KR20030051806A - 하이브리드 형성용 담체 및 하이브리드의 고정화 방법 - Google Patents

하이브리드 형성용 담체 및 하이브리드의 고정화 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20030051806A
KR20030051806A KR10-2003-7006429A KR20037006429A KR20030051806A KR 20030051806 A KR20030051806 A KR 20030051806A KR 20037006429 A KR20037006429 A KR 20037006429A KR 20030051806 A KR20030051806 A KR 20030051806A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
carrier
hybrid
oligonucleotide
gdna
acid
Prior art date
Application number
KR10-2003-7006429A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100509217B1 (ko
Inventor
오까무라히로시
단가미찌후미
야마까와가오루
오바미쯔요시
다까기겐이찌
Original Assignee
도요 고한 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 도요 고한 가부시키가이샤 filed Critical 도요 고한 가부시키가이샤
Publication of KR20030051806A publication Critical patent/KR20030051806A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100509217B1 publication Critical patent/KR100509217B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00502—Particles of irregular geometry
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

DNA 의 말단 부분을 파손시키지 않고 DNA 의 해명을 효율적으로 행할 수 있으며, 분자생물학 분야, 생화학 분야 등에서 유용한 하이브리드 형성용 담체를 제공하는 것을 목적으로 한다. 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 가 고정화된 담체에 있어서, 담체를 화학적으로 개질하여 여기에 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 를 고정하고, 다시 디하이브리다이즈함으로써, 올리고 뉴클레오티드를 결합한 뉴클레오티드 고정용 담체를 제조한다.

