KR20230157348A - 중합체, 중합체의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법 - Google Patents

중합체, 중합체의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법 Download PDF

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Abstract

일부 예에서, 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법이 제공된다. 중합체의 제1 영역의 불활성 모이어티를 광으로 선택적으로 조사하는 동시에 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티를 조사하지 않아 중합체의 제1 영역의 제1 활성 모이어티를 생성할 수 있다. 제1 활성 모이어티는 제1 올리고뉴클레오티드에 커플링될 수 있다. 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티를 광으로 조사하여 중합체의 제2 영역의 제2 활성 모이어티를 생성할 수 있다. 제2 활성 모이어티는 제2 올리고뉴클레오티드에 커플링될 수 있다.

Description

중합체, 중합체의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 3월 9일자로 출원된 "중합체, 중합체의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법"이라는 발명의 명칭의 미국 임시 특허 출원 제63/158,470호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에서 참고로 포함된다.
기술분야
본 출원은 중합체를 제조하고 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
클러스터 증폭은 예를 들어 유전자 서열 분석에 사용하기 위해 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는 접근 방식이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 플로우셀에서 기재 표면에 커플링된 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 프라이머)에 의해 포획되고, 표면 상의 무작위 위치에서 "시드"를 형성한다. 각각의 시드 주위의 표면 상에 클러스터를 형성하기 위해 증폭 사이클을 수행한다. 클러스터는 시드 폴리뉴클레오티드의 카피 및 상보적 카피를 포함한다. 일부 상황에서, 기재는 각각의 클러스터로 충전될 수 있는 웰과 같은, 상이한 클러스터가 결합하는 영역을 정의하도록 패턴화된다.
본원에서 제공되는 예는 중합체, 중합체의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법에 관한 것이다.
본원의 일부 예는 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법을 제공한다. 방법은 중합체의 제1 영역의 불활성 모이어티를 광으로 선택적으로 조사하는 동시에 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티를 조사하지 않아 중합체의 제1 영역의 제1 활성 모이어티를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 제1 활성 모이어티를 제1 올리고뉴클레오티드에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티를 광으로 조사하여 중합체의 제2 영역의 제2 활성 모이어티를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 제2 활성 모이어티를 제2 올리고뉴클레오티드에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 중합체의 제1 영역 또는 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴을 포함한다:
상기 식에서, R3 및 R4 중 하나는 R1이며 다른 하나는 H이고; R1은 중합체의 골격에 대한 결합이며; X는 CH2, O, S, 또는 R4가 X에 직접 커플링되지 않은 경우 NH이거나, 또는 X는 CH 또는 R4가 X에 직접 커플링되는 경우 N이다. 일부 예에서, 제1 활성 모이어티 또는 제2 활성 모이어티는 하기의 디벤조사이클로옥틴을 포함한다:
.
일부 예에서, 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 디벤조사이클로옥틴과 반응하는 아지드(N3)에 커플링되어 하기 구조를 갖는 사이클로 부가물(cycloadduct)을 형성한다:
상기 식에서, R2는 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 예에서, 중합체의 제1 영역 또는 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 테트라졸을 포함한다:
상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타낸다. 일부 예에서, 제1 활성 모이어티 또는 제2 활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 니트릴 이민을 포함한다:
.
일부 예에서, 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 활성 모이어티 또는 제2 활성 모이어티와 반응하는 올레핀에 커플링되어 하기 구조를 갖는 피라졸린을 형성한다:
상기 식에서, R2는 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 예에서, 중합체의 제1 영역 또는 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨을 포함한다:
상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타낸다. 일부 예에서, 제1 활성 모이어티 또는 제2 활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
.
일부 예에서, 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 활성 모이어티 또는 제2 활성 모이어티와 반응하는 비닐 에테르에 커플링되어 하기 구조를 갖는 벤조크로만을 형성한다:
상기 식에서, R2는 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 예에서, 중합체의 제1 영역 또는 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 2H-아지린을 포함한다:
상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타낸다. 일부 예에서, 제1 활성 모이어티 또는 제2 활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 니트릴 일리드를 포함한다:
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일부 예에서, 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 활성 모이어티 또는 제2 활성 모이어티와 반응하는 올레핀에 커플링되어 하기 구조를 갖는 피롤린을 형성한다:
상기 식에서, R2는 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일부 예에서, 제1 올리고뉴클레오티드는 절제 모이어티(excision moiety)가 결여된 제1 프라이머 및 절제 모이어티를 포함하는 제2 프라이머의 혼합물을 포함한다. 일부 예에서, 제2 올리고뉴클레오티드는 절제 모이어티를 포함하는 제3 프라이머 및 절제 모이어티가 결여된 제4 프라이머의 혼합물을 포함한다. 일부 예에서, 제1 프라이머와 제3 프라이머는 절제 모이어티를 제외하고는 서로 동일한 서열을 갖고, 제2 프라이머와 제4 프라이머는 절제 모이어티를 제외하고는 서로 동일한 서열을 갖는다. 일부 예에서, 제1 프라이머와 제2 프라이머의 서열은 서로 직교하고, 제3 프라이머와 제4 프라이머의 서열은 서로 직교한다.
일부 예에서, 중합체의 제1 영역은 복수의 제1 하위 영역을 포함하고, 중합체의 제2 영역은 복수의 제2 하위 영역을 포함한다. 일부 예에서, 각각의 제1 하위 영역은 제2 하위 영역 중 대응하는 하위 영역과 인접해 있다. 일부 예에서, 각각의 제1 하위 영역, 및 제1 하위 영역과 인접해 있는 제2 하위 영역 중 대응하는 하위 영역은 웰 내에 위치한다.
일부 예에서, 방법은 제1 영역 및 제2 영역 위에 포토레지스트를 증착하는 단계를 추가로 포함한다. 방법은 중합체의 제1 영역의 불활성 모이어티를 광으로 선택적으로 조사하는 동시에, 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 조사하지 않고, 제1 영역 위의 포토레지스트를 광으로 조사하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 제1 활성 모이어티를 제1 올리고뉴클레오티드에 커플링하기 전에 중합체의 제1 영역으로부터 조사된 포토레지스트를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 제2 활성 모이어티를 제2 올리고뉴클레오티드에 커플링하기 전에 중합체의 제2 영역으로부터 포토레지스트를 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 조사된 포토레지스트는 중합체의 제1 영역으로부터 제거되고 포토레지스트는 중합체의 제2 영역으로부터 제거된다.
본원의 일부 예는 하기 구조를 갖는 폴리(사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴-아크릴아미드-코-아크릴아미드) 공중합체를 포함하는 중합체를 제공한다:
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본원의 일부 예는 하기 구조를 갖는 폴리(디벤조사이클로옥틴-아크릴아미드-코-아크릴아미드) 공중합체를 포함하는 중합체를 제공한다:
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본원의 일부 예는 중합체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 하기의 라디칼-유도 중합 반응을 포함할 수 있다:
Figure pct00015
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본원의 일부 예는 중합체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 하기의 광-유도 반응을 포함할 수 있다:
.
본원의 일부 예는 하기 구조를 포함하는 중합체를 제공한다:
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본원의 일부 예는 중합체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 하기의 라디칼-유도 중합 반응을 포함할 수 있다:
Figure pct00018
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본원의 일부 예는 기재를 작용화하는 방법을 제공한다. 방법은 하기 노르보르넨기를 포함하는 기재를 제공하는 단계를 포함할 수 있다:
상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타낸다. 방법은 하기 구조를 포함하는 중합체를 기재 위에 증착하는 단계를 포함할 수 있다:
.
방법은 중합체의 아지드(N3)기를 노르보르넨기와 반응시켜 중합체를 기재에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 방법은 상기 방법을 사용하여 중합체를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 방법은 광을 사용하여 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴을 디벤조사이클로옥틴으로 전환하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타낸다. 일부 예에서, 방법은 디벤조사이클로옥틴을 올리고뉴클레오티드(R2)에 커플링된 아지드(N3)와 반응시켜 하기 구조를 갖는 테트라졸을 형성하는 단계를 추가로 포함한다:
.
본원의 일부 예는 상기 방법을 사용하여 중합체를 기재에 커플링하는 단계를 포함하는 동작을 이용하여 제조된 조성물을 제공한다.
본원의 일부 예는 기재 상에 배치된, 전술된 임의의 중합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원의 일부 예는 하기 구조를 갖는 중합체를 제공한다:
.
본원의 일부 예는 중합체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 하기의 라디칼-유도 공중합 반응을 포함할 수 있다:
Figure pct00024
.
본원의 일부 예는 기재를 작용화하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 하기의 노르보르넨기를 포함하는 기재를 제공하는 단계를 포함할 수 있다:
상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타낸다. 방법은 하기 구조를 포함하는 중합체를 기재 위에 증착하는 단계를 포함할 수 있다:
.
방법은 중합체의 아지드(N3)기를 노르보르넨기와 반응시켜 중합체를 기재에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일부 예는 상기 방법을 사용하여 중합체를 기재에 커플링함으로써 제조된 조성물을 제공한다.
본원의 일부 예는 중합체를 작용화하는 방법을 제공한다. 방법은 상기 조성물의 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨을 광을 이용하여 활성 모이어티로 전환하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일부 예는 하기 구조를 갖는 중합체를 제공한다:
.
본원의 일부 예는 중합체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 하기의 라디칼-유도 공중합 반응을 포함할 수 있다:
Figure pct00028
.
본원의 일부 예는 기재를 작용화하는 방법을 제공한다. 방법은 하기 노르보르넨기를 포함하는 기재를 제공하는 단계를 포함할 수 있다:
상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타낸다. 방법은 하기 구조를 포함하는 중합체를 기재 위에 증착하는 단계를 포함할 수 있다:
.
방법은 중합체의 아지드(N3)기를 노르보르넨기와 반응시켜 중합체를 기재에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일부 예는 상기 방법을 사용하여 중합체를 기재에 커플링함으로써 제조된 조성물을 제공한다.
본원의 일부 예는 중합체를 작용화하는 방법을 제공한다. 방법은 상기 조성물의 테트라졸을 광을 이용하여 니트릴 이민 활성 모이어티로 전환하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 또한 니트릴 이민 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일부 예는 하기 구조를 갖는 중합체를 제공한다:
.
본원의 일부 예는 중합체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 하기의 라디칼-유도 공중합 반응을 포함할 수 있다:
Figure pct00032
.
본원의 일부 예는 기재를 작용화하는 방법을 제공한다. 방법은 하기 노르보르넨기를 포함하는 기재를 제공하는 단계를 포함할 수 있다:
상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타낸다. 방법은 하기 구조를 포함하는 중합체를 기재 위에 증착하는 단계를 포함할 수 있다:
.
방법은 중합체의 아지드(N3)기를 노르보르넨기와 반응시켜 중합체를 기재에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일부 예는 상기 방법을 사용하여 중합체를 기재에 커플링함으로써 제조된 조성물을 제공한다.
