CN116710491A - 包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法 - Google Patents

包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116710491A
CN116710491A CN202180088146.4A CN202180088146A CN116710491A CN 116710491 A CN116710491 A CN 116710491A CN 202180088146 A CN202180088146 A CN 202180088146A CN 116710491 A CN116710491 A CN 116710491A
Authority
CN
China
Prior art keywords
substrate
functional group
unsaturated cyclic
adduct
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180088146.4A
Other languages
English (en)
Inventor
R·史密斯
W·乔治
A·布朗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Illumina Cambridge Ltd
Illumina Inc
Original Assignee
Illumina Cambridge Ltd
Illumina Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Illumina Cambridge Ltd, Illumina Inc filed Critical Illumina Cambridge Ltd
Publication of CN116710491A publication Critical patent/CN116710491A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F222/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a carboxyl radical and containing at least one other carboxyl radical in the molecule; Salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof
    • C08F222/36—Amides or imides
    • C08F222/40—Imides, e.g. cyclic imides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F283/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers provided for in subclass C08G
    • C08F283/12—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers provided for in subclass C08G on to polysiloxanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/06—Oxidation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F8/00—Chemical modification by after-treatment
    • C08F8/30—Introducing nitrogen atoms or nitrogen-containing groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J7/00—Chemical treatment or coating of shaped articles made of macromolecular substances
    • C08J7/12—Chemical modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F293/00—Macromolecular compounds obtained by polymerisation on to a macromolecule having groups capable of inducing the formation of new polymer chains bound exclusively at one or both ends of the starting macromolecule
    • C08F293/005—Macromolecular compounds obtained by polymerisation on to a macromolecule having groups capable of inducing the formation of new polymer chains bound exclusively at one or both ends of the starting macromolecule using free radical "living" or "controlled" polymerisation, e.g. using a complexing agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Surface Acoustic Wave Elements And Circuit Networks Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

在一个示例中，不饱和环状二酮偶联到基底，并与包含第一官能团的吲哚或吲唑反应以形成将该第一官能团偶联到该基底的第一加合物。在另一个示例中，不饱和环状二酮偶联到基底并与包含官能团的二烯反应以形成将该官能团偶联到该基底的加合物。在另一个示例中，吲哚或吲唑偶联到基底，并与包含寡核苷酸的不饱和环状二酮反应以形成将该寡核苷酸偶联到该基底的加合物。在另一个示例中，二烯偶联到基底，并与包含寡核苷酸的不饱和环状二酮反应以形成将该寡核苷酸偶联到该基底的加合物。

