KR101880892B1

KR101880892B1 - 글리코겐 및 효모 유래 tRNA 첨가에 의한 혈중 내 miRNA의 추출 효율의 증가 방법

Info

Publication number: KR101880892B1
Application number: KR1020160158170A
Authority: KR
Inventors: 송은주; 반은미; 채동규; 유영숙
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2018-07-24
Also published as: KR20180059046A

Abstract

본 발명은 글리코겐 및 효모 유래 tRNA 첨가에 의한 혈장 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 시료 내 극소량으로 존재하는 miRNA를 빠른 시간에 정량적으로 분석이 가능하다. 또한, 본 발명의 글리코겐 및 효모 유래 tRNA를 추가한 miRNA 검출방법은 글리코켄(Glycogen) 단독, 효모 유래 tRNA 단독으로 첨가한 경우와 대비하여 최소 3배 이상 높기 때문에, 다양한 miRNA 검출하는데 효율적으로 활용될 수 있다.

Description

글리코겐 및 효모 유래 tRNA 첨가에 의한 혈중 내 miRNA의 추출 효율의 증가 방법{A Method for Enhancing Extraction Efficiency of miRNA in Blood by the Addition of Glycogen and tRNA from yeast}

본 발명은 혈장 시료 내 극소량으로 존재하는 miRNA를 검출하는 방법 및 이를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 기존의 miRNA 추출 방법에 운반체(carrier)로서 글리코겐(glycogen)과 효모 유래 tRNA를 동시에 사용하고 인큐베이션 조건을 최적화하여 miRNA를 추출하는 경우 miRNA의 추출 효율을 극대화함으로써, 다양한 질환을 확인, 판정 및 발병 기작을 규명하는데 효과적으로 활용될 수 있다.

마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)는 단일 서열로 구성된 보통 21개에서 22개의 뉴클리오티드로 구성된 매우 작은 크기의 비암호화 RNA이며, mRNA의 번역을 방해하는 과정을 통해 다른 유전자들을 조절함으로써 세포 분화, 배아 발생, 대사 조절 및 암 발생과정을 제어한다. 대략 인간 유전체는 전체 유전자의 30% 가량을 miRNA에 의해 조절되는 것으로 추정된다. miRNA는 비암호화 부분에 있는 개별 유전자의 전사를 통해 생성된다. miRNA는 핵에서 RNA 중합효소 Ⅱ에 의해 전사되는 전구물질인 pri-miRNA로부터 전사된다. 이어서 드로샤(Drosha, dsRNA-specific ribonuclease)라고 하는 핵산분해효소 Ⅲ에 의해 분해되어 헤어핀 모양의 pre-miRNA가 생성된다. pre-miRNA의 헤어핀은 보조인자로써 단백질 엑스포틴-5(exportin-5)와 Ran-GTP에 의해 세포 핵 밖으로 이동되고 리보핵산 분해효소 Ⅲ Dicer 및 TRBP(transactivation-responsive RNA binding protein)의 작용에 의해 대략 22개의 뉴클레오티드로 구성된 miRNA 이중가닥(duplex)으로 처리된다. miRNA duplex는 RICS(RNA induced silencing complexes)와 결합하여 mRNA를 분해하거나 해독과정을 차단을 통해 유전자를 조절한다.

많은 종류의 miRNA와 이에 조절되는 표적 유전자는 다양한 질환의 기작에 miRNA의 중요한 역할을 예측할 수 있다. 따라서 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 따라 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소양상을 보임으로써 miRNA를 질환의 진단 및 예측 및 예후에 이용될 수 있는 바이오마커로써 인식되고 있다. 이와 함께 miRNA를 기반으로 한 치료제 개발이 크게 증가하고 있다.

생물학적 물질 내에 miRNA는 매우 극소량 존재하며 이를 검출하기 위해 선택적이고 고감도의 분석법뿐 아니라 적절한 추출 방법이 필요하다. 현재 miRNA의 검출 방법으로는 역전사 중합효소 연쇄반응 검사가 많이 이용되고 있다. 역전사 중합효소 연쇄반응 검사의 경우 매우 뛰어난 정량 분석법이지만 비용이 비싸고 극소량 존재하는 miRNA를 분석하기 위해 증폭시키는 반응이 선행되어야 하며 이 때문에 재현성과 분석시간이 3-4시간 이상으로 매우 길다는 문제점을 갖고 있다. 따라서 역전사 중합효소 연쇄반응 검사이외의 다른 분석법들이 연구되고 있으며 그 중 모세관 전기 영동법은 정량성, 재현성, 및 분리도가 뛰어나고 무엇보다도 분석시간이 1시간 이내로 짧다는 장점으로 miRNA 검출에 이용하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다.

