CN117043354A - 聚合物、制备聚合物的方法以及使寡核苷酸与聚合物偶联的方法 - Google Patents

聚合物、制备聚合物的方法以及使寡核苷酸与聚合物偶联的方法 Download PDF

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Abstract

在一些示例中，提供了一种使寡核苷酸与聚合物偶联的方法。可用光选择性地照射聚合物的第一区域中的非活性部分，而不照射该聚合物的第二区域中的非活性部分，以在该聚合物的该第一区域中产生第一活性部分。该第一活性部分可与第一寡核苷酸偶联。可用光照射该聚合物的该第二区域中的该非活性部分以在该聚合物的该第二区域中产生第二活性部分。该第二活性部分可与第二寡核苷酸偶联。

Description

聚合物、制备聚合物的方法以及使寡核苷酸与聚合物偶联的 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年3月9日提交并且名称为“聚合物、制备聚合物的方法以及使寡核苷酸与聚合物偶联的方法(POLYMERS,METHODS OF MAKING POLYMERS,AND METHODS OFCOUPLING OLIGONUCLEOTIDES TO POLYMERS)”的美国临时专利申请号63/158,470的权益，该临时专利申请的全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本申请涉及用于制备聚合物以及使寡核苷酸与聚合物偶联的组合物和方法。
背景技术
簇扩增是扩增多核苷酸的方法，例如用于基因测序。靶多核苷酸由流通池中与基底表面偶联的引物(例如，P5和P7引物)捕获，并且在该表面上的随机位置处形成“种子”。执行扩增循环以在每个种子周围的表面上形成簇。这些簇包括种子多核苷酸的拷贝和互补拷贝。在一些情况下，将基底图案化以便限定结合不同簇的区域，诸如可填充有相应簇的孔。
发明内容
本文所提供的示例涉及聚合物、制备聚合物的方法以及使寡核苷酸与聚合物偶联的方法。
本文的一些示例提供一种使寡核苷酸与聚合物偶联的方法。该方法可以包括用光选择性地照射聚合物的第一区域中的非活性部分，而不照射聚合物的第二区域中的非活性部分，以在聚合物的第一区域中产生第一活性部分。该方法可以包括使第一活性部分与第一寡核苷酸偶联。该方法可以包括用光照射聚合物的第二区域中的非活性部分以在聚合物的第二区域中产生第二活性部分。该方法可以包括使第二活性部分与第二寡核苷酸偶联。
在一些示例中，聚合物的第一区域中或聚合物的第二区域中的非活性部分包括具有以下结构的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔：
其中R3和R4中的一者是R1，并且另一者是H；其中R1是连至聚合物的主链的连接基团；并且其中若R4不直接与X偶联，则X是CH2、O、S或NH，或者其中若R4直接与X偶联，则X是CH或N。在一些示例中，第一活性部分或第二活性部分包括二苯并环辛炔：
在一些示例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与叠氮化物(N3)偶联，该叠氮化物与二苯并环辛炔反应以形成具有以下结构的环加合物：
其中R2表示第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
在一些示例中，聚合物的第一区域中或聚合物的第二区域中的非活性部分包括具有以下结构的四唑：
其中R1表示连至聚合物的主链的连接基团。在一些示例中，第一活性部分或第二活性部分包括具有以下结构的腈亚胺：
在一些示例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与烯烃偶联，该烯烃与第一活性部分或第二活性部分反应以形成具有以下结构的吡唑啉：
其中R2表示第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
在一些示例中，聚合物的第一区域中或聚合物的第二区域中的非活性部分包括具有以下结构的3-(羟甲基)-2-萘酚：
其中R1表示连至聚合物的主链的连接基团。在一些示例中，第一活性部分或第二活性部分包括具有以下结构的化合物：
在一些示例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与乙烯基醚偶联，该乙烯基醚与第一活性部分或第二活性部分反应以形成具有以下结构的苯并色满：
其中R2表示第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
在一些示例中，聚合物的第一区域中或聚合物的第二区域中的非活性部分包括具有以下结构的2H-氮丙啶：
其中R1表示连至聚合物的主链的连接基团。在一些示例中，第一活性部分或第二活性部分包括具有以下结构的腈叶立德：
在一些示例中，第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与烯烃偶联，该烯烃与第一活性部分或第二活性部分反应以形成具有以下结构的吡咯啉：
其中R2表示第一寡核苷酸或第二寡核苷酸。
在一些示例中，第一寡核苷酸包含缺乏切除部分的第一引物和包括切除部分的第二引物的混合物。在一些示例中，第二寡核苷酸包含包括切除部分的第三引物和缺乏切除部分的第四引物的混合物。在一些示例中，第一引物和第三引物除切除部分外具有彼此相同的序列，并且第二引物和第四引物除切除部分外具有彼此相同的序列。在一些示例中，第一引物和第二引物的序列彼此正交，并且第三引物和第四引物的序列彼此正交。
在一些示例中，聚合物的第一区域包括多个第一子区域，并且聚合物的第二区域包括多个第二子区域。在一些示例中，第一子区域中的每个第一子区域与第二子区域中对应的一个第二子区域接续。在一些示例中，第一子区域中的每个第一子区域以及第二子区域中与该第一子区域接续的对应的一个第二子区域位于孔内。
在一些示例中，该方法还包括在第一区域和第二区域上方沉积光致抗蚀剂。该方法还可以包括，在用光选择性地照射聚合物的第一区域中的非活性部分而不照射聚合物的第二区域中的非活性部分时，用光照射第一区域上方的光致抗蚀剂。该方法还可以包括，在使第一活性部分与第一寡核苷酸偶联之前，从聚合物的第一区域去除经照射的光致抗蚀剂。该方法还可以包括，在使第二活性部分与第二寡核苷酸偶联之前，从聚合物的第二区域去除光致抗蚀剂。
在一些示例中，将经照射的光致抗蚀剂从聚合物的第一区域去除并且将光致抗蚀剂从聚合物的第二区域去除。
本文的一些示例提供一种聚合物，该聚合物包括具有以下结构的聚(环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔-丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)共聚物：
本文的一些示例提供一种聚合物，该聚合物包括具有以下结构的聚(二苯并环辛炔-丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)共聚物：
本文的一些示例提供一种制备聚合物的方法。该方法可以包括自由基诱导的聚合反应：
本文的一些示例提供一种制备聚合物的方法。该方法可以包括光诱导的反应：
本文的一些示例提供一种包括以下结构的聚合物：
本文的一些示例提供一种制备聚合物的方法。该方法可以包括自由基诱导的聚合反应：
本文的一些示例提供一种使基底官能化的方法。该方法可以包括提供包括降冰片烯基团的基底：
其中虚线表示基底的表面。该方法可以包括将包括以下结构的聚合物沉积到基底上：
该方法可以包括使该聚合物的叠氮化物(N3)基团与降冰片烯基团反应以使该聚合物与该基底偶联。
在一些示例中，该方法还包括使用上述方法制备该聚合物。在一些示例中，该方法还包括使用光将环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔转化为二苯并环辛炔：
其中R1表示连至聚合物的主链的连接基团。在一些示例中，该方法还包括使二苯并环辛炔和与寡核苷酸(R2)偶联的叠氮化物(N3)反应以形成具有以下结构的四唑：
本文的一些示例提供一种组合物，该组合物使用包括以下的操作进行制备：使用上述方法使聚合物与基底偶联。
本文的一些示例提供一种组合物，该组合物包括安置在基底上的上述聚合物中的任一聚合物。
本文的一些示例提供一种具有以下结构的聚合物：
本文的一些示例提供一种制备聚合物的方法。该方法可以包括自由基诱导的共聚反应：
本文的一些示例提供一种使基底官能化的方法，该方法可以包括提供包括降冰片烯基团的基底：
其中虚线表示基底的表面。该方法可以包括将包括以下结构的聚合物沉积到基底上：
该方法可以包括使该聚合物的叠氮化物(N3)基团与降冰片烯基团反应以使该聚合物与该基底偶联。
本文的一些示例提供一种组合物，该组合物通过使用上述方法使聚合物与基底偶联来制备。
本文的一些示例提供一种使聚合物官能化的方法。该方法可以包括使用光将上述组合物的3-(羟甲基)-2-萘酚转化为活性部分。该方法可以包括使活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使寡核苷酸与聚合物偶联。
本文的一些示例提供一种具有以下结构的聚合物：
本文的一些示例提供一种制备聚合物的方法。该方法可以包括自由基诱导的共聚反应：
本文的一些示例提供一种使基底官能化的方法。该方法可以包括提供包括降冰片烯基团的基底：
