KR101783637B1 - 형광검출기를 포함한 모세관 전기영동법을 이용한 miRNA 저해제의 효능 평가 방법 - Google Patents

형광검출기를 포함한 모세관 전기영동법을 이용한 miRNA 저해제의 효능 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 miRNA 저해제에 의한 miRNA 발현양의 변화를, 형광을 띈 DNA 프로브와 세포 내 존재하는 miRNA와의 혼성화(hybridization)시켜 형광검출기가 창착된 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템을 이용하여 miRNA 발현양을 측정하되, 특히 DNA 프로브의 농도를 miRNA 저해제에 의해 방해를 받지 않는 농도로 최적화 하여 사용함으로써, miRNA 발현양을 정확하게 측정할 수 있어 다양한 질환을 확인, 판정 및 발명 기작을 규명하는데 유용하다.

Description

형광검출기를 포함한 모세관 전기영동법을 이용한 miRNA 저해제의 효능 평가 방법{Evaluation of anti-miRNA oligonucleotide efficiency using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence}
본 발명은 형광검출기가 포함된 모세관 전기영동 시스템을 이용하여miRNA 저해제의 효능 평가 방법에 관한 것으로, 구체적으로 miRNA 저해제에 의한 miRNA 발현양의 변화를, 형광을 띈 DNA 프로브와 세포 내 존재하는 miRNA와의 혼성화(hybridization)시켜 형광검출기가 창착된 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템을 이용하여 miRNA 발현양을 측정하되, 특히 DNA 프로브의 농도를 miRNA 저해제에 의해 방해를 받지 않는 농도로 최적화 하여 사용함으로써, miRNA 발현양을 정확하게 측정할 수 있어 다양한 질환을 확인, 판정 및 발명 기작을 규명하는 유용하다.
micro RNA(miRNA)는 단일 서열로 구성된 보통 21개에서 22개의 뉴클리오티드로 구성된 매우 작은 크기의 비암호화 RNA이며, mRNA의 번역을 방해하는 과정을 통해 다른 유전자들을 조절함으로써 세포 분화, 배아 발생, 대사 조절 및 암 발생과정을 제어한다. 대략 인간 유전체는 전체 유전자의 30% 가량을 miRNA에 의해 조절되는 것으로 추정된다. miRNA는 비암호화 부분에 있는 개별 유전자의 전사를 통해 생성된다. miRNA는 핵에서 RNA 중합효소 II 에 의해 전사되는 전구물질인 pri-miRNA로부터 전사된다. 이어서 Drosa라고 하는 핵산분해효소 II에 의해 분해되어 헤어핀 모양의 pre-miRNA가 생성된다. pre-miRNA의 헤어핀은 보조인자로써 protein exportin-5와 Ran-GTP에 의해 세포 핵 밖으로 이동되고 리보핵산 분해효소 II Dicer 및 transactivation-responsive RNA binding protein(TRBP)의 작용에 의해 대략 22개의 뉴클레오티드로 구성된 miRNA duplex로 처리된다. miRNA duplex는 RNA induced silencing complexes(RICS)와 결합하여 mRNA를 분해하거나 해독과정을 차단을 통해 유전자를 조절한다.
많은 종류의 miRNA와 이에 조절되는 표적 유전자는 다양한 질환의 기작에 miRNA의 중요한 역할을 예측 할 수 있다. 따라서 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 따라 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소양상을 보임으로써 miRNA를 질환의 진단 및 예측 및 예후에 이용될 수 있는 바이오마커로써 인식되고 있다. 이와 함께 miRNA를 기반으로 한 치료제 개발이 크게 증가하고 있다.
따라서 miRNA 저해제를 이용한 치료제 개발 및 질환의 바이오마커로써 miRNA의 기능 연구가 매우 활발히 진행되고 있다.
현재 다양한 치환기가 붙은 miRNA 저해제가 합성되고 있고 합성된 치환기의 종류에 따라 그 효율성이 크게 달라진다. 따라서 miRNA 저해제를 이용하여 miRNA 기능 연구의 정확성을 향상을 위해 miRNA 저해제의 정확한 평가가 선행되어야 한다.