그러나 이 방법들은 혈중 miRNA의 농도가 매우 미량 존재하므로 정확한 분석이 어렵고 분석방법 혹은 추출법에 따라 miRNA 농도 편차가 크다는 한계가 있다. 따라서, 혈중 극미량 존재하는 miRNA 양을 정확하게 측정할 수 있도록 miRNA 추출 효율성을 극대화할 수 있는 추출방법의 개발이 요구되어 진다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

1. 미국 공개출원 제2012-0034612호(2012.02.09)

1. Niu Y, Zhang L, Qiu H, et al, Scientific report, 2015 5:15100.

본 발명자들은 혈장 내 극미량으로 존재하는 miRNA를 짧은 시간 내에 고감도로 검출할 수 있는 분석법을 확립하고자 노력하였다. 그 결과, 글리코켄 및 효모 유래 tRNA를 miRNA 운반체(carrier)로 첨가하고 이들의 농도 및 인큐베이션 조건을 최적화함에 따라 혈장 내 miRNA를 포함하는 RNA의 침전 효율성을 극대화하여 혈중 내 존재하는 miRNA를 고감도로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 글리코겐 및 효모 유래 tRNA 첨가에 의한 혈중 내 극소량으로 존재하는 miRNA의 추출 효율의 증가 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 miRNA 검출용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 글리코겐 및 효모 유래 tRNA 첨가에 의한 혈중 내 miRNA의 추출 효율을 증가시키는 방법을 제공한다:

(a) 혈장 시료 내 트리졸 시약을 넣고 원심분리한 후 상층액을 분리하는 단계;

(b) 상기 상층액에 글리코켄 및 효모 유래 tRNA를 운반체(carrier)로 첨가하고 인큐베이션하여 혈중 내 miRNA를 침전시키는 단계;

(c) 원심분리하여 침전된 miRNA 펠릿 추출물을 수득하는 단계; 및

(d) miRNA 펠릿 추출물로부터 miRNA를 검출하는 단계.

본 발명자들은 혈장 내 극미량으로 존재하는 miRNA를 짧은 시간 내에 고감도로 검출할 수 있는 분석법을 확립하고자 노력한 결과 글리코켄 및 효모 유래 tRNA을 miRNA의 침전시키기 위한 운반체(carrier)로 함께 사용하는 경우 혈장 내 극미량의 miRNA를 고감도로 검출할 수 있음을 발견하였다.

miRNA(micro RNA)는 다양한 질환을 예측하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 즉, 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 있어서 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소 확인을 통하여 miRNA를 질환의 진단 및 예후를 예측하는데 이용될 수 있는 바이오마커로써 사용할 수 있다. 하지만, 체내 miRNA는 매우 극소량 존재하며 이를 검출하기 위해 선택적이고 고감도의 분석법이 필요하다. 현재 miRNA의 검출 방법으로는 마이크로어레이와 역전사 중합효소 연쇄반응 검사가 많이 이용되고 있으나 마이크로 어레이는 많은 종류의 miRNA를 검출할 수 있다는 장점이 있으나 정량성이 크게 떨어지는 단점을 갖고 있으며, 역전사 중합효소 연쇄반응 검사의 경우 비용이 비싸고 재현성에 문제가 있으며 무엇보다 분석시간이 3-4시간 이상으로 매우 길다는 단점을 갖고 있다. 또한, RNA 추출방법으로 트리졸(Trizol)을 이용한 방법을 사용하고 있으나, miRNA의 경우 극소량 존재로 인해 miRNA의 추출량에 한계가 있다.

이에 본 발명에서는, 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 운반체(carrier)로 첨가하여 혈중 내 miRNA의 침전 효율성을 향상시킨다.

본 발명자들이 개발한 검출방법에 따르면, 혈장 내에 극소량으로 존재하는 miRNA를 단시간에 검출할 수 있다.

