CN1867680A - 寡核苷酸微阵列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含短的经化学修饰的RNA寡核苷酸的寡核苷酸微阵列和此类微阵列在基因组学应用中的用途。更特别地，本发明提供了包含表面和许多寡核苷酸的寡核苷酸微阵列，其中至少一个寡核苷酸在2’－OH位上具有至少一个经修饰的糖部分。本发明的微阵列更特别地用于检测小RNAs。

Description

寡核苷酸微阵列
发明领域
本发明涉及包含短的化学修饰的RNA寡核苷酸的寡核苷酸微阵列和此类微阵列在基因组学应用中的用途。
技术背景
生物聚合体的微阵列在生物医学研究中已成为有价值的工具。微阵列技术已发展到这样的程度，使得微阵列是具有成本效益的且能提供给研究者所需的灵活性和质量保证(Barrett J Carl；Kawasaki Ernest S，Microarrays：the use of oligonucleotides and cDNA for the analysis of geneexpression.Drug Discovery Today，2003，8，134-41)。可利用具有不同类型生物聚合体阵列的许多微阵列平台，例如蛋白质或肽阵列，包括抗体或酶阵列。其它可获得的微阵列平台使用DNA阵列，根据表面结合的寡核苷酸探针的不同，其有几种类型：例子包括使用通常点样在固体支持体表面上的长的多核苷酸的cDNA阵列，由点样在阵列表面或通过末端连接附着的长的(例如40-80个核苷酸)寡核苷酸组成的DNA寡核苷酸阵列，和由原位合成的短的(例如25个核苷酸(nt))寡核苷酸组成的DNA寡核苷酸阵列(例如Affymetrix)。DNA微阵列作为实验工具的能力依赖于经互补碱基配对的特异分子识别，其使得对于高通量同时分析基因表达是非常有用的。在后基因组时代，微阵列已成为发展许多基于杂交的试验，例如表达概况分析、单核苷酸多态性(SNP)检测、DNA测序和大规模基因型分析的重要的工具。
最近，已发现真核细胞含有许多约18至约25个核苷酸的短RNAs。这些短RNAs作为例如RNA干扰(RNAi)的效应物或在转录后水平上基因表达的调节物。RNAi是一种进化保守的过程，其基于转换长的双链(ds)RNA为20至23个核苷酸的短干扰性dsRNAs(siRNAs)，其通过降解靶mRNA而沉默基因。其它短的RNAs包括microRNAs(miRNAs)和小的暂时RNAs(stRNAs)，其为miRNAs大组的一个子集，它们从内源编码的发夹前体(70至100核苷酸或更长)加工为单链的18至25个核苷酸RNAs，且通过与靶mRNAs的3’-UTRs的碱基配经翻译抑制而表现出功能(Lau N C；Lim L P；Weinstein E G；Bartel D P；Science(2001)，294，858-62)。
虽然在植物、线虫(C.elegans)、果蝇(Drosphila)和哺乳动物中至今已确定了约200种不同的miRNAs，但是只有stRNAs lin-4和let-7已被详细记录在线虫幼虫发育期间调节翻译水平上基因表达的计时。在脊椎动物中，许多miRNAs的表达具有重要的发育性或组织特异性模式，但目前只有很少的功能被确定。miRNAs的不断增多的数目和多样性(Lim，Lee P.；Glasner，Margaret E.；Yekta，Soraya；Burge，Christopher B.；Bartel，DavidP.Vertebrate microRNA genes.Science 2003，299，1540)认为miRNAs在不同于发育计时的多种途径中起重要作用。这被如下发现所支持：在果蝇中，miRNAs涉及调节细胞死亡和增殖且是正常脂代谢所需的(Xu等，2003；见Current Biol.13，790-795(2003)；Brennecke等，2003(Cell 113，25-36(2003)。此外，miRNAs似乎与人类疾病相关。最近在果蝇中进行的研究已将RNAi/miRNA途径与蛋白质dFMR1相联系，该蛋白质是智力迟钝的最常见遗传形式即脆性X染色体综合征中受影响的人蛋白质FMR1的同源物(Caudy，Amy A.；Myers，Mike；Hannon，Gregory J.；Hammond，Scott M.，Fragile X-related protein and VIG associate with the RNA interferencemachinery.Genes&Development 2002，16，2491-2496)。此外，已发现定位于染色体13q14上的两种miRNAs在多数B细胞慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)中被缺失或下调(Calin George Adrian等人；PNAS 2002，99，15524-9)。
为了解释短RNAs在生物学过程中的作用，特别是它们在疾病中的关联，需要一种检测短RNAs的工具。该工具应该理论上允许同时分析真核细胞中的多种短RNAs。然而，由于长度短且丰度低，用目前可利用的工具分析此类RNAs很难且耗时。本发明现提供能检测短RNAs的新的工具，因此对短RNAs的作用和功能的阐明是特别有用的。根据本发明的公开，本领域的技术人员显而易见的是，然而，该工具的应用不限于短RNAs的检测和分析，而能应用于一般核酸的检测或分析。
发明概述
首先，本发明提供包含一个表面和多种寡核苷酸的寡核苷酸阵列，其中至少一个寡核苷酸具有至少一个经修饰的糖部分。在一个实施方案中，所述寡核苷酸的糖部分的2’-OH基团被取代。优选地，所述糖部分在2’位上包含F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可为经取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基、烷氧基烷基、C1至C10低级烷基，取代的C1至C10低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基。
在优选实施方案中，所述的糖部分包含2’-MOE、2’-DMAOE、2’-甲氧基或2′-氨基丙氧基。
在另一方面，本发明提供了检测短RNAs的方法，其包括以下步骤：(a)提供生物样品，其中所述样品包含短RNAs；(b)将所述样品与本发明的寡核苷酸阵列接触；(c)在短的内源RNAs和阵列中的寡核苷酸之间进行杂交反应。
在另一方面，本发明提供关联生物样品与生物学状况的方法，其包括：(a)提供生物样品，其中所述样品包含短RNAs；(b)将所述样品与本发明的寡核苷酸阵列接触，其中所述样品包含适合于检测短RNAs的一套预先确定的序列；(c)将获得的杂交模式与标准杂交模式进行比较。
在另一方面，本发明提供预后或诊断疾病的方法，其包括：(a)提供生物样品，(b)接触本发明的寡核苷酸阵列，其相应于用于检测短RNAs的一套确定的序列，(c)获得杂交模式，(d)将所述杂交模式与标准杂交模式进行比较，其中某种模式的存在或缺乏表明患疾病的可能性或疾病的存在。
