CN1232510A - 鉴定反义寡核苷酸结合的方法 - Google Patents

鉴定反义寡核苷酸结合的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1232510A
CN1232510A CN97198481A CN97198481A CN1232510A CN 1232510 A CN1232510 A CN 1232510A CN 97198481 A CN97198481 A CN 97198481A CN 97198481 A CN97198481 A CN 97198481A CN 1232510 A CN1232510 A CN 1232510A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligonucleotide
library
hybridization
rna
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN97198481A
Other languages
English (en)
Inventor
G·施密特
A·H·汤普森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Brax Genomics Ltd
Original Assignee
Brax Genomics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Brax Genomics Ltd filed Critical Brax Genomics Ltd
Publication of CN1232510A publication Critical patent/CN1232510A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种鉴定能结合靶mRNA的反义寡核苷酸的方法,该方法包括:在杂交条件下使靶mRNA与寡核苷酸文库的每个成员分别接触,除去未杂交的物质,测定哪个或哪些成员杂交;其中寡核苷酸文库包括有预定共同长度的多个不同的核苷酸序列,其中每个核苷酸序列包含4至8个碱基的已知序列,且此已知序列的所有可能的组合均存在于该文库中。

Description

鉴定反义寡核苷酸结合的方法
发明领域
本发明涉及一种鉴定RNA分子中反义试剂可及位点的方法以及鉴定反义寡核苷酸的方法。
发明背景
用于鉴定结合RNA的寡核苷酸(ON)的大多数文库策略是利用RNA酶H断裂靶mRNA作为其选择过程的关键部分。然而，这只能选出通过正常Watson-Crick相互作用与其靶结合的寡核苷酸。与靶RNA结合的寡核苷酸可介导RNA酶H的断裂，且所得片段能用高分辨凝胶电泳分离获得。通过测定片段序列可确定成功寡核苷酸的精确序列。Mishra和Toulme(1)已经发展了另一种选择性方法系依据与其靶结合的寡脱氧核苷酸(ODN)的选择性扩增，并且已经证明，该结合反应中存在非Watson-Crick相互作用。他们的方法需要进行象RNA酶H方法一样的多次测序，只是他们对ODN而不是对靶RNA片段进行测序。而且，大多数文库策略是采用的是游离在溶液中的文库，这样就会有文库内的ON之间产生交叉杂交的问题。这可通过采用具有最少交叉杂交亚型的多个文库来解决，但是这在选择具有反义活性的ODN时增加了所需的劳动量。
发明概述
本发明提供了一种鉴定能结合靶mRNA的反义寡核苷酸的方法，该方法包括：在杂交条件下使靶mRNA与寡核苷酸文库的每个成员分别接触，除去未杂交的物质并测定哪个或哪些成员杂交；其中寡核苷酸文库包括有预定共同长度的多个不同的核苷酸序列，其中每个核苷酸序列包含4至8个碱基的已知序列，且已知序列的所有可能组合均存在于该文库中。
寡核苷酸文库中的每个成员可以与固定在分开的容器中的靶mRNA接触。或者，寡核苷酸文库的每个成员可以固定在杂交阵列的分开位置上。已知序列的长度宜为4至6个碱基。
寡核苷酸文库的每个成员可以包含一组核苷酸序列。每个核苷酸序列可以有一个窗口区域(window region)，该区域包含已知序列以及不超过8个碱基的侧接区域，其中每组中的侧接区域中存在所有可能的碱基组合，核苷酸序列的共同长度不超过12个碱基，最好不超过10个碱基。核苷酸序列可以从DNA类似物获得。
在一种阵列方式中，测定哪个或那些成员杂交的步骤包括包括测定哪个或哪些成员的杂交更迅速。
可以将每个杂交成员的序列与靶mRNA相关的序列信息比较，以鉴定出靶mRNA中的一个或多个反义结合位点。
较佳实施例详述
本发明针对的是鉴定mRNA内可及位点的问题，但是该方法的目的是，在适用于任何RNA分子的系统中，不需通过测序和不受使用RNA酶H的倾向性影响而找出这些可及位点。本专利强调的是采用短的寡核苷酸探针(最好是4聚物)文库。本发明提供了这样一种方法，即在文库中每个探针与靶杂交反应后，测定RNA中的短寡核苷酸探针的可及位点。探针在空间位置上是分开的，在反应中，探针或靶RNA被固定。
采用具有短达4聚物窗口区域的探针的理论基础是，假定给定的4聚物大多数被隔藏在二级或三级结构中。将各单独杂交后获得的数据翻译成一级序列：一些4聚物与可及区域杂交的特点是，重叠的4聚物簇集在RNA一级序列中。通过分析结合动力学，部分错读应当是可分辨的，这样，即使4聚物出现不止一次，在大多数情况下仍可能鉴定出RNA中的大多数可及区域。用短探针的重要性在于，它能校准和标准化文库中所有成员的杂交行为，因为文库并不是大得不能实践。4聚物文库有256个成员，这是一个适中的数目，它能用大量模型分子逼真地测试该文库，以校准系统。校准是很重要的，因为大多数4聚物对于给定的可及程度有不同的结合能。为了根据杂交动力学来鉴定可及的分子区域，考虑到分散的重叠4聚物以不同的动力学与同一可及位点结合，因此需要能与标准化动力学数据比较。当需要使探针在空间上分开时，小的探针阵列对于构建和操作来说较为便宜。而且，短探针本身不太可能有二级或三级结构而不会使杂交反应分析复杂化。
可以改变杂交时间，以获得每个杂交反应的动力学数据。在给定时间后杂交的探针寡核苷酸的量提供了该探针对其靶结合亲和力的定量数据。通过改变杂交时间，就可获得每一探针的杂交反应的时间进程。该结构中任一区域的可及性与其互补探针结合所需时间呈相反关系，因此通过这种方法就能获得关于二级结构的详细信息。通过与下述的闪烁亲近测定法(Amersham)结合，该系统将更加有效，因为不需要洗涤，所以可以采用更短的探针，并可实时跟踪每一探针的杂交反应。
RNA结构的分子探针
探针在空间上隔开和固定避免了采用溶液中游离的寡核苷酸文库时产生的交叉杂交问题，从而简化了结果的解译。该方法不必测定RNA酶H最有效的切割位点，而是提供了关于靶RNA的详细结构信息，以便合理地设计所靶向的分子(该分子可发展成有效的反义试剂)，这样就不必根据RNA酶H介导的RNA降解来操作。
