JP2005345231A - マイクロアレイ用固相基板の使用方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 マイクロアレイ作製において、スポット周囲の彗星状の蛍光を抑制し、検出精度の高いマイクロアレイ用固相基板の使用方法を提供すること。
【解決手段】 生理活性物質を捕捉する物質である捕捉物を固定し、更に捕捉された生理活性物質量を蛍光により検出を行なうマイクロアレイ固相基板の使用方法あって、該基板の表面の一部に生理活性物質を固定化後、塩および／または界面活性剤を含む溶液で煮沸する処理工程を含むマイクロアレイ用固相基板の使用方法。
【選択図】 図１

Description

本発明は、試料検体からの情報シグナルを蛍光量として検出するマイクロアレイ用固相基板の使用方法に関する。

マイクロアレイを用いて試料検体の情報を得る技術は、生物学、医学において欠くことのできない技術になりつつある。例えばＤＮＡマイクロアレイでは、複雑な生物系においてもゲノム全体の発現パターンの研究が可能となり、遺伝子情報量の爆発的な増加がもたらされている。
マイクロアレイのシグナル検出において、マイクロアレイ用基板のバックグランドはＳ／Ｎ比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば、非特許文献１）。Ｓ／Ｎ比とは、ラベル化された試料検体から得られたシグナル量（シグナル）をラベル化された試料検体から得られたシグナル物質以外の部位から発生したシグナル量（ノイズ）で除した値のことをいい、Ｓ／Ｎ比が高いと検出感度が高くなる。
マイクロアレイ上の物質を検出する手段として蛍光物質を用いる場合、マイクロアレイ固相基板の自己蛍光量がバックグランドとなり、基板の自己蛍光が高いと、Ｓ／Ｎ比が低下する問題がある。また、バックグラウンドにムラが生じた場合、その基板から得られたデータの再現性・信頼性に支障をきたす。
ゆえに、マイクロアレイ基板の材料には低蛍光性のものを使用することが多い。また、基板表面には核酸を効率良く固定化するための化学的修飾が施されることが通常であり、アルデヒド基やアミノ基を導入したものが多用されている。これらの官能基に由来する蛍光を低減することは、マイクロアレイを用いたアッセイの精度向上の観点から重要となってくる。マイクロアレイ用基板はガラスもしくはプラスチック製であることが多いが、通常これらの材料表面は化学的に不活性であることから、核酸を固定化するためには表面修飾を施す必要がある。表面修飾としては、アルデヒド基、アミノ基などの活性な官能基を導入する場合が多い。アミノ基を導入した基板では、基板全体が正電荷を帯びているため、負電荷をもつ核酸分子を静電的相互作用により固定化することができる。また、アルデヒド基を導入した基板では、固定化する核酸分子にアミノ基を予め導入しておくことにより、共有結合形成による強固な固定化が可能であることから、特に塩基数が数十個以下のオリゴＤＮＡ固定化用基板として広く用いられている（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３）。

バックグランドの上昇の要因として、基板の自己蛍光のほかに、検査処理過程でバックグランドが上昇することも要因として挙げられる。特にスポット周囲の蛍光は、バックグランドを顕著に増大させるため、問題となっている。
試料検体を基板にスポットする方法は、マイクロピン方式やインクジェット方式が挙げられる。スポット後の形状が円形であればあるほど、その後の蛍光スキャナの読み取りが正確になり、より高精度なシグナル情報を得ることができる。しかしながら、マイクロアレイ作製過程および検査処理過程において、
スポットが円形にならない場合があり、蛍光スキャナの読み取りに支障をきたす場合がある。この現象は、スポットの周囲において顕著に観察される。ＤＮＡマイクロアレイを例に挙げると、マイクロアレイ作製過程および検査処理過程におけるスポット周囲の彗星状の蛍光、およびスポット周囲の蛍光が観察される場合がある。このことにより、シグナルの読み取りが不正確になり、また、基板のバックグランドも上昇するために、シグナルの検出精度が低くなってしまう。このため、スポット周囲の彗星状の蛍光、およびスポット周囲の蛍光を抑制する方法が求められていた。
「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、２０００年、ｐ.５７ 特開２００２−１７６９９１号公報 特開２００２−１８１８１７号公報 特表２００２−５３２６９９号公報