附图简述
图1，代表七个RNA样品与1MM和2MM捕获探针杂交的强度值对从各自匹配序列获得的强度归一化。定义强度为密度(平均)-背景(平均)。用与Cy5标记的RNA杂交的MOE探针提高的错配分辨是通过将杂交温度从37℃增加至42℃而获得的。在相同条件下，具有相同长度的标准DNA探针没有解释任何信号强度。
发明详述
这里引用的所有专利申请、专利和文献作为整体引入作为参考。
本发明提供具有高灵敏度和选择性的寡核苷酸微阵列，其特别用于短核酸分子的检测。至今，短核酸如RNAs的检测和分析已证明是困难的，因为此类核酸长度短且丰度低。目前可获得的核苷酸微阵列不是合适的工具，因为它们的灵敏度和/或选择性对于检测短RNAs来说太低。相比较而言，本发明提供了特别适用于检测短寡核苷酸，特别是短RNAs的寡核苷酸微阵列。
如这里使用的，术语“寡核苷酸”和“寡核糖核苷酸”是可互换使用的，并且指由核糖核苷酸残基或脱氧核糖核苷酸残基组成的聚合物。由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸残基两者组成的聚合物也属于本发明的“寡核苷酸”和“寡核糖核苷酸”的意思范围内。
术语“寡核苷酸阵列”或“阵列”或“微阵列”在这里以下可互换使用，指基质，优选固体基质，其带有至少一个表面，该表面具有附着到刚性表面中不同的已知位置的许多寡核苷酸。寡核苷酸阵列通常具有每cm2至少100个寡核苷酸的密度。在某些实施方案中，该阵列可以具有每cm2约至少500个、至少1000个、至少10000个、至少105个、至少106个、至少107个寡核苷酸的密度。
第一方面，本发明涉及包含表面和许多寡核苷酸的寡核苷酸阵列，其中所述的寡核苷酸阵列包含至少一个具有至少一个经修饰的糖部分的寡核苷酸，其以后称作经修饰的寡核苷酸。优选地，该寡核糖核苷酸包含至少2个、更优选地至少5个或至少10个经修饰的糖部分。在特定的实施方案中，寡核苷酸的所有糖部分是经修饰的，或者在另一优选的实施方案中，寡核苷酸的几乎1、2、3或4个糖部分是经修饰的。寡核苷酸阵列通常包含至少10％、更优选地至少25％，至少33％、至少50％、至少66％、至少75％、至少90％或至少95％的包含经修饰的糖部分的寡核苷酸。在特别优选的实施方案中，寡核苷酸阵列包含100％经修饰的寡核苷酸。
本发明的寡核苷酸微阵列包含带有一个或更多经修饰的糖部分的寡核苷酸。在优选的实施方案中，在糖部分的2’-OH基团上修饰糖部分。多种2’-OH取代是本领域已知的(修饰参见Uhlmann，Eugen.的Recentadvances in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides.CurrentOpinion in Drug Discovery&Development(2000)，3(2)，203-213和Uhlmann，Eugen；Peyman，Anusch.的Antisense oligonucleotides：a newtherapeutic principle.Chemical Reviews(Washington，DC，United States)(1990)，90(4)，543-84)。在另一优选的实施方案中，糖部分的4’-C没有被修饰，在一个更优选的实施方案中，寡核苷酸不包含锁定的核酸(LNA，参见例如(Rajwanshi，Vivek K.等；The eight stereoisomers of LNA(lockednucleic acid)：a remarkable family of strong RNA binding molecules.Angewandte Chemie，International Edition(2000)，39(9)，1656-1659)。
根据本发明，优选修饰的糖部分在2’位上包含以下之一：F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-芳基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可为取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。其它优选的寡核苷酸在它们的糖部分的2’位上包含一个和多个以下的：低级烷基、取代的C1至C10低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基。在另一优选的实施方案中，修饰的糖部分不包含2’-O、4’-C-亚甲基连接。特别优选的是用O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nNR2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和/或O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2取代的糖部分，其中n和m为1至约10。另一优选的修饰包括烷氧基烷氧基基团，特别是2’-甲氧基乙氧基(2’-O-CH2CH2OCH3，也称作2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)。其他优选的修饰包括2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称作2’-DMAOE，2’-甲氧基(2’-O-CH3)，2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)。本领域的技术人员可使用常规方法产生此类修饰的糖结构。教导制备此类修饰的糖结构的代表性美国专利包括，但不局限于美国专利号4,981,957、5,118,800、5,700,920和5,969,116，其每一个都作为整体引入本文作为参考。
给定的化合物中的所有位置都同样地修饰是不必要的，实际上可以在一种化合物或者甚至在寡核苷酸范围内的单个核苷中掺入一种以上的前述修饰。本发明也包括嵌合的寡核苷酸。本发明上下文中“嵌合的”寡核苷酸是含有两个或更多化学上不同区域的寡核苷酸，每一个所述区域由至少一个单体单位组成。此类嵌合寡核苷酸可以例如包含带有一个或更多如上所述修饰的糖部分的核苷酸区域和脱氧核糖核苷酸区域(Lima，Walt F.；Crooke，Stanley T；Biochemistry(1997)，36(2)，390-398)。本发明的寡核苷酸除了在糖部分2，位上的修饰外，可以还包含其它修饰。例如，该寡核苷酸可具有主链中的修饰。多种主链修饰是本领域已知的，此类修饰包括例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、亚磷酰胺等(关于修饰参见Uhlmann，Eugen的Recent advances in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides.Current Opinion in Drug Discovery&Development(2000)，3(2)，203-213和Uhlmann，Eugen；Peyman，Anusch.的Antisense oligonucleotides：a newtherapeutic principle.Chemical Reviews(Washington，DC，United States)(1990)，90(4)，543-84)。