현재 miRNA 저해제의 평가 방법으로서 역전사 중합효소 연쇄반응 및 northern blotting과 같은 miRNA와 프로브간의 혼성화(hybridization)에 의한 miRNA 저해제에 의한 miRNA 발현양의 변화를 측정하는 방법이 많이 이용되고 있으나, 아직까지 혼성화(hybridization) 시 세포에 남아 있는 miRNA 저해제에 의해 miRNA의 검출이 방해되어, miRNA 저해제에 의한 miRNA 발현양의 정확하게 평가하는 것은 한계가 있다.
관련하여, 미국 공개특허 제2010-240058호는 peptide nucleic acids (PNAS)를 통해 정확한 miRNA 저해제의 평가방법을 제안하고 있고, Scott Davis(Scott Davis et al., Nucleic Acids Research, 2009, 37, 70-77)는 일반적인 miRNA 저해제의 평가방법인 northern blotting 방법을 사용하되, 다양한 종류의 miRNA 저해제에 의한 miRNA 발현양의 정확한 측정을 위해 miRNA 저해제에 강한 결합을 하는 peptide nucleic acid를 사용함으로써 miRNA 저해제의 방해 없이 miRNA 발현양의 정확한 측정이 가능하도록 하였다. 그러나 miRNA 저해제의 방해로 여전히 miRNA 발현양을 정확하게 측정하는데 한계가 있다.
이에 본 발명자들은 miRNA 저해제에 의한 miRNA 발현양의 변화를, 형광을 띈 DNA 프로브와 세포 내 존재하는 miRNA와의 혼성화(hybridization)시켜 형광검출기가 창착된 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템을 이용하여 miRNA 발현양을 측정하되, 상기 DNA 프로브의 농도를 miRNA 저해제에 의해 방해를 받지 않는 농도로 최적화 하여 사용함으로써, miRNA 저해제에 의한 miRNA 발현양의 변화를 정확히 평가하는 방법을 수립하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 발명자들은 miRNA 저해제의 정확한 효능 평가법을 확립하고자 노력하였다. 그 결과 LIF(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하되, miRNA와 특이적으로 결합하는 DNA 프로브의 농도를 조절함으로써, miRNA 저해제를 처리한 세포에서 발현된 miRNA와 세포 내 남아 있는 miRNA 저해제가 결합하지 않고 miRNA와 DNA 프로브와 상보적으로 결합함으로써, miRNA 발현양을 정확하게 측정함에 따라, miRNA 저해제의 효능을 정확하게 평가할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 신뢰성이 높은 miRNA 저해제(anti-miRNA oligonucleotide)의 효능 평가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는miRNA 저해제(anti-miRNA oligonucleotide)의 효능 평가 방법을 제공한다:
(a) miRNA 및 miRNA 저해제가 포함된 시료에 상기 miRNA와 특이적인 프로브로서 형광물질이 결합한 단일가닥 DNA를 농도를 달리하여 첨가하여 혼성화(hybridization) 하는 단계;
(b) LIF(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 DNA 프로브(probe) 농도에 따른 miRNA 검출량의 변화를 확인하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 결과로부터 miRNA의 검출량이 일정해지기 시작하는 시점의 DNA 프로브의 농도 값을 확인함으로써, miRNA 저해제로부터 방해 없이 miRNA의 검출이 가능한 DNA 프로브(probe)의 농도 값으로 설정하는 단계;
(d) 시료에 효능을 평가하고자 하는 miRNA 저해제를 농도별로 처리하고, 상기 시료로부터 miRNA를 추출하여 상기 (c) 단계에서 설정한 농도만큼 DNA 프로브(probe)를 사용하여 혼성화(hybridization) 시키는 단계; 및
(e) LIF(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 miRNA 저해제의 농도에 따른 miRNA 검출량의 변화를 확인함으로써 miRNA 저해제의 효능을 평가하는 단계.