其中虚线表示基底的表面。该方法可以包括将包括以下结构的聚合物沉积到基底上：
该方法可以包括使该聚合物的叠氮化物(N3)基团与降冰片烯基团反应以使该聚合物与该基底偶联。
本文的一些示例提供组合物，该组合物通过使用上述方法使聚合物与基底偶联来制备。
本文的一些示例提供一种使聚合物官能化的方法。该方法可以包括使用光将上述组合物的四唑转化为腈亚胺活性部分。该方法也可以包括使腈亚胺活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使寡核苷酸与聚合物偶联。
本文的一些示例提供一种具有以下结构的聚合物：
本文的一些示例提供一种制备聚合物的方法。该方法可以包括自由基诱导的共聚反应：
本文的一些示例提供一种使基底官能化的方法。该方法可以包括提供包括降冰片烯基团的基底：
其中虚线表示基底的表面。该方法可以包括将包括以下结构的聚合物沉积到基底上：
该方法可以包括使该聚合物的叠氮化物(N3)基团与降冰片烯基团反应以使该聚合物与该基底偶联。
本文的一些示例提供一种组合物，该组合物通过使用上述方法使聚合物与基底偶联来制备。
本文的一些示例提供使聚合物官能化的方法。该方法可以包括使用光将上述组合物的2H-氮丙啶转化为腈叶立德活性部分。该方法可以包括使腈叶立德活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使寡核苷酸与聚合物偶联。
本文的一些示例提供一种具有以下结构的聚合物：
其中R选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。
本文的一些示例提供一种制备聚合物的方法。该方法可以包括聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)与官能化炔烃的点击化学反应：
/>
其中选自由以下项组成的组：
本文的一些示例提供一种使聚合物官能化的方法。该方法可以包括使用光将上述聚合物的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚或2H-氮丙啶转化为活性部分。该方法可以包括使活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使寡核苷酸与聚合物偶联。
本文的一些示例提供一种具有以下结构的聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺-共-N-(5-三唑基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺)聚合物：
其中R选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。
本文的一些示例提供一种制备聚合物的方法。该方法可以包括叠氮化物官能聚合物与官能化炔烃的点击化学反应：/>
其中选自由以下项组成的组：
本文的一些示例提供一种使聚合物官能化的方法。该方法可以包括使用光将上述聚合物的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚或2H-氮丙啶转化为活性部分。该方法可以包括使活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使寡核苷酸与聚合物偶联。
本文的一些示例提供一种制备涂覆有官能聚合物的表面的方法，其中使降冰片烯硅烷化表面与叠氮化物官能聚合物反应，并且然后使剩余的叠氮化物基团和与叠氮化物反应性基团偶联的非活性部分反应。
在一些示例中，叠氮化物反应性基团包括炔烃基团。在一些示例中，非活性部分选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。
应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其它(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。
附图说明
图1示意性地示出了在基底上扩增多核苷酸的示例，该基底在基底的第一区域和第二区域中包括不同的寡核苷酸。
图2A-图2D示意性地示出了在基底的第一区域和第二区域中使用不同的寡核苷酸扩增多核苷酸的工艺流程中的示例性组合物和操作。
图3A-图3H示意性地示出了在使不同的寡核苷酸与安置在基底上的聚合物的第一区域和第二区域偶联的工艺流程中的示例性组合物和操作。
图4A-图4E示意性地示出了在使不同的寡核苷酸与安置在基底上的聚合物的第一区域和第二区域的阵列偶联的工艺流程中的示例性组合物和操作。
图5示出了使不同的寡核苷酸与聚合物的第一区域和第二区域偶联的方法中的示例性操作流程。
具体实施方式
本文所提供的示例涉及聚合物、制备聚合物的方法以及使寡核苷酸与聚合物偶联的方法。
可能期望使用官能化聚合物进行边合成边测序(SBS)以测定簇中的靶多核苷酸的序列。图1示意性地示出了在基底上扩增多核苷酸的示例，该基底在基底的第一区域和第二区域中包括不同的寡核苷酸。该基底可以包括第一区域101和第二区域102，该第一区域和第二区域可以诸如参考图2A所描述的方式被官能化以便包括彼此不同的寡核苷酸。可能期望在区域101、102两者中对相同靶多核苷酸的扩增子执行同时双端读段以便提高读段的可靠性，例如通过沿区域101中的第一方向和沿区域102中的相反方向对扩增子执行SBS读段，并且然后使用软件对齐结果，这些结果应该彼此互补并且因此指示彼此相同的序列。如图1所示，在基底区域102(或等同地，基底区域101)上捕获和扩增种子111(靶多核苷酸)可以产生基本上覆盖第一区域121和第二区域122并且可以容易地用于同时双端读段的单克隆簇。
以不同方式官能化基底的不同区域-诸如在基底的不同区域中提供不同的寡核苷酸-可以促进适于同时双端读段的靶核苷酸簇的制备。例如，图2A-图2D示意性地示出了在基底的第一区域和第二区域中使用不同的寡核苷酸扩增多核苷酸的工艺流程中的示例性组合物和操作。首先参考图2A，组合物2000包括基底200和与其偶联的多个寡核苷酸，诸如引物。在该示例中，基底200包括可彼此相邻的第一区域201和第二区域202，其中界面203介于两者之间。第一区域201和第二区域202可以被不同地官能化，更具体地具有与其偶联的不同捕获引物。例如，捕获引物231可与基底200的第一区域201偶联，并且捕获引物241可与基底200的第二区域202偶联。捕获引物231和241可以具有彼此相同的序列，不同的是捕获引物241可以包括切除部分243，其可以诸如以下参考图2D所描述的方式使用。正交捕获引物232可以与基底200的第一区域201偶联，并且正交捕获引物242可以与基底的第二区域202偶联。正交捕获引物232和242可以具有彼此相同的序列，不同的是正交捕获引物232可以包括切除部分233，其可以诸如以下参考图2D所描述的方式使用。切除部分233、243可以位于沿任何合适引物的长度的任何合适位置处，并且可以是但不一定是彼此相同类型的切除部分。
如图2A所示，组合物2000还可以包括流体220，该流体包括靶多核苷酸251，例如，待扩增并最终测序的多核苷酸。靶多核苷酸251可以包括与正交捕获引物232、242互补的第一衔接子254和与捕获引物231、241互补的第二衔接子255。捕获引物(例如，正交捕获引物232和242)中的一个或多个捕获引物可以包括切除部分，例如8-氧代-G，其可以诸如参考图2D所描述的方式被切割。
如图2B所示，靶多核苷酸251的衔接子254可以与区域201中的捕获引物232随机杂交，但同等地可以与区域202中的捕获引物242杂交。在此类初始杂交后，可以使用诸如本领域已知的工艺，例如使用表面结合的聚合酶链式反应(PCR)、桥式扩增或链侵入法(其可被称为ExAmp)，来扩增第一靶多核苷酸251，从而形成图2C中所示的扩增子251'。如果重复扩增操作直到第一基底区域201和第二基底区域202基本上填满，则所得扩增子的两个衔接子可能不一定与对应的捕获引物或正交捕获引物杂交，并且因此扩增子可远离基底线性地延伸，如图2C中所示。然后可以通过使合适的酶或试剂与切除部分233反应来去除正交捕获引物232中的部分，并且可以通过使合适的酶或试剂与切除部分243反应来去除捕获引物241中的部分。和切除部分233一起使用的酶或试剂可与和切除部分243一起使用的酶或试剂相同或不同。如图2D所示，切除部分233(如图2C所示)的反应去除第一基底区域201中的一个取向的多核苷酸，并且切除部分243(如图2C所示)的反应去除第二基底区域202中的另一取向的多核苷酸，使得可在两个基底区域中执行同时双端读段。
本申请提供使不同的寡核苷酸(例如，不同的引物)与彼此不同的聚合物的区域偶联的方法的非限制性示例，例如，用于形成参考图1所描述的区域101和102，或用于形成参考图2所描述的区域201和202，并且也提供聚合物和用于形成此类聚合物的方法。
首先，将简单地解释本文中所使用的一些术语。然后，将描述用于使寡核苷酸与聚合物偶联的一些示例性方法和所得组合物，随后描述用于形成聚合物的一些示例性方法和所得聚合物。
术语
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包含(including)”以及如“包含(include)”、“包含(includes)”、和“包含(included)”等其它形式的使用不具限制性。术语“具有(having)”以及如“具有(have)”、“具有(has)”、和“具有(had)”等其它形式的使用不具限制性。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
