KR102205620B1

KR102205620B1 - 혈중 내 극소량 존재하는 miRNA의 검출 효율의 증가 방법

Info

Publication number: KR102205620B1
Application number: KR1020190057343A
Authority: KR
Inventors: 송은주; 권해진; 반은미; 유영숙; 김은경; 박진영
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2019-05-16
Filing date: 2019-05-16
Publication date: 2021-01-21
Also published as: KR20200132209A

Abstract

본 발명은 혈중 내 극소량 존재하는 miRNA의 검출 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, qPCR 검출 효율을 저해하는 요소의 최적화 방법을 제시함으로써, 혈장에 극미량 존재하는 miRNA를 고감도로 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, qPCR 분석을 저해하는 요소를 최소화하는 조건을 정립하여, 분석 결과의 신뢰도를 높임으로써 다양한 miRNA 검출하는데 효율적으로 활용될 수 있다.

Description

혈중 내 극소량 존재하는 miRNA의 검출 효율의 증가 방법{Methods for increasing the detection efficiency of trace amounts of miRNA in the blood}

본 발명은 혈중 내 극소량 존재하는 miRNA의 검출 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 혈장에 극미량 존재하는 miRNA를 추출하는 과정 중에 수반될 수 있는 qPCR의 분석을 저해하는 요소를 최소화하는 조건을 정립하여 miRNA의 qPCR 분석 결과의 신뢰도를 높이는 조건을 최적화함으로써, 다양한 질환을 확인, 판정 및 발병 기작을 규명하는데 효과적으로 활용될 수 있다.

마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)는 약 22개의 뉴클레오타이드의 짧은 단일가닥으로 구성된 비암호화 RNA로 식물, 동물, 바이러스 등에서 발견된다. mRNA의 번역을 방해하는 과정을 통해 다른 유전자들을 조절함으로써 세포 분화, 배아 발생, 대사 조절 및 암 발생과정을 제어한다. 대략 인간 유전체는 전체 유전자의 30% 가량을 miRNA에 의해 조절되는 것으로 추정된다. miRNA는 비암호화 부분에 있는 개별 유전자의 전사를 통해 생성된다. miRNA는 핵에서 RNA 중합효소 Ⅱ에 의해 전사되는 전구물질인 pri-miRNA(primary miRNA)로부터 전사된다. 이어서 드로샤(Drosha, dsRNA-specific ribonuclease)라고 하는 핵산분해효소 Ⅲ에 의해 분해되어 헤어핀 모양의 pre-miRNA가 생성된다. pre-miRNA의 헤어핀은 보조인자로써 단백질 엑스포틴-5(exportin-5)와 Ran-GTP에 의해 세포 핵 밖으로 이동되고 리보핵산 분해효소 Ⅲ 다이서(Dicer) 및 TRBP(transactivation-responsive RNA binding protein)의 작용에 의해 대략 22개의 뉴클레오티드로 구성된 miRNA 이중가닥(duplex)으로 처리된다. miRNA 듀플렉스는 RICS(RNA induced silencing complexes)와 결합하여 mRNA를 분해하거나 해독과정을 차단을 통해 유전자를 조절한다.

많은 종류의 miRNA와 이에 조절되는 표적 유전자는 다양한 질환의 기작에 miRNA의 중요한 역할을 예측할 수 있다. 따라서 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 따라 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소 양상을 보임으로써 miRNA를 질환의 진단 및 예측 및 예후에 이용될 수 있는 바이오마커로써 인식되고 있다. 이와 함께 miRNA를 기반으로 한 치료제 개발이 크게 증가하고 있다.

생물학적 물질 내에 miRNA는 매우 극소량 존재하며 이를 검출하기 위해 선택적이고 고감도의 분석법뿐 아니라 적절한 추출 방법이 필요하다. 현재 miRNA의 검출 방법으로는 qPCR 분석이 많이 이용되고 있다. qPCR 분석의 경우 매우 뛰어난 정량 분석법으로, SYBR Green I을 이용한 PCR의 실시간 모니터링은 타겟별로 특별한 형광 표식 프로브(probe)를 준비할 필요가 없으며, 비용면에서도 저렴하다. 그러나, SYBR Green I은 2중 가닥 DNA(double strand DNA)에 서열 비특이적으로 결합하므로, 증폭 자체에 특이성이 요구되어 반응 조건 검토가 매우 중요해진다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 혈장 내 극미량으로 존재하는 miRNA를 고감도로 검출할 수 있는 분석법을 확립하고자 예의 노력한 결과, miRNA 추출 과정에서 수반될 수 있는 qPCR 분석을 저해하는 요소를 최소화 하는 조건을 정립하여, 혈중 내 존재하는 miRNA를 고감도로 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

미국 공개출원 제2012-0034612호(2012.02.09)

Chomczynski P, Biotechniques, 1993, 15(3): 532-535. Chomczynski P, Sacchi N, Analytical Biochemistry, 1987, 162(1): 156-159. Niu Y, Zhang L, Qiu H, et. al., Scientific report, 2015, 5:15100.

본 발명은 혈장 시료 안에 극미량으로 존재하는 miRNA를 고감도로 검출하는 방법에 관한 것으로, 혈장 내 고순도 miRNA의 추출 방법을 최적화하였다.

miRNA가 혈청과 혈장을 타고 순환하고 있으며 질병에 따라 발현에 차이가 있다는 사실이 발견되면서, miRNA는 암, 심장질환, 임신, 당뇨, 정신질환 등 다양한 분야의 진단에서 새로운 형태의 바이오마커(biomarker)로서 심도 깊게 연구되고 있다. 따라서 관련 연구 분야에서 miRNA의 정제 및 정량은 매우 중요하다.

추출된 miRNA는 실시간 PCR(real-time polymerase chain reaction, real-time RCR) 또는 정량중합효소연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)이라고도 불리는 방법으로 분석한다. 이때 RNA 순도가 떨어지면 효소 반응을 저해하고 소량의 RNA를 제대로 정제하지 못하면 부정확한 결과가 나올 수 있으므로, miRNA 정량 실험에서 제대로 된 결과를 얻으려면 miRNA가 포함된 고순도의 총 RNA를 얻는 것이 매우 중요하다.

따라서, 혈장에 극미량 존재하는 miRNA를 추출하는 과정 중에 수반될 수 있는 qPCR의 분석을 저해하는 요소를 최소화하는 조건을 정립하여 miRNA의 qPCR 분석 결과의 신뢰도를 높이는 조건을 최적화함으로써, 다양한 질환을 확인, 판정 및 발병 기작을 규명하는데 효과적으로 활용될 수 있다.

이에, 본 발명의 목적은 혈장 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법을 제공하기 위한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 목적은 miRNA 추출 과정 중 qPCR 분석을 저해할 수 있는 요소를 최소화하여 고감도로 miRNA를 정량하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.

본 발명의 일측면은 (a) 혈장 시료에 트리졸 시약을 첨가하고 원심분리한 후 상층액을 분리하는 단계; (b) 상기 분리한 상층액에 글리코겐(glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 첨가하고 인큐베이션하는 단계; (c) 인큐베이션 후 원심분리하여 miRNA가 포함된 총(total) RNA를 펠릿(pellet) 형태로 추출하는 단계; (d) 상기 총 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하는 단계; 및 (e) 상기 수득한 cDNA를 증폭하여 목적하는 miRNA를 검출하는 단계;를 포함하는 혈장 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 단계 (a)에서 혈장 시료의 양은 10 ㎕ 내지 300 ㎕인 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 단계 (a)에서 분리하는 상층액의 양은 350 ㎕ 내지 450 ㎕인 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 단계 (b)에서 글리코겐의 농도는 혈장 시료의 양 10 ㎕ 내지 300 ㎕에 대하여 0.5 ㎍ 내지 120 ㎍이고, 효모 유래 tRNA는 20 ng 내지 1000 ng인 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 단계 (b)에서 인큐베이션은 -60℃ 내지 -100℃에서 30분 내지 3시간 동안 수행하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 단계 (c)에서 펠릿 형태로 추출된, miRNA가 포함된 총 RNA는 에탄올 세척을 진행하지 않는 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 단계 (d)는 (d-1) 총 RNA 펠릿에 DNA 분해효소(DNase)를 첨가하는 단계; 및 (d-2) RNA 중합 효소 및 역전사 효소를 첨가하는 단계;를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 RNA 중합 효소는 폴리(A) 폴리머라아제 (Poly(A) polymerase)이고, 역전사 효소는 HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나 이상인 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 단계 (e)는 목적하는 miRNA에 상응하는 정방향 프라이머, 유니버셜 리버스 프라이머(universal reverse primer), 및 형광물질을 이용하여 실시간(real-time) qPCR을 실시하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 형광물질은 SYBR Green 계열의 형광물질인 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 있어서, 상기 방법은 혈장 시료 내 miRNA가 포함된 총 RNA 추출 과정 중에 발생할 수 있는 qPCR 분석의 저해요인을 최소화한 것인 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 혈장 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법은 qPCR 분석을 저해하는 요인을 최소화하는 조건을 정립해 혈중 내 극미량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 효과가 있다.

본 발명의 일측면에 따른 혈장 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율의 증가 방법은 혈중 내 극미량으로 존재하는 miRNA를 재현성 있게 고감도로 분석이 가능한 효과가 있다.

본 발명의 일측면에 따른 혈장 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율의 증가 방법은 구체적으로 트리졸 시약으로 층 분리 후 상층액을 400 ㎕ 사용하고, RNA 펠릿의 세척 과정을 생략한 경우 바람직한 qPCR 결과를 얻음으로써, 다양한 miRNA를 검출하는데 효율적으로 활용될 수 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.

도 1은 혈장 내 miRNA를 정량 또는 정성 분석하고자, 혈장 내 miRNA의 추출 과정을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 참조물질(C.elegans miR-39 miRNA 모방체)을 첨가한 물 및 혈장 시료를 이용한 qPCR 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 2의 A는 물에 첨가한 참조물질을 추출한 후 qPCR 방법을 이용하여 검출한 결과로, 상층액의 양이 늘어남에 따라 참조물질의 C_T 값이 작아지는 것을 확인한 것이고, 도 2의 B는 혈장 시료에 첨가한 참조물질을 추출한 후 qPCR를 방법을 이용하여 검출한 결과로, 도 2의 A의 결과와 달리 상층액의 양이 늘어남에 따라 C_T 값이 커지는 것을 확인한 것이다. 이는 회수한 수용액 층에 qPCR 분석을 저해하는 요인이 존재함을 확인한 것이다.
도 3은 혈중에 높은 농도로 존재하는 miR-16 및 낮은 농도로 존재하는 miR-155를 각각 선택하여 분석한 qPCR 결과를 나타낸 도로, 분리한 상측액 양에 비례해서 C_T 값이 감소하는 miR-16(도 3의 A)과 달리 miR-155(도 3의 B)의 경우는 상층액의 양과 관련 없는 C_T 값의 양상을 보여준다. 이는 qPCR 분석 시 농도가 낮은 miRNA가 저해 요소에 크게 영향을 받는 것을 확인한 것이다.
도 4는 실시예 2에서 결정한 상층액 400 ㎕을 분리하여 실험을 진행하되, RNA 펠릿을 75% 에탄올로 세척을 하거나 하지 않는 경우에 따른 miRNA의 농도를 qPCR로 확인한 결과를 나타낸 도로, RNA 펠릿을 세척을 하지 않는 것이 더 바람직한 결과를 얻음을 확인한 것이다.
도 5는 혈장 50 ㎕를 이용하여 miR-16 및 miR-155를 분석한 qPCR결과를 나타낸 도로, 실시예 2 및 3에서 결정한 상층액 400 ㎕를 분리하여 RNA 펠릿을 수득하고, 수득한 펠릿은 세척을 하지 않는 조건으로 실험을 진행한 것이다. 일반적으로 환자에서 얻는 혈장 시료의 양이 제한적이기 때문에, 극미량의 혈장 (50 ㎕)을 사용하여 목적 miRNA에 대한 유의한 C_T값과 △C_T값의 결과를 얻음을 확인한 것이다.
도 6은 혈장 50 ㎕, 100 ㎕, 200 ㎕ 및 250 ㎕를 이용하여 miR-16 및 miR-155를 분석한 qPCR결과를 나타낸 도로, 실시예 2 및 3에서 결정한 상층액 400 ㎕를 분리하여 RNA 펠릿을 수득하고, 수득한 펠릿은 세척을 하지 않는 조건으로 실험을 진행한 것이다. 일반적으로 환자에서 얻는 혈장 시료의 양이 제한적이기 때문에, 250 ㎕ 이하의 소량의 혈장 시료를 사용하여 목적 miRNA에 대한 유의한 C_T값의 결과를 얻음을 확인한 것이다.

달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범 위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.

본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 혈중 내 극소량 존재하는 miRNA의 검출 효율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, qPCR 검출 효율을 저해하는 요소의 최적화 방법을 제시함으로써, 혈장에 극미량 존재하는 miRNA를 고감도로 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 qPCR 분석을 저해하는 요소를 최소화하는 추출 조건을 최적화하는 방법을 확립함으로써, 혈장 내 극미량으로 존재하는 miRNA를 고감도로 검출할 수 있음을 발견하였다.

miRNA는 다양한 질환을 예측하는데 중요한 역할을 할 수 있다. 즉, 암, 당뇨병 및 심혈관 질환과 같은 다양한 질환에 있어서 비정상적인 miRNA의 발현의 증가 혹은 감소 확인을 통하여 miRNA를 질환의 진단 및 예후를 예측하는데 이용될 수 있는 바이오마커로써 사용할 수 있다. 하지만, 체내 miRNA는 매우 극미량 존재하며 이를 검출하기 위해 선택적이고 고감도의 분석법이 필요하다. 현재 miRNA의 검출 방법으로 qPCR 분석이 많이 사용되고 있으나, 체내에 극미량으로 존재하는 miRNA의 검출 시 감도 및 재현성에 문제가 있다.

이에 본 발명에서는 qPCR 분석을 저해하는 요인을 최소화하여 재현성 문제를 해결할 수 있는 방법을 검증하였다.

본 발명자들이 개발한 추출 방법에 따르면, 혈장 내에 극미량으로 존재하는 miRNA를 qPCR 방법으로 재현성 있게 고감도로 검출할 수 있다.

본 발명에서 용어 "miRNA(microRNA)"는 짧은 비암호화(noncoding) RNA로, 전사(transcription)와 해독(translation) 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있다. miRNA는 진화를 통해 보존되면서 세포주기, 분화, 발달, 대사, 패터닝(patterning) 및 노화와 같은 근본적인 생물학적 과정에 관여하고 있다.

본 발명에서 용어 "극소량"은 '극미량'과 혼용하여 사용될 수 있으며, 시료 내 나노몰(nM), 피코몰(pM) 또는 펨토몰(fM) 단위 이하로 존재할 정도의 소량을 의미한다.

본 발명에서 miRNA 검출 대상 시료는 "생물학적 시료"를 대상으로 하며, "생물학적 시료"는 생물 유래의 장기, 조직, 세포 또는 체액을 일컫는 것이다. 생물학적 시료의 예로는 조직 절편, 전혈, 혈장, 혈청, 소변 또는 혈액 유래의 백혈구, 적혈구 또는 혈소판, 또는 조직 또는 세포 배양물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한 하나 이상의 상기 시료가 혼합되어 사용될 수 있다.

시료 내에서 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 트리졸(trizol)을 이용하여 추출할 수 있다.

이하, 본 발명을 단계별로 설명하기로 한다.

단계 (a): 혈장 시료 내 트리졸 시약을 넣고 원심분리한 후 상층액을 분리

첫 번째 단계는 혈장 시료 내 트리졸 시약, 클로로폼을 넣고 원심분리한 후 상층액을 분리하는 단계이다. 이때 miRNA의 상대정량을 위해 참조물질(miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control, Qiagen)을 혈장 시료에 넣어준다. 참조물질은 인체 혈중 내에는 존재하지 않는 C. elegans miR-39 miRNA mimic이 사용되고, 트리졸 시약은 RNA/DNA/단백질 추출에 흔히 사용되는 당업계에 널리 알려져 있는 시약으로 페놀, 구아니디니움 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate) 등으로 구성되어 있다. 본 발명에서 첨가하는 트리졸 시약의 양은 목적에 따라 다양할 수 있으며, 바람직하게는 0.01 ㎖ 내지 100 ㎖, 보다 바람직하게는 0.1 ㎖ 내지 10 ㎖를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 혈장 시료의 양은 이에 제한되지는 않으나, 10 ㎕ 내지 300 ㎕, 15 ㎕ 내지 290 ㎕, 20 ㎕ 내지 280 ㎕, 25 ㎕ 내지 270 ㎕, 또는 30 ㎕ 내지 260 ㎕일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 혈장 시료 250 ㎕에 트리졸 시약 750 ㎕를 첨가하여 총(total) RNA를 포함한 상층액을 분리하였다(실시예 1).

또한, 1×PBS 200 ㎕를 첨가한 혈장 시료 50 ㎕에 트리졸 시약 750 ㎕를 첨가하여 총(total) RNA를 포함한 상층액을 분리하였다(실시예 4).

상기 본 발명에서 분리하는 상층액의 양은 이에 제한되지는 않으나, 350 ㎕ 내지 450 ㎕, 360 ㎕ 내지 440 ㎕, 370 ㎕ 내지 430 ㎕, 380 ㎕ 내지 420 ㎕, 390 ㎕ 내지 410 ㎕, 또는 400 ㎕일 수 있다.

또한, 상기 분리하는 상층액의 양은 이에 제한되지는 않으나, 수집 가능한 총 상층액의 양을 100 중량부로 하였을 시, 50 중량부 내지 90 중량부, 55 중량부 내지 85 중량부, 60 중량부 내지 80 중량부, 65 중량부 내지 75 중량부 또는 70 중량부에 해당하는 양일 수 있다.

상기 단계 (a)는 본 발명의 가장 큰 특징 중의 하나로, 기존의 트리졸 시약을 사용한 miRNA 추출법에서는 최대한의 상층액을 사용해 많은 양의 miRNA를 회수하도록 권장한 바와 달리, 정확하고 재현성 높은 qPCR 분석 결과를 얻기 위해서 분리하는 상층액의 양이 중요함을 발견하였다.

본 발명에서는 상층액의 양을 200 ㎕, 300 ㎕, 400 ㎕ 및 500 ㎕로 회수했을 때의 qPCR 결과를 확인하였고, 전체 상층액 양의 약 70%인 400 ㎕의 상층액을 사용했을 때 바람직한 결과가 얻어짐을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 즉, 상층액의 분리 단계를 최적화하여 혈장 시료 내 miRNA가 포함된 총 RNA 추출 과정 중에 발생할 수 있는 qPCR 분석의 저해요인을 최소화할 수 있음을 확인하였다.

상기 'qPCR 분석의 저해요인'이란 이에 제한되지는 않으나, 총 RNA 추출 과정 중 발생할 수 있는 오염원에의 노출, 예컨대 오염된 실험 테이블, 실험에 사용되는 기구, 특히 튜브, 파이펫 팁 등의 멸균 상태 불량에 의한 오염, 실험자의 손이나 실험복에 존재 가능한 불명의 오염원에 의한 오염, 파이펫 내부 오염에 따른 파이펫팅 시 실험 샘플의 오염, qPCR에 사용되는 샘플 또는 시약 등의 오염에 의해 부정확한 qPCR 분석을 유도하는 불특정한 요인일 수 있다. 또한, 최적화되지 않은 qPCR 반응 조건, 예컨대 최적화되지 않은 온도 조건에 따른 비특이적 결합에 의한 증폭, 템플레이트의 고농도 또는 저순도에 따른 부정확한 증폭, 증폭 반응시 사용되는 시약, 예컨대 프라이머, 중합효소 등의 최적화되지 않은 사용량에 의해 부정확한 qPCR 분석을 유도하는 최적화되지 않은 불특정한 반응 조건일 수 있다.

바람직하게는, qPCR에 사용되는 샘플 또는 시약 등의 오염에 의해 부정확한 qPCR 분석을 유도하는 불특정한 요인으로 예컨대, 혈장 시료 내 존재하는 단백질 또는 시약 내 존재하는 페놀 성분일 수 있다.

단계 (b): 글리코겐(glycogen) 및 효모 유래 tRNA의 첨가 후 인큐베이션

본 단계는 상기 단계 (a)의 상층액에 염과 알콜을 첨가하는 과정으로, 염으로 아세트산 나트륨(sodium acetate, 3 M, pH 5.2)을 첨가하고 글리코겐 및 효모 유래 tRNA를 운반체로 첨가한 후, 이소프로판올(isopropanol)을 추가 첨가하여 miRNA가 포함된 총(total) RNA를 추출하기 위해 인큐베이션하는 단계이다.

보다 구체적으로, 아세트산 나트륨은 DNA와 RNA를 수용액 상태에서 침전시켜 농축할 때 가장 널리 사용되고 있는 용액이며, 글리코겐 및 효모 유래 tRNA는 에탄올이나 이소프로판올에 녹지 않으며 핵산을 트랩(trap)하여 침전을 형성하는 역할을 함으로써 핵산 혹은 올리고뉴클레오타이드의 회수율을 증가시키기 위해 사용되는 시약이다. 원심분리 후 녹지 않은 글리코겐 및 효모 유래 tRNA/핵산 침전은 눈에 보이는 펠릿(pellet)을 형성하여 핵산을 회수할 수 있도록 한다. 침전 형성에 도움이 되는 인큐베이션 시간 및 온도를 조절하여 miRNA가 포함된 총 RNA를 추출한다.

본 발명에 있어서, 아세트산 나트륨의 사용량은 이에 제한되지는 않으나, 최종 부피를 기준으로 하여 핵산이 포함된 용액에 1/20 부피(v/v) 내지 1/2 부피(v/v), 또는 1/10 부피(v/v)를 첨가하여 0.1 M 내지 0.5 M, 또는 0.3 M의 농도로 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 이에 제한되지는 않으나, 글리코겐 및 효모 유래 tRNA를 동시에 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 글리코겐의 사용량은 이에 제한되지는 않으나, 혈장 시료의 양 10 ㎕ 내지 300 ㎕에 대하여 0.5 ㎍ 내지 120 ㎍, 1 ㎍ 내지 80 ㎍ 또는 1.5 ㎍ 내지 70 ㎍일 수 있다. 글리코겐의 사용량은 상기 사용량 범위 내에서 핵산을 트랩하여 침전을 형성하고, 이에 따른 miRNA 추출 효율성이 우수하다.

본 발명에 있어서, 효모 유래 tRNA의 사용량은 이에 제한되지는 않으나, 혈장 시료의 양 10 ㎕ 내지 300 ㎕에 대하여 20 ng 내지 1000 ng, 22 ng 내지 800 ng 또는 23 ng 내지 750 ng일 수 있다. 효모 유래 tRNA의 사용량은 상기 사용량 범위 내에서 핵산을 트랩하여 침전을 형성하고, 이에 따른 miRNA 추출 효율성이 우수하다.

아울러, miRNA 추출량을 증가시키기 위해서는 상기의 아세트산 나트륨, 글리코겐 및 효모 유래 tRNA의 첨가 후 인큐베이션을 수행하는 것이 바람직하며, 인큐베이션 온도 조건은 이에 제한되지는 않으나 -60℃ 내지 -100℃, -65℃ 내지 -95℃, -70℃ 내지 -90℃, 또는 -80℃의 온도 조건에서 수행될 수 있다. 또한, 인큐베이션 시간은 이에 제한되지는 않으나 30분 내지 3시간, 45분 내지 2시간, 55분 내지 1시간 30분, 또는 1시간 동안 수행될 수 있다. 상기 시간 범위 내에서 인큐베이션이 수행될 시 핵산의 침전 형성에 도움 되고, 이에 따른 miRNA 추출 효율성이 우수하다.

단계 (c): 인큐베이션 후 원심분리하여 상층액에서 miRNA가 포함된 총 RNA 펠릿 추출물의 수득

본 단계는 miRNA가 포함된 총 RNA를 추출하기 위한 단계 (b)의 인큐베이션이 완료되면, 원심분리하여 miRNA가 포함된 총 RNA 펠릿 추출물을 수득하는 단계이다. 총 RNA 펠릿 추출물을 수득하기 위하여 고속 또는 저속 원심분리기를 사용할 수 있다. 당업자라면 목적에 맞도록 적합한 원심분리기 및 원심분리 시간을 선정할 수 있으며, 자이로젠(Gyrozen) 원심분리기를 이용할 수 있다.

자이로젠 원심분리기를 이용할 경우, 이에 제한되지는 않으나, 18,000 RCF 내지 22,000 RCF, 또는 19,000 RCF 내지 21,000 RCF 또는 20,000 RCF의 속도로 수행할 수 있다. 또한, 원심분리 시간은 이에 제한되지는 않으나, 20분 내지 40분, 25분 내지 35분, 또는 30분 동안 수행할 수 있다.

상기 단계 (c)에서 원심분리 후 펠릿 형태로 추출된, miRNA가 포함된 총 RNA는 에탄올 세척을 진행하지 않는 것이 바람직하다.

기존의 트리졸 시약을 사용한 miRNA 추출법은 본 단계에서 수득한 RNA 펠릿에 있을 불순물을 제거하기 위해 75% 에탄올로 세척하는 것을 권장하지만, 본 발명에서는 세척 과정을 생략하는 것이 더 바람직한 결과를 얻음을 확인하였다(도 4 참조).

단계 (d): miRNA가 포함된 총 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하는 단계

본 단계는 상기 단계 (c)에서 수득한 miRNA가 포함된 총 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하는 단계이다.

상기 단계 (d)는 (d-1) 총 RNA 펠릿에 DNA 분해효소(DNase)를 첨가하는 단계; 및 (d-2) RNA 중합 효소 및 역전사 효소를 첨가하는 단계;를 포함한다.

상기 단계 (d-1)은 총 RNA 펠릿에 존재할 수 있는 DNA를 분해시키는 단계로서, 구체적으로 miRNA가 포함된 총 RNA 펠릿을 30 ㎕의 RNase-프리 정제수(RNase-free water)에 녹인 후, 분석에 방해가 될 수 있는 DNA를 제거하기 위해 DNA 분해 효소(DNase I)를 처리한 단계이다. 이때 바람직하게 RNA 샘플에 0.05 unit의 DNase I 및 버퍼를 첨가한 후, 37℃ 온도 조건에서 30분 동안 인큐베이션하고, 1 ㎕의 0.15 M EDTA 추가한 후 80℃ 온도 조건에서 5분 동안 인큐베이션을 진행하여 DNase I의 활성을 없앤다.

상기 단계 (d-2)는 총 RNA 펠릿에 존재하는 miRNA를 안정성이 더 높은 cDNA로 만들기 위해, 총 RNA 펠릿에 RNA 중합 효소 및 역전사 효소를 첨가하는 단계이다. 본 발명의 일실시예에서는, 간편한 단일 반응으로 cDNA를 합성하기 위해 Mir-X™ miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara, Japan)에 포함된 RNA 중합 효소 및 역전사 효소를 사용하여 수행하였다.

이에 제한되지는 않으나, 상기 RNA 중합 효소는 폴리(A) 폴리머라아제 (Poly(A) polymerase)이고, 상기 역전사 효소는 HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나 이상일 수 있다.

구체적으로, 상기 RNA 중합 효소인 폴리(A) 폴리머라아제는 RNA의 3' 말단에 아데노신을 붙이는 효소이며, 상기 역전사 효소는 역전사 활성, 즉 RNA를 주형으로 하여 여기에 상보적인 DNA를 합성하는 활성을 갖는 효소이면 되고, 예를 들어 모로니 마우스 백혈병 바이러스 유래 역전사 효소 (MMLV 유래 역전사 효소)나 트리 골수 아구증 바이러스 유래 역전사 효소 (AMV 유래 역전사 효소) 등의 바이러스 유래의 역전사 효소, 호열성 바실루스 (Bacillus) 속 세균 유래 DNA 폴리머라아제 (Bca DNA 폴리머라아제 등) 등의 진정 세균 유래의 역전사 효소, 테르무스 (Thermus) 속 세균 유래의 역전사 활성과 DNA 의존성 DNA 폴리머라아제 활성을 겸비하는 DNA 폴리머라아제 (Tth DNA 폴리머라아제 등)가 예시된다.

단계 (e): 수득한 cDNA를 증폭하여 목적하는 miRNA를 검출하는 단계

본 단계는 상기 단계 (d)에서 수득한 cDNA를 증폭하여 목적하는 miRNA를 검출하는 단계로, 목적하는 miRNA에 상응하는 정방향 프라이머, 유니버셜 리버스 프라이머(universal reverse primer), 및 형광물질을 이용하여 실시간(real-time) qPCR을 실시하여 cDNA를 증폭시킴에 따라 목적하는 miRNA를 검출하는 단계이다.

상기 형광물질은 SYBR Green 계열의 형광물질일 수 있다. 상기 SYBR Green 계열의 형광물질은 시아닌(cyanine) 계 염료로, 이에 제한되지는 않으나, SYBR Green I 염료일 수 있다.

구체적으로, Mir-X™ miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara, Japan)를 사용해 간편한 단일 반응으로 cDNA를 합성한 후, SYBR^ⓡ Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO, Cat. No. QPK-201)와 분석하고자 하는 miRNA(목적 miRNA)에 상응하는 프라이머(primer), 유니버셜 역방향 프라이머(universal reverse primer)를 넣고, qPCR(Bio-Rad, USA)을 이용하여 목적 miRNA의 양을 분석하였다.

miRNA의 농도는 △△C_t법(delta-delta C_t method, Comparative CT method)을 사용해 상대 정량한다. △△C_t법은 목적 miRNA와 참조물질의 발현량을 측정해 참조물질에 대한 목적 miRNA의 발현량을 표준화시키고, 실험군과 대조군의 miRNA의 발현량을 비교하는 방법이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 혈장 시료 내에 극미량으로 존재하는 miRNA를 qPCR로 검출하기 위한 최적의 조건을 제시한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 혈장 시료 내 RNA 분리 시 상층액에 qPCR 분석 저해 요인이 존재함을 확인

혈장 시료 또는 물 250 ㎕에 참조물질(miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control, Cat.NO. 219610, Qiagen; 동결건조된 C.elegans miR-39 miRNA 모방체(mimic))을 첨가한 후 750 ㎕ Trizol^® LS 시약과 200 ㎕ 클로로폼을 사용하여 RNA를 포함한 상층액을 분리하였다. 이때 각 샘플에서 200, 300, 400 및 500 ㎕씩 다른 양의 상층액을 분리한 후, 글리코겐, 효모 유래 tRNA 및 이소프로판올을 추가하였다. 이후 1시간 동안 -80℃에서 인큐베이션한 후 펠릿(pellet)의 형태로 miRNA를 포함한 총(total) RNA를 추출하였다. qPCR을 사용하여 분석하기 위해서, 총 RNA 시료에 DNase I을 처리한 후, Mir-X™ miRNA First-Strand Synthesis Kit(Takara, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 SYBR Green Mix와 참조물질의 정방향 프라이머(Ce_miR-39_1 primer, Qiagen, Netherlands)와 유니버셜(universal) 역방향 프라이머(Qiagen, Netherlands)를 넣고, qPCR을 이용하여 참조물질의 양을 분석하였다.

도 2의 A 및 도 2의 B는 각각 물 및 혈장 시료에서 추출한 참조물질의 qPCR 결과로, 전체적으로 혈장 시료에서 추출한 참조물질의 C_T값이 물에서 추출한 값보다 크게 나오는 것을 확인하였다. 또한 상층액의 양에 비례해서 참조물질의 양이 늘어남에 따라 C_T 값이 감소하는 물과 달리 혈장 시료를 사용한 경우에는 오히려 C_T 값이 증가함을 확인하였다. 이로써 혈장 시료에서 회수한 수용액 층에 qPCR 분석을 저해하는 요인이 존재함을 확인하였다.

실시예 2: 혈중 내 miRNA의 qPCR 분석 효율성 증대를 위한 상층액 최적의 양 확립

상기 실시예 1에서 합성된 cDNA에 SYBR Green Mix와 목적 miRNA의 정방향 프라이머와 유니버셜 역방향 프라이머를 넣고, qPCR을 이용하여 목적 miRNA의 양을 분석하였다. 이때 목적 miRNA의 정방향 프라이머는 miR-16 프라이머 (5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'; 서열번호 1) 또는 miR-155 프라이머 (5'-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGTT-3'; 서열번호 2)를 각각 사용하여 분석하였다.

도 3의 A 및 도 3의 B는 각각 혈중 내에 높은 농도로 존재하는 miR-16 및 낮은 농도로 존재하는 miR-155의 qPCR 결과로, 분리한 상측액 양에 비례해서 C_T 값이 감소하는 miR-16(도 3의 A)와 달리 miR-155(도 3의 B)의 경우는 상층액 양과 관련 없는 C_T 값의 양상을 보였다. 이러한 양상은 혈중 내에 존재하는 목적 RNA의 농도를 고려해 보아야 함을 시사한다. 외부에서 넣어 준 참조물질의 농도(5.6×10⁸ copies)가 miR-16과 miR-155 농도의 중간 정도로, 혈중 내에 존재하는 miRNA의 농도가 높으면 qPCR 결과 저해 요인에 영향을 크게 받지 않으나, 농도가 낮을수록 크게 영향을 받음을 알 수 있었다.

상층액의 양에 비례해 회수되는 miRNA의 양이 증가함과 동시에, qPCR 분석을 저해하는 요인 또한 늘어남을 유추할 수 있다. 도 2 및 도 3을 통해 알 수 있듯이, 혈중 내에 존재하는 극미량의 miRNA의 qPCR 분석의 효율성 증대를 위해서, 목적 miRNA의 양을 충분히 확보하면서 qPCR 분석에 영향을 최소로 미칠 수 있는 최적의 상층액의 양은 400 ㎕이라는 것을 확인하였다.

한편, 일반적으로 나노드롭(nanodrop)을 사용하여 총 RNA의 양을 측정하고, 이를 토대로 적정 농도의 총 RNA를 취하여 실험에 적용하는 것이 통상적이다. 그러나, 세포나 조직에서 추출한 총 RNA와 달리 혈장 샘플로부터 추출한 총 RNA의 경우에는 그 농도가 현저히 낮아 나노드롭으로 총 RNA의 농도를 측정할 시 부정확할 뿐 아니라, RNA 분리시 사용한 트리졸 시약에 들어있는 페놀에 의해 흡광도에 간섭 현상을 유발하여 정확한 총 RNA의 양을 측정하기가 어렵다. 아울러 나노드롭 측정을 통해서는 목적 miRNA, 예컨대, miR-16 또는 miR-155와 같은 혈중 내 존재하는 특정 목적 miRNA의 양을 검출할 수 없다.

하기 표 1에는 나노드롭을 이용하여 혈장 샘플로부터 분리한 상층액 양에 따른 총 RNA의 농도를 측정하여 나타내었다.

상층액 양(㎕)	농도 (ng/㎕)
200 ㎕	104.1
300 ㎕	146.5
400 ㎕	210.1
500 ㎕	228.6

상층액 양에 따른 총 RNA의 농도 측정 결과, 상층액 양에 따라 총 RNA 농도가 증가하는 양상을 나타내었으나, 페놀에 의한 간섭 현상으로 인해 정확한 농도 값으로 간주하기 어려울 뿐 아니라, 실질적으로 검출하고자 하는 목적 miRNA로서, 특히 혈중 내 낮은 농도로 존재하는 것으로 알려져 있는 miR-155(도 3의 B)의 경우에는 상층액 양 및 양에 따른 총 RNA의 농도와 관련 없는 C_T 값의 양상을 보인 바, 총 RNA 농도가 높다고 하여 목적 miRNA 검출시 그 검출 효율이 우수한 것이 아님을 알 수 있었다.

이는 상층액의 양에 비례해 회수되는 miRNA의 양이 증가함과 동시에, qPCR 분석을 저해하는 요인 또한 늘어날 수 있음을 유추하게 하는 결과로서, miR-155와 같이 혈중 내 극미량으로 존재하는 miRNA의 qPCR 분석의 효율성을 증대하기 위해서는 부정확성을 띌 가능성이 있는 총 RNA 농도를 기반으로 하여 극미량의 miRNA를 검출하기 보다는, 소량의 혈장 샘플로부터 분리한 상층액의 최적의 양을 기반으로 qPCR 분석의 저해요인을 최소화함으로써 극미량의 miRNA를 검출하는 것이 더 정확하고 효율적임을 알 수 있었다.

실시예 3: RNA 펠릿의 세척 여부에 따른 추출 회수율을 qPCR을 사용하여 확인

기존의 트리졸 시약을 사용한 miRNA 추출법에서는 RNA 펠릿에 존재할 수 있는 불순물을 제거하기 위해 75% 에탄올로 세척하는 것을 권장하는데, 혈장 시료의 경우에는 RNA의 양이 극미량 존재하여 세척 시 RNA가 손실될 우려가 더 크다. 이에, 세척할 경우 펠릿에 존재할 수 있는 불순물보다 RNA 손실에 의해 분석 결과에 더 큰 영향을 미칠 수 있으므로, 세척 단계를 없애는 것이 바람직하다. 이에, RNA 펠릿의 세척 여부에 따른 추출 회수율을 qPCR을 확인하였다.

구체적으로, 250 ㎕의 혈장 시료를 이용하여, 상기 실시예 1의 방법으로 RNA가 포함된 400 ㎕의 상층액을 분리한 후 RNA 펠릿을 얻었다. 이때 RNA 펠릿을 75% 에탄올로 세척한 것과 세척하지 않은 것으로 준비하고, 다음 단계로 진행해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 상기 실시예 2에서 진행한 방법으로 참조물질(동결건조된 C.elegans miR-39 miRNA 모방체)과 목적 RNA인 miR-16과 miR-155를 사용하여 qPCR로 분석하였다.

도 4는 miR-16과 miR-155를 각각 참조물질로 우선 표준화하고, RNA 펠릿을 세척하지 않은 경우를 세척한 경우에 대해 목적 miRNA를 상대 정량한 결과로, 세척하지 않았을 때 miR-16은 약 3.2배, miR-155는 약 1.2배 더 높은 농도 결과를 얻었다.

실시예 4: 소량의 혈장 시료를 사용할 시에도 적용이 가능함을 확인

1×PBS 200 ㎕를 첨가한 혈장 시료 50 ㎕를 이용하여, 상기 실시예 1의 방법으로 RNA가 포함된 400 ㎕의 상층액을 분리한 후 RNA 펠릿을 얻었다. RNA 펠릿은 세척하지 않고, 다음 단계로 진행해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 상기 실시예 2에서 진행한 방법으로 참조물질(C.elegans miR-39 miRNA 모방체)과 목적 RNA인 miR-16과 miR-155를 사용하여 qPCR로 분석하였다.