도 1은 혈장 내 miRNA을 정량 혹은 정성 분석하기 위해 혈장 내 miRNA를 추출하기 위한 과정을 나타낸 것이다. 이하, 본 발명을 단계별로 설명하기로 한다.

단계(a): 혈장 시료 내 트리졸 시약을 넣고 원심분리한 후 상층액을 분리

첫 번째 단계는 혈장 시료 내 트리졸 시약, 클로로폼을 넣고 원심분리한 후 상층액을 분리하는 단계이다. 트리졸 시약은 RNA/DNA/단백질 추출에 흔히 사용되는 당업계에 널리 알려져 있는 시약으로 페놀, 구아니디니움 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate) 등으로 구성되어 있다. 본 발명에서 첨가하는 트리졸 시약의 양은 목적에 따라 다양할 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎖를 포함할 수 있다.

단계(b): 글리코켄 (Glycogen) 및 효모 유래 tRNA의 첨가 및 인큐베이션

본 단계는 본 발명의 가장 큰 특징 중의 하나로, 트리졸만을 이용한 miRNA 추출방법에 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 운반체(carrier)로 첨가하고 인큐베이션하는 경우 혈중 내 miRNA를 침전 효율을 극대화 하여, 혈중 내 miRNA의 추출량을 향상시킨다. 보다 구체적으로, 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA는 알콜 침전으로부터 핵산 혹은 올리고뉴클레오타이드의 회수율을 증가시키기 위해 사용된다. 특히 글리코겐, 효모 유래 tRNA는 에탄올이나 이소프로판올에 녹지 않으며 핵산을 트랩(trap)하여 침전을 형성하는 역할을 한다. 원심 분리 후 녹지 않은 글리코겐, 효모 유래 tRNA/핵산 침전은 눈에 보이는 펠렛(pellet)을 형성하여 핵산을 회수할 수 있도록 한다.

본 발명에서는 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 이용하여 RNA 층 분리 후 이소프로판올(isopropanol)을 추가 첨가하고 침전 형성에 도움이 되는 인큐베이션 시간 및 온도를 조절하여 miRNA를 추출한다.

아울러, 본 발명에서는 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 동시에 사용하는 것이 바람직하다. 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 동시에 사용한 경우, 글리코켄(Glycogen) 단독, 효모 유래 tRNA 단독으로 사용한 경우와 대비하여, 최소 3 배 이상의 추출 효율성이 증가시킨다(도 5a 및 도 5b 참조).

본 발명이 포함하는 글리코겐의 사용량은 혈장 시료 250 ㎕에 대해 바람직하게는 10 ~ 100 ug이며, 보다 바람직하게는 25 ~ 100 ug이며, 가장 바람직하게는 25 ~ 50 ug인 것이다. 글리코겐의 사용량이 10 ug 미만이거나 100 ug를 초과하면 miRNA 추출량에 큰 차이가 없을 수 있다.

효모 유래 tRNA의 사용량은 혈장 시료 250 ㎕에 대해 바람직하게는 300 ~ 1200 ng이며, 보다 바람직하게는 450 ~ 1200 ng이며, 가장 바람직하게는 600 ~ 1200 ng인 것이다. 효모 유래 tRNA의 사용량이 300 ug 미만이거나 1200 ug를 초과하면 miRNA 추출량에 큰 차이가 없을 수 있다.

아울러, miRNA 추출량을 증가시키기 위해서는 상기 운반체인 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA의 첨가 후 인큐베이션을 수행하는 것이 바람직하며, 인큐베이션 온도는 -60 ~ -100℃ 온도 조건에서, 보다 바람직하게는 -70 ~ -80℃ 온도 조건에서, 인큐베이션 시간은 바람직하게는 30분 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 가장 바람직하게는 1시간을 수행하는 것이 좋다. 인큐베이션 시간이 30분 미만이거나 3시간을 초과하면 miRNA 추출량에 큰 차이가 없을 수 있다.

단계(c): 원심분리하여 침전된 miRNA 펠릿 추출물을 수득

상기 인큐베이션이 완료되면, 원심분리하여 miRNA가 포함된 펠릿 추출물을 수득한다. 펠렛 추출물을 수득하기 위하여 고속 또는 저속 원심분리기를 사용할 수 있다. 당업자라면 목적에 맞도록 적합한 원심분리기 및 원심분리 시간을 선정할 수 있으며, 자이로젠(Gyrozen) 원심분리기를 이용할 경우, 1,000 내지 30,000 RCF, 바람직하게는 10,000 내지 15,000 RCF로, 5분 내지 30분, 바람직하게는 10분 내지 20분 수행한다.