Description

하이브리드 형성용 담체 및 하이브리드의 고정화 방법{SUPPORTS FOR HYBRIDIZATION AND METHOD OF IMMOBILIZING HYBRID}
유전자 해석은 분자생물학, 유전자공학 분야에서 유용하며, 최근에는 질병의 발견 등 의료 분야에서도 이용되고 있다.
유전자 해석에서, 최근 DNA 칩이 개발되어 해석 속도가 현저하게 빨라졌다. 그러나, 종래의 DNA 칩은 슬라이드 유리 또는 실리콘 기판 표면에 폴리리신 등의 고분자를 도포하고, 그 후에 DNA 를 고정하는 방법이다. 또, 포토리소그래피 등의 반도체 기술을 사용하여 유리 기판 상에 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
하지만, 슬라이드 유리 또는 실리콘 기판 표면에 폴리리신 등의 고분자를 도포하여 DNA 를 고정하는 방법에서는, DNA 의 고정화 상태가 불안정하고 하이브리드 형성 공정이나 세정 공정에서 DNA 가 박리된다는 문제가 발생한다. 또, 반도체 기술을 사용한 DNA 칩은 제조 공정의 번잡함으로 인해 매우 고가라는 문제가 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서는, 고체 지지체 표면에 DNA 를 고밀도로 강고하게 고정화할 필요가 있다.
또, 종래 고체 지지체의 표면을 화학적으로 개질된 고체 담체(基體)가 알려져 있다. 그러나, 화학적으로 개질된 부분에 아미드 결합으로 직접 원하는 DNA 를 결합시키면 화학 결합시의 처리 등에 의해 DNA 의 말단 부분이 파손될 우려가 있기 때문에, 개량이 요망되고 있었다.
본 발명은, 상기한 바와 같이 DNA 의 말단 부분을 파손시키지 않고 DNA 의 분석을 효율적으로 행할 수 있고, 분자생물학 분야, 유전자공학 분야 등에서 유용한 뉴클레오티드 고정화용 담체를 제공하고자 하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 분자생물학 분야, 유전자공학 관련 분야에서 유용한, 핵산을 고정화 가능한 하이브리드 형성용 담체, 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 로 이루어지는 하이브리드의 고정화 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 고정화용 담체를 화학적으로 개질한 것에 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드를 고정함으로써 올리고 뉴클레오티드가 고정화용 담체의 표면에 대하여 수직 방향으로 고정화되어, 일염기 다형 DNA 정보를 용이하게 판독할 수 있다.
즉, 청구항 1 에 기재된 본 발명은, 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 가 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체를 제공하는 것이다. 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 가 2 개 이상 연속해서 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드를 함유하는 것이 바람직하다. 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드는 데옥시아데닐산, 데옥시시티딜산 또는 데옥시구아닐산인 것이 바람직하다. 또, 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드는 5' 말단측에 존재하는 것이 바람직하다. 올리고 뉴클레오티드는 5' 돌출 말단인 것이 바람직하다. cDNA 가 5' 말단측에 2 개 이상 연속해서 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드를 함유하는 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성될 수도 있다. gDNA 가 5' 말단측에 2 개 이상 연속해서 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드가 함유되도록 절단하는 제한요소에 의해 절단되는 것을 특징으로 한다. gDNA 가 5' 돌출 말단측에 2 개 이상 연속해서 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드가 함유되도록 절단하는 제한요소에 의해 절단되는 것을 특징으로 한다. 그리고, 데옥시아데닐산, 데옥시시티딜산 또는 데옥시구아닐산이 하이브리드 형성용 담체측에 고정화되어 있는 것이 바람직하다. 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 가 고정측의 말단에 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드를 1∼10개 갖는 것이 바람직하다.
