヨンを高湿度雰囲気中で行う方法以外に、 ゲル溶 液を使うことにより、より安定し、より促進した固定化反応を得ることができる。 例えば、 ゲル溶液の成分として、 ァガロース、 ゼラチン、 架橋ポリエチレンォキ サイド等の吸水性の高分子が好ましい。 添加剤として、アルプミン等の蛋白質、 サーモン精子 D N A、 デォキシリボヌクレオチド 3 リン酸、 デンハルト液等ブロ ッキング効果のあるものが好ましい。 ゲル溶液の濃度は、 0 . 0 1〜 9 9 %の範 囲が好ましい。 より好ましくは、 0 . 3 ~ 3 %の範囲が良い。
作成したゲル断片を、 DNAをスポットした場所に載せ、 0〜 80 °Cに設定した 調湿チャンバ一中で反応を進ませることが出来る。 このとき、 DNAの流れ出し を抑制するために、 ゲルを載せる前に、 40〜 80 °Cの恒温室中で、 基板を乾燥さ せることが望ましい。
基板を調湿チャンバ一から出した後に基板の洗浄を行う。 まず洗浄液 (例えば 2 X SSC、 0.2 % SDS)をはったバット中に基板を浸す。 このとき、 DNAをスポッ トした面を上にして入れる。 その後、 振とう機等を用いて振とう洗浄し、 更にも う一度洗浄液を入れ替えて洗浄する。 さらに薄い洗浄液 (例えば 0.1 X SSC)で濯 V、だ後、 遠心機やブロア一を用いて基板を乾燥させる。
なお、 蛋白質等の添加剤を含むゲル溶液を用いてィンキュベーション工程を行 つた場合には、 次のプレハイブリダィゼーション工程は必要ない。
( 5 ) プレハイプリダイゼーシヨン工程
次に、 インキュベーション後の基板にハイブリダィゼーシヨンの前処理として 余分な活性点をマスキングするためのプレハイブリダイゼーションを行う。 プレ ハイブリダイゼーシヨンとしては、 牛血清アルブミン (BSA)、 カゼイン、 サケ精 子 DNA、 デンハルト液等を用いることが出来るが、 これらに 2 0 X S S C、 S D S、 ホルムアミ ド等を加えて溶液を調製し、 プレハイプリダイゼーシヨン用溶 液とする。 プレハイブリダィゼーシヨン用溶液中にサケ精子 D NA等の DNAが 含まれる場合、 熱変性により、 2本鎖を 1本鎖にすべく、 加熱して、 急冷する。
プレハイプリダイゼーション用溶液の一例としては、 溶液にデンハルト液と ホルムアミ ドを加えたもの（5 Xデンハノレト液、 50%ホルムアミ ド）が挙げられる。 基板中の予め D N Aをスポットした場所に、 プレハイブリダィゼーシヨン用溶 液を滴下し、 気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せる。
プレハイプリダイゼーシヨンは、 0 . 1〜2 4時間行うことが好ましい。 プレハイブリダイゼーンヨンは、 プレハイブリダイゼ一シ 3ン溶液が乾燥しな いように高湿で行うことが望ましく、 （4 ) インキュベーションの項で述べたよ うな調湿チャンバ一を利用できる。
タイ トボックスが 0〜 80 °Cに設定したインキュベーター内で調湿チャンバ一 となつた状態で、 （ 4 ) と同様に N a C 1飽和水または 50%ホルムァミ ド溶液に 触れないように軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れ （底上げをした上に 載せる）、 再びインキュベーターに入れる。 こうして、 基板上にスポットした D NAとは無関係な D N Aで、 スポット部位以外のスライドグラス表面がマスキ ングされる （図 5 )。 次に、 洗浄を行う。 例えば、 基板を 0. 1 X S S C溶液に入れて、 カバーグラス をはずす。 次に、 振とう機等を用いて滅菌水で洗浄した後に、 遠心機やブロア一 を用いて基板を乾燥させる。
なお、 このプレハイブリダィゼーション工程は、 ィンキュベーション工程の後 に、 30 °C~ 80 °Cの恒温室中で 0.1〜 24時間基板を乾燥させ、 その後洗浄液（例 えば、 2 X SSC、 0.2% SDS)をはったバット中で十分洗浄し、 リンス液（例えば、 0.1 X SSC)で洗浄して乾燥し、 活性化エステルが完全に加水分解し、 失活した場合 には行わなくても良い。 ただし、 失活が不十分な場合、 後のハイブリダィゼーシ ョン工程においてスポット以外の部分への DNAの固定化が起こるため、 確実な 結果を得るには、 プレハイプリダイゼーション工程を行うことが好ましい。
( 6 ) ハイブリダィゼ一シヨン工程
ターゲットとなる D N Aサンプルを、 蛍光標識ラベルキットにしたがって行う 力 \ あるいは逆転写酵素反応を利用して蛍光標識する。
この蛍光標識 D N Aサンプルに滅菌水、 2 0 X S S C、 S D S、 ホルムアミ ド 等を添加し、 撹拌してハイブリダイゼーション用溶液を調製する。
このとき、 スポッティング工程において、 スポッティング用溶液の熱変性ある いはアルカリ変性を行わず、 2本鎖のままでスポットした場合には、 基板上 DNA の熱変性を行う。 （5)のプレハイプリダイゼーシヨン工程が終了した基板を 3〜5 分間熱水に浸漬し、 その後に氷冷する。 スポッティング溶液を熱変性あるいはァ ルカリ変性してからスポットした場合には、 この工程は必要ない。
作成したハイプリダイゼーション用溶液を基板の DNA をスポットした場所に に滴下し、 気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せる。
ハイプリダイゼーシヨンも高湿で行うことが望ましく、 （4 ) インキュベーシ ョンの項で述べたような調湿チヤンバーを利用できる。