단계(d): miRNA 펠릿 추출물로부터 miRNA를 검출

마지막으로, 상기 miRNA 펠릿 추출물로부터 miRNA를 검출한다.

본 발명의 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA의 운반체(carrier)가 추가된 효율적인 miRNA 검출법은 추출되는 miRNA 양 자체가 글리코켄(Glycogen) 단독, 효모 유래 tRNA 단독으로 첨가한 경우와 대비하여 최소 3배 이상 높기 때문에, 당업계에 알려진 다양한 miRNA 검출법을 활용하여 이를 손쉽게 효율적으로 검출할 수 있다. 한편, 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA가 첨가되지 않은 경우 miRNA 펠릿 추출물이 나올때도 있고 안나올때도 있어 재현성에 문제가 생기기에 이들을 첨가하지 않고 실험을 진행하는 것은 한계가 있다. 이에 본 발명에서는 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 동시에 사용하는 경우에 비로소 재현성 뿐만 아니라 miRNA의 검출 효율성도 함께 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)는 다음의 단계를 포함한다: (d-1) miRNA 펠릿 추출물과 혈중 내에 존재할 것으로 예상되는 miRNA에 특이적인 형광물질이 결합된 유리 DNA를 혼성화 버퍼에서 혼성화 시키는 단계; (d-2) LIF(laser induced fluorescence) 검출기가 장착된 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템을 이용하여 DNA-miRNA 복합체를 분리 및 확인하는 단계; 및 (d-3) 상기 단계 (d-2)의 결과 DNA-miRNA 복합체 피크를 확인하여 혈중 내 miRNA의 존재를 확인하는 단계.

본 발명의 검출방법은 다양한 질환의 진단 및 예후를 예측하는데 이용될 수 있다.

형광물질 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 적합한 표지는 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia) 등 다양한 형광물질을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 6-카르복실플루오르신 (6-FAM, 6-carboxyfluorescein)을 이용할 수 있다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet,Amersham(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (버퍼 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다. 본 발명에서 이용하는 버퍼의 종류는 당업계에 이용되는 다양한 종류의 버퍼를 이용할 수 있으며, 최적의 혼성화 조건은 상기 버퍼 중 가장 혼성화 정도가 높은 버퍼를 선정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 혼성화 버퍼는 TNM 버퍼, PBS 버퍼Tris-Cl 버퍼, SSC 버퍼, HEN 버퍼 또는 TEN 버퍼 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 TEN 버퍼를 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 모세관 전기영동 시스템은 LIF(laser induced fluorescence)검출기가 장착된다(CE/LIF 시스템).

본 발명에서 상기 CE/LIF 시스템을 이용할 경우, 혼성화된 DNA-miRNA 복합체의 분리는 미코팅 모세관(uncoated capillary)을 이용하여 실시할 수 있다. 상기 모세관은 내경이 50-100 ㎛, 길이가 20-60 ㎝인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 분리용 버퍼로 트리스-보레이트(Tris-borate) 버퍼를 사용하여 상기 모세관 내에서 10-20 kV, 바람직하게는 14 kV의 전압을 적용할 경우 혼성화된 DNA-miRNA 복합체를 분리할 수 있다.

LIF 검출기의 파장은 검출하려 하는 형광물질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 형광물질로 6-카르복실플루오르신(6-FAM)를 이용할 경우 여기 파장은 바람직하게는 400-500 ㎚, 가장 바람직하게는 488 ㎚를 갖으며, 방출 파장은 바람직하게는 500-600 ㎚, 가장 바람직하게는 520 ㎚를 갖는다.

아울러, 본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)는 qRT-PCR을 이용하여 miRNA를 증폭하여 miRNA를 분석할 수도 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 miRNA를 검출하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상기 miRNA를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 혈장 내의 miRNA 검출용 키트로서, (a) 트리졸 시약; (b) 글리코켄; (c) 효모 유래 tRNA; (d) 상기 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 형광물질; (e) 혼성화 버퍼; 및 (f) DNA-miRNA 복합체 분리용 버퍼를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혼성화 버퍼는 TNM 버퍼, PBS 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC 버퍼, HEN 버퍼 및 TEN 버퍼로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 버퍼인 것이다. 더욱 바람직하게는 TEN 버퍼이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분리용 버퍼는 트리스-보레이트 버퍼인 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 형광물질은 6-카르복실플루오르신(6-FAM)인 것이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 글리코겐 및 효모 유래 tRNA에 의한 혈장 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명에 따르면, 시료 내 극소량으로 존재하는 miRNA를 빠른 시간에 정량적으로 분석이 가능하다.

