CN1954085A - Rna的微阵列检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过微阵列检测和定量RNA的方法。本发明具体涉及一种方法，其中第一DNA分子被加到待检测RNA池中，该第一DNA分子至少与感兴趣RNA的第一区段互补，以及与该感兴趣RNA的第二区段互补的第二DNA分子，该第二区段与所述第一区段不同并且进一步在3′端和5′端具有特异性核苷酸序列，这些序列并不与感兴趣RNA互补。在允许互补链杂交的条件下DNA分子与RNA池接触。然后移除未与所述第一DNA分子杂交的所有RNA分子。第二DNA分子释放后，它们与一个阵列接触，所述阵列在特定位置具有对特定核苷酸序列有特异性的探针。

Description

RNA的微阵列检测
技术领域
本发明涉及一种用微阵列检测和定量RNA的方法。尤其是本发明涉及一种方法，其中第一DNA分子被加到待检测的RNA池中，该第一DNA分子至少与感兴趣RNA的第一区段互补，并且其中第二DNA分子也被加入，其互补于感兴趣RNA的第二区段，该第二区段与所述第一区段不同。DNA分子在允许互补链杂交的条件下与所述RNA池接触。在RNA和形成的异源双链体分离后，第二DNA分子被释放，并且确定其在微阵列上的存在。
背景技术
基因的差异转录以及伴随的蛋白质生成改变在生物系统中被用于适应外部变化的影响或实现细胞向不同表型的分化。在细胞中，也可以出现由外部影响引起基因组的改变，其导致基因组DNA中核苷酸序列的改变，并且作为结果其导致修饰蛋白质的转录或调节，例如增加，这些基因自身的转录。这样的改变可以对生物过程具有深刻的影响，比如举例来说产生肿瘤细胞等。
根据常规分子生物学方法，这些过程/改变的研究通常存在于“1-基因-1-试验”测试中，然而其仅仅允许测定有限数量的生物过程。
最近，已经开发了所谓的微阵列，它允许同时检测宽泛围的不同生物实体。微阵列通常由用诸如玻璃、硅或尼龙等制造的支持物组成，分子阵列被施加在其上的已知位置。因为在支持物上被所述位置覆盖的区段大约在20-200μm范围，或甚至更小，所以生物分子可以以高密度在支持物上排列。
这些类型的微阵列允许快速和成本有效的评估，例如，生物实体中的基因表达和/或遗传变化。利用作为探针和靶分子的微阵列和核苷酸的常规试验被描述如下：具有约500-2000个碱基大小的探针核苷酸以已知排列被固定在适当载体上，例如玻璃片上。随后待测样品在允许互补链杂交的条件下与支持物接触。非互补链不能跟支持物上的探针杂交，被去除。对微阵列上含有核苷酸双链的位置进行检测，并得出被测试样品中关于核酸序列和数量的结论。
在本领域中微阵列已被用于各种不同的目的。例如，在各自的方法中微阵列被用于分析细胞的转录/表达谱，从而用于检测和表征由特定细胞所表达的mRNA序列的整体情况。(参见Lockhart et al.，Nat.Biotechnol.14(1996)，1675-1680)。
这种试验的缺点至少部分地在于待测样品的纯度，其中在一些情况下待测样品被污染，污染可能有效地阻碍特异性杂交，而特异性杂交对于获得可信的结论是必需的。尤其是，用于mRNA纯化的化学物如苯酚，或生物分子随后的标记效率也可以干扰结果。另外一个问题在于待测样品中特异性核苷酸仅存在非常低的量，以致于在大多数情况下这些分子不能通过常规微阵列测试进行检测。
在这些情况下，为在这样的情况中获得信号强度改善，建议扩增起始材料。这方面的一种方法包括从RNA池中制备cDNA，其使用为此目的的聚dT引物，所述引物在5′端含有T7启动子核苷酸序列。在形成异源双链体和碱变性后，第二DNA链利用在cDNA的3′端的发卡结构作为引物被合成，并通过S1核酸酶使其展开形成线性双链。然后DNA双链用作T7-RNA聚合酶的基质。由此获得的RNA接着做为cDNA合成的引物。
这种方法存在缺陷，全部RNA池被扩增，然而分别产生核糖核苷酸和cDNA分子的群体，其在量上不对应它们在原始群体中的存在百分比。此外，会产生假像，其干扰随后的分析。
一种检测水样品中病毒污染的方法公开于Regan，P.M.und Margolin，A.B.(Journal of Virological Methods 64(1997)，65-72)。脊髓灰质炎病毒RNA通过使用磁珠被分离，并与生物素化寡核苷酸探针杂交。杂交探针随后被扩增和检测。
在Armour，A.L.et al.(Nucleic Acids Research Vol.28，No.2(2000)，605-9)中公开了检测不同遗传座位上的拷贝数。测试DNA经变性，固定到滤膜上并与过量探针进行杂交。洗涤步骤后，结合的探针被扩增和定量。
检测样品中特定生物的方法公开于WO 00/77260。待检测生物基因组DNA的特征区段与特异性探针杂交、并被选择性扩增和检测。
检测目标DNA中缺失、尤其是包含上千碱基长度缺失的方法公开子Sellner，L.N.and Taylor，G.R.(hunam mutation 23(2004)，413-9)。所述方法包括多重可扩增探针的杂交(MAPH)和多重连接依赖的探针扩增(MLPA)，这两者都依赖于探针与目标DNA的序列特异性杂交。杂交探针被扩增并且半定量地检测获得的PCR产物。例如ART-MLPA公开于Eldering，E.et al.(Nucleic Acids Research 31(23)(2003)，53)。所述方法被用于从样品中检测几个转录本并且允许精确鉴定转录模式。
扩增信号的替代方法在于样品本身的信号通过例如酶反应来扩增。
迄今为止，本领域中没有已知方法可以产生满意和可靠的测试灵敏度，也没有方法可以实现以可靠方式定量检测在所述样品中仅含少量的样品核苷酸，例如RNA分子。
发明内容
因此本发明的一个目的在于提供一种检测RNA群体的改进方法，由此有可能定性和定量检测在细胞中仅以低拷贝数存在的RNA。
该目的已经通过包括以下步骤的检测和定量RNA的方法实现：(a)提供RNA池，(b)在允许互补链结合的条件下，向RNA池加入至少第一DNA分子，所述第一DNA与感兴趣RNA的第一区段互补，和加入至少第二DNA分子，其与所述RNA的第二区段互补，该第二区段不同于所述的第一区段，(c)结合异源双链体分子到支持物上，(d)从异源双链体分子中释放第二DNA分子，和(e)使第二DNA分子与阵列接触，所述阵列在已知位置具有第二DNA分子可以结合的分子。
附图说明
图1示意性显示直至提取检测探针的方法的过程；
图2示意性显示检测探针与阵列杂交的结果；和
图3示意性显示在使用可扩增检测探针条件下方法的过程。
                          定义
在本发明中，术语“核苷酸”包括DNA和RNA，其分别含有作为碱基的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶，和作为结构要素的脱氧核糖和核糖。此外核苷酸也可包含任何修饰(人工)碱基，这些碱基能够至少用上述碱基之一配对(例如肌苷)。这可以用于，例如设计探针，尤其是捕获探针，比如在不同核苷酸序列的特定位置可能需要较低的杂交严谨度。
在本发明中，所有类型的RNA，信使-、转移-和核糖体-RNA(分别为mRNA、tRNA和rRNA)可以被使用。作为一部分，mRNA包含所谓的多聚(A)尾，其不被对应的DNA编码，它是这类RNA的特征并且与对应的多聚-dT序列杂交。
术语“转录本”不仅涉及RNA，而且涉及所述RNA在对应DNA分子中的拷贝。
表述“差异转录”描述特定基因的转录，其在特定状态下被细胞激活。RNA也被表示为在细胞中的某种拷贝数，这就给出关于每个细胞中含有RNA分子的平均数的指标。例如特定RNA的低拷贝数在每个细胞中约1-50个分子范围。
在作为捕获和检测分子的情况下，“核酸”可以是长度高达1000个核苷酸的长链多聚核苷酸。阵列上的核酸代表检测探针可以杂交的核苷酸序列，这些核酸通常是较短的多聚核苷酸和/或寡核苷酸，并且或者通过化学共价键或者粘附到阵列的支持物上而被固定化。固定化核酸的长度范围包括至少约10-约500个核酸(10个单体-500个单体)，优选约10-约100个，更优选约20-约80个核酸，甚至更优选至少约20-约50个核酸，以及至少约20-约40个核酸，最优选至少约20-约30个核酸。这些核酸可由本领域技术人员以众所周知的方式合成。
本文中所用的术语“异源双链体”涉及DNA/RNA杂合体。上述术语通常指来自不同来源的单链通过退火形成的任意杂交双链。如果在链间存在序列差异，这个异源双链体可表现出单链环或泡(未配对的区域)。