タイ トボックスが 0〜 80 °Cに設定したインキュベーター内で調湿チャンバ一 となつた状態で、 （ 4 ) と同様に N a C 1飽和水あるいは 50 %ホルムアミ ドに触 れないように基板を入れ （底上げをした上に載せる）、 再びインキュベーターに 入れる。
こうして、 図 7のように、 蛍光標識した D N Aが基板上に予めスポッティング した D N Aにハイブリダィズする。
最後に洗浄を行う。 洗浄は基板を 0. 1 X S S C溶液でカバーグラスを外し、 そ の後洗浄液（例えば、 2 X SSC、 0.2% SDS)をはったバット中で 2度繰り返して洗 浄し、 リンス液 (例えば、 0.1 X SSC)で洗浄して遠心機やブロア一を用いて乾燥 する。
( 7 ) 蛍光部位検出工程
検出は、 基板表面の D NAとハイプリダイズした D N Aの蛍光標識を、 蛍光画 像読み取り用スキャナ一等を用いて読み取ることで行うことができる。 実施例
(実施例 1 )
軟ダイヤモンドコートスライドグラスの使用プロ トコルについて説明する。 ( 1 ) 軟ダイヤモンドコートスライドグラスの準備
まず、 25mm (幅） X 75mm (長さ） X 1mm (厚み）のガラス表面に、 イオン化蒸着 法により、 メタンガス 95 体積％と水素ガスを 5 体積％を混合したガスを原料と して、 DLC膜 25nmの厚みに形成したスライドグラスを作成した。
次に、 このスライ ドガラス表面を化学修飾した。
すなわち、 ガラス基板表面をアンモニア雰囲気下で高圧水銀灯を 10 分間照射し てァミノ化し、 さらに無水コハク酸の N _メチルピロリ ドン溶液中に 60 分間浸 漬した。 このようにして、 基板表面にカルボキシル基を持つ、 軟ダイヤモンドコ 一トスライドグラスを得た。
軟ダイヤモンドコートスライドグラスへの D N Aの固定化は、 図 1のように表 面のカノレポキシル基を N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド （N-hydraxysuccinimide) で活性化エステル化した後に行う。
ダイヤモンド表面の N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド （N— hydroxy succinimide) 活性エステル基を、 DNAの塩基に含まれる第 1級ァミノ基とアミド結合させる
(図 2)。
(2) 活性化
活性化は活性化キットを用いて行う。 活性化キットの溶液組成は以下のものを 用いた。
•溶液 A (水溶液）
リン酸バッファー （ρΗ6) : 0. 1M
Ν—ヒ ドロキシスクシンイミ ド
(Ν— hydroxysuccinimide ： 22 mM ( 2. 5 g / L)
•溶液 B (ジォキサン溶液）
1-[3- (ジメチルァミノ）プロピル] 3-ェチルカルボジィミ ド： lM(191.8gL) ( 1- [3- (dimetnvlammo) propyl] 3 -ethylcarbodiimide)
次に、 リン酸バッファー （pH6) は以下のようにして作成した。
まず、 0. 1M リン酸二水素カリウム溶液 （1 3. 6 gZL) および 0. 1M リン酸水素二カリウム溶液 （1 7. 4 g/L) を用意する。 リン酸二水素カリ ゥム溶液の p Hを p H計で測定し、 p Hをモニターしながら p H 6になるまでリ ン酸水素二力リゥム溶液を添加する。
活性化後の基板は、 活性が落ちてしまわないように、 なるべく早く使用するこ とが好ましい。 保管する場合は、 65°Cで 30分乾燥後、 デシケータ中で保管す るのが好ましい。
溶液 Aを 9 OmLビーカーに入れ、 更に溶液 Bを 1 OmL加える。 液を良く撹 拌したあとに、 この溶液をシャーレに入れ、 軟ダイヤモンドコートスライ ドダラ スを溶液に浸漬し、 30分間室温放置する （振とう機等の撹拌装置がある場合は 撹拌を行う）。 活性化後の軟ダイヤモンドコートスライ ドグラスを、 滅菌水によ り 2回洗浄した。 - 活性化後の基板は、 活性が落ちてしまわないように、 なるべく早く使用するこ とが好ましい。 保管する場合は、 65°Cで 30分乾燥後、 デシケータ中で保管す ることが好ましい。
一方、活性化キットを用いないで基板を活性化することもできる。この場合は、 以下のようにして行う。
まず、 基板表面を活性化する。 以下のものを準備する。
•軟ダイャモンドコートスライ ドグラス
■ 1-[3- (ジメチルァミノ）プロピル] 3-ェチルカルポジィミ ド
(.1-[3-、dimethylammoノ oropyl] 3-ethylcarbodiimide)
■ N—ヒ ドロキシスクシンィミ ド (N— hydroxysuccinimide)
■ リン酸ニ水素力リウム - - リン酸水素二力リウム
•滅菌水
まず、 活性エステル化 （カルボキシル基の N—ヒ ドロキシスクシンイミ ド （N 一 hydroxysuccinimide) 活性エステル化） を行う。 活性化液の組成は以下のとお りのものを用いた。
■ N—ヒ ドロキシスクシンィミ ド （N— hydroxysuccinimide) ： 20 mM ■ 1-[3- (ジメチルァミノ）プロピル] 3-ェチルカルポジイミ ド： 0. 1M
(1- [3- aimethylammo propyl] 3-ethylcarbodiimide)
■ リン酸バッファー （ρΗ6) : 0. 1M