本発明の目的は、マイクロアレイ作製過程においてスポット周囲の彗星状の蛍光を抑制し、高い検出精度を有するマイクロアレイ用固相基板の使用方法を提供することである。

本発明は、
（１）生理活性物質を捕捉する物質である捕捉物を固定し、更に捕捉された生理活性物質量を蛍光により検出を行なうマイクロアレイに用いられる固相基板の使用方法であって、該基板の表面の一部に生理活性物質を固定化後、塩および／または界面活性剤を含む溶液で煮沸する処理工程を含むことを特徴とするマイクロアレイ用固相基板の使用方法、
（２） 固相基板の素材がプラスチックである（１）記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法、
（３） プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（２）記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法、
（４） 固相基板表面がアミノ基で修飾されている（１）〜（３）いずれか記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法、
（５） 固相基板表面がアルデヒド基で修飾されている（１）〜（３）いずれか記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法、
（６） 界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムを含むものである（１）〜（５）いずれか記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法、
（７） 生理活性物質が核酸、ペプチド核酸、アプタマー、オリゴペプチド、糖鎖、およびそれらの類似物の中から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも１つを含む複合体である（１）〜（６）いずれか記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法、
である。

本発明により、シグナル蛍光の検出精度の高いマイクロアレイ用固相基板の使用方法を提供することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
上述したように、マイクロアレイ作製過程およびマイクロアレイ用基板を用いての検査処理の過程において、蛍光スキャナの読み取りに支障をきたす場合がある。これは、スポットの彗星状の蛍光、およびスポット周囲の蛍光（以後、「スポット周囲の彗星状の蛍光」と表記する）となって、顕著に観察される。
本発明におけるマイクロアレイの使用方法は、固相基板上に生理活性物質が固定化された後に、塩および／または界面活性剤を含む溶液で煮沸する処理工程を含むことにより、溶液中へ流される生理活性物質の基板への吸着を低減することを特徴とする。

ＤＮＡマイクロアレイを例に挙げる。核酸マイクロアレイでは、基板上にＤＮＡが溶解された溶液をスポット、次いで熱処理、ＵＶ照射などにより固定化し、洗浄、ブロッキングなどの好適な処理を施す。その前後いずれかに、基板上に固定化されたＤＮＡを一本鎖状態にするために基板を沸騰した純水中に浸漬する「煮沸工程」が導入される。そして、試料検体のハイブリダイゼーションを行ない、適宜な洗浄をした後に、蛍光スキャナで検体からの蛍光シグナルを読み取る。

本発明者らは、この工程の中で、基板を沸騰させた純水中に浸漬する「煮沸工程」が、その後のスポット周囲の蛍光に大きく影響することを見出した。沸騰させた純水中に浸漬したとき、基板上にスポットされた生理活性物質のうち、基板上に固定化されていない生理活性物質が基板上に流れ出る際に、基板表面への非特異的な吸着を起こす。この非特異的吸着が、スポット周囲の彗星状の蛍光となって観察される。この現象は、固相基板がガラスの場合に比べて、その表面性の違いからプラスチックの場合に顕著になる。

さらに、本発明者らは、この「煮沸工程」において、沸騰させた純水を用いるのではなく、塩および／または界面活性剤を含む純水を用いることで、問題となっていたスポット周囲の蛍光を抑制することを見出した。塩／およびまたは界面活性剤を用いることで、溶液中のイオン強度を上がり、ＤＮＡが分散しやすくなり、スポット中から流れ出すＤＮＡの基板への吸着を抑制することができる。この効果は、固相基板がガラスの場合に比べて、その表面性の違いからプラスチックの場合に大きくなる。

本発明に用いる塩としては、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等が挙げられ、特に塩化ナトリウムであることが好ましい。
本発明に用いる溶液中の塩濃度は、好ましくは３０ｍM以上、より好ましくは、
５０ｍM〜１０００ｍM、さらに好ましくは１５０ｍM〜４５０ｍMである。塩濃度が低すぎると、ＤＮＡを分散させる効果が発揮されず、スポット周囲の彗星状の蛍光が観察されてしまい、好ましくない。