贯穿本说明书使用的术语“基本上(substantially)”、“大约(approximately)”、和“约(about)”用于描述和说明如归因于加工中的变化的较小的波动。例如，它们可以指小于或等于±10％、如小于或等于±5％、如小于或等于±2％、如小于或等于±1％、如小于或等于±0.5％、如小于或等于±0.2％、如小于或等于±0.1％、如小于或等于±0.05％。
如本文所用，“杂交(hybridize)”打算意指第一多核苷酸与第二多核苷酸沿那些聚合物的长度非共价缔合以形成双链“双螺旋体(duplex)”。举例来说，两个DNA多核苷酸链可通过互补碱基配对而缔合。第一与第二多核苷酸之间的缔合强度随着那些多核苷酸内核苷酸序列之间的互补性而增加。多核苷酸之间的杂交强度可通过熔融温度(Tm)来表征，在该熔融温度下，50％的双链体具有彼此解离的多核苷酸链。彼此“部分”杂交的多核苷酸是指它们具有彼此互补的序列，但是此类序列仅沿它们的长度的一部分彼此杂交以形成部分双链体。“不能”杂交的多核苷酸包括彼此物理分离的那些多核苷酸，使得它们的碱基的数量不够以彼此杂交的方式彼此接触。
如本文所用，术语“核苷酸(nucleotide)”旨在表示包含糖和至少一个磷酸酯基团，并且在一些示例中还包含核碱基的分子。缺乏核碱基的核苷酸可被称为“无碱基(abasic)”的。核苷酸包含脱氧核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、经修饰的肽核苷酸、经修饰的磷酸糖主链核苷酸、和它们的混合物。核苷酸的示例包含单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、单磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷(dADP)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、二磷酸脱氧胸苷(dTDP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、二磷酸脱氧胞苷(dCDP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、二磷酸脱氧尿苷(dUDP)、和三磷酸脱氧尿苷(dUTP)。
如本文所用，术语“核苷酸”也打算涵盖任何核苷酸类似物，该核苷酸类似物是包含与天然存在的核苷酸相比经修饰的核碱基、糖、和/或磷酸酯部分的类型的核苷酸。示例性经修饰的核碱基包含肌苷、黄嘌呤(xathanine)、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤等。如本领域中已知，某些核苷酸类似物无法并入到多核苷酸中，例如如5'-磷酰硫酸腺苷的核苷酸类似物。核苷酸可以包含任何适合数目的磷酸酯，例如三个、四个、五个、六个、或多于六个磷酸酯。
如本文所用，术语“多核苷酸(polynucleotide)”是指包含彼此结合的核苷酸序列的分子。多核苷酸为聚合物的一个非限制性示例。多核苷酸的示例包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、和它们的类似物。多核苷酸可以是核苷酸的单链序列，如RNA或单链DNA；核苷酸的双链序列，如双链DNA；或可以包含核苷酸的单链和双链序列的混合物。双链DNA(dsDNA)包含基因组DNA、以及PCR和扩增产物。单链DNA(ssDNA)可以转化成dsDNA并且反之亦然。多核苷酸可以包含非天然存在的DNA，如对映异构体DNA。多核苷酸中核苷酸的精确序列可为已知或未知的。以下为多核苷酸的示例：基因或基因片段(例如探针、引物、表达的序列标签(EST)或基因表达系列分析(SAGE)标签)、基因组DNA、基因组DNA片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、前述任一者的核酸探针、引物、或扩增复本。
如本文所用，“聚合酶(polymerase)”旨在表示具有通过将核苷酸聚合成多核苷酸来组装多核苷酸的活性位点的酶。聚合酶可以结合引发的单链靶多核苷酸，并且可以将核苷酸依序添加到生长引物以形成具有与靶多核苷酸的序列互补的序列的“互补复制(complementary copy)”多核苷酸。接着，另一聚合酶或相同聚合酶可以通过形成该互补复制多核苷酸的互补复本形成靶核苷酸的复本。此类复本中的任一者可在本文中被称作“扩增子(amplicon)”。DNA聚合酶可以结合到靶多核苷酸并且然后沿靶多核苷酸向下移动，将核苷酸依序添加到生长多核苷酸链(生长扩增子)的3'端处的游离羟基基团。DNA聚合酶可以自DNA模板合成互补DNA分子并且RNA聚合酶可以自DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可以使用短RNA或DNA链(引物)来开始链生长。一些聚合酶可以使它们将碱基添加到链的位点上游的链移位。此类聚合酶可以称为链移位的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链移位活性的示例性聚合酶包含但不限于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus，Bst)聚合酶、外-克列诺(exo-Klenow)聚合酶、或测序级T7外-聚合酶的大片段。一些聚合酶使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换前方链(5'核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有使它们后面的链降解的活性(3'核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或以其它方式修饰以减少或消除3'和/或5'核酸外切酶活性。
如本文所用，术语“引物”定义为可通过游离3'OH基团向其添加核苷酸的多核苷酸。引物可包括3'封闭基团，该封闭基团能够防止聚合直到去除该封闭基团为止。引物可包括在5'末端处的修饰以允许偶联反应或使该引物偶联到另一部分。引物可包括一个或多个部分，该一个或多个部分可在合适的条件(诸如UV光、化学、酶等)下裂解。引物长度可以是任何适合数目个碱基的长度，并且可以包含天然和非天然核苷酸的任何适合组合。靶多核苷酸可以包含“衔接子(adapter)”，该衔接子可与引物杂交(具有与引物互补的序列)，并且可以扩增以便通过将核苷酸添加到引物的游离3'OH基团来产生互补复制多核苷酸。“捕获引物”旨在表示偶联到基底并且可与靶多核苷酸的第二衔接子杂交的引物，而“正交捕获引物”旨在表示偶联到基底并且可与该靶多核苷酸的第一衔接子杂交的引物。第一衔接子可具有与正交捕获引物的序列互补的序列，并且第二衔接子可具有与捕获引物的序列互补的序列。捕获引物和正交捕获引物可具有彼此不同且独立的序列。另外，捕获引物和正交捕获引物可在至少一种其他特性中彼此不同。例如，捕获引物和正交捕获引物可具有彼此不同的长度；捕获引物或正交捕获引物可包括该捕获引物或该正交捕获引物中的另一者缺乏的非核酸部分(诸如封闭基团或切除部分)；或此类特性的任何合适组合。
如本文所用，术语“基底”是指用作本文所描述的组合物的支撑物的材料。示例性基底材料可包含玻璃、二氧化硅、塑料、石英、金属、金属氧化物、有机硅酸酯(例如，多面体有机倍半硅氧烷(POSS))、聚丙烯酸酯、氧化钽、互补金属氧化物半导体(CMOS)、或它们的组合。POSS的示例可以是描述于Kehagias等人，《微电子工程改造(MicroelectronicEngineering)》86(2009)，第776-778页中的POSS，该文献以全文引用的方式并入。在一些示例中，本申请中使用的基底包含二氧化硅类基底，如玻璃、熔融硅石、或其它含二氧化硅材料。在一些示例中，基底可以包含硅、氮化硅、或氢化硅酮。在一些示例中，本申请中使用的基底包含塑料材料或组分，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯、和聚(甲基丙烯酸甲酯)。示例性塑料材料包含聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、和环烯烃聚合物基底。在一些示例中，基底为或包含二氧化硅类材料或塑料材料或它们的组合。在具体示例中，基底具有至少一个包括玻璃或硅类聚合物的表面。在一些示例中，基底可包含金属。在一些此类示例中，金属为金。在一些示例中，基底具有至少一个包括金属氧化物的表面。在一个示例中，表面包括氧化钽或氧化锡。丙烯酰胺、烯酮、或丙烯酸酯也可用作基底材料或组分。其它基底材料可包含但不限于砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物、和共聚物。在一些示例中，基底和/或基底表面可以是或包含石英。在一些其它示例中，基底和/或基底表面可为或包含例如GaAs或ITO的半导体。前述列表旨在说明但不限于本申请。基底可包括单一材料或多种不同材料。基底可以是复合物或层合物。在一些示例中，基底包括有机硅酸酯材料。基底可以是平坦的、圆形的、球形的、杆状的、或任何其它适合的形状。基底可以是刚性的或柔性的。在一些示例中，基底为珠粒或流通池。