20 OmLビーカーに、 1-[3- (ジメチルァミノ）プロピル] 3-ェチルカルポジィ ミ ド (l-L3-(dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide) 9 o 9mgと、 N—ヒ ト 口キシスクシンィミ ド （N— hydroxysuccinimide) 1 1 5 m gを採り、 50 m L のリン酸バッファー （PH6) で溶解し、 これにスライドグラスを浸漬して前記 の活性化キットを用いた場合と同様に反応させ、 洗浄した。 (3) スポッティング
次に、 活性化した基板に DNAを貼り付けた （いわゆるスポッティング）。 まず、 以下のものを準備した。
'軟ダイヤモンドコートスライドグラス （活性化済み）
- DNAサンプル
• ホノレムアミ ド
-滅菌水
■ スポッター
DNAサンプルを濃度が 1 μ g/zz Lとなるように 10%ホルムアミ ド溶液 (スポッティング用バッファー） に溶解してスポッティング用溶液を準備した。 スポッティング用溶液を 95 °Cで 5分熱変性し、 4 °Cまで急冷した。 図 3に示す ようにスポッターの針で液を吸取り （図 3の a)、 軟ダイヤモンドコートスライ ドグラス表面に押し付けて （同 b)、 DNA液を基板に押し付けた （同 ）。 こ のようにしてスライ ドグラス表面に多数貼り付けた （同 d)。
(4) インキュベーション
軟ダイヤモンドコ一トスライドグラス、 飽和 N a C 1水溶液、 タイ トボックス 及びインキュベーターを準備して行った。 飽和 Na C 1溶液 （例えば水 +ホルム アミ ド （1 ： 1) 溶液） を入れたタイトボックスを、 4 °Cに設定したインキュべ 一ターに入れ、 タイ トボックス全体が 4°Cになるまで約 1時間放置し、 調湿チヤ ンバーを準備した。
タイ トボックスが調湿チャンバ一となつた状態でインキュベーターから取り出 し、 Na C 1飽和水にふれないようにタイ トボックス内に軟ダイヤモンドコート グラスを入れた （底上げをした上に載せた）。 タイ トボックスを再びインキュべ 一ターに入れ、 1時間放置した。この間も湿度を高く保つべく温度調整を行った。 軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れた状態のタイトボックスを図 4に示 す。 その後、 80 °Cのオーブン中で 3時間乾燥した。 (5) プレハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライ ドグラス （スポッ ト及びィンキュベーション済 み）、 カバーグラス、 サーモン DNA、 20 X S SC、 1 X S SC、 10 % S D S、 ホルムアミ ド、 滅菌水、 1. 5mL 反応チューブ、 200 / Lエツベンド ルフチューブ、 ノ ット、 振とう機、 20 OmL ビーカー、 ブロア一、 飽和 N a C 1水溶液、 タイ トボックス及びインキュベーターを用意して以下の操作を行つ た。
まず、 前記 （4) インキュベーションの場合と同様に、 飽和 Na C l溶液を入 れたタイ トボックスを、 37°Cに設定したインキュベーターに入れ、 タイトポッ タス全体が 37°Cになるまで約 1時間放置し、 調湿チャンバ一を準備した。 これ とは別にプレハイプリダイゼーシヨン用溶液を調製した。
サーモン DNA (サンプルとは関係のない DNAをいう） サンプルを lmg反 応チューブに測り採り、 500 μ L滅菌水で溶解する。 その後、 20 X S SCを 250 μ L, 10%SDSを 50 し、 ホルムアミ ドを 200 μ L添加する。 攪 拌後、 必要な量をエツペンドルフチューブに採り、 プレハイブリダィゼーシヨン 用溶液とした。
本実施例においてはスポット範囲が 1 cmX 1 cmの場合、 基板 1枚あたり 1 5 / Lとした。
続いて、 プレハイブリダイゼーション用溶液を 95 °Cで 5分間熱変性し、 4 °C まで急冷した。 軟ダイヤモンドコートスライドグラス中の予め DNAをスポット した場所に、 プレハイプリダイゼーシヨン用溶液を滴下し、 気泡が入り込まない ようにカバーグラスを静かに載せた。 こうして、 サーモン DNAでスポット部位 以外のスライドグラス表面をマスキングした （図 5参照）。
次に、 タイトボックスをインキュベーターから取り出し、 Na C l飽和水に触 れないように軟ダイヤモンドコートスライドグラスを入れ （底上げをした上に載 せる）、 再びインキュベーターに入れ、 反応を進めるため 1時間放置した。 次に、 洗浄を行った。 軟ダイヤモンドコートスライドグラスをインキュベータ 一から取り出し、 20 OmLビーカーに入れた 1 X S S C溶液中で、 カバーグラ スをはずした。 次に、 1 X S S Cと 0.2% SDSをはったバット中に表面を上にし て入れ、 振とう機を用いて 5分間振とうした（図 6)。 その後、 1 X S S Cと 0.2% SDSを捨ててもう一度 1 X S S Cと 0.2% SDSを入れ、 5分間振とうした。 もう 一度同様に 1 X S S Cと 0.2% SDSで洗浄した後、 0. 1 X S S Cで軽く リンス し、 ブロア一を用いて基板表面の溶液を除去した。
(6) ハイブリダィゼーシヨン