优于现有文库策略的优点：
本发明采用了寡核苷酸的随机文库，因为在给定长度的寡核苷酸随机文库中，具有该长度的所有可能的序列均存在，因此包含给定靶RNA长度的每个亚序列也存在。这就意味着，随机文库适用于任何RNA，且其中含有所有的靶亚序列。由于寡核苷酸受到独立监测，这就意味着该方法继承以前专利PCT/GB96/02275中所述的寻靶文库，并且给出了其详细的动力学行为。这样，通过该系统就能获得关于RNA亚区域对正常Watson-Crick相互作用的可及性的明确数据。
非Watson-Crick相互作用可能不如正常的互补反应那样常见，但是它也存在于这样的系统中。人们期望相互作用是与靶RNA部分互补区域的反应。如果Watson-Crick相互作用是唯一可能的势能性相互作用，则预计这种部分杂交作用是弱的，但是如果非Watson-Crick相互作用起了作用(如Mishra和Toulme提出的(1))，则预计这些相互作用的亚系列可能会以较高的强度与靶RNA相互作用。因此，这种策略将鉴定出潜在的非Watson-Crick的特异性相互反应。
采用随机文库和寻靶文库的实验结果显然有所不同。在我们以前的专利申请PCT/GB96/02275所进行的实验中，每个文库鉴定出了不同的切割位点。在那些实验中，寻靶文库只覆盖了靶RNA TNFa的三个特异性亚区域。然而，用这种文库鉴定出的位点却不能被随机文库鉴定出。这可能是由于寻靶文库中的成员更少，每个成员的相对浓度比随机文库中的成员更高。因此，随机文库选出了未被寻靶文库覆盖的区域中更可及的位点，但是对应于寻靶文库中所用区域的寡核苷酸不选取同一切割位点。切割位点被寻靶文库选取可能是因为它们的浓度相对较高，因此这些位点可能不是最可及的。在这些系统中也很难评价交叉杂交的问题，而且这种影响对于各类文库的作用很可能也不相同。本发明的新方法应能标准化所有这些影响，从而提供更有意义的数据。
本方法还能获得动力学数据(如下所述)，从而提供了关于靶RNA结构的详细信息。
杂交实验的动力学数据：
可以改变杂交时间，以获得关于每个杂交反应的动力学数据。在给定时间后杂交的探针寡核苷酸的量提供了该探针对其靶结合亲和力的定量数据。通过改变杂交持续时间，就可获得杂交反应的时间进程。该结构中任一区域的可及性与互补探针结合至一定程度所需的时间呈反相关，因此通过这种方法就能获得关于二级结构的详细信息。
由于所需寡核苷酸数量的关系，如果采用大寡核苷酸文库，则本方法就不可能实行。对大文库中每一探针的校准的工作量大，但是在采用了组合的合成芯片(combinatorially synthesised chips)的自动化图象分析后，大文库是可行的。然而，没有必要采用大的寡核苷酸。
实时动力学试验：
放射性标记是具有理想性能的令人喜欢的标记方案，尤其是产生低能辐射、波程长度短的放射性同位素，如33P。利用放射性标记设计出了接近(proximity)测定法。发出的辐射可用各种方式(包括闪烁或盖革计数器)来检测。接近检测系统和相应的接近测定法测出了标记的信号强度，从而给出了从标记到检测器距离的量度。例如，闪烁接近测定法是以检测放射性同位素发出的辐射为基础的。通过将闪烁光放大，就可检测出到达闪烁体表面的辐射量。从33P发出的β射线有相对较低的能量和较短的波程长度。这就意味着，只有当33P标记的探针相当接近检测表面时，它才能被检测到。距离放射源越远，则测得的强度就越低。如果用33P来标记RNA分子，并使其与固定在含闪烁体表面上的寡核苷酸探针杂交(或者是两者互换)，预计闪烁计数会随着与探针杂交的RNA量的增加而增加。可以预计，会有背景计数，它来自溶液中的游离分子，在非常靠近闪烁体表面时而被检测到，因此必须设立采用标记RNA或探针(根据实际试验中对哪个作标记)的对照反应。在这类系统中，探针必须有一定的空间分辨率，因为每次只能用一种放射性标记，因此每次只能对探针或RNA中的一种作标记。以放射性标记为基础的系统的主要优点是，它能实时测定杂交反应，以提供详细的动力学数据。利用与合适信号处理电子设备连接的检测系统(如Amersham Cytostar-T闪烁微量板)，通过检测经光放大的闪烁，就可进行实时分析。
杂交探针：
采用短寡核苷酸文库有两个互补上的困难。为了保证探针与固定RNA的杂交足够强，需要寡核苷酸足够长，以保证合适的杂交程度，但是探针越长，则分辨单个文库成员行为的工作量就越大。由于RNA/DNA杂交物的结合能高于RNA/RNA或DNA/DNA双链体，它们比任一同源双链体都更稳定，因此可以采用比同源相互作用中所用探针更短的探针，并可用对天然核酸的结合亲和力高于天然核酸组成的探针的非天然类似物。
非天然的核酸类似物：
由于该方法不需要被RNA酶H识别，因此在采用非天然骨架上更具灵活性。可用非天然的碱基类似物来提高任何相互作用的结合能。为了该系统，可采用带电荷比天然磷酸二酯键(如甲基磷酸二酯键或肽核酸)更少的骨架。探针结合能的增加使得固定的探针寡核苷酸链更容易侵入双链区域，其动力学可提供被侵入区域结构的有用信息。
增加寡核苷酸探针的“结合”时间：
本例中面对的杂交较弱的问题非常严重，因为寡核苷酸越短，分子就越容易从其靶RNA上解离下来。在用短寡核苷酸作为结构探针时，每个固定RNA的孔中将加入大量探针寡核苷酸。这将使杂交平衡向有利于杂交的方向移动，从而可能会发生明显的杂交。然而，一旦洗涤除去未结合的寡核苷酸，平衡又会向有利于杂交探针解离的方向迅速移动。可采用各种措施，通过提高相互作用的结合能来增加结合的寡核苷酸的“结合时间”。上述第一例中所述的采用非天然核酸类似物的想法同样适用于此处。可以想象，在该步中还可包括可被光活化的交联效应物以确保杂交的探针“不解离”。
采用短的寡核苷酸探针文库是一个问题，因为为了获得较好的杂交需要有合适长度的核酸，但是探针中每增加一个额外的碱基却会使文库中的寡核苷酸数量呈指数型增长。短寡核苷酸杂交较弱的问题可以这样来间接解决：构建一组寡核苷酸，每一组由固定数目的、已知序列的碱基以及侧接在碱基任一侧或两侧上的其它固定数目的碱基组成，该侧接碱基具有所有可能的核苷酸组合，这些碱基还可以是广义的碱基：
5′-NNXXXXNN-3′
上述例子中，已知序列“窗口区域”XXXX两侧各侧接了两个标记成N的任意碱基。因此，有256组不同的8聚物能用来探测固定的RNA。这与用4聚物探测一样有效，但是侧接碱基能提高相互作用的稳定性。与非天然核酸类似物结合的这种变化方案充分提高复合物的稳定性，以便洗涤和定量测定的进行。
采用短达4聚物的探针可能有这样的问题，即它们会在RNA中过分频繁地出现，从而可能会使动力学数据的分辨更为困难，因为有可能任何给定的4聚物会在单个RNA中出现2次以上。如果能用自动化系统来处理增加的工作量，则采用具有稳定化侧接区的5聚物或6聚物作为窗口区域，可能更容易分辨，因为它们更可能在任何给定的RNA中只出现一次。