본 발명의 miRNA 저해제의 효능 평가 방법은 다양한 질환의 바이오마커 후보물질인 miRNA의 기능 연구, 및 miRNA를 조절을 통한 질환의 치료제로 이용하기 위해 개발된 miRNA 저해제의 효능을 연구하는데 이용될 수 있으며, 바람직하게는 폐암을 연구하는데 이용할 수 있다.
시료 내에서 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 트리졸(trizol) 또는 트리톤 X-100을 이용하여 추출할 수 있다.
아울러 상기 시료는 세포, 혈청, 혈장, 타액, 눈물 또는 뇨이며 반드시 이에 제한되지 않는다. 세포의 경우, 대표적으로 폐암 상피 세포가 이용될 수 있다. 폐암 질환의 바이오마커는 당업계에 다양한 miRNA들이 공지되어 있는데, 본 발명에서는 서열목록 제1서열의 miRAN-23a가 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대의 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 miRNA를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 본 발명에 따른 평가 방법에서 상기 언급한 miRNA-23을 이용할 경우, 서열목록 제2서열의 DNA 프로브(miRNA-23 ssDNA probe)를 이용할 수 있다.
프로브의 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 적합한 표지는 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia) 등 다양한 형광물질을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 6-카르복시플루오리신을 이용할 수 있다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, “Amersham”(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(버퍼 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다. 본 발명에서 이용하는 버퍼의 종류는 당업계에 이용되는 다양한 종류의 버퍼를 이용할 수 있으며, 최적의 혼성화 조건은 상기 버퍼 중 가장 혼성화 정도가 높은 버퍼를 선정할 수 있다.
또한 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 모세관 전기영동 시스템은 LIF(laser induced fluorescence)검출기가 장착된다(CE/LIF 시스템).
본 발명에서 상기 CE/LIF 시스템을 이용할 경우, 혼성화된 DNA-miRNA 복합체의 분리는 미코팅 모세관(uncoated capillary)을 이용하여 실시 할 수 있다. 상기 모세관은 내경이 50-100 ㎛, 길이가 20-60 ㎝인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 분리용 버퍼로 트리스-보레이트(Tris-borate) 버퍼를 사용하여 상기 모세관 내에서 10-20 kV, 바람직하게는 14 kV의 전압을 적용할 경우 혼성화된 DNA-miRNA 복합체를 분리할 수 있다.
LIF 검출기의 파장은 검출하려 하는 형광물질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 형광물질로 6-카르복시플루오리신을 이용할 경우 여기 파장은 바람직하게는 400-500 ㎚, 가장 바람직하게는 488 ㎚를 갖으며, 방출 파장은 바람직하게는 500-600 ㎚, 가장 바람직하게는 520 ㎚를 갖는다.
아울러, 본 발명은 상기 (d) 단계에서 사용한 miRNA 저해제의 효능을 기존의 평가법인 루시퍼라제 분석법(luciferase assay)을 통해 평가하고, 이를 (e) 단계의 결과와 비교함으로써 본 발명에 따른 효능 평가 방법의 신뢰성을 재확인하는 단계((f) 단계)를 추가적으로 더 포함할 수 있다.
이때 루시퍼라제(luciferase) 분석은 Dual-luciferase Assay System (Promega)를 사용하여 수행할 수 있으며, 측정된 Firefly luciferase activity는 Renilla luciferase activity로 표준화할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.
(ⅰ) 본 발명은 형광을 띈 DNA 프로브와 타켓 miRNA를 혼성화(hybridization)시켜 이를 형광검출기가 창착된 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템을 이용하여 miRNA 발현양을 측정하되, DNA 프로브의 농도를 miRNA 저해제에 의해 방해를 받지 않는 농도로 최적화 하여 사용함으로써, miRNA 저해제에 의한 miRNA 발현양의 변화를 정확하게 측정할 수 있다.
