KR20140094905A - 트리톤 Ｘ－100 첨가에 의한 세포 내 ｍｉＲＮＡ의 추출 효율의 증가 방법 - Google Patents

트리톤 Ｘ－100 첨가에 의한 세포 내 ｍｉＲＮＡ의 추출 효율의 증가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트리톤(Triton) X-100 첨가에 의한 세포 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 시료 내 극소량으로 존재하는 miRNA를 빠른 시간에 정량적으로 분석이 가능하다. 또한, 본 발명의 트리톤(Triton) X-100을 추가한 miRNA 검출방법은 트리졸 시약만을 이용하였을 경우와 비교하여 약 2배 이상 검출 효율을 증가시킬 수 있다.

Description

트리톤 Ｘ－100 첨가에 의한 세포 내 ｍｉＲＮＡ의 추출 효율의 증가 방법 {A Method for Enhancing Extraction Efficiency of miRNA from Cells by the Addition of Triton X-100}
본 발명은 시료 내 극소량으로 존재하는 miRNA를 검출하는 방법 및 이를 검출하기 위한 키트에 관한 것이다.
마이크로 RNA(micro RNA, miRNA)는 단일 서열로 구성된 보통 21개에서 22개의 뉴클리오티드로 구성된 매우 작은 크기의 비암호화 RNA이며, mRNA의 번역을 방해하는 과정을 통해 다른 유전자들을 조절함으로써 세포 분화, 배아 발생, 대사 조절 및 암 발생과정을 제어한다. 대략 인간 유전체는 전체 유전자의 30% 가량을 miRNA에 의해 조절되는 것으로 추정된다. miRNA는 비암호화 부분에 있는 개별 유전자의 전사를 통해 생성된다. miRNA는 핵에서 RNA 중합효소 Ⅱ에 의해 전사되는 전구물질인 pri-miRNA로부터 전사된다. 이어서 드로샤(Drosha, dsRNA-specific ribonuclease)라고 하는 핵산분해효소 Ⅲ에 의해 분해되어 헤어핀 모양의 pre-miRNA가 생성된다. pre-miRNA의 헤어핀은 보조인자로써 단백질 엑스포틴-5(exportin-5)와 Ran-GTP에 의해 세포 핵 밖으로 이동되고 리보핵산 분해효소 Ⅲ Dicer 및 TRBP(transactivation-responsive RNA binding protein)의 작용에 의해 대략 22개의 뉴클레오티드로 구성된 miRNA 이중가닥(duplex)으로 처리된다. miRNA duplex는 RICS(RNA induced silencing complexes)와 결합하여 mRNA를 분해하거나 해독과정을 차단을 통해 유전자를 조절한다.
많은 종류의 miRNA와 이에 조절되는 표적 유전자는 다양한 질환의 기작에 miRNA의 중요한 역할을 예측할 수 있다. 따라서 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 따라 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소양상을 보임으로써 miRNA를 질환의 진단 및 예측 및 예후에 이용될 수 있는 바이오마커로써 인식되고 있다.
생물학적 물질 내에 miRNA는 매우 극소량 존재하며 이를 검출하기 위해 선택적이고 고감도의 분석법뿐 아니라 적절한 추출 방법이 필요하다. 현재 miRNA의 검출 방법으로는 역전사 중합효소 연쇄반응 검사가 많이 이용되고 있다. 역전사 중합효소 연쇄반응 검사의 경우 매우 뛰어난 정량 분석법이지만 비용이 비싸고 극소량 존재하는 miRNA를 분석하기 위해 증폭시키는 반응이 선행되어야 하며 이 때문에 재현성과 분석시간이 3-4시간 이상으로 매우 길다는 문제점을 갖고 있다. 따라서 역전사 중합효소 연쇄반응 검사이외의 다른 분석법들이 연구되고 있으며 그 중 모세관 전기 영동법은 정량성, 재현성, 및 분리도가 뛰어나고 무엇보다도 분석시간이 1시간 이내로 짧다는 장점으로 miRNA 검출에 이용하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 그러나 이 방법들은 증폭 과정이 포함되지 않기 때문에 극소량 존재하는 miRNA를 검출하기 위해서는 추출 효과를 극대화할 수 있는 추출방법의 개발이 요구되어 진다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 세포내 극미량으로 존재하는 miRNA를 짧은 시간 내에 고감도로 검출할 수 있는 분석법을 확립하고자 노력하였다. 그 결과, 트리졸을 이용한 추출방법에 트리톤 X-100을 추가할 경우 극미량의 miRNA를 고감도로 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 트리톤(Triton) X-100 첨가에 의한 세포 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 miRNA 검출용 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 트리톤(Triton) X-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether) 첨가에 의한 세포 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법을 제공한다:
(a) 트리졸 시약을 포함하는 세포 용해 완충액을 이용하여 세포를 용해(lysis)하는 단계;
(b) 트리톤 X-100을 첨가하여 인큐베이션 시키는 단계;
(c) 원심분리를 이용하여 세포 추출물을 수득하는 단계; 및
(d) 상기 세포 추출물로부터 miRNA를 검출하는 단계.
