KR20230123872A - 변형된 포획 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 포획 및 증폭시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract
기판 표면에서 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하기 위한 조성물이 제공된다. 조성물은 기판의 표면에 결합되고 변형된 핵산을 포함하는 복수의 포획 프라이머; 및 기판의 표면에 결합되고 변형된 핵산을 포함하는 복수의 직교 포획 프라이머를 포함할 수 있다. 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함할 수 있다. 직교 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함할 수 있다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 21일자로 출원되고 발명의 명칭이 "변형된 포획 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 포획 및 증폭시키기 위한 조성물 및 방법(Compositions and Methods for Capturing and Amplifying Target Polynucleotides Using Modified Capture Primers)"인 미국 특허 예비출원 제63/128,675호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 상기 ASCII 사본은 파일명이 IP-2054-PCT_SL.txt이며, 크기가 4,174 바이트이다.
기술분야
본 출원은 클러스터 증폭에 관한 것이다.
클러스터 증폭은 예를 들어 유전자 서열분석에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위한 접근법이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 플로우셀에서 기판 표면에 결합된 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 포획 프라이머)에 의해 포획되고, 표면 상의 무작위 위치에서 "시드"를 형성한다. 각각의 시드 주위의 표면 상에 클러스터를 형성하기 위해 증폭 사이클을 수행한다. 클러스터는 시드 폴리뉴클레오티드의 카피 및 상보적 카피(함께 "앰플리콘"으로 지칭될 수 있음)를 포함한다. 예를 들어, 도 1은 기판 상의 폴리뉴클레오티드의 증폭을 개략적으로 도시한다. 기판 영역(101) 상 단일 시드(111)의 포획 및 증폭은 시드(111)의 앰플리콘으로 기판 영역을 실질적으로 채울 수 있는 단일클론 클러스터(121)를 생성할 수 있는데, 이는 합성에 의한 서열분석 또는 SBS에 용이하게 사용될 수 있다(점선 및 점선 원은 시간에 따른 클러스터의 확장을 나타내도록 의도됨). 일부 상황에서, 기판은 각각의 클러스터로 충전될 수 있는 웰과 같은, 상이한 클러스터가 결합하는 영역을 정의하도록 패턴화된다.
본원에 제공된 예는 변형된 포획 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키는 것에 관한 것이다. 이러한 포획 및 증폭을 수행하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
일부 실시예에서, 기판의 표면에서 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하기 위한 조성물이 본원에 제공된다. 조성물은 기판의 표면에 결합된 복수의 포획 프라이머를 포함할 수 있다. 각각의 포획 프라이머는 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 조성물은 또한 기판의 표면에 결합된 복수의 직교 포획 프라이머를 포함할 수 있다. 각각의 직교 포획 프라이머는 변형된 핵산을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함한다. 일부 실시예에서, 포획 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 변형된 핵산 및 DNA는 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포된다. 일부 실시예에서, 변형된 핵산은 포획 프라이머의 5' 말단에 배치되고, DNA는 포획 프라이머의 3' 말단에 배치된다.
일부 실시예에서, 직교 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함한다. 일부 실시예에서, 직교 포획 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 변형된 핵산 및 DNA는 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포된다. 일부 실시예에서, 변형된 핵산은 직교 포획 프라이머의 5' 말단에 배치되고, DNA는 직교 포획 프라이머의 3' 말단에 배치된다.
일부 실시예에서, 조성물은 포획 프라이머에 상보적인 제1 어댑터 및 직교 포획 프라이머에 상보적인 제2 어댑터를 각각 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 조성물은 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 상보적인 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제1 어댑터는 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화되어 제1 이중체를 형성하고, 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제2 어댑터는 직교 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화되어 제2 이중체를 형성한다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 이중체는 각각 제2 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 대한 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 의해 형성될 제3 이중체의 용융 온도(Tm)보다 높은 Tm를 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 이중체는 각각 약 80℃ 내지 약 110℃ 사이인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 이중체는 각각 약 85℃ 내지 약 105℃ 사이인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 이중체는 각각 약 90℃ 내지 약 100℃ 사이인 Tm을 갖는다.
일부 실시예에서, 제2 표적 폴리뉴클레오티드 중 실질적으로 어떤 것도 용액 중에서 임의의 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되지 않는다.
일부 실시예에서, 조성물은 약 1% 내지 약 100% 포름아미드(%v/v), 또는 약 5% 내지 약 80% 포름아미드(%v/v)를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 조성물은 약 100 내지 약 800 mM Na+, 또는 약 200 내지 약 800 mM Na+를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 포획 프라이머는 변형된 P5 포획 프라이머이고, 직교 포획 프라이머는 변형된 P7 포획 프라이머이다.
일부 실시예에서, 각각의 포획 프라이머는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 직교 포획 프라이머는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함한다.
일부 실시예에서, 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함하거나; 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함하거나; 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함한다.
일부 실시예에서, 기판의 표면에서 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭하는 방법이 본원에 제공된다. 방법은 조성물을 유체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 조성물은 기판의 표면에 결합된 복수의 포획 프라이머(각각의 포획 프라이머는 변형된 핵산을 포함함); 및 기판의 표면에 결합된 복수의 직교 포획 프라이머(각각의 직교 포획 프라이머는 변형된 핵산을 포함함)를 포함할 수 있다. 유체는 제1 표적 폴리뉴클레오티드(각각은 포획 프라이머에 상보적인 제1 어댑터 및 직교 포획 프라이머에 상보적인 제2 어댑터를 포함함); 및 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 상보적인 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 방법은 유체 중 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 억제하면서, 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제1 어댑터를 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화하여 제1 이중체를 형성하는 단계; 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제2 어댑터를 직교 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화하여 제2 이중체를 형성하는 단계; 및 다음으로 제1 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계로서, 제1 표적 폴리뉴클레오티드의 각각의 앰플리콘을 생성하는 단계를 포함하는 증폭 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함한다. 일부 실시예에서, 포획 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 변형된 핵산 및 DNA는 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포된다. 일부 실시예에서, 변형된 핵산은 포획 프라이머의 5' 말단에 배치되고, DNA는 포획 프라이머의 3' 말단에 배치된다.
일부 실시예에서, 직교 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함한다. 일부 실시예에서, 직교 포획 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 변형된 핵산 및 DNA는 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포된다. 일부 실시예에서, 변형된 핵산은 직교 포획 프라이머의 5' 말단에 배치되고, DNA는 직교 포획 프라이머의 3' 말단에 배치된다.
일부 실시예에서, 제1 및 제2 이중체는 각각 제2 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 대한 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 의해 형성될 제3 이중체의 용융 온도(Tm)보다 높은 Tm를 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 이중체는 각각 약 80℃ 내지 약 110℃ 사이인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 이중체는 각각 약 85℃ 내지 약 105℃ 사이인 Tm을 갖는다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 이중체는 각각 약 90℃ 내지 약 100℃ 사이인 Tm을 갖는다.
일부 실시예에서, 제2 표적 폴리뉴클레오티드 중 실질적으로 어떤 것도 용액 중에서 임의의 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되지 않는다.
일부 실시예에서, 혼성화는 약 1% 내지 약 100% 포름아미드(%v/v), 또는 약 5% 내지 약 80% 포름아미드(%v/v) 중에서 수행된다.
일부 실시예에서, 혼성화는 약 100 내지 약 800 mM Na+, 또는 약 200 내지 약 800 mM Na+ 중에서 수행된다.
일부 실시예에서, 포획 프라이머는 변형된 P5 포획 프라이머이고, 직교 포획 프라이머는 변형된 P7 포획 프라이머이다.
일부 실시예에서, 각각의 포획 프라이머는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 직교 포획 프라이머는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함하거나; 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함하거나; 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 본원에서 설명되는 바와 같은 본 개시의 양태 각각의 임의의 각각의 특징부/예시는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 임의의 하나 이상의 이러한 양태로부터의 임의의 특징부/예시는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 양태(들)의 특징부와 함께 임의의 적절한 조합으로 구현될 수 있음을 이해할 것이다.
도 1은 기판 상의 폴리뉴클레오티드의 증폭을 개략적으로 도시한다.
도 2a 내지 도 2c는 이전에 공지된 포획 프라이머를 사용하는 기판 상의 폴리뉴클레오티드의 포획을 위한 공정 흐름에서의 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다.
도 3a 내지 도 3h는 본 발명의 포획 프라이머를 사용하는 기판 상의 폴리뉴클레오티드의 포획 및 증폭을 위한 예시적인 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다.
도 4는 일부 실시예에 따른, 폴리뉴클레오티드와 본 발명의 포획 프라이머 중 하나 사이의 예시적인 이중체를 개략적으로 도시한다.
도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 포획 프라이머에 의한 폴리뉴클레오티드의 포획에 대한 조건의 예시적인 효과를 예시하는 도표이다.
도 6은 본 발명의 포획 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키는 방법에서의 작업의 예시적인 흐름을 도시한다.
도 2a 내지 도 2c는 이전에 공지된 포획 프라이머를 사용하는 기판 상의 폴리뉴클레오티드의 포획을 위한 공정 흐름에서의 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다.
도 3a 내지 도 3h는 본 발명의 포획 프라이머를 사용하는 기판 상의 폴리뉴클레오티드의 포획 및 증폭을 위한 예시적인 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다.
도 4는 일부 실시예에 따른, 폴리뉴클레오티드와 본 발명의 포획 프라이머 중 하나 사이의 예시적인 이중체를 개략적으로 도시한다.
도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 포획 프라이머에 의한 폴리뉴클레오티드의 포획에 대한 조건의 예시적인 효과를 예시하는 도표이다.
도 6은 본 발명의 포획 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키는 방법에서의 작업의 예시적인 흐름을 도시한다.
본원에 제공된 예는 변형된 포획 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키는 것에 관한 것이다. 이러한 포획 및 증폭을 수행하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
본원에 제공된 변형된 포획 프라이머는 이전에 공지된 포획 프라이머보다 표적 폴리뉴클레오티드와 더 강하게 혼성화할 수 있고, 이와 같이 표적 폴리뉴클레오티드가 기판 상에 포획되는 효율을 향상시킬 수 있다. 예시적으로, 더 강한 결합 때문에, 이전에 공지된 포획 프라이머와 비교하여 보다 낮은 농도의 표적 폴리뉴클레오티드가 기판 상의 클러스터를 제조하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 2a 내지 도 2c를 참조하여 하기에 추가로 기술되는 바와 같은 방식으로, 이전에 공지된 프라이머를 사용한 폴리뉴클레오티드 포획 및 증폭은 표면 혼성화 및 용액-기반 어닐링이 경쟁 공정으로서 작동하는 조건 하에서 수행될 수 있으며, 이는 일부 폴리뉴클레오티드가 포획 또는 증폭에 이용불가능하게 한다. 비교하면, 도 3a 내지 도 3h, 도 4, 도 5a 내지 도 5c 및 도 6을 참조하여 기술된 것과 같은 방식으로, 본 포획 프라이머는, 경쟁 공정으로서 용액-기반 어닐링을 감소시키거나 억제하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드 포획 및 증폭이 수행될 수 있게 하며, 이와 같이, 이전에 알려진 포획 프라이머와 비교하여 포획 및 증폭을 위한 폴리뉴클레오티드의 이용가능성을 실질적으로 증가시킬 수 있고, 기판 상의 클러스터를 제조하기 위해 더 높은 농도의 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것을 허용할 수 있고, 전체 시딩 시간을 감소시킬 수 있다.