다시 말해 본 발명은 miRNA 저해제에 의해 저해되는 miRNA의 양을 직접적으로 정량할 수 있으며, miRNA 저해제(AMO)가 존재할 때에도 miRNA 저해제(AMO)에 의한 방해(interference)없이 miRNA를 정확하게 정량할 수 있는 장점이 있다.
(ⅱ) 이로서 본 발명으로부터 선별된 miRNA 저해제는 질환과 관련하여 miRNA의 기작을 규명함과 동시에 miRNA를 기반으로 한 효과적인 치료제 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 실시예 1의 결과로서, miRNA와 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA 프로브와 혼성화(hybridization)한 후 LIF(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템(CE-LIF)을 이용하여 검출하였을 때, DNA-miRNA complex 피크의 크기가 miRNA 저해제가 있는 경우 뚜렷이 작아짐을 통해 CE-LIF를 miRNA 저해제의 영향 평가 수단으로 사용할 수 있음을 확인한 것이다.
도 2a는 실시예 2의 결과로서, 1 nM miRNA와 DNA 프로브와의 혼성화(hybridization)에서 1 nM miRNA 저해제가 존재할 경우 DNA 프로브의 농도에 따라 DNA-miRNA complex 피크의 크기가 달라지며, 5 nM 이상의 DNA 프로브를 사용할 경우 DNA 프로브의 농도에 따른 DNA-miRNA complex 피크의 크기의 변화 없이 일정함을 확인함으로써 사용한 DNA 농도에서 miRNA 저해제의 방해없이 발현된 miRNA를 측정할 수 있음을 확인한 것이다.
도 2b는 실시예 2의 결과인 도 2a에 의해 결정한 농도 5 nM의 DNA 프로브를 사용할 경우 miRNA 저해제의 농도에 따라 DNA-miRNA complex 피크의 크기가 달라짐을 보여주는 결과로서, 도 2a에서 사용한 miRNA 저해제의 농도(1 nM)에서는 도 2a의 결과처럼 miRNA의 intensity가 miRNA 저해제가 존재하지 않을 때와 비교해서 변화 없음을 통해, miRNA 저해제의 방해 없이 miRNA의 검출이 가능함을 확인한 것이다.
도 3은 실시예 3의 결과로서, 폐암 상피 세포주에 miRNA 저해제를 주입 한 후 트리졸(trizol)을 사용하여 miRNA를 추출한 후 miRNA와 DNA 프로브와의 혼성화(hybridization)에서 DNA 프로브의 농도에 따라 miRNA intensity가 점차 감소하다가 5 nM 이상의 DNA 프로브를 사용할 경우 DNA 프로브의 농도에 따른 miRNA intensity가 일정함을 확인한 것이다.
도 4a는 실시예 4의 결과로서, 페암 상피 세포주에 두 개의 다른 종류의 miRNA 저해제(2OMe-ZEN, 2OMe-PS miRNA 저해제)를 주입한 후 트리졸(trizol)을 사용하여 miRNA를 추출한 후 실시예 2(도 2a)에서 결정한 DNA 프로브 농도를 사용하여 miRNA와 혼성화(hybridization)에서 miRNA 저해제의 종류에 따라 miRNA 의 저해되는 정도가 다름을 보여준다. 이 경우 2OMe-ZEN 및 2OMe-PS miRNA 저해제를 사용할 경우 각각 20 nM 과 5 nM 에서 뚜렷한 miRNA의 발생을 저해시킴을 확인할 수 있다.