探针阵列：
通过将探针在空间上分置在微量孔板的不同孔中，就能单独地测试寡核苷酸(ON)。可以固定靶RNA并用各个荧光标记的寡核苷酸来作用于RNA。因此，对于4核苷酸的寡核苷酸文库，需要一个256孔的阵列，每个孔中固定有等量的RNA。每个孔中加入不同的、标记的寡核苷酸。使寡核苷酸杂交预定长度的时间，然后洗涤除去未杂交的寡核苷酸。测定每个孔中的荧光，以测定杂交的寡核苷酸的量。该方法需要用大量的RNA，这些RNA很容易用(例如)T7噬菌体RNA聚合酶系统来获得。另一种变化方案是固定寡核苷酸探针，用标记的RNA来作用于这些探针。
可以构建随机寡核苷酸文库并将其固定在玻璃表面上，使得阵列的不同区域携带文库中不同的寡核苷酸(2)。如果所有可能的序列均存在的话，8核苷酸的随机文库将含有48个可能的成员。由于寡核苷酸均被固定在阵列上，因此没有交叉杂交。
用(例如)T7噬菌体RNA聚合酶系统，可在体外克隆并制得大量三级结构未知的RNA。该RNA可用荧光标记物标记。然后，在有利于接受RNA正常三级结构的条件(即体内胞质条件)下，可用该RNA作用于固定化的文库。经预定的时间使RNA杂交到阵列上，然后洗涤除去未杂交的RNA。发生杂交的地方可通过检测荧光来显示。阵列中检测到荧光的区域表明寡核苷酸与RNA杂交。
这些方法存在短寡核苷酸探针杂交弱的问题；根据将大分子RNA固定在阵列上并防止RNA被洗去所必需的相互作用的强度来确定探针寡核苷酸的最小长度。这必须经受实践的检验，但是当RNA是活动的成分时，迅速解离的问题并不严重，因为分子的大小会使其比第一例中采用的小寡核苷酸更稍微缓慢。产生具有已知序列短窗口区域和随机序列侧接区域的寡核苷酸的方法也适用于本例，另外还可考虑采用非天然的核酸类似物。采用耐受核酸酶的类似物还有其它的优点，它比磷酸二酯键更能重复使用，因为不能完全保证其中没有破坏DNA阵列的核酸酶等污染。
只要每个RNA分子携带一个荧光标记，这个实例就是定量的。因此，提供荧光最多的阵列区域将是与RNA杂交最强的那些区域。通过使靶RNA与阵列反复作用不同的预定时间，就能获得阵列上每一点发生的杂交反应的动力学详细信息。这将显示出结构确实被破坏并进行杂交的区域，因为它们具有缓慢得多的动力学。
用荧光标记的另一种方案是用与RNA可断裂相连的团块标记物(mass label)来探测阵列。团块标记物是GB9700746.2中所述的光可激发(photo-excitable)化合物的衍生物，如烟酸、芥子酸(sinapinic acid)或肉桂酸，它们可通过施加适当频率的光(理想的是采用激光)来光断裂这些物质并激发成气相。这种标记可通过末端转移酶反应(例如末端连接)掺入RNA中。如果RNA分子用这类激光可激发的团块标记物标记再与寡核苷酸探针阵列杂交，则RNA与阵列不同区域的杂交程度(相对于单个寡核苷酸)可通过MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation)质谱分析来测得。另外也可采用较简单的、不可激发型团块标记物。在这个例子中，RNA与阵列杂交，杂交后除去上清液，将阵列包埋在上述类型的可激发试剂中，断裂标记物的电离可通过基质的激发来间接介导。
用该方法进行合理的药物设计：
三级结构的测定：
现已很好地设计出了核酸的二级结构模型，结合本系统的资料，就可以设计出较好的靶RNA三级结构模型。这将开始使所谓的“合理的”药物设计有更好的定量反复。通过与其它方法(如NMR)结合，也许还能确定全部结构。至少能准确地预计二级结构。很可能只需要从其它方法获得的少量信息就能确定任何给定RNA的结构。
数据库和药物筛选：
使用本系统能提供一个RNA三级结构信息的综合数据库，该数据库能产生更佳的RNA结构理论模型，并允许更具特异性的寻靶方法以设计出有效的反义试剂。Wagner等(3)的数据表明，短的寡核苷酸对靶RNA有特异性。必须对该建议作出的限定条件是短寡核苷酸应具有高度的结构特异性。一旦确定了哪些结构特征分布较广，哪些较少，采用RNA结构综合数据库，这种系统就可以直接实际地指出潜在的药物。直接搜寻稀少特征，就可能使候选药物的选择更加简单。
更通用的反义靶：
本系统并不是特异性地检测RNA酶H敏感的位点，它可用于靶向细胞中各种RNA上的更为通用的反义试剂。因此，本系统在开发治疗剂和研究工具中的许多通用场合中是有潜力的，用于靶向体内更通用的功能性RNA(如核糖体、剪接装置和最近涉及性别鉴定的一些活性RNA)。
自动化：
两个例子均用自动化液体操作系统来实施，因为该方法简单，重复性好。杂交阵列方法在试剂方面较为便宜，但是如果阵列与靶RNA间相互作用的结合强度太低而不能洗涤阵列，则该方法很难实现。第一个例子对试剂有很高的要求，但是能构建微量阵列孔来降低这一要求。
参考文献：
(1)R.K.Mishra,J.J.Toulme,C.R.Acad.Sci.Paris,Life Sciences 317,977-982,1994
(2)W.Bains,Chemistryin Britain,1995年2月，122-125.
(3)R.W.Wagner等，Nature Biotechnology14,840-844,1996.
(4)Siew Peng Ho等，Nucleic Acids Research24,1901-1907。
实施例
4聚物寡核苷酸与2个TNFα cDNA亚片段的杂交：
TNFα cDNA克隆的亚克隆：
载体pFC54.t中含有TNFα全长cDNA序列的克隆53007(pAW731)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rochville,Maryland,USA)。将冻干的细菌重悬在2mlLB肉汤中，将100μl肉汤铺在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上。平板30℃培育过夜。然后将该板上的单菌落接种到100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中并在30℃、225rpm振荡下培育过夜。然后在Hereaus 17RS离心机中5300rpm离心该溶液15分钟，使细菌培养物沉淀。然后用Qiaprep Midi质粒纯化试剂盒(Qiagen Ltd.)，根据生产商说明书来抽提质粒。用10单位的BamHⅠ和HindⅢ(Boehringer Mannheim)消化2μl质粒，并用20μl中的10单位HindⅢ 37℃消化2μl质粒2小时。用BamHⅠ和HindⅢ的消化反应释放出TNFα插入物(ATCC)。然后使消化的质粒在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。