本发明中寡核苷酸阵列的寡核苷酸通常具有约为10至100个核苷酸的长度。优选地长度为约12至50个核苷酸，更优选地15至30个核苷酸。在特别优选的实施方案中，寡核苷酸的长度为18至25个核苷酸。然而寡核苷酸阵列的寡核苷酸不必具有相同的长度，本发明的寡核苷酸阵列通常包含具有相似或相同长度的许多寡核苷酸。
寡核苷酸阵列，也通常称作“基因芯片”，已在本领域中描述。寡核苷酸阵列通常包含具有至少一个表面的固体基质，寡核苷酸可附着在该表面上。该基质可以由无机材料如玻璃、SiO2、石英、Si形成。备选地，该基质可以由有机材料如聚合物，优选聚碳酸酯(PC)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚酰亚胺(PI)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、聚乙烯对苯二酸酯(PET)或聚氨基甲酸酯(PU)形成。在一个实例中，该基质是由玻璃形成的。表面可由与基质相同或不同的物质组成。也可选择该基质和其表面以提供合适的光吸收特性。在优选的实施方案中，该基质和/或该表面是光透明的。在另一优选的实施方案中，该基质包含光透明层。该光透明层可由无机材料形成。备选地，它可由有机材料形成。在一个实例中，该光透明层是金属氧化物，如Ta2O5、TiO2、Nb2O5、ZrO2、ZnO或HfO2。该光透明层是非金属的。
在特别优选的实施方案中，将寡核苷酸阵列置于WO01/02839中描述的消散波传感器平台上。因此，用于样品分析的传感器平台可以例如包含具有折射率(n1)的光透明基质，形成于该基质的一个表面上的薄的光透明层，所述层具有大于(n1)的折射率(n2)，所述平台在其中结合一个或多个包含周期性凹槽的波纹结构，所述凹槽定义一个或多个敏感区，每一个敏感区用于一个或多个捕获成分，所述凹槽如此构造、规格和取向以至于a)所述平台上相干光入射被衍射成单个光束或干涉的衍射级，导致投射光束减少和入射光的异常高反射，由此在一个或多个传感区的表面产生增强的消散场；或者b)在所述平台上的相干且线性偏振入射光被衍射成单个光束或干涉的衍射级，导致投射光束几乎完全消失和入射光的异常高反射，由此在一个或多个传感区的表面产生增强的消散场。
寡核苷酸阵列可通过原位寡核苷酸化学合成而形成。在该方法中，将寡核苷酸直接合成到基质的表面上，使用例如机械合成方法或光指导的合成方法，其可以结合光版印刷方法和固相寡核苷酸合成方法的组合，例如WO90/033382或WO92/10092中描述的，或者如WO98/27430中描述的很大规模的固定化聚合物合成(VLSIPS)。
备选地，天然或合成来源的寡核苷酸可以使用不同技术点样于芯片上，所述技术例如包括喷墨打印机，其具有压电传动装置、电磁传动装置、压力/电磁阀传动装置或其它力传动装置，泡沫喷射打印机，其使用热电传动装置、激光传动装置，环针打印机或针点样工具。(Heller MJ(2002)AnnuRev Biomed Eng；4：129-53)。寡核苷酸可以共价地附着于基质的表面。这种共价附着通常需要活化表面和/或用官能团/反应基团修饰核酸分子。该固定也可以通过化学或光化学交联剂来完成(WO98/27430和WO91/16425)。此类技术对于本领域的技术人员来说是已知的且显而易见的。反应性或光反应性基团可附着在平台的表面，其可用作锚定基团用于进一步的反应步骤。备选地，寡核苷酸可通过非共价结合附着在表面，例如通过静电吸附在带正电荷的表面薄膜上。在本发明优选的实施方案中，寡核苷酸非共价地附着到表面。可以使用官能化有机分子，其提供烃链致使平台更加疏水，可以使用极性基团致使平台更加亲水，或可以使用离子基团或潜在的离子基团以导入电荷。例如可用聚乙二醇(PEG)或其衍生物致使平台亲水，其防止蛋白质对平台/表面的非特异吸附。
为获得可检测的信号，可以标记样品的核酸。可使用适于检测寡核苷酸的任意标记。例如，可使用放射性同位素、化学发光标记、生物发光或量热标记。在优选的实施方案中使用发光标记。可使用的发光染料包括但不限于镧系络合物(Kricka LJ(2002)Stains，labels and detection strategiesfor nucleic acids assays.Ann Clin Biochem；39(Pt 2)：114-29)，并且可以化学或物理地结合寡核苷酸。在更优选的实施方案中，标记物是荧光标记。许多合适的荧光团是已知的，如荧光素、丽丝胺、藻红蛋白、罗丹明、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX。将明白可使用具有不同光谱的不同荧光团以区分不同的探针。备选地，可用合适的标记物，如上述标记物标记寡核苷酸阵列的寡核苷酸。
样品的核酸(“探针”)和寡核苷酸阵列的合适寡核苷酸将杂交，即在合适的条件下将发生互补序列的非共价结合。优选地，序列优选是互补的，但是根据杂交条件，具有1、2、3、4或5个错配的序列还是可以杂交。合适的杂交条件是本领域已知的或可以凭经验决定的。公知的影响反应特异性和动力学的参数包括盐条件、溶剂的离子组成、杂交温度、寡核苷酸配对序列的长度、鸟嘌呤和胞嘧啶(GC)含量、杂交促进剂的存在、pH、配对序列中发现的特定碱基、溶剂条件和有机溶剂的添加。例如，对于高严紧条件，为了使仅有少数或没有错配的核酸杂交，盐条件通常较低。普通高严紧条件可使用小于约1摩尔的盐浓度，更常用小于约750毫摩尔，通常小于约500毫摩尔，可以低至约250或150或15毫摩尔。使用的典型的盐是氯化钠(NaCl)；然而，可以使用其它离子盐，例如KCl，或四烷基铵盐。对于较低严紧条件，根据所希望的严紧度杂交，盐浓度可以小于约3毫摩尔，优选小于2.5毫摩尔，小于2毫摩尔，或更优选小于约1.5毫摩尔。杂交动力学和杂交严紧度也依赖于进行杂交的温度。对于低度严紧杂交的温度通常为较低的温度，例如从约15℃或20℃至约25℃或30℃的温度。需要高度严紧杂交时，进行杂交的温度通常很高。例如，可使用至少37℃，至少42℃，至少48℃，或至少56℃的温度。对于剥离，即破坏互补序列的结合，可使用高温，例如80℃或更高。杂交反应后也可以进行洗涤步骤，其中没有结合寡核苷酸的核酸被洗去。然而，例如当检测消散场诱导的发光时，该步骤也可以省略(WO01/02839)。
在本发明优选的实施方案中，优化杂交条件用于经修饰的寡核苷酸特别是MOE修饰的寡核苷酸与短RNAs的杂交。此类最优可由经验决定且不会本领域的技术人员造成困难。例如温度可从约30℃至60℃，从约37℃至60℃或从约42℃至56℃。