도 4b는 CE-LIF 방법에 의한 miRNA 저해제 효능 평가 방법의 신뢰성을 확인하기 위해(도 4a), 루시퍼라제 분석법(luciferase assay)을 사용하여 2OMe-ZEN 및 2OMe-PS miRNA 저해제를 평가한 결과이다. 도 4A의 결과와 같이, 20 nM의 2OMe-ZEN 및 5 nM의 2OMe-PS miRNA 저해제를 사용할 경우 뚜렷한 miRNA 저해능을 나타냄을 확인할 수 있으며, 이로서 DNA 프로브의 농도를 최적화하여 CE-LIF 방법을 이용한 miRNA 저해제 효능 평가 방법은 신뢰성이 있는 miRNA 저해제의 효능 평가 방법임을 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: CE- LIF 방법을 이용한 miRNA 저해제의 효능(potency) 평가
본 발명자는 여러 가지 질환 중 폐암의 바이오마커로서 miRNA-23a(5'-AUC ACA UUG CCA GGG AUU UCC-3', 서열목록 제1서열)를 본 실험에 이용하였다. 아울러 miRNA-23a에 특이적인 형광물질인 5´-carboxyfluorescein phosphoramidite (6-FAM)를 포함하는 DNA 프로브로서 서열목록 제2서열(5'-GGA AAT CCC TGG CAA TGT GAT-3')를 이용하였다.
페암 상피 세포주인 A549(한국세포주 은행)에 AMO-miRNA-23a를 투하지 않은 것을 대조군으로 하고 AMO-miRNA-23a를 투여한 것을 실험군으로 하였으며, 이들 각 세포에서 miRNA를 추출하고 상기 DNA 프로브와 혼성화 한 후 LIF(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis. CE) 시스템을 이용하여 분석하였다. 이때 CE system은 PA 800 plus CE system (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)이고 LIF 검출기는 여기와 방출 파장이 각각 488 nm 와 520 nm인 filter를 source와 filter를 사용하였다. 분리는 100 mM Tris-borate buffer (pH10.0)를 사용하여 내경이 75 μm이고 길이가 30 cm인 uncoated capillary(Beckman Coulter)내에서 16 kV의 전압을 적용하여 수행하였다. 시료의 주입은 0.5 psi로 5 초 동안 진행되었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, AMO-miRNA-23a가 있는 경우 DNA-miRNA complex 피크의 크기가 뚜렷이 작아짐을 통해, CE-LIF 방법을 miRNA 저해제의 영향 평가 수단으로 사용할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2: 정확한 miRNA 저해제의 효능 평가를 위한 최적의 DNA 프로브 농도 확립
1 nM miRNA-23a 및 1 nM miRNA-23a 저해제를 포함하고 있는 혼성(hybridization) 용액에 miRNA-23a에 특이적인 형광물질인 5´-carboxyfluorescein phosphoramidite(6-FAM)를 포함하는 DNA 프로브의 농도를 달리하여 첨가시킨 후 95℃에서 5분간 변성시키고 40℃에서 15분 간 TEN buffer(50 mM Tris-Ac (pH 8.0), 10 mM EDTA, 50 mM NaCl)에서 hybridization 시킨 후 LIF detector를 갖은 CE system에서 분석하였다.
이때 CE system은 PA 800 plus CE system (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)이고 LIF 검출기는 여기와 방출 파장이 각각 488 nm 와 520 nm인 filter를 source와 filter를 사용하였다. 분리는 100 mM Tris-borate buffer(pH 10.0)를 사용하여 내경이 75 μm이고 길이가 30 cm인 uncoated capillary(Beckman Coulter)내에서 16 kV의 전압을 적용하여 수행하였다. 시료의 주입은 0.5 psi로 5 초 동안 진행되었다.
도 2a는 miRNA-23a 피크의 크기가 0.1 - 100 nM DNA 프로브의 농도에 따라 크게 달라짐을 확인 할 수 있었고, 5 nM 이상의 DNA 프로브를 사용할 때 DNA 프로브와 결합된 miRNA와 결합된 DNA 피크의 변화가 없음을 확인 할 수 있었다. 특히, miRNA 저해제(AMO)를 처리하고 CE-LIF 방법에 의한 miRNA 발현양을 측정(detection)을 위해 miRNA와 DNA 프로브와 혼성(hybridization)시 miRNA 저해제에 의해 방해를 받는데, 이는 miRNA 저해제 역시 타켓 miRNA와 상보적인 결합이 가능하기에 DNA 프로브와 경쟁하기 때문이며, 이러한 miRNA 저해제에 의해 방해를 제한하기 위해 DNA 프로브의 최적 농도를 확립하는 것은 본 발명에서 매우 중요한 의미를 갖는다.