도 5의 A 및 도 5의 B는 각각 miR-16과 miR-155의 C_T값 및 참조물질로 표준화한 △C_T값을 도출하여 나타낸 도로, 소량의 혈장 시료에서도 바람직한 분석 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

실시예 5: 소량의 혈장 시료를 사용할 시에도 적용이 가능함을 재입증

50 ㎕, 100 ㎕, 200 ㎕ 및 250 ㎕의 각각의 혈장 시료를 이용하여 상기 실시예 1의 방법으로 RNA가 포함된 400 ㎕의 상층액을 분리한 후 RNA 펠릿을 얻었다. 이때, 50 ㎕, 100 ㎕ 및 200 ㎕의 혈장 시료의 경우에는 1×PBS를 첨가하여 총 용량이 250 ㎕가 되도록 조정한 후 사용하였다.

상기 얻은 RNA 펠릿은 세척하지 않고, 다음 단계로 진행해 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 상기 실시예 2에서 진행한 방법으로 참조물질(C.elegans miR-39 miRNA 모방체)과 목적 RNA인 miR-16과 miR-155를 사용하여 qPCR로 분석하였다.

도 6의 A 및 도 6의 B는 각각 miR-16 및 miR-155의 C_T값을 도출하여 나타낸 도로, 소량의 혈장 시료에서 바람직한 분석 결과를 얻을 수 있음을 재확인하였다. 구체적으로, 혈중 내 높은 농도로 존재하는 miR-16(도 6의 A)의 C_T 값이 사용한 혈장 시료의 양에 비례해서 감소한 것과 달리, 혈중 내 낮은 농도로 존재하는 miR-155(도 6의 B)의 경우에는 혈장 시료의 양과 관련 없는 C_T 값의 양상을 보였다. 이러한 양상은 실시예 2에서와 마찬가지로 혈중 내 존재하는 miRNA의 농도가 높으면 qPCR 결과 저해 요인에 영향을 크게 받지 않으나, miR-155와 같이 농도가 낮을수록 크게 영향을 받음을 알 수 있었다.

즉, 실시예 2에서와 같은 맥락으로 혈장 시료의 양에 비례해서 qPCR 분석을 저해하는 요인 또한 늘어나게 됨을 유추할 수 있는 결과로, 최적의 혈장 시료 양을 기반으로 하여 저해요인의 영향을 최소화하는 것이 바람직함을 알 수 있었다.

따라서, 상기 일련의 결과를 통해 qPCR 분석의 저해요인을 최소화하여 극미량의 miRNA의 검출 효율을 증대시키기 위해서는 소량의 혈장 샘플로부터 분리한 상층액의 최적의 양을 기반으로 하여 qPCR 분석의 저해요인의 영향을 최소화함으로써 혈중 내 극미량으로 존재하는 miR-155의 같은 miRNA를 정확하고 효율적으로 검출할 수 있는 유의한 결과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Methods for increasing the detection efficiency of trace amounts of miRNA in the blood <130> DP-2019-0070 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-16 primer <400> 1 tagcagcacg taaatattgg cg 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-155 primer <400> 2 ttaatgctaa tcgtgatagg ggtt 24

Claims

다음 단계를 포함하는 혈장 내 극소량 존재하는 miRNA 검출 효율을 증가시키는 방법:
(a) 혈장 시료에 트리졸 시약을 첨가하고 원심분리한 후 상층액을 분리하는 단계;
(b) 상기 분리한 상층액에 글리코겐(glycogen) 및 효모 유래 tRNA를 첨가하고 인큐베이션하는 단계;
(c) 인큐베이션 후 원심분리하여 miRNA가 포함된 총(total) RNA를 펠릿(pellet) 형태로 추출하는 단계;
(d) 상기 총 RNA를 역전사시켜 cDNA를 수득하는 단계; 및
(e) 상기 수득한 cDNA를 증폭하여 목적하는 miRNA를 검출하는 단계를 포함하며,
상기 단계 (a)에서 혈장 시료의 양은 10 ㎕ 내지 300 ㎕이며,
상기 단계 (a)에서 분리하는 상층액의 양은 380 ㎕ 내지 420 ㎕이고,
상기 단계 (b)에서 글리코겐의 농도는 혈장 시료의 양 10 ㎕ 내지 300 ㎕에 대하여 0.5 ㎍ 내지 120 ㎍이고, 효모 유래 tRNA는 20 ng 내지 1000 ng이며,
상기 단계 (d)는 (d-1) 총 RNA 펠릿에 DNA 분해효소(DNase)를 첨가하는 단계; 및 (d-2) RNA 중합 효소 및 역전사 효소를 첨가하는 단계;를 포함하는,
방법.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 인큐베이션은 -60℃ 내지 -100℃에서 30분 내지 3시간 동안 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 펠릿 형태로 추출된, miRNA가 포함된 총 RNA는 에탄올 세척을 진행하지 않는 방법.
삭제
제1항에 있어서, RNA 중합 효소는 폴리(A) 폴리머라아제 (Poly(A) polymerase)이고, 역전사 효소는 HIV, MMLV, 및 AMV로부터 유래된 하나 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (e)는 목적하는 miRNA에 상응하는 정방향 프라이머, 유니버셜 리버스 프라이머(universal reverse primer), 및 형광물질을 이용하여 실시간(real-time) qPCR을 실시하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 형광물질은 SYBR Green 계열의 형광물질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 혈장 시료 내 miRNA가 포함된 총 RNA 추출 과정 중에 발생할 수 있는 qPCR 분석의 저해요인을 최소화한 것인 방법.