用于确定发生杂交的位置的检测方法将取决于所选择的标记。可通过合适的激光源诱导发光。适合的发光检测器包括例如CCD照相机、光电倍增管、雪崩光电二极管、混合光电倍增管。当使用荧光标记的探针时，优选通过共聚焦激光显微术检测。记录信号且在优选的实施方案中，通过计算机分析，例如通过使用12位的模拟-数字转换板分析信号。
第二方面，本发明提供了检测短RNAs的方法。如本文所用的，术语“短RNAs”是指约15至约30个核苷酸的短RNAs，优选约18至约25个核苷酸的短RNAs。该短RNAs包括但不限于miRNAs、stRNAs、siRNAs或短的发夹RNAs(shRNAs)，或所有上面的前体。该RNAs可在细胞中内源形成的，但也可以是转染进细胞的RNAs，例如siRNAs。本发明的发明人现已发现，根据本发明，短RNAs和特别是短的内源RNAs可通过本发明的寡核苷酸阵列来检测，该检测具有比现有已知方法和工具高得多的灵敏度和特异性。
在一个实施方案中，本发明提供检测短RNAs的方法，其包括将生物样品与本发明的寡核苷酸阵列接触。生物样品可源自细胞、组织、器官、体液，例如血清、血浆、精液、尿、滑液和脑脊液。可选择具有特定特征的细胞或组织，例如可选择癌性细胞或组织或者不同发展阶段或病理条件下的细胞或组织。在优选的实施方案中，生物样品源自哺乳动物，更优选啮齿类，例如小鼠或大鼠，或最优选人类。生物样品的核酸可通过纯化步骤例如酚/氯仿萃取、乙醇沉淀或凝胶纯化来富集。在优选的实施方案中，富集样品中短RNAs，例如这可以通过凝胶纯化或大小分级分离来实现。可使用的样品是未稀释的或加入溶剂稀释。合适的溶剂包括水、水性缓冲液或有机溶剂。合适的有机溶剂包括醇、酮、酯、脂族烃、醛、乙腈或腈。
用于检测短RNAs的适宜的方法包含以下步骤：(a)提供生物样品，其中所述样品包含短的内源RNAs；(b)将所述样品与本发明的寡核苷酸阵列相接触；(c)在短的内源RNAs和阵列中的寡核苷酸之间进行杂交反应，和任选地；(d)检测样品的短RNA和阵列的寡核苷酸之间的杂交。在优选的实施方案中，生物样品的短RNAs被标记，优选用荧光染料标记。
在另一实施方案中，本发明的方法用于短RNAs的序型分析。例如，相应于用于检测短RNAs的一套确定的序列的寡核苷酸阵列可以与正常细胞或组织样品和患病细胞或组织接触。在阵列上杂交的寡核苷酸的模式将指示组织样品中存在短RNA的缺乏。因此可以比较正常和患病细胞或组织中存在的短RNAs的模式，由此能将样品与疾病状态相关联。因而，本发明提供了将生物样品或特定短RNA的表达水平与健康状态相关联的方法，其包括：(a)提供生物样品，其中所述样品包含短RNAs；(b)将所述样品与本发明的寡核苷酸阵列接触，其中所述样品包含适合于检测短RNAs的一套预定序列；(c)将获得的杂交模式与标准杂交模式做比较。标准模式例如可获自源于患病细胞或组织的样品。因而相似的模式可表明细胞或组织样品具有某种疾病状态。在优选的实施方案中，细胞或组织被病原体感染，例如被人免疫缺陷病毒(HIV)感染、流感感染、疟疾、肝炎、疟原虫、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒或口蹄疫病毒感染。在优选的实施方案中，细胞或组织被病毒或细菌病原体感染。在另一优选的实施方案中，疾病是癌症(例如参见McManus，Michael T.的MicroRNAs and cancer.Seminarsin Cancer Biology(2003)，13(4)，253-258)，在更优选的实施方案中是实体瘤或血液恶性肿瘤。在更优选的实施方案中，疾病是神经变性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默氏病或多发性硬化。在特别优选的实施方案中，疾病是脆性X相关的智力迟缓(例如参见Caudy AA等(2002)Genes Dev；16：2491-6和Dostie，Josee等RNA(2003)，9(2)，180-186)。
在另一优选的实施方案中，寡核苷酸阵列对于检测生物的给定器官、组织或细胞的小RNAs是全面的，即该阵列包含针对特定生物中或者所述生物的器官、组织或细胞中形成的小RNAs的大部分或全部的寡核苷酸。在该上下文中的大部分是指至少60％，优选至少80％，更优选至少90％或最优选至少95％的小RNAs。该阵列也可包含细胞的特定阶段或条件的标记物的全面的一套预定序列，例如特定肿瘤或特定类型细胞的已知的标记物或标记物组合。在另一优选的实施方案中，寡核苷酸阵列适合于检测给定生物的或所述生物的器官、组织或细胞的小RNAs的特定子集，优选siRNA，更优选miRNAs或stRNAs。
如本领域的技术人员显而易见的，上述方法可用于制作任何生物学状况分布图，其在细胞或组织中短RNAs特别是miRNAs的数量和/或组成上不同。例如，生物样品可与不同的应激条件相关，例如与低氧或机械应力相关，通过该方法使用合适的生物样品和合适的标准模式，可将使用生物样品获得的模式进行比较。备选地，生物样品可与发育的不同阶段相关联。
本发明的另一实施方案提供了探究分化期间短RNA，特别是miRNA动力学的方法。例如，具有用于检测短RNAs且特别是miRNA的一套确定序列的寡核苷酸阵列可与源自例如胚胎干细胞的生物样品接触，所述干细胞经历分化形成不同谱系，如体外造血细胞的分化、成肌细胞的分化或PC12细胞分化成神经元。
本发明的另一方面提供了预后或诊断疾病，特别是人类疾病的方法。此类方法包括：
(a)提供生物样品，其可分离自目的组织或器官或体液，并且可以任选地进行预先处理，
(b)将对应于用于检测短RNAs特别是miRNAs的一套确定序列的寡核苷酸阵列与所述样品接触，
(c)获得杂交模式，
(d)将所述杂交模式与标准杂交模式比较，其中某种模式的存在或不存在表明患疾病的可能性或存在疾病。
例如，可通过某些短RNAs的组合指出癌性状况。当此类短RNAs与具有合适的寡核苷酸的寡核苷酸阵列杂交时，这种组合将引起特定的模式。因此，这种寡核苷酸阵列与生物样品的某种杂交模式的存在或缺乏将指出癌性状况的存在或缺乏。该模式也可与获自健康细胞、组织或器官等的标准模式进行比较，获自生物样品的模式相对于标准模式的差异将指示分析的生物样品中的异常或疾病状态。
仅仅为了举例说明，以下的实施例中进一步描述了本发明。在本发明公开的内容和实施例中参考但没有明确描述的分子遗传学、蛋白质和肽生物化学和免疫学的方法在科学文献中报道，且对于本领域的技术人员来说是熟知的。
实施例
材料和方法
MOE寡核苷酸的设计和合成
为Lagos-Quintana M等；Science 2001，294，853-8，Lagos-Quintana M.等；Current Biology，2002，12，735-9，Lagos-Quintana M.；RNA 2003，9，175-9，Mourelatos Zissimos等；Genes And Development 2002，16，720-8鉴定的31种人miRNAs设计MOE捕获探针。这些miRNAs的长度从20至24个核苷酸不等。这些miRNAs的丰度根据克隆各自miRNAs的频率不同。由于用于鉴定miRNAs的克隆和测序方法不能经常准确地确定miRNA的5’和3’末端，将MOE捕获探针设计成与对应于miRNA中心部分的19个核苷酸互补。对于20个核苷酸长的miRNAs，捕获探针与miRNA的19个5’端核苷酸互补，对于21个核苷酸长和更长的miRNAs，捕获探针与miRNA的核苷酸2-20互补。保持相同(19个核苷酸)长度的捕获探针将各自探针-miRNA双链体的解链温度的差别减少到最小。