따라서 본 발명에서는 miRNA 저해제 효능(AMO Potency)의 정확한 평가를 위해, miRNA 저해제를 방해를 받지 않을 수 있는 DNA 프로브 농도로서 5 nM을 사용하는 것이 가장 바람직함을 규명하였다.
실시예 3: miRNA 저해제를 투여한 세포주로부터 최적의 DNA 프로브 농도 확 립
페암 상피 세포주인 A549(한국세포주 은행)에 miRNA 저해제(AMO-miRNA-23a)를 투여한 후 일반적으로 RNA 혹은 miRNA의 추출방법인 시판하는 Trizol시약을 사용하여 miRNA를 추출하였다. 추출물에 miRNA-23a에 특이적인 DNA 프로브를 농도를 달리하여 첨가하였다. 이때 DNA 프로브와의 혼성(hybridization)과 분석은 실시예 2와 동일한 조건에서 수행하였다.
도 3은 miRNA와 결합된 DNA 피크의 크기가 DNA 프로브 농도에 따라 달라짐을 확인할 수 있고, 5 nM 이상의 DNA 프로브를 사용할 때 miRNA와 결합된 DNA 피크의 변화가 없음을 확인할 수 있다. 따라서 miRNA 저해제 효능(AMO Potency)의 정확한 평가를 위해서는, 실시예 2의 결과와 동일하게 miRNA와 DNA 프로브와 혼성 시 miRNA 저해제로부터 방해를 받지 않도록 5 nM의 DNA 프로브 농도를 사용하여야 함을 확인할 수 있다.
실시예 4: 최적화된 DNA 프로브 농도 및 CE- LIF 방법을 이용한 두 종류의 miRNA 저해제의 효능 평가 및 기존의 평가 방법과의 비교
폐암 상피 세포주인 A549(한국세포주 은행)에 하기 표 1의 miRNA 저해제(2OMe-PS, 2OMe-ZEN miRNA 저해제)를 각각 주입한 후, RPMI 배지에 10% FBS, 1% volume penicillin-streptomycin을 첨가하여 사용하였다. 배지는 이틀 마다 교체하였고 세포를 키우는 배양기는 37 ℃, 5% CO2의 조건을 유지하였다. 세포는 100 mm 디쉬에 1 × 106개의 세포를 배양한 후에 디쉬의 세포를 trizol을 첨가한 후 total RNA를 추출하였다.
miRNA 저해제(AMO) Sequence
2'OMe-PS 5'-G*G*AAATCCCTGGCAATG*T*G*A*T-3'
2'OMe-ZEN 5'-GzGAAATCCCTGGCAATGTGAz-3'
*“z”-ZEN; “*”-PS linkage
추출된 total RNA에 miRNA-23a에 특이적인 DNA 프로브를 추가한 후, DNA hybridization과 분석은 실시예 2와 동일한 조건에서 수행하여 miRNA의 발현양을 측정하여 도 4a에 나타냈다. 도 4a는 miRNA 저해제의 종류에 따라 miRNA의 저해되는 정도가 다름을 보여준다. 2OMe-ZEN miRNA 저해제를 사용할 경우 20 nM, 2OMe-PS miRNA 저해제를 사용할 경우 5 nM에서 뚜렷한 miRNA의 발생을 저해시킴을 확인할 수 있었다.