本发明中所用的术语“杂交”描述在严谨条件下一个分子或一个分子的一部分与另一个分子或另一个分子一部分的连接/结合/形成双联体并形成氢键。在本文中，杂交事件是指发生可检测的杂交，并且可由本领域技术人员通过任何公知方法检测，例如化学发光、共聚焦激光诱导荧光、比色法、电化学、放射性和表面共振。
对于杂交特别重要的、以及当其发生时的最佳条件是选用于杂交的条件的严谨性。严谨性涉及杂交期同的温度、离子强度条件、pH和是否存在某些有机溶剂和/或去污剂。严谨性越高，杂交核苷酸序列之间需要达到的互补性水平越高。术语严谨条件指只有具有高频率互补碱基的核酸将杂交的条件。高严谨性条件可以通过选择高温和低盐浓度实现，而低温、高盐浓度和溶剂如二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)有利于非特异性杂交反应。对于核酸杂交不同严谨性条件在Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，3rd Edition(ISBN 0879695773)中举例说明。
本文中所用的术语“扩增”是指特异性DNA片段拷贝数的增加；在本发明中(扩增捕获探针)这是在体外。体外扩增通过PCR(聚合酶链式反应)进行，这对本领域技术人员是众所周知的技术。
“微阵列”包含支持物或载体，其可以通过任何常规材料生产，例如玻璃、硅、二氧化硅、塑料如尼龙、金属及其混合物，进一步说例如可以具有盘状、板状、凝胶层和/或珠状的形式。支持物在它的表面上有几个单独区，这些区具有特定核苷酸序列，其可以结合(通过杂交)至各自的核苷酸序列，在本发明中为检测探针，并在微阵列上产生特异性模式。如果目标序列被适当标记，那么可以在结合位点处检测、鉴定和定量信号。信号的强度允许进一步估计样品中存在的目标序列的量。待鉴定的核苷酸序列可以在杂交前进行标记。
“标记”或“标签”对本领域技术人员是众所周知的，并且例如可以在扩增目标序列期间通过掺入标记核苷酸或者作为替代通过将标志物连接至杂合体(扩增子)上而实施。对于在扩增反应期间掺入标记核苷酸的情况下，可以获得更高的测试灵敏度，这取决于杂交目标分子中扩增序列的长度和标记物的量。标记或标签可以通过放射显影、荧光、比色法或由电脉冲介导而实施。适合的标记物包括，例如，生物素、地高辛、二硝基苯酚或类似物。标记和标记物的检测这两类技术对本领域技术人员都是众所周知的。
在本发明中优选使用的最常用的“荧光染料的检测方法”是共聚焦激光诱导荧光，其中杂交事件通过使用以荧光染料形式连接到探针核酸的标记分子进行检测。这些染料包括例如花青染料(cyanine)，优选Cy3和/或Cy5，新生染料(renaissance)，优选ROX和/或R110，和荧光染料，优选FAM和/或FITC。
“诊断试剂盒”包含实施本发明方法的各种工具(例如化学物、缓冲剂、手册等)。
具体实施方式
本发明涉及，通过连接序列特异性RNA纯化和微阵列分析，通过微阵列对RNA进行快速和高灵敏度的定性和定量检测的方法。
为实现本发明方法，第一步中提供RNA池，例如由细胞供给的RNA池。细胞中所含的RNA可以直接使用，即细胞裂解物可以直接使用，没有必要专门纯化其中所含总RNA或mRNA。这有特别的好处，通过省略这样的纯化步骤没有干扰可以发生，例如对于特异性RNA的群体，尤其是对于低拷贝数的RNA。自然，如果期望，RNA可以分别通过常规方法纯化和分离，例如描述于Sambrook et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，3rd Edition(ISBN 0879695773)。
随后步骤中RNA将与至少第一DNA分子接触，其被称为“捕获探针”，并进一步与第二DNA分子接触，在此其被称为“检测探针”。
第一核苷酸具有与感兴趣RNA第一区段互补的序列，该第一区段不同于所述第二区段，第二区段与检测探针杂交。在一方面，这个序列可以是多聚-dT，因为捕获探针仅仅结合到整个RNA池中的mRNA上。作为替代和优选地，这个序列可以互补于特定感兴趣RNA(即待测RNA)的第一区段，基本上其对该RNA和相关RNA分子(如基因家族的转录本)分别具有特异性。在这种情况下，捕获探针的杂交仅出现于各自的感兴趣RNA或特定转录本。通常捕获探针的长度为40-200个核苷酸，优选为40-100个，更优选为40-80个核苷酸。
捕获探针除了有与感兴趣RNA杂交的第一区段外，还具有第二区段，通过该第二区段分别能进行或辅助从混合物中特异性分离捕获探针。这个区段可以是任一组结合系统，比如特定的核苷酸序列(其互补性核苷酸序列被设想为其结合伴侣)，或者另一种分子，如生物素、地高辛、二硝基苯酚或类似物。
该第二核苷酸具有与感兴趣RNA分子的特异性第二区段互补的序列。该第二区段通常代表待测定的区段，例如对于核苷酸序列上的突变，或代表对特定RNA有特异性的区段，因此可以检测该RNA是否存在。检测探针长度通常为约20-1000个核苷酸，优选约20-500个，更优选分别为约30、40或50-200个核苷酸。
检测探针和捕获探针在允许互补链杂交的条件下跟RNA池接触。因此，检测探针特异性地结合到感兴趣RNA上，即RNA的特定互补区段，同时捕获探针或者结合到所有mRNA(当使用多聚-dT序列时)或结合到特定基因家族的RNA，它们具有基本相同的序列(通过使用对基因家族为一致性的序列)，或结合到特异性感兴趣RNA(通过使用对特定感兴趣RNA有特异性的序列)。
以这种方式获得的混合物包含游离RNA(所用DNA分子没有与之结合)，游离检测和捕获探针，以及RNA+检测探针+捕获探针和RNA+捕获探针的异源双链体，所述混合物现与允许分别特异性提取、离析或分离所有分子的手段接触，其中存在捕获探针的第二区段，即捕获探针本身和任何与之杂交的RNA分子。
如果捕获探针具有做为第二区段的核苷酸序列，那么可以使用用于提取DNA分子的手段，该DNA分子可以固定到载体或其上并与(捕获探针的第二区段的)所述核苷酸序列互补。做为载体每种可与核酸结合的合适材料都可以使用，比如微珠(跟混合物接触)、或柱子(混合物在其上通过)。其它的适合载体包括例如尼龙膜或经改性的玻璃或塑料表面。
作为替代，捕获探针的第二区段可以是存在合适结合伴侣的基团/分子，它可以与如上举例的载体结合。实例通常包括抗原，例如半抗原如二硝基苯酚或地高辛(与的抗体)，或生物素(与作为结合伴侣结合到载体的链亲合素或亲合素)。
未结合的物质，即所有不含捕获探针的分子(没有与捕获探针结合的RNA；游离检测探针)被移除，例如通过洗涤支持物和去除不通过结合伴侣结合到支持物的物质，或者通过吸微珠和洗涤步骤，使得在获得的混合物中只有捕获探针和取决于在捕获探针和RNA(例如mRNA、或基因家族的RNA)之间的捕获探针异源双链体的选定序列，以及异源双链体，该异源双链体具有捕获探针和检测探针以及相应的感兴趣RNA。如上所述，如果捕获探针互补于感兴趣RNA的一个区段，在期望高特异性情况时它是特别有利的，因为在提取/分离步骤中基本上只有也结合捕获探针的RNA被共分离。
然后，结合在RNA上的检测探针被释放。这可以通过异源双链体链的变性实施，例如通过化学处理，例如用弱碱溶液，或酶处理，例如通过用RNA降解酶如RNAse降解。因此获得游离和未结合的探针用于进一步分析。
在一个优选实施案方案中，检测探针在其各自的5′端和3′端有两个额外的区段，这就允许检测探针的扩增。各自的5′端和3′端进一步在所述区段旁侧，该区段互补于感兴趣RNA的特定RNA序列。这些区段可以是核苷酸序列，它们在随后经PCR扩增步骤中可以作为引物的结合位置。这些核苷酸序列通常具有的序列和长度，在杂交中不会不利地干扰对感兴趣RNA有特异性的序列，长度通常包含约10-25个核苷酸，优选约12-约18个核苷酸。作为替代，这两个区段可以具有T3和T7启动子的核苷酸序列，这就允许通过体外转录进行线性扩增。
代表感兴趣RNA精确映像的检测探针，或者是直接与阵列接触，或者是在接触步骤之前通过各自的方式扩增，例如见Sambrook et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，3rd Edition(ISBN0879695773)。
对于检测探针与阵列上特定位置结合的检测，利用连接在检测探针上的标签。这种标签可以在它与捕获探针一起与RNA池接触之前被连接到检测探针上(在步骤(a)中)，或可在从异源双链体中释放检测探针后被掺入，即在步骤(d)后。
根据一个优选实施方案，具体地，在准备检测低转录本数的RNA的情况下，在步骤(d)后扩增检测探针。在扩增过程中标签可以掺入产生的新分子中，例如放射性核苷酸，或与之连接，例如通过标记物如生物素、地高辛或二硝基苯酚间接标记，然后分别通过与链亲合素或或特异性抗体结合的荧光染料显示。
在任选的扩增步骤后，检测探针将与阵列杂交，所述阵列在已知位置具有特定的分子，检测探针可以与所述特定分子结合。阵列通常附着在支持物上，例如玻璃、硅支持物、二氧化硅、金属、聚合物质/塑料或其混合物，并可以具有圆盘状、板状、凝胶层和/或珠状。
阵列上的分子一般是具有不同序列的核苷酸，也可以是系统如抗原-抗体中的结合伴侣，其中结合伴侣位于检测探针而另外的位于阵列上。在一个优选实施方案中，分别具有不同序列的寡-和多聚核苷酸在支持物上以已知方案排列，也即阵列。从而检测探针将结合到阵列上的位置，在该位置互补性核苷酸序列被附着到支持物上。
通过杂交反应在阵列上获得的模式，以及信号的强度可指示转录本在细胞系统中的定性和定量存在。
本方法尤其适合于检测感兴趣基因的差异转录，例如作为对外界改变的环境条件的应答，例如通过细胞与跟化学剂接触，或细胞的发育阶段。作为替代，本方法可用于定量检测选择性剪接的RNA产物或简单地用于分析特定转录本中的突变。
本文公开方法的优点尤其在于，它不依赖于基本完整或全长RNA分子的存在。本方法也可成功地用于存在部分降解RNA中，附带条件是检测探针和捕获探针结合到该RNA上的区段基本上是完整的。
在替代性实施方案中，在第一步(a)中可以使用几种检测探针，所有这些检测探针都对一个感兴趣RNA分子和对一个特异性序列具有特异性，其基于例如感兴趣基因中的突变。例如，如果一个基因中已知发生点突变，可以使用各自携带不同标签的两种检测探针，使得两个检测探针中的任一个与RNA上指定区段的结合，这取决于序列，即突变，可以指示所调查样品中是否存在突变或者是天然序列。
在一个替代性实施方案中，可以使用对于一个给定RNA分子的多于一个检测探针用于同时检测是否存在多于一个突变。
同样，在对于一个指定RNA分子使用多于一个检测探针的情况下，选择对感兴趣RNA的一个区段(比如含或不含突变的区段)具有特异性的一个检测探针，同时第二检测探针结合到感兴趣RNA的另一个区段。在阵列上杂交步骤中，对于阵列上这两个位置上必须获得相同信号强度，从而如果第一检测探针结合至包含假想突变的区段，第二检测探针可以作为阳性对照和内部标记。
作为替代，多于一个检测探针可以被加到RNA池，以同时对不同RNA实施几个检测步骤，比如对转录本中突变具有特异性的检测探针和对非突变转录本具有特异性的检测探针。为获得改进的区分可能性，在使用多于一个检测探针的情况下，检测探针可以可变地用例如不同荧光染料标记。
本发明方法具有高度特异性，因为一方面所述至少一个检测探针以及任选地捕获探针对特定的感兴趣RNA具有特异性。在检测探针对感兴趣RNA具有特异性的情况下，如果检测探针结合到感兴趣RNA并通过结合到捕获探针的方式进行其它方法步骤，在任选的随后扩增步骤中，只有更多量的DNA被获得。如果以这种方式进一步选择捕获探针，它也对感兴趣RNA具有特异性，则第一步骤已包含对感兴趣RNA的选择。
本发明方法另一个优点也在于高度改进的阵列上杂交动力学，这是由于样品的已知长度，尤其是检测探针。因为缺少各自的转录本，只可以出现较长转录本/样品对结合至阵列中支持物的探针的特异性杂交。这使得对结果的干预是不可能的。
实施例目的在于举例说明本发明，并非对其限制。
实施例
a)检查培养基对Hela细胞差异基因表达的变化。
HeLa细胞在培养基1(DMEM培养基，5％FCS)或培养基2(DMEM培养基，20％FCS)中培养两周时间。
105个细胞被用于分离RNA。根据标准方法分离RNA(Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，3rdEdition (ISBN 0879695773)。
检测基因：GAPDH，MMP-19，核糖体蛋白S27a
MMP-19捕获探针：3′-ttcggactga agagtcgttt ggaggggggt cggggttcgg ggaatcccac