청구항 11 에 기재된 발명은, 하이브리드 형성용 담체를 화학적으로 개질하고, 여기에 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 를 고정한 후, 담체에 고정되어 있지 않은 상보적인 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 를 디하이브리다이즈하는 것을 특징으로 하는 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 로 이루어지는 하이브리드의 고정화 방법이다. 또한 하이브리드 형성용 담체의 화학적 개질이, 담체 표면을 염소화, 아미노화 및 카르복실화의 순서로 행해지는 방법이 바람직하다.
(발명을 실시하기 위한 최선의 형태)
본 발명의 하이브리드 형성용 담체는, 화학적 개질에 의해 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gNDA 가 고정화된 담체로서, 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 가 담체에 대하여 수직으로 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 것이다. 이 때문에, 용이하게 일염기 다형 cDNA 의 정보를 판독할 수 있다.
이 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드는 상보적인 올리고 뉴클레오티드를 디하이브리다이즈하여 담체에 남은 올리고 뉴클레오티드의 정보를 판독한다.
이처럼, 올리고 뉴클레오티드는 필연적으로 DNA 등 2개 사슬의 핵산이다. 올리고 뉴클레오티드는 고등동물, 곰팡이류, 박테리아, 바이러스 등의 천연적인 것 외에 인위적으로 이들의 구조개변을 더한 것, 합성한 것을 들 수 있으나, 후술하는 방법에 의해 간편하게 합성할 수 있으므로 바람직하다.
그리고, 올리고 뉴클레오티드의 염기수는 10∼50개로 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하이브리드 형성용 담체는 이하의 방법에 의해 간편하게 작성할 수 있다.
(1) 하이브리드 형성용 담체의 화학적 개질
본 발명에서는, 이러한 올리고 뉴클레오티드가 화학적으로 개질된 하이브리드 형성용 담체에 고정화되어 있다.
하이브리드 형성용 담체로는, 유리, 다이아몬드, 금, 은, 구리, 알루미늄, 텅스텐, 몰리브덴 등의 금속 ; 상기 유리, 다이아몬드, 금속과 세라믹스의 적층체 ; 폴리카보네이트, 불소 수지 등의 플라스틱 등을 들 수 있다.
기타 재료라 해도 화학적으로 안정된 재료라면 사용할 수 있고, 예를 들어그라파이트, 다이아몬드 라이크 카본을 들 수 있다. 또, 상기 재료의 혼합체 또는 적층체일 수도 있다. 예를 들어, 다이아몬드 라이크 카본을 표면에 코팅한 슬라이드 유리 등을 들 수 있다.
이들 중 DNA 의 고정화 밀도가 매우 높다는 점에서 다이아몬드 또는 다이아몬드 라이크 카본이 바람직하다.
다이아몬드로는 합성 다이아몬드, 고압형성 다이아몬드, 또는 천연 다이아몬드 등 어느 것이나 사용할 수 있다. 또, 이들 구조가 단결정체이든 다결정체이든 지장은 없다. 생산성의 관점에서 마이크로파 플라즈마 CVD 법 등의 기상합성법을 사용하여 제조된 다이아몬드를 사용하는 것이 바람직하다.
다이아몬드 또는 다이아몬드 라이크 카본의 형성방법은 공지된 방법으로 행할 수 있다. 예를 들어, 마이크로파 플라즈마 CVD 법, ECRCVD 법, IPC 법, 직류 스퍼터링법, ECR 스퍼터링법, 이온플레이팅법, 아크 이온 플레이팅법, EB 증착법, 저항가열증착법 등을 들 수 있다. 또, 금속 분말이나 세라믹 분말 등에 관해서는, 원료를 프레스 성형기를 사용하여 압분한 것을 고온에서 소결한 것도 들 수 있다.
담체의 표면은 의도적으로 조면화되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 조면화 표면은 기체의 표면적이 증가하여 다량의 DNA 등을 고정시키는데 적합하기 때문이다. 기체의 형상은 평판형, 실형, 구형, 다각형, 분말형 등 특별히 구애받지 않는다.
그리고, 이 다이아몬드 또는 다이아몬드 라이크 카본으로 이루어지는 하이브리드 형성용 담체는, 다이아몬드 또는 다이아몬드 라이크 카본과 다른 물질과의 복합체 (예를 들어 2 상체) 일 수도 있다.
화학적 개질은 폴리뉴클레오티드를 결합 가능하게 하기 위하여 말단에 극성기, 예를 들어 수산기, 카르복실기, 에폭시기, 아미노기 등을 갖는 탄화수소기로 고체지지체 표면을 치환하는 것에 의한다. 이러한 탄화수소기의 탄화수소 부분은 탄소수 0∼12, 그 중에서도 0∼6 인 것이 바람직하다. 이러한 것으로서 포름산, 아세트산, 프로피온산 등의 모노카르복실산, 옥살산, 마론산, 숙신산, 말레산, 푸말산 등의 디카르복실산, 트리멜리트산 등의 다가 카르복실산 등을 들 수 있으나, 그 중에서도 옥살산, 숙신산이 바람직하다.
그리고, 이 탄화수소기는 고체 지지체 표면에 대하여 아미드 결합되어 있는 것이 바람직하다. 아미드 결합시킴으로써 화학적 개질을 용이하고 강고하게 할 수 있기 때문이다.
이러한 화학적 개질은, 하이브리드 형성용 담체의 표면에 자외선 조사하여 염소화, 암모니아 가스 중에서 자외선 조사하여 아미노화, 이어서 적당한 산클로리드 또는 무수다가카르복실산을 이용하여 카르복실화함으로써 달성할 수 있다.
(2) 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드의 고정