본원의 일부 예는 중합체를 작용화하는 방법을 제공한다. 방법은 상기 조성물의 2H-아지린을 광을 이용하여 니트릴 일리드 활성 모이어티로 전환하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 니트릴 일리드 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일부 예는 하기 구조를 갖는 중합체를 제공한다:
상기 식에서, R은 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원의 일부 예는 중합체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM)와 작용화된 알킨()과의 클릭 화학 반응(click chemistry reaction)을 포함할 수 있다:
상기 식에서, 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
및 .
본원의 일부 예는 중합체를 작용화하는 방법을 제공한다. 방법은 광을 사용하여 상기 중합체의 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 또는 2H-아지린을 활성 모이어티로 전환하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일부 예는 하기 구조를 갖는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드-코-N-(5-트리아졸릴아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드) 중합체를 제공한다:
상기 식에서, R은 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원의 일부 예는 중합체의 제조 방법을 제공한다. 방법은 아지드 작용성 중합체와 작용화된 알킨()과의 클릭 화학 반응을 포함할 수 있다:
상기 식에서, 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
및 .
본원의 일부 예는 중합체를 작용화하는 방법을 제공한다. 방법은 광을 사용하여 상기 중합체의 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 또는 2H-아지린을 활성 모이어티로 전환하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 단계를 포함할 수 있다.
본원의 일부 예는 작용성 중합체 코팅된 표면을 제조하는 방법으로서, 노르보르넨 실란화된 표면을 아지드 작용성 중합체와 반응시킨 다음, 나머지 아지드기를 아지드 반응성 기에 커플링된 불활성 모이어티와 반응시키는, 작용성 중합체 코팅된 표면을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 예에서, 아지드 반응성 기는 알킨기를 포함한다. 일부 예에서, 불활성 모이어티는 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에서 기술되는 바와 같은 본 개시내용의 각각의 양태의 임의의 각각의 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있으며, 이러한 양태 중 임의의 하나 이상의 양태로부터의 임의의 특징/예는 본원에서 기술되는 바와 같은 이익을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 본원에서 기술되는 바와 같은 다른 양태(들)의 임의의 특징과 함께 구현될 수 있음을 이해할 것이다.
도 1은 기재의 제1 및 제2 영역에서 상이한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기재 상의 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 예를 개략적으로 도시한다.
도 2a 내지 도 2d는 기재의 제1 및 제2 영역에서 상이한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다.
도 3a 내지 도 3h는 기재 상에 배치된 중합체의 제1 및 제2 영역에 상이한 올리고뉴클레오티드를 커플링하기 위한 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다.
도 4a 내지 도 4e는 기재 상에 배치된 중합체의 제1 및 제2 영역의 어레이에 상이한 올리고뉴클레오티드를 커플링하기 위한 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다.
도 5는 중합체의 제1 및 제2 영역에 상이한 올리고뉴클레오티드를 커플링하는 방법에서의 작업의 예시적인 흐름을 도시한다.
본원에서 제공되는 예는 중합체, 중합체의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법에 관한 것이다.
클러스터 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 서열을 측정하기 위해서는 작용화된 중합체를 사용하여 합성에 의한 서열분석(SBS: sequencing-by-synthesis)을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 도 1은 기재의 제1 및 제2 영역에서 상이한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 기재 상의 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 예를 개략적으로 도시한다. 기재는 도 2a를 참조하여 설명된 바와 같은 방식으로 서로 상이한 올리고뉴클레오티드를 포함하도록 작용화될 수 있는 제1 영역(101) 및 제2 영역(102)을 포함할 수 있다. 판독의 신뢰성을 향상시키기 위해, 예를 들어 영역(101)에서 제1 방향으로 그리고 영역(102)에서 반대 방향으로 앰플리콘(amplicon)에 대한 SBS 판독을 수행한 다음 결과를 정렬하는 소프트웨어를 사용함으로써 서로 상보적이여야 하고, 그 결과 서로 동일한 서열을 나타내는 동일한 표적 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘에 대해 영역(101, 102) 둘 다에서 동시 쌍단 판독(simultaneous paired-end read)을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 기재 영역(102)(또는, 동등하게는, 기재 영역(101)) 상의 시드(111)(표적 폴리뉴클레오티드)의 포획 및 증폭은 제1 영역(121) 및 제2 영역(122)을 실질적으로 보호하고 동시 쌍단 판독에 용이하게 사용될 수 있는 단일 클론 클러스터(monoclonal cluster)를 생성할 수 있다.
기재의 상이한 영역을 상이한 방식 - 예를 들어, 기재의 상이한 영역에 상이한 올리고뉴클레오티드를 제공하는 방식 - 으로 작용화하면 동시 쌍단 판독에 적합한 표적 뉴클레오티드의 클러스터를 용이하게 제조할 수 있다. 예를 들어, 도 2a 내지 도 2d는 기재의 제1 및 제2 영역에서 상이한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다. 먼저 도 2a를 참조하면, 조성물(2000)은 기재(200) 및 여기에 결합된 복수의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 프라이머를 포함한다. 이러한 예에서, 기재(200)는 계면(interface)(203)를 사이에 두고 서로 인접할 수 있는 제1 영역(201) 및 제2 영역(202)을 포함한다. 제1 영역(201) 및 제2 영역(202)은 상이하게 작용화될 수 있으며, 보다 구체적으로는 그들에 커플링된 상이한 포획 프라이머(capture primer)를 가질 수 있다. 예를 들어, 포획 프라이머(231)는 기재(200)의 제1 영역(201)에 커플링될 수 있으며, 포획 프라이머(241)는 기재(200)의 제2 영역(202)에 커플링될 수 있다. 포획 프라이머(231 및 241)는 포획 프라이머(241)가 도 2d를 참조하여 아래에서 설명된 방식으로 사용될 수 있는 절제 모이어티(243)를 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다. 직교 포획 프라이머(232)는 기재(200)의 제1 영역(201)에 커플링될 수 있으며, 직교 포획 프라이머(242)는 기재의 제2 영역(202)에 커플링될 수 있다. 직교 포획 프라이머(232 및 242)는 직교 포획 프라이머(232)가 도 2d를 참조하여 아래에서 설명된 방식으로 사용될 수 있는 절제 모이어티(233)를 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 서로 동일한 서열을 가질 수 있다. 절제 모이어티(233, 243)는 임의의 적합한 프라이머(들)의 길이를 따라 임의의 적합한 위치에 위치할 수 있으며, 서로 동일한 유형의 절제 모이어티일 수 있지만 필수적으로 필요한 것은 아니다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 조성물(2000)은 표적 폴리뉴클레오티드(251), 예를 들어 증폭되고 궁극적으로는 서열분석되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유체(220)를 추가로 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드(251)는 직교 포획 프라이머(232, 242)에 상보적인 제1 어댑터(adapter)(254), 및 포획 프라이머(231, 241)에 상보적인 제2 어댑터(255)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 포획 프라이머(예를 들어, 직교 포획 프라이머(232 및 242))는 도 2d를 참조하여 설명된 것과 같은 방식으로 절단될 수 있는 8-옥소-G와 같은 절제 모이어티를 포함할 수 있다.
도 2b에 도시된 바와 같이, 표적 폴리뉴클레오티드(251)의 어댑터(254)는 영역(201)의 포획 프라이머(232)에 랜덤하게 혼성화(hybridize)될 수 있지만, 영역(202)의 포획 프라이머(242)에도 동등하게 혼성화될 수 있다. 이러한 초기 혼성화 후, 제1 표적 폴리뉴클레오티드(251)는 당업계에 공지된 바와 같은 프로세스, 예를 들어 표면 결합 폴리머라제 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 브릿지 증폭, 또는 ExAmp로 지칭될 수 있는 가닥 침입 프로세스(strand invasion process)를 사용하여 증폭시켜 도 2c에 도시된 앰플리콘(251')을 형성할 수 있다. 제1 및 제2 기재 영역(201, 202)이 실질적으로 가득찰 때까지 증폭 작업이 반복되는 경우, 생성된 앰플리콘의 두 어댑터는 모두 반드시 상응하는 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머에 혼성화될 필요는 없으며, 따라서 앰플리콘은 도 2c에 도시된 바와 같이 기재로부터 선형으로 멀리 연장될 수 있다. 그런 다음, 직교 포획 프라이머(232)의 일부는 적합한 효소 또는 시약을 절제 모이어티(233)와 반응시킴으로써 제거될 수 있으며, 포획 프라이머(241)의 일부는 적합한 효소 또는 시약을 절제 모이어티(243)와 반응시킴으로써 제거될 수 있다. 절제 모이어티(233)와 함께 사용되는 효소 또는 시약은 절제 모이어티(243)와 함께 사용되는 효소 또는 시약과 동일하거나 상이할 수 있다. 도 2d에 도시된 바와 같이, 절제 모이어티(233)(도 2c에 도시됨)의 반응은 제1 기재 영역(201)에서 하나의 배향의 폴리뉴클레오티드를 제거하고, 절제 모이어티(243)(도 2c에 도시됨)의 반응은 제2 기재 영역(202)에서 다른 배향의 폴리뉴클레오티드를 제거함으로써, 동시 쌍단 판독이 2개의 기재 영역에서 수행될 수 있다.
본 출원은, 예를 들어, 도 1을 참조하여 설명된 영역(101 및 102)를 형성하기 위해, 또는 도 2를 참조하여 설명된 영역(201 및 202)를 형성하기 위해 중합체의 서로 상이한 영역에 상이한 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 상이한 프라이머)를 커플링하는 방법의 비제한적인 예를 제공하며, 또한 중합체 및 이러한 중합체를 형성하는 방법을 제공한다.
먼저, 본원에서 사용되는 일부 용어들을 간략하게 설명할 것이다. 이어서, 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 일부 예시적인 방법 및 생성되는 조성물을 설명하고, 다음으로 중합체를 형성하는 일부 예시적인 방법 및 생성되는 중합체를 설명할 것이다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 "갖다", "갖는다", 및 "가진"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 접속구에서든 또는 청구범위의 본문에서든, "포함한다" 및 "포함하는"의 용어는, 제약을 두지 않는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계들을 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치의 맥락에서 사용될 때, "포함하는"이라는 용어는, 해당 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징 또는 구성요소를 포함하지만, 추가의 특징 또는 구성요소를 포함할 수도 있음을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "실질적으로", "대략", 및 "약"은, 예를 들어 가공에서의 변동으로 인한 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 변동은 ±10% 이하, 예를 들어 ±5% 이하, 예를 들어 ±2% 이하, 예를 들어 ±1% 이하, 예를 들어 ±0.5% 이하, 예를 들어 ±0.2% 이하, 예를 들어 ±0.1% 이하, 예를 들어 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혼성화"는 이러한 중합체의 길이를 따라 제1 폴리뉴클레오티드를 제2 폴리뉴클레오티드에 비공유적으로 결합시켜 이중 가닥 "듀플렉스"를 형성하는 것을 의미하도록 의도된다. 예를 들어, 2개의 DNA 폴리뉴클레오티드 가닥은 상보적 염기 쌍을 통해 결합할 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 결합의 강도는 이들 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 서열 사이의 상보성에 따라 증가한다. 폴리뉴클레오티드 간의 혼성화의 강도는 듀플렉스의 50% 가 서로 해리된 폴리뉴클레오티드 가닥을 갖는 용융 온도(Tm)를 특징으로 할 수 있다. 서로 "부분적으로" 혼성화된 폴리뉴클레오티드는 이들이 서로 상보적인 서열을 갖지만 이러한 서열은 이들의 길이의 일부만을 따라 서로 혼성화되어 부분 듀플렉스를 형성한다는 것을 의미한다. 혼성화에 대한 "불능성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 불충분한 수의 염기를 서로 혼성화하는 방식으로 서로 접촉할 수 있도록 서로 물리적으로 분리된 것들을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 당 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 포함하는 분자를 의미하도록 의도되는 것으로, 일부 예에서는 또한 핵 염기를 포함한다. 핵 염기가 결여된 뉴클레오티드는 "무염기"로 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 포스페이트 당 골격 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 뉴클레오티드의 예는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 티미딘 디포스페이트(TDP), 티미딘 트리포스페이트(TTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 디포스페이트(dCDP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(dUDP) 및 데옥시우리딘 트리포스페이트(dUTP)를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 또한 천연 발생 뉴클레오티드와 비교하여 변형된 핵 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드의 유형인 임의의 뉴클레오티드 유사체를 포함하도록 의도된다. 