根据以下置换规则：A→C；C→A；T→G；G→T，设计1bp和2bp的错配对照寡核苷酸。使用保证所有miRNA种类间最大特异性的算法来导入错配(J.Lange，LSI)。使用标准的亚磷酰胺化学法在ABI394或Expedite/Moss合成仪(Applied Biosystems)来制备本发明描述的合成的DNA和2’-MOE修饰的寡核苷酸。将亚磷酰胺溶解在0.05M浓度的乙腈中。通过乙腈中三氟甲磺酸苯并咪唑的0.2M溶液活化亚磷酰胺进行偶联。偶联时间通常包含3至6分钟。使用标准的封端试剂产生首次封端。通过过氧化氢叔丁基在二氯甲烷中的0.5M溶液进行氧化两分钟。在氧化或硫化之后进行第二次封端。通过二氯己烷中的2％三氯乙酸将寡核苷酸生长链脱三苯甲基用于下一次偶联。完成序列后，将支持体结合的化合物剪切，且通过32％氨水在80℃下脱保护形成“Trityl-on”。
将获得的粗溶液直接通过RP-HPLC纯化。通过电喷射质谱法(Electrospray Mass spectrometry)和毛细管凝胶电泳(Capillary GelElectrophoresis)分析纯化的脱三苯甲基的化合物，且通过紫外线根据它们在260nM下的消光系数进行定量。
与miRNA序列互补(完美匹配＝PM)的MOE-寡核苷酸和对应于1(1MM)和2个碱基对(2MM)错配对照示于表1中。
                             表1：
  No   miRNA  1nt 错配(1MM)
  13249.1   1MM_mir-1d  aca tac ttc gtt aca ttc C
  13250.1   1MM_mir-21  aac atc agt atg ata agc T
  13251.1   1MM_mir-22  agt tct tca cct ggc agc T
  13252.1   1MM_mir-16  cca ata ttt ccg tgc tgc T
  13253.1   1MM_let7a  cta tac aac ata cta cct C
  13254.1   1MM_let7b  cca cac aac ata cta cct C
  13255.1   1MM_mir-19b  gtt ttg cat tga ttt gca C
  13256.1   1MM_mir-23  gaa atc cct tgc aat gtg A
  13257.1   1MM_mir-20  cct gca cta gaa gca ctt T
  13258.1   1MM_mir-24  gtt cct gct taa ctg agc C
  13259.1   1MM_mir-96  aaa aat gtg ata gtg cca A
  13260.1   1MM_mir-122a  aac acc att ttc aca ctc C
  13261.1   1MM_mir-124a  gca ttc acc tcg tgc ctt A
  13262.1   1MM_mir-91  cct gca ctg gaa gca ctt T
  13263.1   1MM_mir-97  tcc agt cga tga tgt tta C
  13264.1   1MM_mir-24  gtt cct gct taa ctg agc C
  13265.1   1MM_mir-102  ctg att tca cat ggt gct A
  13266.1   1MM_mir-104  gct tat cag cct gat gtt G
  13267.1   1MM_mir-93  acc tgc acg cag agc act T
  13268.1   1MM_mir-95  ctc aat aaa gac ccg ttg A
  13269.1   1MM_mir-98  caa tac aac gta cta cct C
  13270.1   1MM_mir-99  caa gat cgg ctc tac ggg T
  13271.1   1MM_mir-100  caa gtt cgg ctc tac ggg T
  13272.1   1MM_mir-18  tct gca cta tat gca cct T
  13273.1   1MM_mir-92  agg ccg gga aaa gtg caa T
  13274.1   1MM_mir-94  tct gca ctg gca gca ctt T
  13275.1   1MM_mir-27  cgg aac tta tcc act gtg A
  13276.1   1MM_mir-101  tca gtt atc cca gta ctg T
  13277.1   1MM_mir-25  aga ccg aga aaa gtg caa T
  13278.1   1MM_mir-26a  cct atc ctg tat tac ttg A
  13279.1   1MM_mir-28  caa tag act ttg agc tcc T
  No   miRNA   2nt 错配(2MM)
  13280.1   2MM_mir-1d   aca tac tta gtt aca ttc C
  13281.1   2MM_mir-21   aac atc agg atg ata agc T
  13282.1   2MM_mir-22   agt tct tcc cct ggc agc T
  13283.1   2MM_mir-16   cca ata ttg ccg tgc tgc T
  13284.1   2MM_let7a   cta tac aaa ata cta cct C
  13285.1   2MM_let7b   cca cac aaa ata cta cct C
  13286.1   2MM_mir-19b   gtt ttg cag tga ttt gca C
  13287.1   2MM_mir-23   gaa atc ccg tgc aat gtg A
  13288.1   2MM_mir-20   cct gca ctc gaa gca ctt T
  13289.1   2MM_mir-24   gtt cct gcg taa ctg agc C
  13290.1   2MM_mir-96   aaa aat gtt ata gtg cca A
  13291.1   2MM_mir-122a   aac acc atg ttc aca ctc C