다음으로, 화학적으로 개질된 부분에 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드 (이하, 올리고 뉴클레오티드 H 라 한다) 를 아미드 결합에 의해 고정한다. 이 올리고 뉴클레오티드 H (서열목록의 서열번호 5 참조) 를 포함한 액을 하이브리다이즈 형성용 담체에 배치하고 올리고 뉴클레오티드의 5' 말단측에 포함되는 제 1급 아민을 결합시킨다. 고정전에, 화학적 개질의 탄화수소기 말단을 탈수축합제로 활성화시켜 두면 고정이 용이해지므로 바람직하다. 특히, 탈수축합제로는 카르보디이미드를 사용하는 것이 바람직하다.
또, 이러한 방법 외에 올리고 뉴클레오티드 고정화 담체의 표면을 염소화, 아미노화한 상태 (카르복실화하지 않음) 로 하여, 형성된 제 1 급 아미노기에 N-히드록시숙신이미드에 의해 디카르복실산을 미리 활성화한 활성화 디에스테르의 한 쪽 에스테르기를 탈수축합시킴으로써 형성할 수도 있다.
또, 화학적으로 개질된 하이브리다이즈 형성용 담체와의 아미드 결합의 용이성을 고려하여 고정측에 데옥시아데닐산, 데옥시시티딜산, 데옥시구아닐산 등의 제 1 급 아민을 1∼10 염기 갖는 것이 바람직하다. 올리고 뉴클레오티드 H 는 하이브리다이즈 형성용 담체의 표면에 대하여 수직 방향으로 고정화되기 때문에, DNA 의 정보를 판독하기 쉽다.
특히 바람직하게는 고정측 (5' 말단) 의 1∼20 염기가 데옥시아데닐산, 데옥시시티딜산 또는 데옥시시티딜산인 것이 바람직하다.
(3) 올리고 뉴클레오티드 H 를 디하이브리다이즈시킨다.
96℃ 정도의 온수중에 올리고 뉴클레오티드를 고정한 하이브리다이즈 형성용 담체를 침지하고, 추가로 수세함으로써 디하이브리다이즈한다.
(실시예)
실시예 1 (EcoRI 로 절단한 gDNA 를 고정화한 하이브리드 형성용 담체)
(1) 하이브리드 형성용 담체의 화학적 개질
염소 가스 중에서 다이아몬드 칩에 자외선 조사하여 표면을 염소화하고, 이어서 암모니아 가스 중에서 자외선 조사하여 아미노화한 후, 산클로리드 10중량% 를 함유하는 1,4-디옥산 중에 침지하고 카르복실화하여 화학적으로 개질된 칩을 얻었다.
(2)EcoRI 에 의한 λ파지 DNA 의 절단
λ파지 DNA 를EcoRI 에 의해 절단하여 21 kbp 의 프래그먼트를 회수하였다.
(1) 에서 얻은 화학적으로 개질된 칩을 하이드로겐시아나미드와 N-히드록시숙신이미드에 의해 활성화 에스테르로 하여, 앞서 얻은 λ파지 21 kbp 프래그먼트의 1㎍/㎕ 농도의 수용액에 침지하여 gDNA 를 고정화하였다.
이 프래그먼트의 500 bp 의 세그먼트를 PCR 에 의한 증폭을 확인함으로써, gDNA 가 칩에 대하여 수직 방향으로 고정화되어 있는 것을 확인하였다.
(3) 하이브리다이즈된 gDNA 의 디하이브리다이즈
(2) 에서 얻은 칩을 96℃ 의 온수중에 침지한 후 수세하여 디하이브리다이즈하였다.
(4) λ파지 21 kbp 프래그먼트의 Cy3 표지
(2) 에서 얻은 λ파지 21 kbp 를 Label IT™(PanVera 사) 를 이용하여 Cy3 표지하고, 1㎍/㎕ 의 수용액으로 하였다. 이 용액을 96℃ 에서 5분간 가열하여 2 줄 사슬을 1개 사슬로 하고, (3) 에서 디하이브리다이즈된 칩을 침지하여 하이브리다이즈시킨 후, 형광 스캐너로 형광강도를 측정한 결과, λ파지 21 kbp 는 30fmol/㎟ 고정화되어 있었다.
실시예 2 (올리고 뉴클레오티드를 고정한 하이브리다이즈 형성용 담체에 의한 일염기 변이의 검출)
(1) 하이브리드 형성용 담체의 화학적 개질
염소 가스 중에서 연다이아몬드를 코팅한 슬라이드 유리에 자외선 조사하여 표면을 염소화하고, 이어서 암모니아 가스 중에서 자외선 조사하여 아미노화한 후, 산클로리드를 10중량% 포함하는 1,4-디옥산 중에 침지하고 카르복실화하여 화학적으로 개질된 칩을 얻었다.
(2) 올리고 뉴클레오티드의 고정
(1) 에서 얻은 하이브리드 형성용 담체에 스포터를 사용하여 10pmol/㎕ 의 농도로 조제한 올리고 뉴클레오티드 용액 A 및 B 를 고정화하였다. 그리고 올리고 뉴클레오티드 A (서열목록의 서열번호 1 참조) 는 올리고 뉴클레오티드 A' (서열목록의 서열번호 2 참조) 로, 올리고 뉴클레오티드 B (서열목록의 서열번호 3 참조) 는 올리고 뉴클레오티드 B' (서열목록의 서열번호 4 참조) 로 4℃ 에서 5시간 하이브리다이즈시킨 후 샘플로 사용하였다.
(3) 하이브리다이제이션
(2) 에서 얻은 올리고 뉴클레오티드를 고정화한 하이브리드 형성용 담체를 96℃ 의 열탕 중에 넣어 1pmol/㎕ 의 농도로 조제한 올리고 뉴클레오티드 용액 A (하이브리다이즈시키지 않음) 를 올려, 커버 글래스로 덮은 후에 5℃ 에서 12시간 하이브리다이즈하였다.
(4) 형광관찰
(3) 에서 얻은 기판을 세정·건조시켜 형광 스캐너로 관찰한 결과, 올리고 뉴클레오티드 A 를 고정한 스포트에서는 형광이 관찰되고, 올리고 뉴클레오티드 B를 고정한 스포트에서는 형광이 관찰되지 않았다.
본 발명의 하이브리드 형성용 담체는, 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드를 수직 방향으로 고정하고 있기 때문에 DNA 등의 정보를 쉽고 정확하게 판독할 수 있다. 또한, 판독하기 전에 디하이브리다이즈하고 있기 때문에 정보가 더욱 정확해진다.