HindⅢ消化物释放出约700bp的条带，BamHⅠ和HindⅢ消化释放出约700bp和800bp的条带HindⅢ释放出的700bp的片段对应于TNFα插入物的3′端，HindⅢ和BamHⅠ释放出的800bp的片段对应于TNFα插入物的5′端。然后用无菌手术刮刀将两条带从凝胶上切下，使其旋转通过GenElute琼脂糖旋转柱(Supelco,USA)，根据生产商的说明书来抽提DNA。用2.5体积的100％乙醇和0.1体积的3M乙酸钠使DNA沉淀。然后将溶液-20℃培育30分钟，然后在Heraeus A13台式离心机中13000rpm下旋转15分钟，使DNA沉淀。然后倒去上清液，用100μl70％乙醇洗涤沉淀并空气干燥。然后将干的沉淀重悬在30μl水中。5μg质粒pBluescriptSK(+)(Stratagene)用10个单位的BamHⅠ和HindⅢ 37℃消化2小时，5μg质粒用50μl中的HindⅢ(Boehringer Mannheim)消化2小时，然后根据生产商的说明书用Chromospin-100柱(Clonetech)来纯化。在Pharmacia Genequant分光光度计中读取260nm和280nm吸光度，测定纯化的条带和经消化的质粒的DNA浓度。然后将700bp和800bp的条带连接到经适当消化的pBluescript中，用400单位的T4 DNA连接酶(New England Biolabs)来连接800bp的片段，用Rapid Ligation试剂盒(Boehringer Mannheim)来连接700bp的片段。使DNA与细胞在冰上共培育30分钟，然后42℃热激45秒，再在冰上培育2分钟，以将2μl各个连接物转化入50μlXL-1BLUE感受态细胞(Stratagene)中。
然后，加入450μlSOC培养基，使细胞在37℃、250rpm振动下培育1小时。然后将100μl转化物接种在含100μg/ml氨苄青霉素、0.1mM IPTG和40μg/mlX-GAL的琼脂板上。平板37℃培育过夜。
挑取白色菌落，用来接种入2.5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中，并在37℃、250rpm摇动下培育7小时。将1ml细菌培养物离心到微量离心管中，用Qiaprep Spin质粒试剂盒(Qiagen)抽提质粒。用合适的酶消化20％的各种微量制备的质粒，并在琼脂糖凝胶上进行电泳，以检测正确片段的存在。然后将含700bp片段的质粒和含800bp片段的质粒的其余的细菌培养物接种到含100μg/ml氨苄青霉素的250ml LB肉汤中，然后37℃、250rpm摇动培育过夜。然后，在Hereaus 17RS离心机中5300rpm下旋转离心溶液15分钟，使细菌培养物沉淀。然后用Qiaprep质粒纯化试剂盒(Qiagen Ltd.)，根据生产商的说明书抽提质粒。
体外转录
用50μl1×缓冲液H中的50单位ClaⅠ(Boehringer Mannheim)37℃消化25μg各个质粒3小时，使其成为线性。
然后用Chromospin-100柱(Clonetech)，根据生产商的说明书纯化所消化的质粒。然后利用RiboMax大规模T3 RNA生产系统(Promega)，根据生产商的说明书，用40μl各个质粒建立200μl的体外转录反应。利用RiboMax大规模T3 RNA生产系统(Promega)，根据生产商的说明书，用各质粒剩余的10μl来建立50μl的体外转录反应，只是这次在各反应物中加入了0.25μl荧光素-12-UTP(BoehringerMannheim)以对RNA作荧光标记。所有的体外转录反应均在37℃下培育3小时。
RNA可被生物素化的寡核苷酸捕获的证明
将与pBluescript SK(+)的T3 RNA启动子制得的RNA 5′端互补的3′生物素化的寡核苷酸(cap53B)(序列为5′CCACT AGTTC TAGAG CGGCC GCCAC CGCGG3生物素)和5′生物素化的寡核苷酸(cap 35B)(序列为5′生物素-CCCCCCC TCGAGGTCGA CGGTA TCGA TAAG3′)固定在黑色、包被了链霉亲和素的微量滴定板(Boehringer Mannheim)的孔中。
这可通过使200pmol的各个寡核苷酸在50μl10×SSC中室温下杂交1小时来实现。然后，每个孔用100μl10×SSC洗两次。然后将从700bp和800bp片段制得的荧光素标记过的RNA 65℃加热5分钟，使之变性。将50μl10×SSC中的各RNA的1/6加入含cap35B和cap53B的孔中。使RNA在冰上培育30分钟，以使RNA与寡核苷酸杂交。然后用100μl10×SSC洗涤孔3次，用Biolumin960(MolecularDynamics)和Xperiment1.1.0版软件测定荧光。
然后，孔用100μl5×SSC洗涤3次，用100μl0.1×SSC洗涤3次，再用5×SSC和0.1×SSC洗涤3次后，如前所述那样测定荧光。
读数用减去背景后的相对荧光单位表示。cap 35B
         10×SSC     5×SSC      0.1×SSC800bp片段    66974       220         0700bp片段    44350       133         0cap 53B
         10×SSC     5×SSC      0.1×SSC800bp片段    50734       5136        686700bp片段    42660       1438        217
上述数据表明，固定在微量滴定板上的cap53B寡核苷酸可选择性地捕获pBluescript SK(+)的T3 RNA启动子位点产生的RNA。这些数据也证明，RNA可用高度严谨的洗涤(如0.1×SSC)洗去。
cap53B捕获RNA和用4聚物探测
将100μl含200pmol cap53B寡核苷酸的15×SSC转移到黑色、包被了链霉亲和素的64孔微量滴定板(Boehringer Mannheim)的每个孔中，并在室温下培育2小时。
然后用150μl15×SSC洗涤孔两次。使在200μl反应物中从700bp和800bp克隆转录得到的RNA(见上文)在85℃下放置2分钟，使其变性。然后将700bp和800bp RNA(制备见上文)各自细分到24孔有16单位核糖核酸酶抑制剂(BoehringerMannheim)的100μl15×SSC中，留置冰上杂交1小时。然后，用150μl冰冷的15×SSC洗涤孔两次。对于两种RNA，将100μl15×SSC中的200pmol各种4聚物加入4个孔中(3个有RNA，一个只有cap53B)，并在冰上杂交1小时。然后，每个孔用150μl冰冷的15×SSC洗涤3次，并如前所述那样进行荧光读数(见上文)。再次用150μl冰冷的15×SSC洗涤孔并测定荧光。