軟ダイヤモンドコートスライドグラス (プレハイブリダィゼーション済み）、 カバーグラス、 ターゲット DNA、 20 X S S C、 1 X S S C、 1 0 % S D Sヽ ホルムアミ ド、滅菌水、 200 μ Lエツペンドルフチューブ、バット、振とう機、 20 OmL ビーカー、 ブロア一、 蛍光標識キット、 飽和 Na C 1水溶液、 タイ トボックス、 インキュベーターを用意した。
まず、 飽和 N a C 1溶液を入れたタイ トボックスを、 3 7°Cに設定したインキ ュベータ一に入れ、 タイ トボックス全体が 3 7°Cになるまで約 1時間放置して、 調湿チャンバ一を準備した。
次に、 DN Aサンプルの蛍光標識を行った。 蛍光標識は、 蛍光標識ラベルキッ トに従って行う力 \ あるいは逆転写酵素反応を利用して蛍光標識することができ る。
続いて、 1 μ gZ β Lの蛍光標識 DN Αサンプル 2 μ Lを反応チューブに採り、 48 Lの滅菌水を加えた。 その後、 20 X S S Cを 2 5 L、 1 0%SD Sを 5 L、 ホルムアミ ドを 2 0 μ L添カ卩し、 撹拌し、 ハイプリダイゼーシヨン用溶 液を調製した。
ハイブリダイゼーション用溶液を軟ダイャモンドコートスライドグラスに滴下 し、 気泡が入り込まないようにカバーグラスを静かに載せた。 次に、 タイ トボッ クスをインキュベーターから取り出し、 Na C 1飽和水に触れないように前記ス ライ ドグラスを入れ （底上げをした上に載せる）、再びインキュベーターに入れ、 1時間放置した。 このようにして、 蛍光標識した DNAが基板上に予めスポッテ ィングした DN Aにハイプリダイズさせた （図 7参照）。
最後に洗浄を行った。 基板をインキュベーターから取り出し、 200mL ビ 一力一を入れた 1 X S S C溶液中で、 力バーグラスをはずした。 次に、 1 X S S Cと 0.2% SDSを張ったバット中に表面を上にして入れ、 振とう機を用いて 5分 間振とうした。 もう一度同様に 1 X S S Cと 0.2% SDSで洗浄した後、 0. I X S S Cで軽くリンスし、 ブロア一を用いて基板表面の溶液を除去した。
(7) 検出
検出は蛍光画像読み取り用スキャナーを用意し、 軟ダイヤモンドコートスライ ドグラス表面の DNAとハイブリダィズした DNAの蛍光標識を、 蛍光画像を読 み取ることにより行った。
なお、 上記説明では、 DNAの検出について説明したが、 DNAの代わりに蛋 白質の検出を行うことも同様に可能である。
(実施例 2)
実施例 1と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、 実施例 1と同 様な活性化を行った。 スポッティングは、 実施例 1で用いた溶液のうち、 ホルム アミ ドの替わりに 10%グリセリンを用いた。
(4) ィンキュベーション
インキュベーションは N a C 1飽和水を入れたタイ 1、ボックスを、 4°Cに設定 したインキュベーターに入れ、 タイ トボックス全体が 4°Cになるまで、 約 1時間 放置する。 タイ トボックスをインキュベーターから取り出し、 Na C l飽和水に ふれないように基板を入れ （底上げをした上に載せる）、 再びインキュベーター に入れ、 1時間放置する。 N a C 1飽和水を入れたタイ トボックスを、 65 °Cに 設定したインキュベーターに入れ、 1時間放置し、 乾燥した。 乾燥後、 20xSSC と 10%SDS を含んだバッファー液で洗浄した。 なお、 実施例 1で実施したプレ ハイプリダイゼーションは行わなかった。
(6) ハイブリダィゼーシヨン
軟ダイヤモンドコートスライ ドグラス (プレハイプリダイゼーション済み）、 カバーグラス、 ターゲット DNA、 20 XS SC、 1 X S S C、 10%SDS、 ホルムアミ ド、滅菌水、 200 μ Lエツペンドルフチューブ、ノ ット、振とう機、 20 OmL ビーカー、 ブロア一、 蛍光標識キット、 飽和 N a C 1水溶液、 タイ トボックス、 インキュベーターを用意した。
まず、 飽和 Na C 1溶液を入れたタイ トボックスを、 45°Cに設定したインキ ュベータ一に入れ、 タイ トボックス全体が 45 °Cになるまで約 1時間放置して、 調湿チャンバ一を準備した。 以後の処理は実施例 1と同様に行った。
検出も実施例 1と同様に、 行った。 なお、 DNAの検出について説明したが、 DN Aの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
(実施例 3 )
実施例 1と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、 実施例 1と同 様な活性化を行った。 スポッティングは、 実施例 1で用いた溶液のうち、 ホルム アミ ドの替わりに 10%グリセリンを用いた。
(4) ィンキュベ一ション
インキュベーションは N a C 1飽和水を入れたタイ トボックスを、 4°Cに設定 したインキュベーターに入れ、 タイトボックス全体が 4°Cになるまで、 約 1時間 放置する。 タイ トボックスをインキュベーターから取り出し、 Na C l飽和水に ふれないように基板を入れ （底上げをした上に載せる）、 再びインキュベーター に入れ、 1時間放置する。 Na C 1飽和水を入れたタイ トボックスを、 65°Cに 設定したインキュベータ一に入れ、 1時間放置し、 乾燥した。 基板表面に、 濃度 が 0. 5 %のァガロースゲルを載せた後、 基板をタイ トボックス中に入れ、 タイ トボックスを 45 °Cインキュベーターに 12時間入れた。