(ⅲ) 또한, 본 발명의 글리코겐 및 효모 유래 tRNA을 추가한 miRNA 검출방법은 글리코겐 및 효모 유래 tRNA를 동시에 사용하고 인큐베이션 조건을 최적화함으로써 글리코켄(Glycogen) 단독, 효모 유래 tRNA 단독으로 첨가한 경우와 대비하여 약 3배 이상 높기 때문에, 다양한 miRNA 검출하는데 효율적으로 활용될 수 있다.

도 1은 혈장 내 miRNA을 정량 혹은 정성 분석하기 위해 혈장 내 miRNA를 추출하기 위한 과정을 나타낸 것이다.
도 2a는 글리코겐 단독으로 사용한 경우 글리코켄의 사용량을 달리하여 추출한 후 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA과 혼성화한 후 CE-LIF를 이용하여 검출 한 결과로, DNA-miRNA complex 피크의 크기(miRNA의 추출 효율성)가 글리코겐의 사용량이 증가함에 따라 달라지며 25 ug을 사용할 경우 최고의 감도를 보여짐을 확인한 것이다.
도 2b는 효모 유래 tRNA 단독으로 사용한 경우 효모 유래 tRNA의 사용량을 달리하여 추출한 후 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA과 혼성화한 후 CE-LIF를 이용하여 검출 한 결과로, DNA-miRNA complex 피크의 크기(miRNA의 추출 효율성)가 효모 유래 tRNA의 사용량이 증가함에 따라 달라지며 1200 ng을 사용할 경우 최고의 감도를 보여짐을 확인한 것이다.
도 3은 글리코겐과 효모 유래 tRNA를 동시에 사용한 것으로, 글리코겐 및 효모 유래 tRNA의 사용량을 달리하여 추출한 후 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA과 혼성화한 후 CE-LIF를 이용하여 검출 한 결과로, DNA-miRNA complex 피크의 크기(miRNA의 추출 효율성)가 글리코겐 및 효모 유래 tRNA의 사용량이 증가함에 따라 달라지며 글리코겐 25 ug이고, 효모 유래 tRNA 600 ng을 사용할 경우 최고의 감도를 보여짐을 확인한 것이다.
도 4는 트리졸 시약과 함께 글리코겐 20 ug과 효모 유래 tRNA 600 ng를 동시에 사용하여 RNA 층을 분리한 후 이소프로판올을 추가한 후 인큐베이션 조건에 따른 miRNA 추출 효율성을 비교한 것으로, 상온(RT)에서 10분, 80℃에서 30분, 1시간, 3시간 및 over night하여 인큐베이션한 후 miRNA를 추출하였고, 그 결과 80℃에서 1시간 정도 방치할 경우 최고의 감도를 보여짐을 확인한 것이다.
도 5a는 실시예 2에서 결정한 80℃에서 1시간에서 인큐베이션을 실행하되, 글리코겐 단독, 효모 유래 tRNA 단독, 이들의 동시 사용한 경우에 따른 miRNA의 회수율을 CE-LIF를 이용하여 확인한 결과로서, 글리코겐 25 ug, 효모 유래 tRNA 600 ng을 동시에 사용할 경우 글리코겐 단독, 효모 유래 tRNA 단독으로 사용한 경우와 대비하여 최소 3배 이상 추출 효율성이 증가함을 확인한 것이다.
도 5b는 실시예 2에서 결정한 80℃에서 1시간에서 인큐베이션을 실행하되, 글리코겐 단독, 효모 유래 tRNA 단독, 이들의 동시 사용한 경우에 따른 miRNA의 회수율을 qRT-PCR을 이용하여 확인한 결과로서, 글리코겐 25 ug, 효모 유래 tRNA 600 ng을 동시에 사용할 경우 글리코겐 단독, 효모 유래 tRNA 단독으로 사용한 경우와 대비하여 최소 3배 이상의 추출 효율성이 증가함을 확인한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 혈중 내 miRNA의 추출 효율성 증대를 위한 글리코겐(glycogen)과 효모 유래 tRNA의 최적의 양 확립

혈장 시료 250 ㎕에 miRNA 155(5´-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3´)를 첨가한 후 Trizol®시약과 운반체(carrier)로서 글리코겐(glycogen) 단독, 효모 유래 tRNA 단독, 이들을 동시에 사용하여 혈장 내 miRNA를 추출하였다.