本発明の溶液中には界面活性剤を添加されていることが好ましい。界面活性剤としては、一般的なものを用いることができ、アニオン性、カチオン性、あるいはノニオン性であってもよいが、ノニオン性、アニオン性がより好ましく、アニオン性がさらに好ましい。ノニオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ポリエチレングリコールなどが挙げられ、アニオン性界面活性剤として、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ-ドデシルサルコシン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩などを好適に用いることができるが、バックグラウンドを抑える効果が高いドデシル硫酸ナトリウムが最も好ましい。

界面活性剤の添加量は、０．００１〜１．０重量％であることが好ましく、０．００５〜０．５重量％であることがさらに好ましい。過剰量の界面活性剤の添加は、室温における緩衝液中の界面活性剤の析出が著しく、ハンドリング面で困難を伴なうため好ましくない。逆に、界面活性剤添加量が過少であると、ＤＮＡを分散させる効果が発揮されず、スポット周囲の彗星状の蛍光が観察されてしまい、好ましくない。

本発明によるマイクロアレイの使用方法における煮沸工程の工程順序については特に限定はないが、ブロッキング工程の前後いずれかであることが好ましい。本発明における煮沸工程により、基板上に固定化されたＤＮＡを一本鎖にほぐし、その後のハイブリダイゼーションの効率を良くすることだけでなく、スポット周囲の彗星状の蛍光を抑制することができる。

本発明におけるマイクロアレイ用固相基板の素材は、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、プラスチックの場合が、本発明の効果が最も発揮される。プラスチックとしては、バックグランドを抑えるために蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂が好ましい。たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。

本発明におけるマイクロアレイ用固相基板は、表面に官能基を修飾していることが好ましい。官能基としては、アルデヒド基、アミノ基、エポキシ基、活性エステルなどが挙げられるが、アルデヒド基、アミノ基であることが好ましい。表面の官能基がアミノ基のときは、静電的相互作用により、核酸を固定化することができるが、表面の官能基がアルデヒド基のときは、アルデヒド基との反応性を高めるため、固定化する核酸に予めアミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基の導入位置は核酸の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが好ましい。

本発明で用いる生理活性物質としては、生理活性物質としては、核酸、ペプチド核酸、アプタマー、オリゴペプチド、糖鎖、およびこれらの類似物の中から選ばれる少なくとも１つであるか、またはこれらの中から少なくとも１つを含む複合体を挙げることができるがこれらに限定されない。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、実施例の範囲に限定されるものではない。
（ＰＣＲ産物の調整）
長鎖ＤＮＡおよび蛍光標識長鎖ＤＮＡの調整は、ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ４８０（タカラバイオ社製）を使用して、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを用いた。プライマーとして、オリゴヌクレオチド（シグマジェノシス社製）（配列１：ＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡＧＣ（配列番号１）、配列２：ＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴ（配列番号２））を使用し、ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎｌｉｖｅｒ）（タカラバイオ社製）を鋳型として、βアクチン遺伝子のＤＮＡ断片（５０２ｂｐ）を増幅した。
ＰＣＲ反応液の組成は、２００μＭ ｄＮＴＰ、ＴａｋａｒａＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）、２ｍＭＭｇＣｌ₂、Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒであり、ＰＣＲ反応は、プレ変性：９０℃、３０秒；１サイクル、熱変性：９０℃、３０秒、アニーリング：６０℃、３０秒、伸長：７２℃、４５秒；３０サイクル、伸長：７２℃、３分；１サイクルで行なった。この断片をアガロースゲル電気泳動により増幅されていることを確認後、マイクロコン１００（ミリポア社製）を用いて、ＰＣＲ増幅産物を精製、濃縮した。
蛍光標識長鎖ＤＮＡの調整は、Ｃｙ３標識オリゴヌクレオチドを用いて、上記と同様の方法で行なった。

（基板の作製過程）
飽和環状ポリオレフィン樹脂をスライドガラス形状（７６×２６×１ｍｍ）に加工した。表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキルシランの２％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した基板を作製した。

（ＤＮＡの固定化過程）
上記で得られた長鎖ＤＮＡを所定の水溶液を用いて、所定濃度に溶解し、９６穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて基板上に点着した。基板は、上記で得られたアミノ基が導入されたプラスチックを用いた。点着後、８０℃で１時間熱処理、ＵＶを照射（１２０ｍＪ）することにより長鎖ＤＮＡを固定化し、０．１％ＳＤＳで洗浄を行なった。