Claims (12)

  1. 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 가 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  2. 제 1 항에 있어서, 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 가 2 개 이상 연속해서 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드가 데옥시아데닐산, 데옥시시티딜산 또는 데옥시구아닐산인 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한항에 있어서, 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드가 5' 말단측에 존재하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 올리고 뉴클레오티드가 5' 돌출 말단인 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, cDNA 가 5' 말단측에 2 개 이상 연속해서제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드를 함유하는 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하여 합성되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, gDNA 가 5' 말단측에 2 개 이상 연속해서 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드가 함유되도록 절단하는 제한효소에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  8. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, gDNA 가 5' 돌출 말단측에 2 개 이상 연속해서 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드가 함유되도록 절단하는 제한효소에 의해 절단되는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서, 데옥시아데닐산, 데옥시시티딜산 또는 데옥시구아닐산이 하이브리드 형성용 담체측에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  10. 제 9 항에 있어서, 하이브리드 형성용 담체에 고정하는 하이브리다이즈된 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 가 고정측의 말단에 제 1 급 아민을 갖는 뉴클레오티드를 1∼10개 갖는 것을 특징으로 하는 하이브리드 형성용 담체.
  11. 하이브리드 형성용 담체를 화학적으로 개질하고, 여기에 하이브리다이즈된올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 를 고정한 후, 담체에 고정화되어 있지 않은 상보적인 올리고 뉴클레오티드, cDNA 또는 gDNA 를 디하이브리다이즈하는 것을 특징으로 하는 하이브리드의 고정화 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 하이브리드 형성용 담체의 화학적 개질이, 하이브리드 형성용 담체 표면의 염소화, 아미노화 및 카르복실화로 이루어지는 것을 특징으로 하는 하이브리드의 고정화 방법.
KR10-2003-7006429A 2000-11-13 2001-11-09 하이브리드 형성용 담체 및 하이브리드의 고정화 방법 KR100509217B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000344651 2000-11-13
JPJP-P-2000-00344651 2000-11-13
PCT/JP2001/009798 WO2002039111A1 (fr) 2000-11-13 2001-11-09 Supports d'hybridation et procede d'immobilisation d'hybrides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20030051806A true KR20030051806A (ko) 2003-06-25
KR100509217B1 KR100509217B1 (ko) 2005-08-18

Family

ID=18818814

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2003-7006429A KR100509217B1 (ko) 2000-11-13 2001-11-09 하이브리드 형성용 담체 및 하이브리드의 고정화 방법