먼저, 본원에서 사용되는 일부 용어들이 간략하게 설명될 것이다. 이어서, 본 발명의 포획 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 포획 및 증폭시키기 위한 일부 예시적인 조성물 및 예시적인 방법이 기재될 것이다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 "갖다", "갖는다", 및 "가진"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 청구항의 전제부에서든 또는 본문에서든, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형(open-ended) 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계들을 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징부들 또는 구성요소들을 포함하지만, 또한 추가의 특징부들 또는 구성요소들을 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "실질적으로", "대략", 및 "약"은, 예를 들어 가공에 있어서의 변동으로 인한 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 변동은 ±10% 이하, 예를 들어 ±5% 이하, 예를 들어 ±2% 이하, 예를 들어 ±1% 이하, 예를 들어 ±0.5% 이하, 예를 들어 ±0.2% 이하, 예를 들어 ±0.1% 이하, 예를 들어 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "혼성화"는 이중 가닥 "이중체"를 형성하기 위해 폴리뉴클레오티드의 길이를 따라 제1 폴리뉴클레오티드를 제2 폴리뉴클레오티드에 비공유결합시키는 것을 의미하고자 한다. 예를 들어, 2개의 DNA 폴리뉴클레오티드 가닥은 상보적 염기 쌍을 통해 결합할 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 결합의 강도는 이들 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 서열 사이의 상보성에 따라 증가한다. 폴리뉴클레오티드 간의 혼성화의 강도는 이중체의 50% 가 서로 해리된 폴리뉴클레오티드 가닥을 갖는 용융 온도(Tm)를 특징으로 할 수 있다. 서로 "부분적으로"혼성화된 폴리뉴클레오티드는 이들이 서로 상보적인 서열을 갖지만 이러한 서열은 이들의 길이의 일부만을 따라 서로 혼성화되어 부분 이중체를 형성한다는 것을 의미한다. 혼성화에 대한 "불능성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 불충분한 수의 염기가 서로 혼성화하기 위한 방식으로 서로 접촉할 수 있도록 서로 물리적으로 분리된 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 당 모이어티, 적어도 하나의 포스페이트기를 포함하는 골격 성분, 및 일부 예시에서 또한 핵염기를 포함하는 분자를 의미하고자 한다. 핵 염기가 결여된 뉴클레오티드는 "무염기"로 지칭될 수 있다 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 포스페이트 당 골격 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 뉴클레오티드의 예는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 티미딘 디포스페이트(TDP), 티미딘 트리포스페이트(TTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 디포스페이트 (dCDP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(dUDP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 또한 자연 발생 뉴클레오티드와 비교하여 변형된 핵 염기, 당 모이어티 및/또는 골격 성분(예컨대, 포스페이트 또는 아미드)을 포함하는 뉴클레오티드의 유형을 지칭하도록 의도된 임의의 "뉴클레오티드 유사체"를 포함하도록 의도된다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 "변형된 핵산"으로도 지칭될 수 있다 예시적인 변형된 핵염기는 이노신, 잔타닌, 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸 시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸 아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필 구아닌, 2-프로필 아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-하이드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌 등을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 유사체는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 아데노신 5'-포스포설페이트와 같은 뉴클레오티드 유사체에 혼입될 수 없다. 뉴클레오티드의 골격 성분은 임의의 적합한 수의 포스페이트, 예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 6개 초과의 포스페이트를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 또한 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 및 5-하이드록실부티닐-2'-데옥시우리딘("슈퍼 T")을 포함한다. LNA는 리보스 모이어티가 2' 산소 및 4' 탄소를 연결하는 추가 가교를 포함하는 RNA-유사 골격을 포함한다. PNA는 펩티드 결합에 의해 연결된 반복 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위, 및 메틸렌 가교 및 카르보닐기를 통해 골격에 결합된 핵염기를 포함하는 골격을 포함한다. 슈퍼 T는 5-하이드록시부티닐-2'-데옥시유리딘 핵염기를 포함한다. LNA, PNA 및 슈퍼 T에 대한 예시적인 구조가 하기에 나타나 있다:
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 서로 결합된 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 중합체의 하나의 비제한적인 예이다. 폴리뉴클레오티드의 예는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 이의 유사체, 예컨대, 잠금 핵산(LNA) 및 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열, 예컨대, RNA 또는 단일 가닥 DNA, 뉴클레오티드의 이중 가닥 서열, 예컨대, 이중 가닥 DNA일 수 있거나 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열과 이중 가닥 서열의 혼합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 게놈 DNA, 및 PCR 및 증폭 생성물을 포함한다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 dsDNA로 전환될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 폴리뉴클레오티드는 거울상이성질체 DNA, LNA 또는 PNA와 같은 비천연 발생 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 정확한 서열은 공지되거나 알려지지 않을 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, 발현된 서열 태그(EST) 또는 유전자 발현의 연속 분석(SAGE) 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머 또는 전술한 것 중 어느 하나의 증폭된 카피. 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 PNA, DNA 및 RNA, PNA 및 RNA 등의 인접한 섹션과 같은 상이한 유형의 폴리뉴클레오티드의 인접한 섹션을 포함하는 "키메라"구조를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "중합효소"는 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드로 중합시켜 폴리뉴클레오티드를 조립하는 활성 부위를 갖는 효소를 의미하는 것으로 의도된다. 중합효소는 프라이밍된 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있고, 성장하는 프라이머에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하여 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 갖는 "상보적 카피" 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 그 후, 다른 중합효소 또는 동일한 중합효소가 이러한 상보적 카피 폴리뉴클레오티드의 상보적 카피를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드의 카피를 형성할 수 있다. 임의의 이러한 카피는 본원에서 "앰플리콘"으로 지칭될 수 있다. DNA 중합효소는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합한 다음, 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥(성장 앰플리콘)의 3'말단의 유리 하이드록실기에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하여 표적 폴리뉴클레오티드 아래로 이동할 수 있다. DNA 중합효소는 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 분자를 합성할 수 있고, RNA 중합효소는 DNA 주형으로부터 RNA 분자를 합성할 수 있다(전사). 중합효소는 가닥 성장을 시작하기 위해 짧은 RNA 또는 DNA 가닥(프라이머)을 사용할 수 있다. 일부 중합효소는 이들이 사슬에 염기를 첨가하고 있는 부위 상류의 가닥을 치환할 수 있다. 이러한 중합효소는 가닥 치환인 것으로 언급될 수 있으며, 이는 중합효소에 의해 판독되는 주형 가닥으로부터 상보적 가닥을 제거하는 활성을 갖는 것을 의미한다. 가닥 치환 활성을 갖는 예시적인 중합효소는, 제한 없이, Bst(바실러스 스테아로써모필루스) 중합효소, 엑소-클레나우 중합효소 또는 서열분석 등급 T7 엑소-중합효소의 큰 단편을 포함한다. 일부 중합효소는 이들 전방의 가닥을 분해하여, 후방의 성장하는 사슬로 효과적으로 대체(5' 엑소뉴클레아제 활성)한다. 일부 중합효소는 이들 뒤의 가닥을 분해하는 활성(3' 엑소뉴클레아제 활성)을 갖는다. 일부 유용한 중합효소는 돌연변이에 의해 또는 그렇지 않으면 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머"는 뉴클레오티드가 유리 3' OH기를 통해 첨가될 수 있는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 프라이머는 블록이 제거될 때까지 중합을 방지하는 3' 블록을 포함할 수 있다. 프라이머는 커플링 반응을 허용하거나 프라이머를 또 다른 모이어티에 결합시키기 위해 5' 말단에 변형을 포함할 수 있다. 프라이머는 UV 광, 화학, 효소 등과 같은 적합한 조건 하에서 절단될 수 있는 8-옥소-G와 같은 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다. 프라이머 길이는 임의의 적합한 수의 염기만큼 길 수 있으며, 임의의 적합한 천연 및 비천연 뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 프라이머에 혼성화하는 (이에 상보적인 서열을 가지는) "어댑터"를 포함할 수 있고, 프라이머의 유리 3' OH기에 뉴클레오티드를 첨가함으로써 상보적 카피 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 증폭될 수 있다. "포획 프라이머" 는 기판에 결합되고 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 어댑터에 혼성화될 수 있는 프라이머를 의미하고자 하는 반면, "직교 포획 프라이머"는 기판에 결합되고 그 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 어댑터에 혼성화될 수 있는 프라이머를 의미하는 것으로 의도된다. 제1 어댑터는 포획 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있고, 제2 어댑터는 직교 포획 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 서로 상이하고 독립적인 서열을 가질 수 있다. 추가적으로, 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 적어도 하나의 다른 특성에서 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 서로 다른 길이를 가질 수 있거나; 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머 중 하나는 다른 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머에서는 결여된 비핵산 모이어티(예컨대, 차단기 또는 절제 모이어티)를 포함할 수 있거나; 이러한 특성의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다. "변형된 포획 프라이머"는, 이에 제한되지는 않으나, LNA, PNA, 또는 슈퍼 T와 같은 복수의 핵산 유사체를 포함하는 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머이다. 변형된 포획 프라이머는 DNA와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 복수의 자연 발생 핵산을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기판"은 본원에 기재된 조성물에 대한 지지체로서 사용되는 물질을 지칭한다. 예시적인 기판 재료는 유리, 실리카, 플라스틱, 석영, 금속, 금속 산화물, 유기-실리케이트(예를 들어, 다면체 유기 실세스퀴옥산(POSS)), 폴리아크릴레이트, 탄탈륨 옥사이드, 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. POSS의 예는 그 전체가 참조로서 포함된 Kehagias 등의 문헌[Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있다. 일부 예시에서, 본 출원에 사용된 기판은 유리, 용융 실리카, 또는 다른 실리카-함유 물질과 같은 실리카계 기판을 포함한다. 일부 예시에서, 기판은 실리콘, 실리콘 질화물, 또는 실리콘 수소화물을 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 본 출원에 사용된 기판은 플라스틱 물질 또는 구성요소, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함한다. 예시적인 플라스틱 물질은 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스티렌, 및 사이클릭 올레핀 중합체 기판을 포함한다. 일부 예시에서, 기판은 실리카계 물질 또는 플라스틱 물질 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 예시에서, 기판은 유리 또는 규소계 중합체를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일부 예시에서, 기판은 금속을 포함할 수 있다. 일부 이러한 예시에서, 금속은 금이다. 일부 예시에서, 기판은 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일 예시에서, 표면은 산화탄탈륨 또는 산화주석을 포함한다. 아크릴아미드, 에논 또는 아크릴레이트도 또한 기판 물질 또는 성분으로서 사용될 수 있다. 다른 기판 재료는, 이에 제한되지는 않으나, 갈륨 비소, 인듐 포스파이드, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 일부 예시에서, 기판 및/또는 기판 표면은 석영일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 예시에서, 기판 및/또는 기판 표면은 GaAs 또는 ITO와 같은 반도체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 전술한 목록은 본 출원을 예시하는 것으로 의도되며, 이들로 제한하고자 함이 아니다. 기판은 단일 몰질 또는 복수의 상이한 물질을 포함할 수 있다. 기판은 복합체 또는 라미네이트일 수 있다. 일부 예시에서, 기판은 유기-실리케이트 물질을 포함한다. 기판은 편평한, 둥근, 구형, 막대 형상, 또는 임의의 다른 적합한 형상일 수 있다. 기판은 강성 또는 가요성일 수 있다. 일부 예시에서, 기판은 비드 또는 플로우 셀이다.
일부 예시에서, 표면은 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 기판의 노출된 층 상 또는 그 안의 상이한 영역들의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 영역들 중 하나 이상은 하나 이상의 포획 프라이머가 존재하는 특징부일 수 있다. 특징부는 포획 프라이머가 존재하지 않는 틈새 영역(interstitial region)에 의해 분리될 수 있다. 일부 예시에서, 패턴은 행(row) 및 열(column)로 있는 특징부의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 예시에서, 패턴은 특징부 및/또는 틈새 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 예시에서, 패턴은 특징부 및/또는 틈새 영역의 무작위 배열일 수 있다. 일부 예시에서, 기판은 표면에 웰의 어레이(함몰부)를 포함한다. 웰은 실질적으로 수직 측벽에 의해 제공될 수 있다. 웰은, 포토리소그래피, 스탬핑 기법, 몰딩 기법 및 마이크로에칭 기법을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 기법들을 사용하여 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 사용되는 기법은 어레이 기재의 조성 및 형상에 의존할 것이다.