구체적으로, miRNA 추출 시료는 CE-LIF를 사용하여 분석하였고, CE-LIF 의 경우, 추출 시료는 혼성화 용액에 녹이고 miRNA-155에 특이적인 형광물질인 6-카르복실플루오르신(6-FAM)를 포함하는 유리 DNA 프로브를 첨가시킨 후 95℃에서 5분간 변성시키고 40℃에서 15분 간 TEN buffer (50 mM Tris-Ac (pH 8.0), 10 mM EDTA, 50 mM NaCl)에서 혼성화 시킨 후 LIF detector를 갖은 CE system에서 분석하였다. CE system은 PA 800 plus CE system (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)이고 LIF 검출기는 여기와 방출 파장이 각각 488 nm 와 520 nm인 filter를 source와 filter를 사용하였다. 분리는 125 mM Tris-borate buffer (pH10.0)를 사용하여 내경이 75-μm이고 길이가 50-cm인 uncoated capillary(Beckman Coulter)내에서 14 kV의 전압을 적용하여 수행하였다.

도 2a는 글리코겐 단독으로 사용한 경우로서 글리코겐의 사용량이 증가함에 따라 달라지며 25 ug을 사용할 경우 최고의 감도를 보여짐을 확인할 수 있으며, 도 2b는 효모 유래 tRNA 단독으로 사용한 경우로서 효모 유래 tRNA의 사용량이 증가함에 따라 달라지며 1200 ng을 사용할 경우 최고의 감도를 보여짐을 확인할 수 있었다.

그러나, 도 3의 결과를 보면 글리코겐과 효모 유래 tRNA를 동시에 사용한 경우 도 2에서 단독으로 사용한 경우와 대비하여 최소 3배 이상의 추출 효율성을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다. 특히, 글리코겐 25 ug이고, 효모 유래 tRNA 600 ng을 사용할 경우 최고의 감도를 보였다.

실시예 2: 혈중 miRNA 추출에 효과적인 최적의 인큐베이션 시간 및 온도 확 립

혈장 시료 250 ㎕에 miRNA 155를 투여한 후 Trizol®시약과 글리코겐(glycogen)과 효모 유래 tRNA를 동시에 사용하여 RNA를 포함한 용액을 분리한 후 이소프로판올(isopropanol)을 추가한 후 인큐베이션 온도 및 시간을 달리하여 miRNA를 추출 하였다. 추출 시료는 CE-LIF을 사용하여 분석하였고, 실시예 1과 같은 조건에서 수행하였다.

이러한 결과인 도 4를 보면, miRNA의 추출 효율이 인큐베이션 조건에 따라 달라짐을 확인할 수 있었고 80℃에서 1시간 정도 방치할 경우 miRNA와 결합된 DNA 피크의 크기가 가장 높음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 혈장 중 miRNA의 추출 회수율을 CE- LIF를 사용하여 확인

혈장 시료 250 ㎕에 miRNA-155를 첨가한 후 RNA 혹은 miRNA의 추출을 위해 사용되는 시판하는 Trizol®시약과 글리코겐(glycogen) 단독, 효모 유래 tRNA 단독, 이들을 동시에 사용하여 RNA를 포함한 용액을 분리한 후 이소프로판올(isopropanol)을 추가한 후 1 시간 동안 80℃에서 인큐베이션(incubation)한 후 펠렛(pellet)의 형태로 miRNA를 포함한 total RNA를 추출하였다. CE-LIF를 사용하여 분석하기 위해서 추출된 total RNA에 miRNA-155에 특이적인 형광물질인 6-FAM를 포함하는 DNA 프로브를 사용하여 혼성화 시킨 후에 결합시켜 그 복합체를 실시예 1과 동일한 방법으로 CE/LIF를 이용하여 분석하였다.