（基板の煮沸過程）
上記過程を経た基板を実施例１〜実施例３および比較例１によりそれぞれ煮沸を行なった。

（実施例１）
２×ＳＳＣ（クエン酸ナトリウム緩衝液）、０．１％ＳＤＳの水溶液を調整し、ホットプレート上で沸騰させた後、基板を１分間浸漬した。この場合の塩濃度は、３００ｍＭであった。

（実施例２）
２×ＳＳＣを調整し、ホットプレート上で沸騰させた後、基板を１分間浸漬した。このときの塩濃度は３００ｍＭであった。

（実施例３）
０．１％ＳＤＳの水溶液を調整し、ホットプレート上で沸騰させた後、基板を１分間浸漬した。

（比較例１）
ホットプレート上で沸騰させた純水中に、基板を１分間浸漬した。

（ブロッキング過程およびハイブリダイゼーション過程）
実施例１〜実施例３および比較例１によりそれぞれ煮沸を行なった基板を５×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ水溶液中に５０℃で1時間浸すことで、ＤＮＡが点着されていない部分のブロッキングを行なった。次いで、水で洗浄した後、ハイブリダイゼーション反応を５０℃で１６時間行なった。ハイブリダイゼーション溶液として、上記で得られた蛍光標識長鎖ＤＮＡを所定の濃度に溶解した、５×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳを用いた。
ハイブリダイゼーション終了後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で４２℃、１０分浸漬した。その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で室温で１０分浸漬し、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの順に洗浄を行なった。次いで、基板を遠心することにより乾燥した。

（蛍光スキャナによるスポットの蛍光強度の数値化）
マイクロアレイスキャナ「ＳｃａｎＡｒｒａｙ Ｌｉｔｅ」（パッカードバイオチップテクノロジー社製）を用いて、上記で得られた各基板のスポットの蛍光を検出した。スポットの蛍光強度の数値化は、スキャナに付属の解析用ソフトウェア「ＱｕａｎｔＡｒｒａｙ」を用いて行なった。

比較例１の蛍光量を１として各実施例の蛍光量を相対値を表１に示す。また、表中のＣＶ値は、９６スポットの各蛍光量の平均値を９６スポットの各蛍光量の標準偏差で除した値であり、シグナルのバラツキを表すものである。また、各基板のスポットの蛍光イメージを図１〜図４に示す。
実施例１、実施例２、実施例３では、比較例１と比較して、スポット周囲の彗星状の蛍光が観察されず、基板のバックグランド蛍光値も低い結果となった。かつスポットの蛍光量も高い結果となり、この結果は、本発明の効果を支持するものであった。

本発明により、スポット周囲の彗星状の蛍光を抑制したマイクロアレイの作製が可能となり、高い検出精度を有するマイクロアレイの提供が可能となった。

実施例１を経て作製した基板におけるスポットの蛍光イメージである。 実施例２を経て作製した基板におけるスポットの蛍光イメージである。 実施例３を経て作製した基板におけるスポットの蛍光イメージである。 比較例１を経て作製した基板におけるスポットの蛍光イメージである。

Claims (7)

1. 生理活性物質を捕捉する物質である捕捉物を固定し、更に捕捉された生理活性物質量を蛍光により検出を行なうマイクロアレイに用いられる固相基板の使用方法であって、該基板の表面の一部に生理活性物質を固定化後、塩および／または界面活性剤を含む溶液で煮沸する処理工程を含むことを特徴とするマイクロアレイ用固相基板の使用方法。
2. 固相基板の素材がプラスチックである請求項１記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法。
3. プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項２記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法。
4. 固相基板表面がアミノ基で修飾されている請求項１〜３いずれか記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法。
5. 固相基板表面がアルデヒド基で修飾されている請求項１〜３いずれか記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法。
6. 界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムを含むものである請求項１〜５いずれか記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法。
7. 生理活性物質が核酸、ペプチド核酸、アプタマー、オリゴペプチド、糖鎖、およびそれらの類似物の中から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも１つを含む複合体である請求項１〜６いずれか記載のマイクロアレイ用固相基板の使用方法。