2xSSC と 0.2%SDS を含んだバッファー溶液で洗浄後、 更に、 O.lxSSC で洗浄し た。 最後に、 70%エタノール溶液で洗浄した。 なお、 実施例 1で実施したプレ ハイブリダィゼーションは行わなかった。
(6) ハイブリダイゼーション
軟ダイヤモンドコートスライ ドグラス （プレハイブリダイゼ——ンョン済み)、 カバーグラス、 ターゲット DNA、 20 XS SC、 1 XS SC、 10 % S D S、 ホルムアミ ド、滅菌水、 200 μ Lエツペンドルフチューブ、ノ ット、振とう機、 20 OmL ビーカー、 ブロア一、 蛍光標識キット、 飽和 N a C 1水溶液、 タイ トボックス、 インキュベーターを用意した。
まず、 飽和 Na C 1溶液を入れたタイ トボックスを、 45 °Cに設定したインキ ュベータ一に入れ、 タイトボックス全体が 45°Cになるまで約 1時間放置して、 調湿チャンバ一を準備した。 以後の処理は実施例 1と同様に行った。
検出も実施例 1と同様に、 行った。 なお、 DNAの検出について説明したが、 DNAの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。
(実施例 4)
実施例 1と同様の軟ダイヤモンドコートスライドグラスを用いて、 実施例 1と同 様な活性化を行った。 スポッティングは、 実施例 1で用いたホルムアミ ドを添加 せず、 超純水のみで調製した。
(4) ィンキュベーション
インキュベーションは 50%ホノレムアミ ド水溶液を入れたタイ 1、ボックスを、 60 °Cに設定したィンキュベータ一に入れ、 タイ トボックス全体が 60°Cになるまで、 約 1時間放置する。 タイ トボックスをインキュベーターから取り出し、 50%ホル ムアミ ド水溶液にふれないように基板を入れ （底上げをした上に載せる）、 再び インキュベーターに入れ、 3時間放置した。 2xSSC と 0.2%SDS を含んだバッフ ァー溶液で洗浄後、 更に、 O.lxSSC で洗浄し、 滅菌水で濯いだ後にブロア一で乾 燥した。 次にプレハイブリダィゼーシヨン溶液（5 Xデンハルト液、 50 %ホルム アミ ド）を基板に滴下し、 気泡が入り込まないようにカバーバラスを静かに載せ る。 タイトボックスを 60 °Cに設定したインキュベーターから取り出し、 50 %ホ ルムアミ ドにふれないように基板をいれた。 基板の入ったタイ トボックスを 60 °Cに設定したインキュベーターに入れ、 1 時間プレハイプリダイゼーシヨンを行 つた。
0.1 X SSCでカバーグラスを洗い落とし、 滅菌水で 15分間洗浄した。 その後、 ブロァ一で氷塩の溶液を吹き飛ばした。
(6) ハイブリダイゼーション
軟ダイャモンドコートスライ ドグラス (プレハイブリダイゼーション済み)、 カバーグラス、 ターゲット DNA、 20 X S S C、 1 X S SC、 10%SDS、 ホルムアミ ド、滅菌水、 200 ^ Lエツペンドルフチューブ、ノ ッ ト、振とう機、 20 OmL ビーカー、 ブロア一、 蛍光標識キット、 50%ホルムアルデヒ ド水 溶液、 タイ トボックス、 インキュベーターを用意した。
まず、 50%ホルムアルデヒ ド水溶液を入れたタイ トボックスを、 45°Cに設 定したインキュベーターに入れ、 タイトボックス全体が 45°Cになるまで約 1時 間放置して、調湿チャンバ一を準備した。以後の処理は実施例 1と同様に行った。 検出も実施例 1と同様に、 行った。 なお、 DNAの検出について説明したが、 DNAの代わりに蛋白質の検出を行うことも同様に可能である。 産業上の利用可能性 ·
本発明の活性化キットを用いることにより、 A液と B液とを調整し、 一段階の 反応だけで基板を活性化できるので、 基板を簡便にかつ迅速に活性化できる。 また、 本発明の DNA又は蛋白質の検出方法によれば、 プレハイブリダィゼー シヨンを行うので、 余分な活性点にも DNAが付着してしまうことなく、 正確な DNA検出が可能である。
さらに、 ゲノレ溶液を使ってインキュベーションを行うと、 安定かつ促進した固 定化反応が行われるので、 正確な DN A又は蛋白質の検出が可能である。 したがって、 本発明は、 医療分野での疾病診断、 生化学、 分子生物学分野での 研究等、 各分野で有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. リ ン酸パッファー ( p H 6 ) 及び N—ヒ ドロキシスクシンィ ミ ド (N-hydroxysuccinimide) からなる溶液 Aと、 1 - [3- (ジメチルァミノ）プロピル] 3- ェチノレカノレホシィ ド ( 1- [3-、dimethylamino) propyl] 3-ethylcarbodiimide) 力、らな る溶液 Bとを主成分とする基板の活性化キット。
2. 前記溶液 Aが、 リン酸バッファー （pH6) ： 0. 01〜5M及びN_ヒ ドロキシスクシンイミ ド （N-hydroxysuccinimide) : l〜500mM (0. 1 1 5 〜 57. 5 g/L) の水溶液である請求項 1記載の活性化キット。
3. 前記溶液 Bが、 1-[3- (ジメチルァミノ）プロピル] 3-ェチルカ
ノレホシィミ ト (1-[3-、aimetoylamino) propylj 3-ethylcarbodiimide) か 0. 0 5 ~ 1 0M (9. 59〜1 918 g/L) のジォキサン溶液である請求項 1又は 2記載 の活性化キット。