본 발명자들은 세포내 극미량으로 존재하는 miRNA를 짧은 시간 내에 고감도로 검출할 수 있는 분석법을 확립하고자 노력한 결과 트리졸을 이용한 추출방법에 트리톤 X-100을 포함할 경우 극미량의 miRNA를 고감도로 검출할 수 있음을 발견하였다.
miRNA(micro RNA)는 다양한 질환을 예측하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 즉, 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 있어서 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소 확인을 통하여 miRNA를 질환의 진단 및 예후를 예측하는데 이용될 수 있는 바이오마커로써 사용할 수 있다. 하지만, 체내 miRNA는 매우 극소량 존재하며 이를 검출하기 위해 선택적이고 고감도의 분석법이 필요하다. 현재 miRNA의 검출 방법으로는 마이크로어레이와 역전사 중합효소 연쇄반응 검사가 많이 이용되고 있으나 마이크로 어레이는 많은 종류의 miRNA를 검출할 수 있다는 장점이 있으나 정량성이 크게 떨어지는 단점을 갖고 있으며, 역전사 중합효소 연쇄반응 검사의 경우 비용이 비싸고 재현성에 문제가 있으며 무엇보다 분석시간이 3-4시간 이상으로 매우 길다는 단점을 갖고 있다.
또한, RNA 추출방법으로 트리졸(Trizol)을 이용한 방법을 사용하고 있으나, miRNA의 경우 극소량 존재로 인해 miRNA의 추출량에 한계가 있다.
본 발명에서, 용어“극소량”은 시료 내 펨토몰(femto mole, fM) 단위 이하로 존재할 정도의 소량을 의미한다. 본 발명의 “극소량”은 바람직하게는 500 fM, 보다 바람직하게는 100 fM, 가장 바람직하게는 50 fM 이하의 양이다.
본 발명자들이 개발한 검출방법에 따르면, 세포 내에 극소량으로 존재하는 miRNA를 단시간, 바람직하게는 1시간 이내에 검출할 수 있다.
이하, 본 발명을 단계별로 설명하기로 한다.
단계(a): 트리졸 시약을 포함하는 세포 용해 완충액을 이용한 세포의 용해( lysis )
첫 번째 단계는 miRNA를 추출하고자 하는 대상 세포를 용해하는 과정이다. 본 과정에서는 세포의 용해를 위해 어떠한 완충액을 사용할 수도 있으며, 바람직하게는 트리졸 시약을 포함하는 세포 용해 완충액을 이용한다.
트리졸 시약은 RNA/DNA/단백질 추출에 흔히 사용되는 당업계에 널리 알려져 있는 시약으로 페놀, 구아니디니움 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate) 등으로 구성되어 있다. 본 발명에서 첨가하는 트리졸 시약의 양은 목적에 따라 다양할 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎖를 포함할 수 있다.
단계(b): 트리톤 X-100의 첨가 및 인큐베이션
본 단계는 본 발명의 가장 큰 특징 중의 하나로, 트리졸만을 이용한 miRNA 추출방법에 트리톤 X-100을 추가할 경우 세포 내 극소량으로 존재하는 miRNA를 트리졸만을 이용한 경우와 비교하여 보다 많은 추출량, 바람직하게는 1.2 내지 4배, 보다 바람직하게는 1.5 내지 3배의 양으로 추출할 수 있다.