  13292.1   2MM_mir-124a   gca ttc aca tcg tgc ctt A
  13293.1   2MM_mir-91   cct gca ctt gaa gca ctt T
  13294.1   2MM_mir-97   tcc agt cgc tga tgt tta C
  13295.1   2MM_mir-24   gtt cct gcg taa ctg agc C
  13296.1   2MM_mir-102   ctg att tcc cat ggt gct A
  13297.1   2MM_mir-104   gct tat cat cct gat gtt G
  13298.1   2MM_mir-93   acc tgc act cag agc act T
  13299.1   2MM_mir-95   ctc aat aac gac ccg ttg A
  13300.1   2MM_mir-98   caa tac aaa gta cta cct C
  13301.1   2MM_mir-99   caa gat cgt ctc tac ggg T
  13302.1   2MM_mir-100   caa gtt cgt ctc tac ggg T
  13303.1   2MM_mir-18   tct gca ctc tat gca cct T
  13304.1   2MM_mir-92   agg ccg ggc aaa gtg caa T
  13305.1   2MM_mir-94   tct gca ctt gca gca ctt T
  13306.1   2MM_mir-27   cgg aac ttc tcc act gtg A
  13307.1   2MM_mir-101   tca gtt ata cca gta ctg T
  13308.1   2MM_mir-25   aga ccg agc aaa gtg caa T
  13309.1   2MM_mir-26a   cct atc ctt tat tac ttg A
  13310.1   2MM_mir-28   caa tag acg ttg agc tcc T
n(g，a，t)＝2’-O-(2-甲氧基乙基)-核糖核苷，c＝2’-O-(2-甲氧基乙基)-5-甲基胞嘧啶。3’-末端的大写字母表示N(A，G，C，T)2’-脱氧核苷酸(nts)。由于实际的原因，所有序列都使用DNA支持物合成，导致在3’-末端位置具有一个2’-脱氧核苷酸的MOE寡核苷酸。
寡核苷酸微阵列的印刷和杂交
基本上根据所述的制备、印刷和杂交NovaChips(D，Budach W，WankeC，Chibout SD (2003) EVanescent resonator chips：a universal platformwith superior sensitivity for fluorescence-based microarrays.BiosensBioelectron；18：489-97)。杂交混合物含有3微克标记的microRNA(Budach，Wolfgang；Neuschaefer，Dieter；Wanke，Christoph；Chibout，Salah-Dine.Generation of transducers for fluorescence-based microarrays withenhanced sensitivity and their application for gene expression profiling.Analytical Chemistry(2003)，75(11)，2571-2577)。
从人HeLa和小鼠P19细胞制备miRNA
在37℃下将HeLa细胞生长在添加了10％FCS和2mM L-谷氨酰胺的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基中。用PBS清洗约1.5×107个细胞，并根据制造商说明书，每10cm2表面用1ml Trizol(Life-TechnologiesTM)提取RNA。每500μl用20U DNA酶I在37℃下消化水相中存在的DNA 1小时。接着进行苯酚/氯仿萃取，乙醇沉淀全部RNA，在无RNA酶的水中重悬浮，按照制造商的RNA清除方案，将100μg RNA应用于RNeasy小旋转柱(Qiagen)。用乙醇沉淀包含在流动液中的小于～200nts的RNAs种类，将其在变性凝胶上样缓冲液(70％甲酰胺，30mM EDTA，0.05％二甲苯腈蓝，0.05％溴酚蓝)中重悬浮，并在在TBE缓冲液中电泳的含8M脲-12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离。在紫外线光投影下从凝胶中切除大小范围在15至30nts的RNAs，将其在4℃下用含有500mM醋酸铵、1mMEDTA和20％苯酚/氯仿的溶液洗脱16小时，乙醇沉淀并在无RNA酶的水中重悬浮。通过在260nm下测量光密度来估计回收的RNA的量。备选地，将RNA样品应用于RNeasy小旋转柱(Qiagen)且在省略了PAGE纯化步骤的芯片实验中使用。
合成的对照miRNA寡核苷酸和从HeLa和P19细胞分级分离的大小选择的miRNAs的荧光标记
互补于8种不同的miRNA序列的19-mer RNA寡核苷酸购自Xeragon。对于RNAs的标记，通过加入1μl新制备的100mM高碘酸钠水溶液，之后在黑暗中室温下孵育1小时，将9μl水中的9μg RNA氧化成二醛。通过加入1μl 200mM的亚硫酸钠并在室温下孵育20分钟来除去多余的氧化剂。在加入12μl 50mM pH 4的醋酸钠缓冲液之后，将5μl 20mM pH7.2的乙二胺氢氯化物溶液加入到氧化的RNA中。将反应混合物在37℃下孵育1小时，通过用2μl新制备的乙腈中的200mM氰基硼氢化钠还原来稳定RNA和间隔臂之间的醛亚胺键。在室温下孵育30分钟且在0℃下用2倍体积的丙酮中的2％高氯酸锂沉淀1小时。将样品在14000转/分钟下旋转45分钟(3-4℃)，在除去上清液之后，用丙酮清洗RNA沉淀并空气干燥。通过在5μl DEPC处理的水中重悬浮氨基修饰的RNA，并加入1M磷酸钠缓冲液(pH 7.8)中的5μl 30mM Cy5 N-羟基琥珀酰亚胺基活性酯进行偶联。在黑暗中室温孵育1小时之后，在-20℃下用2.5倍体积100％冰预冷的乙醇沉淀RNA 1小时。将样品在14000转/分钟下旋转30分钟(3-4℃)，在除去上清液之后，用冰预冷的70％乙醇水溶液清洗Cy5-RNA沉淀并空气干燥。通过毛细管凝胶电泳分析标记的RNA的质量和数量，且通过紫外线根据在260nm下的消光系数定量RNA。
表2中包含Cy5-标记的RNA序列。
表2：用于与固定的互补“捕获”寡核苷酸杂交的3’-Cy5标记的合成miRNA等价物的序列。碱基配对的核苷酸用粗体高亮显示。
  Nr   miRNA   Compl   序列   芯片上的捕获序列   来源   Acc Nr.