MMP-19检测探针：3′-agggaccgga atggggtagt taagaatcga ccggaagttt cgggtagagt
GAPDH捕获探针：3′-gtcttctgac acctaccggg gaggcccttt gacaccgcac taccggcgcc
GAPDH检测探针：3′-accatagca ccttcctgag tactggtgtc aggtacggta gtgacggtgg
S27a捕获探针：3′-aaacgaccgt tcgtcgacct tctacctgca tgaaacagac tgatgttata
S27a检测探针：3′-ggttctaggt cctattcctt ccttaaggag gactagtcgt ctctgactag
检测探针5′端用Cy3标记。
捕获探针5′端用生物素标记。
b)测试条件
分别使用2μg总RNA用于分析。
总杂交体积：50μl；杂交缓冲液：2xSSC，2％SDS；杂交时间：3小时；温度：68℃；检测探针和捕获探针的浓度：都是500nM。
根据制造商手册(Dynal)，通过包被链亲合素的磁珠纯化结合了RNA的捕获探针，所述RNA包括结合的检测探针。在杂交缓冲液中洗涤3次。
在珠子处用RNAse A和RNAse H的混合物进行RNA酶消化。这些分离出来的捕获探针从上清液中被移除，并且在杂交缓冲液中直接杂交到DNA微阵列。
使用的DNA微阵列：DualChipTM人类通用(Eppendorf AG)
杂交根据制造商手册(标准条件)实施。微阵列用Genpix 4000A读值和分析。
c)结果
对所有三种探针的信号进行检测。
GAPDH和S27a在两种制备物中表现出相同的表达水平，培养基2中的MMP-19相比于培养基1中上调了约5倍。

Claims (10)

1.一种检测和定量RNA的方法，其包含以下步骤：
(a)提供RNA池，
(b)在允许互补链结合的条件下，向RNA池添加至少第一DNA分子，所述第一DNA与感兴趣RNA的第一区段互补，和至少第二DNA分子，所述第二DNA分子与RNA的第二区段互补，该第二区段不同于所述第一区段，
(c)结合异源双链体分子到支持物上，
(d)从异源双链体分子中释放第二DNA分子，和
(e)使所述至少一种第二DNA分子与阵列接触，所述阵列在其已知位置连接有分子，所述至少一种第二DNA可以与所述分子结合。
2.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一DNA分子在3′和5′端进一步具有核苷酸序列，其可以用于扩增所述第一DNA分子，并且其中本方法进一步包括在步骤(e)前扩增步骤(d)中释放的所述第二DNA分子的步骤。
3.根据权利要求2的方法，其中所述扩增步骤在使用T3聚合酶或T7聚合酶下通过体外扩增的方式实施。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中使用细胞裂解物作为RNA池。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一DNA分子的长度在50-200个核苷酸的范围并且所述第二DNA分子的长度在40-80个核苷酸的范围。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第二DNA分子的序列对感兴趣RNA具有特异性。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中两个检测探针用于相同的RNA。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中检测探针与阵列上特定区段结合的显示通过放射显影、荧光、比色法或经电脉冲介导来实施。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，用于检测疾病，其依赖于特定基因的转录或结构改变(突变)。
10.一种诊断试剂盒，其包括实施根据前述权利要求中任一项的方法的手段。
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