예시적인 변형된 핵 염기는 이노신, 잔타닌, 하이포잔틴, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸 시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸 아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필 구아닌, 2-프로필 아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-하이드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌 등을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 유사체는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 아데노신 5'-포스포설페이트와 같은 뉴클레오티드 유사체에 혼입될 수 없다. 뉴클레오티드는 임의의 적합한 수의 포스페이트, 예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 6개 초과의 포스페이트를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 서로 결합된 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 중합체의 하나의 비제한적인 예이다. 폴리뉴클레오티드의 예는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 이들의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열, 예를 들어 RNA 또는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA와 같은 뉴클레오티드의 이중 가닥 서열일 수 있거나, 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열과 이중 가닥 서열의 혼합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 게놈 DNA, 및 PCR 및 증폭 생성물을 포함한다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 dsDNA로 전환될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 폴리뉴클레오티드는 거울상이성질체 DNA와 같은 비천연 발생 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 정확한 서열은 공지되거나 공지되지 않을 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, 발현된 서열 태그(EST) 또는 유전자 발현의 연속 분석(SAGE) 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머 또는 전술한 것 중 어느 하나의 증폭된 카피.
본원에서 사용되는 "폴리머라제"는 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드로 중합시켜 폴리뉴클레오티드를 조립하는 활성 부위를 갖는 효소를 의미하도록 의도된다. 폴리머라제는 프라이밍된 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있고, 성장하는 프라이머에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하여 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 갖는 "상보적 카피" 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 그 후, 다른 폴리머라제 또는 동일한 폴리머라제가 상보적 카피 폴리뉴클레오티드의 상보적 카피를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드의 카피를 형성할 수 있다. 임의의 이러한 카피는 본원에서 "앰플리콘"으로 지칭될 수 있다. DNA 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합한 다음, 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥(성장 앰플리콘)의 3' 말단에서 유리 하이드록실기에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하여 표적 폴리뉴클레오티드 아래로 이동할 수 있다. DNA 폴리머라제는 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 분자를 합성할 수 있고, RNA 폴리머라제는 DNA 주형으로부터 RNA 분자를 합성할 수 있다(전사). 폴리머라제는 가닥 성장을 시작하기 위해 짧은 RNA 또는 DNA 가닥(프라이머)을 사용할 수 있다. 일부 폴리머라제는 이들이 사슬에 염기를 첨가하고 있는 부위 상류의 가닥을 치환할 수 있다. 이러한 폴리머라제는 가닥 치환인 것으로 언급될 수 있으며, 이는 폴리머라제에 의해 판독되는 주형 가닥으로부터 상보적 가닥을 제거하는 활성을 갖는 것을 의미한다. 가닥 치환 활성을 갖는 폴리머라제의 예는 Bst(바실루스 스테아로써모필루스) 폴리머라제, 엑소-Klenow 폴리머라제 또는 서열분석 등급 T7 엑소-폴리머라제의 큰 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 폴리머라제는 이들 전방의 가닥을 분해하여, 후방의 성장하는 사슬로 효과적으로 대체(5' 엑소뉴클레아제 활성)한다. 일부 폴리머라제는 이들 뒤의 가닥을 분해하는 활성(3' 엑소뉴클레아제 활성)을 갖는다. 일부 유용한 폴리머라제는 돌연변이에 의해 또는 그렇지 않으면 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 변형되었다.
본원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 뉴클레오티드가 유리 3' OH기를 통해 첨가될 수 있는 폴리뉴클레오티드로 정의된다. 프라이머는 블록이 제거될 때까지 중합을 방지하는 3' 블록을 포함할 수 있다. 프라이머는 커플링 반응을 허용하거나 프라이머를 또 다른 모이어티에 결합시키기 위해 5' 말단에 변형을 포함할 수 있다. 프라이머는 UV 광, 화학, 효소 등과 같은 적합한 조건 하에서 절단될 수 있는 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다. 프라이머 길이는 임의의 적합한 수의 염기만큼 길 수 있으며, 임의의 적합한 천연 및 비천연 뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 프라이머에 혼성화하는 (이에 상보적인 서열을 갖는) "어댑터"를 포함할 수 있으며, 프라이머의 유리 3' OH기에 뉴클레오티드를 첨가함으로써 상보적 카피 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 증폭될 수 있다. "포획 프라이머"는 기재에 결합되고 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 어댑터에 혼성화될 수 있는 프라이머를 의미하려는 반면, "직교 포획 프라이머"는 기재에 결합되고 그 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 어댑터에 혼성화될 수 있는 프라이머를 의미하도록 의도된다. 제1 어댑터는 직교 포획 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있으며, 제2 어댑터는 포획 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 서로 상이하고 독립적인 서열을 가질 수 있다. 추가적으로, 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 적어도 하나의 다른 특성에서 서로 상이할 수 있다. 예를 들어, 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 서로 다른 길이를 가질 수 있거나; 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머 중 하나는 다른 포획 프라이머 또는 직교 포획 프라이머에서는 결여된 비핵산 모이어티(예를 들어, 차단기 또는 절제 모이어티)를 포함할 수 있거나; 또는 이러한 특성의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "기재"는 본원에서 기술되는 조성물에 대한 지지체로서 사용되는 물질을 지칭한다. 예시적인 기재 물질은 유리, 실리카, 플라스틱, 석영, 금속, 금속 산화물, 유기-실리케이트(예를 들어, 다면체 유기 실세스퀴옥산(POSS)), 폴리아크릴레이트, 산화 탄탈럼, 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. POSS의 예는 그 전체가 참고로 포함된 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기술된 것일 수 있다. 일부 예에서, 본 출원에서 사용되는 기재는 유리, 용융 실리카, 또는 다른 실리카-함유 물질과 같은 실리카계 기재를 포함한다. 일부 예에서, 기재는 규소, 질화규소, 또는 실리콘 수소화물을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 출원에서 사용되는 기재는 플라스틱 물질 또는 성분, 예를 들어 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함한다. 예시적인 플라스틱 물질은 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스티렌, 및 사이클릭 올레핀 중합체 기재를 포함한다. 일부 실시예에서, 기재는 실리카계 물질 또는 플라스틱 물질 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 예에서, 기재는 유리 또는 규소계 중합체를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일부 예에서, 기재는 금속을 포함할 수 있다. 일부 이러한 예에서, 금속은 금이다. 일부 예에서, 기재는 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일례에서, 표면은 산화 탄탈럼 또는 산화 주석을 포함한다. 아크릴아미드, 에논 또는 아크릴레이트도 또한 기재 물질 또는 성분으로서 사용될 수 있다. 다른 기재 물질은 갈륨 비소, 인듐 포스파이드, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 석영일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 GaAs 또는 ITO와 같은 반도체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 전술한 목록은 본 출원을 예시하도록 의도되며, 이들로 제한하려는 것이 아니다. 기재는 단일 물질 또는 복수의 상이한 물질을 포함할 수 있다. 기재는 복합체 또는 라미네이트일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 유기-실리케이트 물질을 포함한다. 기재는 편평한, 둥근, 구형, 막대 형상, 또는 임의의 다른 적합한 형상일 수 있다. 기재는 강성 또는 가요성일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 비드 또는 플로우 셀이다.
일부 예에서, 기재는 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 기재의 노출된 층 내의 또는 층 상의 상이한 영역들의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 영역들 중 하나 이상은 하나 이상의 포획 프라이머가 존재하는 특징부일 수 있다. 특징부는 포획 프라이머가 존재하지 않는 틈새 영역(interstitial region)에 의해 분리될 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 행과 열인 특징부의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 특징부 및/또는 틈새 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 특징부 및/또는 틈새 영역의 무작위 배열일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 표면에 웰의 어레이(함몰부)를 포함한다. 웰은 실질적으로 수직 측벽에 의해 제공될 수 있다. 웰은 포토리소그래피, 스탬핑 기법, 몰딩 기법 및 마이크로에칭 기법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 기법들을 사용하여 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 사용되는 기술은 어레이 기재의 조성 및 형상에 좌우될 것이다.
기재의 패턴화된 표면의 특징부는 본원에서 제공되는 바와 같은 패턴화된 중합체를 가진 유리, 규소, 플라스틱 또는 다른 적합한 물질(들) 상의 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)의 어레이 중의 웰을 포함할 수 있다. 일례에서, 중합체는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM)와 같은 공유 결합된 겔을 포함한다. 패턴화는 서열분석에 사용될 수 있는, 예를 들어 다수의 사이클을 사용하는 서열분석 실행에 걸쳐 안정적일 수 있는 중합체 패드를 제공할 수 있다. 일부 예에서, 웰에 대한 중합체의 공유 결합은 다양한 사용 중에 구조화된 기재의 수명 전체에 걸쳐서 구조화된 특징부(예를 들어, 웰) 내에 중합체를 유지하는 데 도움이 될 수 있다. 그러나, 일부 예에서, 중합체는 웰에 공유 결합될 필요는 없다.
특정 예에서, 구조화된 기재는 적합한 물질로 형성된 기재에 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)을 패턴화하고, 기재 물질을 중합체 물질로 코팅하고, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 연마를 통해 중합체 코팅된 물질의 표면을 연마하여 웰 내에 중합체를 보유하지만 웰들 사이의 구조화된 기재의 표면 상의 틈새 영역으로부터 실질적으로 모든 중합체를 제거하거나 불활성화시킴으로써 제조할 수 있다. 프라이머는, 예를 들어, 본원에서 제공되는 것과 같은 방식으로 중합체 물질에 부착할 수 있다. 다음으로, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단편화된 인간 게놈 또는 이의 부분)를 포함하는 용액을 개별 표적 폴리뉴클레오티드가 중합체 물질에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해 개별 웰에 시딩하도록 연마된 기재와 접촉시킬 수 있다; 그러나, 중합체 물질의 부재 또는 불활성으로 인해 표적 폴리뉴클레오티드는 틈새 영역을 점유하지 않을 것이다. 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭은 틈새 영역 내의 중합체의 부재 또는 불활성이 성장하는 클러스터의 외측 방향 이동을 억제할 수 있기 때문에 웰로 한정될 것이다. 공정은 편리하게 제조 가능하고, 확장 가능하며, 종래의 마이크로-제조 또는 나노-제조 방법을 활용한다.
패턴화된 기재는 예를 들어 슬라이드 또는 칩으로 에칭된 웰을 포함할 수 있다. 웰의 에칭 및 기하학적 구조의 패턴은 다양한 상이한 형상 및 크기를 취할 수 있고, 이러한 특징부는 물리적으로 또는 기능적으로 서로 분리 가능할 수 있다. 이러한 구조적 특징부를 갖는 특히 유용한 기재는 미소구체와 같은 고체 입자의 크기를 선택할 수 있는 패턴화된 기재를 포함한다. 이러한 특성을 갖는 예시적인 패턴화된 기재는 BEAD ARRAY 기술과 관련하여 사용되는 에칭된 기재이다(Illumina, Inc., 미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재).