4聚物的序列(所有4聚物均用荧光素标记)为TACT、TACA、TAAA、TGTC、GTCA、ACCA、TGAA、CACG。
所有数据点用相对荧光单位表示，它们是三个孔的平均值减去没有RNA的孔所得的读数。
对于800bp片段：4聚物       第一读数   第二读数TACT        0          655TACA        2292       562TAAA        0          0TGTC       1118        382GTCA       498         57ACCA       0           0TGAA       0           0CAGG       0           116
对于700bp片段：4聚物    第一读数    第二读数TACT       756         135TACA       0           0TAAA       875         259TGTC       658         0GTCA       0           0ACCA       0           0TGAA       536         156CAGG       0           0
上述数据表明，4聚物TACA、TGTC和GTCA与800bp片段转录所得的RNA杂交的强度依次降低。这些寡核苷酸对应于一级序列中下列数字表示的位置，该位置以起始密码子的“A”作为TNFα中的碱基1。
对于800bp片段：TACA    264-267
    276-279
    392-395TGTC    60-63
    256-259
    770-773GTCA    255-258
    615-618
所有三个寡核苷酸均有明显的簇集，它们结合在碱基250至280周围。
序列中发现的但不结合的寡核苷酸TAAA    751-754ACCA    371-374
    374-373
    568-571CAGG    114-117
    147-150
    262-265
    336-339
    390-393
    527-530
    566-569
    696-699
    737-740
对于700bp片段：
寡核苷酸TAAA、TACA和TGAA与从700bp片段转录获得的RNA杂交的强度依次降低。这些寡核苷酸对应于一级序列中下列数字表示的位置，该位置以起始密码子的“A”作为TNFα中的碱基1。TAAA    838-841
    1146-1149
    1168-1171
    1175-1178
    1179-1182
    1186-1189
    1190-1193
    1194-1197
    1210-1213
    1351-1356TGAA    873-876
    921-924
    1461-1464
发现TACA存在于pBluescript SK(+)的T3 RNA启动子位点中。
序列中发现的但不结合的寡核苷酸TACA    1206-1209
    1246-1249
    1313-1316
    1449-1452TGTC    970-973
    1051-1054
    1105-1108
    1267-1270GTCA    969-972
    1050-1053
    1398-1401ACCA    1001-1004
    1395-1398CAGG    866-869
    888-891
    967-970
    1232-1235
    1321-1324
不同系列的4聚物与2个不同的RNA物质杂交的事实提供了证据，即获得的信号是真实杂交的产物，而不是由于特定4聚物的非特异性结合性能。这还得到下列事实的进一步支持，即，100％AT含量(因而Tm最低)的4聚物已经杂交，而75％GC含量(因而Tm高得多)的4聚物却没有杂交。
同样，在两种RNA中发现所有寡核苷酸序列均存在，但是只有一种选择的寡核苷酸能结合，并且在一个例子中，寡核苷酸簇集在特定序列的周围。4聚物的这种簇集现象提示这一部分RNA是单链或是可及的，因此它是反义(试剂)的明显靶子。
因此，该实验提供了这样一个证据，即通过与4聚物杂交可以探测RNA分子的单链部分并获得序列信息。

Claims (23)

1．一种鉴定能结合靶mRNA的反义寡核苷酸的方法，该方法包括下列步骤：在杂交条件下使靶mRNA与寡核苷酸文库的每个成员分别接触，任选地除去未杂交的物质，测定哪个或哪些成员杂交；其中寡核苷酸文库包括有预定共同长度的多个不同的核苷酸序列，其中每个核苷酸序列包含4至8个碱基的已知序列，且已知序列的所有可能的组合均存在于该文库中。
2．根据权利要求1所述的方法，其中使寡核苷酸文库的每个成员与分隔开容器中的靶mRNA接触。
3．根据权利要求2所述的方法，其中靶mRNA被固定在容器内。
4．根据权利要求1所述的方法，其中寡核苷酸文库的每个成员被固定在杂交阵列中隔开的位置上。
5．根据前述任一权利要求所述的方法，其中已知序列的长度为4至6。
6．根据前述任一权利要求所述的方法，其中寡核苷酸文库的每个成员包含一组核苷酸序列，组内每个核苷酸序列有一个窗口区域，该窗口区域包含已知序列和不超过8个碱基的侧接区域，其中每组的侧接区域中存在所有可能的碱基组合，核苷酸序列的共同长度不超过12个碱基。
7．根据前述任一权利要求所述的方法，其中核苷酸序列的共同长度不超过10个碱基。
8．根据前述任一权利要求所述的方法，其中测定哪个或哪些成员杂交的步骤包括测定哪个或哪些成员更迅速地杂交。
9．根据前述任一权利要求所述的方法，其中将杂交的每个成员的序列与靶mRNA相关的序列信息比较，以鉴定靶RNA中的一个或多个反义结合位点。
10．根据前述任一权利要求所述的方法，其中核苷酸序列得自DNA类似物。
11．根据前述任一权利要求所述的方法，其中用标记物对靶mRNA或寡核苷酸文库成员作标记，并通过检测标记物来测定杂交。
12．根据权利要求11所述的方法，其中标记物包括荧光标记物或团块标记物。
13．根据权利要求11所述的方法，其中检测表面用于检测标记物与检测表面的接近程度。
14．根据权利要求13所述的方法，其中标记物包括放射性标记物，检测表面包括闪烁体。
15．寡核苷酸文库在鉴定能结合靶mRNA的反义寡核苷酸的方法中的应用，该文库包括有预定共同长度的多个不同的核苷酸序列，其中每个核苷酸序列包括4至8个碱基的已知序列，该已知序列的所有可能的组合均存在于该文库中，且文库的每个成员在空间上是相互分开的。