4. 前記溶液 A： 50-99容量％に対し、 溶液 B ： 1〜 50容量％を配合し て用いる請求項 1〜 3のいずれかに記載の活性化キット。
5. 前記基板が、 ダイヤモンドライクカーボンの表面処理層を有するスライ ド グラスに化学修飾を施した基板であることを特徴とする請求項 1記載の基板の活 性化キット
6. 前記化学修飾が、 末端に水酸基、 カルボキシル基、 エポキシ基、 アミノ基 を有することを特徴とする請求項 1または 5記載の基板の活性化キット
7. 前記化学修飾が、 基板にアンモニアガス中でプラズマによりアミノ化する ことを特徴とする請求項 1、 5または 6記載の基板の活性化キット
8. 請求項 1記載の活性化キットを用いて活性化した基板に DNA又は蛋白質 をスポッティング後であって、 スポッティングされた DNA又は蛋白質への蛍光 標識 DNAのハイプリダイゼーシヨンを行う前において、 スポッティング部位以 外の基板表面をマスキングするプレハイブリダィゼーションを行うことを特徴と する DN A又は蛋白質の検出方法。
9. プレハイブリダィゼーシヨンが、 基板表面にスポッティングされた DNA 又は蛋白質とは異なる DNA又は蛋白質を固定化することによる請求項 8記載の D N A又は蛋白質の検出方法。
1 0. 請求項 1記載の活性化キッ トを用いた基板の活性化工程、 活性化された 基板への DNA又は蛋白質のスポッティング工程、 スポッティング後の基板の乾 燥工程、 スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプレハイブリダィ ゼーション工程、 スポッティングされた DNA又は蛋白質への蛍光標識 DNAの ハイブリダイゼーション工程、 及び、 ハイブリダイゼーション部位の蛍光部位検 出工程の各工程からなることを特徴とする DN A又は蛋白質の検出方法。
1 1. 請求項 1記載の活性化キットを用いた基板の活性化工程、 活性化された 基板への DNA又は蛋白質のスポッティング工程、 スポッティング後の基板のィ ンキュベーション工程、 スポッティング部位以外の基板表面をマスキングするプ レハイプリダイゼーション工程、 スポッティングされた DN A又は蛋白質への蛍 光標識 D N Aのハイプリダイゼーション工程、 及ぴ、 ハイブリダイゼーション部 位の蛍光部位検出工程の各工程からなることを特徴とする D N A又は蛋白質の検 出方法。
1 2. プレハイブリダィゼーシヨン工程が、 基板表面にスポッティングされた DN A又は蛋白質とは異なる DN A又は蛋白質を固定化する工程である請求項 1 0記載の DN A又は蛋白質の検出方法。
1 3. 請求項 1記載の活性化キットを用いた基板の活性化工程、 活性化された 基板への DNA又は蛋白質のスポッティング工程、 スポッティング後の基板のィ ンキュベーション工程、 スポッティングされた DNA又は蛋白質への蛍光標識 D N Aのハイブリダイゼーション工程、 及び、 ハイブリダイゼーション部位の蛍光 部位検出工程の各工程からなることを特徴とする D N A又は蛋白質の検出方法。
14. 前記ィンキュベーシヨン工程が、 ゲルからなる溶液で処理することを特 徴とする請求項 1 1乃至 1 3記載の DNA又は蛋白質の検出方法。
1 5. 前記ゲルからなる溶液が、 吸水性高分子を含むことを特徴とする請求項 14記載の DN A又は蛋白質の検出方法。
1 6. 前記吸水性高分子が、 ァガロース、 ゼラチン、 架橋ポリエチレンォキサ ィドであることを特徴とする請求項 1 5記載の DNA又は蛋白質の検出方法。
1 7. 前記ゲルからなる溶液が、 蛋白質、 サーモン精子 DNA、 デォキシリブ ヌクレオチド 3リン酸、 デンハルト液を含むことを特徴とする請求項 14乃至 1 6記載の DN A又は蛋白質の検出方法。
PCT/JP2001/005246 2000-08-08 2001-06-20 Coffret d'activation de substrat et procede de detection d'adn ou similaire a l'aide dudit coffret WO2002012891A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020037001769A KR100544850B1 (ko) 2000-08-08 2001-06-20 기판의 활성화 키트 및 이를 사용한 ｄｎａ 등의 검출 방법
EP01941108A EP1310793A4 (en) 2000-08-08 2001-06-20 SUBSTRATE ACTIVATION KIT AND METHOD FOR DETECTING DNA OR SIMILAR
JP2002517524A JP4730808B2 (ja) 2000-08-08 2001-06-20 基板の活性化キット及びこれを用いたｄｎａ等の検出方法
US10/344,166 US7078172B1 (en) 2000-08-08 2001-06-20 Substrate activation kit and method for detecting DNA and the like using the same
AU2001274560A AU2001274560A1 (en) 2000-08-08 2001-06-20 Substrate activation kit and method of detecting dna or the like by using the same