도 5a는 글리코겐 단독, 효모 유래 tRNA 단독, 이들의 동시 사용한 경우에 따른 miRNA의 회수율을 CE-LIF를 이용하여 확인한 결과로서, 글리코겐 25 ug, 효모 유래 tRNA 600 ng을 동시에 사용할 경우 글리코겐 단독, 효모 유래 tRNA 단독으로 사용한 경우와 대비하여 최소 3배 이상 추출 효율성이 증가함을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 혈장 중 miRNA의 추출 회수율을 qRT - PCR를 사용하여 확인

혈장 시료 250 ㎕에 miRNA-155를 첨가한 후 RNA 혹은 miRNA의 추출을 위해 사용되는 시판하는 Trizol®시약과 글리코겐(glycogen) 단독, 효모 유래 tRNA 단독, 이들을 동시에 사용하여 RNA를 포함한 용액을 분리한 후 이소프로판올(isopropanol)을 추가한 후 1 시간 동안 80℃에서 인큐베이션(incubation)한 후 펠렛(pellet)의 형태로 miRNA를 포함한 total RNA를 추출하였다. qRT-PCR를 사용하여 분석하기 위해서total RNA 시료를 Mir-X miRNA First-strand Synthesis Kit(Takara, Dalian, China)을 이용하여 miRNA 155의 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 SYBR®Green Real-time PCR Master Mix와 miRNA 155의 forward primer (5′-TTAATGCTAATCGUGATAGGGGT-3′)와 universal reverse primer를 넣고, quantitative real-time PCR (Bio-Rad, USA)을 이용하여 miRNA 155의 발현을 분석하였다.

도 5b는 글리코겐 단독, 효모 유래 tRNA 단독, 이들의 동시 사용한 경우에 따른 miRNA의 회수율을 qRT-PCR을 이용하여 확인한 결과로서, 글리코겐 25 ug, 효모 유래 tRNA 600 ng을 동시에 사용할 경우 글리코겐 단독, 효모 유래 tRNA 단독으로 사용한 경우와 대비하여 최소 3배 이상의 추출 효율성이 증가함을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Institute of Science & Technology <120> A Method for Enhancing Extraction Efficiency of miRNA in Blood by the Addition of Glycogen and tRNA from yeast <130> DP-2016-0688 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA155 <400> 1 uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23

Claims

다음의 단계를 포함하는 글리코겐 및 효모 유래 tRNA 첨가에 의한 혈중 내 존재하는 miRNA의 추출 효율을 증가시키는 방법:
(a) 혈장 시료 내 트리졸 시약을 넣고 원심분리한 후 상층액을 분리하는 단계;
(b) 상기 상층액에 글리코켄(Glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 운반체(carrier)로 첨가하고 인큐베이션하여 혈중 내 miRNA를 침전시키는 단계;
(c) 원심분리하여 침전된 miRNA 펠릿 추출물을 수득하는 단계; 및
(d) miRNA 펠릿 추출물로부터 miRNA를 검출하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 글리코겐의 농도는 혈장 시료 250 ㎕에 대해 10 ~ 100 ug이고, 효모 유래 tRNA는 300 ~ 1200 ng인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 인큐베이션은 -60 ~ -100℃에서 30분 ~ 3시간인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(d-1) miRNA 펠릿 추출물과 혈중 내에 존재할 것으로 예상되는 miRNA에 특이적인 형광물질이 결합된 유리 DNA를 혼성화 버퍼에서 혼성화 시키는 단계;
(d-2) LIF(laser induced fluorescence) 검출기가 장착된 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템을 이용하여 DNA-miRNA 복합체를 분리 및 확인하는 단계; 및
(d-3) 상기 단계 (d-2)의 결과 DNA-miRNA 복합체 피크를 확인하여 혈중 내 miRNA의 존재를 확인하는 단계.
제 4 항에 있어서, 상기 LIF 검출기는 여기 파장이 400-500 ㎚이고 방출 파장이 500-600 ㎚인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 DNA-miRNA 복합체의 분리는 미코팅 모세관(uncoated capillary)을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 미코팅 모세관은 내경이 50-100 ㎛이고 길이가 20-60 ㎝인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 분리는 트리스-보레이트 버퍼를 사용하여 미코팅 모세관 내에서 10-20kV의 전압을 적용하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
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