16．根据权利要求15所述的应用，其中寡核苷酸文库中的每个成员存在于分开的容器中。
17．根据权利要求15所述的应用，其中寡核苷酸文库的每个成员在杂交阵列的分开位置上。
18．根据权利要求15至17所述的应用，其中已知序列的长度为4至6。
19．根据权利要求15至18任一权利要求所述的应用，其中寡核苷酸文库的每个成员包括一组核苷酸序列，组内每个核苷酸序列有一个窗口区域，该窗口区域包含已知序列和不超过8个碱基的侧接区域，其中每一组的侧接区域中存在所有可能的碱基组合，且核苷酸序列的共同长度不超过12个碱基。
20．根据权利要求15至19任一权利要求所述的应用，其中核苷酸序列的共同长度不超过10个碱基。
21．根据权利要求15至20任一权利要求所述的应用，其中核苷酸序列得自DNA类似物。
22．根据权利要求15至21任一权利要求所述的应用，其中用标记物对靶mRNA或寡核苷酸文库成员作标记，并通过检测标记物来测定杂交。
23．根据权利要求22所述的应用，其中标记物包括荧光标记物或团块标记物。
CN97198481A 1996-10-04 1997-10-06 鉴定反义寡核苷酸结合的方法 Pending CN1232510A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9620749.3A GB9620749D0 (en) 1996-10-04 1996-10-04 Identifying antisense oligonucleotides
GB9620749.3 1996-10-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1232510A true CN1232510A (zh) 1999-10-20

Family

ID=10800964

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN97198481A Pending CN1232510A (zh) 1996-10-04 1997-10-06 鉴定反义寡核苷酸结合的方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6500615B1 (zh)
EP (1) EP0956366A1 (zh)
JP (1) JP2001501479A (zh)
CN (1) CN1232510A (zh)
AU (1) AU732121B2 (zh)
CA (1) CA2267524C (zh)
GB (1) GB9620749D0 (zh)
IL (1) IL129312A0 (zh)
NZ (1) NZ334987A (zh)
WO (1) WO1998015651A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104182211A (zh) * 2013-05-21 2014-12-03 中国银联股份有限公司 一种应用信息提供装置和方法

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050042625A1 (en) * 1997-01-15 2005-02-24 Xzillion Gmbh & Co. Mass label linked hybridisation probes
GB2335035B (en) * 1998-03-03 2003-05-28 Brax Genomics Ltd Screening for functional antisense agents
WO2000014273A2 (en) * 1998-09-03 2000-03-16 Signalgene Inc. Differential genetic display technique and vector
CA2259745A1 (en) * 1999-01-19 2000-07-19 Guy Tremblay Generation of oligonucleotide libraries representative of genomes or expressed mrnas (cdnas) and use thereof
WO2000075377A2 (en) * 1999-06-03 2000-12-14 Jacques Schrenzel Non-cognate hybridization system (nchs)
DE10033091A1 (de) * 2000-07-07 2002-01-31 Max Planck Gesellschaft Polymer-Chip
US20020187482A1 (en) * 2000-09-25 2002-12-12 Zicai Liang Methods and means of RNA analysis
GB0105790D0 (en) * 2001-03-08 2001-04-25 Expresson Biosystems Ltd Detecting binding of mRNA to an oligonnucleotide array using RNA dependent nucleic acid modifying enzymes
GB0105787D0 (en) * 2001-03-08 2001-04-25 Expresson Biosystems Ltd Complex element micro-array and methods of use
GB0105789D0 (en) * 2001-03-08 2001-04-25 Expresson Biosystems Ltd Detecting interactions between oligonucleotides and RNA using fluorescence resonance energy transfer (FRET)
US7301017B2 (en) * 2002-05-30 2007-11-27 Kolesnick Richard N Kinase suppressor of Ras inactivation for therapy of Ras mediated tumorigenesis
DE60333365D1 (de) * 2002-05-30 2010-08-26 Sloan Kettering Inst Cancer Kinasesuppressor der ras-inaktivierung zur therapie von durch ras vermittelter tumorgenese