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000-240496 2000-08-08
JP2000240496 2000-08-08
JP2000336640 2000-11-02
JP2000-336640 2000-11-02
JP2000-401867 2000-12-28
JP2000401867 2000-12-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002012891A1 true WO2002012891A1 (fr) 2002-02-14

Family

ID=27344295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/005246 WO2002012891A1 (fr) 2000-08-08 2001-06-20 Coffret d'activation de substrat et procede de detection d'adn ou similaire a l'aide dudit coffret

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7078172B1 (ja)
EP (1) EP1310793A4 (ja)
JP (1) JP4730808B2 (ja)
KR (1) KR100544850B1 (ja)
CN (1) CN1284972C (ja)
AU (1) AU2001274560A1 (ja)
WO (1) WO2002012891A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004007710A1 (ja) 2002-07-17 2004-01-22 Toyo Kohan Co., Ltd. 静電層を有する固体支持体及びその用途
JP2006267063A (ja) * 2005-03-25 2006-10-05 Univ Of Tokushima アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット
JP2006267058A (ja) * 2005-03-25 2006-10-05 Univ Of Tokushima ダイヤモンドチップへの蛋白質／ペプチドの固定化方法
JP2010204130A (ja) * 2010-06-25 2010-09-16 Univ Of Tokushima ダイヤモンドチップへの蛋白質／ペプチドの固定化方法
JP2010266448A (ja) * 2010-06-07 2010-11-25 Univ Of Tokushima アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット
JP2015064350A (ja) * 2013-08-28 2015-04-09 国立大学法人九州大学 生体分子親和性含フッ素高分岐ポリマー及び生体分子認識表面
US9540684B2 (en) 2012-12-14 2017-01-10 Mindera Corporation Methods and devices for detection and acquisition of biomarkers

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7943388B2 (en) * 2003-11-14 2011-05-17 3M Innovative Properties Company Acoustic sensors and methods
US7361767B2 (en) * 2003-11-14 2008-04-22 3M Innovative Properties Company N-sulfonyldicarboximide containing tethering compounds
US7423155B2 (en) * 2003-11-14 2008-09-09 3M Innovative Properties Company N-sulfonyldicarboximide containing tethering compounds
KR101130956B1 (ko) * 2003-11-14 2012-03-30 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 Ｎ-술포닐아미노카르보닐 함유 화합물
US7169933B2 (en) * 2003-11-14 2007-01-30 3M Innovative Properties Company N-sulfonylaminocarbonyl containing compounds
US7544756B2 (en) * 2005-09-30 2009-06-09 3M Innovative Properties Company Crosslinked polymers with amine binding groups
US7544754B2 (en) 2005-09-30 2009-06-09 3M Innovative Properties Company Crosslinked polymers with amine binding groups
GB0804495D0 (en) * 2008-03-11 2008-04-16 Iti Scotland Ltd Surface attachment
CN102115737B (zh) * 2009-12-31 2015-06-03 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 稳定碱性磷酸酶或其标记物的试剂和方法
CN102269761A (zh) 2010-06-04 2011-12-07 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种碱性磷酸酶结合物的合成工艺
CN102269762B (zh) 2010-06-04 2014-12-10 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 结合物的制备方法及相关试剂盒
JP2013088378A (ja) 2011-10-21 2013-05-13 Sony Corp ケミカルセンサ、ケミカルセンサモジュール、生体分子検出装置及び生体分子検出方法
CN106702500B (zh) * 2015-11-17 2018-10-26 港龙生物技术（深圳）有限公司 一种用于固定核酸探针的点样液及其配制方法和核酸探针固定方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08500722A (ja) * 1992-01-29 1996-01-30 日立化成工業株式会社 ポリヌクレオチド固定化担体
WO1999066322A1 (en) * 1998-06-15 1999-12-23 Biosensor Systems Design, Inc. (1998) A sensor for analyte detection
JP2001139532A (ja) * 1999-11-11 2001-05-22 Toyo Kohan Co Ltd 化学修飾を施した基体およびその製造方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE88762T1 (de) * 1986-08-11 1993-05-15 Siska Diagnostics Inc Methoden und zusammensetzungen fuer tests mit nukleinsaeuresonden.
WO1999036564A1 (en) * 1998-01-16 1999-07-22 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods
FR2803913B1 (fr) * 2000-01-13 2002-08-16 Pasteur Sanofi Diagnostics Procede d'immobilisation de reactif(s) affin(s) sur phase solide hydrophobe

