JPWO2002039111A1 - ハイブリッド形成用担体及びハイブリットの固定化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分子生物学分野、遺伝子工学関連分野において有用な、核酸を固定化可能なハイブリット形成用担体、オリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAからなるハイブリットの固定化方法に関するものである。
背景技術
遺伝子解析は分子生物学、遺伝子工学分野で有用であり、近年では病気の発見等医療分野でも利用されている。
遺伝子解析において、近年DNAチップが開発され解析速度が著しく速くなった。しかし従来のDNAチップはスライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にDNAを固定する方法である。また、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いてガラス基板上にオリゴヌクレオチドを合成する方法が用いられている。
しかし、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してDNAを固定する方法では、DNAの固定化状態が不安定であり、ハイブリッド形成工程や洗浄工程において、DNAが剥離するといった問題が生じる。また、半導体技術を用いたDNAチップは、製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。
このような問題点を解決するためには、固体支持体表面にDNAを高密度で且つ強固に固定化する必要がある。
また、従来、固体支持体の表面を化学修飾した基体が知られている。しかし、化学修飾部分にアミド結合で直接所望のDNAを結合させると、化学結合の際の処理等によりDNAの末端部分が破損するおそれがあるため、改良が望まれていた。
本発明は、上記のようにDNAの末端部分を破損させることなく、DNAの解明を効率的に行うことができ、分子生物学分野、遺伝子工学分野等において有用なヌクレオチド固定化用担体を提供しようとすることを目的とするものである。
発明の開示
本発明者らは、固体化用担体を化学修飾したものに、ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチドを固定することにより、オリゴヌクレオチドが固定化用担体の表面に対して垂直方向に固体化し、一塩基多型のDNA情報を容易に読みとることができる。
すなわち、請求項1記載の本発明は、ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAが固定化されていることを特徴とするハイブリッド形成用担体を提供するものである。ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAが2個以上連続して第1級アミンを有するヌクレオチド含むことが望ましい。第1級アミンを有するヌクレオチドは、デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸あるいはデオキシグアニル酸であることが望ましい。また、第1級アミンを有するヌクレオチドは、5’末端側に存在することが好ましい。オリゴヌクレオチドは、5’突出末端であることが好ましい。cDNAが5’末端側に2個以上連続して第1級アミンを有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成されても良い。gDNAが5’末端側に2個以上連続して第1級アミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限要素により切断されることを特徴とする。gDNAが5’突出末端側に2個以上連続して第1級アミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限要素により切断されることを特徴とする。更に、デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸あるいはデオキシグアニル酸がハイブリット形成用担体側に固定化されていることが望ましい。ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAが固定側の末端に第1級アミンを有するヌクレオチドを1〜10個有することが望ましい。
請求項11記載の発明は、ハイブリッド形成用担体を化学修飾し、これにハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAを固定した後、担体に固定されてない相補的オリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAをデハイブリタイズすることを特徴とするオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAからなるハイブリットの固定化方法。また、ハイブリッド形成用担体の化学修飾が、担体の表面を塩素化、アミノ化及びカルボキシル化の順に行った方法が望ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明のハイブリッド形成用担体は、化学修飾によってハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAが固定化されたされた担体であって、オリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAが担体に対して垂直に固定化していることを特徴とするものである。このため、容易に、一塩基多型のcDNAの情報を読みとることができる。
このハイブリタイズしたオリゴヌクレチドは、相補的なオリゴヌクレチドをデハイブリタイズして、担体に残ったオリゴヌクレチドの情報を読みとる。
このように、オリゴヌクレオチドは、必然的にDNAなど二本鎖の核酸である。オリゴヌクレオチドは、高等動物、カビ類、バクテリア、ウイルス等の天然のもののほか、人為的にこれらの構造改変を加えたもの、合成したものが挙げられるが、後述の方法により簡便に合成することができるので、好ましい。
なお、オリゴヌクレオチドの塩基数は10〜50個とすることが好ましい。
本発明のハイブリッド形成用担体は、以下の方法により簡便に作成することができる。
(1)ハイブリッド形成用担体の化学修飾
本発明においては、このようなオリゴヌクレオチドが化学修飾されたハイブリッド形成用用担体に固定化されている。
ハイブリッド形成用担体としては、ガラス、ダイヤモンド、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属;上記ガラス、ダイヤモンド、金属とセラミックスとの積層体;ポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック等が挙げられる。
その他の材料でも、化学的に安定な材料であれば使用でき、例えば、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボンが挙げられる。また、上記材料の混合体又は積層体でもよい。例えば、ダイヤモンドライクカーボンを表面にコーティングしたスライドガラス等が挙げられる。。
これらのうち、DNAの固定化密度が極めて高い点からダイヤモンド或いはダイヤモンドライカーボンが好ましい。
ダイヤモンドとしては、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。また、それらの構造が単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差し支えない。生産性の観点よりマイクロ波プラズマCVD法などの気相合成法を用いて製造されたダイヤモンドを用いることが好ましい。
ダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンの形成方法は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD法、ECRCVD法、IPC法、直流スパッタリング法、ECRスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、EB蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。また、金属粉末やセラミック粉末等に関しては、原料をプレス成形機を用いて圧粉したものを高温で焼結したものもあげられる。
担体の表面は意図的に粗面化されていることが望ましい。このような粗面化表面は基体の表面積が増えて多量のDNA等を固定させることに好都合であるからである。基体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。
さらに、このダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンからなるハイブリッド形成用担体は、ダイヤモンド或いはダイヤモンドライクカーボンと他の物質との複合体(例えば、2相体)であってもよい。
化学修飾は、ポリヌクレオチドを結合可能とすべく、末端に極性基、例えば、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基、アミノ基等を有する炭化水素基で固体支持体表面を置換することによる。このような炭化水素基の炭化水素部分は、炭素数0〜12、中でも0〜6であることが好ましい。このようなものとして、蟻酸、酢酸、プロピオン酸等のモノカルボン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などのジカルボン酸、トリメリット酸等の多価カルボン酸等が挙げられるが、中でもシュウ酸、コハク酸が望ましい。
そして、この炭化水素基は固体支持体表面に対しアミド結合されていることが望ましい。アミド結合させることにより、化学修飾を容易かつ強固なものとできるからである。
このような化学修飾は、ハイブリッド形成用担体の表面に紫外線照射してを塩素化、アンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化、次いで適当な酸クロリドあるいは無水多価カルボン酸を用いてカルボキシル化することにより達成できる。
(2)ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチドの固定
次に、化学修飾部分にハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド(以下、オリゴヌクレオチドHという。)をアミド結合により固定する。このオリゴヌクレオチドH(配列表の配列番号5参照)を含んだ液をハイブリダイズ形成用担体にスポットして、オリゴヌクレオチドの5’末端側に含まれる第1級アミンを結合させる。固定前に、化学修飾の炭化水素基末端を脱水縮合剤で活性化しておくと、固定が容易となるので望ましい。特に、脱水縮合剤としては、カルボジイミドを用いることが好ましい。
なお、このような方法のほか、オリゴヌクレオチド固定化担体の表面を塩素化、アミノ化した状態(カルボキシル化しない)とし、形成された第1級アミノ基に、N−ヒドロキシスクシンイミドによりジカルボン酸を予め活性化した活性化ジエステルの一方のエステル基を脱水縮合させることにより形成することもできる。
また、化学修飾したハイブリダイズ形成用担体とのアミド結合の容易性を考慮して、固定側にデオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸、デオキシグアニル酸等の第1級アミンを1〜10塩基有することが望ましい。オリゴヌクレオチドHはハイブリダイズ形成用担体の表面に対して垂直方向に固定化されるので、DNAの情報を読みとりやすい。
特に望ましくは、固定側(5’末端)の1〜20塩基がデオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸又はデオキシシチジル酸であることが望ましい。
(3)オリゴヌクレオチドHをデハイブリダイズさせる。
96℃位の温水中にオリゴヌクレオチドを固定したハイブリダイズ形成用担体を浸漬し、更に水洗することによりデハイブリタイズする。
実施例
実施例1(EcoRIで切断したgDNAを固定化したハイブリッド形成用担体)