ATE459725T1 (de) * 2002-11-18 2010-03-15 Panomics Inc Caged-sensoren, -regulatoren und-verbindungen sowie verwendungen davon
BRPI0411874A (pt) 2003-06-23 2006-08-08 Pionner Hi Bred International potencial de staygreen controlado em plantas por gene simples obtido por engenharia genética
CN103710429B (zh) 2005-11-29 2016-03-30 剑桥企业有限公司 乳腺癌标志物
JP2010538244A (ja) * 2007-06-20 2010-12-09 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 骨及び関節の変性疾患の治療に有用な分子標的及び化合物並びにその同定方法
US8765376B2 (en) 2008-09-11 2014-07-01 Galapagos Nv Methods for identifying and compounds useful for increasing the functional activity and cell surface expression of CF-associated mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
WO2010094734A2 (en) 2009-02-19 2010-08-26 Biofocus Dpi B.V. Methods for identifying and compounds useful for the diagnosis and treatment of diseases involving inflammation
JP2012518181A (ja) 2009-02-19 2012-08-09 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 炎症を包含する疾患の診断及び治療に有用な同定方法及び化合物
JP2012517821A (ja) 2009-02-19 2012-08-09 ガラパゴス・ナムローゼ・フェンノートシャップ 炎症を包含する疾患の診断及び治療に有用な同定方法及び化合物
WO2010112569A1 (en) 2009-03-31 2010-10-07 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
EP2414830A2 (en) 2009-03-31 2012-02-08 Robert Zimmermann Modulation of adipose triglyceride lipase for prevention and treatment of cachexia, loss of weight and muscle atrophy and methods of screening therefor
EP2272969A1 (en) 2009-07-10 2011-01-12 Schmülling, Thomas Disruption of CKX3 and at least one other CKX gene in a plant or plant cell leads to improved traits
WO2011015573A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
WO2011015572A1 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of neurodegenerative diseases
JP6081798B2 (ja) 2010-02-26 2017-02-15 メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センター ｍｉＲＮＡに関連する癌を検出および処置するための方法および組成物およびｍｉＲＮＡインヒビターおよび標的
US9617538B2 (en) 2011-08-29 2017-04-11 Niigata University Of Pharmacy And Applied Life Science Heptamer-type small guide nucleic acids inducing apoptosis of human leukemia cells
WO2014139885A2 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of diseases associated with epithelial mesenchymal transition
EP2972322B1 (en) 2013-03-14 2019-03-06 Galapagos NV Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrotic diseases
WO2014139884A2 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Galapagos Nv Molecular targets and compounds, and methods to identify the same, useful in the treatment of fibrosis
CN117106868A (zh) * 2013-11-26 2023-11-24 杭州联川基因诊断技术有限公司 一种扩增靶核酸的试剂盒和方法
US20180066026A1 (en) 2014-12-17 2018-03-08 Ei Du Pont De Nemours And Company Modulation of yep6 gene expression to increase yield and other related traits in plants

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991008489A1 (en) * 1989-12-01 1991-06-13 Packard Instrument Company, Inc. Scintillation proximity radioimmunoassay using solid scintillator support body