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08500722A (ja) * 1992-01-29 1996-01-30 日立化成工業株式会社 ポリヌクレオチド固定化担体
WO1999066322A1 (en) * 1998-06-15 1999-12-23 Biosensor Systems Design, Inc. (1998) A sensor for analyte detection
JP2001139532A (ja) * 1999-11-11 2001-05-22 Toyo Kohan Co Ltd 化学修飾を施した基体およびその製造方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MENGSU YANG ET AL.: "Covalent immobilization of oligonucleotides on modified glass/silicon surfaces for solid-phase DNA hybridization and amplification", CHEMISTRY LETTERS, 1998, pages 257 - 258, XP002945038 *
See also references of EP1310793A4 *
SILVIA STORRI ET AL.: "A piezoelectric biosensor for DNA hybridisation detection", ANALYTICAL LETTERS, vol. 31, 1998, pages 1795 - 1808, XP002945037 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004007710A1 (ja) 2002-07-17 2004-01-22 Toyo Kohan Co., Ltd. 静電層を有する固体支持体及びその用途
JP2006267063A (ja) * 2005-03-25 2006-10-05 Univ Of Tokushima アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット
JP2006267058A (ja) * 2005-03-25 2006-10-05 Univ Of Tokushima ダイヤモンドチップへの蛋白質／ペプチドの固定化方法
JP4568841B2 (ja) * 2005-03-25 2010-10-27 国立大学法人徳島大学 アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット
JP4660756B2 (ja) * 2005-03-25 2011-03-30 国立大学法人徳島大学 ダイヤモンドチップへの蛋白質／ペプチドの固定化方法
JP2010266448A (ja) * 2010-06-07 2010-11-25 Univ Of Tokushima アレルギー疾患の判定方法及びアレルギー疾患の判定キット
JP2010204130A (ja) * 2010-06-25 2010-09-16 Univ Of Tokushima ダイヤモンドチップへの蛋白質／ペプチドの固定化方法
US9540684B2 (en) 2012-12-14 2017-01-10 Mindera Corporation Methods and devices for detection and acquisition of biomarkers
EP3542850A1 (en) 2012-12-14 2019-09-25 Mindera Corporation Methods and devices for detection and acquisition of biomarkers
US10995366B2 (en) 2012-12-14 2021-05-04 Mindera Corporation Methods and devices for detection and acquisition of biomarkers
JP2015064350A (ja) * 2013-08-28 2015-04-09 国立大学法人九州大学 生体分子親和性含フッ素高分岐ポリマー及び生体分子認識表面

Also Published As

Publication number Publication date
CN1284972C (zh) 2006-11-15
JPWO2002012891A1 (ja) 2004-01-15
JP4730808B2 (ja) 2011-07-20
EP1310793A4 (en) 2005-11-16
KR100544850B1 (ko) 2006-01-24
EP1310793A1 (en) 2003-05-14
AU2001274560A1 (en) 2002-02-18
US7078172B1 (en) 2006-07-18
KR20030031145A (ko) 2003-04-18
CN1606693A (zh) 2005-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2002012891A1 (fr) Coffret d'activation de substrat et procede de detection d'adn ou similaire a l'aide dudit coffret
JP4764901B2 (ja) 静電層を有する固体支持体及びその用途
JP4380631B2 (ja) 選択結合性物質固定化担体
US9857369B2 (en) Biochip substratum and method for production thereof
JP5289843B2 (ja) 生体関連分子の相互作用を検出するための方法及びそれに用いる担体支持部材
JP3842107B2 (ja) 粗面化スライドグラス及びそれを用いて生体物質を解析する方法
JP4950336B2 (ja) 生体関連分子の相互作用を検出するための方法及びユニット
US20030119028A1 (en) Device and methods for enhanced microarray hybridization reactions
JP4207528B2 (ja) 選択結合性物質の結合方法
JP2003172737A (ja) 固体支持体、基体、バイオセンサ、およびそれらを用いた生体物質の解析方法
CN103755153A (zh) 一种制备高醛基官能团密度生物芯片用基片的方法
US20040014080A1 (en) Solid supports having surface-treated layer formed thereon
JP5607373B2 (ja) マイクロアレイの検出方法
JP2003014747A (ja) 表面処理層が形成された固体支持体
JP2002082116A (ja) 表面処理層が形成されたスライドグラス
JP2008249677A (ja) 液体導入用デバイス、固定ホルダおよび分析キット
JP5188228B2 (ja) 蛍光標識された生体関連分子の検出方法
JP2002181817A (ja) ポリヌクレオチドアレイの作製方法
WO2004051272A1 (ja) ポリヌクレオチドを固体支持体上へ固定化する方法、その方法により固定化されてなる固体支持体、その固体支持体から標的ポリヌクレオチドを検出する方法、およびポリヌクレオチド固定化溶液
WO2002031502A1 (fr) Substrat modifie chimiquement et procede de production de celui-ci
JPWO2002039111A1 (ja) ハイブリッド形成用担体及びハイブリットの固定化方法
WO2012173015A1 (ja) プローブセット及びその利用
WO2001086294A1 (fr) Microreseau de polynucleotides, procede et appareil permettant la construction de celui-ci
KR20090121573A (ko) 동족 ｄｎａ로 개질된 기질 표면에 단백질을 고정화 하는방법
JP2012233752A (ja) 分析チップ

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2002 517524

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020037001769

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 018147917

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001941108

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020037001769

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001941108

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10344166

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1020037001769

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1020037001769

Country of ref document: KR