在一些示例中，基底包含图案化表面。“图案化表面(patterned surface)”是指在基底的暴露层中或上的不同区域的布置。举例来说，区域中的一者或多者可以是其中存在一个或多个捕获引物的特征部。特征部可以由其中不存在捕获引物的间隙区域分隔开。在一些示例中，图案可为成行和成列的x-y形式的特征部。在一些示例中，图案可以是重复布置的特征部和/或间隙区域。在一些示例中，图案可为随机布置的特征部和/或间隙区域。在一些示例中，基底在表面中包含孔(凹陷)的阵列。孔可由基本上竖直的侧壁提供。孔可如本领域通常已知的那样使用多种技术来制造，这些技术包含但不限于光刻、压印技术、模制技术、和微蚀刻技术。本领域的技术人员将会知道，所使用的技术将取决于阵列基底的组成和形状。
基底的图案化表面中的特征部可包括玻璃、硅、塑料或其它具有诸如本文所提供的图案化聚合物的合适材料上的孔阵列中的孔(例如微孔或纳米孔)。在一个示例中，聚合物包括共价连接凝胶，诸如聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。图案化可以提供可用于测序的聚合物垫，例如该聚合物垫在具有大量循环的测序运行中可为稳定的。在一些示例中，聚合物与孔的共价连接可有助于在多种用途期间的结构化基底的整个寿命期间将聚合物维持在结构化特征部(例如，孔)中。然而，在一些示例中，聚合物不需要与孔共价连接。
在具体示例中，结构化基底可通过以下方法来制备：将由适合材料形成的基底图案化为具有孔(例如，微孔或纳米孔)，用聚合物材料涂覆基底材料，并且例如经由化学或机械抛光来抛光已涂覆聚合物的材料的表面，从而将聚合物保持在孔中，但从孔之间的结构化基底的表面上的间隙区域去除基本上所有聚合物或使基本上所有聚合物失活。引物可以例如以诸如本文所提供的方式与聚合物材料附接。包括多种靶多核苷酸(例如片段化人类基因组或其部分)的溶液接着可与经抛光基底接触，使得个别靶多核苷酸将经由与附接到聚合物材料的引物的相互作用来对个别孔接种；然而，由于此处不存在聚合物材料或聚合物材料无活性，靶多核苷酸将不占据间隙区域。因为间隙区域中不存在聚合物或聚合物无活性可以阻止生长簇的向外迁移，所以靶多核苷酸的扩增可以限制于孔中。该工艺可方便地制造、可扩展、且利用常规微型或纳米制造方法。
图案化基底可包含例如蚀刻到载片或芯片中的孔。孔的蚀刻的图案和几何形状可呈多种不同形状和大小，并且此类特征部可在物理上或功能上与彼此分开。具有此类结构特征部的尤其有用的基底包含可以选择如微球体的固体粒子的大小的图案化基底。具有这些特性的示例图案化基板是与珠粒阵列技术(加利福尼亚州圣地亚哥Illumina公司(Illumina,Inc.,San Diego,Calif.))结合使用的蚀刻基板。
在一些示例中，本文所描述的基底形成流通池的至少部分、或位于流通池中、或与流通池耦合。流通池可包含划分成多个泳道或多个分区的流动腔室。本文所阐述的方法和组合物中可以使用的示例性流通池和用于制造流通池的基底包含但不限于可购自Illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)的那些。
如本文所用，当参考覆盖基底的表面的层使用时，术语“直接”旨在表示该层覆盖基底的表面而没有明显的中间层，例如粘合层或聚合物层。直接覆盖表面的层可通过任何化学或物理相互作用(包括共价键或非共价粘附)附接到该表面。
如本文所用，当参考多核苷酸使用时，术语“固定”旨在表示通过共价键或非共价键直接或间接附接到基底。在某些示例中，可使用共价附接或任何其他合适附接，其中多核苷酸在旨在使用基底的条件下(例如在多核苷酸扩增或测序中)保持固定或附接到基底。待用作捕获引物或用作靶多核苷酸的多核苷酸可被固定，使得3'-端可用于酶促延伸，并且序列的至少一部分能够与互补序列杂交。固定可通过与表面附接的寡核苷酸杂交而发生，在这种情况下，所固定的寡核苷酸或多核苷酸可处于3'-5'取向。替代地，固定可通过除碱基配对杂交之外的方式(诸如共价附接)发生。
如本文所用，术语“阵列”是指可根据相对位置彼此区分的一组基底区域。位于阵列的不同区域处的不同分子(诸如多核苷酸)可根据这些区域在该阵列中的位置而彼此区分。阵列的单个区域可包括一种或多种特定类型的分子。例如，基底区域可包括具有特定序列的单个靶多核苷酸，或基底区域可包括具有相同序列(或其互补序列)的若干多核苷酸。阵列的区域可分别包括相同基底上的彼此不同的特征部。示例性特征包括但不限于基底中的孔、基底中或基底上的珠粒(或其它颗粒)、基底的突出部、基底上的脊或基底中的通道。阵列的区域可分别包括彼此不同的基底上的不同区域。可根据基底在与基底相关联的表面上的位置，或者根据基底在液体或凝胶中的位置，来识别附接到单独基底的不同分子。其中单独的基底位于表面上的示例性阵列包括但不限于在孔中具有珠粒的那些阵列。
如本文所用，术语“多个(plurality)”旨在表示两个或更多个不同成员的群体。多个数目可在小、中、大到极大的大小范围内。小的多个数目的大小可在例如几个成员到数十个成员的范围内。中等大小的多个数目可在例如数十个成员到约100个成员或数百个成员的范围内。大的多个数目可在例如约数百个成员到约1000个成员、到数千个成员、和多达数万个成员的范围内。极大的多个数目可在例如数万成员到约几十万、一百万、几百万、几千万、和多达或超过数亿成员的范围内。因此，多个数目可以在两个到远超过一亿成员的大小以及如通过成员的数目所测量的所有大小范围内、在以上示例性范围之间、且超过以上示例性范围。示例性多核苷酸多个数目包含例如约1×105或更多、5×105或更多、或1×106或更多不同多核苷酸的群体。因此，术语的定义打算包含大于二的所有整数值。多个数目的上限可以例如通过样本中多核苷酸序列的理论多样性来设置。
如本文所用，当参考多核苷酸使用时，术语“双链”旨在表示多核苷酸中的所有核苷酸或基本上所有核苷酸都与互补多核苷酸中的相应核苷酸氢键合。
如本文所用，当参考多核苷酸使用时，术语“单链”是指多核苷酸中的核苷酸基本上都没有与互补多核苷酸中的相应核苷酸氢键合。
如本文所用，术语“靶多核苷酸(target polynucleotide)”旨在表示是分析或作用的对象的多核苷酸。分析或作用包含使多核苷酸经历扩增、测序、和/或其它程序。靶多核苷酸可以包含待分析的靶序列之外的核苷酸序列。举例来说，靶多核苷酸可以包含一种或多种衔接子，包含充当引物结合位点的衔接子，该衔接子侧接待分析的靶多核苷酸序列。与捕获引物杂交的靶多核苷酸可包括以并非所有靶多核苷酸都易于延伸的方式来延伸超过捕获寡核苷酸的5'端或3'端的核苷酸。在特定示例中，靶多核苷酸可具有彼此不同的序列，但是可具有彼此相同的第一衔接子和第二衔接子。可位于特定靶多核苷酸序列侧翼的两个衔接子可具有彼此相同的序列，或彼此互补的序列，或者这两个衔接子可具有不同的序列。因此，多个靶多核苷酸中的种类可包括已知序列的区域，该区域位于将通过例如测序(例如，SBS)来评估的未知序列区域的侧翼。在一些示例中，靶多核苷酸在单个末端携带衔接子，并且此类衔接子可位于靶多核苷酸的3'端或5'端。可在没有任何衔接子的情况下使用靶多核苷酸，在这种情况下，引物结合序列可直接源自靶多核苷酸中发现的序列。
术语“多核苷酸(polynucleotide)”和“寡核苷酸(oligonucleotide)”在本文中可互换地使用。除非另外具体地指示，否则不同术语并不意图表示大小、序列、或其它特性的任何具体差异。为了描述清楚起见，当描述包含若干多核苷酸物类的具体方法或组合物时，术语可用于区分一种多核苷酸物类与另一种物类。
如本文所用，术语“扩增子(amplicon)”当关于多核苷酸使用时打算意指复制多核苷酸的产物，其中产物具有与多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分基本上相同或基本上与多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。“扩增(amplification)”和“扩增(amplifying)”是指制造多核苷酸的扩增子的工艺。靶多核苷酸的第一扩增子可以是互补的复本。额外扩增子为在产生第一扩增子之后从靶多核苷酸或从第一扩增子产生的复本。后续扩增子可具有与靶多核苷酸基本上互补或与靶多核苷酸基本上一致的序列。应理解，当产生多核苷酸的扩增子时，可出现该多核苷酸的少量突变(例如由于扩增伪影)。
如本文所用，术语“非活性部分”旨在表示在指定的一组条件下与第二化学实体基本上不具反应性的第一化学实体。如本文所用，术语“活性部分”旨在表示在指定的一组条件下与第二化学实体具有反应性的第三化学实体。第一化学实体可以转化为第三化学实体，从而将非活性部分转化为活性部分。
如本文所用，用光“选择性地照射”元件的一部分旨在表示用光照射基本上仅该元件的该部分，而不用光照射该元件的其它部分。用光选择性地照射元件的一部分的方式的非限制性示例是掩蔽该元件的其它部分不被照射，并且然后照射整个元件或其任何合适部分(包括被选择性地照射的部分)。用光选择性地照射元件的一部分的方式的另一非限制性示例是使用光聚焦光学件，其任选地以诸如在PCT公开号WO 2021/028815和名称为“用于图案化流通池基底的系统和方法(System and Method for Patterning Flow CellSubstrates)“中所描述的方式与诸如光耦合光栅的一个或多个其它元件组合，该公开的全部内容以引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“掩模”旨在表示抑制光透射至实体的光学组件，而术语“去掩模”旨在表示去除此类光学组件以便允许光透射至该实体。