본 발명에서 이용하는 트리톤 X-100은 비이온계 계면활성제의 한 종류로 폴리에틸렌글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르라고도 불린다.
본 발명이 포함하는 트리톤 X-100의 농도는 바람직하게는 0.5 내지 10 %인 것이며, 보다 바람직하게는 1 내지 5%, 가장 바람직하게는 1.5 내지 3%인 것이다. 트리톤 X-100의 농도가 0.5%미만이거나 10%를 초과하면 miRNA 추출량에 큰 차이가 없을 수 있다.
miRNA 추출량을 증가시키기 위해 상기 트리톤 X-100의 첨가 후 인큐베이션을 수행하는 것이 바람직하며, 인큐베이션 시간은 바람직하게는 1분 내지 100분, 보다 바람직하게는 5분 내지 30분, 가장 바람직하게는 15분 내지 30분을 수행하는 것이 좋다. 인큐베이션 시간이 1분미만이거나 100분을 초과하면 miRNA 추출량에 큰 차이가 없을 수 있다.
단계(c): 원심분리를 이용한 세포 추출물 수득
상기 인큐베이션이 완료되면, 이어서 세포 추출물을 수득한다. 세포 추출물을 수득하기 위하여 고속 또는 저속 원심분리기를 사용할 수 있다. 당업자라면 목적에 맞도록 적합한 원심분리기 및 원심분리 시간을 선정할 수 있으며, 자이로젠(Gyrozen) 원심분리기를 이용할 경우, 1,000 내지 30,000 RCF, 바람직하게는 10,000 내지 15,000 RCF로, 5분 내지 30분, 바람직하게는 10분 내지 20분 수행한다.
단계(d): 세포 추출물로부터 miRNA 를 검출
마지막으로, 상기 세포 추출물로부터 miRNA를 검출한다.
본 발명의 트리톤 X-100가 추가된 효율적인 miRNA 검출법은 트리졸 시약에 트리톤 X-100이 첨가되면, 추출되는 miRNA 양 자체가 트리톤 X-100이 첨가되지 않은 상태와 비교하여 약 2배 이상 높기 때문에, 당업계에 알려진 다양한 miRNA 검출법을 활용하여 이를 손쉽게 효율적으로 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 검출방법은 세포 내에 극소량으로 존재하는 miRNA를 단시간, 바람직하게는 1시간 이내에 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)는 다음의 단계를 포함한다: (d-1) 세포 추출물로부터 RNA를 추출하는 단계; (d-2) 상기 단계 (d-1)로부터 추출한 RNA와, 상기 세포 추출물에 존재할 것으로 예상되는 miRNA에 특이적인 형광물질이 결합된 유리 DNA를 혼성화 버퍼에서 혼성화 시키는 단계; (d-3) LIF(laser induced fluorescence) 검출기가 장착된 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템을 이용하여 DNA-miRNA 복합체를 분리 및 확인하는 단계; 및 (d-4) 상기 단계 (d-3)의 결과 DNA-miRNA 복합체 피크를 확인하여 세포내 극소량의 miRNA의 존재를 확인하는 단계.
본 발명의 검출방법은 다양한 질환의 진단 및 예후를 예측하는데 이용될 수 있으며, 바람직하게는 심근경색을 포함하는 심혈관질환의 진단에 이용할 수 있다.
심혈관질환의 바이오마커는 당업계에 다양한 miRNA들이 알려져 있으며, 본 발명의 검출방법이 심혈관질환의 바이오마커 검출에 이용될 경우, miRNA는 바람직하게는 miRNA-1, miRNA-21, miRNA-133, miRNA-208 또는 miRNA-499, 보다 바람직하게는 miRNA-21 또는 miRNA-499, 가장 바람직하게는 서열목록 제1서열의 miRNA-21를 심혈관질환의 바이오마커로 이용할 수 있다.
형광물질 표지는 혼성화 여부를 검출케 하는 시그널을 제공할 수 있으며, 이는 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 적합한 표지는 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5(Pharmacia) 등 다양한 형광물질을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 6-카르복시플루오리신을 이용할 수 있다. 표지는 당업계에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법, 예컨대, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, “Amersham”(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 실시될 수 있다.
혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건 (stringent condition)은 온도, 이온세기 (버퍼 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다. 본 발명에서 이용하는 버퍼의 종류는 당업계에 이용되는 다양한 종류의 버퍼를 이용할 수 있으며, 최적의 혼성화 조건은 상기 버퍼 중 가장 혼성화 정도가 높은 버퍼를 선정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 혼성화 버퍼는 TNM 버퍼, PBS 버퍼Tris-Cl 버퍼, SSC 버퍼, HEN 버퍼 또는 TEN 버퍼 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 TEN 버퍼를 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 모세관 전기영동 시스템은 LIF(laser induced fluorescence)검출기가 장착된다(CE/LIF 시스템).
본 발명에서 상기 CE/LIF 시스템을 이용할 경우, 혼성화된 DNA-miRNA 복합체의 분리는 미코팅 모세관(uncoated capillary)을 이용하여 실시할 수 있다. 상기 모세관은 내경이 50-100 ㎛, 길이가 20-60 ㎝인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 분리용 버퍼로 트리스-보레이트(Tris-borate) 버퍼를 사용하여 상기 모세관 내에서 10-20 kV, 바람직하게는 16 kV의 전압을 적용할 경우 혼성화된 DNA-miRNA 복합체를 분리할 수 있다.
LIF 검출기의 파장은 검출하려 하는 형광물질의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 형광물질로 6-카르복시플루오리신을 이용할 경우 여기 파장은 바람직하게는 400-500 ㎚, 가장 바람직하게는 488 ㎚를 갖으며, 방출 파장은 바람직하게는 500-600 ㎚, 가장 바람직하게는 520 ㎚를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 miRNA를 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 miRNA를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 50 펨토몰 이하의 극소량의 miRNA 검출용 키트로서, (a) 트리졸 시약; (b) 트리톤 X-100; (c) 상기 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 형광물질; (d) 혼성화 버퍼; 및 (e) DNA-miRNA 복합체 분리용 버퍼를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 miRNA는 miRNA-21인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기혼성화 버퍼는 TNM 버퍼, PBS 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC 버퍼, HEN 버퍼 및 TEN 버퍼로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 버퍼인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분리용 버퍼는 트리스-보레이트 버퍼인 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 형광물질은 6-카르복시풀루오리신인 것이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 트리톤(Triton) X-100 첨가에 의한 세포 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법을 제공한다:
(ⅱ) 본 발명에 따르면, 시료 내 극소량으로 존재하는 miRNA를 빠른 시간에 정량적으로 분석이 가능하다.
(ⅲ) 또한, 본 발명의 트리톤(Triton) X-100을 추가한 miRNA 검출방법은 트리졸 시약만을 이용하였을 경우와 비교하여 약 2배 이상 검출 효율을 증가시킬 수 있다.
도 1은 세포 내 miRNA을 정량 혹은 정성 분석하기 위해 세포 내 miRNA를 추출하기 위한 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 트리졸 시약의 miRNA 추출방법에 트리톤 X-100을 첨가 하였을 경우 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA와 혼성화된 DNA-miRNA 복합체 피크의 감도가 증가되며 감도는 트리톤 X-100의 농도에 따라 달라지며 2% 의 트리톤 X-100을 사용할 때 최고의 감도를 보여짐을 확인한 것이다.
도 3은 트리졸 시약의 miRNA 추출방법에 2% 의 트리톤 X-100을 사용 한 후 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA와 혼성화된 DNA-miRNA 복합체 피크의 감도는 트리톤 X-100의 인큐베이션 시간에 따라 달라지며 실온에서 20 분 동안의 인큐베이션 시간에서 최고의 감도가 보여짐을 확인한 것이다.
