KR20090071641A

KR20090071641A - 약 ８ 내지 ５０개 뉴클레오티드 길이의 짧은 핵산 서열의 정성적 및 정량적 검출을 위한 신규 방법

Info

Publication number: KR20090071641A
Application number: KR1020097009994A
Authority: KR
Inventors: 페터 데. 브로드만; 도미니크 무르; 랄프 자이파르트
Original assignee: 바이오뤼틱스 아게
Priority date: 2006-10-21
Filing date: 2007-10-19
Publication date: 2009-07-01
Also published as: EP1914317A1; AU2007312534A1; EP2121970A2; IL198546A0; US20100240030A1; CN101611153A; WO2008046645A3; WO2008046645A2

Abstract

본 발명은 특히 생물학적 샘플 물질로부터 약 8 내지 50개 뉴클레오타이드 길이의 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 단편화된 핵산 서열을 정성적으로 및 정량적으로 검출하기 위한 신규 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 짧은 핵산 서열의 증폭 및 정량화를 가능하게 하고 반응의 민감도 및 특이성을 증가시키는, 표적 서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브에 대한 개질된 핵산의 도입에 관한 것이다. 본 발명은 또한 짧은 핵산 서열을 검출하고 정량화하는 핵산 증폭을 수행하기 위한 시험 키트, 그것을 제작하는 방법 및 신규 분석 방법의 용도를 포함한다.

짧은 핵산 서열, DNA 올리고뉴클레오티드, 포획 프로브, 핵산 증폭, 정량화

Description

약 ８ 내지 ５０개 뉴클레오티드 길이의 짧은 핵산 서열의 정성적 및 정량적 검출을 위한 신규 방법{A NEW METHOD FOR QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETECTION OF SHORT NUCLEIC ACID SEQUENCES OF ABOUT 8-50 NUCLEOTIDES IN LENGTH}

새롭게 발명된 본 발명의 분석 방법 및 시험 키트는 혈청, 조직 샘플 및 다른 기질에서의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 및 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드와 같은 짧은 올리고머 핵산의 정성적 및 정량적 검출에 대해 특수화된 것이다. 본 발명은 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 및 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 검출 및 정량화 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 약 50 fM (안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 G3139, 또한 포스포디에스테르 유사체에 대해 0.3 pg/ml)의 검출 한계 (LOD)를 가지며, 이는 15 ㎕의 샘플 부피 (인간 혈청) 중 표적 올리고뉴클레오티드 0.75 amol의 절대량에 상응한다. 정량화 한계 (LOQ)는 100 fM이고, 이 방법은 약 7 로그-값 (100 fM 내지 0.5 μM)의 광범위한 정확한 정량화 동적 범위를 갖는다. 이러한 본 발명의 방법의 특징은 특히 생물학적 샘플 물질로부터의 짧은 핵산 서열의 정량화를 위해 적용되는 모든 공지의 방법보다 우수하다.

공개된 다른 올리고뉴클레오티드 정량화 방법에 비한 본 발명의 주요 이점은 증가된 민감도, 높은 특이성, 양호한 판별력, 높은 정확도 및 정밀도, 양호한 재현성 및 강건성, 광범위한 동적 범위, 낮은 샘플 요구량, 어려운 샘플 세정 절차 또는 샘플 유도체화 단계의 부재, 신속하고 용이한 샘플 처리, 및 고-처리능이다. 특히 생물학적 샘플 물질 (혈청, 전혈, 조직 등)로부터의 DNA 올리고뉴클레오티드 및 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 정량적 검출이 기재된 방법의 핵심적인 특징이다. 본 발명의 방법은 핵산 정량화를 위한 통상의 최신 기술인 실시간 PCR 접근법을 기반으로 한다.

신규하고 진보된 본 발명의 방법은 질량 분광분석법 (MS), 모세관 겔 전기영동법 (CGE), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 혼성화 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 통상적인 분석 방법을 대체할 것이다.

세포, 혈장 및 조직에서의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA (siRNA) 및 마이크로RNA (miRNA)를 비롯한 짧은 이중-가닥 또는 단일-가닥 올리고머 핵산의 정량적 검출이 점점 중요해지고 있다. 특히 약리학적 도구 및 치료제로서의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 관심이 늘고 있다. 짧은 올리고뉴클레오티드의 치료적 용도, 생물학적 유체에서의 안정성, 및 표적 특이성을 연구하기 위해 이전부터 짧은 올리고뉴클레오티드의 정량화에 대한 다양한 기술 및 방법이 개발되어 왔다. 짧은 핵산 서열을 검출하기 위한 다수의 방법이 문헌에 인용되어 있고, 특허 출원 공개공보에 개시되어 있다.

다른 올리고뉴클레오티드 정량화 방법에 비한 본 발명의 주요 이점은 증가된 민감도, 높은 특이성, 높은 정확도 및 정밀도, 광범위한 동적 범위, 신속하고 용이한 샘플 처리, 및 고-처리능이다. 특히 생물학적 샘플 물질로부터의 DNA 올리고뉴클레오티드 및 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 정량적 검출이 기재된 방법의 핵심적인 특징이다. 이하에서는 공개된 올리고뉴클레오티드 정량화 방법을 기재하고 본 발명과 비교한다.

혼성화 검정:

핵산 혼성화 검정에서는, 표적 올리고뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 고상에 공유 결합시키고, 표적 서열 결정을 위해 표지된 트레이서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 샌드위치 혼성화 검정 또는 경쟁적 검정을 수행한다.

생물학적 유체 및 조직에서의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 정량화 방법이 문헌 [Temsamani et al., Anal Biochem. 1993. 215(1), p.54-58]에 기재되어 있으며, 이 방법에서는 표적 안티센스 올리고뉴클레오티드를 나일론 멤브레인 상에 고정시키고, 상보적인 트레이서 올리고뉴클레오티드를 사용하여 고정된 분석물질을 정량화한다. 기재된 방법의 불리한 점은 15％의 올리고뉴클레오티드 손실이 나타나는 만족스럽지 못한 용매 추출 절차와 방사성표지된 트레이서 올리고뉴클레오티드의 사용이다. 위험한 방사성 취급을 피하기 위해 디그옥시게닌 표지된 트레이서 올리고뉴클레오티드를 사용하는 다른 화학발광 검출 방법 또한 기재되어 있다. 이들 두 방법은 모두 혈장 250 ㎕ 중 올리고뉴클레오티드 0.2 pmol의 유사한 민감도 (LOD = 0.8 nM)를 갖는 반면, 본 발명은 혈장 15 ㎕ 중 0.75 amol의 검 출 한계 (LOD = 50 fM)를 나타내며, 이는 민감도가 16,000배 증가하였음을 보여준다. 또한, 기재된 방법의 정확한 정량화를 위한 동적 범위는 약 1.5 ng 내지 50 ng (2 로그-값)인 반면, 본 발명은 8.5 fg 내지 50 ng (약 7 로그-값)의 동적 범위를 갖는다.

문헌 [Overhoff et al., Nucleic Acids Research 2004. 32(21), p.e170]에는 siRNA의 상응하는 ³²P-표지된 센스 가닥을 사용하는 siRNA의 정량화가 기재되어 있다. siRNA 및 표지된 프로브의 액체 혼성화 후에, 결합하지 않은 프로브를 RNase 분해로 제거하고, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 이어 나일론 멤브레인 상으로의 블랏팅 및 정량화에 의해 샘플을 분석한다. 이 방법의 불리한 점은 방사성표지된 올리고뉴클레오티드의 사용 및 어려운 추출 및 정제 절차이다.

인간 조직에서의 마이크로RNA 발현 프로파일링의 분석을 위한 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 접근법이 문헌 [Barad et al., Genome Research 2004. 14(12), p.2486-2494]에 기재되어 있다. 이 방법은 60-머 올리고뉴클레오티드의 다양한 세팅으로 공지된 인간 miRNA 서열을 함유하는 DNA 칩 (아질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) 제조)에 기초한다. 칩 상에 혼성화시키기 위한 물질은 인간 세포로부터의 어댑터-라이게이션된, 크기-분별된 RNA로부터 유래된다. 증폭 후에, 3' 어댑터 상에 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 보유하는 이중-가닥 cDNA를 표지 반응에 사용한다. 이어서, 형광 표지된 cRNA를 마이크로어레이에 혼성화시키고, 마이크로어레이 스캐너를 이용하여 분석한다. 기재된 DNA 마이크로어레이 방 법은 인간 조직에서 150개의 공지된 miRNA의 발현 프로파일링을 허용한다. 마이크로어레이 기술에 의해 측정된 발현 데이타는 루미넥스(Luminex)에 의해 개발된 방법으로 확인하였다 (문헌 [Yang et al., Genome Research 2001. 11 (11), p.1888-1898]). 이 방법은 각각의 마이크로RNA에 대해 특이적인 서열을 갖는 포획 올리고뉴클레오티드 및 검출 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 포획 올리고뉴클레오티드는 색상-암호화 비드 (각각의 miRNA에 대해 고유한 색상)에 공유 결합되는 반면, 검출 올리고뉴클레오티드는 비오틴으로 표지된다. 스트렙타비딘-피코에리트린을 첨가하고, 각각의 색상-암호화 비드와 연관된 형광을 판독한 후에 비오틴을 검출에 사용한다. 두 방법은 모두 특별히 마이크로RNA 또는 miRNA의 전구체의 검출을 위해 고안된 것으로, 본 발명의 핵심적인 특징인 생물학적 샘플 물질 (혈청, 전혈, 조직 등)로부터의 DNA 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 압타머의 검출 및 정량화를 허용하지 않는다. 또한, 기재된 칩 기술은 상대적 정량화 접근법을 이용하는 miRNA의 발현 프로파일링을 허용하며, 표적 RNA의 절대적인 정량화는 허용하지 않는다.

경쟁적, 비-경쟁적, 샌드위치 효소 결합 면역흡착 검정 ( ELISA ):

문헌 [Deverre et al., Nucleic Acids Research 1997. 25(18), p.3584-3589]에서는 15-머 안티센스 포스포디에스테르 올리고데옥시리보뉴클레오티드 및 포스포로티오에이트 유사체의 마우스 혈장 농도를 측정하기 위한 효소 경쟁적 혼성화 검정을 개발하였다. 이 검정의 원리는 비오티닐화된 트레이서 올리고뉴클레오티드 및 표적 안티센스 올리고뉴클레오티드를 폴리스티렌 마이크로웰의 표면에 공유 결 합된 고상 고정 센스-올리고뉴클레오티드에 경쟁적으로 혼성화시키는 것을 포함한다. 이어서, 스트렙타비딘-아세틸콜린에스테라제 컨쥬게이트와 반응시킨 후에 비색 검출 방법을 이용하여 트레이서 올리고뉴클레오티드를 검정한다. 이 방법의 정량화 한계는 900 pM으로, 본 발명의 방법 (LOQ = 100 fM)보다 9,000배 덜 민감하다.

2개의 상이한 프로브 및 형광물질 수송 과정을 사용하여, 추출하지 않고 생물학적 유체에서 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드를 정량화하는 경쟁적 혼성화 검정이 문헌 [Boutet et al., Biochem Biophys Res Commun. 2000. 268(1), p.92-98]에 기재되어 있다. 혈장에서 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드에 대한 검정의 민감도는 각각 800 pM 및 200 pM이다. 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드 둘 모두에 대한 본 발명의 정량화 한계는 100 fM으로, 이는 각각 민감도가 8,000배 및 2,000배 증가한 값이다.

문헌 [Yu et al., Analytical Biochemistry 2002. 304(1), p.19-25]에는 인간 혈장에서 안티센스 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드의 정량화를 위한 비-경쟁적 혼성화-라이게이션 이종 효소-결합 면역흡착 검정이 기재되어 있다. 이 검정의 원리는 고정된 프로브 올리고뉴클레오티드에 대한 안티센스 표적 올리고뉴클레오티드의 이종 비-경쟁적 결합에 이은 형광 신호 프로브의 라이게이션에 기초한다. 검출 및 정량화는 형광 마이크로타이터 플레이트 판독기를 이용하여 수행한다. 인간 혈장에서 이 방법의 정량화 한계는 50 pM으로, 본 발명 (LOQ = 100 fM) 보다 500배 덜 민감하다.

또한, 이 방법의 선형 범위는 0.05 nM 내지 2 nM (약 2 로그-값)인 반면, 본 발명은 100 fM 내지 0.5 μM (약 7 로그-값)의 선형 범위를 갖는다.

생물학적 유체 (혈장 및 세포내 기질)에서 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 정량화를 위한 혼성화-기반의 효소-결합 면역흡착 검정 방법이 문헌 [Wei et al., Pharm Res. 2006. 23(6), p.1251-1264]에 기재되어 있다. 이 방법은 비오틴-표지된 포획 프로브로의 포스포로티오에이트 표적의 혼성화에 이은 디그옥시게닌-표지된 검출 프로브와의 라이게이션에 기초한다. 이어서, 결합된 이중나선을 비색 검출 방법을 이용하여 항-디그옥시게닌-알칼리 포스파타제 컨쥬게이트에 의해 검출한다. 이 검정의 정량화 한계는 50 pM이고, 선형 범위는 0.05 nM 내지 10 nM (약 2 로그-값)인 반면, 본 발명의 방법은 100 fM 내지 0.5 μM (약 7 로그-값)의 선형 범위 및 500배 더 높은 민감도 (본 발명의 LOQ = 100 fM)를 갖는다.

비색 혼성화 검정의 민감도 및 특이성을 증가시키기 위해 잠금 핵산 (LNA)을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것이 문헌 [Efler et al., Oligonucleotides 2005, 15(2), p.119-131]에 기재되어 있다. 이 검정에 대한 검출 한계는 표적 올리고뉴클레오티드 2.8 pg/ml 또는 40 amol이며, 선형 범위는 7.8 내지 1000 pg/ml (약 2 로그-값)이다. 0.75 amol의 검출 한계를 갖는 본 발명의 방법은 55배 더 높은 민감도를 가지며, 약 7 로그-값 (0.6 pg/ml 내지 3 ㎍/ml)의 보다 넓은 선형 검출 범위를 갖는다. 또한, 이 방법 (및 대부분의 다른 ELISA-기반의 방법)의 혈장 샘플 요구량은 100 ㎕인 반면, 본 발명의 방법의 샘플 요구량은 단지 15 ㎕이다.

모세관 겔 전기영동법/UV-검출:

모세관 겔 전기영동법 (CGE)은 짧은 핵산 서열의 정량화를 위한 잘 확립된 기술로, 다수의 임상 시험에서 주요 생물분석 방법으로 이용되어 왔다. CGE는 사슬-감소된 대사물질로부터 모 화합물이 양호하게 분해되어 분리되는 것을 허용한다. CGE 분리 이후에, 260 nm에서의 UV-검출이 가장 빈번하게 적용되는데, 이는 혈장에서 70 ng/ml의 LOD 값을 갖는다. 이 민감도는 약동학적 거동을 모니터링하기에는 충분하지만, 혈장에서 올리고뉴클레오티드의 최종적인 제거 단계를 특성화하기에는 불충분하다. 이러한 요구는 혈장에서 0.3 pg/ml인 100,000배 더 높은 민감도를 갖는 본 발명의 정량화 방법에 의해 충족된다. 또한, 본 발명은 문헌 [Shang et al., Acta Pharmcol Sin. 2004. 25(6), p.801-806] 및 [Yu et al., Drug Discovery ＆ Development 2004. 7(2), p.195-203]에 기재된 바와 같이, 광범위한 추출 방법 및 만족스럽지 못한 샘플 세정 절차 또는 컬럼상 유도체화 단계를 필요로 하지 않아서 민감도가 개선된다.

질량 분광분석법:

짧은 핵산 서열의 정량화를 위한 잘 확립된 또 다른 기술은 질량 분광분석법 (MS)이다. 예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그것의 대사물질의 정량화를 위한 다른 방법이 기술되어 있다. MS 및 탠덤 MS/MS 방법 이전에 수행되는 액체 크로마토그래피는 혈장 샘플에서 올리고뉴클레오티드의 정량화를 용이하게 하지만, 안티센스 올리고뉴클레오티드 검출을 위해 고상 추출 절차가 여전히 요구된다.

문헌 [Yu et al., Drug Discovery ＆ Development 2004. 7(2), p.195-203]에는 혈장 샘플에 대한 MS 방법이 기재되어 있으며, 이 방법의 동적 범위는 1 내지 2000 ng/ml이고, LOD는 컬럼 상에서 100 pg (혈장 중 5 ng/ml와 동등함)이다. MS 방법에 비해, 본 발명은 10,000배 더 높은 민감도 (LOD = 0.0045 pg, 혈장 샘플 중 0.3 pg/ml와 동등함) 및 약 7 로그-값 (100 fM 내지 0.5 μM)의 보다 넓은 정확한 정량화 동적 범위를 갖는다.

문헌 [Dai et al., J. Chromatotogr. B. 2005. 825(2), p.201-213]에는 17.6 nM의 LOQ를 갖는, 인간 및 래트 혈장에서의 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드의 HPLC-MS/MS 정량화 방법이 기재되어 있다. 본 발명의 LOQ는 100 fM으로, 이는 100,000배 증가된 민감도에 상응한다.

탠덤 광 크로마토그래피-UV 검출-MS 방법이 문헌 [Gilar et al., Oligonucleotides 2003. 13(4), p.229-243]에 기재되어 있으며, 이 방법의 추정 LOQ는 컬럼 상에 주입된 올리고뉴클레오티드 1 pmol 미만이다. 본 발명의 방법의 LOQ는 1.5 amol로, 10⁵배 초과하여 더 민감하다.

다른 핵산 정량화 방법:

추가로 언급된 핵산 정량화 방법은 혈장 및 다른 생물학적 샘플에서의 올리고뉴클레오티드의 정량적 분석에 적용되는 것으로 나타난 적이 없고/거나, 본 발명에 기재된 방법에 비해 덜 민감하고/거나 덜 특이적이었다.

전기활성 혼성화 프로브:

올리고뉴클레오티드 정량화를 위한 다른 기술이 문헌 [Jenkins et al., Anal Chem. 78(7), p.2314-2318]에 기재되어 있는데, 이 기술은 일회용 전극의 금 표면 상의 전기활성 혼성화 프로브의 혼합된 단일층을 사용한다. 표적 서열을 페로센-표지된 헤어핀 프로브에 혼성화시키면 전극으로부터의 표지의 치환에 기인하는 것으로 추정되는 순환 산화환원 전류의 감소가 발생한다. 검출 한계는 거의 100 fM까지인 것으로 입증되었으나, 지금까지 이 기술은 혈장 샘플에서의 올리고뉴클레오티드의 분석에 적용되는 것으로 나타난 적이 없으며, 표준 정량적 생물분석 방법으로 이용되지 않았다.

라이게이션 검정:

문헌 [Dille et al in Journal of Clinical Microbiology, 1993, 31(3), p. 720-731]에 기재된 라이게이션 검정은 리가제 연쇄 반응 (LCR)에 의한 증폭과 비교되는 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 클라미디아 트라코마티스(Clamydia trachomatis) DNA의 증폭을 보여준다. 두 증폭 절차 모두 3개의 씨. 트라코마티스 기본 소체에 대해 동등한 양의 DNA를 일관되게 증폭시킬 수 있었다. 15개의 모든 씨. 트라코마티스 혈청형은 LCR에 의해 검출가능한 수준으로 증폭되었으며, 임상 표본에서 발견될 가능성이 있는 16개 유기체 또는 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) 및 클라미디아 뉴모니아(Chlamidia pneumoniae)로부터의 DNA는 LCR에 의해 증폭되지 않았다.

데옥시리보자임 검정:

문헌 [Tabor et al., Nucleic Acids Research 2006. 34(8), p.2166-2177]에 서는, 하프-데옥시리보자임이 가교 올리고뉴클레오티드에 의해 활성화되어 라이게이션 반응을 수행할 수 있는 2-원 데옥시리보자임 리가제를 제작하였다. 제작된 데옥시리보자임은 혼성화를 통한 하나의 서열의 "판독(reading)" 후에 라이게이션에 의한 별도의 서열의 "기술(writing)"에 의해 핵산 정보를 재코딩할 수 있으며, 이는 이후에 PCR에 의한 증폭에 주형으로 사용될 수 있다. 지금까지 이 기술은 혈장 샘플에서의 올리고뉴클레오티드의 정량적 분석에 적용되는 것으로 나타난 적이 없으며, 표준 정량적 생물분석 방법으로 이용되지 않았다.

DNA 결합 염료:

문헌 [Gray et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997. 7(3) p.133-140]에는 송아지, 마우스 및 인간 혈장 샘플에서 올리고뉴클레오티드 및 유사체의 정량화를 허용하는 단일-가닥 DNA 결합 형광단 올리그린(OliGreen)의 사용이 기재되어 있다. 이 방법의 선형 범위는 15 내지 500 nM인 것으로 보고되었다. 본 발명에 따른 방법은 150,000배 증가된 민감도 및 약 7 로그-값 (100 fM 내지 0.5 μM)의 보다 넓은 동적 범위를 갖는다.

PCR -기반의 검정:

마이크로RNA 및 짧은 간섭 RNA의 PCR-기반의 정량적 분석 방법은 문헌 [Raymond et al., RNA 2005. 11(11) p.1737-1744]에 기재되어 있다. 이 방법은 역전사에 의한 RNA의 cDNA로의 프라이머 신장 전환에 이어 정량적 실시간 PCR에 의존한다. PCR 역방향 프라이머 내의 LNA 염기는 검정의 성능을 증가시킨다. 이 검정 은 fM 범위의 측정을 허용하고, 본 발명의 방법과 대등한 수준인 10⁶ 내지 10⁷배의 높은 동적 범위를 갖는다. 이 방법은 짧은 RNA 분자의 정량화를 위한 고안되었으며, 혈장 샘플에서 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 정량화는 허용하지 않는다.

마이크로RNA 및 짧은 간섭 RNA의 정량적 분석을 위한 PCR-기반의 방법은 또한 WO 2005/098029 A2 (EXIQON A/S [DK]; Jacobsen Nana [DK] et al., 20.10.2005)에 개략되어 있다. 기재된 방법은 본 발명에 비해 완전히 상이한 효소 반응 단계를 이용한다. 한 가지 방법은 프라이머 신장 및 그 이후의 특히 주형으로 RNA를 필요로 하는 역전사효소를 사용한 역전사에 기초한다. 이어서, 반응 생성물을 실시간 PCR 시스템의 프라이머 및 검출 프로브와 합하고, 이를 PCR 주형으로 사용한다. 이 방법은 오직 RNA 표적 서열의 검출만을 기재하고 있으며, 역전사효소의 효소 반응 단계를 이용하는 DNA 표적 서열 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 정량적 분석은 기재하고 있지 않다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 역전사효소 필요 없이 DNA 폴리머라제 효소를 사용하여 생물학적 샘플 물질로부터 DNA 서열을 검출 및 정량화한다. 두번째로 기재된 방법은 표적 핵산 서열에 인접하여 혼성화된 2개의 태깅 프로브를 연결하는 라이게이션 반응에 기초한다. 이어서, 리가제 반응 생성물을 실시간 PCR 시스템의 프라이머 및 검출 프로브와 합하고, 이를 PCR 주형으로 사용한다. 반응하지 않은 태깅 프로브는 상보적 서열을 갖는 PCR 프라이머에 혼성화되어 이차적으로 원치않는 PCR 반응 (프라이머/태깅 프로브 하이브리드의 연 장)을 개시하기 때문에, 표적 서열의 신뢰성 높은 정량적 분석을 위해서는, 상기 셋-업에 있어서 반응하지 않은 태깅 프로브의 제거가 요구될 것이다. PCR에서 성분들 (프라이머, 폴리머라제, 뉴클레오티드)에 대해 발생한 경쟁은 양호하지 못한 선형성, PCR-효율 및 검출 한계를 초래하여, 신뢰성 높은 정량적 분석을 방해한다. 선형 회귀 분석으로 산출한 표적 적정 곡선의 보고된 기울기는 -4.31로, 이는 71％의 PCR-효율에 상응하는 반면, 본 발명의 방법은 -3.67의 기울기 및 적어도 87％의 PCR-효율을 갖는다 (실시예 1, 표 1). 이 방법의 LOD는 pM-범위인 반면, 본 발명의 LOD는 1000배 더 높은 민감도를 갖는 fM-범위이다. 반응하지 않은 태깅 프로브의 제거는 광범위한 정제 절차를 필요로 할 것인데, 이는 양호하지 못한 회수율로 인해 방법의 민감도를 더 낮출 수 있다. 특히 생물학적 샘플 물질 (혈청, 전혈, 조직 등)로부터의 핵산 서열의 검출에 대한, 기재된 방법의 성공적인 적용을 보여주는 예는 제시되어 있지 않다. 개략된 실시예에서, 합성 RNA 올리고뉴클레오티드 또는 고도로 정제된 RNA가 표적으로 사용되었으나, 본 발명에서 특별히 고안된 복잡한 생물학적 기질에서의 표적 올리고뉴클레오티드의 검출은 기재되어 있지 않다.

작은 RNA 서열의 검출을 위한 PCR-기반의 방법은 문헌 US 2006/003337 A1 (Brandis John [US] et al., 05.01.2006)에 기재되어 있다. 이 방법은 표적 RNA 서열에 인접하여 혼성화된 2개의 표적 프로브를 연결시키는 RNA-주형의 라이게이션에 기초한다. 표적 프로브들 중 하나에 대한 비오틴 친화성 태그를 사용하는 임의의 라이게이션 생성물 정제 방법이 적용될 수 있다. 라이게이션 생성물의 검출 및 정량화는 실시간 PCR로 수행한다. 기재된 방법은 오직 RNA 서열의 검출만을 위해 고안된 반면, 본 발명은 바람직하게는 라이게이션 검정 및 광범위한 세정 절차를 이용하지 않고 DNA 표적 서열 및 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드를 정량화한다. 또한, 상기 방법에서는 비-주형 대조군 (NTC)의 높은 백그라운드 신호가 나타나 방법의 민감도를 감소시킨다. 본 발명의 핵심적인 특징인, 특히 생물학적 샘플 물질 (혈청, 전혈, 조직 등)로부터의 DNA 서열의 정량화 방법의 성공적인 적용을 보여주는 예는 제시되어 있지 않다.

문헌 WO 2006/012468 A2 (OSI EYETECH INC [US]; Shima David T. [US] et al., 02.02.2006)에는 이중 혼성화에 의한 올리고뉴클레오티드의 검출 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 리보자임 및 짧은 간섭 RNA (siRNA)를 비롯한 개질된 올리고뉴클레오티드의 정량적 검출을 허용한다. 이 방법은 표적 압타머 서열에 인접하여 혼성화된 포획 프로브 및 검출 프로브를 연결시키는 라이게이션 반응에 기초한다. 친화성 태그 또는 자성 비드를 라이게이션 반응 생성물의 정제를 허용하는 포획 프로브에 연결시킨다. 이어서, 실시간 PCR 접근법을 이용하여 라이게이션 생성물을 정량화한다. PCR 시스템은 검출 프로브 상에 표적화되므로, 라이게이션되지 않은 검출 프로브를 완전히 제거하여 높은 백그라운드 신호를 방지하기 위해 광범위한 세정 절차가 필요하다. 나타낸 실험 데이타가 기재된 방법의 이러한 결점을 확인시켜 준다. 이의 LOD는 pM-범위인 반면, 본 발명의 LOD는 광범위한 세정 절차 없이 fM-범위 (1000배 더 민감함)이다.

문헌 WO 2006/069584 A (EXIQON A/S [DK]; Plasterk Ronald [NL] et al., 06.07.2006)는 마이크로RNA, 그것의 표적 mRNA, 뿐만 아니라 작은 간섭 RNA 및 다 른 비-코딩 RNA의 검출 및 정량화를 위한 신규 올리고뉴클레오티드 조성물 및 프로브 서열을 기재하고 있다. 이 문헌은 척추동물 마이크로RNA, 제브라피쉬 miRNA, 노랑 초파리 miRNA, 예쁜꼬마선충 miRNA, 애기장대 miRNA, 인간 miRNA 및 마우스 miRNA인 표적 서열에 대해 특이적인 프로브를 제공하는 프로브 집합 또는 라이브러리를 열거하고 있다. 이들 프로브 또는 프로브 집합은 오직 RNA 표적 서열의 정량적 분석 또는 발현 프로파일링에만 사용될 수 있으며, 본 발명의 핵심적인 특징인, 특히 생물학적 샘플 물질 (혈청, 전혈, 조직 등)로부터의 치료용 DNA 올리고, 안티센스 올리고 또는 포스포로티오에이트 올리고와 같은 DNA 서열의 정량적 분석에는 사용될 수 없다.

스템-루프 RT-PCR:

스템-루프 RT-PCR에 의한 마이크로RNA 및 다른 작은 RNA의 실시간 정량화는 문헌 [Chen et al., Nucleic Acids Research 2005. 33(20) p.1-9]에 기재되어 있다. RNA에서 cDNA로의 역전사를 촉진하기 위해, 이 방법은 스템-루프 구조를 형성하는 RT 프라이머를 사용하며, 이는 선형 프라이머보다 더 양호한 특이성 및 민감도를 나타낸다. 이어서, 본 발명과 대등한 수준인 10⁷배의 동적 범위를 나타내는 실시간 PCR 검정을 이용하여 cDNA의 정량화를 수행한다. 이 PCR-기반의 방법은 정제된 작은 RNA 분자의 정량화를 위해 고안된 것으로, 본 발명의 핵심적인 특징인 혈장 샘플에서의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 정량화에는 사용될 수 없다.

등온 증폭:

문헌 [Tan et al., Anal Chem. 2005. 77(24) p.7984-7992]에는 짧은 DNA 서열을 검출하는 등온 핵산 증폭 반응이 기재되어 있다. 이 방법은 DNA-관능화된 금 나노스피어의 집합에 기초한 시각적 비색 판독과 병행된다. 이 반응은 기하급수적으로 증폭되어, 2 세트의 DNA-관능화된 금 콜로이드를 가교시킬 수 있는 보편적인 리포터 올리고뉴클레오티드로 전환되는 트리거(trigger) 올리고뉴클레오티드에 의해 개시된다. 이 방법은 10분 내에 100 fM의 트리거 올리고뉴클레오티드의 검출을 허용하지만, 이 기술은 지금까지 예를 들면 혈장 샘플에서의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 분석에 적용되는 것으로 나타난 적이 없으며, 표준 정량적 생물분석 방법으로 사용되지 않았다.

관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적임으로써 이에 혼성화될 수 있는 부분 및 관심 대상 서열에 비-상보적인 부분을 포함하는 포획 프로브와 샘플을 접촉시키는 단계; 포획 프로브를 주형으로 사용하여 핵산 폴리머라제에 의해 관심 대상 서열을 신장시키는 단계; 관심 대상 서열을 주형으로 사용하여 핵산 폴리머라제에 의해 포획 프로브를 신장시키는 단계; 및 핵산 증폭 반응을 사용하여 신장된 관심 대상 서열 및 신장된 포획 프로브를 직접적으로 또는 간접적으로 정성적 및 정량적 검출함으로써, 관심 대상 서열의 존재 및 그것의 양을 나타내는 단계를 포함하며; 핵산 증폭에 사용되는 프라이머는 관심 대상 서열의 신장부 및 포획 프로브의 신장부에 상보적인 부분을 포함함으로써, 관심 대상 서열의 부재 시에는 핵산 증폭을 방지하는 것임을 특징으로 하는, 샘플에서 관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드를 정성적으로 및 정량적으로 검출하는 방법을 개시한다.

상기 방법은 표적 분자 0.75 amol에 상응하는 50 fM (0.3 pg/ml)의 검출 한계 및 약 7 로그-값의 동적 범위를 갖는다.

도 1a 및 1b는 (a) 표적/프로브 신장을 위한 핵산 폴리머라제 반응 및 (b) 표적 분자의 정량적 분석을 위한 실시간 PCR 검정을 포함하는 본 발명의 방법의 개략도를 나타낸다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명은 또한 전술한 모든 필요성을 만족시킨다. 이는 상보적인 표적 특이 영역을 함유함으로써 관심 대상 표적 서열의 존재 하에 상보적인 표적 서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화를 통해 달성될 수 있다.

제1 측면에서, 본 발명은 관심의 대상인 짧은 핵산 표적 서열의 일부에 상보적임으로써 이에 혼성화될 수 있는 부분 및 관심 대상 서열에 비-상보적인 부분을 포함하며, 표적 서열 및 혼성화된 포획 프로브 둘 다의 쌍을 이루지 않은 말단은 핵산 폴리머라제에 의한 신장에서 주형으로 작용하는 것인, 관심의 대상인 짧은 핵산 표적 서열을 정성적으로 및 정량적으로 검출하는 방법에 사용하기 위한 포획 프로브를 제공한다.

표적 가닥, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드는 관심 대상 서열, 예컨대 약 8 내지 50개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 고도로 단편화된 DNA (이로써 본 발명의 방법을 처리된 샘플에서 종-특이 서열의 존재를 검출 및 정량화하는 데 사용할 수 있음) 또는 임의의 다른 짧은 핵산 서열의 핵산 및/또는 핵산 유사체 (DNA, LNA, PNA, PTO, MGB, 2'-MOE)를 포함할 수 있다.

관심 대상 서열에 대한 포획 프로브의 혼성화는 비-상보적 서열의 쌍을 이루지 않은 양 말단을 갖는 상보적 서열의 핵산 이중나선을 형성한다. 포획 프로브는 바람직하게는 DNA, LNA (잠금 핵산) 또는 PNA (펩티드 핵산)를 포함하지만, RNA, MGB (마이너 그루브 결합제), PTO (포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드), 2'-MOE (2'-메톡시에틸) 올리고뉴클레오티드, 다른 핵산 유사체 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수도 있다.

LNA는 "내부 가교화" 뉴클레오시드 유사체를 혼입시킨 합성 핵산 유사체이다. LNA의 합성 및 그것의 특성은 다수의 문헌 [Nielsen et al, (1997 J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 3423)]; [Koshkin et al, (1998 Tetrahedron Letters 39, 4381)]; [Singh ＆ Wengel (1998 Chem. Commun. 1247)]; 및 [Singh et al, (1998 Chem. Commun. 455)]에 기재되어 있다. LNA는 DNA와 쌍을 이루었을 때, 통상적인 DNA/DNA 이형 이중나선보다 큰 열 안정성을 나타낸다. 그러나, LNA는 통상적인 핵산 합성기로 합성할 수 있는 반면에, PNA는 그렇게 할 수 없고; 단일-가닥 PNA/DNA 키메라를 형성하는 경우, DNA에 PNA를 연결하기 위해서는 특수한 링커가 필요하다. 반면에, LNA는 통상적인 기술에 의해서 간단하게 DNA 분자에 연결할 수 있다. 그러므로, 일부 측면에서는 LNA가 본 발명에 따른 프로브에서 사용하기에 PNA보다 바람직한 것이다. 특히, 포획 프로브의 표적 특이 영역은 LNA 및/또는 다른 핵산 유사체를 포함할 수 있고, 관심 대상 서열에 비-상보적인 영역은 DNA를 포함한다.

다수의 핵산 증폭 방법이 문헌에 인용되어 있고, 유럽 및 PCT 특허 출원 공개공보에 개시되어 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)으로 알려져 있는 이러한 방법의 하나는 미국 특허 제4,683,202호에 개시되어 있고, 세계적으로 잘 도입되어 있다.

PCR의 발명은 핵산 검출 방법의 민감도 및 특이성을 크게 개선시켰다. PCR은 핵산을 증폭시키는 방법이며, 2개의 핵산 프라이머 (올리고뉴클레오티드), 중합을 위한 작용제 (예를 들면, 열 안정성 DNA 폴리머라제), 표적 핵산 주형, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 여러 부의 특정 핵산 세그먼트를 제조하기 위한 핵산 변성, 어닐링 및 프라이머 신장의 연속 주기의 사용을 포함한다. 이 방법으로, 한 부의 게놈 DNA의 세그먼트를 매우 높은 특이성 및 충실성으로 천만 배 이상 증폭시킬 수 있다.

PCR 생성물의 검출 방법은 미국 특허 제4,683,195호에 구체적으로 기재되어 있다. 상기 방법은 증폭된 표적 핵산과 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 필요로 한다.

표적 핵산의 검출을 용이하게 하기 위해 핵산을 표지하는 다수의 작용제가 기재되어 있다. 적합한 표지는 형광, 방사성, 비색법, X-선 회절 또는 흡수, 자성, 또는 효소 활성에 의해 검출가능한 신호를 제공할 수 있고, 예를 들어 형광단, 발색단, 방사성 동위원소, 전자-밀집 시약, 효소, 및 특이 결합 짝을 갖는 리간드를 포함할 수 있다.

미국 특허 제5,210,015호에는 증폭된 핵산을 검출하는 다른 검정 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 검출을 위해, 어닐링되고 표지된 올리고뉴클레오티드를 혼성화된 이중나선으로부터 분리시키고 표지된 올리고뉴클레오티드 단편을 방출시키는 핵산 폴리머라제의 5'→3' 뉴클레아제 활성을 이용한다. 상기 방법은 PCR 생성물의 정량적 검출에 적합하고, 프라이머쌍, 및 폴리머라제에 의한 신장을 방지하기 위해 차단된 3'-OH 말단을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 필요로 한다.

짧은 핵산 서열의 검출에 대해, PCR 방법은 증폭에 필요한 주형 핵산 서열의 길이에 제한이 있다는 결점을 갖는다. 최소 길이는 중복되지 않아야 하는 프라이머 및 프로브 어닐링 서열, 및 그 사이 서열의 길이에 의해 결정된다. 그러므로, 적어도 50개 염기쌍의 주형 핵산 서열이 필요하며, 따라서 50개 미만의 염기쌍에 대해서는 사용이 불가능하다.