使寡核苷酸与聚合物偶联的方法
本文提供的一些示例涉及在聚合物中将产生簇的区域中提供具有选定特征的捕获引物。本文的示例特别适合生成用于同时双端读段的簇，其中彼此平行地使用SBS在聚合物的第一区域中读取经扩增的多核苷酸序列，并使用SBS在聚合物的第二区域中读取多核苷酸互补序列，但是应当理解，这些示例通常适用于任何类型的簇并且实际上适用于可能期望偶联任何类型的寡核苷酸的任何聚合物。
例如，图3A-图3H示意性地示出了在使不同的寡核苷酸与安置在基底上的聚合物的第一区域和第二区域偶联的工艺流程中的示例性组合物和操作。图3A中所示的组合物3000包括基底310和聚合物，该聚合物包括安置在(例如固定在)基底310上的主链311和与主链311偶联的非活性部分312。以诸如图3A中所示的方式，可以用光(如向下指向的箭头所指示)选择性地照射聚合物的第一区域321中的非活性部分312，而不照射聚合物的第二区域322中的非活性部分312。例如，可以使用掩模360(如由阻挡向下指向的箭头的掩模所指示)来掩蔽第二区域322。以诸如图3B中所示的方式，光可在聚合物的第一区域中产生第一活性部分313，例如光可将聚合物的第一区域中的非活性部分312转化为活性部分。就这一点而言，光可以具有适于进行此类转化的波长和强度，例如光可以在约365nm至约450nm的范围内，以便具有足够高的频率来进行该转化，同时基本上不破坏寡核苷酸。本文其它地方提供了与非活性部分偶联的聚合物主链的非限制性示例，可使用光将这些非活性部分转化为活性部分。任选地，在用光选择性地照射区域321之前，光致抗蚀剂可以沉积在此类区域上方并且可以提高照射区域321的准确度，同时保持区域322不被照射。然后，在以诸如参考图3C所描述的方式使聚合物与流体320接触之前，可以例如使用合适的溶剂来去除光致抗蚀剂。在一些示例中，在彼此不同的步骤中或者在彼此共同的步骤中，从第一区域321去除经照射的光致抗蚀剂，并且从第二区域322去除未经照射的光致抗蚀剂。
然后可以使第一活性部分313与第一寡核苷酸偶联。例如，以诸如图3C所示的方式，可以使第一活性部分313和非活性部分312与流体320接触。在例示的示例中，流体320包括对应于参考图2A所描述的寡核苷酸231的寡核苷酸331和对应于参考图2A所描述的寡核苷酸232的寡核苷酸332的混合物。寡核苷酸332可以包括切除部分333，而寡核苷酸331可以缺乏切除部分。每个寡核苷酸331、332可以包括反应性基团323，第一活性部分313可以与该反应性基团反应，并且非活性部分312基本上可以不与该反应性基团反应。因此，以诸如图3D所示的方式，寡核苷酸331、332的混合物可以与区域321内的聚合物偶联，而寡核苷酸可以不与区域322内的聚合物偶联。可用于与活性部分反应并且基本上不与非活性部分反应的反应性基团的非限制性示例在本文其它地方提供。
尽管可以预期区域321内基本上所有的第一活性基团313与反应性基团323完全反应并因此变得不可用于任何后续反应，但是可以任选地进行另外的“封端”反应，其中任何剩余的第一活性基团313与另外的试剂接触，此类第一活性基团与该另外的试剂反应并因此变得不可用于任何后续反应。例示地，“封端”反应可以包括添加单官能叠氮化物分子，诸如聚乙二醇-叠氮化物(PEG-叠氮化物)、1-叠氮己烷、3-叠氮丙酸、3-叠氮丙-1-醇等，或添加与烯烃反应的活性基团，诸如1-己烯-6-醇或5-己烯酸。
然后可以照射聚合物的第二区域322。例如，以诸如图3E所示的方式，可将聚合物的第二区域322去掩蔽，并且可用光照射聚合物的第二区域中的非活性部分312以在聚合物的第二区域中产生第二活性部分314，诸如图3F中所示。第二活性部分314可以与第一活性部分313在化学上相同，但处于聚合物的不同区域322中。在一些示例中，例如因为区域321中的任何非活性部分312已经转化为活性部分313并且基本上完全与反应性基团323或任选的封端试剂反应，可以同时用光照射区域321与区域322。然而，应当理解，可以选择性地照射区域322，例如，可以任选地掩蔽区域321，同时用光照射区域322，例如以抑制光降解寡核苷酸331、332。附加地或另选地，可以选择光的波长以便抑制寡核苷酸的光诱导降解，例如，光可以在约365nm至约450nm的范围内。
然后可以使第二活性部分314与第二寡核苷酸偶联。例如，以诸如图3G所示的方式，可以使第二活性部分314以及寡核苷酸331、332与流体320'接触。在例示的示例中，流体320'包括对应于参考图2A所描述的寡核苷酸241的寡核苷酸341和对应于参考图2A所描述的寡核苷酸242的寡核苷酸342的混合物。寡核苷酸342可以包括切除部分343，而寡核苷酸341可以缺乏切除部分，如图3G所示。每个寡核苷酸341、342可以包括反应性基团323，第二活性部分314可以与该反应性基团反应，并且该反应性基团可以是与在图3C中所示的操作期间所使用的反应性基团相同类型的反应性基团。因此，以诸如图3H所示的方式，寡核苷酸341、342的混合物可以与区域322内的聚合物偶联(如图3G所示)，而寡核苷酸331、332可以仍与区域321内的聚合物偶联(如图3G所示)。图3H中所示的所得组合物3001可包括对应于参考图1所描述的聚合物区域101和参考图2A所描述的聚合物区域201的聚合物区域301，以及对应于参考图1所描述的聚合物区域102和参考图2A所描述的聚合物区域202的聚合物区域302，并且可以用于以与参考图1和图2A-图2D所描述类似的方式扩增靶多核苷酸。
可以使用任何合适的非活性部分312，其可以以诸如参考图3A-图3B所描述的方式转化为活性部分313和以诸如参考图3E-图3F所描述的方式转化为活性部分314。例示地，非活性部分312可以包括具有以下结构的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔：
其中R3和R4中的一者是R1，并且另一者是H；其中R1是连至聚合物的主链的连接基团；并且其中若R4不直接与X偶联，则X是CH2、O、S或NH，或者其中若R4直接与X偶联，则X是CH或N。用紫外(UV)光(例如，在350nm和合适的强度下)照射引起环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔的脱羰反应，以形成活性部分二苯并环辛炔(DBCO)：
以诸如上文参考图3C所描述的方式，流体320中的寡核苷酸331、332所偶联的反应性基团323可以是叠氮化物(N3)，并且以诸如参考图3G所描述的方式，流体320'中的寡核苷酸341、342所偶联的反应性基团323也可以是叠氮化物。叠氮化物可以与二苯并环辛炔反应以形成具有以下结构的环加合物：
其中R2表示寡核苷酸，因此使寡核苷酸与聚合物偶联。
在一个非限制性示例中，环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔具有以下结构：
其中R1表示连至聚合物的主链311的连接基团。用紫外(UV)光(例如，在350nm和合适的强度下)照射引起环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔的脱羰反应，以形成活性部分二苯并环辛炔(DBCO)：
以诸如上文参考图3C所描述的方式，流体320中的寡核苷酸331、332所偶联的反应性基团323可以是叠氮化物(N3)，并且以诸如参考图3G所描述的方式，流体320'中的寡核苷酸341、342所偶联的反应性基团323也可以是叠氮化物。叠氮化物可以与二苯并环辛炔反应以形成具有以下结构的环加合物：
其中R2表示寡核苷酸，因此使寡核苷酸与聚合物偶联。
在其它示例中，非活性部分312可包括具有以下结构的四唑：
其中R1表示连至聚合物的主链311的连接基团。用紫外(UV)光(例如，在300nm-365nm和合适的强度下)照射引起非活性部分的脱氮作用(失去N2)，以形成活性部分，即具有以下结构的腈亚胺：
以诸如上文参考图3C所描述的方式，流体320中的寡核苷酸331、332所偶联的反应性基团323可以包括烯烃并且以诸如参考图3G所描述的方式，流体320'中的寡核苷酸341、342所偶联的反应性基团323也可以是烯烃/>烯烃可以与活性部分反应以形成具有以下结构的吡唑啉：
其中R2表示寡核苷酸，因此使寡核苷酸与聚合物偶联。
在另外其它示例中，非活性部分312可包括具有以下结构的3-(羟甲基)-2-萘酚：
其中R1表示连至聚合物的主链311的连接基团。用紫外(UV)光(例如，在300nm-350nm和合适的强度下)照射引起H2O从非活性部分中缩合以形成具有以下结构的活性部分：
以诸如上文参考图3C所描述的方式，流体320中的寡核苷酸331、332所偶联的反应性基团323可以是乙烯基醚并且以诸如参考图3G所描述的方式，流体320'中的寡核苷酸341、342所偶联的反应性基团323也可以是乙烯基醚/>乙烯基醚可与活性部分反应以形成具有以下结构的苯并色满：
其中R2表示寡核苷酸，因此使寡核苷酸与聚合物偶联。
在又其它示例中，非活性部分312可包括具有以下结构的2H-氮丙啶：
其中R1表示连至聚合物的主链的连接基团。用紫外(UV)光(例如，在约302nm和合适的强度下)照射引起2H-氮丙啶非活性部分的开环重排，以形成活性部分，即具有以下结构的腈叶立德：