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20040132031A1 (ko)
EP (1) EP1343008A4 (ko)
JP (1) JPWO2002039111A1 (ko)
KR (1) KR100509217B1 (ko)
CN (1) CN1474943A (ko)
AU (1) AU2002212738A1 (ko)
WO (1) WO2002039111A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7491554B2 (en) * 2003-04-23 2009-02-17 Tadamasa Fujimura Carrier of a diamond fine particle for immobilizing virus

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5237016A (en) * 1989-01-05 1993-08-17 Siska Diagnostics, Inc. End-attachment of oligonucleotides to polyacrylamide solid supports for capture and detection of nucleic acids
US5106730A (en) * 1989-07-24 1992-04-21 Microprobe Corporation Lactam-containing compositions and methods useful for the hybridization of nucleic acids
WO1993015228A1 (en) * 1992-01-29 1993-08-05 Hitachi Chemical Co., Ltd. Polynucleotide immobilized support
CA2140763A1 (en) * 1992-07-28 1994-02-03 Masato Mitsuhashi Gene detection system
EP0998347A1 (en) * 1997-07-22 2000-05-10 Rapigene, Inc. Polyethylenimine-based biomolecule arrays
US6391655B1 (en) * 1997-07-30 2002-05-21 Corning Incorporated Oxidized styrenic polymers for DNA binding
EP1000978B1 (en) * 1997-07-31 2009-05-13 Sumitomo Chemical Company, Limited Acrylic resin film and laminated film containing the same
US5858653A (en) * 1997-09-30 1999-01-12 Surmodics, Inc. Reagent and method for attaching target molecules to a surface
US6465182B1 (en) * 1999-04-29 2002-10-15 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to oligonucleotide microarrays
EP1182252A4 (en) * 1999-05-10 2002-10-09 Toyo Kohan Co Ltd METHOD FOR THE PRODUCTION OF LIBRARIES AND CARRIERS WITH DNA LIBRARIES IMMOBILIZED THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
US20040132031A1 (en) 2004-07-08
KR100509217B1 (ko) 2005-08-18
CN1474943A (zh) 2004-02-11
JPWO2002039111A1 (ja) 2004-03-18
AU2002212738A1 (en) 2002-05-21
WO2002039111A1 (fr) 2002-05-16
EP1343008A1 (en) 2003-09-10
EP1343008A4 (en) 2007-08-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1068356B1 (en) Addressable protein arrays
AU2006243370B2 (en) New labelling strategies for the sensitive detection of analytes
CN1232510A (zh) 鉴定反义寡核苷酸结合的方法
US7851159B2 (en) Method for detecting target nucleic acid with specific base sequence and set of nucleic acids for detection
EP2476759B1 (en) Carrier for holding nucleic acids
JP3786248B2 (ja) 化学修飾を施した基体およびその製造方法
KR100608152B1 (ko) 고체 지지체 상에 핵산을 고정시키기 위한 기판
EP1548102B1 (en) Solid support having electrostatic layer and use thereof
AU771491B2 (en) Method for characterizing nucleic acid fragments
KR100509217B1 (ko) 하이브리드 형성용 담체 및 하이브리드의 고정화 방법
KR100482718B1 (ko) 핵산 프로브 고정화 기체 및 그것을 이용한 표적 핵산의존재를 검출하는 방법
JP2003172737A (ja) 固体支持体、基体、バイオセンサ、およびそれらを用いた生体物質の解析方法
KR100695057B1 (ko) 뉴클레오티드 고정용 담체 및 이의 제조 방법
WO2002054068A1 (fr) Procédé de réutilisation d'un substrat d'immobilisation de l'adn
WO1999034014A2 (en) A method for the determination of a nucleic acid
JP3917640B2 (ja) 核酸プローブ固定化基体を用いた標的核酸の存在を検出する方法
JP2002202304A (ja) Ｄｎａ固定化基体の製造法
JP5128031B2 (ja) ＲｅｃＡタンパク質を用いて標識が導入された核酸を製造する方法
JPWO2002031502A1 (ja) 化学修飾を施した基体およびその製造方法
AU2004200234A1 (en) Addressable protein arrays
JP2008271789A (ja) 制限酵素キット、それを用いた標的核酸の増幅方法及び検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee