KR20140106061A

KR20140106061A - 복수의 형광 검출기를 장착한 모세관 전기영동 시스템을 이용한 다중 ｍｉＲＮＡ 동시 검출법

Info

Publication number: KR20140106061A
Application number: KR1020130020062A
Authority: KR
Inventors: 송은주; 반은미
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2013-02-25
Filing date: 2013-02-25
Publication date: 2014-09-03
Also published as: US20140242578A1

Abstract

본 발명은 다중 miRNA를 동시 검출하는 방법 및 이를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 시료 내 극소량으로 존재하는 두 가지 이상의 miRNA를 단 1회의 측정으로 분석이 가능하다. 또한, 본 발명의 검출방법을 통하여 질환과 관련된 다중 miRNA를 동시 복합적으로 검출하여 질환의 진단, 예컨대 심근경색을 포함하는 심혈관 질환을 높은 정확도로 진단할 수 있다.

Description

복수의 형광 검출기를 장착한 모세관 전기영동 시스템을 이용한 다중 ｍｉＲＮＡ 동시 검출법{Simultaneous Detection of Multiple miRNAs using Capillary Electrophoresis with Plural Laser Induced Fluorescence}

본 발명은 각기 다른 파장에서 형광물질을 검출할 수 있는 복수의 검출기가 장착된 모세관 전기영동 시스템을 이용하여 시료 내 극소량으로 존재하는 다중 miRNA를 동시에 검출하는 방법 및 이를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.

마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)는 단일 서열로 구성된 보통 21개에서 22개의 뉴클리오티드로 구성된 매우 작은 크기의 비암호화 RNA이며, mRNA의 번역을 방해하는 과정을 통해 다른 유전자들을 조절함으로써 세포 분화, 배아 발생, 대사 조절 및 암 발생과정을 제어한다. 대략 인간 유전체는 전체 유전자의 30% 가량을 miRNA에 의해 조절되는 것으로 추정된다. miRNA는 비암호화 부분에 있는 개별 유전자의 전사를 통해 생성된다. miRNA는 핵에서 RNA 중합효소 Ⅱ에 의해 전사되는 전구물질인 pri-miRNA로부터 전사된다. 이어서 드로샤(Drosha, dsRNA-specific ribonuclease)라고 하는 핵산분해효소 Ⅲ에 의해 분해되어 헤어핀 모양의 pre-miRNA가 생성된다. pre-miRNA의 헤어핀은 보조인자로써 단백질 엑스포틴-5(exportin-5)와 Ran-GTP에 의해 세포 핵 밖으로 이동되고 리보핵산 분해효소 Ⅲ Dicer 및 TRBP(transactivation-responsive RNA binding protein)의 작용에 의해 대략 22개의 뉴클레오티드로 구성된 miRNA 이중가닥(duplex)으로 처리된다. miRNA 이중가닥은 RISCs(RNA induced silencing complexes)와 결합하여 mRNA를 분해하거나 해독과정을 차단을 통해 유전자를 조절한다.

많은 종류의 miRNA와 이에 조절되는 표적 유전자는 다양한 질환의 기작에 miRNA의 중요한 역할을 예측할 수 있다. 따라서 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 따라 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소양상을 보임으로써 miRNA를 질환의 진단 및 예측 및 예후에 이용될 수 있는 바이오마커로써 인식되고 있다.

특히, 심혈관 질환의 경우 질환의 진단 및 예후에 바이오마커로써 miRNA의 연구가 매우 활발히 진행되고 있다. 이는 심혈관 질환은 세계적으로 주요 사망 원인으로 발병 즉시 처치하지 않을 경우 그 예후가 좋지 않아 빠르고 정확한 진단이 요구되어 짐에 따라 유효한 바이오마커의 발견이 요구되고 있다. 특히, miRNA는 세포뿐 아니라 혈청, 혈장 혹은 타액, 눈물 그리고 뇨 등과 같이 다양한 생체 물질에서 발견되고 특정 miRNA의 농도가 질환에 따라 정상인에 비해 차이를 보임으로써 심혈관질환을 포함한 다양한 질환 관련 바이오마커로써의 가능성 연구 및 질환의 진단에 적용할 수 있다.

그러나 한 가지 miRNA는 다양한 질환과 관련이 있기 때문에 진단의 오류를 최소화하기 위해서는 몇 가지 miRNA 진단 마커 후모물질들의 동시 검출이 필요하다. 또한 진단뿐 아니라 새로운 진단 마커의 발견을 위해서도 여러 miRNA의 스크리닝이 필요하다. 현재 miRNA의 검출 방법으로는 마이크로어레이와 역전사 중합효소 연쇄반응 검사가 많이 이용되고 있으나 마이크로 어레이는 많은 종류의 miRNA를 검출할 수 있다는 장점이 있으나 정량성이 떨어지는 단점을 갖고 있다. 역전사 중합효소 연쇄반응 검사의 경우 매우 뛰어난 정량 분석법이지만 비용이 비싸고 재현성에 문제가 있으며 무엇보다 분석시간이 3-4시간 이상으로 매우 길다는 단점을 갖고 있다. 이에 비해 모세관 전기 영동법은 정량성, 재현성, 및 분리도가 뛰어나고 무엇보다도 분석시간이 1시간 이내로 짧다는 장점으로 miRNA 검출에 이용하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 이에 정량성, 재현성, 신속성 및 분리도가 뛰어나고, 무엇보다도 여러 가지 miRNA를 동시에 검출하기 위한 연구들이 시작되었으나, 아직까지 만족할 만하지 못한 것이 현실이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 질환과 관련된 다중 miRNA들을 동시에 검출하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 이들 miRNA들을 각각 다른 형광물질을 포함하는 프로브들로 혼성화 시킨 뒤, 복수의 검출기가 장착된 모세관 전기영동 시스템을 이용하여 검출할 경우 세포내에 존재하는 다중 miRNA를 고감도로 신속하게 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 시료 내 존재하는 두 가지 이상의 miRNA의 동시 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 복수의 LIF 검출기가 장착된 모세관 전기영동 시스템에 적용하기 위한 두 가지 이상의 miRNA 동시 검출용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 존재하는 두 가지 이상의 miRNA의 동시 검출방법을 제공한다:

(a) 분석하고자 하는 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)로부터 추출한 RNA와, 상기 시료에 존재할 것으로 예상되는 두 가지 이상의 miRNA에 각각 특이적인 프로브로서 형광물질이 결합된 단일가닥 DNA를 혼성화 버퍼에서 혼성화 시키는 단계;

(c) 복수의 LIF(laser induced fluorescence) 검출기가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 DNA-miRNA 복합체를 확인하는 단계; 및

(d) 상기 단계 (c)의 결과 서로 다른 파장에서 DNA-miRNA 복합체 피크를 확인하여 시료내 존재하는 두 가지 이상의 miRNA를 검출하는 단계.

본 발명자들은 질환과 관련된 다중 miRNA들을 동시에 검출하는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과 이들 miRNA들을 각각 다른 형광물질을 포함하는 프로브들로 혼성화 시킨 뒤, 복수의 검출기가 장착된 모세관 전기영동 시스템을 이용하여 검출할 경우 세포내에 존재하는 다중 miRNA를 동시에 고감도로 신속하게 검출할 수 있음을 확인하였다.

miRNA(micro RNA)는 다양한 질환을 예측하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 즉, 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 있어서 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소 확인을 통하여 miRNA를 질환의 진단 및 예후를 예측하는데 이용될 수 있는 바이오마커로써 사용할 수 있다. 현재 miRNA의 검출 방법으로는 마이크로어레이와 역전사 중합효소 연쇄반응 검사가 많이 이용되고 있으나 마이크로 어레이는 많은 종류의 miRNA를 검출할 수 있다는 장점이 있으나 정량성이 크게 떨어지는 단점을 갖고 있으며, 역전사 중합효소 연쇄반응 검사의 경우 비용이 비싸고 재현성에 문제가 있으며 무엇보다 분석시간이 3-4시간 이상으로 매우 길다는 단점을 갖고 있다. 또한, 모세관 전기 영동법은 정량성, 재현성, 및 분리도가 뛰어나고 무엇보다도 분석시간이 1시간 이내로 짧다는 장점이 있으나, 다양한 종류의 miRNA를 동시에 검출하기 어렵다는 단점을 갖고 있다.

본 발명자들이 개발한 검출방법에 따르면, 체내 극소량 존재하는 질환과 관련된 다양한 종류의 miRNA를 복수의 LIF 검출기를 이용하여 단 시간 내에 동시에 검출할 수 있으며, 질환의 진단 및 예측에 보다 효과적으로 적용할 수 있다.

본 발명에서, 용어“극소량”은 시료 내 나노몰, 피코몰 또는 펨토몰 단위 이하로 존재할 정도의 소량을 의미한다.

시료 내에서 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 트리졸(trizol) 또는 트리톤 X-100을 이용하여 추출할 수 있다.

본 발명의 검출방법은 다양한 질환의 진단 및 예후를 예측하는데 이용될 수 있으며, 바람직하게는 심근경색을 포함하는 심혈관질환의 진단에 이용할 수 있다.

심혈관질환의 바이오마커는 당업계에 다양한 miRNA들이 공지되어 있다(Wilson et al., Dynamic microRNA expression programs during cardiac differentiation of human embryonic stem cells: role for miR-499, Circ Cardiovasc Genet, 3(5):426-35 (2010)). 따라서, 본 발명의 검출방법이 심혈관질환의 바이오마커 검출에 이용될 경우, miRNA는 바람직하게는 miRNA-23a, miRNA-24-1, miRNA-21, miRNA-499, miRNA-1, miRNA-133a 및 miRNA-208로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 miRNA, 보다 바람직하게는 서열목록 제1서열의 miRNA-23a, 서열목록 제2서열의 miRNA-24-1, 서열목록 제3서열의 miRNA-21, 서열목록 제4서열의 miRNA-499, 서열목록 제5서열의 miRNA-1, 서열목록 제6서열의 miRNA-133a 및 서열목록 제7서열의 miRNA-208로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 miRNA, 가장 바람직하게는 서열목록 제1서열의 miRNA-23a, 서열목록 제2서열의 miRNA-24-1 및 서열목록 제3서열의 miRNA-21로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 miRNA를 심혈관질환의 바이오마커로 이용할 수 있다.

상기 miRNA는 다양한 신체기관, 즉, 세포, 혈청, 혈장, 타액, 눈물 또는 뇨에 극소량 존재할 수 있다. 예를 들어, miRNA를 심혈관질환의 바이오마커로 이용할 경우 상기 세포는 심근세포(cardiomycyte)가 될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브는 바람직하게는 2 가지 이상의 miRNA에 각각 혼성화 될 수 있는 2 가지 이상의 프로브로서, 상기 miRNA를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다.

프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 적합한 표지는 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine), 시아닌(cyanine)등 다양한 형광물질을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 6-FAM(5´-carboxyfluorescein phosphoramidite)이나 Cy3 또는 Cy5을 이용할 수 있다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, “Amersham”(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(버퍼 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다. 본 발명에서 이용하는 버퍼의 종류는 당업계에 이용되는 다양한 종류의 버퍼를 이용할 수 있으며, 최적의 혼성화 조건은 상기 버퍼 중 가장 혼성화 정도가 높은 버퍼를 선정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 혼성화 버퍼는 트리스-아세테이트 버퍼를 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 모세관 전기영동 시스템은 복수의 LIF 검출기가 장착된다(CE/LIF 시스템).

복수의 LIF 검출기는 이중 LIF(dual LIF, dLIF) 또는 삼중 LIF(triple LIF, tLIF)이 될 수도 있다.

LIF 검출기의 파장은 검출하려 하는 형광물질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 이중 LIF의 경우 두 가지 형광물질을 이용하여 두 가지의 여기 파장 또는 방출 파장, 삼중 LIF의 경우 세 가지 형광물질을 이용하여 세 가지의 여기 파장 또는 방출 파장을 나타낼 수 있다.

상기 파장의 범위는 사용하는 형광물질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 검출 대상, 검출 목적 및 사용하는 형광물질의 종류를 고려하여 결정할 수 있다. 여기 파장 값으로 바람직하게는 400-700 ㎚의 값을 가지며, 보다 바람직하게는 488 ㎚, 514 ㎚, 530 ㎚, 560 ㎚, 594 ㎚, 635 ㎚, 640 ㎚ 및 685 ㎚로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 값을 갖는다. 방출파장 값으로는 바람직하게는 500-800 ㎚ 값을 갖는다.

예를 들어, 형광물질로 6-FAM을 이용할 경우 여기 파장이 488 ㎚인 LIF 검출기를 이용할 수 있으며, Cy-5를 이용할 경우 여기 파장이 635 ㎚인 LIF 검출기를 이용할 수 있다.

이중 또는 삼중 LIF 검출기가 장착된 모세관 전기영동 시스템(CE/dLIF 또는 CE/tLIF 시스템)을 이용할 경우, 서로 다른 두 개 또는 세 개의 파장에서 각각 다른 두 가지 이상의 miRNA를 동시에 검출할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 복수의 LIF(laser induced fluorescence) 검출기가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템에 적용하기 위한 두 가지 이상의 miRNA 동시 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 (a) 두 가지 이상의 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 2 가지 이상의 프로브 및 상기 프로브에 결합 가능한 2 가지 이상의 형광물질, 또는 2 가지 이상의 형광물질이 각각 결합된 프로브로서 상기 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 2 가지 이상의 프로브; (b) 혼성화 버퍼; 및 (c) DNA-miRNA 복합체 분리용 버퍼를 포함한다.

본 발명에서 이용 가능한 형광물질은 당업계에 존재하는 다양한 형광물질일 수 있으며, 바람직하게는 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine), 시아닌(cyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 형광물질을 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혼성화 버퍼는 트리스-아세테이트 버퍼이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분리용 버퍼는 트리스-보레이트 버퍼이다.

본 발명의 키트는 시료 내 존재하는 다중 miRNA 동시 검출에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 miRNA-23a, miRNA-24-1, miRNA-21, miRNA-499, miRNA-1, miRNA-133a 및 miRNA-208로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 miRNA 검출에 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 두 가지 이상의 miRNA를 동시 검출하는 방법 및 이를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에 따르면, 시료 내 극소량으로 존재하는 두 가지 이상의 miRNA를 단 1회의 측정으로 분석이 가능하다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 검출방법은 질환과 관련된 여러 가지 miRNA를 동시 복합적으로 검출하여 질환의 진단, 예컨대 심근경색을 포함하는 심혈관 질환을 높은 정확도로 진단할 수 있다.

도 1은 세포내에서 miRNA의 생성 및 miRNA를 매개로 한 유전자 조절과정을 나타낸 것이다.
도 2는 몇 가지 종류의 miRNA을 정량 혹은 정성 분석하기 위해 타겟 miRNA와 타겟 miRNA에 특이성을 갖는 두 가지 다른 파장을 갖는 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA를 반응 시킨 후 이중 CE/LIF(CE/dLIF)를 이용하여 검출하여 반응하지 않은 DNA 피크 및 DNA-타겟 miRNA 복합체 피크를 통해 타겟 miRNA의 존재를 동시에 확인한 것이다.
도 3은 miRNA-21, miRNA-23a, 그리고 miRNA-24-1에 특이성을 띠는 두 가지 다른 파장을 갖는 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA들을 CE/dLIF를 이용하여 검출 하였을 때와 DNA 피크와 miRNA-21, miRNA-23a, 그리고 miRNA-24-1를 DNA와 반응시킨 후 CE/dLIF를 이용하여 검출하여 DNA-miRNA 복합체 피크들을 확인한 것이다.
도 4는 miRNA-21, miRNA-23 그리고 miRNA-24-1의 양에 특이성을 띠는 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA와 혼성화 시 miRNA-21, miRNA-23 그리고 miRNA-24-1의 농도의 증가에 따라 DNA-miRNA 복합체 피크의 감도가 비례적으로 증가됨을 확인한 것이다.
도 5는 miRNA-21, miRNA-23 그리고 miRNA-24-1을 첨가 혹은 첨가되지 않은 H9c2 심근세포주를 추출한 전체 RNA에 miRNA-21, miRNA-23 그리고 miRNA-24-1에 특이성을 띠는 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA를 첨가시켜 혼성화 반응 후 CE/dLIF를 이용하여 검출 하였을 때 반응하지 않은 DNA 피크 및 DNA-miRNA-21와 DNA-miRNA-23 복합체 피크로부터 H9c2 심근세포 내 miRNA-21과 miRNA-23 검출을 확인한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 모세관 전기영동법에 의해 유리 DNA 피크 및 miRNA 와 결합된 DNA 피크 확인

본 발명자들은 심혈관질환의 바이오마커 miRNA들 중 miRNA-23a, miRNA-24-1 및 miRNA-21를 선별하고, 도 2와 같이 miRNA-23a (5´-AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC-3´, 서열목록 제1서열) 및 miRNA-24-1 (5´-UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU-3´, 서열목록 제2서열)에 특이적인 DNA에 형광물질인 5´-카르복시플루오레세인 포스포라미다이트 (5´-carboxyfluorescein phosphoramidite, 6-FAM)를 포함하는 프로브를, miRNA-21 (5´-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3´, 서열목록 제3서열)에 특이적인 DNA에 형광물질인 Cy-5를 포함하는 프로브를 각각 miRNA-21, miRNA-23a, miRNA-24-1와 95℃에서 5분간 변성시키고 40℃에서 15분간 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 그리고 1% 트리톤 X-100을 포함한 50 mM 트리스-아세테이트 버퍼(pH 8.0)에서 혼성화시킨 후 LIF(laser-induced fluorescence) 검출기를 갖는 CE 시스템에서 분석하였다. 도 3은 488 ㎚에서 반응하지 않은 두 개의 DNA 프로브 및 DNA-miRNA-23과 DNA-miRNA-24-1 복합체 피크를, 그리고 635 ㎚에서 반응하지 않은 DNA 프로브 및 DNA-miRNA-21 복합체 피크를 확인한 것이다. CE 시스템은 PA 800 plus CE 시스템(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)이고 LIF 검출기는 여기파장이 각각 488 ㎚ 및 635 ㎚이고 방출 파장이 520 ㎚ 및 663 ㎚인 Beckman P/ACE System Laser Module 488과 Laser Module 635를 사용하였다. 분리는 100 mM 트리스-보레이트 버퍼(pH 10.0)를 사용하여 내경이 75 ㎛이고 길이가 30 ㎝인 미코팅 모세관(Beckman Coulter)내에서 14 kV의 전압을 적용하여 수행하였다. 시료의 주입은 0.5 psi로 10 초 동안 진행되었다.

실시예 2: miRNA 의 정량성 확립

miRNA-21, miRNA-23a 및 miRNA-24-1에 특이적인 DNA에 형광물질인 6-FAM 또는 Cy-5를 포함하는 프로브와 10 pM 내지 1 nM 농도의 miRNA-21, miRNA-23a 및 miRNA-24-1를 95℃에서 5분간 변성시키고 40℃에서 15분간 TEN 혼성화 버퍼에서 혼성화 시킨 후 LIF 검출기를 갖는 CE 시스템에서 분석하였다(도 4). 분석은 실시예 1과 같은 조건에서 수행하였다. 이러한 결과로부터 miRNA와 결합된 DNA 피크의 크기가 miRNA의 농도에 따라 증가하는 직선성을 나타내며 따라서 정량 분석이 가능함을 확인 할 수 있었다.

실시예 3: 심근세포주에서의 miRNA 검출 및 확인

심근세포주(cardiomyocytes)인 H9c2(한국세포주 은행)은 DMEM 배지에 10% FBS, 1% volume 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였다. 배지는 이틀마다 교체하였고 세포를 키우는 배양기는 37℃, 5% CO₂의 조건을 유지하였다. 세포는 100 ㎜ 디쉬에 1 × 10⁶개의 세포를 배양한 후에 1 nM의 miRNA-21, miRNA-23a 및 miRNA-24-1를 첨가한 디쉬의 세포와 miRNA를 첨가 하지 않은 디쉬의 세포를 트리졸 및 트리톤 X-100을 사용하여 전체 RNA를 각각 추출하였다. 추출된 전체 RNA에 miRNA-21, miRNA-23a 및 miRNA-24-1에 특이적인 프로브를 95℃에서 5분간 변성시키고 40℃에서 15분간 0.1 mM EDTA, 50 mM NaCl 그리고 1% 트리톤 X-100을 포함한 50 mM 트리스-아세테이트 버퍼(pH 8.0)에서 혼성화 시킨 후에 결합시켜 그 복합체를 CE/dual LIF(CE/dLIF)를 이용하여 분석하였다. CE 시스템은 PA 800 plus CE 시스템(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)이고 LIF 검출기는 여기파장이 각각 488 ㎚ 및 635 ㎚이고 방출 파장이 520 ㎚ 및 663 ㎚인 Beckman P/ACE System Laser Module 488과 Laser Module 635를 사용하였다. 분리는 100 mM 트리스-보레이트 버퍼(pH 10.0)를 사용하여 내경이 75 ㎛이고 길이가 30 ㎝인 미코팅모세관(Beckman Coulter)내에서 14 kV의 전압을 적용하여 수행하였다. 시료의 주입은 0.5 psi로 10 초 동안 진행되었다. 488 ㎚와 635 ㎚의 파장에서 1nM miRNA-21, miRNA-23a 및 miRNA-24-1를 첨가한 세포의 추출물에 있어서, 488 ㎚의 파장에서는 DNA-miRNA-23a 및 DNA-miRNA-24-1 복합체 피크를, 635 ㎚의 파장에서는 DNA-miRNA-21 복합체 피크를 확인 할 수 있었다(도 5). 또한 miRNA가 첨가되지 않은 세포의 추출물에서는 488 ㎚의 파장에서는 DNA-miRNA-23a 복합체 피크를, 635 ㎚의 파장에서는 DNA-miRNA-21 복합체 피크가 검출되었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Simultaneous Detection of Multiple miRNAs using Capillary Electrophoresis with Plural Laser Induced Fluorescence <130> DP-2013-0053 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-23a <400> 1 aucacauugc cagggauuuc c 21 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-24-1 <400> 2 ugccuacuga gcugauauca gu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-21 <400> 3 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-499 <400> 4 uuaagacuug cagugauguu u 21 <210> 5 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-1 <400> 5 uggaauguaa agaagugugu au 22 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-133a <400> 6 uuuggucccc uucaaccagc ug 22 <210> 7 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-208 <400> 7 auaagacgag caaaaagc 18

Claims

다음의 단계를 포함하는 시료 내 존재하는 두 가지 이상의 miRNA의 동시 검출방법:
(a) 분석하고자 하는 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)로부터 추출한 RNA와, 상기 시료에 존재할 것으로 예상되는 두 가지 이상의 miRNA에 각각 특이적인 프로브로서 형광물질이 결합된 단일가닥 DNA를 혼성화 버퍼에서 혼성화 시키는 단계;
(c) 복수의 LIF(laser induced fluorescence) 검출기가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 DNA-miRNA 복합체를 확인하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (c)의 결과 서로 다른 파장에서 DNA-miRNA 복합체 피크를 확인하여 시료내 존재하는 두 가지 이상의 miRNA를 검출하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 시료는 세포, 혈청, 혈장, 타액, 눈물 또는 뇨인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 2 항에 있어서, 상기 세포는 심근세포(cardiomyocyte)인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 두 가지 이상의 miRNA는 miRNA-23a, miRNA-24-1, miRNA-21, miRNA-499, miRNA-1, miRNA-133a 및 miRNA-208로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 miRNA인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 4 항에 있어서, 상기 두 가지 이상의 miRNA는 서열목록 제1서열의 miRNA-23a, 서열목록 제2서열의 miRNA-24-1 및 서열목록 제3서열의 miRNA-21로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 miRNA인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine) 및 시아닌(cyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 형광물질인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 6 항에 있어서, 상기 플루오리신은 6-FAM(5´-carboxyfluorescein phosphoramidite)인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 6 항에 있어서, 상기 시아닌은 Cy3 또는 Cy5인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 복수의 LIF 검출기는 각각 다른 여기 파장 및 방출 파장 값을 갖는 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 9 항에 있어서, 상기 여기 파장 값은 400-700 ㎚인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 10 항에 있어서, 상기 여기 파장 값은 488 ㎚, 514 ㎚, 530 ㎚, 560 ㎚, 594 ㎚, 635 ㎚, 640 ㎚ 및 685 ㎚로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 값인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1 항에 있어서, 상기 복수의 LIF 검출기는 두 개의 LIF 검출기가 결합된 이중 LIF 검출기(dual LIF)인 것을 특징으로 하는 검출방법.
제 1 항에 있어서, 두 가지 이상의 miRNA의 검출은 서로 다른 형광물질이 결합된 DNA와 혼성화된 두 가지 이상의 DNA-miRNA 복합체 피크를 서로 다른 파장에서 확인하여 수행하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
(a) 두 가지 이상의 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 2 가지 이상의 프로브 및 상기 프로브에 결합 가능한 2 가지 이상의 형광물질, 또는 2 가지 이상의 형광물질이 각각 결합된 프로브로서 상기 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 2 가지 이상의 프로브; (b) 혼성화 버퍼; 및 (c) DNA-miRNA 복합체 분리용 버퍼를 포함하는, 복수의 LIF(laser induced fluorescence) 검출기가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템에 적용하기 위한 두 가지 이상의 miRNA 동시 검출용 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 형광물질은 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine) 및 시아닌(cyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 형광물질인 것을 특징으로 하는 두 가지 이상의 miRNA 동시 검출용 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 혼성화 버퍼는 트리스-아세테이트 버퍼인 것을 특징으로 하는 두 가지 이상의 miRNA 동시 검출용 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 DNA-miRNA 복합체 분리용 버퍼는 트리스-보레이트 버퍼인 것을 특징으로 하는 두 가지 이상의 miRNA 동시 검출용 키트.
제 14 항에 있어서, 상기 두 가지 이상의 miRNA는 miRNA-23a, miRNA-24-1, miRNA-21, miRNA-499, miRNA-1, miRNA-133a 및 miRNA-208로 구성된 군으로부터 선택되는 2 이상의 miRNA인 것을 특징으로 하는 두 가지 이상의 miRNA 동시 검출용 키트.