以诸如上文参考图3C所描述的方式，流体320中的寡核苷酸331、332所偶联的反应性基团323可以是烯烃并且以诸如参考图3G所描述的方式，流体320'中的寡核苷酸341、342所偶联的反应性基团323也可以是烯烃/>烯烃可与活性部分反应以形成具有以下结构的吡咯啉：
其中R2表示寡核苷酸，因此使寡核苷酸与聚合物偶联。
可包括非活性部分的聚合物的非限制性示例以及制备此类聚合物的方法在本文其它地方更详细地提供，可使用光将这些非活性部分转化为活性部分，诸如上文所例示的那些。
尽管参考图3A-图3H所描述的示例可建议使用具有彼此相邻的第一区域和第二区域的平坦基底，但应显而易见的是可使用更复杂的基底。例如，图4A-图4E示意性地示出了在使不同的寡核苷酸与安置在基底上的聚合物的第一区域和第二区域的阵列偶联的工艺流程中的示例性组合物和操作。诸如参考图4A-图4E所描述的组合物可以以与参考图3A-图3H所描述的那些的类似方式制备和使用。
在图4A的平面图中示出的示例中，该平面图的一部分在图4B的剖视图中示出，基底450可以包括多个垂直侧壁403，其提供孔451的阵列，在每个孔内可以安置聚合物，例如包括主链411和非活性部分412，诸如参考图3A-图3H所描述以及如本文其它地方所例示。孔451的阵列内的聚合物可以以任何合适的方式被掩蔽，或以其它方式被选择性地照射，以便仅照射每个孔内的聚合物的一部分。例如，多个平行、伸长的掩模460可延伸跨过多个孔451的区域并因此掩蔽这些区域，同时使区域421以诸如图4C中所示的方式暴露于辐射。然后可以执行诸如参考图3A-图3H所描述的工艺，以便获得诸如图4D的平面图中所示的孔451的阵列，该平面图的一部分在图4E的剖视图中示出。在孔451中的每个孔内可以安置第一聚合物区域401和聚合物区域402，该第一聚合物区域可以与分别参考图1、图2A-图2D和图3H所描述的聚合物区域101、201和301类似地配置，该聚合物区域可以与分别参考图1、图2A-图2D和图3H所描述的聚合物区域102、202和302类似地配置和使用。因此，聚合物的第一区域可被认为包括多个第一子区域401，并且聚合物的第二区域可被认为包括多个第二子区域402。以诸如图4D中所示的方式，第一子区域401中的每个第一子区域可与第二子区域402中对应的一个第二子区域接续。另外，以诸如图4D中所示的方式，第一子区域401中的每个第一子区域以及第二子区域402中与该第一子区域接续的对应的一个第二子区域位于孔451内，如图4E所示。
图5示出了使不同的寡核苷酸与聚合物的第一区域和第二区域偶联的方法中的示例性操作流程。图5中所示的方法500可以包括用光选择性地照射聚合物的第一区域中的非活性部分，而不照射聚合物的第二区域中的非活性部分，以在聚合物的第一区域中产生第一活性部分(操作510)。参考图3A-图3B和图4C描述此类选择性照射的非限制性示例。图5中所示的方法500也可包括使第一活性部分与第一寡核苷酸偶联(操作520)。参考图3C-图3D描述此类偶联的非限制性示例。图5中所示的方法500也可包括用光照射聚合物的第二区域中的非活性部分以在聚合物的第二区域中产生第二活性部分(操作530)。参考图3E-图3F描述此类照射的非限制性示例。图5中所示的方法500也可包括使第二活性部分与第二寡核苷酸偶联(操作540)。参考图3G-图3H描述此类偶联的非限制性示例。
聚合物以及制备聚合物的方法
上文参考图3A-图3H提供了可使用光转化为活性部分的非活性部分以及可与此类活性部分反应以使寡核苷酸与聚合物偶联的反应性基团的非限制性示例。现将描述形成包括此类非活性部分的聚合物的方法以及所得聚合物的一些非限制性示例。
在一些示例中，聚合物包括具有以下结构的聚(环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔-丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)共聚物：
其中，在一些示例中，m在约50至100,000的范围内并且n在约5至20,000的范围内。需要说明的是，环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔可以具有任何合适的结构，诸如上文进一步所描述，以形成环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔官能单体的任何合适的共聚物，并且不限于该特定示例。此类聚合物可以以包括自由基诱导的共聚反应的方法制备：
其可以以无规、嵌段性、二嵌段、多嵌段、梯度或其它合适类型的共聚形式进行。
以诸如参考图3A-图3H所描述的方式，此类聚合物的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔对应于非活性部分312，并且可以使用光将其转化为活性部分。由此类转化产生的聚合物可以包括具有以下结构的聚(二苯并环辛炔-丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)共聚物：
需要说明的是，二苯并环辛炔可以具有任何合适的结构，诸如上文进一步所描述。此类聚合物可以在包括光诱导的反应的方法中制备：
此类聚合物可以安置在基底上，并且可以与基底共价或非共价地偶联。为了促进与基底的共价偶联，可以将上述聚合物(其中环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔可以具有任何合适的结构)改性，以便成为具有以下结构的叠氮化物官能聚合物：
其中，在一些示例中，m和n可以如上文所定义，并且x是叠氮化物官能化的丙烯酰胺的重复单元的数目，例如在约5至10,000的范围内。此类叠氮化物官能聚合物可以使用包括自由基诱导的聚合反应的方法来形成：
其可以以无规、嵌段性、二嵌段、多嵌段、梯度或其它合适类型的共聚形式进行。
叠氮化物可与基底反应以使聚合物与基底共价偶联。例如，聚合物可以沉积到包括降冰片烯基团的基底上：
其中虚线表示基底的表面。降冰片烯基团可以被官能化(例如，可以被取代或可以包括杂(降冰片烯))，并且可以以诸如美国专利号9,994,687中所描述的方式与基底偶联，该专利的全部内容以引用的方式并入本文。聚合物的叠氮化物(N3)基团可与降冰片烯基团反应以使聚合物与基底偶联，例如使用1,3-偶极环加成反应进行，诸如美国专利号9,994,687中所描述。然后可以将此类聚合物的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔转化为活性部分DBCO，并与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应，从而以诸如本文其它地方所描述的方式使寡核苷酸与聚合物偶联以及与基底偶联。
在一些示例中，叠氮化物官能化聚合物包括具有以下结构的丙烯酰胺-叠氮丙烯酰胺-(3-(羟甲基)-2-萘酚)丙烯酰胺共聚物：
其中m为50至100,000，n为5至10,000，并且x为5至10,000。
此类聚合物可以以包括自由基诱导的共聚反应的方法制备：
其可以以无规、嵌段性、二嵌段、多嵌段、梯度或其它合适类型的共聚形式进行。叠氮化物可与基底反应以使聚合物与基底共价偶联。例如，聚合物可以沉积到包括降冰片烯基团的基底上。聚合物的叠氮化物(N3)基团可与降冰片烯基团反应以使聚合物与基底偶联，例如使用1,3-偶极环加成反应进行，诸如美国专利号9,994,687中所描述。然后可将此类聚合物的3-(羟甲基)-2-萘酚转化为活性部分，并与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应，从而以诸如本文其它地方所描述的方式使寡核苷酸与聚合物偶联以及与基底偶联。
在一些示例中，叠氮化物官能化聚合物包括具有以下结构的丙烯酰胺-叠氮丙烯酰胺-四唑丙烯酰胺共聚物：
其中m为50至100,000，n为5至10,000，并且x为5至10,000。此类聚合物可以以包括自由基诱导的共聚反应的方法制备：
其可以以无规、嵌段性、二嵌段、多嵌段、梯度或其它合适类型的共聚形式进行。叠氮化物可与基底反应以使聚合物与基底共价偶联。例如，聚合物可以沉积到包括降冰片烯基团的基底上。聚合物的叠氮化物(N3)基团可与降冰片烯基团反应以使聚合物与基底偶联，例如使用1,3-偶极环加成反应进行，诸如美国专利号9,994,687中所描述。然后可将此类聚合物的四唑转化为活性部分，并与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应，从而以诸如本文其它地方所描述的方式使寡核苷酸与聚合物偶联以及与基底偶联。
在一些示例中，叠氮化物官能化聚合物包括具有以下结构的丙烯酰胺-叠氮丙烯酰胺-氮丙啶丙烯酰胺共聚物：
其中m为50至100,000，n为5至10,000，并且x为5至10,000。
此类聚合物可以以包括自由基诱导的共聚反应的方法制备：
其可以以无规、嵌段性、二嵌段、多嵌段、梯度或其它合适类型的共聚形式进行。叠氮化物可与基底反应以使聚合物与基底共价偶联。例如，聚合物可以沉积到包括降冰片烯基团的基底上。聚合物的叠氮化物(N3)基团可与降冰片烯基团反应以使聚合物与基底偶联，例如使用1,3-偶极环加成反应进行，诸如美国专利号9,994,687中所描述。然后可将此类聚合物的2H-氮丙啶转化为活性部分，并与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应，从而以诸如本文其它地方所描述的方式使寡核苷酸与聚合物偶联以及与基底偶联。