기판의 패턴화된 표면 내의 특징부는 유리, 실리콘, 플라스틱 또는 패턴화된, 공유 결합된 겔을 갖는 다른 적합한 물질(들), 예컨대 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM) 상의 웰의 어레이(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)내 웰을 포함할 수 있다. 공정은 다수의 사이클을 갖는 서열분석 실행에 걸쳐서 안정적일 수 있는 서열분석을 위해 사용되는 겔 패드들을 생성한다. 웰에 대한 중합체의 공유 결합은 다양한 사용 중 구조화된 기판의 수명 전체에 걸쳐서 구조화된 특징부 내에 겔을 유지하는 데 도움이 될 수 있다. 그러나, 많은 예에서, 겔이 웰에 공유 결합될 필요는 없다. 예를 들어, 일부 조건에서, 구조화된 기판의 어느 부분에도 공유결합으로 부착되지 않은 실란 비함유 아크릴아미드(SFA)가 겔 물질로서 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 구조화된 기판은 적합한 물질로 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)을 패턴화시키고, 패턴화된 물질을 겔 물질(예를 들어, PAZAM, SFA 또는 이들의 화학적으로 변형된 변이체, 예컨대 SFA의 아지도 분해된 버전(아지도-SFA))로 코팅하고, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 연마를 통해서 겔 코팅된 물질의 표면을 연마하여 웰 내에 겔을 보유시키지만 웰들 사이의 구조화된 기판의 표면 상의 틈새 영역로부터 실질적으로 모든 겔을 제거하거나 불활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 프라이머는 겔 물질에 부착될 수 있다. 다음으로, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단편화된 인간 게놈 또는 이의 부분)를 포함하는 용액은 개별 표적 폴리뉴클레오티드가 겔 물질에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해 개별 웰에 시딩하도록 연마된 기판과 접촉될 수 있다; 그러나, 겔 물질의 부재 또는 불활성으로 인해 표적 폴리뉴클레오티드는 틈새 영역을 점유하지 않을 것이다. 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭은 틈새 영역 내 겔의 부재 또는 비활성이 성장하는 클러스터의 외향 이동을 방지할 수 있기 때문에 웰로 한정될 것이다. 공정은 편리하게 제조가능하고, 확장가능하며, 종래의 마이크로- 또는 나노-제조 방법을 활용한다.
패턴화된 기판은 예를 들어 슬라이드 또는 칩에 에칭된 웰을 포함할 수 있다. 웰의 에칭 및 기하학적 구조의 패턴은 다양한 상이한 형상 및 크기를 취할 수 있고, 이러한 특징부는 물리적으로 또는 기능적으로 서로 분리 가능할 수 있다. 이러한 구조적 특징부를 갖는 특히 유용한 기판은 미소구체와 같은 고체 입자의 크기를 선택할 수 있는 패턴화된 기판을 포함한다. 이러한 특성을 갖는 예시적인 패턴화된 기판은 BEAD 어레이 기술(llumina, Inc., San Diego, Calif)과 관련하여 사용되는 에칭된 기판이다.
일부 실시예에서, 본원에 설명된 기판은 플로우 셀의 적어도 일부를 형성하거나 플로우 셀에 위치되거나 또는 그에 결합된다. 플로우 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 분할되는 유동 챔버를 포함할 수 있다. 본원에 제시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 플로우 셀의 제조를 위한 예시적인 플로우 셀 및 기판은, 이에 제한되지는 않으나, 일루미나 사(San Diego, Calif.)로부터 상업적으로 입수 가능한 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 기판의 표면을 덮는 층과 관련하여 사용될 때 용어 "직접" 등은 층이 예를 들어 접착제 층 또는 중합체 층과 같은 특정한 중간 층 없이 기판의 표면을 덮는 것을 의미하도록 의도된다. 표면을 직접 덮는 층은 공유 결합 또는 비공유 접착을 포함하는 임의의 화학적 또는 물리적 상호작용을 통해 이 표면에 부착될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때 용어 "고정된"은 공유 또는 비공유 결합(들)을 통한 기판에 대한 직접 또는 간접 부착을 의미하도록 의도된다. 특정 실시예에서, 공유결합 부착이 사용될 수 있거나, 기판을 사용하도록 의도된 조건 하에, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 증폭 또는 서열분석 시, 폴리뉴클레오티드가 고정되거나 기판에 부착된 상태로 유지되는 임의의 다른 적합한 부착이 사용될 수 있다. 포획 프라이머로서 또는 표적 폴리뉴클레오티드로서 사용되는 폴리뉴클레오티드는, 3'-말단이 효소 연장에 이용 가능하고 서열의 적어도 일부가 상보적 서열에 혼성화될 수 있도록 고정될 수 있다. 고정화는 표면 부착된 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 통해 발생할 수 있으며, 이 경우 고정된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 3'-5' 배향일 수 있다. 대안적으로, 고정화는 공유결합적 부착과 같은 염기쌍 혼성화 이외의 수단에 의해 발생할 수 있다. 예시적으로, 화학적 작용기는 화학적 링커를 통해 본 발명의 포획 프라이머 중 하나의 5'말단에 혼입될 수 있다. 포획 프라이머 상의 화학적 작용성은 비공유결합적 상호 작용(들)(예를 들어, 정전기, 금속-리간드 결합, 혼성화 등) 또는 공유결합적 상호 작용(들)(예를 들어, 구리 클릭 화학 반응, 구리 유리 클릭 화학 반응 등) 중 하나 이상의 임의의 적합한 조합을 통해 기판 표면에 부착될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "어레이"는 상대적 위치에 따라 서로 구별될 수 있는 기판 영역의 집단을 지칭한다. 어레이의 다른 부위에 있는 다른 분자(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)는 어레이 내의 영역의 위치에 따라 서로 구별될 수 있다. 어레이의 개별 영역은 특정 유형의 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기판 영역은 특정 서열을 갖는 단일 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 기판 영역은 동일한 서열(또는 이의 상보적 서열)을 갖는 몇몇 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 어레이의 영역은 동일한 기판 상에서 서로 상이한 특징부를 각각 포함할 수 있다. 예시적인 특징부는, 제한 없이, 기판 내의 웰, 기판 내 또는 기판 상의 비드(또는 다른 입자), 기판로부터의 돌출부, 기판 상의 릿지(ridge) 또는 기판 내의 채널을 포함한다. 어레이의 영역은 각각 서로 상이한 기판 상에 상이한 영역을 포함할 수 있다. 별도의 기판에 부착된 상이한 분자는 기판이 결합된 표면 상의 기판의 위치에 따라, 또는 액체 또는 겔 내의 기판의 위치에 따라 식별될 수 있다. 별도의 기판이 표면에 위치하는 예시적인 어레이는 웰에 비드를 갖는 어레이를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "복수"는 둘 이상의 상이한 부재의 집단을 의미하도록 의도된다. 복수는 작은, 중간, 큰, 매우 큰 크기의 범위일 수 있다. 작은 복수의 크기는, 예를 들어, 수 개의 부재 내지 수십 개의 부재의 범위일 수 있다. 중간 크기의 복수는, 예를 들어, 수십 부재 내지 약 100개의 부재 또는 수백 개의 부재의 범위일 수 있다. 큰 복수는, 예를 들어, 약 수백개의 부재 내지 약 1000개의 부재, 수천 개의 부재 및 최대 수만 개의 부재의 범위일 수 있다. 매우 큰 복수는, 예를 들어, 수만 개의 부재 내지 약 수십만, 백만, 수백만, 수천만 및 최대 수억 또는 수억을 초과하는 부재의 범위일 수 있다. 따라서, 복수는 크기에서 2개에서부터 억을 초과하는 부재뿐 아니라 부재의 수에 의해 측정된 바와 같은, 그 사이, 그리고 전술한 예시적인 범위보다 더 큰 모든 크기의 범위일 수 있다. 예시적인 폴리뉴클레오티드 복수는, 예를 들어, 약 1×105 이상, 5×105 이상, 또는 1×106 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드의 집단을 포함한다. 따라서, 이러한 용어의 정의는 2를 초과하는 모든 정수 값을 포함하도록 의도된다. 복수의 상한은 예를 들어 샘플 내 폴리뉴클레오티드 서열의 이론적 다양성에 의해 설정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이중 가닥"은 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 폴리뉴클레오티드 내 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 상보적 폴리뉴클레오티드 내 각각의 뉴클레오티드에 수소 결합됨을 의미하고자 한다. "부분" 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는 이의 뉴클레오티드의 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%, 그러나 이의 전체 뉴클레오티드보다는 적게 상보적 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드에 수소 결합된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 가닥"은 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 본질적으로 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드 중 어느 것도 상보적 폴리뉴클레오티드 내 각각의 뉴클레오티드에 수소 결합되지 않음을 의미한다. 다른 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 "불능성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 폴리뉴클레오티드"는 분석 또는 작용의 대상인 폴리뉴클레오티드를 의미하고자 하는 것이며, 또한 "라이브러리 폴리뉴클레오티드", "주형 폴리뉴클레오티드"또는 "라이브러리 주형"으로도 지칭될 수 있다 분석 또는 작용은 폴리뉴클레오티드를 포획, 증폭, 서열분석 및/또는 다른 절차에 적용하는 것을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 분석될 표적 서열에 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 분석될 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 옆에 위치하는 프라이머 결합 부위로서 기능하는 어댑터를 포함하는 하나 이상의 어댑터를 포함할 수 있다. 포획 프라이머에 혼성화된 표적 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 전부가 연장될 수는 없는 방식으로 포획 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단을 넘어 연장되는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 서로 상이한 서열을 가질 수 있지만, 서로 동일한 제1 및 제2 어댑터를 가질 수 있다. 특정 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 측면에 위치할 수 있는 2개의 어댑터는 서로 동일한 서열, 또는 서로 상보적 서열을 가질 수 있거나, 2개의 어댑터는 상이한 서열을 가질 수 있다. 따라서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드에서의 종은, 예를 들어, 서열분석(예를 들어, SBS)에 의해 평가될 미지의 서열의 영역 옆에 위치하는 공지된 서열의 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 말단에 어댑터를 보유하고, 이러한 어댑터는 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 위치할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 어떠한 어댑터도 없이 사용될 수 있으며, 이 경우 프라이머 결합 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 내에서 발견되는 서열로부터 직접 유래할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 상이한 용어는 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 크기, 서열 또는 다른 특성에서 임의의 특정한 차이를 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 설명의 명확성을 위해, 여러 폴리뉴클레오티드 종을 포함하는 특정 방법 또는 조성물을 설명할 때 하나의 폴리뉴클레오티드의 종을 다른 것으로부터 구별하기 위해 용어가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "앰플리콘"은, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 폴리뉴클레오티드를 카피하는 산물을 의미하며, 여기서 산물은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 실질적으로 동일하거나 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. "증폭" 및 "증폭하는"은 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 제조하는 공정을 지칭한다. 표적 핵산의 제1 앰플리콘은 상보적 카피일 수 있다. 추가 앰플리콘은 제1 앰플리콘의 생성 후에, 표적 폴리뉴클레오티드로부터 또는 제1 앰플리콘으로부터 생성된 카피이다. 후속 앰플리콘은 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적이거나 표적 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 소수의 돌연변이(예를 들어, 증폭 아티팩트에 기인함)는 그 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 생성할 때 발생할 수 있음을 이해할 것이다.
주어진 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘만을 실질적으로 포함하는 기판 영역은 "단일클론"으로 지칭될 수 있는 반면, 서로 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 포함하는 기판 영역은 "다중클론"으로 지칭될 수 있다. 기판의 다중클론 영역은 각각이 단일클론인 상이한 서브영역들을 그 안에 포함할 수 있다. 각각의 이러한 단일클론 영역은 더 큰 다중클론 영역 내에 또는 그 자체든지 간에, "시드"로부터 생성된 "클러스터"에 상응할 수 있다 "시드"는 단일 표적 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있는 반면, "클러스터"는 그 표적 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘의 집합을 지칭할 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키는 조성물 및 방법
본원에 제공된 예시는, 변형된 포획 프라이머가 용액으로부터 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하는 동안, 용액-기반 어닐링을 감소시키거나 억제하는 조건 하에서 사용될 수 있는 변형된 포획 프라이머를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 비교하면, 이전에 알려진 포획 프라이머는 용액-기반 어닐링이 용액으로부터의 표적 폴리뉴클레오티드의 포획과 경쟁하는 조건 하에서 사용될 수 있고, 이러한 경쟁은 포획을 위한 표적 폴리뉴클레오티드의 이용가능성을 감소시킨다.
예를 들어, 도 2a 내지 도 2c는 이전에 공지된 포획 프라이머를 사용하여 기판 상의 폴리뉴클레오티드를 포획하기 위한 공정 흐름에서의 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다. 도 2a에 도시된 조성물(2000)은 기판에 결합된 포획 프라이머(231) 및 직교 포획 프라이머(232)를 갖는 기판(200)뿐만 아니라, 표적 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 합성에 의한 서열분석(SBS)을 이용하여 포획, 증폭, 및 서열분석하고자 하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 유체(용액)를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 서로 상보적인 서열을 갖는 표적 폴리뉴클레오티드 사이에 이중체(예시적으로, 이중체 D1, D2 및 D3)의 형태를 포함하거나 이중체의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 이중체(D1)는 서열(211), 제1 어댑터(221), 및 제2 어댑터(222)를 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드 및 제1 표적 뉴클레오티드에 상보적인, 예를 들어, 상보적 서열(211'), 제1 상보적 어댑터(221') 및 제2 상보적 어댑터(222')를 포함하는 제2 표적 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 이중체(D2)는 서열(212), 제1 어댑터(221), 및 제2 어댑터(222)를 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드 및 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인, 예를 들어 상보적 서열(212'), 제1 상보적 어댑터(221') 및 제2 상보적 어댑터(222')를 포함하는 제2 표적 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 이중체(D3)는 서열(213), 제1 어댑터(221), 제2 어댑터(222)를 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드 및 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인, 예를 들어 상보적 서열(212'), 제1 상보적 어댑터(221') 및 제2 상보적 어댑터(222')를 포함하는 제2 표적 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 서열(211, 212 및 213)은 서로 상이할 수 있고, SBS를 사용하여 이들 서열을 결정하는 것이 바람직할 수 있다. 제1 어댑터(221)는 적합한 조건 하에서 혼성화할 수 있도록 포획 프라이머(231)에 상보적일 수 있고, 제2 어댑터(222)는 적합한 조건 하에서 혼성화할 수 있도록 직교 포획 프라이머(232)에 상보적일 수 있다. 구체적으로 도시되지 않았지만, 각각의 포획 프라이머(231) 또는 각각의 직교 포획 프라이머(232)는 절단 가능한 모이어티, 예컨대 8-옥소-G를 포함할 수 있다.
포획 프라이머(231)는, 예를 들어 P5 포획 프라이머일 수 있고, 직교 포획 프라이머(232)는, 예를 들어 P7 포획 프라이머일 수 있다. 일루미나 사(San Diego, CA)로부터 상업적으로 입수 가능한 P5 포획 프라이머는 서열 5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'(서열번호 1)을 갖는다. 또한, 일루미나 사로부터 상업적으로 입수 가능한 P7 포획 프라이머는 서열 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'(서열번호 2)를 갖는다. 제1 어댑터(221)는, 예를 들어 상보적 P5 어댑터(cP5)일 수 있고, 제2 어댑터(222)는, 예를 들어 상보적 P7 어댑터(cP7)일 수 있다. 일루미나 사(San Diego, CA)로부터 상업적으로 입수 가능한 상보적 P5 어댑터는 서열 5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'(서열번호 3)을 갖는다. 일루미나 사(San Diego, CA)로부터 상업적으로 입수 가능한 상보적 P7 어댑터는 서열 5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'(서열번호 4)을 가질 수 있다.
추후 증폭 및 서열분석을 위해 기판(200) 상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하려고 시도하기 전에, 이중체(D1, D2 및 D3)는 도 2b에 예시된 바와 같은 방식으로 용융되어, 포획 프라이머(231)와의 혼성화에 이용가능한 제1 어댑터(221) 및 직교 포획 프라이머(232)와의 혼성화에 이용가능한 제2 어댑터(222)를 갖는 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드를 얻는다. 이러한 용융은, 예를 들어, 이중체(D1, D2 및 D3)가 배치되는 용액의 온도 및/또는 조성을 변경함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 이중체(D1, D2 및 D3)는 용액 중 충분한 양의 포름아미드, 예를 들어 약 1% 내지 100% 포름아미드(%v/v), 또는 약 5% 내지 약 80% 포름아미드(%v/v), 또는 약 10% 내지 약 50% 포름아미드(%v/v), 또는 약 1% 내지 약 20% 포름아미드(%v/v)에 노출되어, 이중체가 현재 용액 온도에서 해리되게 할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 현재 용액 조성물에서 용액의 온도는 이중체의 용융 온도(Tm)를 초과하도록 증가할 수 있다. 이중체의 특정 Tm은 이중체 내 폴리뉴클레오티드의 길이 및 서열뿐만 아니라 용액의 조성(예를 들어, 존재하는 경우 염(Na+) 농도 및 포름아미드 농도)에 의존할 수 있음을 이해할 것이다.
도 2b를 참조하여 기술된 바와 같이 이중체(D1, D2 및 D3)가 용융된 후, 제1 어댑터(221)는 포획 프라이머(231)와의 혼성화에 이용가능할수 있고, 제2 어댑터(222)는 직교 포획 프라이머(232)와의 혼성화에 이용가능할 수 있다. 그러나, 이러한 용융을 야기하는 용액 및 온도 조건은 또한 제1 어댑터(221)가 포획 프라이머(231)에 혼성화되는 것을 억제할 수 있고, 제2 어댑터(222)가 직교 포획 프라이머(232)에 혼성화되는 것을 억제할 수 있다. 따라서, 이러한 혼성화를 촉진하고, 이에 따라 기판(200) 상의 표적 폴리뉴클레오티드의 포획을 촉진하기 위해, 표적 폴리뉴클레오티드가 다시 배치되는 용액의 온도 및/또는 조성이 변경될 수 있다. 예를 들어, 현재 용액 온도에서 충분한 양의 포름아미드가 용액으로부터 제거될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 현재 용액 조성물에서 용액의 온도는 (a) 제1 어댑터(221)와 포획 프라이머(231) 및 (b) 제2 어댑터(222)와 직교 포획 프라이머(232) 사이의 이중체의 용융 온도(Tm) 미만으로 감소될 수 있다.
도 2c에 예시된 비제한적인 예시에서, 이러한 조건, 예를 들어 용액 온도 및/또는 조성물에서의 추가적인 변화는 서열(211)에 결합된 제2 어댑터(222)와 포획 프라이머(232) 중 하나 사이의 혼성화; 및 서열(213)에 결합된 제1 어댑터(221)와 포획 프라이머(231) 중 하나 사이의 혼성화를 용이하게 한다. 그러나, 이러한 조건에서의 추가적인 변화는 또한 용액 중의 표적 폴리뉴클레오티드 사이의 어닐링을 용이하게 한다. 예를 들어, 서로 상보적인 서열을 각각 포함하는 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드는, 예시적으로, 이들의 길이를 따라 재어닐링하여 이중체(D2)를 재형성하는 서열(212 및 212')처럼 그들의 길이를 따라 서로 재어닐링될 수 있다. 추가적으로, 서로 상보적이지 않은 서열을 포함하는 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드는, 예시적으로, 도 2c에 예시된 바와 같은 방식으로 실질적으로 이들의 어댑터에서만 어닐링하여 이중체(D4)를 형성하는 비상보적 서열(214 및 211')처럼, 예를 들어 어댑터(221 및 221')와 어댑터(222 및 222')에서 서로 부분적으로 어닐링할 수 있다. 용액 중에서 어닐링하여 이중체를 형성하는 표적 폴리뉴클레오티드, 예시적으로, 도 2c에 도시된 비제한적인 예시에서 서열(212 및 214)을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드는 포획 프라이머(231) 또는 직교 포획 프라이머(232)와의 혼성화에 이용가능하지 않고, 따라서 포획되지 않을 수 있어서, 증폭되거나 서열분석되지 않고 남겨질 수 있다.
비교하면, 본 발명의 변형된 포획 프라이머는 용액 내 어닐링이 실질적으로 발생하지 않을 수 있는 조건 하에서, 예를 들어, 염 농도, 포름아미드 함량 및/또는 용액 내 어닐링이 실질적으로 발생하지 않을 수 있는 온도에서 표적 폴리뉴클레오티드의 어댑터와 혼성화될 수 있다. 이와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드는 이러한 용액에서 실질적으로 이중체를 형성하도록 어닐링되지 않아서, 본 발명의 포획 프라이머와의 혼성화에 이용가능하도록 유지될 수 있으며, 이후 이들은 증폭되고 서열분석되거나 그렇지 않으면 원하는 대로 사용될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 변형된 포획 프라이머는 용액 내 표적 폴리뉴클레오티드의 어댑터 또는 포획 프라이머에 대한 임의의 비특이적 또는 비생산적 혼성화를 억제하는 조건 하에서 표적 폴리뉴클레오티드의 어댑터와 혼성화될 수 있으며, 이에 따라 실질적으로 모든 혼성화 사건이 생산적일 수 있고, 서열분석될 수 있는 이중체를 생성할 것으로 예상될 수 있다.
도 3a 내지 도 3h는 본 발명의 포획 프라이머를 사용하는 기판 상의 폴리뉴클레오티드의 포획 및 증폭을 위한 예시적인 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다. 도 3a에 도시된 조성물(3000)은 기판에 결합된 포획 프라이머(331) 및 직교 포획 프라이머(332)를 갖는 기판(300)뿐만 아니라, 표적 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 합성에 의한 서열분석(SBS)을 사용하여 포획, 증폭 및 서열분석하도록 의도된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 유체(용액)를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 서로 상보적인 서열을 갖는 표적 폴리뉴클레오티드 사이에 이중체(예시적으로, 이중체 D5, D6 및 D7)의 형태를 포함하거나 이중체의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 도 2a를 참조하여 설명된 것과 유사한 방식으로, 이중체(D5)는 서열(311), 제1 어댑터(321) 및 제2 어댑터(322)를 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드 및 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인, 예를 들어 상보적 서열(311'), 제1 상보적 어댑터(321') 및 제2 상보적 어댑터(322')를 포함하는 제2 표적 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 이중체(D6)는 서열(312), 제1 어댑터(321) 및 제2 어댑터(322)를 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드, 및 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인, 예를 들어 상보적 서열(312'), 제1 상보적 어댑터(321') 및 제2 상보적 어댑터(322')를 포함하는 제2 표적 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 유사하게, 이중체(D7)는 서열(313), 제1 어댑터(321) 및 제2 어댑터(322)를 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드 및 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 상보적인, 예를 들어, 상보적 서열(312'), 제1 상보적 어댑터(321') 및 제2 상보적 어댑터(322')를 포함하는 제2 표적 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 서열(311, 312 및 313)은 서로 상이할 수 있고, SBS를 사용하여 이들 서열을 결정하는 것이 바람직할 수 있다. 제1 어댑터(321)는 포획 프라이머(331)에 상보적일 수 있어서, 적합한 조건 하에 혼성화될 수 있고, 제2 어댑터(322)는 변형된 직교 포획 프라이머(332)에 상보적일 수 있어서, 적합한 조건 하에서 이에 혼성화될 수 있다.
포획 프라이머(331) 각각은 제1 어댑터(321)와 상보적 제1 어댑터(321') 사이의 이중체의 Tm과 비교하여 포획 프라이머(331)와 제1 어댑터(321) 사이의 이중체의 Tm을 증가시키는 복수의 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포획 프라이머(331)의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 제1 어댑터(321)와 상보적 제1 어댑터(321') 사이의 이중체의 Tm과 비교하여 포획 프라이머(331)와 제1 어댑터(321) 사이의 이중체의 Tm을 증가시킬 것으로 예상될 수 있다. 포획 프라이머(331)는 DNA를 추가로 포함할 수 있다. 변형된 핵산 및 DNA는 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포될 수 있다. 예를 들어, 포획 프라이머(331)의 서열은 하나 이상의 DNA 분자, 이어서 하나 이상의 변형된 핵산, 이어서 하나 이상의 DNA 분자, 이어서 하나 이상의 변형된 핵산 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 도 4를 참조하여 하기에 기재된 바와 같은 방식으로, 변형된 핵산은 포획 프라이머의 5' 말단에 배치될 수 있고, DNA는 포획 프라이머의 3' 말단에 배치된다. 구체적으로 예시되지는 않았지만, 각각의 포획 프라이머(331)는 또한 절단 가능한 모이어티, 예컨대 8-옥소-G를 포함할 수 있다.
유사하게, 각각의 직교 포획 프라이머(332)는 제2 어댑터(322)와 상보적 제2 어댑터(322') 사이의 이중체의 Tm과 비교하여 직교 포획 프라이머(332)와 제2 어댑터(322) 사이의 이중체의 Tm을 증가시키는 복수의 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 직교 포획 프라이머(332)의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함할 수 있으며, 이들 각각은 제2 어댑터(322)와 상보적 제2 어댑터(322') 사이의 이중체의 Tm과 비교하여 직교 포획 프라이머(332)와 제2 어댑터(322) 사이의 이중체의 Tm을 증가시킬 것으로 예상될 수 있다. 직교 포획 프라이머(332)는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 핵산 및 DNA는 직교 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포될 수 있다. 예를 들어, 직교 포획 프라이머(332)의 서열은 하나 이상의 DNA 분자, 이어서 하나 이상의 변형된 핵산, 이어서 하나 이상의 DNA 분자, 이어서 하나 이상의 변형된 핵산 등을 포함할 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 도 4를 참조하여 하기에 기재된 바와 같은 방식으로, 변형된 핵산은 포획 프라이머의 5' 말단에 배치될 수 있고, DNA는 포획 프라이머의 3' 말단에 배치된다. 구체적으로 예시되지는 않았지만, 각각의 직교 포획 프라이머(332)는 또한 절단 가능한 모이어티, 예컨대 8-옥소-G를 포함할 수 있다.
포획 프라이머(331)의 변형된 핵산은, 반드시 그럴 필요는 없지만, 동일한 유형의 직교 포획 프라이머(332)의 변형된 핵산일 수 있다. 예시적으로, 포획 프라이머(331) 및 직교 포획 프라이머(332)는 LNA를 포함할 수 있거나; 포획 프라이머(331) 및 직교 포획 프라이머(332)는 PNA를 포함할 수 있거나; 포획 프라이머(331) 및 직교 포획 프라이머(332)는 슈퍼 T를 포함할 수 있다. 대안적으로, 포획 프라이머(331)는 LNA를 포함할 수 있는 반면, 직교 포획 프라이머(332)는 PNA 또는 슈퍼 T를 포함할 수 있거나; 포획 프라이머(331)는 PNA를 포함할 수 있는 반면, 직교 포획 프라이머(332)는 LNA 또는 슈퍼 T를 포함할 수 있거나; 포획 프라이머(331)는 슈퍼 T를 포함할 수 있는 반면, 직교 포획 프라이머(332)는 LNA 또는 PNA를 포함할 수 있다. 또 다른 예시에서, 직교 포획 프라이머(332)는 LNA를 포함할 수 있는 반면, 포획 프라이머(331)는 PNA 또는 슈퍼 T를 포함할 수 있거나; 직교 포획 프라이머(332)는 PNA를 포함할 수 있는 반면, 포획 프라이머(331)는 LNA 또는 슈퍼 T를 포함할 수 있거나; 직교 포획 프라이머(332)는 수퍼 T를 포함할 수 있는 반면, 포획 프라이머(331)는 LNA 또는 PNA를 포함할 수 있다.
LNA는 DNA를 유사하게 모사하되, 2' 및 4' 탄소를 연결하는 링커에만 변화를 갖는다. PNA는 카르복실산기 및 아미노기를 갖고, 폴리펩티드와 유사하게 구조화된다. 슈퍼 T는 부틴기를 갖는 변형된 티미딘 염기를 포함한다. LNA 및 슈퍼 T 염기 변형의 경우, 분자 구조의 증가된 강성 및 더 강한 염기 적층은 DNA/DNA 이중체(321-321' 또는 322-322')와 비교하여, 이중체 상호작용(321-331 또는 322-332)의 결합 에너지를 증가시킬 수 있다. 한편, 비하전된 PNA(321-331 또는 322-332)를 함유하는 이중체의 용융점은 감소된 정전기 척력으로 인해 DNA/DNA 이중체(321-321' 또는 322-322')와 비교하여 증가될 수 있다. 포획 프라이머 서열이 이러한 변형된 핵산을 포함하도록 변형될 때, 표면/용액 이중체(321-331 또는 322-332) 사이의 용융점은 용액/용액 DNA 이중체(321-321' 또는 322-322')의 용융점보다 유의하게 더 높아질 수 있다. 이는 표적 폴리뉴클레오티드(311, 312, 313)가 용액에서 어댑터의 재어닐링을 허용하지 않는 조건의 세트(예를 들어, 염 농도, 포름아미드 농도 및 온도)에서 시딩될 수 있게 한다. 이와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드(311, 312, 313)는 도 2c를 참조하여 기술된 바와 같은 어댑터 재어닐링으로 실질적으로 손실되지 않으면서 시딩될 수 있다.
추후의 증폭 및 서열분석을 위해 기판(300) 상의 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하기 위한 시도 이전에, 이중체(D5, D6, 및 D7)는 도 3b에 예시된 바와 같은 방식으로 용융되어 포획 프라이머(331)와 혼성화하기 위해 이용 가능한 제1 어댑터(321) 및 직교 포획 프라이머(332)와 혼성화하기 위해 이용 가능한 제2 어댑터(322)를 갖는 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드를 얻는다. 도 2b를 참조하여 설명된 것과 유사한 방식으로, 이러한 용융은, 예를 들어, 이중체(D5, D6, 및 D7)가 배치되는 용액의 온도 및/또는 조성을 변경함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 이중체(D5, D6, 및 D7)는 용액 중 충분한 양의 포름아미드, 예를 들어 약 1% 내지 100% 포름아미드(%v/v), 또는 약 5% 내지 약 80% 포름아미드(%v/v), 또는 약 10% 내지 약 50% 포름아미드(%v/v), 또는 약 1% 내지 약 20% 포름아미드(%v/v)에 노출되어, 이중체가 현재 용액 온도에서 해리되게 할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 현재 용액 조성물에서 용액의 온도는 이중체의 용융 온도(Tm)를 초과하도록 증가할 수 있다. 이중체의 특정 Tm은 이중체 내 폴리뉴클레오티드의 길이 및 서열뿐만 아니라 용액의 조성(예를 들어, 존재하는 경우 염(Na+) 농도 및 포름아미드 농도)에 의존할 수 있음을 이해할 것이다.
이중체(D5, D6, 및 D7)가 도 3b를 참조하여 기술된 바와 같이 용융된 후, 제1 어댑터(321)는 포획 프라이머(331)에 혼성화될 수 있고, 제2 어댑터(322)는 도 3c에 도시된 바와 같은 방식으로, 이중체(D5, D6, 및 D7)를 용융시키는 데 사용된 동일한 조건에서 직교 포획 프라이머(332)에 혼성화될 수 있다. 즉, 이러한 용융을 야기하는 용액 및 온도 조건은 제1 어댑터(321)가 포획 프라이머(331)에 혼성화되는 것을 억제하지 않을 수 있고, 제2 어댑터(322)가 직교 포획 프라이머(332)에 혼성화되는 것을 억제하지 않을 수 있다. 대신에, 이러한 조건은 어댑터(321)와 상보적 어댑터(321') 사이의 임의의 어닐링 및 어댑터(322)와 상보적 어댑터(322') 사이의 임의의 재어닐링을 억제할 수 있고, 따라서 도 2c를 참조하여 설명된 바와 같이 임의의 이중체의 형성을 억제할 수 있다. 이와 같이, 각각의 표적 폴리뉴클레오티드는 포획에 이용가능하게 유지될 수 있고, 이중체(D5, D6, 및 D7)를 용융시키는 데 사용된 조건을 변경할 필요 없이, 예를 들어, 포름아미드의 농도를 감소시킬 필요 없이 그리고 용액 온도를 감소시킬 필요 없이, 기판 상에서 포획될 수 있다.
도 3c에 예시된 비제한적인 예에서, 용액에서 표적 폴리뉴클레오티드 간의 어닐링을 억제하는 조건에서, 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제1 어댑터(321)는 포획 프라이머(331) 중 각각의 하나에 혼성화되어 제1 이중체를 형성하고, 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제2 어댑터(322)는 직교 포획 프라이머(332) 중 각각의 하나에 혼성화되어 제2 이중체를 형성한다. 제1 및 제2 이중체는 각각 제2 표적 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 대한 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 의해 형성될 제3 이중체의 용융 온도(Tm)보다 높은 Tm을 가질 수 있다. 예시적으로, 서열(312)에 결합된 제1 어댑터(321)는 포획 프라이머(331) 중 하나에 혼성화되어 이중체(D8)를 형성하고; 서열(311)에 결합된 제2 어댑터(322)는 직교 포획 프라이머(332) 중 하나에 혼성화되어 이중체 D9를 형성하고; 서열(313)에 결합된 제2 어댑터(322)는 직교 포획 프라이머(332) 중 하나에 혼성화되어 이중체(D10)를 형성한다.
제1 어댑터(321)와 포획 프라이머(331) 사이의 이중체의 Tm은 제1 어댑터(321)와 상보적 제1 어댑터(321') 사이의 이중체의 Tm보다 높을 수 있으며, 예를 들어 제1 어댑터(321)와 상보적 제1 어댑터(321') 사이의 이중체의 Tm을 적어도 약 5℃, 적어도 약 10℃, 적어도 약 15℃, 적어도 약 20℃, 또는 적어도 약 25℃만큼 초과할 수 있다. 유사하게, 제2 어댑터(322)와 직교 포획 프라이머(332) 사이의 이중체의 Tm은 제2 어댑터(322)와 상보적 어댑터(322') 사이의 이중체의 Tm보다 높을 수 있는데, 예를 들어, 제1 어댑터(321)와 상보적 제1 어댑터(321') 사이의 이중체의 Tm을 적어도 약 5℃, 적어도 약 10℃, 적어도 약 15℃, 적어도 약 20℃, 또는 적어도 약 25℃만큼 초과할 수 있다. 이와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드는 제1 어댑터(321)와 포획 프라이머(331) 사이의 이중체의 Tm 및 제2 어댑터(322)와 직교 포획 프라이머(332) 사이의 이중체의 Tm 미만이고 제1 어댑터(321)와 상보적 제1 어댑터(321') 사이의 이중체의 Tm을 초과하고 제2 어댑터(322)와 상보적 제2 어댑터(322') 사이의 이중체의 Tm을 초과하는 온도에서 기판(300) 상에 포획될 수 있다.
예시적으로, 도 3c에 도시된 이중체(D8, D9, 및 D10)의 Tm은 도 2a 및 도 2c를 참조하여 설명된 이중체(D1, D2, D3 및 D4) 중 임의의 것의 Tm보다 높을 수 있다. 예를 들어, 이중체(D8, D9, 및 D10)는 각각 약 80℃ 내지 약 110℃ 사이, 예를 들어 약 85℃ 내지 약 105℃ 사이, 또는 약 90℃ 내지 약 100℃ 사이인 용융 온도(Tm)를 가질 수 있다. 비교하면, 이중체(D1, D2, D3, 및 D4)의 Tm은 약 80℃ 미만, 예를 들어 약 75℃ 미만, 약 70℃ 미만, 약 65℃ 미만, 또는 약 60℃ 미만일 수 있다. 용액 중 어댑터간의 이중체의 Tm과 비교하여 어댑터와 표면 프라이머 사이의 이중체의 유의하게 다른 Tm의 결과로서, 실질적으로 용액 중 어떠한 제2 표적 폴리뉴클레오티드도 임의의 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되지 않는다. 이와 같이, 이중체(D8, D9, 및 D10)는 이중체(D1, D2, D3, 및 D4)가 형성되지 않을 수 있는 특정 조건에서 쉽게 형성될 수 있다. 이중체는, 예를 들어, 푸와송 분포에 따라 기판(300)의 표면 상 상이한 위치에 형성될 수 있다. 구체적으로 도시되지는 않았지만, 기판(300)이 패턴화되어, 예를 들어, 그 안에 이중체가 각각 형성될 수 있고, 그 안에 클러스터가 후속적으로 증폭을 사용하여 형성될 수 있는 상이한 영역을 정의할 수 있음을 이해할 것이다. 추가적으로, 도 3a 내지 도 3h를 참조하여 설명된 실시예는 편평한 기판의 사용을 제안하는 것으로 예시되지만, 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드가 각각 시딩되고 그 안에 실질적으로 단일클론 클러스터가 형성될 수 있는 웰을 포함하는 더 복잡한 기판이 사용될 수 있다는 것이 명백해야 한다.
도 3d에 도시된 바와 같이, 도 3c를 참조하여 설명된 초기 혼성화 후, 각각의 표적 폴리뉴클레오티드(311, 312, 313)가 증폭되어 각각의 앰플리콘(311', 312', 313')을 형성할 수 있다. 이러한 증폭 후, 표적 폴리뉴클레오티드(311, 312, 313)는 도 3e에 예시된 바와 같은 방식으로 탈혼성화될 수 있는 반면, 앰플리콘(311', 312', 및 313')은 기판(300)에 공유 결합된 상태로 유지된다. 이러한 탈혼성화가 반드시 수행될 필요는 없다는 점에 주목한다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드(311, 312, 313)의 탈혼성화 대신, 이러한 폴리뉴클레오티드는 기판에 혼성화된 채로 유지될 수 있고, 당업계에 공지되고 ExAmp로 지칭될 수 있는 가닥 침습 공정을 사용하여 추가로 증폭될 수 있다.
도 3f에 도시된 바와 같이, 도 3d 및 도 3e를 참조하여 설명된 초기 증폭 이후, 생성된 앰플리콘은 기판(300) 상의 다른 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머에 잠재적으로 혼성화되도록 구부러질 수 있다. 예를 들어, 앰플리콘(311')의 상보적 제1 어댑터(321')는 포획 프라이머(331) 중 하나에 혼성화될 수 있고; 앰플리콘(312')의 상보적 제2 어댑터(322')는 직교 포획 프라이머(332) 중 하나에 혼성화될 수 있고; 앰플리콘(313')의 상보적 제1 어댑터(321')는 포획 프라이머(331) 중 하나에 혼성화될 수 있다. 앰플리콘의 어댑터와 각각의 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머 사이의 이중체는 이중체(D8, D9 및 D10)와 유사하거나 동일한 Tm을 가질 수 있으며, 따라서 표적 폴리뉴클레오티드의 추가 증폭을 촉진하도록 혼성화된 상태로 유지될 수 있다.
도 3g는 다른 증폭 작업 후 도 3f의 조성물을 도시한다. 조성물이 앰플리콘(311')의 추가적인 앰플리콘(311); 앰플리콘(312')의 추가적인 앰플리콘(312); 및 앰플리콘(313')의 추가적인 앰플리콘(313)을 포함한다는 것을 알 수 있다. 이러한 추가적인 앰플리콘은 이들이 생성된 앰플리콘에 혼성화될 수 있다. 용액은 도 3h에 예시된 바와 같은 방식으로 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머로부터 앰플리콘의 어댑터를 탈혼성화하기 위해 증가될 수 있다. 증폭 작업은 앰플리콘(311, 311', 312, 312', 313, 및 313')의 추가 앰플리콘을 생성하기 위해 임의의 적합한 횟수로 반복될 수 있다. 증폭 작업은 실질적으로 단일클론 클러스터, 예를 들어, 각각 표적 폴리뉴클레오티드(311, 312 또는 313)의 앰플리콘으로 각각의 기판 영역(구체적으로 예시되지 않음)을 실질적으로 채우도록 임의의 적합한 횟수로 수행될 수 있다. 예를 들어, 각각의 기판 영역 내의 앰플리콘은 하나의 선택된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 60%의 앰플리콘, 또는 하나의 선택된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 70%의 앰플리콘, 또는 하나의 선택된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 80% 앰플리콘, 또는 하나의 선택된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 90% 앰플리콘, 또는 하나의 선택된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 95% 앰플리콘, 또는 하나의 선택된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 98% 앰플리콘, 또는 하나의 선택된 표적 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 99%의 앰플리콘, 또는 하나의 선택된 표적 폴리뉴클레오티드의 약 100% 앰플리콘을 각각 포함할 수 있다.
위에서 언급된 바와 같이, 일부 예시에서, 특정 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 비뉴클레오티드 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 비뉴클레오티드 모이어티는, 이에 제한되지는 않으나, 이를 통해 포획 프라이머의 일부가 선택적으로 제거될 수 있는 절제 모이어티를 포함할 수 있다. 절제 모이어티는 임의의 적합한 프라이머(들)의 길이를 따라 임의의 적합한 위치에 위치할 수 있고, 반드시 그럴 필요는 없지만, 서로 동일한 유형의 절제 모이어티일 수 있다. 도 3e 내지 도 3h를 참조하여 설명된 바와 같은 원하는 수의 추가 증폭 작업에 이어서, 포획 프라이머(331) 또는 직교 포획 프라이머(332)의 부분은 적합한 효소(들) 또는 시약(들)을 절제 모이어티와 반응시킴으로써 제거될 수 있다.
본 발명의 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 이들 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머 사이의 이중체의 Tm을 충분히 증가시키는 임의의 적합한 수, 유형 및 배열의 변형된 핵산, 및 표적 폴리뉴클레오티드의 어댑터를 포함할 수 있다. 도 4는 일부 실시예에 따른, 폴리뉴클레오티드와 본 발명의 포획 프라이머 중 하나 사이의 예시적인 이중체를 개략적으로 도시한다. 도 4에 도시된 비제한적인 예시에서, 변형된 핵산(441)(예컨대 PNA 또는 LNA)은 포획 프라이머(331)의 5' 말단에 배치되고, DNA(442)는 포획 프라이머의 3' 말단에 배치된다. 선택적인 T-스페이서(443)는 DNA(442)와 기판(400)의 표면(예를 들어, 플로우셀) 사이에 배치된다. 함께, 변형된 핵산(441) 및 DNA(442)는 "키메라" 이식 프라이머 구조를 제공하는 것으로 간주될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 변형된 핵산 서열(441)에 상보적인 제1 서브서열(341)을 포함하는 어댑터(321)에 결합된 라이브러리 주형(311), 및 DNA의 서열(442)에 상보적인 제2 서브서열(342)을 포함할 수 있다. 대안적으로, 변형된 핵산(예컨대 PNA, LNA, 또는 슈퍼 T) 및 DNA는 위에서 추가로 기재된 바와 같은 방식으로 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포된다. 직교 포획 프라이머(332)는 도 4에 도시된 포획 프라이머(331)와 유사하게 구성될 수 있으며, 예를 들어, 키메라 이식 프라이머 구조를 포함할 수 있지만, 상이한 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 변형된 핵산(예컨대 PNA, LNA, 또는 슈퍼 T) 및 DNA는 위에서 추가로 기재된 바와 같은 방식으로 직교 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포될 수 있다.
일부 예시에서, 각각의 포획 프라이머(331)는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함할 수 있고, 각각의 직교 포획 프라이머(332)는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 그러나, 변형된 핵산의 수는, 기판 표면에서 이중체 형성을 허용하면서 용액에서 이중체 형성을 억제하는 조건에서 사용하기 위해 적절한 Tm을 얻도록 적합하게 조정될 수 있고, 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 서로 동일한 수, 유형 또는 분포의 변형된 핵산을 포함할 필요는 없는 것으로 이해될 것이다. 예시적으로, 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함할 수 있고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함할 수 있거나; 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함할 수 있고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함할 수 있거나; 각각의 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함할 수 있고, 각각의 직교 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함할 수 있다.
포획 프라이머(331) 및 직교 포획 프라이머(332)는 변형된 핵산을 포함하지만, 그렇지 않으면 포획 프라이머(231 및 232)와 유사하거나 동일한 서열을 가질 수 있다는 점에 유의한다. 즉, 포획 프라이머(331)는 변형된 P5 포획 프라이머일 수 있고, 여기서 직교 포획 프라이머는 변형된 P7 포획 프라이머이다. 예를 들어, 포획 프라이머(331)는 본원의 다른 곳에 제공된 서열을 갖는 P5 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있으며, 여기서 P5 DNA 염기 중 적어도 일부는 PNA, LNA, 또는 슈퍼 T 유사체로 대체된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 직교 포획 프라이머(332)는 본원의 다른 곳에 제공된 서열을 갖는 P7 프라이머일 수 있거나 이를 포함할 수 있으며, 여기서 P7 DNA 염기 중 적어도 일부는 이들의 PNA, LNA, 또는 슈퍼 T 유사체로 대체된다. 다양한 길이의 LNA를 포함하는 키메라 P5 및 P7 서열의 비제한적인 예로서, 키메라 P5 또는 P7 서열과 이들 각각의 어댑터 cP5 또는 cP7(750 mM Na+) 사이의 이중체에 대하여 계산된 Tm이 하기 표 1에 제공되어 있으며, 진한 텍스트는 LNA를 나타내고, 진하게 표시되지 않은 텍스트는 DNA를 나타낸다. 상업적으로 입수 가능한 P5 및 P7 서열, 및 P5 또는 P7 서열과 이들 각각의 어댑터 cP5 또는 cP7 사이의 이중체에 대하여 계산된 Tm이 참고를 위해 제공된다.
[표 1]
표 1에 제공된 실시예로부터, P5 서열의 경우, LNA로 15개의 DNA 염기를 대체하는 것은 해당 서열과 cP5 어댑터 사이의 이중체의 Tm을 약 21℃만큼 증가시킬 수 있고; 12개의 DNA 염기를 LNA로 대체하는 것은 해당 서열과 cP5 어댑터 사이의 이중체의 Tm을 약 16℃만큼 증가시킬 수 있고; 9개의 DNA 염기를 LNA로 대체하는 것은 해당 서열과 cP5 어댑터 사이의 이중체의 Tm을 약 11℃만큼 증가시킬 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 추가적으로, 표 1에 제공된 실시예로부터, P7 서열의 경우, 15개의 DNA 염기를 LNA로 대체하는 것은 해당 서열과 cP7 어댑터 사이의 이중체의 Tm을 약 21℃만큼 증가시킬 수 있고; 12개의 DNA 염기를 LNA로 대체하는 것은 해당 서열과 cP7 어댑터 사이의 이중체의 Tm을 약 17℃만큼 증가시킬 수 있고; 9개의 DNA 염기를 LNA로 대체하는 것은 해당 서열과 cP7 어댑터 사이의 이중체의 Tm을 약 12℃만큼 증가시킬 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 본원에 제공된 바와 같은 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머에 사용하기에 적합한 임의의 Tm을 제공하기 위해 임의의 서열에서 변형된 핵산의 수를 이해될 것이다.
본 발명의 변형된 포획 프라이머를 구현하는 것에 대한 하나의 고려사항은, 이러한 프라이머가 적합한 효소, 예컨대, 재조합 효소, 단일 가닥 결합 단백질 및 중합효소와 상용성이 있어서, 클러스터 생성 및 서열분석에 사용될 수 있다는 것이다. 도 4를 참조하여 기술된 것과 같은 PNA 또는 LNA를 포함하는 키메라 구조는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 하기 참고문헌에 기재된 것과 유사한 방식으로 이러한 효소와 상용성일 것으로 예상된다: Levin 등의 문헌["Position-dependent effects of locked nucleic acid (LNA) on DNA sequencing and PCR primers," Nucleic Acids Research 34(20): e142, 11 pages (2006)]; 및 Misra 등의 문헌["Polyamide nucleic acid-DNA chimera lacking the phosphate backbone are novel primers for polymerase reaction catalyzed by DNA polymerases," Biochemistry 37: 1917-1925 (1998)]. LNA에 대한 추가 정보는 그 전체 내용이 참조로서 본원에 포함된 Braasch 등의 문헌["Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA," Chemistry & Biology 8: 1-7 (2001)]에서 찾을 수 있다. 도 4를 참조하여 기술된 바와 같은 키메라 구조의 3' 말단에 DNA를 제공하는 것은, 효소가 상호작용할 가능성이 있는 위치에 비변형 DNA 염기를 위치시킴으로써 예상되는 효소 활성을 유지하는 데 도움이 될 수 있으며, 키메라 구조의 5' 말단에 변형된 핵산을 제공하는 것은, 어댑터에 대한 결합의 강도를 증강시킬 수 있다.
추가적으로, 본원의 다른 곳에서 언급되고, 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 임의의 주어진 이중체의 Tm은 이중체가 배치되는 용액의 조성에 기초하여 달라질 수 있다. 예를 들어, 포름아미드를 용액에 첨가하는 것은 주어진 이중체의 Tm을 감소시킬 수 있는 한편, 용액에 염을 첨가하는 것은 주어진 이중체의 Tm을 증가시킬 수 있다. 이와 같이, 본원에 제공된 예시적인 Tm(및 Tms 사이의 차이)는 순전히 예시적인 것이고, 이중체가 배치되는 용액의 특정 조성에 기초하여 달라질 수 있다. 도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 포획 프라이머에 의한 폴리뉴클레오티드의 포획에 대한 조건의 예시적인 효과를 예시하는 도표이다. 도 5a에 도시된 비제한적인 예시에서, 0% v/v 포름아미드 및 750 mM Na+를 포함하는 용액 중 이중 가닥 DNA(dsDNA)의 백분율은 cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체에 대한 온도의 함수(곡선(501))로서, 그리고 cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체에 대한 온도의 함수(곡선(502))로서 나타난다. LNA로 변형된 P7 포획 프라이머는 서열 CAAGC AGAAG ACGGC ATAC(8-옥소G) AGAT(서열번호 13)(여기서 진한 텍스트는 LNA를 나타냄)을 가졌고, cP7과 이중체화될 때 20℃ Tm을 갖는 것으로 모델링되었다.
도 5a에서, 약 77℃의 온도는 cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm에 상응하는 반면(곡선(501)), 약 91℃의 온도는 cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm에 상응한다(곡선(502))는 것을 알 수 있다. 약 85℃를 초과하는 온도에서, 곡선(501)은 cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 경우 dsDNA의 백분율이 미량(예를 들어, 1% 미만)이 된다는 것을 보여준다. 또한, 약 90℃ 미만의 온도에서, 곡선(501)은 cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 경우 dsDNA의 백분율이 대략 100% 임을 보여준다. 따라서, 도 5a에서, 약 85℃ 내지 90℃의 온도에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화가 실질적으로 완전히 억제될 수 있는 반면, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화는 매우 안정한 이중체를 형성한다는 것을 이해할 수 있다. 이와 같이, 이 온도 범위 내에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 고효율로 용액으로부터 포획될 수 있고, 실질적으로 도 2c를 참조하여 기술된 것과 같은 용액-기반 어닐링 공정에서의 경쟁이 없다. 이러한 작업을 수행하기에 적합한 특정 온도 범위는 용액의 특정 조성에 따라 달라질 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 다른 포획 프라이머 및 어댑터 서열은 이중체 형성에 있어서 유사한 온도에 따른 의존성을 나타낼 것으로 예상될 수 있다.
예를 들어, 도 5b에 도시된 비제한적인 예시에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm(곡선(503)) 및 cP7 및 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은(곡선(504))은, 750 mM Na+의 염 농도의 경우, 포름아미드 농도(%v/v)의 함수로서 나타낸다. 유사하게 도 5a에서와 같이, 0% v/v 포름아미드의 경우, 약 77℃의 온도는 cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm에 상응하는 반면(곡선(503)), 약 91℃의 온도는 cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm에 상응한다(곡선(504))는 것을 알 수 있다. 포름아미드의 농도가 증가함에 따라, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체 및 cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체에 대한 Tm 모두 감소한다. 예를 들어, 약 5% v/v 포름아미드의 농도에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 69℃까지 감소하고, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 88℃까지 감소한다. 약 10% v/v 포름아미드의 농도에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 66℃까지 감소하고, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 85℃까지 감소한다. 약 15% v/v 포름아미드의 농도에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 63℃까지 감소하고, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 82℃까지 감소한다. 약 20% v/v 포름아미드의 농도에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 58℃까지 감소하고, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 79℃까지 감소한다.
따라서, 도 5b에서, 임의의 주어진 포름아미드의 농도(예를 들어, 약 1% 내지 약 20% 포름아미드(%v/v), 또는 약 5% 내지 약 20% 포름아미드(%v/v)의 농도)에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화가 실질적으로 완전히 억제될 수 있으면서, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화는 매우 안정한 이중체를 형성하는 온도 범위가 존재한다는 것을 이해할 수 있다. 이와 같이, 이 온도 범위 내에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 고효율로 용액으로부터 포획될 수 있고, 실질적으로 도 2c를 참조하여 기술된 것과 같은 용액-기반 어닐링 공정에서의 경쟁이 없다. 임의의 다른 포획 프라이머 및 어댑터 서열은 이중체 형성에 있어서 유사한 포름아미드 농도에 따른 의존성을 나타낼 것으로 예상될 수 있다.
다른 예시로서, 도 5c에 도시된 비제한적인 예시에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체(곡선(505)) 및 cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체(곡선(506))에 대한 Tm은 염 농도(mM Na+)의 함수로서 나타난다. 750 mM Na+의 경우, 약 72℃의 온도는 cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm(곡선(505))에 상응하는 반면, 약 89℃의 온도는 cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm(곡선(506))에 상응한다는 것을 알 수 있다. 염의 농도가 감소함에 따라, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체 및 cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체에 대한 Tm은 모두 감소한다. 예를 들어, 약 500 mM Na+의 농도에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 70℃까지 감소하고, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 87℃까지 감소한다. 약 100 mM Na+의 농도에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 55℃까지 감소하고, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 77℃까지 감소한다. 약 0 mM Na+의 농도에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 42℃까지 감소하고, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중체의 Tm은 약 58℃까지 감소한다.
따라서, 도 5c로부터, 임의의 주어진 염의 농도(예를 들어, 약 100 내지 약 800 mM Na+, 또는 200 내지 약 800 mM Na+의 농도)에서, cP7과 P7 표준 라이브러리 포획 프라이머 사이의 혼성화가 실질적으로 완전히 억제될 수 있는 온도 범위가 존재하는 반면, cP7과 LNA로 변형된 P7 포획 프라이머 사이의 혼성화는 매우 안정한 이중체를 형성하는 온도 범위가 존재한다는 것이 이해될 수 있다. 이와 같이, 이 온도 범위 내에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 고효율로 용액으로부터 포획될 수 있고, 실질적으로 도 2c를 참조하여 기술된 것과 같은 용액-기반 어닐링 공정에서의 경쟁이 없다. 임의의 다른 포획 프라이머 및 어댑터 서열은 이중체 형성에서 유사한 염 농도에 유사한 의존성을 나타낼 것으로 예상될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 예시적인 조성물은 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키는 임의의 적합한 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 도 6은 본 발명의 변형된 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키기 위한 방법(600)에서의 작업의 예시적인 흐름을 도시한다. 방법(600)은 도 3a 내지 도 3h를 참조하여 설명된 조성물(3000)을 사용하여 구현될 수 있지만, 방법(600)은 임의의 다른 적합한 조성물을 사용하여 구현될 수 있다.
이제 도 6을 참조하면, 방법(600)은 (a) 기판의 표면에 결합된 복수의 포획 프라이머로서, 각각의 포획 프라이머는 변형된 핵산을 포함하는, 복수의 포획 프라이머, 및 (b) 기판의 표면에 결합된 복수의 직교 포획 프라이머로서, 각각의 직교 포획 프라이머는 변형된 핵산을 포함하는, 직교 포획 프라이머를 포함하는 조성물을 제공하는 단계(작업(610))를 포함할 수 있다. 조성물은 도 3a를 참조하여 설명된 조성물(3000)과, 유사할 수 있으며, 예를 들어, 기판(300)에 결합된 포획 프라이머(331) 및 직교 포획 프라이머(332)를 포함할 수 있다.
도 6에 예시된 방법(600)은 (a) 포획 프라이머에 상보적인 제1 어댑터 및 직교 포획 프라이머에 상보적인 제2 어댑터를 각각 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드; 및 (b) 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 상보적인 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유체를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 유체는 도 3a를 참조하여 기재된 바와 유사하게 구성될 수 있는데, 예를 들어, 각각이 제1 어댑터(321) 및 제2 어댑터(322)에 결합되는 표적 폴리뉴클레오티드(311, 312, 313)를 포함할 수 있고, 각각이 상보적 제1 어댑터(321') 및 상보적 제2 어댑터(322')에 결합되는 상보적 표적 폴리뉴클레오티드(311', 312' 313')를 포함할 수 있다.
도 6에 도시된 방법(600)은 조성물을 유체와 접촉시키는 단계(작업(630))를 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 작업(610)에서 제공된 조성물은 작업(620)에서 제공된 유체와 접촉될 수 있다. 예시적으로, 조성물은 플로우셀 내에 제공될 수 있고, 유체는 플로우셀 내의 조성물과 접촉하도록 유동된다.
도 6에 도시된 방법(600)은 유체 중의 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 억제하면서, (a) 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제1 어댑터를 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화하여 제1 이중체를 형성하는 단계 및 (b) 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제2 어댑터를 직교 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화하여 제2 이중체를 형성하는 단계(단계(640))를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3b 내지 도 3c를 참조하여 기재된 바와 같은 방식으로, 포획 프라이머에 대한 위한 제1 어댑터의 혼성화 및 직교 포획 프라이머에 대한 제2 어댑터의 혼성화는 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드가 서로 어닐링하는 것을 억제하는 조건 하에서 수행될 수 있다. 예시적인 조건은 본원의 다른 곳에서 제공된다. 동일한 세트의 조건이 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 간 서로로부터의 해리를 유발하고 제1 폴리뉴클레오티드의 어댑터와 본 포획 프라이머의 혼성화를 촉진하는 데 사용될 수 있다는 점에 유의한다. 비교하면, 이전에 알려진 포획 프라이머를 사용하는 것은 2가지 세트의 조건과 관련될 수 있는데, 제1 조건은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드의 서로로부터의 해리를 유발하고, 이어서 제2 조건은 이전에 공지된 포획 프라이머에 대한 제1 폴리뉴클레오티드의 어댑터의 혼성화를 촉진한다.
도 6에 예시된 방법(600)은 제1 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계를 추가로 포함할 수 있는데, 증폭 단계는 제1 표적 폴리뉴클레오티드의 각각의 앰플리콘을 생성하는 단계(작업(650))를 포함한다. 이러한 앰플리콘이 생성될 수 있는 방식의 비제한적인 예가 도 3d 내지 도 3h를 참조하여 제공된다.
따라서, 이전에 알려진 포획 프라이머는 비생산적 재혼성화 복합체가 용액에서 형성될 수 있는 조건 하에서 사용될 수 있지만, 본 발명의 변형된 포획 프라이머(직교 포획 프라이머를 포함)는 용액/용액 이중체와 비교하여 표면/용액 이중체에 더 강한 결합(및 더 높은 Tm)을 부여하는 변형된 핵산을 포함하는 서열을 사용함으로써 이러한 문제를 극복한다. 표면/용액 및 용액/용액 이중체 사이의 Tm의 차이는, 예를 들어 LNA, PNA, 슈퍼 T, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있는 변형된 포획 프라이머 서열을 사용함으로써 달성될 수 있다. 염기 변형을 포획 프라이머에 혼입함으로써, 표적 폴리뉴클레오티드의 어댑터가 표면에 혼성화될 수 있지만 용액 중의 다른 어댑터에는 혼성화될 수 없는 온도 요법이 존재한다.