EP0614988A1 (en) 1993-02-24 1994-09-14 Hoechst Aktiengesellschaft Method of identifying fast-hybridizing single-stranded polynucleotides
GB9401833D0 (en) * 1994-02-01 1994-03-30 Isis Innovation Method for discovering ligands
GB9518864D0 (en) 1995-09-14 1995-11-15 Cambridge Res & Innovation Oligonucleotides and their uses

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104182211A (zh) * 2013-05-21 2014-12-03 中国银联股份有限公司 一种应用信息提供装置和方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU4565297A (en) 1998-05-05
CA2267524A1 (en) 1998-04-16
AU732121B2 (en) 2001-04-12
EP0956366A1 (en) 1999-11-17
IL129312A0 (en) 2000-02-17
JP2001501479A (ja) 2001-02-06
NZ334987A (en) 2000-12-22
WO1998015651A1 (en) 1998-04-16
CA2267524C (en) 2003-12-02
US6500615B1 (en) 2002-12-31
GB9620749D0 (en) 1996-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1232510A (zh) 鉴定反义寡核苷酸结合的方法
US7052841B2 (en) Systems, tools and methods of assaying biological materials using spatially-addressable arrays
US8329394B2 (en) Methods and substances for isolation and detection of small polynucleotides
CA2377567A1 (en) High throughput assay system
CN1489632A (zh) 固相支持物上的核酸等温扩增
CA2452819A1 (en) High throughput assay system
AU2001247328A1 (en) Methods for assay and detection on a microarray
WO2001066555A1 (en) Methods for assay and detection on a microarray
US7851159B2 (en) Method for detecting target nucleic acid with specific base sequence and set of nucleic acids for detection
JP2008035779A (ja) 核酸の分解度を測定する方法と核酸アレイ
US20030152931A1 (en) Nucleic acid detection device and method utilizing the same
CN1867680A (zh) 寡核苷酸微阵列
JP2005200405A (ja) 分子ロッドを含むオリゴヌクレオチド
EP1138762A1 (en) Method for immobilizing oligonucleotide on a carrier
WO1999006591A1 (fr) Procede de detection de mutation dans une sequence de bases
US20050003366A1 (en) Method for reusing standard blots and microarrays utilizing DNA dendrimer technology
Hellweg et al. Mass spectrometric characterization of DNA microarrays as a function of primary ion species
US20040185470A1 (en) Nucleic acid detection
CN111718986A (zh) Ptgs1基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法
JP2004531708A (ja) 錯体要素マイクロアレイおよび使用方法
JP5394045B2 (ja) マウスＡｃｉｄｉｃｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎＰ０遺伝子の検出方法
US20110318740A1 (en) Reduced Interference from Single Strand Binding Proteins
KR20030051806A (ko) 하이브리드 형성용 담체 및 하이브리드의 고정화 방법
CN111718987A (zh) Slco1b1基因检测引物组、检测试剂盒及检测方法
JP2005172819A (ja) ポリヌクレオチドアレイ及びそれを利用した標的ポリヌクレオチドの検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C53 Correction of patent of invention or patent application
CB02 Change of applicant information

Applicant after: Brax Genomics Ltd.

Applicant before: Brax Genomics Ltd.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: BRAX GENOMICS LTD. TO: JERRY BLACKSTONE GROUP CO., LTD.

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication