KR20240026950A - 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 및 중합 - Google Patents
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Abstract
(a) 3'-차단된 뉴클레오티드, (b) 3'-OH 뉴클레오티드, (c) 연마 중합효소, 및 (d) 주형을 포함하는 용액을 제조하는 단계를 포함하는 뉴클레오티드를 정제하는 방법이 제공된다. 연마 중합효소 및 주형은 사용되어 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합하고 이에 따라 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시킨다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 5월 26일에 출원되고, "3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 및 중합"이라는 제목의 미국 특허 가출원 번호 63/193,413의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 출원은 뉴클레오티드를 정제하는 방법에 관한 것이다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2022년 5월 11일에 생성된 상기 ASCII 카피의 이름은 85491.01616.txt이고 크기는 3.09 킬로바이트이다.
생물학적 샘플 내에 존재하는 특이적 핵산 서열의 검출은, 예를 들어 미생물의 식별 및 분류, 감염성 질환의 진단, 유전적 이상의 검출 및 특성화, 암과 연관된 유전적 변화의 식별, 질환에 대한 유전적 감수성의 연구, 및 다양한 치료 유형에 대한 반응의 측정을 위한 방법으로 사용되어 왔다. 생물학적 샘플에서 특이적 핵산 서열을 검출하기 위한 일반적인 기술은 핵산 시퀀싱이다.
핵산 시퀀싱 방법론은 Maxam 및 Gilbert에 의해 사용된 화학적 분해 방법 및 Sanger에 의해 사용된 가닥 연신(elongation) 방법으로부터 진화되었다. 단일 칩 상에 수천 개의 모든 핵산을 병렬 처리할 수 있도록 하는 여러 시퀀싱 방법론이 현재 사용되고 있다. 일부 플랫폼은 실리카 비드가 시퀀싱, 유전자형 분석, 또는 유전자 발현 프로파일링을 포함하는 적용에서 이러한 포맷의 적용에 따라 프로브로 기능화되는 비드-기반 및 마이크로어레이 포맷을 포함한다.
일부 시퀀싱 시스템은 "합성에 의한 시퀀싱" 또는 유전자형 분석을 위해 형광-기반 검출을 사용하며, 주어진 뉴클레오티드는 형광 표지로 표지되고, 뉴클레오티드는 해당 표지로부터 형광 물질을 검출하는 것에 기반하여 식별된다.
본원에 제공된 예는 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 및 중합에 관한 것이다. 이러한 정제 및 중합을 수행하기 위한 방법, 및 연관된 조성물 및 디바이스가 개시된다.
일부 예에서, 뉴클레오티드를 정제하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 (a) 3'-차단된 뉴클레오티드, (b) 3'-OH 뉴클레오티드, (c) 연마 중합효소, 및 (d) 주형을 포함하는 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 연마 중합효소 및 주형을 사용하여 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합하고 이에 따라 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 용액을 제조하는 것은 물, 연마 중합효소, 및 주형을 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 동결건조된 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 용액을 제조하는 것은 물을 3'-차단된 뉴클레오티드, 3'-OH 뉴클레오티드, 연마 중합효소, 및 주형의 동결건조된 혼합물에 첨가하는 것을 포함한다.
일부 예에서, 연마 중합효소는 열안정성 중합효소를 포함한다. 일부 예에서, 열안정성 중합효소는 딥 벤트(Deep Vent), 태크(Taq), Bst, 설포로버스(Sulfolobus) DNA 중합효소 IV, 및 Pfu로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 방법은 열안정성 중합효소 및 주형을 사용하는 동안 용액을 가열하는 것을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 용액은 약 30-75℃의 온도까지 가열된다. 일부 예에서, 용액은 약 40-60℃의 온도까지 가열된다.
일부 예에서, 용액은 내부 구조체, 외부 슬리브, 및 용액이 유동하는 나선형 튜브를 포함하는 캐시 매니폴드를 사용하여 가열되며, 내부 구조체 및 외부 슬리브 중 적어도 하나가 가열된다. 일부 예에서, 내부 구조체는 유체가 유동하는 내부 슬리브를 포함한다.
일부 예에서, 용액은 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 추가로 포함하여, 3'-OH 뉴클레오티드가 중합되는 속도를 YPP 부재에서의 이러한 속도에 비해 증가시킨다.
일부 예에서, 연마 중합효소 및 주형은 합성에 의한 시퀀싱 기구에서 사용된다.
일부 예에서, 용액은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 α-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이다. 변형된 β-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 및 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)을 포함한다. 변형된 γ-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린이다. 일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 형광 염료에 커플링될 수 있고, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 형광 염료의 용해도를 촉진할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 약 1% 내지 약 10% (중량/부피)의 농도를 갖는다. 일부 예에서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 용액 내에서 약 1.5 mM 미만의 농도를 갖는다. 일부 예에서, 용액은 적어도 약 1 mM의 농도로 마그네슘 이온을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 이인산염의 형성을 억제할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 사인산염의 형성을 억제할 수 있다.
일부 예에서, 뉴클레오티드를 중합하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드를 포함하는 제1 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 (a) 제1 용액으로부터의 3'-차단된 뉴클레오티드, 및 (b) 합성에 의한 시퀀싱 (SBS) 중합효소를 포함하는 제2 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 SBS 중합효소 및 제1 주형을 사용하여 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 제1 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키는 것은 연마 중합효소 및 제2 주형을 사용하여 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 제2 용액은 연마 중합효소를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 연마 중합효소는 열안정성 중합효소를 포함한다. 일부 예에서, 열안정성 중합효소는 딥 벤트, 태크, Bst, 설포로버스 DNA 중합효소 IV, 및 Pfu로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 제2 용액은 중합된 3'-OH 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 연마 중합효소 및 SBS 중합효소는 합성에 의한 시퀀싱 기구 상에서 사용된다.
일부 예에서, 제2 용액을 제조하는 것은 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 제1 용액 내의 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시킨 후 SBS 중합효소를 제1 용액에 첨가하는 것을 포함한다.
일부 예에서, 제1 용액은 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 추가로 포함하여, 3'-OH 뉴클레오티드가 중합되는 속도를 YPP 부재에서의 이러한 속도에 비해 증가시킨다.
일부 예에서, 제1 및 제2 용액은 내부 구조체, 외부 슬리브, 및 제1 및 제2 용액이 다른 시간에 유동하는 나선형 튜브를 포함하는 캐시 매니폴드를 사용하여 가열되며, 내부 구조체 및 외부 슬리브 중 적어도 하나가 가열된다. 일부 예에서, 내부 구조체는 유체가 유동하는 내부 슬리브를 포함한다.
일부 예에서, 제1 용액 내의 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 방법은 3'-차단된 뉴클레오티드가 SBS 중합효소 및 제1 주형을 사용하여 중합되는 동안 3'-차단된 뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티를 검출하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 예에서, 제1 용액은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 α-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이다. 변형된 β-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 및 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)을 포함한다. 변형된 γ-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린이다. 일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 형광 염료에 커플링될 수 있고, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 형광 염료의 용해도를 촉진할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 제1 용액 내에서 약 1% 내지 약 10% (중량/부피)의 농도를 갖는다. 일부 예에서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 제1 용액 내에서 약 1.5 mM 미만의 농도를 갖는다. 일부 예에서, 제1 용액은 적어도 약 1 mM의 농도로 마그네슘 이온을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 제1 용액 내에서 이인산염의 형성을 억제할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 제1 용액 내에서 사인산염의 형성을 억제할 수 있다. 일부 예에서, 제2 용액은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 용액이 본원에 제공된다. 용액은 물; 3'-차단된 뉴클레오티드; 3'-OH 뉴클레오티드; 연마 중합효소; 및 주형을 포함한다. 3'-OH 뉴클레오티드는 연마 중합효소 및 주형을 사용하여 선택적으로 중합가능할 수 있다.
일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 연마 중합효소는 열안정성 중합효소를 포함한다. 일부 예에서, 열안정성 중합효소는 딥 벤트, 태크, Bst, 설포로버스 DNA 중합효소 IV, 및 Pfu로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 용액은 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 포함한다.
일부 예에서, 용액은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 α-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이다. 변형된 β-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 및 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)을 포함한다. 변형된 γ-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린이다. 일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 형광 염료에 커플링될 수 있고, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 형광 염료의 용해도를 촉진할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 약 1% 내지 약 10% (중량/부피)의 농도를 갖는다. 일부 예에서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 용액 내에서 약 1.5 mM 미만의 농도를 갖는다. 일부 예에서, 용액은 적어도 약 1 mM의 농도로 마그네슘 이온을 추가로 포함한다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 이인산염의 형성을 억제할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 사인산염의 형성을 억제할 수 있다.
일부 예에서, 또 다른 용액이 본원에 제공된다. 용액은 물; 3'-차단된 뉴클레오티드; 제1 주형에 혼성화된 중합된 3'-OH 뉴클레오티드; 연마 중합효소; 및 합성에 의한 시퀀싱 (SBS) 중합효소를 포함한다. 3'-차단된 뉴클레오티드는 SBS 중합효소 및 제2 주형을 사용하여 중합가능하다.
일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 용액은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 포함한다. 변형된 α-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이다. 변형된 β-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 및 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)을 포함한다. 변형된 γ-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린이다.
일부 예에서, 동결건조된 혼합물이 본원에 제공된다. 동결건조된 혼합물은 3'-차단된 뉴클레오티드; 3'-OH 뉴클레오티드; 연마 중합효소; 및 주형을 포함할 수 있다. 동결건조된 혼합물을 재수화하는 경우, 3'-OH 뉴클레오티드는 연마 중합효소 및 주형을 사용하여 선택적으로 중합가능할 수 있다.
일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함한다. 일부 예에서, 연마 중합효소는 열안정성 중합효소를 포함한다. 일부 예에서, 열안정성 중합효소는 딥 벤트, 태크, Bst, 설포로버스 DNA 중합효소 IV, 및 Pfu로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예에서, 동결건조된 혼합물은 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 동결건조된 혼합물은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 포함한다. 변형된 α-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이다. 변형된 β-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 및 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)을 포함한다. 변형된 γ-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린이다.
본원에 기술된 본 개시내용의 각각의 측면의 임의의 각 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 시행될 수 있고, 이들 측면 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 본원에 기술된 다른 측면 (들)의 임의의 특징과 함께 시행되어 본원에 기술된 이익을 달성할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
도 1a-1b는 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제하기 위한 공정 흐름에서의 조성물 및 작동의 예를 개략적으로 예시한다.
도 2a-2b는 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하기 위한 공정 흐름에서의 조성물 및 작동의 예를 개략적으로 예시한다.
도 3은 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제를 위한 방법에서의 작동의 흐름의 예를 예시한다.
도 4는 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하기 위한 방법에서의 작동의 흐름의 예를 예시한다.
도 5a-5b는 온도 제어 디바이스의 예를 개략적으로 예시한다.
도 6a-6d는 또 다른 온도 제어 디바이스의 예를 개략적으로 예시한다.
도 7a-7c는 하나 이상의 온도 제어 디바이스를 사용하는 온도 제어 시스템의 예를 개략적으로 예시한다.
도 8은 다른 조건을 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합 동안의 페이징 및 프리페이징의 플롯이다.
도 9는 다른 중합효소 및 다른 온도를 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합 동안의 페이징 및 프리페이징의 플롯이다.
도 10은 태크 중합효소 및 다른 농도의 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합 동안의 프리페이징의 플롯이다.
도 11은 다른 온도 및 농도의 3'-OH 뉴클레오티드를 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합 동안의 프리페이징의 플롯이다.
도 12는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 마그네슘 이온의 농도의 기능으로서 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 등고선 플롯이다.
도 13은 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 마그네슘 이온의 농도의 기능으로서 다른 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 플롯을 포함한다.
도 14는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 이들 뉴클레오티드의 농도의 기능으로서 선택된 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 등고선 플롯이다.
도 15는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD, 마그네슘 이온, 및 형광 표지된 뉴클레오티드의 농도의 기능으로서 다른 부산물의 농도의 플롯을 포함한다.
도 2a-2b는 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하기 위한 공정 흐름에서의 조성물 및 작동의 예를 개략적으로 예시한다.
도 3은 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제를 위한 방법에서의 작동의 흐름의 예를 예시한다.
도 4는 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하기 위한 방법에서의 작동의 흐름의 예를 예시한다.
도 5a-5b는 온도 제어 디바이스의 예를 개략적으로 예시한다.
도 6a-6d는 또 다른 온도 제어 디바이스의 예를 개략적으로 예시한다.
도 7a-7c는 하나 이상의 온도 제어 디바이스를 사용하는 온도 제어 시스템의 예를 개략적으로 예시한다.
도 8은 다른 조건을 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합 동안의 페이징 및 프리페이징의 플롯이다.
도 9는 다른 중합효소 및 다른 온도를 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합 동안의 페이징 및 프리페이징의 플롯이다.
도 10은 태크 중합효소 및 다른 농도의 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합 동안의 프리페이징의 플롯이다.
도 11은 다른 온도 및 농도의 3'-OH 뉴클레오티드를 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합 동안의 프리페이징의 플롯이다.
도 12는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 마그네슘 이온의 농도의 기능으로서 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 등고선 플롯이다.
도 13은 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 마그네슘 이온의 농도의 기능으로서 다른 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 플롯을 포함한다.
도 14는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 이들 뉴클레오티드의 농도의 기능으로서 선택된 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 등고선 플롯이다.
도 15는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD, 마그네슘 이온, 및 형광 표지된 뉴클레오티드의 농도의 기능으로서 다른 부산물의 농도의 플롯을 포함한다.
3'-차단된 뉴클레오티드를 정제 및 중합하는 것이 본원에 제공된다.
예를 들어, 본 출원은 합성에 의한 시퀀싱 (SBS) 또는 유전자형 분석 결정 작동을 시작하기 전에 용액으로부터 임의의 차단되지 않은 (3'-OH) 뉴클레오티드를 제거하기 위해 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제, 또는 "연마"하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 3'-차단된 뉴클레오티드는 3' 위치의 뉴클레오티드에 커플링된 차단기, 예를 들어 아지도메틸기를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 또한 형광단과 같은 검출가능한 모이어티에 커플링될 수 있다. SBS 중합효소가 상보성 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 시퀀싱될 주형)를 사용하여 뉴클레오티드 중 주어진 하나를 성장하는 폴리뉴클레오티드에 첨가함으로써 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합할 경우, 해당 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 사용하여 검출 및 식별될 수 있으며, 따라서 상보성 뉴클레오티드가 식별되도록 한다. 그러나, 중합효소는 3'-차단기가 적합한 시약을 사용하여 제거될 때까지 또 다른 뉴클레오티드를 신장하는 폴리뉴클레오티드에 첨가할 수 없을 수 있다. 3'-차단기가 제거된 후, 검출가능한 모이어티는 해당 뉴클레오티드로부터 절단될 수 있고 또 다른 3'-차단된 뉴클레오티드를 신장하는 폴리뉴클레오티드에 첨가할 수 있다. 이러한 공정은 예를 들어, 상보성 폴리뉴클레오티드의 서열에서 하나 이상의 염기를 식별하기 위해 임의의 적합한 횟수로 반복될 수 있다. 다양한 3'-차단된 뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티는 적합한 검출 회로를 통해 검출될 수 있다. 일부 예에서, 검출가능한 모이어티는 적합한 광학 검출 회로를 통해 검출될 수 있는 형광단을 포함할 수 있다. 그러나, 검출가능한 모이어티는 임의의 적합한 방식으로 검출될 수 있고, 형광을 통한 검출에 제한되지 않는다는 것이 인식될 것이다.
3'-차단되지 않은 뉴클레오티드 (3'-차단된 것이 아닌 뉴클레오티드)의 존재는 상보성 폴리뉴클레오티드의 시퀀싱을 방해할 수 있다. 예를 들어, 저장 또는 운송은 검출가능한 모이어티를 뉴클레오티드에 커플링하는 가수분해 결합에 의해 3'-차단된 뉴클레오티드가 탈차단되도록 유발하며, 따라서 3'-차단된 뉴클레오티드를 3'-OH 뉴클레오티드로 전환시킬 수 있다. 이러한 가수분해는 저장 또는 운송 전에 3'-차단된 뉴클레오티드를 동결건조함으로써 감소될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 일부 3'-OH 뉴클레오티드는 뉴클레오티드가 사용된 시점까지 3'-차단된 뉴클레오티드와 혼합될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 3'-차단기가 3'-차단된 뉴클레오티드의 합성 동안 초기에 첨가되는 경우, 반응 수율이 반드시 100%일 필요는 없을 수 있고, 이와 같은 일부 잔류 3'-OH 뉴클레오티드가 3'-차단된 뉴클레오티드와 혼합될 수 있다. 예를 들어, SBS 중합효소 및 상보성 폴리뉴클레오티드를 사용한 중합 동안 3'-OH 뉴클레오티드가 3'-차단된 뉴클레오티드와 혼합되는 경우, 3'-OH 뉴클레오티드는 상보성 폴리뉴클레오티드의 시퀀싱에 오차를 유발할 수 있다. 예를 들어, SBS 중합효소는 경우에 따라 3'-OH 뉴클레오티드를 신장하는 폴리뉴클레오티드에 첨가할 수 있지만, 이러한 3'-OH 뉴클레오티드에는 3'-차단기가 결여되어 있기 때문에, SBS 중합효소는 시약의 첨가를 기다려서 차단기를 제거해야 하기 보다는 또 다른 뉴클레오티드를 신장하는 폴리뉴클레오티드에 신속하게 첨가할 수 있다. 이와 같이, 3'-OH 뉴클레오티드는 중합을 가속화할 수 있으며 (이러한 가속화는 "프리페이징"이라고도 함), 증가된 속도는 검출 회로가 3'-OH 뉴클레오티드에 커플링된 검출가능한 모이어티를 정확하게 검출 및 식별할 수 있는 것을 억제할 수 있다. 이와 같이, 상보성 폴리뉴클레오티드의 서열은 완전히 또는 정확하게 결정되지 않을 수 있다.
3'-차단된 뉴클레오티드를 정제 및 중합하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 하기에서 더 상세히 기술된 바와 같이, 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합함으로써 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 3'-OH 뉴클레오티드의 농도가 감소될 수 있다. 예시적으로, 연마 중합효소 및 폴리뉴클레오티드 (주형)는 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 혼합물과 수용액에서 혼합된다. 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드 둘 모두를 상대적으로 잘 중합할 수 있는 SBS 중합효소와 달리, 연마 중합효소는 3'-OH 뉴클레오티드를 상대적으로 잘 중합할 수 있지만 3'-OH 뉴클레오티드보다 유의하게 더 낮은 속도로 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합할 수 있다. 연마 중합효소의 비제한적인 예는 열안정성 중합효소이지만, 3'-차단된 뉴클레오티드보다 유의하게 더 높은 속도로 3'-OH 뉴클레오티드를 중합하거나, 예를 들어 SBS에서 사용하기 위해 특이적으로 조작되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드를 실질적으로 중합하지 않을 수 있는 중합효소의 많은 다른 예가 존재한다. 연마 중합효소는 혼합물에서 3'-OH 뉴클레오티드를 중합하여 용액으로부터 이들 뉴클레오티드를 제거할 수 있는 반면, 3'-차단된 뉴클레오티드는 용액에 잔류할 수 있다. 이어서, SBS 중합효소를 사용하여 3'-OH 뉴클레오티드로부터의 감소된 간섭으로, 예를 들어 SBS 또는 유전자형 분석 공정에서 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합할 수 있다.
일부 예에서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 후속 중합 작동을 수행하는 동일한 기구 상에서 정제될 수 있다. 예를 들어, 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제 및 중합하는 것 둘 모두는 동일한 SBS 기구 상에서 수행될 수 있다. 하기에 더 상세히 기술되는 바와 같이, 기구는 사용되어 정제하는 것을 위한 용액을 가열 또는 냉각하여, 예를 들어 연마 중합효소가 적합한 온도에서 사용될 수 있도록 하고, 중합하는 것을 위한 용액을 가열 또는 냉각하여, 예를 들어 SBS 중합효소가 적합한 온도에서 사용될 수 있도록 하는 "캐시 매니폴드"와 같은 디바이스를 포함할 수 있다. 캐시 매니폴드는 내부 및 외부 슬리브를 갖는 열 교환기를 포함할 수 있으며, 이 중 하나 또는 둘 모두는 가열 또는 냉각될 수 있고, 슬리브 사이에 위치하고 가열 또는 냉각될 용액이 유동할 수 있는 코일형 유체의 경로를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 일부 용어를 간략히 설명한다. 이어서, 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제 및 중합하기 위한 일부 시스템의 예 및 방법의 예, 및 연관된 조성물 및 디바이스가 기술될 것이다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는(including)"뿐만 아니라 "포함하다(include)," "포함하다(includes)," 및 "포함된(included),"과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 "가지다(have)" "가지다(has)," 및 "가진(had),"과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된, 전이구에서 또는 청구범위의 본문에서든지, 용어 "포함하다(comprise(s))" 및 "포함하는(comprising)"은 개방형 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 "적어도 갖는(having)" 또는 "적어도 포함하는(including)"이라는 문구와 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정의 맥락에서 사용될 경우, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 인용된 단계들을 포함하지만, 추가적인 단계를 포함할 수 있다는 것을 의미한다. 화합물, 조성물, 또는 디바이스의 맥락에서 사용될 경우, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물, 또는 디바이스가 적어도 인용된 특징 또는 성분을 포함하지만, 추가적인 특징 또는 성분도 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "실질적으로", "대략", 및 "약"은 처리에서의 변이로 인한 것과 같은 작은 변동을 기술하고 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 이는 ±5% 이하, 예컨대 ±2% 이하, 예컨대 ±1% 이하, 예컨대 ±0.5% 이하, 예컨대 ±0.2% 이하, 예컨대 ±0.1% 이하, 예컨대 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "뉴클레오티드"는 당 및 적어도 하나의 인산염기를 포함하는 분자를 의미하도록 의도되고, 선택적으로 핵염기도 포함한다. 핵염기가 결여된 뉴클레오티드는 "무염기"로 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 인산염 당 골격 뉴클레오티드, 및 이의 혼합물을 포함한다. 뉴클레오티드의 예는 아데노신 일인산염 (AMP), 아데노신 이인산염 (ADP), 아데노신 삼인산염 (ATP), 티미딘 일인산염 (TMP), 티미딘 이인산염 (TDP), 티미딘 삼인산염 (TTP), 시티딘 일인산염 (CMP), 시티딘 이인산염 (CDP), 시티딘 삼인산염 (CTP), 구아노신 일인산염 (GMP), 구아노신 이인산염 (GDP), 구아노신 삼인산염 (GTP), 우리딘 일인산염 (UMP), 우리딘 이인산염 (UDP), 우리딘 삼인산염 (UTP), 데옥시아데노신 일인산염 (dAMP), 데옥시아데노신 이인산염 (dADP), 데옥시아데노신 삼인산염 (dATP), 데옥시티미딘 일인산염 (dTMP), 데옥시티미딘 이인산염 (dTDP), 데옥시티미딘 삼인산염 (dTTP), 데옥시시티딘 이인산염 (dCDP), 데옥시티딘 삼인산염 (dCTP), 데옥시구아노신 일인산염 (dGMP), 데옥시구아노신 이인산염 (dGDP), 데옥시구아노신 삼인산염 (dGTP), 데옥시우리딘 일인산염 (dUMP), 데옥시우리딘 이인산염 (dUDP), 및 데옥시우리딘 삼인산염 (dUTP)을 포함한다.
본원에 사용된, 용어 "뉴클레오티드"는 또한 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 비교하여 변형된 핵염기, 당 및/또는 인산염 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드의 유형인 임의의 뉴클레오티드 유사체를 포괄하도록 의도된다. 변형된 핵염기의 예는 이노신, 크사타닌, 하이포크사타닌, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-히드록시메틸 시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸 아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필 구아닌, 2-프로필 아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-히드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환된 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸라데닌, 8-아자구아닌, 8-아자데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자데닌 등을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 유사체는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신 5'-포스포설페이트와 같은 뉴클레오티드 유사체 내로 포함될 수 없다.
본원에 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 서로 결합된 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 중합체의 하나의 비제한적인 예이다. 폴리뉴클레오티드의 예는 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 및 이의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열, 예컨대 RNA 또는 단일 가닥 DNA, 뉴클레오티드의 이중 가닥 서열, 예컨대 이중 가닥 DNA 또는 이중 가닥 RNA일 수 있거나, 뉴클레오티드의 단일 가닥 및 이중 가닥 서열의 혼합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA (dsDNA)는 게놈 DNA, 및 PCR 및 증폭 생성물을 포함한다. 단일 가닥 DNA (ssDNA)는 dsDNA로 전환될 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 폴리뉴클레오티드는 거울상 이성질체 DNA와 같은 비자연적으로 발생하는 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 정확한 서열은 공지되어 있거나 공지되어 있지 않을 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 예이다: 유전자 또는 유전자 단편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, 발현된 서열 태그 (EST) 또는 유전자 발현의 연속 분석 (SAGE) 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머 또는 전술된 임의의 것의 증폭된 카피.
본원에 사용된, "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드와 같은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체성 형태를 지칭할 수 있다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA를 포함한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 이중 및 단일-가닥 분자 둘 모두를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 예는 유전자 또는 유전자 단편, 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 비코딩 RNA (ncRNA), 예컨대 PIWI-상호작용 RNA (piRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 및 긴 비코딩 RNA (lncRNA), 소형 헤어핀 (shRNA), 소형 핵 RNA (snRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 작은 핵소체 RNA (snoRNA) 및 바이러스 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머 또는 전술된 임의의 것의 증폭된 카피를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 비자연 염기를 갖는 뉴클레오티드, 아자- 또는 데아자-퓨린과 같은 변형된 자연 염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 폴리뉴클레오티드는 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 및 티민 (T)의 4개의 뉴클레오티드 염기의 특이적 서열로 구성될 수 있다. 우라실 (U)은 또한, 예를 들어 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 티민에 대한 자연적인 대체물로서 존재할 수 있다. 우라실은 또한 DNA에서 사용될 수 있다. 따라서, 용어 '서열'은 자연 및 비자연 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 임의의 핵산 분자의 알파벳순 표현을 지칭한다.
본원에 사용된, "표적 핵산" 또는 이의 문법적 등가물은 식별, 서열, 분석 및/또는 추가 조작이 요구되는 핵산 분자 또는 서열을 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 표적 핵산은 식별될 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, SNP는 프로브를 표적 핵산에 혼성화하고, 프로브를 연장시킴으로써 식별될 수 있다. 일부 예에서, 연장된 프로브는 연장된 프로브를 캡처 프로브에 혼성화함으로써 검출될 수 있다.
본원에 사용된, "혼성화하다"는 뉴클레오티드 염기의 특이적 수소 결합 쌍을 통해 이들 폴리뉴클레오티드의 길이를 따라 제1 폴리뉴클레오티드를 제2 폴리뉴클레오티드에 비공유적으로 부착하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 부착의 강도는 이들 중합체 내의 단량체 단위의 서열 사이의 길이 및 상보성에 따라 증가한다. 예를 들어, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 부착의 강도는 이들 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 서열 사이의 상보성, 및 해당 상보성의 길이에 따라 증가한다. "일시적으로 혼성화된"은 중합체 서열이 제1 시간에 서로 혼성화되고, 제2 시간에 서로 탈혼성화되는 것을 의미한다.
예를 들어, 본원에 사용된, "혼성화," "혼성화하는" 또는 이의 문법적 등가물은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 적어도 일부로 형성되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭할 수 있다. 수소 결합은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합, 또는 임의의 다른 서열-특이적 방식에 의해 발생할 수 있다. 복합체는 이중 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-혼성화 가닥, 또는 이의 임의의 조합을 가질 수 있다. 가닥은 또한 수소 결합에 첨가하여 가교되거나 그렇지 않으면 힘에 의해 연결될 수 있다.
본원에 사용된, "중합효소"는 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 중합함으로써 폴리뉴클레오티드를 조립하는 활성인 부위를 갖는 엔자임을 의미하도록 의도된다. 중합효소는 이중 가닥 DNA에 결합할 수 있고, 뉴클레오티드를 연장된 가닥의 3' 말단에 순차적으로 첨가하여 주형의 서열에 상보성인 서열을 갖는 신장하는 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다.
"합성에 의한 시퀀싱 중합효소" 또는 "SBS 중합효소"는 적어도 3'-차단된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드 내로 중합하는 엔자임을 의미하도록 의도된다. 3'-OH 뉴클레오티드가 3'-차단된 뉴클레오티드와 혼합될 경우, SBS 중합효소는 또한 이러한 3'-OH 뉴클레오티드를 중합할 수 있다. SBS 중합효소의 예는 조작되어 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합할 수 있는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) DNA 중합효소 I (Bsu) 및 엔테로박테리아 파지 Φ29 DNA 중합효소를 포함한다.
"연마 중합효소"는, 예를 들어 상보성 폴리뉴클레오티드를 사용하여 3'-OH 뉴클레오티드를 신장하는 폴리뉴클레오티드에 첨가함으로써 3'-OH 뉴클레오티드를 중합하고, 3'-OH 뉴클레오티드에 비해 유의하게 감소된 속도로 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합할 수 있고, 실제로 실질적으로 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하지 않을 수 있는 엔자임을 의미하도록 의도된다. 이와 같이, 연마 중합효소는 3'-OH 뉴클레오티드를 "선택적으로" 중합하는 것으로 간주될 수 있다. 연마 중합효소의 비제한적인 예는 "열안정성" 중합효소이며, 이는 비교적 고온, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 100℃, 또는 약 40℃ 내지 약 80℃, 또는 약 50℃ 내지 약 70℃에서 잘 기능할 수 있는 중합효소를 지칭한다.00℃, 또는 약 40℃ 내지 약 80℃, 또는 약 50℃ 내지 약 70℃에서 잘 기능할 수 있는 중합효소를 지칭하는 "안정성" 폴리머라제이다. 열안정성 중합효소의 예는 상표명 DEEP VENT®DNA 중합효소 (예시 작업 온도 75℃)의 피로코커스 종(Pyrococcus sp.) (균주 GB-D) DNA 중합효소, 써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) DNA 중합효소 I (태크 중합효소) (예시 작업 온도 75℃), Bst (예시 작업 온도 65℃), 설포로버스 DNA 중합효소 IV (예시 작업 온도 55℃), 및 Pfu (퓨전(Phusion)) (예시 작업 온도 75℃)를 포함하며, 이의 모두는 New England Biolabs, Inc.(Ipswich, MA)으로부터 상업적으로 이용가능하다. 연마 중합효소의 다른 비제한적인 예는 대장균(Escherischia coli) DNA 중합효소 I 단백질 분해 (클레나우(Klenow) 단편) (예시 작업 온도 37℃) 및 Bsu (예시 작업 온도 37℃)를 포함하며, 이는 New England Biolabs, Inc.으로부터 상업적으로 이용가능하다.
본원에 사용된, 용어 "프라이머" 및 "주형"은 유리 3'-OH기를 갖는 단일 가닥을 갖는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 프라이머 또는 주형은 또한 5' 말단에서 변형을 가져 커플링 반응을 하도록 하거나 프라이머를 또 다른 모이어티에 커플링하도록 할 수 있다. 프라이머 또는 주형 길이는 임의의 수의 염기의 길이일 수 있고, 다양한 비자연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 프라이머 또는 주형은 3' 말단에서 차단되어 블록이 제거될 때까지 중합을 억제할 수 있다.
본원에 사용된, "연장하는," "연장" 또는 이의 임의의 문법적 등가물은 dNTP 또는 ddNTP를 중합효소, 또는 리가제와 같은 연장 엔자임에 의해 프라이머, 폴리뉴클레오티드 또는 다른 핵산 분자에 첨가하는 것을 지칭할 수 있다.
뉴클레오티드의 3' 위치는 "차단기"에 커플링될 수 있으며, 이는 모이어티가 적합한 시약을 사용하여 제거될 때, 예를 들어 히드록실(OH)기로 대체될 때까지 SBS 중합효소가 추가 뉴클레오티드를 해당 뉴클레오티드에 커플링하는 것을 억제하는 모이어티를 의미하도록 의도된다. 차단기의 비제한적인 예는 아지도메틸기이고, 이는 트리스-(히드록시프로필)-포스핀 (THPP)과 같은 3차 포스핀 또는 다른 적합한 환원제를 사용하여 제거될 수 있다. 차단기의 또 다른 비제한적인 예는 아세탈 또는 티오카바메이트 3'-OH 차단기이며, 이는 Pd(0)THPPn과 같은 유기금속 촉매를 사용하여 제거될 수 있다. 차단기는 임의의 적합한 화학을 사용하여 뉴클레오티드의 3' 위치에 커플링될 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "표지" 및 "검출가능한 모이어티"는 뉴클레오티드에 커플링되고, 이에 기반하여 뉴클레오티드의 존재가, 예를 들어 적합한 회로를 사용하여 검출될 수 있는 구조체를 의미하도록 의도된다. 표지 또는 검출가능한 모이어티는 형광단이 간접적으로 커플링될 수 있는 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티를 뉴클레오티드에 간접적으로 커플링하기 위해 뉴클레오티드는 커플링되어 제1 모이어티를 포함할 수 있고, 검출가능한 모이어티 (예컨대, 형광단)는 제1 모이어티에 커플링되는 제2 모이어티에 커플링될 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "기재"는 본원에 기술된 조성물을 위한 지지체로서 사용된 물질을 지칭한다. 기재 물질의 예는 유리, 실리카, 플라스틱, 석영, 금속, 금속 산화물, 유기-규산염 (예를 들어, 다면체 유기 실세스퀴옥산 (POSS)), 폴리아크릴레이트, 탄탈륨 산화물, 상보성 금속 산화물 반도체 (CMOS), 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. POSS의 예는 그 전체가 참조로 포함되는 Kehagias 등, Microelectronic Engineering 86 (2009), pp.776-778에 기술된 것일 수 있다. 일부 예에서, 본 출원에 사용된 기재는 실리카-기반 기재, 예컨대 유리, 용융 실리카, 또는 다른 실리카-함유 물질을 포함한다. 일부 예에서, 실리카-기반 기재는 실리콘, 실리콘 이산화물, 실리콘 질화물, 또는 실리콘 수소화물을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 출원에 사용된 기재는 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(염화 비닐), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)와 같은 플라스틱 물질 또는 성분을 포함한다. 플라스틱 물질의 예는 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스티렌, 및 환형 올레핀 중합체 기재를 포함한다. 일부 예에서, 기재는 실리카-기반 물질 또는 플라스틱 물질 또는 이의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 예에서, 기재는 유리 또는 실리콘-기반 중합체를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일부 예에서, 기재는 금속을 포함할 수 있다. 일부 이러한 예에서, 금속은 금이다. 일부 예에서, 기재는 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일 예에서, 표면은 탄탈륨 산화물 또는 주석 산화물을 포함한다. 아크릴아미드, 에논, 또는 아크릴레이트가 또한 기재 물질 또는 성분으로서 사용될 수 있다. 다른 기재 물질은 갈륨 비화물, 인듐 인화물, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 석영일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 GaAs 또는 ITO와 같은 반도체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 전술된 목록은 본 출원의 예시를 위해 의도되지만, 이를 제한하지는 않는다. 기재는 단일 물질 또는 복수의 다른 물질을 포함할 수 있다. 기재는 합성물 또는 적층물일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 유기-규산염 물질을 포함한다.
기재는 편평, 원형, 구형, 로드(rod) 형상, 또는 임의의 다른 적합한 형상일 수 있다. 기재는 강성 또는 가요성일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 비드 또는 유동 셀, 또는 유동 셀 내에 위치한 비드이다.
기재는 기재의 하나 이상의 표면 상에 비패턴화, 텍스쳐링, 또는 패턴화될 수 있다. 일부 예에서, 기재가 패턴화된다. 이러한 패턴은 포스트, 패드, 웰, 리지(ridges), 채널, 또는 다른 3차원 오목 또는 볼록 구조체를 포함할 수 있다. 패턴은 기재의 표면에 걸쳐 규칙적이거나 불규칙적일 수 있다. 패턴은 예를 들어, 나노임프린트 리소그래피에 의해 또는 예를 들어 비금속 표면 상에 특징을 형성하는 금속 패드의 사용에 의해 형성될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기술된 기재는 유동 셀의 적어도 일부를 형성하거나 유동 셀 내에 위치하거나 이에 커플링된다. 유동 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 분할되는 유동 챔버를 포함할 수 있다. 본원에 제시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 유동 셀의 제조를 위한 유동 셀 및 기재의 예는 Illumina, Inc.(San Diego, CA)으로부터 상업적으로 이용 가능한 것들을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 비드는 유동 셀 내에 위치할 수 있다.
본원에 사용된, "표면"은 접근 가능하여 시약, 비드 또는 분석물과 접촉하는 기재 또는 지지 구조체의 일부를 지칭할 수 있다. 표면은 실질적으로 편평하거나 평면일 수 있다. 대안적으로, 표면은 원형이거나 등고선이 형성될 수 있다. 표면 상에 포함될 수 있는 등고선의 예는 웰, 함몰부(depression), 기둥, 리지, 채널 등이다. 기재 또는 지지 구조체로서 사용될 수 있는 물질의 예는 유리, 예컨대 변형된 또는 기능화된 유리; 플라스틱, 예컨대 아크릴, 폴리스티렌 또는 스티렌 및 또 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 또는 TEFLON; 다당류 또는 가교된 다당류, 예컨대 아가로스 또는 세파로스; 나일론; 니트로셀룰로스; 수지; 규소 및 변형된 규소를 포함하는 실리카 또는 실리카-기반 물질; 탄소-섬유; 금속; 무기 유리; 광섬유 다발, 또는 다양한 다른 중합체를 포함한다. 단일 물질 또는 여러 다른 물질들의 혼합물은 특정 예에서 유용한 표면을 형성할 수 있다. 일부 예에서, 표면은 웰을 포함한다. 일부 예에서, 지지 구조체는 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 지지 구조체의 예는 칩, 필름, 다중-웰 플레이트, 및 유동 셀을 포함할 수 있다.
본원에 사용된, "비드"는 고체 물질로 이루어진 작은 본체를 지칭할 수 있다. 비드의 물질은 강성 또는 반강성일 수 있다. 본체는 예를 들어, 규칙적인 또는 불규칙적인 치수를 갖는지 여부에 관계없이 구형, 타원형, 미소구형, 또는 다른 인식된 입자 형상으로서 특징화된 형상을 가질 수 있다. 일부 예에서, 비드 또는 복수의 비드는 표면을 포함할 수 있다. 비드에 유용한 물질의 예는 유리, 예컨대 변형된 또는 기능화된 유리; 플라스틱, 예컨대 아크릴, 폴리스티렌 또는 스티렌 및 또 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 또는 테플론; 다당류 또는 가교된 다당류, 예컨대 아가로스 또는 세파로스; 나일론; 니트로셀룰로스; 수지; 규소 및 변형된 규소를 포함하는 실리카 또는 실리카-기반 물질; 탄 소-섬유; 금속; 무기 유리; 또는 다양한 다른 중합체를 포함한다. 비드의 예는 제어된 기공 유리 비드, 상자성 비드, 토리아 솔(thoria sol), 세파로스 비드, 나노결정 및 당업계에 공지된 다른 것을 포함한다. 비드는 생물학적 또는 비생물학적 물질로 이루어질 수 있다. 자기 비드는 본원에 기술된 방법의 다양한 공정에서 자석을 사용하여 자기 비드 조작의 용이함으로 인해 특히 유용하다. 특정 예에서 사용된 비드는 약 5.0 nm 내지 약 100 ㎛, 예를 들어 약 10 nm 내지 약 100 ㎛, 예를 들어, 약 50 nm 내지 약 50 ㎛, 예를 들어 약 100 nm 내지 약 500 nm의 직경, 폭 또는 길이를 가질 수 있다. 일부 예에서, 특정 예에서 사용된 비드는 약 100 ㎛, 50 ㎛, 10 ㎛, 5 ㎛, 1 ㎛, 0.5 ㎛, 100 nm, 50 nm, 10 nm, 5 nm, 1 nm, 0.5 nm, 100 pm 미만의 직경, 폭 또는 길이, 또는 전술된 직경, 폭 또는 길이 중 임의의 2개의 범위 내의 임의의 직경, 폭 또는 길이를 가질 수 있다. 비드 크기는 선택되어 감소된 크기를 가질 수 있고, 따라서 특징을 분석하기 위해 충분한 신호 (특징당 주형 카피)를 유지하면서, 단위 면적당 더 많은 특징을 얻을 수 있다.
일부 예에서, 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포획 프로브 또는 코드는 비드에 커플링될 수 있다. 일부 예에서, 비드는 유동 셀과 같은 기재의 표면 상의 웰 내로 분포될 수 있다. 특정 예에서 사용될 수 있는 비드 어레이의 예는 무작위로 규칙적인 BEADARRAY technology (Illumina Inc., San Diego CA)를 포함한다. 이러한 비드 어레이는 Michael 등, Anal Chem 70, 1242-8 (1998); Walt, Science 287, 451-2 (2000); Fan 등, Cold Spring Harb Symp Quant Biol 68:69-78 (2003); Gunderson 등, Nat Genet 37:549-54 (2005); Bibikova 등 Am J Pathol 165:1799-807 (2004); Fan 등, Genome Res 14:878-85 (2004); Kuhn 등, Genome Res 14:2347-56 (2004); Yeakley 등, Nat Biotechnol 20:353-8 (2002); 및 Bibikova 등, Genome Res 16:383-93 (2006)에 개시되어 있으며, 이의 각각은 그 전체가 참조로 포함된다.
본원에 사용된, "중합체"는 서로 커플링되고 단량체로 지칭될 수 있는 많은 소단위의 사슬을 포함하는 분자를 지칭한다. 소단위는 반복될 수 있거나 서로 다를 수 있다. 중합체는 생물학적 또는 합성 중합체일 수 있다. 표지 내에 적합하게 포함될 수 있는 생물학적 중합체의 예는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 다당류, 폴리뉴클레오티드 유사체, 및 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 유사체의 예는 DNA, 거울상 이성질체 DNA, RNA, PNA (펩티드-핵산), 모르폴리노, 및 LNA (잠금된 핵산)를 포함한다. 중합체는 Glen Research (Sterling, VA)로부터 상업적으로 이용가능한 것과 같은 폴리뉴클레오티드에 커플링될 수 있지만 핵염기가 결여된 스페이서 포스포아미다이트를 포함할 수 있다. 합성 폴리펩티드의 예는 하전된 또는 중성 아미노산뿐만 아니라 친수성 및 소수성 잔기를 포함할 수 있다. 합성 중합체의 예는 PEG (폴리에틸렌 글리콜), PPG (폴리프로필렌 글리콜), PVA (폴리비닐 알코올), PE (폴리에틸렌), LDPE (저밀도 폴리에틸렌), HDPE (고밀도 폴리에틸렌), 폴리프로필렌, PVC (폴리 염화비닐), PS (폴리스티렌), 나일론 (지방족 폴리아미드), TEFLON® (테트라플루오로에틸렌), 열가소성 폴리우레탄, 폴리알데히드, 폴리올레핀, 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(ω-알켄산 에스테르), 폴리(알킬 메타크릴레이트), 및 Hermanson, Bioconjugate Techniques, 3차 개정판, Academic Press, London (2013)에 기술된 바와 같은 다른 중합체성 화학적 및 생물학적 링커를 포함한다. 합성 중합체는 전도성, 반전도성, 또는 절연성일 수 있다.
3'-차단된 뉴클레오티드를 정제 및 중합하는 방법의 예시, 및 연관된 조성물
도 1a-1b는 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제하기 위한 공정 흐름에서의 조성물 및 작동의 예시를 개략적으로 예시한다. 이제 도 1a를 참조하면, 조성물 (100)은 유동 셀과 같은 기재 (101), 및 용액 (120)을 포함한다. 용액 (120)은 물; 3' 위치에 차단기 (125)를 각각 포함하는 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124); 3' 위치에 차단기 대신 히드록실기를 각각 포함하는 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), 및 (114); 연마 중합효소 (105); 및 주형 (150)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)는 검출가능한 모이어티 (표지로도 지칭될 수 있음)를 포함할 수 있다. 예시적으로, 3'-차단된 뉴클레오티드 (121) (G)는 검출가능한 모이어티 (131)를 포함할 수 있고, 3'-차단된 뉴클레오티드 (122) (T)는 검출가능한 모이어티 (132)를 포함할 수 있고, 3'-차단된 뉴클레오티드 (123) (A)는 검출가능한 모이어티 (133)를 포함할 수 있고, 3'-차단된 뉴클레오티드 (124) (C)는 검출가능한 모이어티 (134)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 각각의 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)는 상응하는 3'-차단된 뉴클레오티드와 동일한 검출가능한 모이어티를 포함할 수 있는데, 예를 들어, 3'-OH 뉴클레오티드가 3'-차단된 뉴클레오티드의 분해로부터 초래할 수 있거나, 차단기 (125)를 첨가할 경우 3'-OH 뉴클레오티드의 3'-차단된 뉴클레오티드로의 100% 미만의 전환 후에 잔류하였을 수 있기 때문이다. 이와 같이, 3'-OH 뉴클레오티드 (111) (G)는 검출가능한 모이어티 (131)를 포함할 수 있고, 3'-OH 뉴클레오티드 (112) (T)는 검출가능한 모이어티 (132)를 포함할 수 있고, 3'-OH 뉴클레오티드 (113) (A)는 검출가능한 모이어티 (133)를 포함할 수 있고, 3'-OH 뉴클레오티드 (114) (C)는 검출가능한 모이어티 (134)를 포함할 수 있다. 적합한 링커 (135) (도 1a에서 표지되는 단일의 이러한 링커)는 표지를 상응하는 3'-OH 뉴클레오티드 또는 3'-차단된 뉴클레오티드에 커플링할 수 있고, n-히드록시숙신이미드 (NHS) 에스테르 화학 또는 클릭 화학과 같은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 제공될 수 있다.
3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)는 연마 중합효소 (105) 및 주형 (150)을 사용하여 선택적으로 중합가능하다. 연마 중합효소 (105)는 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)와 비교하여 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)를 중합하기 위해 유의적으로 더 높은 친화도를 가질 수 있다. 이와 같이, 연마 중합효소 (105)는 3'-OH 뉴클레오티드에 특이적인 것으로 간주될 수 있다. 도 1a에 예시된 특정 시간에, 폴리뉴클레오티드 (140)가 상보성인 주형 (150)의 서열을 사용하여 신장하는 폴리뉴클레오티드 (140) 내로 포함됨으로써, 연마 중합효소 (105)는 이것이 결합하는 특정 3'-OH 뉴클레오티드 (예시적으로, 뉴클레오티드 (113))를 중합한다. 추가적으로, 잔류하는 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)에는 차단기 (125)가 결여되어 있기 때문에, 연마 중합효소 (105)는 폴리뉴클레오티드 (150)의 서열을 사용하여 뉴클레오티드에 결합함에 따라 이러한 뉴클레오티드를 중합하여 폴리뉴클레오티드 (140)를 연장하는 반면 (예시적으로, 서열 ATCGA에서), 3'-차단된 뉴클레오티드는 도 1b에 예시된 바와 같은 방식으로 실질적으로 용액 (120) 내에 잔류한다. 이와 같이, 연마 중합효소 (105)는 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키고, 따라서 3'-차단된 뉴클레오티드와 함께 중합될 3'-OH 뉴클레오티드의 이용가능성을 감소시키거나, 심지어 실질적으로 제거하는 방식으로, 예를 들어 도 2a-2b를 참조하여 기술된 것과 같은 방식으로 3'-OH 뉴클레오티드를 격리시키는 것으로 간주될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 (150)는 중합효소 (105)가 사용하여 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드를 중합할 수 있는 임의의 적합한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 (150)는 임의의 3'-OH 뉴클레오티드가, 예를 들어 5개 이상의 무염기 뉴클레오티드, 10개 이상의 무염기 뉴클레오티드, 15개 이상의 무염기 뉴클레오티드, 또는 20개 이상의 무염기 뉴클레오티드를 혼성화할 수 있는 복수의 무염기 뉴클레오티드 (N)를 포함할 수 있다. 무염기 뉴클레오티드는 서로 인접하여, 예를 들어, 서열 NNN...N을 형성할 수 있다. 일부 예에서, 본 조성물 및 방법은 폴리뉴클레오티드 (150)에 결합하고 폴리뉴클레오티드 (150)의 서열을 사용하여 중합된 3'-OH 뉴클레오티드를 사용하여 연장되어 폴리뉴클레오티드 (140)를 형성하는 프라이머 (141)의 사용을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 프라이머 (141)는 용액 (120) 내에서 유리-부유성일 수 있고, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 (150)로서 대략 등몰량, 또는 과량으로 첨가될 수 있고, 폴리뉴클레오티드 (150)의 상보성 프라이머 (151)에 혼성화할 수 있다.
도 1a-1b에 예시된 바와 같은 다른 예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 루프 올리고뉴클레오티드 (142)를 통해 폴리뉴클레오티드 (150)에 연결되고 상보성 프라이머 (151)에 혼성화되는 프라이머 (141)의 사용을 포함할 수 있어, 프라이머 및 상보성 프라이머가 서로 혼성화하여 헤어핀 루프를 형성할 수 있고, 프라이머가 용액 (120) 내에서 유리하여(freely) 부유하지 않을 수 있도록 한다. 일 비제한적인 예에서, 헤어핀 루프는 프라이머 (141)를 포함하는 제1 부분, 제2 부분 (142) (루프 올리고뉴클레오티드로 지칭될 수 있음), 제1 부분에 상보성이고 (상보성 프라이머로 지칭될 수 있음) 제2 부분을 통해 제1 부분에 연결된 제3 부분 (151), 및 서로 인접할 수 있는 복수의 무염기 뉴클레오티드를 포함하는 제4 부분 (152)을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 제1 부분 (141)은 제3 부분 (151)에 혼성화할 수 있고, 중합효소 (105)는 제4 부분 (152)의 서열을 사용하여 3'-OH 뉴클레오티드를 제1 부분 (141)에 첨가할 수 있다. 일 오로지 예시적인 예에서, 프라이머 (141), 루프 올리고뉴클레오티드 (142), 상보성 프라이머 (151), 및 제4 부분 (152)은 하기 서열을 포함할 수 있으며;
5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNcggccatataactggtagcttTTTTaagctaccagttatatggccg-3' (서열 번호 1)
프라이머 (141) (제1 부분)는 서열의 aagctaccagttatatggcc (서열 번호 2) 부분을 포함하고, 루프 올리고뉴클레오티드 (142) (제2 부분)는 서열의 TTTT 부분을 포함하고, 상보성 프라이머 (151) (제3 부분)는 서열의 cggccatataactggtagctt (서열 번호 3) 부분을 포함하고, 다시 폴딩되어 서열의 aagctaccagttatatggcc 부분으로 혼성화하고, 제4 부분 (152)은 서열의 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (서열 번호 4) 부분을 포함한다. 제1 부분 (141), 제2 부분 (142), 및 제3 부분 (151)은 선택된 뉴클레오티드의 임의의 적합한 서열을 가져 제1 및 제3 부분이 서로 상보성이도록 할 수 있고 제2 부분을 통해 서로 커플링되어 제1 및 제3 부분이 서로 혼성화할 수 있도록 한다는 것이 인식될 것이다. 또한, 제4 부분 (152)은, 예를 들어 프라이머 (141) 및 제4 부분 (152)의 서열을 사용하여 폴리뉴클레오티드 (140)를 연장시키기 위해 선택된 뉴클레오티드의 임의의 적합한 서열을 가질 수 있어 3'-OH 뉴클레오티드가 중합효소 (105)를 사용하여 중합될 수 있도록 한다는 것이 인식될 것이다.
도 1b는 5개의 3'-OH 뉴클레오티드가 주형 (150)을 사용하여 중합되는 것을 제시할 수 있지만, 임의의 적합한 수의 3'-OH 뉴클레오티드가 용액 (120) 내의 각 주형을 사용하여 중합될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 예를 들어, 약 하나의 3'-OH 주형이 각 주형 (150)을 사용하여 중합될 수 있거나, 약 2개의 3'-OH 뉴클레오티드가 각 주형 (150)을 사용하여 중합될 수 있거나, 약 3개의 3'-OH 뉴클레오티드가 각 주형 (150)을 사용하여 중합될 수 있거나, 약 4개의 3'-OH 뉴클레오티드가 각 주형 (150)을 사용하여 중합될 수 있거나, 약 5개의 3'-OH 뉴클레오티드가 각 주형 (150)을 사용하여 중합될 수 있거나, 약 5개 초과의 3'-OH 뉴클레오티드가 각 주형 (150)을 사용하여 중합될 수 있다.
3'-OH 뉴클레오티드 용액 (120) 내의 초기 농도는 약 5% 이상일 수 있고, 연마 중합효소 (105)는 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하, 또는 약 0.5% 이하, 또는 약 0.2% 이하, 또는 약 0.1% 이하, 또는 약 0.05% 이하, 또는 약 0.02% 이하, 또는 약 0.01% 이하, 또는 심지어 약 0%까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도는 약 2% 이상일 수 있고, 연마 중합효소 (105)는 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 약 1% 이하, 또는 약 0.5% 이하, 또는 약 0.2% 이하, 또는 약 0.1% 이하, 또는 약 0.05% 이하, 또는 약 0.02% 이하, 또는 약 0.01% 이하, 또는 심지어 약 0%까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도는 약 1% 이상일 수 있고, 연마 중합효소 (105)는 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 약 0.5% 이하, 또는 약 0.2% 이하, 또는 약 0.1% 이하, 또는 약 0.05% 이하, 또는 약 0.02% 이하, 또는 약 0.01% 이하, 또는 심지어 약 0%까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도는 약 0.5% 이상일 수 있고, 연마 중합효소 (105)는 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 약 0.2% 이하, 또는 약 0.1% 이하, 또는 약 0.05% 이하, 또는 약 0.02% 이하, 또는 약 0.01% 이하, 또는 심지어 약 0%까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도는 약 0.2% 이상일 수 있고, 연마 중합효소 (105)는 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 약 0.1% 이하, 또는 약 0.05% 이하, 또는 약 0.02% 이하, 또는 약 0.01% 이하, 또는 심지어 약 0%까지 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도는 약 0.1% 이상일 수 있고, 연마 중합효소 (105)는 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 약 0.05% 이하, 또는 약 0.02% 이하, 또는 약 0.01% 이하, 또는 심지어 약 0%까지 감소시킬 수 있다.
예시적으로, 연마 중합효소 (105)는 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 10%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 20%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 30%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 40%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 50%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 60%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 70%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 80%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 90%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 95%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 98%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 99%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 99.9%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 99.99%만큼 감소시킬 수 있거나, 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 해당 용액 내 3'-OH 뉴클레오티드의 초기 농도와 비교하여 약 100%만큼 감소시킬 수 있다.
도 1a-1b를 참조하여 기술된 용액 (120)은 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 일 예에서, 용액 (120)은 물, 연마 중합효소 (105), 및 주형 (150) (부분 (141), (142), 및 (151), (152)를 포함할 수 있음)을 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124) 및 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)의 동결건조된 혼합물에 첨가함으로써 제조된다. 예를 들어, 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 동결건조된 혼합물은 저장 또는 운송을 위해 충분히 안정할 수 있고, 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제하기 전에 물로 재구성되고 연마 중합효소 및 주형과 혼합될 수 있다. 또 다른 예에서, 용액 (120)은 물을 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124), 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114), 연마 중합효소 (105), 및 주형 (150) (부분 (141), (142), 및 (151), (152)를 포함할 수 있음)의 동결건조된 혼합물에 첨가함으로써 제조된다. 예를 들어, 3'-차단된 뉴클레오티드, 3'-OH 뉴클레오티드, 연마 중합효소, 및 주형의 동결건조된 혼합물은 저장 또는 운송을 위해 충분히 안정할 수 있고, 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제하기 전에 물로 재구성될 수 있다. 이러한 동결건조된 혼합물은, 예를 들어 재수화될 수 있는 케이크로서 제공될 수 있다. 또 다른 예에서, 용액 (120)은 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제하기 전에 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124) 및 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)의 수성 혼합물을 연마 중합효소 (105) 및 주형 (150)과 함께 혼합함으로써 제조된다. 예를 들어, 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 수성 혼합물이 동결건조된 혼합물보다 다소 덜 안정할 수 있지만 (예를 들어, 3'-차단된 뉴클레오티드는 동결건조된 경우에 비해 용액 내에 있을 때 3'-OH 뉴클레오티드로 가수분해될 가능성이 더 높을 수 있음), 본 방법을 사용하여 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제하는 것은 3'-차단된 뉴클레오티드의 가수분해를 억제하기 위해 시도할 필요성을 감소시킬 수 있다. 용액 (120)의 임의의 적합한 조제물은 중합효소 기능에 사용하기 위한 적절한 완충제(들), 예를 들어 마그네슘 양이온 또는 칼륨 양이온과 같은 염 (예를 들어, 아세트산 마그네슘, 아세트산 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 칼륨, 염화 나트륨 등을 통함)을 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다.
일부 예에서, 용액 (120) (및 용액 (120)이 제조될 수 있는 임의의 동결건조된 혼합물)은 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제를 향상시키기 위해 충분한 양의 효모 유기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)를 중합하는 것은 하기와 같이 발현될 수 있는 가역 반응에서 피로인산염 (PPi)을 생성할 수 있다:
.
일부 예에서, YPP는 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)가 중합될 때 용액으로부터 피로인산염을 제거하기 위해 용액 (120)의 다른 성분과 혼합될 수 있고, 따라서 추가적인 3'-OH 뉴클레오티드가 중합되는 (신장하는 가닥에 첨가됨) 속도를 YPP의 부재에서의 이러한 속도에 비해 증가시키기 위해 가역 반응을 정방향으로 구동시킬 수 있다.
일부 예에서, 용액 (120) (및 용액 (120)이 제조될 수 있는 임의의 동결건조된 혼합물)은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함할 수 있다. 변형된 α-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이다. 변형된 β-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 및 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)을 포함한다. 변형된 γ-시클로덱스트린의 비제한적인 예는 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린이다. 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 YPP와 함께 사용될 수 있거나, 또는 YPP 없이 사용될 수 있다. 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 뉴클레오티드의 용해도를 촉진할 수 있고/있거나 용액 내에서 이인산염 또는 사인산염과 같은 하나 이상의 부산물의 형성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 용액 (120)은 연마 중합효소 및/또는 SBS 중합효소 (예를 들어, 적어도 약 1 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 6 mM의 농도에서)에 의한 사용을 위한 마그네슘 이온을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 (3'-차단된 및 3'-OH)는 후속 시간에 수행될 SBS 동안 사용되어 뉴클레오티드를 서로 구별할 수 있는 검출가능한 모이어티, 예컨대 형광 염료에 커플링될 수 있다. 임의의 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 용액 (120) 내에서 뉴클레오티드가 비교적 높은 농도 (예를 들어, 적어도 약 0.5 mM)를 갖는 경우, 마그네슘 이온은 뉴클레오티드 및/또는 이에 커플링된 검출가능한 모이어티, 예를 들어 형광 염료의 용해도를 감소시킬 수 있는 것으로 여겨진다. 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 (120) 내의 뉴클레오티드 및/또는 검출가능한 모이어티의 용해도를 향상시키기 위해 충분한 양으로 포함될 수 있고, 따라서 그렇지 않으면 마그네슘 이온에 의해 유발될 수 있는 용해도의 임의의 감소를 완화시킬 수 있다. 예시적으로, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 (120) 내에서 약 1% 내지 약 10% 중량/부피 (w/v), 예를 들어 약 2% 내지 약 5% (w/v), 또는 약 5% 내지 약 9% (w/v)의 농도를 가질 수 있거나, 용액 (120) 내에서 약 10% (w/v) 초과의 농도를 가질 수 있다. 다른 용액 조건은 용액 (120) 내에서 뉴클레오티드 및/또는 이에 커플링된 형광 염료의 용해도를 향상시키기 위해 적합하게 조정될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드의 농도는 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 선택적으로 사용해 충분히 감소되어, 예를 들어 약 1.5 mM 미만, 예를 들어 약 0.1 mM 내지 약 1.5 mM, 또는 약 0.5 내지 약 1.0 mM의 농도까지 용해도를 유지할 수 있다.
예를 들어, 도 1a-1b를 참조하여 기술된 바와 같은 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 후에, 3'-차단된 뉴클레오티드가 중합될 수 있다. 예를 들어, 도 2a-2b는 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하기 위한 공정 흐름에서의 조성물 및 작동의 예를 개략적으로 예시한다. 이제 도 2a를 참조하면, 조성물 (200)은 기재 (201), 예컨대 유동 셀, 용액 (220), 및 기재 (201)에 커플링될 수 있는 주형 (250)을 포함한다. 용액 (220)은 물; 3' 위치에서 차단기 (125)을 각각 포함하는 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124); 및 SBS 중합효소 (205)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)는 검출가능한 모이어티 (이는 표지로도 지칭될 수 있음), 예를 들어, 도 1a-1b를 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 적합한 링커 (135)를 통해 3'-차단된 뉴클레오티드에 커플링될 수 있는 검출가능한 모이어티 (131), (132), (133), (134)를 포함할 수 있다. 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)는 SBS 중합효소 (205) 및 주형 (250)을 사용하여 중합가능하다. 예를 들어, SBS 중합효소 (205)는 원칙적으로 특정 시간에 용액 (220) 내에 존재하는 임의의 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114) 또는 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)에 결합이 가능할 수 있지만 (예를 들어, 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드에 대해 비특이적일 수 있음), 용액 (220) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도는 더 이른 시간에 정제 작동을 사용하여 감소되거나 제거될 수 있다. 이와 같이, SBS 중합효소 (205)는 실질적으로 임의의 3'-OH 뉴클레오티드에 결합 및 중합하지 않고 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)에 결합 및 중합할 수 있다.
도 2b에 예시된 특정 시간에, SBS 중합효소 (205)는 폴리뉴클레오티드 (240)이 상보성인 주형 (250)의 서열을 사용하여 신장하는 폴리뉴클레오티드 (240) 내로 포함함으로써, 이것이 결합하는 특정 3'-차단된 뉴클레오티드 (예시적으로, 뉴클레오티드 (121))를 중합한다. 추가적으로, 3'-차단된 뉴클레오티드 (121)는 차단기 (125)를 포함하기 때문에, SBS 중합효소 (205)는 차단기 (125)가 제거되지 않는 한 및 차단기 (125)가 제거될 때까지 또 다른 이러한 뉴클레오티드를 중합하지 않을 수 있다. 검출 회로 (260)는 SBS (205)가 뉴클레오티드 (121)에 결합하는 동안 검출가능한 모이어티 (131)를 검출 및 식별할 수 있고, 이에 의해 주형 (250) 내의 뉴클레오티드 (121) 및 이의 상보성 뉴클레오티드를 식별할 수 있다. 차단기 (125)가 제거된 후, 그런 다음 SBS 중합효소 (205)는 검출 회로 (260)가 뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티를 사용하여 식별할 수 있는 추가적인 3'-차단된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예시적으로, 검출가능한 모이어티 (131), (132), (133), (134)는 하나 이상의 형광단을 포함할 수 있고, 검출 회로 (260)는 카메라와 같은 광학 검출 회로를 포함할 수 있지만, 본 방법 및 조성물은 형광 또는 이러한 형광의 광학 검출을 통해 뉴클레오티드를 검출하는 것에 제한되지 않는다는 것이 인식될 것이다.
도 2a-2b를 참조하여 기술된 용액 (220)은 임의의 적합한 방식으로 제조될 수 있다. 일 예에서, 용액 (220)은 SBS 중합효소 (205)를 도 1a-1b를 참조하여 기술된 정제 작동으로부터 수득된 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)와 함께 혼합함으로써 제조된다. 도 2a-2b에 예시된 특정 예에서, 용액 (220)은, 예를 들어 도 1a-1b를 참조하여 기술된 정제 작동으로부터 초래하는 주형 (150)에 혼성화된 중합된 3'-OH를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 주형 (150)에 혼성화된 중합된 3'-OH 뉴클레오티드는 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)의 중합에 유의하게 영향을 미치거나 방해하지 않을 수 있고, 이와 같이 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)를 중합하기 전에 용액 (220)으로부터 주형 (150)에 혼성화된 중합된 3-OH 뉴클레오티드 (140)를 제거할 필요가 없을 수 있다. 용액 (220)은 또한 또는 대안적으로, 연마 중합효소 (105)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 연마 중합효소 (105)는 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)의 중합에 유의하게 영향을 미치거나 방해하지 않을 수 있고, 이와 같이 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)를 중합하기 전에 용액 (220)으로부터 연마 중합효소를 제거할 필요가 없을 수 있다. 따라서, 일 비제한적인 예에서, 용액 (220)은, 예를 들어 도 1a-1b를 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)에 비해 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)의 농도를 감소시킨 후, SBS 중합효소 (205)를 용액 (120)에 첨가하고, 주형 (250)을 용액 (220)과 접촉시킴으로써 제조된다. 일부 예에서, 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)에 비해 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)의 농도는 주형 (250)의 존재에서 감소되고, 용액 (220)은 이러한 감소 후 주형 (250)의 존재에서 SBS 중합효소 (205)를 용액 (120)에 첨가함으로써 제조된다. 다른 예에서, 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)에 비해 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)의 농도(도 1b)는 다른 곳에서 감소되고, 용액 (220)은 이러한 감소 후에 SBS 중합효소 (205)를 용액 (120)에 첨가함으로써 제조되고, 그런 다음 용액 (220)은 주형 (250)과 접촉된다. YPP 또는 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린과 같은 첨가제가 용액 (120) 내에 포함될 경우, 이러한 첨가제는 또한 용액 (220) 내에 존재할 수 있다.
본 조성물은 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제 또는 중합하기 위한 임의의 적합한 방법에 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예시적으로, 도 3은 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제하기 위한 방법에서 작동의 흐름의 예를 예시한다. 도 3에 예시된 방법 (300)은 (a) 3'-차단된 뉴클레오티드, (b) 3'-OH 뉴클레오티드, (c) 연마 중합효소, 및 (d) 주형을 포함하는 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다(작동 (310)). 예를 들어, 도 1a-1b를 참조하여 기술된 용액 (120)은 (a) 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124); (b) 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114); (c) 연마 중합효소 (105); 및 (d) 주형 (150)을 포함하여 제조될 수 있다. 일부 예에서, 용액을 제조하는 단계는 물, 연마 중합효소, 및 주형을 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 동결건조된 혼합물에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 용액을 제조하는 단계는 물을 3'-차단된 뉴클레오티드, 3'-OH 뉴클레오티드, 연마 중합효소, 및 주형의 동결건조된 혼합물에 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티, 예를 들어 도 1a-1b를 참조하여 기술된 검출가능한 모이어티 (131), (132), (133), (134)를 포함한다.
도 3에 예시된 방법 (300)은 연마 중합효소 및 주형을 사용하는 단계를 추가로 포함하여 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합하고 따라서 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시킬 수 있다 (작동 (320)). 예를 들어, 연마 중합효소 (105) 및 주형 (150)은 사용되어 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)를 선택적으로 중합하고 따라서 도 1a-1b를 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)에 비해 용액 (120) 내에서 이들 뉴클레오티드의 농도를 감소시킬 수 있다. 작동 (320) 동안 연마 중합효소 및 주형을 사용하면서 용액을 가열할 수 있다. 예를 들어, 다른 연마 중합효소는 이들이 3'-OH 뉴클레오티드를 효율적이고 선택적으로 중합할 수 있는 다른 온도를 가질 수 있다. 예시적으로, 용액은 약 30-75℃의 온도, 예를 들어 약 40-60℃의 온도로 가열될 수 있다. 그러나, 작동 (320)을 수행하기 위한 특정 온도(들)는 적어도 사용되는 특정 연마 중합효소, 및 용액 내에서 특정 3'-OH 뉴클레오티드를 중합하기 위한 이의 성능에 기반하여 선택될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 일부 예에서, 용액은 내부 슬리브, 외부 슬리브, 및 용액이 유동하는 나선형 튜브를 포함하는 캐시 매니폴드를 사용하여 가열될 수 있으며, 내부 슬리브 및 외부 슬리브 중 적어도 하나가 가열된다. 이러한 캐시 매니폴드의 비제한적인 예가 도 5a-5b 및 도 6a-6d를 참조하여 기술된다.
도 4는 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거하는 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하기 위한 방법에서의 작동의 흐름의 예를 예시한다. 도 4에 예시된 방법 (400)은 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드를 포함하는 제1 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다 (작동 (410)). 도 3을 참조하여 기술된 작동 (310) 및 (320)은 작동 (410)이 수행될 수 있는 방식의 비제한적인 예를 제공한다. 예를 들어, 작동 (410)은, 예를 들어 도 1a-1b 및 도 3을 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 연마 중합효소 (105) 및 주형 (150)을 사용하여 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합함으로써 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)에 비해 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)의 농도를 감소시키는 단계를 포함할 수 있다.
도 4에 예시된 방법 (400)은 (a) 제1 용액으로부터의 3'-차단된 뉴클레오티드, 및 (b) SBS 중합효소를 포함하는 제2 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다 (작동 (420)). 예를 들어, 도 2a-2b를 참조하여 기술된 용액 (220)은 (a) 용액 (120)으로부터의 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124) (도 1a-1b), 및 (b) SBS 중합효소 (205)를 포함하여 제조될 수 있다. 도 1a-1b를 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로, 용액 (120)은 연마 중합효소 (105)를 추가로 포함할 수 있고, 추가적으로 또는 대안적으로 중합된 3'-OH 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 예시적으로, 제2 용액을 제조하는 단계는 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)에 비해 용액 (120) 내에서 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)의 농도를 감소시킨 후에 SBS 중합효소 (205)를 용액 (120)에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 작동 (420)은 주형 (250)의 존재에서 수행될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
도 4에 예시된 방법 (400)은 SBS 중합효소 및 제1 주형을 사용하는 단계를 포함하여 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합할 수 있다 (작동 (430)). 예를 들어, SBS 중합효소 (205)는 도 2a-2b를 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 주형 (250)을 사용하여 3'-차단된 뉴클레오티드 (121), (122), (123), (124)를 중합할 수 있다. 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114) (도 1a-1b)가 용액 (220) (도 2a-2b) 내에서 더 적을 (및 일부 예에서는 실질적으로 없음) 수 있기 때문에, 주형 (250)의 서열 (도 2a-2b)은 용액 (220)이 대신에 더 큰 수 또는 농도의 3'-OH 뉴클레오티드 (111), (112), (113), (114)를 포함하였던 경우보다 더 정확하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 용액 (120) 및 (220) 내 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 방법 (400)은 3'-차단된 뉴클레오티드가, 예를 들어 도 2a-2b를 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 SBS 중합효소 및 제1 주형을 사용하여 중합되는 동안 3'-차단된 뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
작동 (320) 및 (430)은 임의의 적합한 성분을 사용하여 수행될 수 있다는 것이 인식되어야 한다. 일 비제한적인 예에서, 연마 중합효소 (105) 및 주형 (150)은 작동 (320) 동안 합성에 의한 시퀀싱 기구에서 사용된다. SBS 중합효소 (205) 및 주형 (250)은, 일부 예에서 3'-차단된 뉴클레오티드가 별도의 작동을 사용하여 정제되는 것과 동일한 기구 상에서 사용될 수 있다. 즉, 연마 중합효소 및 SBS 중합효소 둘 모두는 다른 시간에서지만 동일한 합성에 의한 시퀀싱 기구 상에서 사용될 수 있다. 이와 같이, 3'-차단된 뉴클레오티드는 이를 중합하기 전에 임의의 적합한 시간에 정제될 수 있고, 심지어 이를 중합하기 직전에 정제될 수 있으므로, 중합 전에 3'-차단된 뉴클레오티드의 3'-OH 뉴클레오티드로의 전환을 감소시키거나 억제할 수 있다.
상기 추가로 언급된, 다른 중합효소는 다른 온도에서 다르게 기능할 수 있다. 예를 들어, 방법 (300)의 작동 (320)에서 사용된 특정 연마 중합효소는 방법 (400)의 작동 (430)에서 사용된 특정 SBS 중합효소보다 더 높거나 더 낮은 온도에서 적절하게 기능할 수 있다. 도 5a-5b는, 예를 들어 도 1a-1b를 참조하여 기술된 용액 (120) 또는 도 2a-2b를 참조하여 기술된 용액 (220)을 가열 또는 냉각하기 위해 사용될 수 있는 온도 제어 디바이스 (500)의 예를 개략적으로 예시한다. 도 5a의 사시도 및 도 5b의 횡단면도에서 예시된 디바이스 (500)은 본원에서 "캐시 매니폴드"로 지칭될 수 있다. 디바이스 (500)는 입구 (501), 출구 (502), 내부 구조체 (511), 외부 슬리브 (512), 나선형 튜브 (520), 및 장착 구조체 (530)를 포함한다. 입구 (501)은 내부 구조체 (511) 및 외부 슬리브 (512) 사이를 통과하는 나선형 튜브 (520)에 커플링될 수 있다. 내부 구조체 (511)는 가열 또는 냉각될 수 있고, 외부 슬리브 (512)는 가열 또는 냉각될 수 있다. 도 5a-5b에 예시된 비제한적인 예에서, 내부 구조체 (511)는, 예를 들어 공기 냉각을 사용하여 냉각될 수 있거나, 예를 들어 내부 구조체 (511) 내에 배치된 가열 요소 (515) (예컨대 유동하는, 가열된 유체 또는 저항성 가열 요소)를 사용하여 가열될 수 있다. 예를 들어, 내부 구조체 (511)는 가열 또는 냉각을 제공하기 위해 유체가 유동할 수 있는 루멘 (lumen)을 제공하는 내부 슬리브를 포함할 수 있거나, 또는 저항성 가열 요소 (515)와 같은 가열 요소와 접촉할 수 있다.
사용 동안, 입구 (501)는 가열 또는 냉각될 유체 (예를 들어, 용액 (120) 또는 (220))를 수용할 수 있다. 유체는 나선형 튜브 (520)를 통과하고, 출구 (502)에서 디바이스 (500)를 빠져나가기 전에 내부 구조체 (511) 및 외부 슬리브 (512) 중 하나 또는 둘 모두와의 열 접촉을 통해 가열 또는 냉각된다. 예를 들어, 내부 구조체 (511)는 나선형 튜브 (520)가 디바이스 (500)의 길이를 따라 끼워지는 스캘럽핑된(scalloped) 코어 (513)를 포함하여, 따라서 나선형 튜브 (520)를 구조체 (511)와 열적으로 접촉시킬 수 있다. 나선형 튜브 (520)는 열 포팅(potting) 물질 (514)를 사용하여 외부 슬리브 (512)에 열적으로 연결될 수 있다. 디바이스 (500)는 유체의 온도를 제어하는데 사용하기 위해, 합성에 의한 시퀀싱 기구, 또는 임의의 다른 적합한 시스템 또는 장치에 제공될 수 있다. 예를 들어, 장착 구조 (530)는 디바이스 (500)이, 예를 들어 시약 저장소 및 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 또는 중합 (또는 정제 및 중합 둘 모두)이 수행되는 기재 사이의 유체 유동 경로 내와 같은, 합성에 의한 시퀀싱 기구 내의 제자리로 고정될 수 있는 개구를 포함할 수 있다. 디바이스 (500)는 임의의 적합한 온도, 예를 들어 도 1a-1b 및 도 3을 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 연마 중합효소를 사용하기에 적합한 온도, 또는 도 2a-2b 및 도 4를 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 SBS 중합효소를 사용하기에 적합한 온도까지 용액을 가열 또는 냉각하기 위해 사용될 수 있다.
디바이스 (500)는 임의의 적합한 치수들을 가질 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 디바이스 (500)는 약 10 mm 내지 약 1 m, 또는 약 50 mm 내지 약 500 mm, 또는 약 50 mm 내지 약 200 mm의 길이를 가질 수 있다.추가적으로 또는 대안적으로, 내부 구조체 (511)는 약 5 mm 내지 약 80 mm, 또는 약 10 mm 내지 약 50 mm의 내경을 가질 수 있다.추가적으로 또는 대안적으로, 외부 슬리브 (512)는 약 10 mm 내지 약 100 mm, 또는 약 20 mm 내지 약 50 mm의 외경을 가질 수 있다.일 비제한적인 예에서, 디바이스 (500)는 약 100 mm의 길이를 가질 수 있고, 내부 구조체 (511)는 약 50 mm의 내경을 가질 수 있고, 외부 슬리브 (512)는 약 70 mm의 외경을 가질 수 있다.예시적으로, 나선형 튜브 (620)는 약 4 ml의 부피를 가질 수 있다.
도 6a-6d는 또 다른 온도 제어 디바이스의 예, 예를 들어 도 1a-1b를 참조하여 기술된 용액 (120) 또는 도 2a-2b를 참조하여 기술된 용액 (220)을 개략적으로 예시한다. 도 6a의 사시도 및 도 6b의 횡단면도에서 예시된 온도 제어 디바이스 (600)는 본원에서 "캐시 매니폴드"로 지칭될 수 있다. 디바이스 (600)는 입구 (601), 출구 (602), 내부 슬리브 (611), 외부 슬리브 (612), 나선형 튜브 (620), 및 장착 구조체 (630)를 포함한다. 입구 (601)는 내부 슬리브 (611) 및 외부 슬리브 (612) 사이를 통과하는 나선형 튜브 (620)에 커플링될 수 있다. 내부 슬리브 (611)는 가열 또는 냉각될 수 있고, 외부 슬리브 (612)는 가열 또는 냉각될 수 있다. 도 6a-6b에 예시된 비제한적인 예에서, 내부 슬리브 (611)는, 예를 들어 내부 슬리브 (611) 내에 배치된 가열/냉각 요소 (615) (예컨대, 유동, 가열되거나 냉각된 유체)를 사용하여 냉각될 수 있거나 가열될 수 있다. 외부 슬리브 (612)는, 예를 들어 외부 슬리브 (612) 내에 배치된 가열 요소 (616) (예컨대, 저항성 가열 요소)을 사용하여 냉각될 수 있거나 가열될 수 있다. 사용 동안, 입구 (601)는 가열되거나 냉각될 유체 (예를 들어, 용액 (120) 또는 (220))를 수용할 수 있다. 유체는 나선형 튜브 (620)를 통과하고, 출구 (602)에서 디바이스 (600)를 빠져나가기 전에 내부 슬리브 (611) 및 외부 슬리브 (612) 중 하나 또는 둘 모두와의 열 접촉을 통해 가열 또는 냉각된다. 예를 들어, 내부 슬리브 (611)는 나선형 튜브 (620)이 디바이스 (600)의 길이를 따라 끼워지는 스캘럽핑된 코어 (613)를 포함하여, 따라서 나선형 튜브 (620)를 내부 슬리브 (611)와 열적으로 접촉시킬 수 있다. 나선형 튜브 (620)는 열 포팅 물질 (614)을 사용하여 외부 슬리브 (612)에 열적으로 연결될 수 있다. 디바이스 (600)은 시약 저장소 및 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 또는 중합 (또는 정제 및 중합 둘 모두)가 수행되는 기재 사이의 유체 유동 경로 내와 같은 유체의 온도를 제어하는데 사용하기 위한 합성에 의한 시퀀싱 기구, 또는 임의의 다른 적합한 시스템 또는 장치로 제공될 수 있다. 예를 들어, 장착 구조체 (630)는 디바이스 (600)가, 예를 들어 합성에 의한 시퀀싱 기구 내의 제자리로 고정될 수 있는 개구를 포함할 수 있다. 도 6c는 디바이스 (600)의 장착 구조체 (630) 및 외부 하우징 (640)의 예의 사시도를 개략적으로 예시한다. 도 6d는 디바이스 (600)의 외부 하우징 (640)을 통한 횡단면도를 개략적으로 예시하며, 내부 슬리브 (611)의 입구 (617) 및 내부 슬리브 (611)의 출구 (618)가 보여질 수 있다. 디바이스 (600)는 임의의 적합한 온도, 예를 들어 도 1a-1b 및 도 3을 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 연마 중합효소를 사용하기에 적합한 온도, 또는 도 2a-2b 및 도 4를 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 SBS 중합효소를 사용하기에 적합한 온도까지 용액을 가열 또는 냉각하기 위해 사용될 수 있다.
디바이스 (600)는 임의의 적합한 치수를 가질 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 디바이스 (600)는 약 10 mm 내지 약 1 m, 또는 약 50 mm 내지 약 500 mm, 또는 약 50 mm 내지 약 200 mm의 길이를 가질 수 있다.추가적으로 또는 대안적으로, 내부 슬리브 (611)는 약 5 mm 내지 약 80 mm, 또는 약 10 mm 내지 약 50 mm의 내경을 가질 수 있다.추가적으로 또는 대안적으로, 외부 슬리브 (612)는 약 10 mm 내지 약 100 mm, 또는 약 20 mm 내지 약 50 mm의 외경을 가질 수 있다.일 비제한적인 예에서, 디바이스 (600)는 약 250 mm의 길이를 갖고, 내부 슬리브 (611)은 약 50 mm의 내경을 가질 수 있고, 외부 슬리브 (612)는 약 70 mm의 외경을 가질 수 있다.예시적으로, 나선형 튜브 (620)은 약 4 ml의 부피를 가질 수 있다.
임의의 적합한 수의 캐시 매니폴드는, 예를 들어 합성에 의한 시퀀싱 기구에서 임의의 적합한 수의 유체를 가열하거나 냉각시키는 데 사용될 수 있다. 예시적으로, 도 7a-7c는 도 6a-6d의 하나 이상의 가열 및 냉각 디바이스 (600)을 사용하는 온도 제어 시스템의 예를 개략적으로 예시한다. 도 7a에 나타난 온도 제어 시스템 (700)의 예에서, 냉각제 저장소 (710)는 임의의 적합한 수의 온도 제어 디바이스 (600), 예를 들어 제1 및 제2 온도 제어 디바이스에 커플링될 수 있고, 또한 도 7a에서 2차 모듈 (720)로 지칭되는, 냉각될 임의의 다른 적합한 요소에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 냉각제 저장소 (710)는 1차 냉각제 라인 (730) 및 2차 냉각제 라인 (740)을 통해 온도 제어 디바이스(들) (600) 및 2차 모듈 (720)에 커플링될 수 있다. 예시적으로, 냉각제가 온도 제어 디바이스(들) (600)의 내부 슬리브(들) (611)를 통해 유동한 후 (도 6a) 다시 1차 냉각제 라인 (730)으로 유동할 수 있는 1차 냉각제 라인 (730) 및 2차 냉각제 라인 (740) 사이의 연결부를 능동적으로 개방 또는 폐쇄하기 위해 능동 밸브 (750)는 적합한 제어 모듈에 의해 제어될 수 있다(특이적으로 예시되지 않음). 냉각제는 또한 2차 모듈 (720)을 통한 1차 냉각제 라인 (730)을 통해 유동될 수 있고, 가온된 냉각제 (예를 들어, 냉각 디바이스(들) 및 2차 모듈 (720) 중 임의의 적합한 것에 의해 가열된 바와 같음)는 리턴(return) 라인 (760)을 통해 냉각제 저장소로 리턴될 수 있다. 사용 동안, 유체 (예를 들어, 용액 (120) 또는 용액 (220)))는 온도 제어 디바이스(들) (600)를 통해 유동될 수 있고, 예를 들어 외부 슬리브 (612)의 가열 요소 (616)를 사용하여 제어가능하게 가열될 수 있고, 예를 들어 내부 슬리브 (611)를 통해 유동하는 냉각제를 사용하여 냉각될 수 있다 (도 6b). 일 비제한적인 예에서, 2차 모듈 (720)은 조명 모듈을 포함하고, 냉각제 저장소 (710)는 조명 모듈 및 온도 제어 디바이스(들) (600) 둘 모두를 냉각시키기 위한 것이다.
도 7b에 나타난 온도 제어 시스템 (700')의 예에서, 냉각제 저장소 (710')는 임의의 적합한 수의 온도 제어 디바이스 (600), 예를 들어 제1 및 제2 온도 제어 디바이스에 커플링될 수 있고, 또한 도 7b에서 2차 모듈 (720')로 지칭되는 냉각될 임의의 다른 적합한 요소에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 냉각제 저장소 (710')는 1차 냉각제 라인 (730')을 통해 온도 제어 디바이스(들) (600)에 커플링될 수 있으며(도 6a), 이를 통해 냉각제가 온도 제어 디바이스(들) (600)의 내부 슬리브 (611)을 통해 유동될 수 있고, 이어서 2차 냉각제 라인 (740') 내로 유동될 수 있다. 그런 다음, 냉각제가 2차 냉각제 라인 (740')으로 그리고 2차 모듈 (720')을 통해 유동될 수 있고, 가온된 냉각제 (예를 들어, 냉각 디바이스(들) 및 2차 모듈 (720')에 의해 가열된 바와 같음)가 리턴 라인 (760')을 통해 냉각제 저장소로 리턴될 수 있다. 사용 동안, 유체 (예를 들어, 용액 (120) 또는 용액 (220))가 온도 제어 디바이스(들) (600)를 통해 유동될 수 있고, 예를 들어 외부 슬리브 (612)의 가열 요소 (616)를 사용하여 제어가능하게 가열될 수 있거나, 예를 들어 내부 슬리브 (611)를 통해 유동하는 냉각제를 사용하여 냉각될 수 있다 (도 6b). 일 비제한적인 예에서, 2차 모듈 (720')은 조명 모듈을 포함하고, 냉각제 저장소 (710')는 조명 모듈 및 온도 제어 디바이스(들) (600) 둘 모두를 냉각시키기 위한 것이다.
도 7c에 나타난 온도 제어 시스템 (700")의 예에서, 냉각제 저장소 (710')는 임의의 적합한 수의 온도 제어 디바이스 (600), 예를 들어 제1 및 제2 온도 제어 디바이스에 커플링될 수 있고, 또한 도 7c에서 2차 모듈 (720")로서 지칭되는 냉각될 임의의 다른 적합한 요소에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 냉각제 저장소 (710")는, 냉각제가 온도 제어 디바이스(들) (600)의 내부 슬리브(들) (611)를 통해 유동될 수 있고, 이어서 2차 냉각제 라인 (740")으로 유동될 수 있는 1차 냉각제 라인 (730")을 통해 온도 제어 디바이스(들) (600)에 커플링될 수 있다(도 6a). 그런 다음, 냉각제는 2차 냉각제 라인 (740")으로 그리고 2차 모듈 (720")을 통해 유동될 수 있고, 가온된 냉각제 (예를 들어, 냉각 디바이스(들) 및 2차 모듈 (720")에 의해 가열된 바와 같음)는 리턴 라인 (760")을 통해 냉각제 저장소로 리턴될 수 있다. 사용 동안, 유체 (예를 들어, 용액 (120) 또는 용액 (220))가 온도 제어 디바이스(들) (600)를 통해 유동될 수 있고, 예를 들어 외부 슬리브 (612)의 가열 요소 (616)를 사용하여 제어 가능하게 가열되거나, 예를 들어 내부 슬리브 (611)를 통해 유동하는 냉각제를 사용하여 냉각될 수 있다 (도 6b). 일 비제한적인 예에서, 2차 모듈 (720")은 조명 모듈을 포함하고, 냉각제 저장소 (710")는 조명 모듈 및 온도 제어 디바이스(들) (600) 둘 모두를 냉각시키기 위한 것이다.
작업 실시예
추가적인 예는 청구범위의 범위를 제한하도록 어떠한 방식으로든 의도되지 않는 하기의 실시예에서 추가로 상세히 개시된다.
실시예 1. 정제 조건
도 8은 다른 조건을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드 중합 동안의 페이징 및 프리페이징의 플롯이다. 더 특이적으로, 뉴클레오티드 스트레스 조건을 시뮬레이션하고 3'-차단된 뉴클레오티드의 부분을 3'-OH 뉴클레오티드로 전환시키기 위해 아지도메틸기로 차단된 3'-차단된 뉴클레오티드의 수용액을 55℃에서 5시간 동안 가열하였다. 생성된 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 수성 혼합물을 클레나우 중합효소 및 다른 조건, 예를 들어 하기 추가로 기술된 다른 주형, 및 다른 농도의 주형을 사용하여, 도 1a-1b 및 도 3을 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 37℃에서 30분 동안 정제하였다. 이어서, 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드를 주형으로서 픽스(PhiX) 라이브러리를 사용하여 MINISEQ® 합성에 의한 시퀀싱 기구 (Illumina, Inc., San Diego CA) 상에서 2×151 사이클 실행을 사용하는 시퀀싱 반응에 사용하였다. 정제된 뉴클레오티드는 2개의 시퀀싱 판독 (R1 및 R2)에서 유사하게 반응하였다. 3'-차단된 뉴클레오티드 중합 후 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드뿐만 아니라 가열되고 정제되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드 및 가열되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드에 대한 판독 1의 150개의 사이클에 걸친 축적된 프리페이징 (R1 C150% 프리페이징 중량) 및 판독 1의 150개의 사이클에 걸친 축적된 페이징 (R1 C150% 페이징 중량)을 측정하였다.
도 8의 가장 좌측의 데이터 지점 ("std")은 가열되지 않아 3'-OH 뉴클레오티드의 더 낮은 기준선 농도를 함유한 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 17%의 R1 C150% 페이징 중량 및 약 16%의 R1 C150% 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점 ("연마 없음")은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었지만 정제되지 않아 3'-OH 뉴클레오티드의 더 높은 기준선 농도를 함유한 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 14%의 R1 C150% 페이징 중량 및 약 36%의 R1 C150% 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. "std" 데이터 지점과 "연마 없음" 데이터 지점의 비교로부터, 3'-차단된 뉴클레오티드를 가열하는 것이 중합 동안 페이징 및 프리페이징을 유의하게 증가시켰다는 것을 이해할 수 있다.
제1 실시예 주형의 농도의 효과를 결정하였다. 더 특이적으로, 우측의 다음 데이터 지점 ("50 nM")는 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 서열 5'- NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNC GGC CAT ATA ACT GGT AGC TT-3' (서열 번호 5)의 50 nM의 20N 주형을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하며, N은 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열 AAG CTA CCA GTT ATA TGG CCG (서열 번호 6)와 등몰량으로 조합된 축퇴된 염기이다. 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 12%의 R1 C150 페이징 중량 및 약 24%의 R1 C150 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 200 nM의 동일한 20N 주형을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 18.5%의 R1 C150 페이징 중량 및 약 16.5%의 R1 C150 페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 300 nM의 동일한 20N 주형을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 19%의 R1 C150 페이징 중량 및 약 13%의 R1 C150 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점 ("500 nM")는 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 500 nM의 동일한 20N 주형을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 23%의 R1 C150 페이징 중량 및 약 17%의 R1 C150 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 20N 주형의 다른 농도에 상응하는 데이터 지점의 비교로부터, 20N 주형의 농도가 증가함에 따라 프리페이징은 가열되지 않은 ("std") 3'-차단된 뉴클레오티드에 대한 것과 유사한 프리페이징에 접근하였다는 것을 이해할 수 있다. 그러나, 20N 주형의 농도가 증가함에 따라, 페이징은 유의하게 증가하였다.
다른 주형을 사용하여 페이징 및 프리페이징에 대한 효과를 결정하였다. 더 특이적으로, 우측의 다음 데이터 지점 ("4N")은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 서열 5'-NNN NCGGC CAT ATA ACT GGT AGCTT-3' (서열 번호 7)의 200nM의 4N 주형을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하며, N은 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열 AAG CTA CCA GTT ATA TGG CCG (서열 번호 6)와 등몰량으로 조합된 축퇴된 염기이다. 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 18.5%의 R1 C150 페이징 중량 및 약 21%의 R1 C150 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점 ("6N")은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 서열 5'-NNNNNCGGCCATAACTGGTAGCTT-3' (서열 번호 8)의 200 nM의 6N 주형을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하며, 이는 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열 AAG CTA CCA GTT ATA TGG CCG (서열 번호 6)와 등몰량으로 조합된다. 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 15%의 R1 C150 페이징 중량 및 약 17.5%의 R1 C150 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다른 선형 주형 중량에 상응하는 데이터 지점의 비교로부터, 더 높은 수의 N을 갖는 주형은 가열되지 않은 ("std") 3'-차단된 뉴클레오티드의 프리페이징 및 페이징에 더 가까운 프리페이징 및 페이징을 가졌다는 것을 이해할 수 있다.
우측의 다음 데이터 지점은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 각 주형이 하나의 염기에 상응하는 각 서열 GGG GGG GGG GGG CGG CCA TAT AAC TGG TCA CTC CAG TTA TAT GGC CG (헤어핀 G) (서열 번호 9), TTT TTT TTT TTT CGG CCA TAT AACTGG TCA CTC CAG TTA TAT GGC CG (헤어핀 T) (서열 번호 10), CCC CCC CCC CCC CGG CCA TAT AACTGG TCA CTC CAG TTA TAT GGC CG (헤어핀 C) (서열 번호 11), AAA AAA AAA AAA CGG CCA TAT AAC TGG TCA CTC CAG TTA TAT GGC CG (헤어핀 A) (서열 번호 12)의 4개의 헤어핀 주형의 200 nM의 혼합물을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응한다. 헤어핀 주형을 동일한 농도로 반응물에 첨가하여 200 nM의 DNA의 최종 농도에 도달하였다. 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 14%의 R1 C150% 페이징 중량 및 약 16%의 R1 C150% 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 서열 NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN CGG CCA TAT AAC TGG TAG CTT TTT TAA GCT ACC AGTT AT ATG GCC G (서열 번호 1)를 갖는 5' 말단에서 20개의 축퇴된 염기 (N)를 함유하는 200 nM의 헤어핀 주형을 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응한다. 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 12%의 R1 C150% 페이징 중량 및 약 16%의 R1 C150% 프리페이징 중량을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 2개 세트의 데이터의 비교로부터, 헤어핀 주형 둘 모두는 유사하고, 가열되지 않은 ("std") 3'-차단된 뉴클레오티드의 프리페이징 및 페이징에 비교적 가까운 프리페이징 및 페이징을 가졌다는 것을 이해할 수 있다. 또한, 헤어핀 주형은 6N 주형과 유사한 페이징 및 프리페이징을 가졌다는 것을 이해할 수 있다.
실시예 2. 정제 중 중합효소 및 온도
도 9는 다른 중합효소 및 다른 온도를 사용해 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거한 3'-차단된 뉴클레오티드 중합 동안의 페이징 및 프리페이징의 플롯이다. 더 특이적으로 실시예 1과 유사하게, 3'-차단된 뉴클레오티드의 부분을 3'-OH 뉴클레오티드로 전환시키기 위해 아지도메틸기로 차단된, 3'-차단된 뉴클레오티드의 수용액을 55℃에서 5시간 동안 가열하였다. 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 생성된 수성 혼합물을 20개의 축퇴된 염기 (각 위치에서 4개의 염기 중 하나가 포함될 수 있음을 의미하고; 이는 무작위이기 때문에, 각 올리고머는 다른 서열을 가져야 함) 및 하기에 추가로 기술된 다른 중합효소 및 다른 온도를 갖는 hp 올리고머 주형을 사용하여, 도 1a-1b 및 도 3을 참조하여 기술되는 것과 같은 방식으로 30분 동안 정제하였다. 이어서, 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드를 주형으로서 픽스 라이브러리를 사용한 MINISEQ® 합성에 의한 시퀀싱 기구 (Illumina, Inc., San Diego CA) 상에서 2×26 사이클 실행을 사용하여 중합하였다. 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드뿐만 아니라 가열되고 정제되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드 및 가열되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드에 대한 기울기가 조정된 프리페이징 및 페이징을 측정하였다.
도 9에서 가장 좌측의 데이터 지점 ("스트레스 없음")은 대조군이며, 3'-차단된 뉴클레오티드는 가열되지 않아 3'-OH 뉴클레오티드의 더 낮은 기준선 농도를 함유하였고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 0.13%의 정규화된 페이징 (901) 및 약 0.18%의 정규화된 프리페이징 (902)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점 ("스트레스, 연마 없음")은 55C에서 5시간 동안 가열되었지만 정제되지 않아 3'-OH 뉴클레오티드의 더 높은 기준선 농도를 함유한 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 0.14%의 정규화된 페이징 (911) 및 약 0.31%의 정규화된 프리페이징 (912)을 갖는 것으로 밝혀졌다."스트레스 없음" 데이터 지점과 "스트레스, 연마 없음" 데이터 지점의 비교로부터, 3'-차단된 뉴클레오티드를 가열하는 것은 중합 동안 프리페이징을 유의하게 증가시키고, 페이징은 유의하게 영향을 받지 않았다는 것을 이해할 수 있다.
다른 중합효소를 다른 온도에서 사용하여 페이징 및 프리페이징에 대한 효과를 결정하였다. 더 특이적으로, 우측의 다음 데이터 지점 ("벤트 연마 60C")은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 60℃에서 딥 벤트 중합효소를 사용하여 정제된 (DEEP VENT® DNA Polymerase (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA)) 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 0.12%의 정규화된 페이징 (921) 및 약 0.15%의 정규화된 프리페이징 (922)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점 ("태크 연마 37C")은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 37℃에서 태크 중합효소를 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 0.13%의 정규화된 페이징 (931) 및 약 0.09%의 정규화된 프리페이징 (932)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점 ("태크 연마 45C")은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 45℃에서 태크 중합효소를 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 0.12%의 정규화된 페이징 (941) 및 약 0.08%의 정규화된 프리페이징 (942)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 우측의 다음 데이터 지점 ("태크 연마 60C")은 상기 나타낸 바와 같이 가열되었고 60℃에서 태크 중합효소를 사용하여 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 0.12%의 정규화된 페이징 (951) 및 약 0.09%의 정규화된 프리페이징 (952)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다른 중합효소의 성능의 비교로부터, 60℃에서 딥 벤트 중합효소를 사용하는 것은 3'-차단된 뉴클레오티드가 가열되지 않은 더 낮은 기준선 "스트레스 없음"에 대한 것과 유사한 페이징 및 프리페이징을 제공하였다는 것을 이해할 수 있다. 추가적으로, 실험 온도에서 태크 중합효소를 사용하는 것은 3'-차단된 뉴클레오티드가 가열되지 않은 더 낮은 기준선 "스트레스 없음"에 대해서보다 더욱 더 적은 프리페이징을 제공하였다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 태크 중합효소가 가열을 사용해 생성된 3'-OH 뉴클레오티드뿐만 아니라, 가열하지 않아도 존재한 3'-OH 뉴클레오티드 중 적어도 일부를 용액으로부터 제거하였다는 것을 이해할 수 있다. 본 실시예의 특정 실험적인 조건 하에서, 태크 중합효소는 딥 벤트 보다 더 좋은 성능을 제공하는 것으로 나타났고, 딥 벤트 또는 태크 둘 모두는 페이징에 유해한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
실시예 3. 피로인산염 축적 완화
도 10은 태크 중합효소 및 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP) 엔자임을 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거한 3'-차단된 뉴클레오티드 중합 동안의 프리페이징의 플롯이다. 더 특이적으로, 정제 동안 피로인산염의 축적을 완화하고 따라서 3'-OH 뉴클레오티드의 중합을 정방향으로 구동하기 위한 YPP 엔자임의 사용을 측정하였다. 실시예 1과 유사하게, 3'-차단된 뉴클레오티드의 부분을 3'-OH 뉴클레오티드로 전환시키기 위해 아지도메틸기로 차단된 3'-차단된 뉴클레오티드의 수용액을 55℃에서 5시간 동안 가열하였다. 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 생성된 수성 혼합물을 20개의 축퇴된 염기 (NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN CGG CCA TAT AAC TGG TAG CTT TTT TAA GCT ACC AGTT AT ATG GCC G (서열 번호 1))를 갖는 10×의 hp 올리고머 주형, 10×의 태크 중합효소, 및 다양한 농도의 YPP를 사용하여 도 1a-1b 및 도 3을 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 37℃에서 30분 동안 정제하였다. 이어서, 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드를 주형으로서 픽스 라이브러리를 사용하여 MISEQ® 합성에 의한 시퀀싱 기구 (Illumina, Inc., San Diego CA) 상에서 2×26 사이클 실행을 사용하여 중합하였다. 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드뿐만 아니라 가열되고 정제되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드 및 가열되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드에 대한 정규화된 프리페이징을 측정하였다.
트레이스 (1010) ("대조군")는 가열되지 않아 3'-OH 뉴클레오티드의 더 낮은 기준선 농도를 함유한 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 0.11%의 정규화된 프리페이징을 갖는 것으로 밝혀졌다. 트레이스 (1020) ("스트레스")는 상기 나타낸 바와 같이 가열되었지만 정제되지 않아 약 0.29%의 정규화된 프리페이징을 갖는 3'-OH 뉴클레오티드의 더 높은 기준선을 함유한 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응한다. 트레이스 (1010) 및 (1020)의 비교로부터, 3'-차단된 뉴클레오티드를 가열하는 것이 중합 동안 정규화된 프리페이징을 유의하게 증가시켰다는 것을 이해할 수 있다. 트레이스 (1030) ("YPP 없음")는 YPP를 사용하지 않고 상기 기술된 바와 같은 중합에 대한 정규화된 프리페이징에 상응하는 반면, 트레이스 (1040) ("YPP")는 다른 농도의 YPP, 다시 말해 10 μL, 20 μL, 및 40 μL의 YIPP를 사용하는 중합에 대한 정규화된 프리페이징에 상응한다. 도 10으로부터, YPP의 농도가 증가함에 따라 정규화된 프리페이징은 감소하였으며, 40 μL의 YPP에서의 정규화된 프리페이징은 대조군의 그것과 유사하다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 적합한 농도의 YPP를 용액 (120) 내로 혼합하는 것은 3'-OH 뉴클레오티드의 중합 및 따라서 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제를 용이하게 할 수 있다.
실시예 4. 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 온도 및 농도의 영향
도 11은 다른 온도 및 농도의 3'-차단된 뉴클레오티드를 사용하여 정제되어 3'-OH 뉴클레오티드를 제거한 3'-차단된 뉴클레오티드 중합 동안의 프리페이징의 플롯이다. 실시예 1과 유사하게, 3'-차단된 뉴클레오티드의 부분을 3'-OH 뉴클레오티드로 전환시키기 위해 아지도메틸기로 차단된 3'-차단된 뉴클레오티드의 수용액을 55℃에서 5시간 동안 가열하였다. 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 생성된 수성 혼합물을 다양한 온도에서 20개의 축퇴된 염기 (NNN NNN NNN NNN NNN NNN NN CGG CCA TAT AAC TGG TAG CTT TTT TAA GCT ACC AGTT AT ATG GCC G (서열 번호 1))를 갖는 10×의 hp 올리고머 주형, 10×의 태크 중합효소 및 0.5 mM 또는 1 mM의 가열된 3'-차단된 뉴클레오티드를 사용하여 도 1a-1b 및 도 3을 참조하여 기술된 바와 같은 방식으로 30분 동안 정제하였다. 이어서, 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드를 주형으로서 픽스 라이브러리를 사용하여 MISEQ® 합성에 의한 시퀀싱 기구 (Illumina, Inc., San Diego CA) 상에서 2×26 사이클 실행을 사용하여 중합하였다. 정제된 3'-차단된 뉴클레오티드뿐만 아니라 가열되고 정제되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드 및 가열되지 않은 3'-차단된 뉴클레오티드에 대한 정규화된 프리페이징을 측정하였다.
트레이스 (1110) ("대조군")는 가열되지 않아 3'-OH 뉴클레오티드의 더 낮은 기준선 농도를 함유한 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응하고; 이들 3'-차단된 뉴클레오티드는 약 0.1%의 정규화된 프리페이징을 갖는 것으로 밝혀졌다. 트레이스 (1120) ("스트레스 샘플")는 상기 나타낸 바와 같이 가열되었지만 정제되지 않아 3'-OH 뉴클레오티드의 더 높은 기준선 농도 및 약 0.29%의 정규화된 프리페이징을 함유한 3'-차단된 뉴클레오티드의 중합에 상응한다. 트레이스 (1110) 및 (1120)의 비교로부터, 3'-차단된 뉴클레오티드를 가열하는 것이 중합 동안 정규화된 프리페이징을 유의하게 증가시켰다는 것을 이해할 수 있다. 트레이스 (1130) ("0.5")는 다른 온도에서 0.5 mM의 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 동안 농도를 사용하여 상기 기술된 바와 같은 중합에 대한 정규화된 프리페이징에 상응하는 반면, 트레이스 (1140) ("1")는 다른 온도에서 1 mM의 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제 동안 농도를 사용하여 상기 기술된 바와 같은 중합에 대한 정규화된 프리페이징에 상응한다. 도 11로부터, 정규화된 프리페이징은 온도가 증가함에 따라 감소하였으며, 50℃에서의 정규화된 프리페이징은 대조군의 그것과 유사하고, 53℃ 및 60℃에서의 정규화된 프리페이징은 대조군보다 유의하게 더 낮았다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 적어도 태크와 같은 특정 열안정성 중합효소에 대해 더 높은 온도는 3'-차단된 뉴클레오티드의 정제를 용이하게 할 수 있다.
실시예 5. 3'-차단된 뉴클레오티드의 감소된 용해도 완화 및/또는 부산물 감소
다른 형광 염료에 커플링된 뉴클레오티드 (3'-차단된 및 3'-OH)를 연마 중합효소, 주형, (아세트산마그네슘으로부터의) 마그네슘 이온, 및 완충제와 혼합할 경우 침전물이 형성되고 용액의 색 변화가 관찰되었다. 색 변화를 형광 염료의 농도가 감소된 용액으로 해석하였고, 침전물을 형광 염료에 커플링된 뉴클레오티드의 응집체인 것으로 해석하였다. 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD도 첨가된 유사한 용액은 침전물 또는 색 변화를 형성하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이로부터, 변형된 α-시클로덱스트린 (예컨대 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린), 다른 변형된 β-시클로덱스트린 (예컨대 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린, HEBCD), 또는 변형된 γ-시클로덱스트린 (예컨대 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린)이 뉴클레오티드 및/또는 형광 염료의 용해도를 촉진할 수 있는 것으로 추론하였다. 일련의 용액을 제조하였으며, 마그네슘 이온의 농도는 0 내지 6.3 mM에서 변화하였고, HPBCD의 농도는 0% 내지 10% (w/v)에서 변화하였고, 형광 염료를 포함하는 뉴클레오티드의 농도는 0.5 내지 1.5 mM에서 변화하였다. 용액 내에서 형광 염료의 정규화된 강도를 용액 내에서 뉴클레오티드의 안정성, 즉 뉴클레오티드 (및 이의 형광 염료)가 용액 내에 잔류하였는지 또는 침전되었는지의 메트릭으로서 사용하였다. 도 12-15를 참조하여 하기 기술된 플롯을 추가적인 농도에 대한 용액 시스템의 반응을 보간한 모델에서 다른 용액 성분의 상응하는 농도와 함께 측정된 정규화된 강도를 사용하여 수득하였다. 변형된 α-시클로덱스트린 (예컨대 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린), 다른 변형된 β-시클로덱스트린 (예컨대 HEBCD), 또는 변형된 γ-시클로덱스트린 (예컨대 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린)이 HPBCD에 대해 본 실시예에 기술된 용액 내에서 유사한 반응을 나타낼 것으로 합리적으로 예측할 수 있고, 변형된 α-, β-, 또는 γ-시클로덱스트린의 농도를 본원의 본 교시내용에 기반해 과도한 실험없이 적합하게 선택하여 HPBCD에 대해 입증된 바와 유사한 효과를 달성할 수 있다. 예를 들어, 시클로덱스트린의 α-유도체 (6-mer 구조) 및 γ-유도체 (8-mer 구조)가 HPBCD (7-mer 구조)와 유사한 방식으로 기능할 것이고, HEBCD (또 다른 7-mer 구조)가 HPBCD와 유사한 방식으로 기능할 것으로 합리적으로 예측할 수 있다.
도 12는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 마그네슘 이온의 농도의 기능으로서 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 등고선 플롯이다. 도 12에서 사용된 뉴클레오티드는 FFC-1로 명명되었으며, "1"로 지칭되는 염료에 커플링된 시티딘 (C)을 의미한다. 도 12에서, 곡선 (1210), (1220), (1230)은 1.0, 0.95, 또는 0.90의 FFC-1의 안정성을 함께 제공하는 HPBCD 및 마그네슘 이온의 농도 범위에 각각 상응한다. 이 실시예에서, 약 0.9 내지 1.0의 안정성은 안정한 것으로 간주될 수 있는 반면, 약 0.90 미만의 안정성은 SBS를 만족스럽게 수행하기 위해 불충분한 농도의 뉴클레오티드가 용액 내에 잔류하기 때문에 "불안정한" 것으로 간주될 수 있다. 뉴클레오티드 농도는 이 모델에 대해 유의하지 않았기에 도 12에 나타난 등고선 플롯은 총 뉴클레오티드 농도의 0.5-1.5 mM 범위를 포함한다. 도 12를 제조하는 데 사용된 용액은 연마 용액 내에 완충 성분을 포함하였지만, 중합효소 또는 올리고뉴클레오티드 주형을 포함하지 않았다. 도 12의 음영진 영역 (1240)은 FFC-1이 불안정한 HPBCD 농도 및 마그네슘의 조합에 상응한다. 도 12의 음영진 영역 (1240)은 FFC-1이 불안정한 HPBCD 농도 및 마그네슘의 조합에 상응한다. 곡선 (1210) (안정성 1.0)은 약 0.5 mM 내지 약 0 mM의 마그네슘 농도 및 약 0% (w/v) 내지 약 6% (w/v)의 HPBCD 농도에 상응하고; 곡선 (1220) (안정성 0.95)은 약 0.8 mM 내지 약 6 mM의 마그네슘 농도 및 약 0% (w/v) 내지 약 8.5% (w/v)의 HPBCD 농도에 상응하고; 곡선 (1230) (안정성 0.90)은 약 1.1 mM 내지 약 6 mM의 마그네슘 농도 및 약 0% (w/v) 내지 약 7.5% (w/v)의 HPBCD 농도에 상응한다는 것을 알 수 있다. 도 12로부터, 마그네슘의 농도가 증가함에 따라, HPBCD의 농도는 증가하여 0.9 초과의 뉴클레오티드의 안정성을 유지할 수 있고; 약 7.5% (w/v) 초과의 HPBCD의 농도의 경우 뉴클레오티드의 안정성은 마그네슘의 농도에 상대적으로 둔감하다는 것을 이해할 수 있다.
또한, 다른 형광 염료를 포함하는 다른 뉴클레오티드의 안정성은 대략 뉴클레오티드의 HPLC 체류 시간을 사용하여 독립적으로 측정된 뉴클레오티드의 각각의 소수성의 기능으로서 서로 다르다는 것을 관찰하였다. 도 13은 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 마그네슘 이온의 농도의 기능으로서 다른 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 플롯을 포함한다. 도 13을 제조하기 위해 사용된 용액은 연마 용액 내 완충 성분을 포함하였지만, 중합효소 또는 올리고뉴클레오티드 주형은 포함하지 않았다. 도 13의 플롯의 좌측 열에서, 마그네슘 이온의 농도는 6.3 mM를 유지한 한편, HPBCD의 농도는 0% 내지 10% (w/v)에서 변화하였고, 도 13의 플롯의 우측 열에서, HPBCD의 농도는 3% (w/v)를 유지한 한편, 마그네슘 이온의 농도는 0 내지 6.3 mM에서 변화하였다. 도 13에서 "다크(Dark) G"로 지칭된 뉴클레오티드는 형광 염료가 결여된 구아닌 (G)을 포함하여 대조군으로 사용하였고, HPBCD 또는 마그네슘 이온의 농도에 상대적으로 둔감한 약 0.98의 안정성을 가진다는 것을 알 수 있다. 염료 "2"에 커플링된 C를 포함한 FFC-2로 지칭된 뉴클레오티드는 도 13의 좌측 열에 보여진 0% HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.7 내지 10% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0으로 증가한 안정성; 및 도 13의 우측 열에 보여진 3% (w/v) HPBCD 및 0 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0 내지 3% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.8로 감소한 안정성을 가졌다. 염료 "3"에 커플링된 아데닌 (A)을 포함한 FFA-3으로 지칭된 뉴클레오티드는 도 13의 좌측 열에 보여진 0% HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.4 내지 10% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0으로 증가한 안정성; 및 도 13의 우측 열에 보여진 3% (w/v) HPBCD 및 0 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0 내지 3% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.6으로 감소한 안정성을 가졌다.
염료 "1"에 커플링된 시티딘 (C)을 포함한 FFC-1로 지칭된 뉴클레오티드는 도 13의 좌측 열에 보여진 0% HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.3 내지 10% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0으로 증가한 안정성; 및 도 13의 우측 열에 보여진 3% (w/v) HPBCD 및 0 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0 내지 3% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.5로 감소한 안정성을 가졌다. 염료 "4"에 커플링된 티민 (T)을 포함한 FFT-4로 지칭된 뉴클레오티드는 도 13의 좌측 열에 보여진 0% HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.4 내지 10% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0으로 증가한 안정성; 및 도 13의 우측 열에 보여진 3% (w/v) HPBCD 및 0 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0 내지 3% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.6으로 감소한 안정성을 가졌다. 염료 "1"에 커플링된 아데닌 (A)을 포함한 FFA-1로 지칭된 뉴클레오티드는 도 13의 좌측 열에 보여진 0% HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.3 내지 10% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0으로 증가한 안정성; 및 도 13의 우측 열에 보여진 3% (w/v) HPBCD 및 0 mM 마그네슘 이온에서의 약 1.0 내지 3% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서의 약 0.5로 감소한 안정성을 가졌다.
도 13으로부터, 다른 뉴클레오티드는 서로 다른 안정성을 가질 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 예를 들어, FFC-2에 대한 결과를 FFA-3 및 FFT-4에 대한 결과와 비교하면, 뉴클레오티드는 0% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서 서로 다른 안정성을 가졌다: 도 13의 좌측 열에 보여진 바와 같이 FFC-2의 경우 약 0.7, 및 FFA-3 및 FFT-4의 경우 약 0.4. 이러한 조건 하에서 FFA-3 및 FFT-4와 비교하여 FFC-2의 더 큰 안정성은 FFC-2가 마그네슘 이온의 존재에서 덜 소수성이고 응집체 형성에 덜 감수성을 띄기 때문이었다. 유사하게, 이들 뉴클레오티드는 3% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서 서로 다른 안정성을 가졌다: FFC-2의 경우 약 0.8, 및 FFA-3 및 FFT-4의 경우 약 0.6. 이러한 조건하에서 FFA-3 및 FFT-4와 비교하여 FFC-2의 더 큰 안정성은 FFC-2가 마그네슘 이온의 존재에서 덜 소수성이고 응집체 형성에 덜 감수성을 띄기 때문이었다. 또한, 도 13으로부터 충분한 농도의 HPBCD, 예를 들어 약 8% 초과의 HPBCD, 또는 약 9% 초과의 HPBCD, 또는 약 10% 초과의 HPBCD에서, 각각의 뉴클레오티드는 사용된 특정 핵염기 또는 마그네슘 이온의 농도에 관계없이 안정하였던 것을 이해할 수 있다.
추가적으로, FFC-2에 대한 결과를 FFC-1에 대한 결과와 비교하면, 이들 뉴클레오티드 각각이 서로 동일한 핵염기를 포함하더라도, 이들은 0% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서 서로 다른 안정성을 가졌다: 도 13의 좌측 열에 보여진 바와 같이 FFC-2의 경우 약 0.7, 및 FFC-1의 경우 약 0.3. 이러한 조건 하에서 FFC-1과 비교하여 FFC-2의 더 큰 안정성은 FFC-2가 마그네슘 이온의 존재에서 덜 소수성이고 응집체 형성에 덜 감수성을 띄기 때문이었다. 유사하게, 이들 뉴클레오티드는 3% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서 서로 다른 안정성을 가졌다: FFC-2의 경우 약 0.8, 및 FFC-1의 경우 약 0.5. 이러한 조건 하에서 FFC-1과 비교하여 FFC-2의 더 큰 안정성은 FFC-2가 마그네슘 이온의 존재에서 덜 소수성이고 응집체 형성에 덜 감수성을 띄기 때문이었다. 유사하게, FFA-3에 대한 결과를 FFA-1에 대한 결과와 비교하면, 이들 뉴클레오티드 각각이 서로 동일한 핵염기를 포함하더라도, 이들은 0% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서 서로 다른 안정성을 가졌다: 도 13의 좌측 열에 보여진 바와 같이, FFA-3의 경우 약 0.4, 및 FFA-1의 경우 약 0.3. 이러한 조건 하에서 FFA-1과 비교하여 FFA-3의 더 큰 안정성은 FFA-3이 마그네슘 이온의 존재에서 덜 소수성이고 응집체 형성에 덜 감수성을 띄기 때문이었다. 유사하게, 이들 뉴클레오티드는 3% (w/v) HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온에서 서로 다른 안정성을 가졌다: FFA-3의 경우 약 0.6, 및 FFA-1의 경우 약 0.5. 이러한 조건 하에 FFA-1과 비교하여 FFA-3의 더 큰 안정성은 FFA-3이 마그네슘 이온의 존재에서 덜 소수성이고 응집체 형성에 덜 감수성을 띄기 때문이었다. 또한 도 13으로부터, 충분한 농도의 HPBCD, 예를 들어 약 8% 초과의 HPBCD, 또는 약 9% 초과의 HPBCD, 또는 약 10% 초과의 HPBCD에서, 각각의 뉴클레오티드는 사용된 특정 형광 염료 또는 마그네슘 이온의 농도에 관계없이 안정하였던 것을 이해할 수 있다. 또한 도 13으로부터, 충분한 농도의 HPBCD, 예를 들어 약 8% 초과의 HPBCD, 또는 약 9% 초과의 HPBCD, 또는 약 10% 초과의 HPBCD에서, 각각의 뉴클레오티드는 사용된 특정 형광 염료 또는 마그네슘 이온의 농도에 관계없이 안정하였다는 것을 이해할 수 있다.
상기 추가로 언급된, 뉴클레오티드 (FFN)의 농도는 또한 이들의 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 도 14는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD 및 이들 뉴클레오티드의 농도의 기능으로서 선택된 형광 표지된 뉴클레오티드의 안정성의 등고선 플롯이다. 도 14에 사용된 뉴클레오티드는 상기 기술된 FFC-1 및 FFT-4였고, 마그네슘 이온의 농도를 6.3 mM로 고정하였다. 도 14를 제조하는 데 사용된 용액은 연마 용액 내의 완충 성분뿐만 아니라 중합효소 및 올리고뉴클레오티드 주형을 포함하였다. 도 14의 음영진 영역 (1430)은 6.3 mM의 마그네슘 이온에 대해, FFC-1 및 FFT-4가 불안정한 (여기서, 약 0.90 미만의 안정성을 가짐) 뉴클레오티드 및 HPBCD 농도의 조합에 상응하는 반면, 음영진 영역 (1440)은 FFT-4가 안정하고 (여기서, 약 0.9 내지 1.0의 안정성을 가짐) FFC-1이 불안정한 뉴클레오티드 및 HPBCD 농도의 조합에 상응하고, 음영이 없는 영역 (1450)은 FFC-1 및 FFT-4 둘 모두가 안정한 (여기서, 약 0.90 내지 1.0의 안정성을 가짐) 뉴클레오티드 및 HPBCD 농도의 조합에 상응한다. 도 14에서, 각 곡선 (1410) 및 (1420)은 6.3 mM의 마그네슘 이온에 대해 0.95 및 0.9의 FFC-1의 안정성을 함께 제공하는 FFC-1 및 HPBCD의 농도 범위에 상응하고, 각 곡선 (1411) 및 (1421)은 6.3 mM의 마그네슘 이온에 대해 0.95 및 0.9의 FFT-4의 안정성을 함께 제공하는 FFT-4 및 HPBCD의 농도 범위에 상응한다. 곡선 (1410) (FFC-1의 안정성 0.95)은 약 0.5 mM 내지 약 1.4 mM의 뉴클레오티드 농도 및 약 4.8% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 HPBCD 농도에 상응하고; 곡선 (1420) (FFC-1의 안정성 0.90)은 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mM의 뉴클레오티드 농도 및 약 3.5% (w/v) 내지 약 7.4% (w/v)의 HPBCD 농도에 상응하고; 곡선 (1411) (FFT-4의 안정성 0.95)은 약 0.5 mM 내지 약 1.3 mM의 뉴클레오티드 농도 및 약 3.4% (w/v) 내지 약 10% (w/v)의 HPBCD 농도에 상응하고; 곡선 (1421) (FFT-4의 안정성 0.90)은 약 0.5 mM 내지 약 1.5 mMM의 뉴클레오티드 농도 및 약 2.6% (w/v) 내지 약 7.3% (w/v)의 HPBCD 농도에 상응한다는 것을 알 수 있다. 도 14로부터, 뉴클레오티드의 농도가 증가함에 따라 HPBCD의 농도는 증가하여 뉴클레오티드의 안정성을 유지할 수 있고, 심지어 다른 소수성을 갖는 뉴클레오티드의 경우, HPBCD의 농도를 사용하여 주어진 농도의 마그네슘에 대해 뉴클레오티드를 적합하게 안정화시킬 수 있다는 것을 이해할 수 있다. 도 14의 삽입도는 표면 프로파일로 나타난 FFC-1 및 FFT-4의 정규화된 강도 반응을 예시하며, z-축은 HPBCD의 농도 (y-축) 및 뉴클레오티드의 농도 (x-축)의 기능으로서 상대 강도를 나타낸다.
HPBCD 또한 다른 부산물의 형성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 도 15는 변형된 β-시클로덱스트린 HPBCD, 마그네슘 이온, 및 형광 표지된 뉴클레오티드 FFA-1, FFA-3, 및 FFC-1의 농도의 기능으로서 다른 부산물 농도의 플롯을 포함한다. 더 특이적으로, 용액 내의 이인산염 및 사인산염의 각 농도를 측정하고 상기 언급된 모델에서 사용하였다. 도 15를 제조하는 데 사용된 용액은 연마 용액 내의 완충 성분뿐만 아니라 중합효소 및 올리고뉴클레오티드 주형을 포함하였다. 도 15의 플롯의 좌측 열에서, 마그네슘 이온의 농도를 6.3 mM로 유지하고 뉴클레오티드 (FFN)의 농도를 1.5 mM로 유지한 반면, HPBCD의 농도는 0% 내지 10% (w/v)에서 변화하였고; 도 15의 플롯의 중간 열에서, HPBCD의 농도를 9% (w/v)로 유지하였고 뉴클레오티드 (FFN)의 농도를 1.5 mM로 유지한 반면, 마그네슘 이온의 농도는 0 mM 내지 7.8 mM에서 변화하였고; 도 15의 플롯의 우측 열에서, HPBCD의 농도를 9% (w/v)로 유지하였고 마그네슘 이온의 농도를 6.3 mM로 유지한 반면, 뉴클레오티드의 농도는 0.5 내지 1.5 mM에서 변화하였다.
도 15의 가장 좌측 열로부터, 0% (w/v) HPBCD의 경우 FFA-1 용액은 뉴클레오티드에 비해 약 3.0% (w/v) 사인산염의 농도를 가졌고, HPBCD의 농도가 증가함에 따라 사인산염의 농도가 평활하게 감소하였고; 유사하게, 0% (w/v) HPBCD의 경우 FFA-3 용액은 뉴클레오티드에 비해 약 2.5% (w/v) 사인산염의 농도를 가졌고, HPBCD의 농도가 증가함에 따라 사인산염의 농도가 평활하게 감소하였고; 유사하게, 0% (w/v) HPBCD의 경우 FFC-1 용액은 뉴클레오티드에 비해 약 3.8% (w/v) 사인산염의 농도를 가졌고, HPBCD의 농도가 증가함에 따라 사인산염의 농도가 평활하게 감소하였고; 0% (w/v) HPBCD의 경우 이인산염의 가중 평균 농도는 약 3.8% (w/v)이었고, HPBCD의 농도가 증가함에 따라 이인산염의 농도가 평활하게 감소하였다는 것을 알 수 있다. 도 15의 플롯의 중간 열로부터, 9% HPBCD 및 1.5 mM 뉴클레오티드의 경우 각 FFA-1 용액, FFA-3 용액, 및 FFC-1 용액은 임의의 농도의 마그네슘 이온에 대해 약 0 사인산염을 가졌고, 이인산염의 가중 평균 농도는 약 0.75% (w/w)이었다는 것을 알 수 있다. 도 15의 플롯의 우측 열로부터, 9% HPBCD 및 6.3 mM 마그네슘 이온의 경우 각 FFA-1 용액, FFA-3 용액, 및 FFC-1 용액은 임의의 농도의 뉴클레오티드에 비해 약 0 사인산염을 가졌고, 이인산염의 가중 평균 농도는 약 1.5% (w/w) 내지 약 0.3% (w/w)에서 변하였다는 것을 알 수 있다.
따라서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린과 같은 다양한 용액 성분의 농도를 적절하게 선택하는 것은, 예를 들어 뉴클레오티드의 용해도를 개선함으로써 및/또는 사인산염 또는 이인산염과 같은 부산물의 생성을 억제함으로써 뉴클레오티드의 연마 및 시퀀싱을 용이하게 할 수 있고, 따라서 시퀀싱의 정확도를 향상시킬 수 있다는 것을 이해할 수 있다.
추가적인 설명
다양한 예시적인 실시예가 상기 기술되었지만, 다양한 변화 및 변형이 본 발명으로부터 벗어나지 않고 이 안에서 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 열안정성 중합효소가 3'-차단된 뉴클레오티드를 정제하는 것에 특히 유용할 수 있는 것으로 밝혀졌지만, 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합하는 임의의 적합한 중합효소가 사용될 수 있다는 것을 인식해야 한다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 본질 및 범위 내에 속하는 모든 그러한 변화 및 변형을 포함하도록 의도된다.
본원에 기술된 본 개시내용의 각 측면의 임의의 각 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 시행될 수 있고, 이들 측면 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 본원에 기술된 다른 측면(들)의 임의의 특징과 함께 시행되어 본원에 기술된 이익을 달성할 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> ILLUMINA, INC.
ILLUMINA CAMBRIDGE LIMITED
<120> PURIFYING AND POLYMERIZING 3'-BLOCKED NUCLEOTIDES
<130> IP-2015-PCT
<150> US 63/193,413
<151> 2021-05-26
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> illustrative example of primer 141, loop oligonucleotide 142,
complementary primer 151, and fourth portion 152
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n = degenerated bases
<400> 1
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cggccatata actggtagct tttttaagct accagttata 60
tggccg 66
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> illustrative example of primer 141
<400> 2
aagctaccag ttatatggcc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> illustrative example of complementary primer 151
<400> 3
cggccatata actggtagct t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> illustrative example of fourth position 152
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n = degenerated bases
<400> 4
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> template sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n = degenerated bases
<400> 5
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn cggccatata actggtagct t 41
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer oligonucleotide sequence
<400> 6
aagctaccag ttatatggcc g 21
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> template sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> n = degenerated bases
<400> 7
nnnncggcca tataactggt agctt 25
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> template sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> n = degenerated bases
<400> 8
nnnnnncggc catataactg gtagctt 27
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hairpin G template
<400> 9
gggggggggg ggcggccata taactggtca ctccagttat atggccg 47
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hairpin T template
<400> 10
tttttttttt ttcggccata taactggtca ctccagttat atggccg 47
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hairpin C template
<400> 11
cccccccccc cccggccata taactggtca ctccagttat atggccg 47
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hairpin A template
<400> 12
aaaaaaaaaa aacggccata taactggtca ctccagttat atggccg 47
Claims (67)
- 하기를 포함하는 뉴클레오티드를 정제하는 방법:
(a) 3'-차단된 뉴클레오티드, (b) 3'-OH 뉴클레오티드, (c) 연마 중합효소, 및 (d) 주형을 포함하는 용액을 제조하는 단계;
연마 중합효소 및 주형을 사용하여 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합하고 이에 따라 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키는 단계. - 제1항에 있어서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 용액을 제조하는 단계는 물, 연마 중합효소, 및 주형을 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드의 동결건조된 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 용액을 제조하는 단계는 물을 3'-차단된 뉴클레오티드, 3'-OH 뉴클레오티드, 연마 중합효소, 및 주형의 동결건조된 혼합물에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 연마 중합효소는 열안정성 중합효소를 포함하는, 방법.
- 제5항에 있어서, 열안정성 중합효소는 딥 벤트(Deep Vent), 태크(Taq), Bst, 설포로버스 DNA 중합효소 IV, 및 Pfu로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 열안정성 중합효소 및 주형을 사용하는 동안 용액을 가열하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제7항에 있어서, 용액은 30-75℃의 온도까지 가열되는, 방법.
- 제7항에 있어서, 용액은 40-60℃의 온도까지 가열되는, 방법.
- 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 내부 구조체, 외부 슬리브, 및 용액이 유동하는 나선형 튜브를 포함하는 캐시 매니폴드를 사용하여 가열되며, 여기서 내부 구조체 및 외부 슬리브 중 적어도 하나는 가열되는, 방법.
- 제10항에 있어서, 내부 구조체는 유체가 유동하는 내부 슬리브를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 추가로 포함하여 3'-OH 뉴클레오티드가 중합되는 속도를 YPP의 부재에서의 이러한 속도에 비해 증가시키는, 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 연마 중합효소 및 주형은 합성에 의한 시퀀싱 기구에서 사용되는, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이거나, 변형된 β-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 또는 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)이거나, 변형된 γ-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린인, 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 형광 염료에 커플링되고, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 형광 염료의 용해도를 촉진하는, 방법.
- 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 약 1% 내지 약 10% (중량/부피)의 농도를 갖는, 방법.
- 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 용액 내에서 약 1.5 mM 미만의 농도를 갖는, 방법.
- 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 마그네슘 이온을 적어도 약 1 mM의 농도로 추가로 포함하는, 방법.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 이인산염의 형성을 억제하는, 방법.
- 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 사인산염의 형성을 억제하는, 방법.
- 하기를 포함하는 뉴클레오티드를 중합하는 방법:
3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 3'-차단된 뉴클레오티드 및 3'-OH 뉴클레오티드를 포함하는 제1 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키는 단계;
(a) 제1 용액으로부터의 3'-차단된 뉴클레오티드, 및 (b) 합성에 의한 시퀀싱 (SBS) 중합효소를 포함하는 제2 용액을 제조하는 단계; 및
SBS 중합효소 및 제1 주형을 사용하여 3'-차단된 뉴클레오티드를 중합하는 단계. - 제22항에 있어서, 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 제1 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키는 단계는 연마 중합효소 및 제2 주형을 사용하여 3'-OH 뉴클레오티드를 선택적으로 중합하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제23항에 있어서, 제2 용액은 연마 중합효소를 추가로 포함하는, 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 연마 중합효소는 열안정성 중합효소를 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 열안정성 중합효소는 딥 벤트, 태크, Bst, 설포로버스 DNA 중합효소 IV, 및 Pfu로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
- 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용액은 중합된 3'-OH 뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 방법.
- 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용액을 제조하는 단계는 3'-차단된 뉴클레오티드에 비해 제1 용액 내에서 3'-OH 뉴클레오티드의 농도를 감소시키는 단계 후 SBS 중합효소를 제1 용액에 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용액은 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 추가로 포함하여, 3'-OH 뉴클레오티드가 중합되는 속도를 YPP 부재에서의 이러한 속도에 비해 증가시키는, 방법.
- 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 용액은 내부 구조체, 외부 슬리브, 및 제1 및 제2 용액이 다른 시간에 유동하는 나선형 튜브를 포함하는 캐시 매니폴드를 사용하여 가열되며, 여기서 내부 구조체 및 외부 슬리브 중 적어도 하나는 가열되는, 방법.
- 제30항에 있어서, 내부 구조체는 유체가 유동하는 내부 슬리브를 포함하는, 방법.
- 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 연마 중합효소 및 SBS 중합효소는 합성에 의한 시퀀싱 기구 상에서 사용되는, 방법.
- 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용액 내 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함하는, 방법.
- 제33항에 있어서, 3'-차단된 뉴클레오티드가 SBS 중합효소 및 제1 주형을 사용하여 중합되는 동안 3'-차단된 뉴클레오티드의 검출가능한 모이어티를 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용액은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함하는, 방법.
- 제35항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이거나, 변형된 β-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 또는 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)이거나, 변형된 γ-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린인, 방법.
- 제35항 또는 제36항에 있어서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 형광 염료에 커플링되고, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 형광 염료의 용해도를 촉진하는, 방법.
- 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 제1 용액 내에서 약 1% 내지 약 10% (중량/부피)의 농도를 갖는, 방법.
- 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 제1 용액 내에서 약 1.5 mM 미만의 농도를 갖는, 방법.
- 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용액은 마그네슘 이온을 적어도 약 1 mM의 농도로 추가로 포함하는, 방법.
- 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 제1 용액 내에서 이인산염의 형성을 억제하는, 방법.
- 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 제1 용액 내에서 사인산염의 형성을 억제하는, 방법.
- 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용액은 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함하는, 방법.
- 용액으로서,
물;
3'-차단된 뉴클레오티드;
3'-OH 뉴클레오티드; 및
연마 중합효소,
주형을 포함하며,
여기서 3'-OH 뉴클레오티드는 연마 중합효소 및 주형을 사용하여 선택적으로 중합가능한,용액. - 제44항에 있어서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함하는, 용액.
- 제44항 또는 제45항에 있어서, 연마 중합효소는 열안정성 중합효소를 포함하는, 용액.
- 제46항에 있어서, 열안정성 중합효소는 딥 벤트, 태크, Bst, 설포로버스 DNA 중합효소 IV, 및 Pfu로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용액.
- 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 추가로 포함하는, 용액.
- 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함하는, 용액.
- 제49항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이거나, 변형된 β-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 또는 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)이거나, 변형된 γ-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린인, 용액.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 형광 염료에 커플링되고, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 형광 염료의 용해도를 촉진하는, 용액.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 약 1% 내지 약 10% (중량/부피)의 농도를 갖는, 용액.
- 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 3'-차단된 뉴클레오티드는 용액 내에서 약 1.5 mM 미만의 농도를 갖는, 용액.
- 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 용액은 마그네슘 이온을 적어도 약 1 mM의 농도로 추가로 포함하는, 용액.
- 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 이인산염의 형성을 억제하는, 용액.
- 제49항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린은 용액 내에서 사인산염의 형성을 억제하는, 용액.
- 용액으로서,
물;
3'-차단된 뉴클레오티드;
제1 주형에 혼성화된 중합된 3'-OH 뉴클레오티드;
연마 중합효소; 및
합성에 의한 시퀀싱 (SBS) 중합효소를 포함하며,
여기서 3'-차단된 뉴클레오티드는 SBS 중합효소 및 제2 주형을 사용하여 중합가능한,용액. - 제57항에 있어서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함하는, 용액.
- 제57항 또는 제58항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함하는, 용액.
- 제59항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이거나, 변형된 β-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 또는 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)이거나, 변형된 γ-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린인, 용액.
- 동결건조된 혼합물로서,
3'-차단된 뉴클레오티드;
3'-OH 뉴클레오티드;
연마 중합효소; 및
주형을 포함하며,
여기서 동결건조된 혼합물을 재수화하는 경우, 3'-OH 뉴클레오티드는 연마 중합효소 및 주형을 사용하여 선택적으로 중합가능한,동결건조된 혼합물. - 제61항에 있어서, 각각의 3'-차단된 뉴클레오티드는 검출가능한 모이어티를 포함하는, 동결건조된 혼합물.
- 제61항 또는 제62항에 있어서, 연마 중합효소는 열안정성 중합효소를 포함하는, 동결건조된 혼합물.
- 제63항에 있어서, 열안정성 중합효소는 딥 벤트, 태크, Bst, 설포로버스 DNA 중합효소 IV, 및 Pfu로 이루어진 군으로부터 선택되는, 동결건조된 혼합물.
- 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 효모 무기 피로인산가수분해효소 (YPP)를 추가로 포함하는, 동결건조된 혼합물.
- 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린, 변형된 β-시클로덱스트린, 또는 변형된 γ-시클로덱스트린을 추가로 포함하는, 동결건조된 혼합물.
- 제66항에 있어서, 변형된 α-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-α-시클로덱스트린이거나, 변형된 β-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (HPBCD) 또는 (2-히드록시에틸)-β-시클로덱스트린 (HEBCD)이거나, 변형된 γ-시클로덱스트린은 (2-히드록시프로필)-γ-시클로덱스트린인, 동결건조된 혼합물.
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