이와 같이, 본 발명의 변형된 포획 프라이머는 하기 이점들 중 하나 이상을 제공한다:
A) 라이브러리 포획이 더 효율적이다. 적절한 경우에, 더 낮은 투입 농도의 표적 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다;
B) "플로우셀 상"의 표면 포획 후 변성은 더 높은 온도에서 수행될 수 있으며, 이는 적시에 혼성화를 선호하는 온도에 도달하기 위해 활성 냉각을 통합해야 할 필요성을 감소시키거나 제거할 수 있다; 그리고/또는
C) 큰 라이브러리를 필요로 하는 플로우셀은 시딩을 위한 다수의 유체 푸쉬를 이용할 수 있으며, 이는 턴어라운드 시간(TAT), 예를 들어, 샘플 제조의 시작부터 서열분석 데이터를 얻기까지의 시간을 크게 증가시킨다. 본 발명의 포획 프라이머에 의해 제공되는 더 높은 시딩 효율로, 더 적은 유체 푸쉬를 갖는 더 높은 농도의 표적 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것이 가능하다. 이는 시딩 중 시간을 절약할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 전술된 특정 작업과 함께 사용하는 것으로 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 도 3a 내지 도 3h는 "가교 증폭"또는 "표면-결합 중합효소 연쇄 반응"과 일치하는 작업으로 간주될 수 있지만, 본 발명의 조성물 및 방법은 다른 증폭 양식과 함께 사용하도록 쉽게 적응될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 증폭 양식 중 하나는 "배제 증폭"또는 ExAmp이다. 배제 증폭 방법은 기판 영역 당 단일 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 및 기판 영역에서 실질적으로 앰플리콘의 단일클론 집단의 생성을 허용할 수 있다. 예를 들어, 기판 영역 내에서 제1 포획된 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 속도는 기판 영역에서 표적 폴리뉴클레오티드의 훨씬 더 느린 이송 및 포획의 속도에 비해 신속할 수 있다. 이와 같이, 기판 영역에 포획된 제1 표적 폴리뉴클레오티드는 신속하게 증폭되고 전체 기판 영역을 채우므로, 동일한 기판 영역에서 추가적인 표적 폴리뉴클레오티드의 포획을 억제한다. 대안적으로, 제2 표적 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리뉴클레오티드 이후 동일한 기판 영역에 부착되는 경우, 제1 폴리뉴클레오티드의 상대적으로 신속한 증폭은 합성에 의한 서열분석을 수행하기에 충분히 강한 신호를 초래하도록 기판 영역을 충분히 채울 수 있다. 배제 증폭의 사용은 또한 단일클론 기판 영역의 초푸와송 분포를 초래할 수 있다 즉, 실질적으로 단일클론인 어레이 내 기판 영역의 분획은 푸와송 분포에 의해 예측된 분획을 초과할 수 있다.
더욱 실질적으로 단일클론인 기판 영역이 더 높은 품질 신호를 초래할 수 있고 따라서 SBS를 개선시킬 수 있기 때문에 유용한 클러스터의 초푸아송 분포를 증가시키는 것이 유용하다; 그러나, 표적 폴리뉴클레오티드를 기판 영역에 시딩하는 것은 공간적 푸아송 분포를 따를 수 있으며, 여기서 점유된 기판 영역의 수를 증가시키기 위한 트레이드오프는 다중클론 기판 영역의 수를 증가시킨다. 더 높은 초푸아송 분포를 얻는 한 가지 방법은 시딩이 신속하게 발생하고, 이어서 시딩된 표적 폴리뉴클레오티드 사이에 지연이 후속되는 것이다. 생화학적 반응 속도론을 통해 발생하는 것으로 생각되기 때문에, "운동학적 지연"이라고 하는 지연은 하나의 시딩된 표적 폴리뉴클레오티드에 다른 시딩된 표적보다 빠른 시작을 제공한다. 배제 증폭은 재조합효소가 서열 매칭을 매개할 때 이중 가닥 DNA(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드) 내로 프라이머 (예를 들어, 기판 영역에 부착된 프라이머)의 침습을 용이하게 하기 위해 재조합효소를 사용함으로써 작용한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 재조합효소가 서열 매칭을 매개할 때 본 발명의 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머의 표적 폴리뉴클레오티드로의 침입을 용이하게 하기 위해 재조합효소와 함께 사용하도록 조정될 수 있다. 실제로, 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 표면 기반 폴리뉴클레오티드 증폭 방법, 예컨대 열 PCR, 화학적으로 변성된 PCR, 및 효소적으로 매개된 방법(재조합효소 중합효소 증폭 (RPA) 또는 ExAmp로도 지칭될 수 있음)과 함께 사용하도록 조정될 수 있다.
추가 주석
다양한 예시적인 예가 위에서 설명되어 있지만, 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 속하는 이러한 모든 변경 및 수정을 포함하도록 의도된다.
본원에 기재된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 본원에서 설명되는 바와 같은 본 개시의 양태 각각의 임의의 각각의 특징부/예시는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 임의의 하나 이상의 이러한 양태로부터의 임의의 특징부/예시는 본원에 기재된 바와 같은 임의의 다른 양태(들)의 특징부와 함께 임의의 적절한 조합으로 구현될 수 있음을 이해할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> ILLUMINA, INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR CAPTURING AND AMPLIFYING TARGET
POLYNUCLEOTIDES USING MODIFIED CAPTURE PRIMERS
<130> IP-2054-PCT
<150> US 63/128,675
<151> 2020-12-21
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P5 capture primer
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P7 capture primer
<400> 2
caagcagaag acggcatacg a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Complementary P5 adapter
<400> 3
tcggtggtcg ccgtatcatt 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Complementary P7 adapter
<400> 4
tcgtatgccg tcttctgctt g 21
<210> 5
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> High Tm DNA/LNA chimeric P5/P7-Standard P5
<220>
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<222> (29)..(29)
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<212> DNA
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<223> High Tm DNA/LNA chimeric P5/P7-LNA-mod. P5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> High Tm DNA/LNA chimeric P5/P7-LNA-mod. P7
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(21)
<223> Locked Nucleic Acid (LNA)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n = 8-oxoG
<400> 10
ttttttcaag cagaagacgg catacnagat 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> High Tm DNA/LNA chimeric P5/P7-LNA-mod. P7
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(18)
<223> Locked Nucleic Acid (LNA)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n = 8-oxoG
<400> 11
ttttttcaag cagaagacgg catacnagat 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> High Tm DNA/LNA chimeric P5/P7-LNA-mod. P7
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(15)
<223> Locked Nucleic Acid (LNA)
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n = 8-oxoG
<400> 12
ttttttcaag cagaagacgg catacnagat 30
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LNA-modified P7 capture primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> Locked Nucleic Acid (LNA)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n = 8-oxoG
<400> 13
caagcagaag acggcatacn agat 24
Claims (48)
- 기판의 표면에서 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하기 위한 조성물로서,
상기 기판의 표면에 결합된 복수의 포획 프라이머로서, 각각의 포획 프라이머가 변형된 핵산을 포함하는, 복수의 포획 프라이머; 및
상기 기판의 표면에 결합된 복수의 직교 포획 프라이머로서, 각각의 직교 포획 프라이머가 변형된 핵산을 포함하는, 복수의 직교 포획 프라이머를 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함하는, 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포획 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 변형된 핵산 및 상기 DNA는 상기 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포되는, 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 변형된 핵산은 상기 포획 프라이머의 5' 말단에 배치되고, 상기 DNA는 상기 포획 프라이머의 3' 말단에 배치되는, 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 직교 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함하는, 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 직교 포획 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 변형된 핵산 및 상기 DNA는 상기 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포되는, 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 변형된 핵산은 상기 직교 포획 프라이머의 5' 말단에 배치되고, 상기 DNA는 상기 직교 포획 프라이머의 3' 말단에 배치되는, 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 포획 프라이머에 상보적인 제1 어댑터 및 상기 직교 포획 프라이머에 상보적인 제2 어댑터를 각각 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드; 및
상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 상보적인 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 조성물. - 제10항에 있어서, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제1 어댑터는 상기 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화되어 제1 이중체를 형성하고, 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제2 어댑터는 상기 직교 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화되어 제2 이중체를 형성하는, 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이중체는 각각 상기 제2 표적 폴리뉴크레오티드에 대해 상보적인 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 대한 상기 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 의해 형성될 제3 이중체의 용융 온도(Tm)보다 높은 Tm를 갖는, 조성물.
- 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이중체는 각각 약 80℃ 내지 약 110℃ 사이인 용융 온도(Tm)를 갖는, 조성물.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이중체는 각각 약 85℃ 내지 약 105℃ 사이인 용융 온도(Tm)를 갖는, 조성물.
- 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이중체는 각각 약 90℃ 내지 약 100℃ 사이인 용융 온도(Tm)를 갖는, 조성물.
- 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 상기 제2 표적 폴리뉴클레오티드 중 어떤 것도 용액 내에서 임의의 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되지 않는, 조성물.
- 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1% 내지 약 1000% 포름아미드(%v/v)를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약 5% 내지 약 80% 포름아미드(%v/v)를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100 내지 약 800 mM Na+를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제11항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 약 200 내지 약 800 mM Na+를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프라이머는 변형된 P5 포획 프라이머이고, 상기 직교 포획 프라이머는 변형된 P7 포획 프라이머인, 조성물.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 포획 프라이머는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 상기 직교 포획 프라이머는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 상기 직교 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 상기 직교 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함하는, 조성물.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 상기 직교 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함하는, 조성물.
- 기판의 표면에서 표적 폴리뉴클레오티드를 포획하고 증폭시키는 방법으로서,
조성물을 유체와 접촉시키는 단계로서, 상기 조성물은,
상기 기판의 표면에 결합된 복수의 포획 프라이머로서, 각각의 포획 프라이머가 변형된 핵산을 포함하는, 복수의 포획 프라이머; 및
상기 기판의 표면에 결합된 복수의 직교 포획 프라이머로서, 각각의 직교 포획 프라이머는 변형된 핵산을 포함하는, 복수의 직교 포획 프라이머를 포함하고;
상기 유체는,
상기 포획 프라이머에 상보적인 제1 어댑터 및 상기 직교 포획 프라이머에 상보적인 제2 어댑터를 각각 포함하는 제1 표적 폴리뉴클레오티드; 및
상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 상보적인 제2 표적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단계;
상기 유체 내 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 혼성화를 억제하면서,
상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제1 어댑터를 상기 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화하여 제1 이중체를 형성하는 단계;
상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 일부의 제2 어댑터를 상기 직교 포획 프라이머 중 각각의 하나에 혼성화하여 제2 이중체를 형성하는 단계; 및 이어서
상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 단계로서, 상기 증폭 단계는 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드의 각각의 앰플리콘을 생성하는 단계를 포함하는 것인 단계를 포함하는, 방법. - 제26항에 있어서, 상기 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함하는, 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 포획 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 변형된 핵산 및 상기 DNA는 상기 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포되는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 변형된 핵산은 상기 포획 프라이머의 5' 말단에 배치되고, 상기 DNA는 상기 포획 프라이머의 3' 말단에 배치되는, 방법.
- 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 직교 포획 프라이머의 변형된 핵산은 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA), 또는 슈퍼 T를 포함하는, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 직교 포획 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA)을 추가로 포함하는, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 변형된 핵산 및 상기 DNA는 상기 포획 프라이머의 5' 말단과 3' 말단 사이에 분포되는, 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 변형된 핵산은 상기 직교 포획 프라이머의 5' 말단에 배치되고, 상기 DNA는 상기 직교 포획 프라이머의 3' 말단에 배치되는, 방법.
- 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이중체는 각각 상기 제2 표적 뉴클레오티드에 대해 상보적인 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드 중 각각의 하나에 대한 상기 제2 표적 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 의해 형성될 제3 이중체의 용융 온도(Tm)보다 높은 Tm를 갖는, 방법.
- 제26항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이중체는 각각 약 80℃ 내지 약 110℃ 사이인 용융 온도(Tm)를 갖는, 방법.
- 제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이중체는 각각 약 85℃ 내지 약 105℃ 사이인 용융 온도(Tm)를 갖는, 방법.
- 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 이중체는 각각 약 90℃ 내지 약 100℃ 사이인 용융 온도(Tm)를 갖는, 방법.
- 제26항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 상기 제2 표적 폴리뉴클레오티드 중 어떤 것도 용액 중에서 임의의 상기 제1 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되지 않는, 방법.
- 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화는 약 1% 내지 약 100% 포름아미드(%v/v)에서 수행되는, 방법.
- 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화는 약 5% 내지 약 80% 포름아미드(%v/v)에서 수행되는, 방법.
- 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화는 약 100 내지 약 800 mM Na+에서 수행되는, 방법.
- 제26항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화는 약 200 내지 약 800 mM Na+에서 수행되는, 방법.
- 제26항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프라이머는 변형된 P5 포획 프라이머이고, 상기 직교 포획 프라이머는 변형된 P7 포획 프라이머인, 방법.
- 제26항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 포획 프라이머는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 상기 직교 포획 프라이머는 약 5개 내지 약 20개의 변형된 핵산을 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 상기 직교 포획 프라이머는 적어도 약 9개의 변형된 핵산을 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 상기 직교 포획 프라이머는 적어도 약 12개의 변형된 핵산을 포함하는, 방법.
- 제26항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 상기 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함하고, 각각의 상기 직교 포획 프라이머는 적어도 약 15개의 변형된 핵산을 포함하는, 방법.
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