(1)ハイブリッド形成用担体の化学修飾
塩素ガス中でダイヤモンドチップに紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、酸クロリドを10重量%含む1,4−ジオキサン中に浸漬してカルボキシル化し、化学修飾されたチップを得た。
(2)EcoRIによるλファージDNAの切断
λファージDNAをEcoRIにより切断し21kbpのフラグメントを回収した。
(1)で得られた化学修飾されたチップを、ハイドロゲンシアナミドとN−ヒドロキシスクシンイミドにより活性化エステルとし、先に得られたλファージ21kbpフラグメントの1μg/μl濃度の水溶液に浸漬けてgDNAを固定化した。
該フラグメントの500bpのセグメントをPCRによる増幅を確認することにより、gDNAがチップに対して垂直方向に固定化していることを確認した。
(3)ハイブリタイズしたgDNAのデハイブリタイズ
(2)で得られたチップを96℃の温水中に浸漬後、水洗してデハイブリタイズした。
(4)λファージ21kbpフラグメントのCy3標識
(2)で得られたλファージ21kbpをLabel ITTM(PanVera社)を用いてCy3標識し、1μg/μlの水溶液とした。この溶液を96℃で5分間加熱して2本鎖を1本鎖にして、(3)でデハイブリダイズしたチップを浸漬しでハイブリダイズさせた後、蛍光スキャナーで蛍光強度を測定した結果、λファージ21kbpは30fmol/mm2固定化されていた。
実施例2(オリゴヌクレオチドを固定したハイブリダイズ形成用担体による一塩基変異の検出)
(1)ハイブリッド形成用担体の化学修飾
塩素ガス中で軟ダイヤモンドをコーティングしたスライドグラスに紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、酸クロリドを10重量%含む1,4−ジオキサン中に浸漬してカルボキシル化し、化学修飾されたチップを得た。
(2)オリゴヌクレオチドの固定
(1)で得られたハイブリッド形成用担体に、スポッターを用いて、10pmol/μlの濃度に調製したオリゴヌクレオチド溶液AおよびBを固定化した。なお、オリゴヌクレオチドA(配列表の配列番号1参照)はオリゴヌクレオチドA’(配列表の配列番号2参照)と、オリゴヌクレオチドB(配列表の配列番号3参照)はオリゴヌクレオチドB’(配列表の配列番号4参照)と、4℃で5時間ハイブリダイズさせた後にサンプルとして用いた。
(3)ハイブリダイゼーション
(2)で得られたオリゴヌクレオチドを固定化したハイブリッド形成用担体を96℃の熱湯中に入れ、1pmol/μlの濃度に調製したオリゴヌクレオチド溶液A(ハイブリダイスさせていない)をのせ、カバーグラスで覆った後に、5℃で12時間ハイブリダイズした。
(4)蛍光観察
(3)で得られた基板を洗浄・乾燥し、蛍光スキャナーで観察した結果、オリゴヌクレオチドAを固定したスポットでは蛍光が観察され、オリゴヌクレオチドBを固定したスポットからは蛍光が観察されなかった。
産業上の利用可能性
本発明のハイブリッド形成用担体は、ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチドを垂直方向に固定しているので、DNA等の情報が容易に、正確に読みとれる。また、読みとる前にデハイブリタイズしているので、情報がより正確になる。
【配列表】
Claims (12)
- ハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAが固定化されていることを特徴とするハイブリッド形成用担体。
- ハイブリタイズしたオリゴヌクレチド、cDNAあるいはgDNAが2個以上連続して第1級アミンを有するヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項1記載のハイブリッド形成用担体。
- 第1級アミンを有するヌクレオチドがデオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸あるいはデオキシグアニル酸であることを特徴とする請求項1又は2記載のハイブリッド形成用担体。
- 第1級アミンを有するヌクレオチドが5’末端側に存在することを特徴とする請求項1〜3記載のハイブリッド形成用担体。
- オリゴヌクレオチドが5’突出末端であることを特徴とする請求項1乃至4記載のハイブリッド形成用担体。
- cDNAが5’末端側に2個以上連続して第1級アミンを有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成されることを特徴とする請求項1又は2記載のハイブリッド形成用担体。
- gDNAが5’末端側に2個以上連続して第1級アミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限酵素により切断されることを特徴とする請求項1又は2記載のハイブリッド形成用担体。
- gDNAが5’突出末端側に2個以上連続して第1級アミンを有するヌクレオチドが含まれるように切断する制限酵素により切断されることを特徴する請求項1、2又は7記載のハイブリッド形成用担体。
- デオキシアデニル酸、デオキシシチジル酸あるいはデオキシグアニル酸がハイブリッド形成用担体側に固定化されていることを特徴とする請求項1乃至8記載のハイブリッド形成用担体。
- ハイブリッド形成用担体に固定するハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAが、固定側の末端に第1級アミンを有するヌクレオチドを1〜10個有することを特徴とする請求項9記載のハイブリッド形成用担体。
- ハイブリッド形成用担体を化学修飾し、これにハイブリタイズしたオリゴヌクレオチド、cDNAあるいはgDNAを固定した後、担体に固定化されていない相補的なオリゴヌクレチド、cDNAあるいはgDNAをデハイブリタイズすることを特徴とするハイブリットの固定化方法。
- ハイブリッド形成用担体の化学修飾が、ハイブリッド形成用担体の表面の塩素化、アミノ化およびカルボキシル化からなる請求項11記載のハイブリットの固定化方法。
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