도 4는 H9c2 심근세포주를 트리톤 X-100 을 첨가하지 않거나 도 2 및 3에서 확인한 최적의 감도를 갖는 트리톤 X-100을 첨가한 후 추출한 전체 RNA에 miRNA-21에 특이성을 띠는 형광을 띤 잔기가 붙은 단일 가닥 DNA를 첨가 시켜 혼성화 반응 후 CE/LIF를 이용하여 검출 하였을 때 반응하지 않은 DNA 피크 및 DNA-miRNA-21 복합체 피크로부터 H9c2 심근세포 내 miRNA-21를 검출하여 추출 된 miRNA-21의 양을 비교한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 추출 효율에 효과적인 최적의 트리톤 X-100 농도 확립
심근세포주 (H9c2 cardiomyocytes)에 일반적으로 RNA 혹은 miRNA의 추출방법인 시판하는 트리졸 시약의 miRNA 추출방법에 Triton X-100의 농도를 달리하여 첨가 시켜 total RNA를 추출하였다. 추출된 전체 RNA 시료에 miRNA-21 (5´-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3´)에 특이적인 형광물질인 6-FAM(5´-carboxyfluorescein phosphoramidite)를 포함하는 유리 DNA 를 95℃에서 5분간 변성시키고 40℃에서 15분 간 TEN 버퍼(50 mM Tris-Ac (pH 8.0), 10 mM EDTA, 50 mM NaCl)에서 혼성화 시킨 후 LIF(laser-induced fluorescence) 검출기를 갖는 CE 시스템에서 분석하였다. CE 시스템은 PA 800 plus CE 시스템(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)이고 LIF 검출기는 여기와 방출 파장이 각각 488 nm 와 520 nm인 Beckman P/ACE System Laser Module 488을 사용하였다. 분리는 100 mM 트리스-보레이트 버퍼(pH10.0)를 사용하여 내경이75 ㎛이고 길이가 30 cm인 미코팅 모세관(Beckman Coulter)내에서 16 kV의 전압을 적용하여 수행하였다. 시료의 주입은 0.5 psi로 5 초 동안 진행되었다. “도 2”는 miRNA-21과 결합된 DNA 피크의 크기가 트리톤 X-100의 농도에 따라 크게 달라짐을 확인 할 수 있었고 2% 트리톤 X-100를 사용할 때 miRNA와 결합된 DNA 피크의 크기가 가장 높음을 확인 할 수 있었다.
실시예 2:추출 효율에 효과적인 최적의 Triton X-100 인큐베이션 시간 확립
심근세포주에 일반적으로 RNA 혹은 miRNA의 추출방법인 시판하는 트리졸 시약의 miRNA 추출방법에 2% 트리톤 X-100 첨가 한 후 인큐베이션 시간을 달리하여 전체 RNA를 추출하였다(도 3). 분석은 실시예 2과 같은 조건에서 수행하였다. 이러한 결과로부터 miRNA와 결합된 DNA 피크의 크기가 인큐베이션 시간에 따라 달라짐을 확인 할 수 있었고 2% 트리톤 X-100을 사용 한 후 20분간의 인큐베이션을 적용 할 때 miRNA와 결합된 DNA 피크의 크기가 가장 높음을 확인 할 수 있었다.
실시예 3:심근세포주에서의 트리톤 X-100 유무에 따른 miRNA 검출 및 비교
심근세포주는 DMEM 배지에 10% FBS, 1% volume 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 사용하였다. 배지는 이틀마다 교체하였고 세포를 키우는 배양기는 37℃, 5% CO2의 조건을 유지하였다. 세포는 100 ㎜ 디쉬에 1 × 106개의 세포를 배양한 후에 디쉬의 세포를 트리졸에 2% 을 첨가한 후 20분간 인큐베이션 하거나 트리톤 X-100을 첨가 없이 전체 RNA를 각각 추출하였다. 추출된 전체 RNA에 miRNA-21에 특이적인 프로브에 형광물질인 6-FAM를 포함하는 DNA를 95℃에서 5분간 변성시키고 40℃에서 15분 간 TEN 혼성화 버퍼에서 혼성화시킨 후에 결합 시켜 그 복합체를 CE/LIF를 이용하여 분석 하였다. CE 시스템은 PA 800 plus CE 시스템(Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)이고 LIF 검출기는 여기와 방출 파장이 각각 488 nm 와 520 nm인 Beckman P/ACE System Laser Module 488을 사용하였다. 분리는 100 mM 트리스-보레이트 버퍼(pH 10.0)를 사용하여 내경이75 ㎛이고 길이가 30 ㎝인 미코팅 모세관(Beckman Coulter)내에서 16 kV의 전압을 적용하여 수행하였다. 시료의 주입은 0.5 psi로 5초 동안 진행되었다. 이러한 결과를 “도 4A와 B"에 나타내었으며 트리톤 X-100을 첨가한 세포 및 트리톤 X-100이 첨가되지 않은 세포에서 모두 DNA-miRNA 복합체 피크를 확인 할 수 있었으나 트리톤 X-100을 첨가한 세포에서 DNA-miRNA 복합체 피크의 감도가 2배 가량 크게 검출됨을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Institute of Science & Technology <120> A Method for Enhancing Extraction Efficiency of miRNA from Cells by the Addition of Triton X-100 <130> DP-2012-0883 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-21 <400> 1 uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims (19)