일부 예에서, 본원에서 기술되는 기재는 플로우 셀의 적어도 일부를 형성하거나 또는 플로우 셀에 위치하거나 또는 플로우 셀에 결합된다. 플로우 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 분할되는 유동 챔버를 포함할 수 있다. 본원에서 제시되는 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 예시적인 플로우 셀 및 플로우 셀의 제작을 위한 기재로는 Illumina, Inc.(미국 캘리포니아 주 샌디에이고 소재)로부터 상업적으로 입수 가능한 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "직접적으로"는, 기재의 표면을 덮는 층과 관련하여 사용될 때, 층이, 예를 들어, 접착제 층 또는 중합체 층과 같은 유의미한 중간 층 없이 기판의 표면을 덮는 것을 의미하도록 의도된다. 표면을 직접 덮는 층은 공유 결합 또는 비공유 접착을 포함하는 임의의 화학적 또는 물리적 상호작용을 통해 이러한 표면에 부착될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "고정된"은, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 공유 또는 비공유 결합(들)을 통해 기재에 직접 또는 간접 부착되는 것을 의미하도록 의도된다. 특정 예에서, 공유결합 부착이 사용될 수 있거나, 기재를 사용하도록 의도된 조건 하에, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 증폭 또는 서열분석 시, 폴리뉴클레오티드가 고정되거나 기판에 부착된 상태로 유지되는 임의의 다른 적합한 부착이 사용될 수 있다. 포획 프라이머로서 또는 표적 폴리뉴클레오티드로서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 3'-말단이 효소 연장에 이용 가능하고 서열의 적어도 일부가 상보적 서열에 혼성화될 수 있도록 고정될 수 있다. 고정화는 표면 부착된 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화를 통해 발생할 수 있으며, 이러한 경우 고정된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 3'-5' 배향일 수 있다. 대안적으로, 고정화는 공유적 부착과 같은 염기쌍 혼성화 이외의 수단에 의해 발생할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "어레이"는 상대적 위치에 따라 서로 구별될 수 있는 기재 영역의 집단을 지칭한다. 어레이의 상이한 영역에 있는 상이한 분자(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)는 어레이 내의 영역의 위치에 따라 서로 구별될 수 있다. 어레이의 개별 영역은 특정 유형의 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 기재 영역은 특정 서열을 갖는 단일 표적 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 기재 영역은 동일한 서열(또는 그의 상보적 서열)을 갖는 몇몇 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 어레이의 영역은 동일한 기재 상에서 서로 상이한 특징부를 각각 포함할 수 있다. 예시적인 특징부는 기재 내의 웰, 기재 내 또는 기재 상의 비드(또는 다른 입자), 기재로부터의 돌출부, 기재 상의 릿지(ridge) 또는 기재 내의 채널을 제한 없이 포함한다. 어레이의 영역은 각각 서로 상이한 기재 상에 상이한 영역을 포함할 수 있다. 별도의 기재에 부착된 상이한 분자는 기재가 결합된 표면 상의 기재의 위치에 따라, 또는 액체 또는 겔 내의 기재의 위치에 따라 식별될 수 있다. 별도의 기재가 표면에 위치하는 예시적인 어레이는 웰에 비드를 갖는 어레이를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "복수"는 둘 이상의 상이한 구성원의 집단을 의미하도록 의도된다. 복수는 작은, 중간, 큰, 매우 큰 크기의 범위일 수 있다. 작은 복수의 크기는, 예를 들어, 수 개의 구성원 내지 수십 개의 구성원의 범위일 수 있다. 중간 크기의 복수는, 예를 들어, 수십 개의 구성원 내지 약 100개의 구성원 또는 수백 개의 구성원의 범위일 수 있다. 큰 복수는, 예를 들어, 약 수백 개의 구성원 내지 약 1000개의 구성원, 수천 개의 구성원 및 최대 수만 개의 구성원의 범위일 수 있다. 매우 큰 복수는, 예를 들어, 수만 개의 구성원 내지 약 수십만, 백만, 수백만, 수천만 및 최대 수억을 초과하는 구성원의 범위일 수 있다. 따라서, 복수는 구성원의 수에 의해 측정되는 바와 같이, 위의 예의 범위 사이 및 그보다 큰 모든 크기와 같이, 2개부터 1억 개의 구성원을 훨씬 넘는 크기의 범위일 수 있다. 예시적인 폴리뉴클레오티드 복수는 예를 들어 약 1×105개 이상, 5×105개 이상 또는 1×106개 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드의 집단을 포함한다. 따라서, 이러한 용어의 정의는 2를 초과하는 모든 정수 값을 포함하도록 의도된다. 복수의 상한은, 예를 들어, 샘플 내 폴리뉴클레오티드 서열의 이론적 다양성에 의해 설정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이중 가닥"은, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 폴리뉴클레오티드 내 모든 또는 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 상보적 폴리뉴클레오티드 내 각각의 뉴클레오티드에 수소 결합됨을 의미하도록 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "단일 가닥"은, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 본질적으로 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드 중 어느 것도 상보적 폴리뉴클레오티드 내 각각의 뉴클레오티드에 수소 결합되지 않음을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "표적 폴리뉴클레오티드"는 분석 또는 작용의 대상인 폴리뉴클레오티드를 의미하도록 의도된다. 분석 또는 작용은 폴리뉴클레오티드를 증폭, 서열분석 및/또는 다른 절차에 적용시키는 것을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 분석될 표적 서열에 추가적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 분석될 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 옆에 위치하는 프라이머 결합 부위로서 기능하는 어댑터를 포함하는 하나 이상의 어댑터를 포함할 수 있다. 포획 프라이머에 혼성화된 표적 폴리뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드 전부가 연장될 수는 없는 방식으로 포획 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단을 넘어 연장되는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 서로 상이한 서열을 가질 수 있지만, 서로 동일한 제1 및 제2 어댑터를 가질 수 있다. 특정 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 측면에 위치할 수 있는 2개의 어댑터는 서로 동일한 서열, 또는 서로 상보적 서열을 가질 수 있거나, 2개의 어댑터는 상이한 서열을 가질 수 있다. 따라서, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드에서의 종은, 예를 들어, 서열분석(예를 들어, SBS)에 의해 평가될 미지의 서열의 영역 옆에 위치하는 공지된 서열의 영역을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 단일 말단에 어댑터를 보유하고, 이러한 어댑터는 표적 폴리뉴클레오티드의 3' 말단 또는 5' 말단에 위치할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 어떠한 어댑터도 없이 사용될 수 있으며, 이 경우 프라이머 결합 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 내에서 발견되는 서열로부터 직접 유래할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상이한 용어는 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 크기, 서열 또는 다른 특성의 임의의 특정 차이를 나타내도록 의도되지 않는다. 설명의 명확성을 위해, 여러 폴리뉴클레오티드 종을 포함하는 특정 방법 또는 조성물을 설명할 때 하나의 폴리뉴클레오티드 종을 다른 것으로부터 구별하기 위해 용어가 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "앰플리콘"은, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 폴리뉴클레오티드를 카피하는 산물을 의미하도록 의도되며, 여기서 산물은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 실질적으로 동일하거나 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. "증폭" 및 "증폭하는"은 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 제조하는 공정을 지칭한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 앰플리콘은 상보적 카피일 수 있다. 추가 앰플리콘은 제1 앰플리콘의 생성 후에, 표적 폴리뉴클레오티드로부터 또는 제1 앰플리콘으로부터 생성되는 카피이다. 후속 앰플리콘은 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적이거나 표적 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 소수의 돌연변이(예를 들어, 증폭 아티팩트에 기인함)가 그의 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 생성할 때 발생할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "불활성 모이어티"는 특정 세트의 조건 하에서 제2 화학 물질과 실질적으로 반응하지 않는 제1 화학 물질을 의미하도록 의도된다. 본원에서 사용되는 용어 "활성 모이어티"는 특정 세트의 조건 하에서 제2 화학 물질과 반응성인 제3 화학 물질을 의미하도록 의도된다. 제1 화학 물질은 제3 화학 물질로 전환되고, 따라서 불활성 모이어티가 활성 모이어티로 전환될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 요소의 일부를 광으로 "선택적으로 조사한다(selectively irradiate)"는 것은 실질적으로 단지 요소의 해당 부분만을 광으로 조사하는 반면, 해당 요소의 다른 부분(들)은 광으로 조사하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. 요소의 일부를 광으로 선택적으로 조사하는 방법의 비제한적인 예는 해당 요소의 다른 부분이 조사되는 것을 차폐한 다음, 전체 요소 또는 선택적으로 조사되는 부분을 포함하는 요소의 임의의 적합한 부분을 조사하는 것이다. 요소의 일부를 광으로 선택적으로 조사하는 방법의 또 다른 비제한적인 예는 광 집속 광학 장치를 "플로우 셀 기재를 패턴화하기 위한 시스템 및 방법(System and Method for Patterning Flow Cell Substrates)"이란 발명의 명칭의 PCT 공개 WO 2021/028815호에 기술된 바와 같은 방식으로 광 커플링 격자와 같은 하나 이상의 다른 요소와 선택적으로 조합하여 사용하는 것으로, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에서 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "차폐(mask)"는 개체에 대한 광의 투과를 억제하는 광학 성분을 의미하는 반면, 용어 "비차폐(unmask)"는 해당 개체에 대한 광의 투과를 허용하기 위해 그러한 광학 성분을 제거하는 것을 의미하도록 의도된다.
올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법
본원에서 제공되는 일부 예는 클러스터가 생성될 중합체 영역(들)의 선택된 특성을 갖는 포획 프라이머를 제공하는 것에 관한 것이다. 본원의 예는, 증폭된 폴리뉴클레오티드의 서열은 중합체의 제1 영역에서 SBS를 사용하여 판독되고, 폴리뉴클레오티드의 상보적 서열은 중합체의 제2 영역에서 SBS를 사용하여 서로 병행하여 판독되는 동시 쌍단 판독에서 사용하기 위한 클러스터를 생성하는 데 특히 매우 적합하지만, 이러한 예는 일반적으로 임의의 유형의 클러스터에 적용 가능하며 실제로 임의의 유형의 올리고뉴클레오티드를 커플링하기에 바람직할 수 있는 임의의 중합체에 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다.
예를 들어, 도 3a 내지 도 3h는 기재 상에 배치된 중합체의 제1 및 제2 영역에 상이한 올리고뉴클레오티드를 커플링하기 위한 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다. 도 3a에 도시된 조성물(3000)은 기재(310), 및 기재(310) 상에 배치된(예를 들어, 기재 상에 고정된) 골격(311) 및 골격(311)에 커플링된 불활성 모이어티(312)를 포함하는 중합체를 포함한다. 도 3a에 도시된 바와 같은 방식으로, 중합체의 제1 영역(321)의 불활성 모이어티(312)는 광으로 선택적으로 조사(아래쪽을 가리키는 화살표로 표시된 바와 같음)될 수 있는 반면, 중합체의 제2 영역(322)의 불활성 모이어티(312)는 조사되지 않는다. 예를 들어, 제2 영역(322)은 마스크(360)를 사용하여 차폐할 수 있다(아래쪽을 가리키는 화살표를 차단하는 마스크로 표시됨). 도 3b에 도시된 바와 같은 방식으로, 광은 중합체의 제1 영역의 제1 활성 모이어티(313)를 생성할 수 있으며, 예를 들어, 중합체의 제1 영역의 불활성 모이어티(312)를 활성 모이어티로 전환시킬 수 있다. 이와 관련하여, 광은 이러한 전환을 수행하는 데 적합한 파장 및 강도를 가질 수 있으며, 예를 들어, 광은 올리고뉴클레오티드를 실질적으로 손상시키지 않으면서 전환을 수행하기에 충분히 높은 주파수를 갖도록 약 365 nm 내지 약 450 nm의 범위에 있을 수 있다. 광을 사용하여 활성 모이어티로 전환할 수 있는 비활성 모이어티에 커플링된 중합체 골격의 비제한적인 예는 본원의 다른 곳에서 제공된다. 선택적으로, 영역(321)을 광으로 선택적으로 조사하기 전에, 포토레지스트를 이러한 영역 위에 증착시킬 수 있으며, 영역(322)을 조사되지 않은 상태로 유지하면서 영역(321)이 조사되는 정밀도를 증가시킬 수 있다. 이어서, 도 3c를 참조하여 설명된 방식으로 포토레지스트를, 예를 들어, 적합한 용매를 사용하여 제거한 다음 중합체를 유체(320)와 접촉시킬 수 있다. 일부 예에서, 서로 상이한 단계에서, 또는 서로 공통 단계에서, 조사된 포토레지스트는 제1 영역(321)으로부터 제거하고, 조사되지 않은 포토레지스트는 제2 영역(322)으로부터 제거한다.
이어서, 제1 활성 모이어티(313)는 제1 올리고뉴클레오티드에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 도 3c에 도시된 바와 같은 방식으로, 제1 활성 모이어티(313) 및 불활성 모이어티(312)는 유체(320)와 접촉될 수 있다. 도시된 예에서, 유체(320)는 도 2a를 참조하여 설명된 올리고뉴클레오티드(231)에 상응하는 올리고뉴클레오티드(331), 및 도 2a를 참조하여 설명된 올리고뉴클레오티드(232)에 상응하는 올리고뉴클레오티드(332)의 혼합물을 포함한다. 올리고뉴클레오티드(332)는 절제 모이어티(333)를 포함할 수 있는 반면, 올리고뉴클레오티드(331)는 절제 모이어티가 결여될 수 있다. 각각의 올리고뉴클레오티드(331, 332)는 제1 활성 모이어티(313)가 반응할 수 있고, 불활성 모이어티(312)는 실질적으로 반응하지 않을 수 있는 반응성 기(323)를 포함할 수 있다. 이와 같이, 도 3d에 도시된 바와 같은 방식으로, 올리고뉴클레오티드(331, 332)의 혼합물은 영역(321) 내의 중합체에 커플링될 수 있는 반면, 올리고뉴클레오티드는 영역(322) 내의 중합체에 커플링되지 않을 수 있다. 활성 모이어티와 반응하는데 사용될 수 있고 불활성 모이어티와 실질적으로 반응하지 않는 반응성 기의 비제한적인 예는 본원의 다른 곳에서 제공된다.