  3839   mir-21   匹配1MM2MM   UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAC   aacatcagtctgataagcTaacatcagtatgataagcTaacatcaggatgataagcT   人   AF480524
  3840   mir-23   匹配1MM2MM   AUCACAUUGCCAGGGAUUUCCA   gaaatccctggcaatgtgAgaaatcccttgcaatgtgAgaaatcccgtgcaatgtgA   人   AF480526
  3841   mir-124a   匹配1MM2MM   UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA   gcattcaccgcgtgccttAgcattcacctcgtgccttAgcattcacatcgtgccttA   小鼠   AJ459733
  3842   mir-24   匹配1MM2MM   UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG   gttcctgctgaactgagcCgttcctgcttaactgagcCgttcctgcgtaactgagcC   人   AF480527
  3843   mir-99   匹配1MM2MM   AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG   caagatcggatctacgggTcaagatcggctctacgggTcaagatcgtctctacgggT   人   AF480537
  3844   mir-100   匹配1MM2MM   AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG   caagttcggatctacgggTcaagttcggctctacgggTcaagttcgtctctacgggT   人   AF480498
  11657   mir-30a-s/mir-97   匹配1MM2MM   GUAAACAUCCUCGACUGGA   tccagtcgaggatgtttaCtccagtcgatgatgtttaCtccagtcgctgatgtttaC   人
  11660   mir-104   匹配1MM2MM   CAACAUCAGUCUGAUAAGC   gcttatcagactgatgttGgcttatcagcctgatgttGgcttatcatcctgatgttG   人
结果
使用含有一组点样的MOE和DNA寡核苷酸以及它们对应的1和2核苷酸错配对照的芯片来检查寡核苷酸捕获探针的亲和性和特异性。互补于在芯片上代表的八种不同miRNA序列的RNA寡核苷酸用Cy5标记(表2)，并在不同的条件下与该芯片杂交。
对于所有DNA寡核苷酸微阵列的共同问题是关于平台的灵敏度和特异性方面需要足够的折衷。
如图1所阐明的，用MOE修饰的1和2核苷酸错配寡核苷酸获得的荧光强度相对于完美匹配的双链体显示了显著的强度增加。增加杂交温度将进一步提高分辨力。相反，相应的标准DNA捕获探针在所选择的杂交严紧条件下不能形成稳定的双链体，导致所有的DNA捕获探针都没有显著的强度值。
在8种情况中的5种中，通过将杂交温度从37℃提高至42℃，使用MOE探针的错配分辨可以显著提高(图1)，且没有损害它们的捕获灵敏度。在寡核苷酸mir-99和mir-100的情况中，观察到了显著程度的交叉反应性，所述寡核苷酸代表仅有一个核苷酸不同的miRNAs。
来自人和小鼠细胞提取物的miRNAs与MOE NovaChips的杂交
在下一步中，从HeLa/P19小鼠细胞中提取大小经选择的miRNAs，将其用Cy5标记并用探针与具有高灵敏性的芯片在30℃至56℃的温度范围下杂交(Novachip：Generation of transducers for fluorescence-basedmicroarrays with enhanced sensitivity and their application for geneexpression profiling.Budach，Wolfgang；Neuschaefer，Dieter；Wanke，Christoph；Chibout，Salah-Dine.Novartis Pharma AG Switzerland，Basel，Switz.Analytical/Chemistry(2003)，75(11)，2571-2577)。表3中显示了对于芯片上31种不同标记的具有互补的MOE捕获探针的miRNAs和1nt MM和2 nt MM对照测量的荧光强度。即使在30℃和37℃下已能观察到一些miRNAs的特异杂交(根据用野生型和1MM和2MM MOE探针获得的信号的比较)，在NovaChip上存在的错配和完全互补序列之间的分辨在42℃或更高温度下更好。在48℃和56℃下进行杂交允许几乎所有miRNAs的特异性检测，在较高温度下伴随着强度的减少。在56℃下，在很少的情况中没有记录到信号。通过在三种不同的温度(42、48和56℃)下进行杂交，对于几乎所有测试的miRNAs都可能记录特异的信号。实际上，在任何测试温度下，仅有六种miRNAs的信号似乎不存在或者是非特异性的。这可能是由于细胞分离物中特定miRNA的缺乏，或者是由于用于杂交的RNA样品中存在交叉杂交的无关RNA。如通过一种情况例证的，如果单个错配不允许miRNA的特定检测，则两个错配允许更好的分辨。最后，在42℃下两个各自进行的杂交的强度值(数据未显示)显示了相当的强度值，表明高水平的可再现性。
表3：将Cy5标记的HeLa miRNA在不同温度(T)下在所述条件下于芯片上杂交。对于芯片上的大多数探针，48℃(用粗体标记)的杂交温度似乎是信号强度和特异性之间的最佳折衷。
  杂交温度   48℃
  探针名   序列   密度(平均值)-背景(平均值)
  let7a   cta tac aac cta cta cct C   3306
  1MM_let7a   cta tac aac ata cta cct C   -35
  2MM_let7a   cta tac aaa ata cta cct C   -46
  let7b   cca cac aac cta cta cct C   2436
  1MM_let7b   cca cac aac ata cta cct C   -7
  2MM_let7b   cca cac aaa ata cta cct C   -81
  mir-100   caa gtt cgg atc tac ggg T   2459
  1MM_mir-100   caa gtt cgg ctc tac ggg T   1056
  2MM_mir-100   caa gtt cgt ctc tac ggg T   24
  mir-101   tca gtt atc aca gta ctg T   64
  1MM_mir-101   tca gtt atc cca gta ctg T   0
  2MM_mir-101   tca gtt ata cca gta ctg T   -43
  mir-102   ctg att tca aat ggt gct A   624
  1MM_mir-102   ctg att tca cat ggt gct A   6
  2MM_mir-102   ctg att tcc cat ggt gct A   130
  mir-104   gct tat cag act gat gtt G   -44
  1MM_mir-104   gct tat cag cct gat gtt G   6
  2MM_mir-104   gct tat cat cct gat gtt G   -17
  mir-122a   aac acc att gtc aca ctc C   -4
  1MM_mir-122a   aac acc att ttc aca ctc C   -54
  2MM_mir-122a   aac acc atg ttc aca ctc C   -21
  mir-124a   gca ttc acc gcg tgc ctt A   554
  1MM_mir-124a   gca ttc acc tcg tgc ctt A   541
  2MM_mir-124a   gca ttc aca tcg tgc ctt A   -35
 杂交温度   48℃
  探针名  序列   密度(平均值)-背景(平均值)
  mir-16  cca ata ttt acg tgc tgc T   1031
  1MM_mir-16  cca ata ttt ccg tgc tgc T   86
  2MM_mir-16  cca ata ttg ccg tgc tgc T   173
  mir-18  tct gca cta gat gca cct T   1013
  1MM_mir-18  tct gca cta tat gca cct T   242
  2MM_mir-18  tct gca ctc tat gca cct T   13
  mir-19b  gtt ttg cat gga ttt gca C   7243
  1MM_mir-19b  gtt ttg cat tga ttt gca C   15
  2MM_mir-19b  gtt ttg cag tga ttt gca C   -12
  mir-1d  aca tac ttc ttt aca ttc C   -9
  1MM_mir-1d  aca tac ttc gtt aca ttc C   96
  2MM_mir-1d  aca tac tta gtt aca ttc C   -79
  mir-20  cct gca cta taa gca ctt T   2531
  1MM_mir-20  cct gca cta gaa gca ctt T   8