  1. 다음의 단계를 포함하는 트리톤(Triton) X-100(polyethylene glycol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-phenyl ether) 첨가에 의한 세포 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법:
    (a) 트리졸 시약을 포함하는 세포 용해 완충액을 이용하여 세포를 용해(lysis)하는 단계;
    (b) 트리톤 X-100을 첨가하여 인큐베이션 시키는 단계;
    (c) 원심분리를 이용하여 세포 추출물을 수득하는 단계; 및
    (d) 상기 세포 추출물로부터 miRNA를 검출하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 트리톤 X-100의 농도는 1 내지 5%인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 인큐베이션 시간은 5분 내지 30분인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (d-1) 세포 추출물로부터 RNA를 추출하는 단계;
    (d-2) 상기 단계 (d-1)로부터 추출한 RNA와, 상기 세포 추출물에 존재할 것으로 예상되는 miRNA에 특이적인 형광물질이 결합된 유리 DNA를 혼성화 버퍼에서 혼성화 시키는 단계;
    (d-3) LIF(laser induced fluorescence) 검출기가 장착된 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템을 이용하여 DNA-miRNA 복합체를 분리 및 확인하는 단계; 및
    (d-4) 상기 단계 (d-3)의 결과 DNA-miRNA 복합체 피크를 확인하여 세포내 극소량의 miRNA의 존재를 확인하는 단계.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 LIF 검출기는 여기 파장이 400-500 ㎚이고 방출 파장이 500-600 ㎚인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 DNA-miRNA 복합체의 분리는 미코팅 모세관(uncoated capillary)을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 미코팅 모세관은 내경이 50-100 ㎛이고 길이가 20-60 ㎝인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 분리는 트리스-보레이트 버퍼를 사용하여 미코팅 모세관 내에서 10-20kV의 전압을 적용하여 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 세포는 심근세포(cardiomyocyte)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 miRNA는 miRNA-21인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 miRNA-21은 서열목록 제1서열의 miRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 6 항에 있어서, 상기 형광물질은 6-카르복시풀루오리신인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 6 항에 있어서, 상기 혼성화 버퍼는 TNM 버퍼, PBS 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC 버퍼, HEN 버퍼 및 TEN 버퍼로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 혼성화 버퍼는 TEN 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 50 펨토몰 이하의 극소량의 miRNA 검출용 키트로서, (a) 트리졸 시약; (b) 트리톤 X-100; (c) 상기 miRNA에 특이적인 혼성화가 가능한 형광물질; (d) 혼성화 버퍼; 및 (e) DNA-miRNA 복합체 분리용 버퍼를 포함하는 모세관 전기영동(CE/LIF) 시스템에 적용하기 위한 miRNA 검출용 키트.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 miRNA는 miRNA-21인 것을 특징으로 하는 miRNA 검출용 키트.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 혼성화 버퍼는 TNM 버퍼, PBS 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC 버퍼, HEN 버퍼 및 TEN 버퍼로 구성된 군으로부터 선택되는 1 또는 그 이상의 버퍼인 것을 특징으로 하는 miRNA 검출용 키트.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 분리용 버퍼는 트리스-보레이트 버퍼인 것을 특징으로 하는 miRNA 검출용 키트.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 형광물질은 6-카르복시풀루오리신인 것을 특징으로 하는 miRNA 검출용 키트.
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