영역(321) 내의 실질적으로 모든 제1 활성 기(313)가 반응성 기(323)와 완전히 반응하고, 따라서 임의의 후속 반응에 사용할 수 없게 되는 것을 예상할 수 있지만, 선택적으로, 임의의 나머지 제1 활성 기(313)가 이러한 제1 활성 기가 반응하고 이와 같이 임의의 후속 반응에 사용할 수 없게 되는 추가 시약과 접촉하는 추가의 "캡핑" 반응이 수행될 수 있다. 예시적으로, "캡핑" 반응은 폴리에틸렌 글리콜-아지드(PEG-아지드), 1-아지도헥산, 3-아지도프로파노산, 3-아지도프로판-1-올 등과 같은 일작용성 아지드 분자의 첨가, 또는 1-헥센-6-올 또는 5-헥세노산과 같은 올레핀과 반응하는 활성 기를 첨가하는 것을 포함할 수 있다.
이어서, 중합체의 제2 영역(322)이 조사될 수 있다. 예를 들어, 도 3e에 도시된 바와 같은 방식으로, 중합체의 제2 영역(322)은 차폐 해제될 수 있고, 중합체의 제2 영역 내의 불활성 모이어티(312)는 도 3f에 도시된 바와 같이 광으로 조사되어 중합체의 제2 영역에서 제2 활성 모이어티(314)를 생성할 수 있다. 제2 활성 모이어티(314)는 제1 활성 모이어티(313)와 화학적으로는 동일할 수 있지만, 중합체의 다른 영역(322)에 있을 수 있다. 일부 예에서, 영역(321)은 영역(322)과 동시에 광으로 조사될 수 있는데, 예를 들어 이는 영역(321)의 임의의 불활성 모이어티(312)가 이미 활성 모이어티(313)로 전환되고 반응성 기(323) 또는 선택적인 캡핑 시약과 실질적으로 완전히 반응했을 것이기 때문이다. 그러나, 영역(322)은 선택적으로 조사될 수 있으며, 예를 들어, 영역(321)은 영역(322)이 광으로 조사되는 동안 선택적으로 차폐되어, 예를 들어, 광이 올리고뉴클레오티드(331, 332)를 분해하는 것을 억제할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 광의 파장은 올리고뉴클레오티드의 광 유도 분해를 억제하도록 선택될 수 있으며, 예를 들어, 약 365 nm 내지 약 450 nm의 범위일 수 있다.
이어서, 제2 활성 모이어티(314)는 제2 올리고뉴클레오티드에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 도 3g에 도시된 바와 같은 방식으로, 제2 활성 모이어티(314)뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드(331, 332)는 유체(320)와 접촉될 수 있다. 도시된 예에서, 유체(320)는 도 2a를 참조하여 설명된 올리고뉴클레오티드(241)에 상응하는 올리고뉴클레오티드(341), 및 도 2a를 참조하여 설명된 올리고뉴클레오티드(242)에 상응하는 올리고뉴클레오티드(342)의 혼합물을 포함한다. 도 3g에 도시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드(342)는 절제 모이어티(343)를 포함할 수 있는 반면, 올리고뉴클레오티드(341)는 절제 모이어티가 결여될 수 있다. 각각의 올리고뉴클레오티드(341, 342)는 제2 활성 모이어티(314)와 반응할 수 있는 반응성 기(323)를 포함할 수 있으며, 이는 도 3c에 도시된 작동 중에 사용된 것과 동일한 유형의 반응성 기일 수 있다. 이와 같이, 도 3h에 도시된 바와 같은 방식으로, 올리고뉴클레오티드(341, 342)의 혼합물은 영역(322)(도 3g에 도시됨) 내의 중합체에 커플링될 수 있는 반면, 올리고뉴클레오티드(331, 332)는 영역(321)(도 3g에 도시됨) 내의 중합체에 대해 커플링을 유지할 수 있다. 도 3h에 도시된 생성되는 조성물(3001)은 도 1을 참조하여 설명된 중합체 영역(101) 및 도 2a를 참조하여 설명된 중합체 영역(201)에 상응하는 중합체 영역(301) 및 도 1을 참조하여 설명된 중합체 영역(102) 및 도 2a를 참조하여 설명된 중합체 영역(202)에 상응하는 중합체 영역(302)을 포함할 수 있으며, 도 1 및 도 2a 내지 도 2d를 참조하여 설명한 것과 유사한 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 데 사용될 수 있다.
도 3a 및 도 3b를 참조하여 설명된 바와 같은 방식으로 활성 모이어티(313)로 전환될 수 있고, 도 3e 및 도 3f를 참조하여 설명된 바와 같은 방식으로 활성 모이어티(314)로 전환될 수 있는 임의의 적합한 불활성 모이어티(312)가 사용될 수 있다. 예시적으로, 불활성 모이어티(312)는 하기 구조를 갖는 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴을 포함할 수 있다:
상기 식에서, R3 및 R4 중 하나는 R1이며 다른 하나는 H이고; R1은 중합체의 골격에 대한 결합이며; X는 CH2, O, S, 또는 R4가 X에 직접 커플링되지 않은 경우 NH이거나, 또는 X는 CH 또는 R4가 X에 직접 커플링되는 경우 N이다. 자외선(UV) 광(예를 들어, 350 nm 및 적합한 강도)을 조사하면 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴이 탈카보닐화되어 활성 모이어티인 디벤조사이클로옥틴(DBCO)을 형성한다:
.
도 3c를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320) 내의 올리고뉴클레오티드(331, 332)가 커플링되는 반응성 기(323)는 아지드(N3)일 수 있으며, 도 3g를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320') 내의 올리고뉴클레오티드(341, 342)가 커플링되는 반응성 기(323)도 또한 아지드일 수 있다. 아지드는 디벤조사이클로옥틴과 반응하여 하기 구조를 갖는 사이클로 부가물을 형성할 수 있다:
상기 식에서, R2는 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 따라서 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링한다.
하나의 비제한적인 예에서, 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴은 하기 구조를 갖는다:
상기 식에서, R1은 중합체의 골격(311)에 대한 결합을 나타낸다. 자외선(UV) 광(예를 들어, 350 nm 및 적합한 강도)을 조사하면 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴이 탈카보닐화되어 활성 모이어티인 하기의 디벤조사이클로옥틴(DBCO)을 형성한다:
.
도 3c를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320) 내의 올리고뉴클레오티드(331, 332)가 커플링되는 반응성 기(323)는 아지드(N3)일 수 있으며, 도 3g를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320') 내의 올리고뉴클레오티드(341, 342)가 커플링되는 반응성 기(323)도 또한 아지드일 수 있다. 아지드는 디벤조사이클로옥틴과 반응하여 하기 구조를 갖는 사이클로 부가물을 형성할 수 있다:
상기 식에서, R2는 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 따라서 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링한다.
다른 예에서, 불활성 모이어티(312)는 하기 구조를 갖는 테트라졸을 포함할 수 있다:
상기 식에서, R1은 중합체의 골격(311)에 대한 결합을 나타낸다. 자외선(UV) 광(예를 들어, 300 내지 365 nm 및 적합한 강도)을 조사하면 불활성 모이어티가 탈질소화(N2 손실)되어 활성 모이어티인 하기 구조를 갖는 니트릴 이민을 형성한다:
.
도 3c를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320) 내의 올리고뉴클레오티드(331, 332)가 커플링되는 반응성 기(323)는 올레핀()을 포함할 수 있으며, 도 3g를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320') 내의 올리고뉴클레오티드(341, 342)가 커플링되는 반응성 기(323)도 또한 올레핀()일 수 있다. 올레핀은 활성 모이어티와 반응하여 하기 구조를 갖는 피라졸린을 형성할 수 있다:
상기 식에서, R2는 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 따라서 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링한다.
또 다른 예에서, 불활성 모이어티(312)는 하기 구조를 갖는 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨을 포함할 수 있다:
상기 식에서, R1은 중합체의 골격(311)에 대한 결합을 나타낸다. 자외선(UV) 광(예를 들어, 300 내지 350 nm 및 적합한 강도)을 조사하면 불활성 모이어티로부터 H2O가 축합되어 하기 구조를 갖는 활성 모이어티를 형성한다:
.
도 3c를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320) 내의 올리고뉴클레오티드(331, 332)가 커플링되는 반응성 기(323)는 비닐 에테르()일 수 있으며, 도 3g를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320') 내의 올리고뉴클레오티드(341, 342)가 커플링되는 반응성 기(323)도 또한 비닐 에테르()일 수 있다. 비닐 에테르는 활성 모이어티와 반응하여 하기 구조를 갖는 벤조크로만을 형성할 수 있다:
상기 식에서, R2는 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 따라서 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링한다.
또 다른 예에서, 불활성 모이어티(312)는 하기 구조를 갖는 2H-아지린을 포함할 수 있다:
상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타낸다. 자외선(UV) 광(예를 들어, 약 302 nm 및 적합한 강도)을 조사하면 2H-아지린 불활성 모이어티의 개환 재배열이 일어나 활성 모이어티인 하기 구조를 갖는 니트릴 일리드를 형성한다:
.
도 3c를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320) 내의 올리고뉴클레오티드(331, 332)가 커플링되는 반응성 기(323)는 올레핀()일 수 있으며, 도 3g를 참조하여 전술한 바와 같은 방식으로, 유체(320') 내의 올리고뉴클레오티드(341, 342)가 커플링되는 반응성 기(323)도 또한 올레핀()일 수 있다. 올레핀은 활성 모이어티와 반응하여 하기 구조를 갖는 피롤린을 형성할 수 있다:
상기 식에서, R2는 올리고뉴클레오티드를 나타내며, 따라서 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링한다.
광을 사용하여 위에서 예시된 바와 같은 활성 모이어티로 전환될 수 있는 불활성 모이어티를 포함할 수 있는 중합체의 비제한적인 예, 및 이러한 중합체를 제조하는 방법은 본원의 다른 곳에서 더 자세히 제공된다.
도 3a 내지 도 3h를 참조하여 설명된 예들은 서로 인접한 제1 및 제2 영역을 갖는 편평한 기재의 사용을 제안할 수 있지만, 더 복잡한 기재가 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 도 4a 내지 도 4e는 기재 상에 배치된 중합체의 제1 및 제2 영역의 어레이에 상이한 올리고뉴클레오티드를 커플링하기 위한 공정 흐름에서의 예시적인 조성물 및 작업을 개략적으로 도시한다. 도 4a 내지 도 4e를 참조하여 설명된 바와 같은 조성물은 도 3a 내지 도 3h를 참조하여 설명된 바와 유사한 방식으로 제조 및 사용될 수 있다.
도 4a의 평면도, 및 그의 일부가 도시된 도 4b의 단면도에 도시된 예에서, 기재(450)는, 예를 들어, 골격(411)을 포함하는 중합체가 각각 내부에 배치될 수 있는 웰(451)의 어레이를 제공하는 복수의 수직 측벽(403) 및 도 3a 내지 도 3h를 참조하여 설명되고 본원의 다른 곳에서 예시되는 불활성 모이어티(412)를 포함할 수 있다. 웰(451)의 어레이 내의 중합체는 차폐될 수 있거나, 달리는 각각의 웰 내의 중합체의 단지 일부만을 조사하기 위해 임의의 적합한 방식으로 선택적으로 조사될 수 있다. 예를 들어, 복수의 평행한 세장형 마스크(460)는 도 4c에 도시된 바와 같은 방식으로 조사를 위해 노출된 영역(421)을 남기면서 복수의 웰(451)의 영역을 가로질러 연장되어 그를 차폐할 수 있다. 그런 다음, 도 3a 내지 도 3h를 참조하여 설명된 바와 같은 공정을 수행함으로써, 도 4d의 평면도, 및 그의 일부가 도시된 도 4e의 단면도에 도시된 바와 같은 웰(451)의 어레이를 얻을 수 있다. 각각의 웰(451) 내에는 도 1, 도 2a 내지 도 2d, 및 도 3h를 참조하여 각각 설명된 중합체 영역(101, 201 및 301)과 유사하게 구성될 수 있는 제1 중합체 영역(401), 및 도 1, 도 2a 내지 도 2d, 및 도 3h를 참조하여 각각 설명된 중합체 영역(102, 202 및 302)과 유사하게 구성되고 사용될 수 있는 중합체 영역(402)이 배치될 수 있다. 따라서, 중합체의 제1 영역은 복수의 제1 하위 영역(401)을 포함하는 것으로 간주될 수 있으며, 중합체의 제2 영역은 복수의 제2 하위 영역(402)을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 도 4d에 도시된 바와 같은 방식으로, 각각의 제1 하위 영역(401)은 제2 하위 영역(402) 중 상응하는 하나와 연속될 수 있다. 또한, 도 4d에 도시된 바와 같은 방식으로, 각각의 제1 하위 영역(401), 및 제1 하위 영역과 연속되어 있는 제2 하위 영역(402) 중 상응하는 하위 영역은 도 4e에 도시된 바와 같이 웰(451) 내에 위치한다.
도 5는 중합체의 제1 및 제2 영역에 상이한 올리고뉴클레오티드를 커플링하는 방법에서의 작업의 예시적인 흐름을 도시한다. 도 5에 도시된 방법(500)은 중합체의 제1 영역의 불활성 모이어티를 광으로 선택적으로 조사하는 동시에 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티를 조사하지 않아 중합체의 제1 영역의 제1 활성 모이어티를 생성하는 단계(작업 510)를 포함할 수 있다. 이러한 선택적 조사의 비제한적인 예는 도 3a 및 도 3b 및 도 4c를 참조하여 설명된다. 도 5에 도시된 방법(500)은 또한 제1 활성 모이어티를 제1 올리고뉴클레오티드에 커플링하는 단계(작업 520)를 포함할 수 있다. 이러한 커플링의 비제한적인 예는 도 3c 및 도 3d를 참조하여 설명된다. 도 5에 도시된 방법(500)은 또한 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티를 광으로 조사하여 중합체의 제2 영역의 제2 활성 모이어티를 생성하는 단계(작업 530)를 포함할 수 있다. 이러한 조사의 비제한적인 예는 도 3e 및 도 3f를 참조하여 설명된다. 도 5에 도시된 방법(500)은 또한 제2 활성 모이어티를 제2 올리고뉴클레오티드에 커플링하는 단계(작업 540)를 포함할 수 있다. 이러한 커플링의 비제한적인 예는 도 3g 및 도 3h를 참조하여 설명된다.
중합체, 및 중합체의 제조 방법
광을 사용하여 활성 모이어티로 전환할 수 있는 불활성 모이어티 및 이러한 활성 모이어티와 반응하여 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링할 수 있는 반응성 기의 비제한적인 예는 도 3a 내지 도 3h를 참조하여 상기에서 제공된다. 이하, 이러한 불활성 모이어티를 포함하는 중합체를 형성하는 방법 및 생성되는 중합체의 일부 비제한적인 예를 설명할 것이다.
일부 예에서, 중합체는 하기 구조를 갖는 폴리(사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴-아크릴아미드-코-아크릴아미드) 공중합체를 포함한다:
,
상기 식에서, 일부 예에서, m은 약 50 내지 100,000의 범위이며, n은 약 5 내지 20,000의 범위이다. 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴은 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴 작용성 단량체의 임의의 적합한 공중합체를 형성하기 위해 전술한 바와 같은 임의의 적합한 구조를 가질 수 있으며, 이러한 특정 예로 제한되지 않는다는 사실에 유의한다. 이러한 중합체는 라디칼-유도 공중합 반응을 포함하는 방법으로 제조될 수 있으며:
Figure pct00069
이는 랜덤, 블록, 디블록, 멀티블록, 구배, 또는 기타 적합한 유형의 공중합으로 수행될 수 있다.
도 3a 내지 도 3h를 참조하여 설명된 바와 같은 방식으로, 이러한 중합체의 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴은 불활성 모이어티(312)에 상응하며, 광을 사용하여 활성 모이어티로 전환할 수 있다. 이러한 전환으로부터 생성된 중합체는 하기 구조를 갖는 폴리(디벤조사이클로옥틴-아크릴아미드-코-아크릴아미드) 공중합체를 포함할 수 있다:
디벤조사이클로옥틴은 위에서 추가로 설명된 바와 같은 임의의 적합한 구조를 가질 수 있다는 사실에 유의한다. 이러한 중합체는 광-유도 반응을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:
이러한 중합체는 기재 상에 배치될 수 있으며, 기재에 공유적으로 또는 비공유적으로 커플링될 수 있다. 기재에 대한 공유 커플링을 촉진하기 위해, 전술된 중합체(여기서, 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴은 임의의 적합한 구조를 가질 수 있음)는 하기 구조를 갖는 아지드 작용성 중합체가 되도록 개질될 수 있다:
상기 식에서, 일부 예에서, m 및 n은 상기에서 정의된 바와 같을 수 있으며, x는 아지드-작용화된 아크릴아미드의 반복 단위의 수로서, 예를 들어, 약 5 내지 10,000 범위이다. 이러한 아지드 작용성 중합체는 라디칼-유도 중합 반응을 포함하는 방법을 사용하여 형성될 수 있으며:
Figure pct00073
이는 랜덤, 블록, 디블록, 멀티블록, 구배, 또는 기타 적합한 유형의 공중합으로 수행될 수 있다.
아지드는 기재와 반응하여 중합체를 기재에 공유적으로 커플링할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 하기 노르보르넨 기를 포함하는 기재 위에 증착될 수 있다:
상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타낸다. 노르보르넨기는 작용화(예를 들어, 치환될 수 있거나 헤테로(노르보르넨)을 포함할 수 있음)될 수 있고, 미국 특허 제9,994,687호에 기술된 바와 같은 방식으로 기재에 커플링될 수 있으며, 이의 전체 내용은 본원에서 참고로 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 제9,994,687호에 기술된 바와 같은 1,3-쌍극성 고리첨가를 사용하여 중합체의 아지드(N3)기를 노르보르넨기와 반응시켜 중합체를 기재에 커플링할 수 있다. 이어서, 이러한 중합체의 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴은 활성 모이어티 DBCO로 전환될 수 있고, 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응하여 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 방식으로 올리고뉴클레오티드를 중합체 및 기재에 커플링할 수 있다.
일부 예에서, 아지드 작용화된 중합체는 하기 구조를 갖는 아크릴아미드-아지도아크릴아미드-(3-(하이드록시메틸)-2-나프톨)아크릴아미드 공중합체를 포함한다:
상기 식에서, m은 50 내지 100,000이고, n은 5 내지 10,000이며, x는 5 내지 10,000이다.
이러한 중합체는 라디칼-유도 공중합 반응을 포함하는 방법으로 제조될 수 있으며:
Figure pct00076
이는 랜덤, 블록, 디블록, 멀티블록, 구배, 또는 기타 적합한 유형의 공중합으로 수행될 수 있다. 아지드는 기재와 반응하여 중합체를 기재에 공유적으로 커플링할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 하기 노르보르넨 기를 포함하는 기재 위에 증착될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제9,994,687호에 기술된 바와 같은 1,3-쌍극성 고리첨가를 사용하여 중합체의 아지드(N3)기를 노르보르넨기와 반응시켜 중합체를 기재에 커플링할 수 있다. 이어서, 이러한 중합체의 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨은 활성 모이어티로 전환될 수 있고, 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응하여 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 방식으로 올리고뉴클레오티드를 중합체 및 기재에 커플링할 수 있다.
일부 예에서, 아지드 작용화된 중합체는 하기 구조를 갖는 아크릴아미드-아지도아크릴아미드-테트라졸아크릴아미드 공중합체를 포함한다:
상기 식에서, m은 50 내지 100,000이고, n은 5 내지 10,000이며, x는 5 내지 10,000이다. 이러한 중합체는 라디칼-유도 공중합 반응을 포함하는 방법으로 제조될 수 있으며:
Figure pct00078
이는 랜덤, 블록, 디블록, 멀티블록, 구배, 또는 기타 적합한 유형의 공중합으로 수행될 수 있다. 아지드는 기재와 반응하여 중합체를 기재에 공유적으로 커플링할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 하기 노르보르넨 기를 포함하는 기재 위에 증착될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제9,994,687호에 기술된 바와 같은 1,3-쌍극성 고리첨가를 사용하여 중합체의 아지드(N3)기를 노르보르넨기와 반응시켜 중합체를 기재에 커플링할 수 있다. 이어서, 이러한 중합체의 테트라졸은 활성 모이어티로 전환될 수 있고, 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응하여 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 방식으로 올리고뉴클레오티드를 중합체 및 기재에 커플링할 수 있다.
일부 예에서, 아지드 작용화된 중합체는 하기 구조를 갖는 아크릴아미드-아지도아크릴아미드-아지린아크릴아미드 공중합체를 포함한다:
상기 식에서, m은 50 내지 100,000이고, n은 5 내지 10,000이며, x는 5 내지 10,000이다.
이러한 중합체는 라디칼-유도 공중합 반응을 포함하는 방법으로 제조될 수 있으며:
Figure pct00080
이는 랜덤, 블록, 디블록, 멀티블록, 구배, 또는 기타 적합한 유형의 공중합으로 수행될 수 있다. 아지드는 기재와 반응하여 중합체를 기재에 공유적으로 커플링할 수 있다. 예를 들어, 중합체는 하기 노르보르넨 기를 포함하는 기재 위에 증착될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제9,994,687호에 기술된 바와 같은 1,3-쌍극성 고리첨가를 사용하여 중합체의 아지드(N3)기를 노르보르넨기와 반응시켜 중합체를 기재에 커플링할 수 있다. 이어서, 이러한 중합체의 2H-아지린은 활성 모이어티로 전환될 수 있고, 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응하여 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 방식으로 올리고뉴클레오티드를 중합체 및 기재에 커플링할 수 있다.
일부 예에서, 중합체는 하기 구조를 갖는 공중합체를 포함한다:
상기 식에서, x는 50 내지 100,000이고, y는 5 내지 20,000이며, R은 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 요소의 비제한적인 예는 본원의 다른 곳에서 설명된다.
이러한 중합체는 PAZAM과 작용화된 알킨()의 클릭 화학 반응을 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:
상기 식에서, 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
및 . 이러한 클릭 화학 반응의 좌측에 있는 중합체는 본원의 다른 곳에서 설명된 것과 유사한 라디칼-유도 중합을 사용하여 제조될 수 있다. 광은 중합체의 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨 또는 2H-아지린을 활성 모이어티로 전환하고; 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 데 사용될 수 있다.
일부 예에서, 공중합체는 하기 구조를 갖는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드-코-N-(5-트리아졸릴아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드) 중합체를 포함한다:
상기 식에서, R은 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 요소의 비제한적인 예는 본원의 다른 곳에서 설명된다.
이러한 중합체는 아지드 작용성 중합체인 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드)와 작용화된 알킨()과의 클릭 화학 반응으로 제조될 수 있다:
상기 식에서, 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
및 . 이러한 클릭 화학 반응의 좌측에 있는 중합체는 본원의 다른 곳에서 설명된 것과 유사한 라디칼-유도 중합을 사용하여 제조될 수 있다. 광은 중합체의 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨 또는 2H-아지린을 활성 모이어티로 전환하고; 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 데 사용될 수 있다.
많은 상이한 유형의 광 활성화 가능 모이어티를 갖는 많은 상이한 중합체가 본원의 교시에 기초하여 구상될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 존재하는 중합체 중 임의의 것은 블록 공중합체일 수 있거나, 랜덤하게 분포된 공중합체일 수 있거나, 이들 둘의 임의의 적합한 조합일 수 있다. 또한, 알킨을 제한 없이 포함하는 임의의 적합한 아지드 반응성 기는 불활성 모이어티를 중합체에 커플링하기 위해 불활성 모이어티에 커플링될 수 있다는 사실을 이해할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명의 중합체 및 방법을 사용하여 많은 상이한 기재를 작용화할 수 있다는 사실을 이해할 수 있을 것이다. 예시적으로, 본원의 일부 예는 작용성 중합체 코팅된 표면을 제조하는 방법으로서,
,
노르보르넨 실란화된 표면을 아지드 작용성 중합체(이의 비제한적인 예는 본원의 다른 곳에서 제공됨)와 반응시킨 다음, 나머지 아지드기를 아지드 반응성 기에 커플링된 불활성 모이어티와 반응시키는, 작용성 중합체 코팅된 표면을 제조하는 방법을 제공한다. 하나의 비제한적인 예에서, 아지드 반응성 기는 알킨기를 포함한다. 비제한적인 예에서, 불활성 모이어티는 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이어서, 불활성 모이어티(예를 들어, 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨 또는 2H-아지린)은 광을 사용하여 활성 모이어티로 전환될 수 있으며, 활성 모이어티는 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 방식으로 올리고뉴클레오티드에 커플링된다.
추가 주석
본 발명의 중합체, 조성물 및 방법은 주형 폴리뉴클레오티드 증폭과 같은 임의의 적합한 용도에 사용될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 사용하여 "가교 증폭" 또는 "표면 결합된 폴리머라제 연쇄 반응"을 수행할 수 있지만, 본 발명의 조성물은 다른 증폭 양식과 함께 사용하도록 쉽게 적응될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 이러한 증폭 양식 중 하나는 "배제 증폭" 또는 ExAmp이다. 배제 증폭 방법은 기재 영역 당 단일 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 및 기재 영역에서 실질적으로 앰플리콘의 단일클론 집단의 생성을 허용할 수 있다. 예를 들어, 기재영역 내에서 제1 포획된 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭 속도는 기재 영역에서 표적 폴리뉴클레오티드의 훨씬 더 느린 이송 및 포획의 속도에 비해 더 신속할 수 있다. 이와 같이, 기재 영역에 포획된 제1 표적 폴리뉴클레오티드는 신속하게 증폭되고 전체 기재 영역을 채우므로, 동일한 기재 영역에서 추가적인 표적 폴리뉴클레오티드의 포획을 억제할 수 있다. 대안적으로, 제2 표적 폴리뉴클레오티드가 제1 폴리뉴클레오티드 이후에 동일한 기재 영역에 부착되는 경우, 제1 폴리뉴클레오티드의 상대적으로 신속한 증폭은 기재 영역을 채우기에 충분하여 합성에 의한 서열분석을 수행하기에 충분히 강한 신호를 생성할 수 있다(예를 들어, 기재 영역은 적어도 기능적으로 단일클론일 수 있음). 배제 증폭의 사용은 또한 단일클론 기재 영역의 초푸아송 분포를 초래할 수 있고; 즉, 기능적으로 단일클론인 어레이 내 기재 영역의 분획은 푸아송 분포에 의해 예측된 분획을 초과할 수 있다.
더욱 기능적으로 단일클론인 기재 영역이 더 높은 품질 신호를 생성할 수 있고, 따라서 SBS를 개선시킬 수 있기 때문에 유용한 클러스터의 초푸아송 분포를 증가시키는 것이 유용하고; 그러나, 표적 폴리뉴클레오티드를 기재 영역에 시딩하는 것은 공간적 푸아송 분포를 따를 수 있으며, 여기서 점유된 기재 영역의 수를 증가시키기 위한 트레이드오프는 다중클론 기재 영역의 수를 증가시킨다. 더 높은 초푸아송 분포를 얻는 한 가지 방법은 시딩이 신속하게 발생하고, 이어서 시딩된 표적 폴리뉴클레오티드 사이에 지연이 후속되는 것이다. 생화학적 반응 속도론을 통해 발생하는 것으로 생각되기 때문에, "운동학적 지연"이라고 하는 지연은 하나의 시딩된 표적 폴리뉴클레오티드에 다른 시딩된 표적보다 빠른 시작을 제공한다. 배제 증폭은 재조합효소가 서열 매칭을 매개할 때 이중 가닥 DNA(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드) 내로 프라이머(예를 들어, 기판 영역에 부착된 프라이머)의 침습을 용이하게 하기 위해 재조합효소를 사용함으로써 작용한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 재조합효소가 서열 매칭을 매개할 때 본 발명의 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머의 본 표적 폴리뉴클레오티드로의 침입을 용이하게 하기 위해 재조합효소와 함께 사용하도록 조정될 수 있다. 실제로, 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 표면 기반 폴리뉴클레오티드 증폭 방법, 예를 들어 열 PCR, 화학적으로 변성된 PCR, 및 효소적으로 매개된 방법(재조합효소 중합효소 증폭(RPA) 또는 ExAmp로도 지칭될 수 있음)과 함께 사용하도록 조정될 수 있다.
다양한 예시적인 예가 위에서 설명되어 있지만, 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 속하는 이러한 모든 변경 및 수정을 포함하도록 의도된다.
본원에서 기술되는 바와 같은 본 개시내용의 각각의 양태의 임의의 각각의 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있으며, 이러한 양태 중 임의의 하나 이상의 양태로부터의 임의의 특징/예는 본원에서 기술되는 바와 같은 이익을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 본원에서 기술되는 바와 같은 다른 양태(들)의 임의의 특징과 함께 구현될 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (58)

  1. 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법으로서:
    중합체의 제1 영역의 불활성 모이어티를 광으로 선택적으로 조사하는 동시에 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티를 조사하지 않아 중합체의 제1 영역의 제1 활성 모이어티를 생성하는 단계;
    상기 제1 활성 모이어티를 제1 올리고뉴클레오티드에 커플링하는 단계;
    상기 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티를 광으로 조사하여 중합체의 제2 영역의 제2 활성 모이어티를 생성하는 단계; 및
    상기 제2 활성 모이어티를 제2 올리고뉴클레오티드에 커플링하는 단계를 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중합체의 제1 영역 또는 상기 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴을 포함하는, 방법:

    상기 식에서, R3 및 R4 중 하나는 R1이며 다른 하나는 H이고; R1은 중합체의 골격에 대한 결합이며; X는 CH2, O, S, 또는 R4가 X에 직접 커플링되지 않은 경우 NH이거나, 또는 X는 CH 또는 R4가 X에 직접 커플링되는 경우 N임.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 활성 모이어티 또는 상기 제2 활성 모이어티는 하기의 디벤조사이클로옥틴을 포함하는, 방법:
    .
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 디벤조사이클로옥틴과 반응하는 아지드(N3)에 커플링되어 하기 구조를 갖는 사이클로 부가물(cycloadduct)을 형성하는, 방법:

    상기 식에서, R2는 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 나타냄.
  5. 제1항에 있어서, 상기 중합체의 제1 영역 또는 상기 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 테트라졸을 포함하는, 방법:

    상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타냄.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 활성 모이어티 또는 상기 제2 활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 니트릴 이민을 포함하는, 방법:
    .
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 활성 모이어티 또는 상기 제2 활성 모이어티와 반응하는 올레핀에 커플링되어 하기 구조를 갖는 피라졸린을 형성하는, 방법:

    상기 식에서, R2는 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 나타냄.
  8. 제1항에 있어서, 상기 중합체의 제1 영역 또는 상기 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨을 포함하는, 방법:

    상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타냄.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제1 활성 모이어티 또는 상기 제2 활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 화합물을 포함하는, 방법:
    .
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 활성 모이어티 또는 상기 제2 활성 모이어티와 반응하는 비닐 에테르에 커플링되어 하기 구조를 갖는 벤조크로만을 형성하는, 방법:

    상기 식에서, R2는 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 나타냄.
  11. 제1항에 있어서, 상기 중합체의 제1 영역 또는 상기 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 2H-아지린을 포함하는, 방법:

    상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타냄.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 활성 모이어티 또는 상기 제2 활성 모이어티는 하기 구조를 갖는 니트릴 일리드를 포함하는, 방법:
    .
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 활성 모이어티 또는 상기 제2 활성 모이어티와 반응하는 올레핀에 커플링되어 하기 구조를 갖는 피롤린을 형성하는, 방법:

    상기 식에서, R2는 제1 올리고뉴클레오티드 또는 제2 올리고뉴클레오티드를 나타냄.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드는 절제 모이어티(excision moiety)가 결여된 제1 프라이머 및 절제 모이어티를 포함하는 제2 프라이머의 혼합물을 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 절제 모이어티를 포함하는 제3 프라이머 및 절제 모이어티가 결여된 제4 프라이머의 혼합물을 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제1 프라이머와 상기 제3 프라이머는 절제 모이어티를 제외하고는 서로 동일한 서열을 갖고, 상기 제2 프라이머와 상기 제4 프라이머는 절제 모이어티를 제외하고는 서로 동일한 서열을 갖는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 제1 프라이머와 상기 제2 프라이머의 서열은 서로 직교하고, 상기 제3 프라이머와 상기 제4 프라이머의 서열은 서로 직교하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체의 제1 영역은 복수의 제1 하위 영역을 포함하고, 상기 중합체의 제2 영역은 복수의 제2 하위 영역을 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 각각의 제1 하위 영역은 상기 제2 하위 영역 중 대응하는 하위 영역과 인접해 있는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 각각의 제1 하위 영역, 및 상기 제1 하위 영역과 인접해 있는 상기 제2 하위 영역 중 대응하는 하위 영역은 웰 내에 위치하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 영역 및 상기 제2 영역 위에 포토레지스트를 증착하는 단계;
    상기 중합체의 제1 영역의 불활성 모이어티를 광으로 선택적으로 조사하는 동시에, 상기 중합체의 제2 영역의 불활성 모이어티는 선택적으로 조사하지 않고, 상기 제1 영역 위의 포토레지스트를 광으로 조사하는 단계;
    상기 제1 활성 모이어티를 상기 제1 올리고뉴클레오티드에 커플링하기 전에 상기 중합체의 제1 영역으로부터 조사된 포토레지스트를 제거하는 단계; 및
    상기 제2 활성 모이어티를 상기 제2 올리고뉴클레오티드에 커플링하기 전에 상기 중합체의 제2 영역으로부터 포토레지스트를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 서로 공통 단계에서, 상기 조사된 포토레지스트는 상기 중합체의 제1 영역으로부터 제거되고 상기 포토레지스트는 중합체의 제2 영역으로부터 제거되는, 방법.
  23. 하기 구조를 갖는 폴리(사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴-아크릴아미드-코-아크릴아미드) 공중합체를 포함하는 중합체:
    .
  24. 하기 구조를 갖는 폴리(디벤조사이클로옥틴-아크릴아미드-코-아크릴아미드) 공중합체를 포함하는 중합체:
    .
  25. 하기 라디칼-유도 중합 반응을 포함하는 중합체의 제조 방법:
    Figure pct00108
    .
  26. 하기 광-유도 반응을 포함하는 중합체의 제조 방법:
    .
  27. 하기 구조를 포함하는 중합체:
    .
  28. 하기 라디칼-유도 중합 반응을 포함하는 중합체의 제조 방법:
    Figure pct00111
    .
  29. 기재를 작용화하는 방법으로서:
    하기 노르보르넨기를 포함하는 기재를 제공하는 단계:

    (상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타냄);
    상기 기재 위에 하기 구조를 포함하는 중합체를 증착하는 단계;
    ; 및
    상기 중합체의 아지드(N3)기를 상기 노르보르넨기와 반응시켜 상기 중합체를 상기 기재에 커플링하는 단계를 포함하는, 기재를 작용화하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 제28항의 방법을 사용하여 중합체를 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 광을 사용하여 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴을 디벤조사이클로옥틴으로 전환하는 단계를 추가로 포함하는 방법:

    상기 식에서, R1은 중합체의 골격에 대한 결합을 나타냄.
  32. 제31항에 있어서, 상기 디벤조사이클로옥틴을 올리고뉴클레오티드(R2)에 커플링된 아지드(N3)와 반응시켜 하기 구조를 갖는 테트라졸을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법:
    .
  33. 제29항의 방법을 사용하여 중합체를 기재에 커플링시킴으로써 제조된 조성물.
  34. 기재 상에 배치된 제23항, 제24항 또는 제27항 중 어느 한 항의 중합체를 포함하는 조성물.
  35. 하기 구조를 갖는 중합체:
    .
  36. 하기 라디칼-유도 공중합 반응을 포함하는 중합체의 제조 방법:
    Figure pct00117
    .
  37. 기재를 작용화하는 방법으로서:
    하기 노르보르넨기를 포함하는 기재를 제공하는 단계:

    (상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타냄);
    상기 기재 위에 하기 구조를 포함하는 중합체를 증착하는 단계;
    ; 및
    상기 중합체의 아지드(N3)기를 상기 노르보르넨기와 반응시켜 상기 중합체를 상기 기재에 커플링하는 단계를 포함하는, 기재를 작용화하는 방법.
  38. 제37항의 방법을 사용하여 중합체를 기재에 커플링시킴으로써 제조된 조성물.
  39. 중합체를 작용화하는 방법으로서:
    제38항의 조성물의 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨을 광을 이용하여 활성 모이어티로 전환하는 단계; 및
    상기 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 중합체에 커플링하는 단계를 포함하는, 중합체를 작용화하는 방법.
  40. 하기 구조를 갖는 중합체:
    .
  41. 하기 라디칼-유도 공중합 반응을 포함하는 중합체의 제조 방법:
    Figure pct00121
    .
  42. 기재를 작용화하는 방법으로서:
    하기 노르보르넨기를 포함하는 기재를 제공하는 단계:

    (상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타냄);
    상기 기재 위에 하기 구조를 포함하는 중합체를 증착하는 단계;
    ; 및
    상기 중합체의 아지드(N3)기를 상기 노르보르넨기와 반응시켜 상기 중합체를 상기 기재에 커플링하는 단계를 포함하는, 기재를 작용화하는 방법.
  43. 제42항의 방법을 사용하여 중합체를 기재에 커플링시킴으로써 제조된 조성물.
  44. 중합체를 작용화하는 방법으로서:
    제43항의 조성물의 테트라졸을 광을 이용하여 니트릴 이민 활성 모이어티로 전환하는 단계; 및
    상기 니트릴 이민 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 중합체에 커플링하는 단계를 포함하는, 중합체를 작용화하는 방법.
  45. 하기 구조를 갖는 중합체:
    .
  46. 하기 라디칼-유도 공중합 반응을 포함하는 중합체의 제조 방법:
    Figure pct00125
    .
  47. 기재를 작용화하는 방법으로서:
    하기 노르보르넨기를 포함하는 기재를 제공하는 단계:

    (상기 식에서, 점선은 기재의 표면을 나타냄);
    상기 기재 위에 하기 구조를 포함하는 중합체를 증착하는 단계;
    ; 및
    상기 중합체의 아지드(N3)기를 상기 노르보르넨기와 반응시켜 상기 중합체를 상기 기재에 커플링하는 단계를 포함하는, 기재를 작용화하는 방법.
  48. 제42항의 방법을 사용하여 중합체를 기재에 커플링시킴으로써 제조된 조성물.
  49. 중합체를 작용화하는 방법으로서:
    제43항의 조성물의 2H-아지린을 광을 이용하여 니트릴 일리드 활성 모이어티로 전환하는 단계; 및
    상기 니트릴 일리드 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 중합체에 커플링하는 단계를 포함하는, 중합체를 작용화하는 방법.
  50. 하기 구조를 갖는 중합체:

    상기 식에서, R은 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택됨.
  51. 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM)와 작용화된 알킨()과의 클릭 화학 반응(click chemistry reaction)을 포함하는 중합체의 제조 방법:

    상기 식에서, 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:
    및 .
  52. 중합체를 작용화하는 방법으로서:
    광을 사용하여 제51항의 중합체의 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 또는 2H-아지린을 활성 모이어티로 전환하는 단계; 및
    상기 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 중합체에 커플링하는 단계를 포함하는, 중합체를 작용화하는 방법.
  53. 하기 구조를 갖는 중합체:

    상기 식에서, R은 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택됨.
  54. 아지드 작용성 중합체와 작용화된 알킨()과의 클릭 화학 반응을 포함하는 중합체의 제조 방법:

    상기 식에서, 는 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:
    및 .
  55. 중합체를 작용화하는 방법으로서:
    광을 사용하여 제53항의 중합체의 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 또는 2H-아지린을 활성 모이어티로 전환하는 단계; 및
    상기 활성 모이어티를 아지드-커플링된 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 중합체에 커플링하는 단계를 포함하는, 중합체를 작용화하는 방법.
  56. 작용성 중합체 코팅된 표면을 제조하는 방법으로서, 노르보르넨 실란화된 표면을 아지드 작용성 중합체와 반응시킨 다음, 나머지 아지드기를 아지드 반응성 기에 커플링된 불활성 모이어티와 반응시키는, 작용성 중합체 코팅된 표면을 제조하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 아지드 반응성 기는 알킨기를 포함하는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 불활성 모이어티는 사이클로프로페논-차폐된 디벤조사이클로옥틴, 테트라졸, 3-(하이드록시메틸)-2-나프톨, 및 2H-아지린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
KR1020237031500A 2021-03-09 2022-03-04 중합체, 중합체의 제조 방법, 및 올리고뉴클레오티드를 중합체에 커플링하는 방법 KR20230157348A (ko)

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