본 발명은 약 8 내지 50개 뉴클레오티드 길이의 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드 (예를 들면 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 정성적 및 정량적 검출을 허용하는 PCR-기반 방법에 대한 요구에 대처하여 이를 해결한다.

실시예 1: 본 발명의 방법의 선형 검출 범위

본 발명의 방법을 사용한 정확한 정량화의 선형 범위를 측정하기 위해, 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 G3139 (5'-3' 서열: TCT CCC AGC GTG CGC CAT)를 표적 분자로 선택하였다. 피펫팅 로봇 (CAS1200, 코르벳 리서치(Corbett Research))을 사용하여 PTO의 10배 계열 희석물을 제조하였다. 희석 계열은 최대 올리고-농도가 2 μM인 10개의 농도 수준으로 구성되었다.

핵산 폴리머라제 반응은 클레나우(Klenow) 효소 (대장균 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편)를 사용하여 수행하였다. 각 농도 수준의 PTO 15 ㎕를 클레나우 마스터믹스 5 ㎕와 혼합하였다. 클레나우 반응물은 다음으로 구성되었다 (최종 농도): 0.5 μM 포획 프로브 (5'-3' 서열: TTT GGA GCC TGG GAC GTG CTG GAT ACG ACA TGG CGC AC; 볼드체 = 잠금 핵산 염기; 시그마-프롤리고(Sigma-Proligo)), 50 μM dNTP 믹스, 1x 클레나우 반응 완충액 (퍼멘타스(Fermentas)), 5 단위의 클레나우 효소 (퍼멘타스), 10 ng/㎕ 인간 DNA, 및 20 ㎕의 최종 반응 부피까지의 H₂O. 반응물 중 G3139 안티센스 PTO의 농도는 0.5 μM - 0.5 fM이었다. 또한, PTO가 없는 비-주형 대조군을 제조하였다. 열순환기를 사용하여 클레나우 반응물을 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.

실시간 PCR을 사용하여 클레나우 반응물 중 표적 분자의 정량화를 수행하였다. 각각의 1:10 희석 클레나우 반응물 5 ㎕를 PCR 마스터믹스 15 ㎕와 혼합하였다. PCR 반응물은 다음으로 구성되었다 (최종 농도): 0.5 μM 정방향 프라이머 (5'-3' 서열: CCG TTC TCC CAG CGT GC), 0.5 μM 역방향 프라이머 (5'-3' 서열: TTT GGA GCC TGG GAC GTG), 0.2 μM 프로브 (5'-3' 서열: FAM-TGG ATA CGA CAT GGC GCA-MGB; 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)), 1x qPCR 마스터믹스 (유로젠텍(Eurogentec)), 및 20 ㎕의 최종 반응 부피까지의 H₂O. 하기 프로그램을 사용하여 ABI 7900HT 실시간 PCR 열순환기 (어플라이드 바이오시스템즈)로 실시간 PCR을 수행하였다: 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 이어서 95℃에서 15초, 60℃에서 60초의 50 주기.

도 2는 10배 계열 희석한 G3139 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 주형으로 사용한 핵산 폴리머라제 반응의 PCR 증폭 그래프를 나타낸다.

도 3은 실시간 PCR의 선형 회귀 분석을 나타낸다.

하기 표 1에 실시예 1의 실시간 PCR 데이타를 제시하였다.

실시예 2: 혈장 샘플에서의 검출 한계

혈장에서의 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 G3139에 대한 본 발명의 방법의 검출 한계 (LOD)를 측정하기 위해, 50 pM - 5 fM의 최종 농도로 10 단계 희석한 PTO를 인간 혈장에 첨가하였다.

각 농도 수준의 PTO 15 ㎕를, 인간 DNA를 첨가하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조한 (실시예 1 참조) 클레나우 마스터믹스 5 ㎕와 혼합하였다. 또한, PTO가 없는 혈장의 비-주형 대조군을 제조하였다. 열순환기를 사용하여 클레나우 반응물을 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다.

뉴클레오스핀 익스트랙트(NucleoSpin Extract) II (마헤라이-나겔(Macherey-Nagel)) DNA 정제 키트를 사용하여 클레나우 반응물을 정제하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 추출을 수행하였다. DNA를 100 ㎕ 용리 완충액에 용리시켰다.

실시간 PCR을 사용한 표적 분자의 정량화를 위해, 각각의 용리액 5 ㎕를 PCR 마스터믹스 (실시예 1 참조) 15 ㎕와 혼합하였다. 하기 프로그램을 사용하여 로터젠(Rotorgene) 실시간 PCR 열순환기 (코르벳 리서치)에서 실시간 PCR을 수행하였다: 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 이어서 95℃에서 15초, 60℃에서 60초의 50 주기.

도 4는 주형으로서 G3139 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 첨가한 인간 혈장을 사용한 핵산 폴리머라제 반응의 PCR 증폭 그래프를 나타낸다.

하기 표 2에 실시예 2의 실시간 PCR 데이타를 제시하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Biolytix AG Moor, Dominik Brodmann, Peter Seyfarth, Ralf <120> A new method for qualitative and quantitative detection of short nucleic acid sequences of about 8-50 nucleotides in length <130> Biolytix 102 <140> 06022097.7-1222 <141> 2007-01-03 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Phosphorothioate Oligodeoxyribonucleotide to Homo sapiens B-cell CLL/lymphoma 2 (BCL2) mRNA <220> <221> modified_base <222> (1)..(18) <300> <308> GenBank / CS080249 <309> 2005-05-09 <313> (1)..(18) <300> <302> Method for identifying interferon mimics <310> WO2005038052 <312> 2005-04-28 <313> (1)..(18) <400> 1 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> capture probe contains LNA (Locked Nucleic Acid) bases at postitions: 30, 32, 34, 36, 37 <220> <221> modified_base <222> (30)..(37) <400> 2 tttggagcct gggacgtgct ggatacgaca tggcgcac 38 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer <220> <221> primer_bind <222> (1)..(17) <400> 3 ccgttctccc agcgtgc 17 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 4 tttggagcct gggacgtg 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> TaqMan MGB probe <220> <221> primer_bind <222> (1)..(18) <400> 5 tggatacgac atggcgca 18

Claims

(a) 관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적임으로써 이에 혼성화될 수 있는 부분 및 관심 대상 서열에 비-상보적인 부분을 포함하는 포획 프로브와 샘플을 접촉시키는 단계;

(b) 포획 프로브를 주형으로 사용하여 핵산 폴리머라제에 의해 관심 대상 서열을 신장시키고; 관심 대상 서열을 주형으로 사용하여 핵산 폴리머라제에 의해 포획 프로브를 신장시키는 단계; 및