다음으로 종래의 평가법인 루시퍼라제 분석법(luciferase assay)을 이용하여 miRNA 저해제의 효능을 평가하였다. 구체적으로, 제한효소 인식부위인 PmeⅠ와 XbaⅠ사이에 miRNA-23a의 상보적인 서열을 삽입한 pmirGLO Dual-luciferase vector를 이용하여 진행하였다. 96 well plate에 A549 세포를 5 × 10개로 분주한 후, 5 nM의 miRNA-23a mimic을 Lipofectamine 2000으로 transfection 한 후 24 시간 동안 배양하였다. 그리고 2-40 nM의 miRNA-23a AMO와 miRNA-23a의 상보적인 서열이 삽입된 200 ng의 pmirGLO dual-luciferase vector를 Lipofectamine 2000을 이용하여 동시에 transfection 하였다. 이틀 간 37 ℃, 5% CO2의 조건의 배양기에서 배양한 후에 Firefly(luc2)와 Renilla(hRluc)의 활성을 Dual-Glo luciferase assay system(Promega)을 이용하여 측정하였다. 측정된 firefly luciferase activity는 renilla luciferase activity로 정규화 하여, 그 결과를 도 4b에 나타냈다. 도 4a의 결과와 같이, 도 4b에서도 20 nM의 2OMe-ZEN 및 5 nM의 2OMe-PS miRNA 저해제를 사용할 경우 뚜렷한 miRNA 저해능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
이로서 최적화된 DNA 프로브 농도 조건 하에서 CE-LIF 방법에 의한 miRNA 저해제 효능 평가 방법은 신뢰성이 있는 miRNA 저해제의 효능 평가 방법임을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 miRNA 저해제 효능 평가 방법은 miRNA 저해제에 의해 저해되는 miRNA의 양을 직접적으로 정량할 수 있으며, miRNA 저해제(AMO)가 존재할 때에도 miRNA 저해제(AMO)에 의한 방해(interference)없이 miRNA를 정확하게 정량할 수 있어 신뢰성이 우수한 miRNA 저해제 효능 평가 방법이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Institute of Science & Technology <120> evaluation of anti-miRNA oligonucleotide efficiency using capillary electrophoresis with laser-induce fluorescence <130> DP-2015-0566 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-23a <400> 1 aucacauugc cagggauuuc c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-23a ssDNA probe <400> 2 ggaaatccct ggcaatgtga t 21

Claims (9)

  1. 다음 단계를 포함하는 miRNA 저해제(anti-miRNA oligonucleotide)의 효능 평가 방법:
    (a) 서열목록 제1서열의 miRNA 및 이의 miRNA 저해제가 포함된 시료에 상기 miRNA와 특이적인 서열목록 제2서열의 프로브로서 형광물질이 결합한 단일가닥 DNA를 농도를 달리하여 첨가하여 혼성화(hybridization) 하는 단계;
    (b) LIF(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 DNA 프로브(probe) 농도에 따른 miRNA 검출량의 변화를 확인하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 결과로부터 miRNA의 검출량이 일정해지기 시작하는 시점의 DNA 프로브의 농도 값을 확인함으로써, miRNA 저해제로부터 방해 없이 miRNA의 검출이 가능한 DNA 프로브(probe)의 농도 값으로 5 nM을 설정하는 단계;
    (d) 시료에 효능을 평가하고자 하는 2'-O-메틸-포스포로티오에이트(2’-O-methyl-phosphorothioate) 또는 2'-O-메틸-젠(2’-O-methyl-Zen)인 miRNA 저해제를 농도별로 처리하고, 상기 시료로부터 miRNA를 추출하여 상기 (c) 단계에서 설정한 농도만큼 DNA 프로브(probe)를 사용하여 혼성화(hybridization) 시키는 단계;
    (e) LIF(laser induced fluorescence)가 장착된 모세관 전기영동(capillary electrophoresis) 시스템을 이용하여 miRNA 저해제의 농도에 따른 miRNA 검출량의 변화를 확인함으로써 miRNA 저해제의 효능을 평가하는 단계; 및
    (f) 상기 (d) 단계에서 사용한 miRNA 저해제의 효능을 루시퍼라제 분석법(luciferase assay)을 통해 평가하고 이를 (e) 단계의 결과와 비교하여 신뢰성을 재확인하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 세포, 혈청, 혈장, 타액, 눈물 또는 뇨인 것을 특징으로 하는 효능 평가 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 세포는 폐암 상피 세포인 것을 특징으로 하는 효능 평가 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 형광물질은 6-카르복시플루오리신인 것을 특징으로 하는 효과 평가 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
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