在一些示例中，聚合物包括具有以下结构的共聚物：
其中x为50至100,000，y为5至20,000，并且R选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。此类元件的非限制性示例在本文其它地方描述。
此类聚合物可以在包括PAZAM与官能化炔烃的点击化学反应的方法中制备：
其中选自由以下项组成的组：
上述点击化学反应的左侧上的聚合物可使用类似于本文其它地方所描述的自由基诱导的聚合来制备。可使用光将聚合物的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚或2H-氮丙啶转化为活性部分；并且使活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸以使寡核苷酸与聚合物偶联。
在一些示例中，共聚物包括具有以下结构的聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺-共-N-(5-三唑基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺)聚合物：
其中R选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。此类元件的非限制性示例在本文其它地方描述。
此类聚合物可以在叠氮化物官能聚合物聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)与官能化炔烃的点击化学反应中制备：
其中选自由以下项组成的组：
上述点击化学反应的左侧上的聚合物可使用类似于本文其它地方所描述的自由基诱导的聚合来制备。可使用光将聚合物的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚或2H-氮丙啶转化为活性部分；并且使活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸以使寡核苷酸与聚合物偶联。
应当理解，基于本文的教示内容，可以设想具有许多不同类型的可光活化部分的许多不同聚合物。本发明聚合物中的任一聚合物可以是嵌段共聚物，可以是无规分布的共聚物，或这两者的任何合适的组合。另外，应当理解，任何合适的叠氮化物反应性基团，包括但不限于炔烃，可与非活性部分偶联，从而使非活性部分与聚合物偶联。
还应理解，许多不同的基底可使用本发明的聚合物和方法官能化。例示地，本文的一些示例提供一种制备涂覆有官能聚合物的表面的方法，其中降冰片烯硅烷化表面
与叠氮化物官能聚合物(其非限制性示例在本文其它地方提供)反应，并且然后使剩余的叠氮化物基团和与叠氮化物反应性基团偶联的非活性部分反应。在一个非限制性示例中，叠氮化物反应性基团包括炔烃基团。在非限制性示例中，非活性部分选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。然后可以使用光将非活性部分(例如，环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚或2H-氮丙啶)转化为活性部分，并且以诸如本文其它地方所描述的方式使活性部分与寡核苷酸偶联。
另外的注释
应当理解，本发明的聚合物、组合物和方法可用于任何合适的应用，诸如扩增模板多核苷酸。例如，尽管本发明的组合物可用于执行“桥式扩增”或“表面结合的聚合酶链式反应”，但是应当理解，本发明的组合物可容易地适于与其它扩增模式一起使用。一种此类扩增模式是“排除扩增”或ExAmp。排除扩增方法可允许每个基底区域扩增单个靶多核苷酸和在基底区域中产生基本上单克隆的扩增子群体。例如，相对于在基底区域处的靶多核苷酸的更慢的转运和捕获速率，在基底区域内的第一捕获的靶多核苷酸的扩增速率可更快。因此，在基底区域中捕获的第一靶多核苷酸可快速扩增并填充整个基底区域，因此抑制相同基底区域中的额外靶多核苷酸的捕获。替代地，如果在第一多核苷酸之后第二靶多核苷酸附接到相同基底区域，则第一靶多核苷酸的相对快速扩增可填充足够的基底区域以产生足够强以执行边合成边测序的信号(例如，基底区域可以是至少功能上单克隆的)。排除扩增的使用也可能导致单克隆基底区域的超泊松分布；即，在功能上单克隆的阵列中的基底区域的分数可超过由泊松分布预测的分数。
增加有用簇的超泊松分布是有用的，因为更多功能上单克隆的基底区域可能产生更高质量的信号，并且因此改进的SBS；然而，将靶多核苷酸接种到基底区域可遵循空间泊松分布，其中用于增加占用的基底区域的数量的折衷方案是增加多克隆基底区域的数量。获得较高超泊松分布的一种方法是使接种快速发生，然后在接种的靶多核苷酸之中延迟。由于延迟(术语称为“动力学延迟”)被认为是通过生物化学反应动力学而产生的，所以其给出了一种接种的靶多核苷酸(与其他接种的靶标相比更早开始)。当重组酶介导序列匹配时，排除扩增通过使用重组酶促进引物(例如，附接到基底区域的引物)侵入到双链DNA(例如，靶多核苷酸)中来工作。本发明的组合物和方法可适于与重组酶一起使用以在重组酶介导序列匹配时促进本发明的捕获引物和正交捕获引物侵入到本发明的靶多核苷酸中。实际上，本发明的组合物和方法可适于与任何基于表面的多核苷酸扩增方法一起使用，诸如热PCR、化学变性PCR和酶促介导的方法(其也可称为重组酶聚合酶扩增(RPA)或ExAmp)。
虽然上文描述了各种说明性示例，但本领域的技术人员将显而易见，可在不脱离本发明的情况下在其中作出各种改变和修改。所附权利要求书打算涵盖落入本发明的真正精神和范围内所有此类改变和修改。
应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其它(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。

Claims (58)

1.一种使寡核苷酸与聚合物偶联的方法，所述方法包括：
用光选择性地照射聚合物的第一区域中的非活性部分，而不照射所述聚合物的第二区域中的非活性部分，以在所述聚合物的所述第一区域中产生第一活性部分；
使所述第一活性部分与第一寡核苷酸偶联；
用光照射所述聚合物的所述第二区域中的所述非活性部分以在所述聚合物的所述第二区域中产生第二活性部分；以及
使所述第二活性部分与第二寡核苷酸偶联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物的所述第一区域中或所述聚合物的所述第二区域中的所述非活性部分包括具有以下结构的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔：
其中R3和R4中的一者是R1，并且另一者是H；其中R1是连至所述聚合物的主链的连接基团；并且其中若R4不直接与X偶联，则X是CH2、O、S或NH，或者其中若R4直接与X偶联，则X是CH或N。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一活性部分或所述第二活性部分包括二苯并环辛炔：
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与叠氮化物(N3)偶联，所述叠氮化物与所述二苯并环辛炔反应以形成具有以下结构的环加合物：
其中R2表示所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物的所述第一区域中或所述聚合物的所述第二区域中的所述非活性部分包括具有以下结构的四唑：
其中R1表示连至所述聚合物的主链的连接基团。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一活性部分或所述第二活性部分包括具有以下结构的腈亚胺：
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与烯烃偶联，所述烯烃与所述第一活性部分或所述第二活性部分反应以形成具有以下结构的吡唑啉：
其中R2表示所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物的所述第一区域中或所述聚合物的所述第二区域中的所述非活性部分包括具有以下结构的3-(羟甲基)-2-萘酚：
其中R1表示连至所述聚合物的主链的连接基团。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一活性部分或所述第二活性部分包括具有以下结构的化合物：
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与乙烯基醚偶联，所述乙烯基醚与所述第一活性部分或所述第二活性部分反应以形成具有以下结构的苯并色满：
其中R2表示所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合物的所述第一区域中或所述聚合物的所述第二区域中的所述非活性部分包括具有以下结构的2H-氮丙啶：
其中R1表示连至所述聚合物的主链的连接基团。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第一活性部分或所述第二活性部分包括具有以下结构的腈叶立德：
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一寡核苷酸或第二寡核苷酸与烯烃偶联，所述烯烃与所述第一活性部分或所述第二活性部分反应以形成具有以下结构的吡咯啉：
其中R2表示所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸。
14.根据权利要求1至13中的任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包含：缺乏切除部分的第一引物和包含切除部分的第二引物的混合物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含：包含切除部分的第三引物和缺乏切除部分的第四引物的混合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一引物和所述第三引物除所述切除部分外具有彼此相同的序列，并且其中所述第二引物和所述第四引物除所述切除部分外具有彼此相同的序列。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中所述第一引物和所述第二引物的所述序列彼此正交，并且其中所述第三引物和所述第四引物的所述序列彼此正交。
18.根据权利要求1至17中的任一项所述的方法，其中所述聚合物的所述第一区域包括多个第一子区域，并且其中所述聚合物的所述第二区域包括多个第二子区域。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一子区域中的每个第一子区域与所述第二子区域中对应的一个第二子区域接续。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一子区域中的每个第一子区域以及所述第二子区域中与所述第一子区域接续的所述对应的一个第二子区域位于孔内。
21.根据权利要求1至20中的任一项所述的方法，所述方法还包括：
在所述第一区域和所述第二区域上方沉积光致抗蚀剂；
在用光选择性地照射所述聚合物的所述第一区域中的所述非活性部分而不照射所述聚合物的所述第二区域中的所述非活性部分时，用光照射所述第一区域上方的所述光致抗蚀剂；
在使所述第一活性部分与所述第一寡核苷酸偶联之前，从所述聚合物的所述第一区域去除经照射的光致抗蚀剂；以及
在使所述第二活性部分与所述第二寡核苷酸偶联之前，从所述聚合物的所述第二区域去除所述光致抗蚀剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在彼此共同的步骤中，从所述聚合物的所述第一区域去除经照射的光致抗蚀剂并且从所述聚合物的所述第二区域去除所述光致抗蚀剂。
23.一种聚合物，所述聚合物包括具有以下结构的聚(环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔-丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)共聚物：
24.一种聚合物，所述聚合物包括具有以下结构的聚(二苯并环辛炔-丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)共聚物：
25.一种制备聚合物的方法，所述方法包括自由基诱导的聚合反应：
26.一种制备聚合物的方法，所述方法包括光诱导的反应：
27.一种聚合物，所述聚合物包括以下结构：
28.一种制备聚合物的方法，所述方法包括自由基诱导的聚合反应：
29.一种使基底官能化的方法，所述方法包括：
提供包括降冰片烯基团的基底：
其中虚线表示所述基底的表面；
将包括以下结构的聚合物沉积到所述基底上：
以及
使所述聚合物的叠氮化物(N3)基团与所述降冰片烯基团反应以使所述聚合物与所述基底偶联。
30.根据权利要求29所述的方法，所述方法还包括使用根据权利要求28所述的方法制备所述聚合物。
31.根据权利要求29或权利要求30所述的方法，所述方法还包括使用光将所述环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔转化为二苯并环辛炔：
其中R1表示连至所述聚合物的主链的连接基团。
32.根据权利要求31所述的方法，所述方法还使所述二苯并环辛炔和与寡核苷酸(R2)偶联的叠氮化物(N3)反应以形成具有以下结构的四唑：
33.一种组合物，所述组合物通过使用根据权利要求29所述的方法使聚合物与基底偶联来制备。
34.一种组合物，所述组合物包括安置在基底上的根据权利要求23、24或27中的任一项所述的聚合物。
35.一种聚合物，所述聚合物具有以下结构：
36.一种制备聚合物的方法，所述方法包括自由基诱导的共聚反应：
37.一种使基底官能化的方法，所述方法包括：
提供包括降冰片烯基团的基底：
其中虚线表示所述基底的表面；
将包括以下结构的聚合物沉积到所述基底上：
以及
使所述聚合物的叠氮化物(N3)基团与所述降冰片烯基团反应以使所述聚合物与所述基底偶联。
38.一种组合物，所述组合物通过使用根据权利要求37所述的方法使聚合物与基底偶联来制备。
39.一种使聚合物官能化的方法，所述方法包括：
使用光将根据权利要求38所述的组合物的3-(羟甲基)-2-萘酚转化为活性部分；以及
使所述活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使所述寡核苷酸与所述聚合物偶联。
40.一种聚合物，所述聚合物具有以下结构：
41.一种制备聚合物的方法，所述方法包括自由基诱导的共聚反应：
42.一种使基底官能化的方法，所述方法包括：
提供包括降冰片烯基团的基底：
其中虚线表示所述基底的表面；
将包括以下结构的聚合物沉积到所述基底上：
以及
使所述聚合物的叠氮化物(N3)基团与所述降冰片烯基团反应以使所述聚合物与所述基底偶联。
43.一种组合物，所述组合物通过使用根据权利要求42所述的方法使聚合物与基底偶联来制备。
44.一种使聚合物官能化的方法，所述方法包括：
使用光将根据权利要求43所述的组合物的四唑转化为腈亚胺活性部分；以及
使所述腈亚胺活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使所述寡核苷酸与所述聚合物偶联。
45.一种聚合物，所述聚合物具有以下结构：
46.一种制备聚合物的方法，所述方法包括自由基诱导的共聚反应：
47.一种使基底官能化的方法，所述方法包括：
提供包括降冰片烯基团的基底：
其中虚线表示所述基底的表面；
将包括以下结构的聚合物沉积到所述基底上：
以及
使所述聚合物的叠氮化物(N3)基团与所述降冰片烯基团反应以使所述聚合物与所述基底偶联。
48.一种组合物，所述组合物通过使用根据权利要求42所述的方法使聚合物与基底偶联来制备。
49.一种使聚合物官能化的方法，所述方法包括：
使用光将根据权利要求43所述的组合物的2H-氮丙啶转化为腈叶立德活性部分；以及
使所述腈叶立德活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使所述寡核苷酸与所述聚合物偶联。
50.一种聚合物，所述聚合物具有以下结构：
其中R选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。
51.一种制备聚合物的方法，所述方法包括聚(N-(5-叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)与官能化炔烃的点击化学反应：/>
其中选自由以下项组成的组：
52.一种使聚合物官能化的方法，所述方法包括：
使用光将根据权利要求51所述的聚合物的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚或2H-氮丙啶转化为活性部分；以及
使所述活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使所述寡核苷酸与所述聚合物偶联。
53.一种聚合物，所述聚合物具有以下结构：
其中R选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。
54.一种制备聚合物的方法，所述方法包括叠氮化物官能聚合物与官能化炔烃的点击化学反应：/>
其中选自由以下项组成的组：
55.一种使聚合物官能化的方法，所述方法包括：
使用光将根据权利要求53所述的聚合物的环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚或2H-氮丙啶转化为活性部分；以及
使所述活性部分与偶联叠氮化物的寡核苷酸反应以使所述寡核苷酸与所述聚合物偶联。
56.一种制备涂覆有官能聚合物的表面的方法，其中使降冰片烯硅烷化表面与叠氮化物官能聚合物反应，并且然后使剩余的叠氮化物基团和与叠氮化物反应性基团偶联的非活性部分反应。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述叠氮化物反应性基团包括炔烃基团。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的方法，其中所述非活性部分选自由以下项组成的组：环丙烯酮掩蔽的二苯并环辛炔、四唑、3-(羟甲基)-2-萘酚和2H-氮丙啶。
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