(c) 핵산 증폭 반응을 사용하여 신장된 관심 대상 서열 및 신장된 포획 프로브를 직접적으로 또는 간접적으로 정성적 및 정량적 검출함으로써, 관심 대상 서열의 존재 및 그것의 양을 나타내는 단계를 포함하며; 핵산 증폭에 사용되는 프라이머는 관심 대상 서열의 신장부 및 포획 프로브의 신장부에 상보적인 부분을 포함함으로써, 관심 대상 서열의 부재 시에는 핵산 증폭을 방지하는 것임을 특징으로 하는,

샘플에서 관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드를 정성적으로 및 정량적으로 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 관심 대상 서열이 약 8 내지 50개 뉴클레오티드 길이인 방 법.
제1항에 있어서, 관심 대상 서열이 DNA, PTO (포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드), 2'-MOE (2'-메톡시에틸) 올리고뉴클레오티드, LNA (잠금 핵산), MGB (마이너 그루브 결합제), PNA (펩티드 핵산), 다른 핵산 유사체 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 관심 대상 서열이 단일-가닥 분자, 이중-가닥 분자 또는 이들의 임의의 조합인 방법.
제1항에 있어서, 포획 프로브가 DNA, PTO (포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드), 2'-MOE (2'-메톡시에틸) 올리고뉴클레오티드, RNA, LNA (잠금 핵산), MGB (마이너 그루브 결합제), PNA (펩티드 핵산), 다른 핵산 유사체 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 포획 프로브의 서열이, 관심 대상 서열과의 혼성화가 포획 프로브의 쌍을 이루지 않은 말단을 형성시키도록 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 포획 프로브의 서열이, 관심 대상 서열과의 혼성화가 관심 대상 서열의 쌍을 이루지 않은 말단을 형성시키도록 하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 포획 프로브의 쌍을 이루지 않은 말단을 주형으로 사용하여 등온 반응 또는 열 반응에서 핵산 폴리머라제에 의해 관심 대상 서열을 신장시키는 방법.
제1항에 있어서, 관심 대상 서열의 쌍을 이루지 않은 말단을 주형으로 사용하여 등온 반응 또는 열 반응에서 핵산 폴리머라제에 의해 포획 프로브를 신장시키는 방법.
제1항에 있어서, 관심 대상 서열의 신장 및 포획 프로브의 신장으로 프라이머 어닐링에 적합한 서열의 형성이 발생하는 방법.
제1항에 있어서, 관심 대상 서열의 신장 및/또는 포획 프로브의 신장으로 리보자임 활성 (리가제, 뉴클레아제 또는 임의의 다른 촉매 활성)을 갖는 핵산 서열의 형성이 발생하는 방법.
제10항에 있어서, 프라이머 어닐링을 위해 형성시킨 서열을 신장된 관심 대상 서열 및 신장된 포획 프로브의 등온 핵산 증폭 또는 열 핵산 증폭에 사용하는 방법.
제12항에 있어서, 증폭 방법을 합성된 핵산 서열의 직접 또는 간접 검출에 사용하는 방법.
제12항에 있어서, 핵산 증폭에 사용되는 프라이머가 DNA, PTO (포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드), 2'-MOE (2'-메톡시에틸) 올리고뉴클레오티드, RNA, LNA (잠금 핵산), MGB (마이너 그루브 결합제), PNA (펩티드 핵산), 다른 핵산 유사체 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 핵산 증폭을 핵산 프로브와의 혼성화에 의해 검출하는 방법.
제12항에 있어서, 핵산 증폭에 사용되는 프로브가 DNA, PTO (포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드), 2'-MOE (2'-메톡시에틸) 올리고뉴클레오티드, RNA, LNA (잠금 핵산), MGB (마이너 그루브 결합제), PNA (펩티드 핵산), 다른 핵산 유사체, 형광 표지 또는 방사성표지, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 핵산 증폭을 형광 염료로 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 포획 프로브 및/또는 관심 대상 서열 신장의 직접적 또는 간접적 결과로서 합성된 핵산을 고체 표면에 포획하는 방법.
관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적임으로써 이에 혼성화될 수 있는 부분 및 관심 대상 서열에 비-상보적인 부분을 포함하는, 관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드를 정성적으로 및 정량적으로 검출하는 방법에 사용하기 위한 포획 프로브.
제19항에 있어서, 제1항에 따른 방법에 사용하기 위한 포획 프로브.
포획 프로브의 신장부에 상보적임으로써 이에 혼성화될 수 있는 부분을 포함하는, 관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드를 정성적으로 및 정량적으로 검출하는 방법에 사용하기 위한 정방향 (상류-, 5'-) 프라이머.
제21항에 있어서, 제1항에 따른 방법에 사용하기 위한 정방향 프라이머.
관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 신장부에 상보적임으로써 이에 혼성화될 수 있는 부분을 포함하는, 관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드를 정성적으로 및 정량적으로 검출하는 방법에 사용하기 위한 역방향 (하류-, 3'-) 프라이머.
제23항에 있어서, 제1항에 따른 방법에 사용하기 위한 역방향 프라이머.
관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 일부에 상보적인 부분 및 관심 대상 서열의 신장부에 상보적인 부분을 포함함으로써 이에 혼성화될 수 있는, 관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드를 정성적으로 및 정량적으로 검출하는 방법에 사용하기 위한 DNA 프로브.
제25항에 있어서, 제1항에 따른 방법에 사용하기 위한 DNA 프로브.
제19항에 따른 포획 프로브 및 적절한 패키징 수단을 포함하는, 샘플에서 관심의 대상인 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드의 존재를 정성적으로 및 정량적으로 검출하는 데 사용하기 위한 키트.
제20항, 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 방법을 수행하는 데 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함하는 키트.
제20항, 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 폴리머라제; 리보- 또는 데옥시리보-뉴클레오티드 트리포스페이트 (표지되거나 표지되지 않은 것); 표지 시약; 검출 시약; 프라이머 (표지되거나 표지되지 않은 것); 프로브 (표지되거나 표지되지 않은 것); 완충액 중 하나 이상을 추가로 포함하는 키트.
제29항에 정의된 바와 같은 약 8 내지 50개 뉴클레오타이드 길이의 짧은 핵산 서열, 바람직하게는 DNA 올리고뉴클레오티드 또는 개질된 DNA 올리고뉴클레오티드를 검출하기 위한 제1항의 방법의 용도.