  2MM_mir-20  cct gca ctc gaa gca ctt T   13
  mir-21  aac atc agt ctg ata agc T   2796
  1MM_mir-21  aac atc agt atg ata agc T   -9
  2MM_mir-21  aac atc agg atg ata agc T   37
  mir-22  agt tct tca act ggc agc T   1820
  1MM_mir-22  agt tct tca cct ggc agc T   1183
  2MM_mir-22  agt tct tcc cct ggc agc T   2771
  mir-23  gaa atc cct ggc aat gtg A   9291
  1MM_mir-23  gaa atc cct tgc aat gtg A   102
  2MM_mir-23  gaa atc ccg tgc aat gtg A   16
  mir-24  gtt cct gct gaa ctg agc C   5708
  1MM_mir-24  gtt cct gct taa ctg agc C   4022
  2MM_mir-24  gtt cct gcg taa ctg agc C   1305
  杂交温度   48℃
  探针名   序列   密度(平均值)-背景(平均值)
  mir-24   gtt cct gct gaa ctg agc C   6171
  1MM_mir-24   gtt cct gct taa ctg agc C   3858
  2MM_mir-24   gtt cct gcg taa ctg agc C   1282
  mir-25   aga ccg aga caa gtg caa T   1186
  1MM_mir-25   aga ccg aga aaa gtg caa T   -37
  2MM_mir-25   aga ccg agc aaa gtg caa T   -36
  mir-26a   cct atc ctg gat tac ttg A   1533
  1MM_mir-26a   cct atc ctg tat tac ttg A   97
  2MM_mir-26a   cct atc ctt tat tac ttg A   -66
  mir-27   cgg aac tta gcc act gtg A   29330
  1MM_mir-27   cgg aac tta tcc act gtg A   996
  2MM_mir-27   cgg aac ttc tcc act gtg A   1064
  mir-28   caa tag act gtg agc tcc T   836
  1MM_mir-28   caa tag act ttg agc tcc T   -17
  2MM_mir-28   caa tag acg ttg agc tcc T   -36
  mir-91   cct gca ctg taa gca ctt T   4435
  1MM_mir-91   cct gca ctg gaa gca ctt T   297
  2MM_mir-91   cct gca ctt gaa gca ctt T   -42
  mir-92   agg ccg gga caa gtg caa T   5896
  1MM_mir-92   agg ccg gga aaa gtg caa T   3043
  2MM_mir-92   agg ccg ggc aaa gtg caa T   7643
  mir-93   acc tgc acg aag agc act T   319
  1MM_mir-93   acc tgc acg cag agc act T   19
  2MM_mir-93   acc tgc act cag agc act T   56
  mir-94   tct gca ctg tca gca ctt T   2340
  1MM_mir-94   tct gca ctg gca gca ctt T   197
  2MM_mir-94   tct gca ctt gca gca ctt T   717
  杂交温度   48℃
  探针名   序列   密度(平均值)-背景(平均值)
  mir-95   ctc aat aaa tac ccg ttg A   -42
  1MM_mir-95   ctc aat aaa gac ccg ttg A   -40
  2MM_mir-95   ctc aat aac gac ccg ttg A   -7
  mir-96   aaa aat gtg cta gtg cca A   225
  1MM_mir-96   aaa aat gtg ata gtg cca A   -46
  2MM_mir-96   aaa aat gtt ata gtg cca A   -63
  mir-97   tcc agt cga gga tgt tta C   4811
  1MM_mir-97   tcc agt cga tga tgt tta C   39
  2MM_mir-97   tcc agt cgc tga tgt tta C   12
  mir-98   caa tac aac tta cta cct C   82
  1MM_mir-98   caa tac aac gta cta cct C   -30
  2MM_mir-98   caa tac aaa gta cta cct C   -33
  mir-99   caa gat cgg atc tac ggg T   2140
  1MM_mir-99   caa gat cgg ctc tac ggg T   1059
  2MM_mir-99   caa gat cgt ctc tac ggg T   127

Claims (20)

1.包含表面和许多寡核苷酸的寡核苷酸阵列，其中至少一个寡核苷酸具有至少一个经修饰的糖部分。
2.根据权利要求1的寡核苷酸阵列，其中所述糖部分的2’-OH基团被取代。
3.根据权利要求2的寡核苷酸阵列，其中所述糖部分在2’-位包含：F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可以为经取代或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基、烷氧基烷基、C1至C10低级烷基，经取代的C1至C10低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2、CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基。
4.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中糖部分包含2’-MOE、2’-DMAOE、2’-甲氧基或2′-氨基丙氧基。
5.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中所述寡核苷酸具有约15至50个核苷酸的长度。
6.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中所述寡核苷酸包含至少10个经修饰的糖部分。
7.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中所述寡核苷酸阵列包含至少50％的具有经修饰的糖部分的寡核苷酸。
8.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中所述寡核苷酸阵列包含与短的哺乳动物RNAs特异杂交的寡核苷酸。
9.权利要求8的寡核苷酸阵列，其中所述寡核苷酸与短的人RNAs特异杂交。
10.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中所述寡核苷酸阵列对于检测生物的给定器官、组织或细胞的小RNAs是全面的。
11.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中所述寡核苷酸非共价附着到所述表面。
12.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中所述寡核苷酸阵列包含具有一个或更多脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸。
13.根据前面权利要求任一项的寡核苷酸阵列，其中该寡核苷酸阵列可在消散波传感器平台上使用。
14.检测短RNAs的方法，其包括步骤：(a)提供生物样品，其中所述样品包含短RNAs；(b)将所述样品与根据权利要求1至13任一项的寡核苷酸阵列接触；(c)在短的内源RNAs和阵列中的所述寡核苷酸之间进行杂交反应。
15.关联生物样品与生物学状况的方法，其包括：(a)提供生物样品，其中所述样品包含短RNAs；(b)将所述样品与根据权利要求1至13任一项的寡核苷酸阵列接触，其中所述阵列包含适于检测短RNAs的一套预先确定的序列；(c)将获得的杂交模式与标准杂交模式进行比较。
16.根据权利要求14或15的方法，其中所述的短RNAs是micro RNAs(miRNAs)。
17.根据权利要求15或16的方法，其中所述生物样品与健康状态相关。
18.预后或诊断疾病的方法，其包括：(a)提供生物样品，(b)接触相应于用于检测短RNAs的一套确定的序列的根据权利要求1至13任一项的寡核苷酸阵列，(c)获得杂交模式，(d)将所述杂交模式与标准杂交模式进行比较，其中某种模式的存在或不存在表明可能患疾病或者存在疾病。
19.根据权利要求18的方法，其中所述生物样品来源于人。
20.根据权利要求18或19的方法，其中所述疾病是癌症、神经变性疾病或传染病。
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