Description

包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年1月5日提交的名称为“Compositions IncludingFunctional Groups Coupled to Substrates,and Methods of Making the Same”的美国临时专利申请63/133,955号的权益，该专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术领域
本申请涉及将官能团偶联到基底。
背景技术
聚合物涂覆的基底用于许多技术应用中。例如，植入式医疗装置可涂覆有生物惰性聚合物。在另一个示例中，聚合物涂覆的基底用于生物分子的制备和/或分析。分子分析，诸如某些核酸测序方法，依赖于将核酸链附接到基底的聚合物涂覆的表面。然后可以通过本领域已知的多种不同方法测定附接的核酸链的序列。
在某些测序方法中，诸如边合成边测序(SBS)，用聚合物涂覆基底(诸如流通池)的表面，然后将寡核苷酸引物(例如，单链DNA或ssDNA)接枝到该聚合物上。
聚合物表面(和它们的制备)通常与广泛的测序和检测过程相容，包括不同的化学条件、温度、光学检测方法、捕获部分密度和其他参数，并且通常在各种储存和运输条件下是稳定的。在这些分子生物学方法中使用的某些聚合物材料采用在铜介导的环加成反应中与基底的表面和/或待接枝的寡核苷酸上的烯烃或炔烃基团反应的侧基式叠氮基基团。然而，残留的铜在生物相关环境中可能具有细胞毒性作用。就DNA测序应用而言，在一些情况下，铜会损坏DNA，从而降低测序产量和数据质量。此外，铜催化的反应通常是铜密集型的，并且因此是昂贵的，并且可能不能足够有效或快速地运行以确保足够的聚合物附接和定位在基底表面上。因此，需要具有改进特性的表面聚合物涂层，诸如提高反应效率并导致残留铜减少。
发明内容
本文提供的示例涉及包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法。还公开了使用此类组合物的方法。
本文的一些示例提供将官能团偶联到基底的方法。所述方法可包括提供偶联到基底的不饱和环状二酮，以及使所述不饱和环状二酮与包含第一官能团的吲哚或吲唑反应以形成将所述第一官能团偶联到所述基底的第一加合物。
在一些示例中，所述不饱和环状二酮为：
其中L包含与所述基底的连接子并且每个X独立地为CH或N。在一些示例中，所述不饱和环状二酮为三唑啉二酮：
在一些示例中，所述不饱和环状二酮为马来酰亚胺：
在一些示例中，5.根据权利要求2所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为4-环戊烯-1,3-二酮：
在一些示例中，所述吲哚或吲唑为：
其中F1包含所述第一官能团；R为H、吸电子基团或供电子基团；并且Z为CH或N。在一些示例中，所述吲哚为1H-吲哚：
在一些示例中，所述吲哚为1H-吲唑：
在一些示例中，所述第一加合物为：
其中L包含与所述基底的连接子并且每个X独立地为CH或N。在一些示例中，所述第一加合物为：
在一些示例中，所述方法还包括对所述第一加合物进行加热以使偶联到所述基底的所述不饱和环状二酮再生。
在一些示例中，所述方法还包括使所述第一加合物与包含第二官能团的二烯反应以形成将所述第二官能团偶联到所述基底的第二加合物。在一些示例中，所述二烯包括1,3-二烯。在一些示例中，所述1,3-二烯为：
其中F2包含所述第二官能团。在一些示例中，所述第二加合物为：
其中L包含与所述基底的连接子。
在一些示例中，所述第二官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。在一些示例中，所述第二官能团为寡核苷酸。
在一些示例中，所述第一官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。在一些示例中，所述第一官能团为寡核苷酸。
在一些示例中，所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。在一些示例中，所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
在一些示例中，提供偶联到所述基底的所述不饱和环状二酮包括：提供偶联到所述基底的4-取代的尿唑，以及使所述4-取代的尿唑氧化以形成三唑啉二酮。
本文的一些示例提供一种组合物，所述组合物包含基底，和偶联到所述基底的加合物：
其中L包含与所述基底的连接子；F1包含第一官能团；每个X独立地为CH或N；R为H、吸电子基团或供电子基团；并且Z为CH或N。
在一些示例中，所述加合物为：
在一些示例中，所述第一官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。在一些示例中，所述第一官能团为寡核苷酸。
在一些示例中，所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。在一些示例中，所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
本文的一些示例提供将官能团偶联到基底的方法。所述方法可包括提供偶联到基底的不饱和环状二酮，以及使所述不饱和环状二酮与包含官能团的二烯反应以形成将所述官能团偶联到所述基底的加合物。
在一些示例中，所述不饱和环状二酮为：
其中L为与所述基底的连接子并且每个X独立地为CH或N。在一些示例中，所述不饱和环状二酮为三唑啉二酮：
在一些示例中，所述不饱和环状二酮为马来酰亚胺：在一些示例中，所述不饱和环状二酮为4-环戊烯-1,3-
二酮：
在一些示例中，所述二烯包括1,3-二烯。在一些示例中，所述1,3-二烯为：
其中F2包含所述官能团。在一些示例中，所述加合物为：
其中L包含与所述基底的连接子。
在一些示例中，所述官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。在一些示例中，所述官能团为寡核苷酸。
在一些示例中，所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。在一些示例中，所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
在一些示例中，提供偶联到所述基底的所述不饱和环状二酮包括：提供偶联到所述基底的4-取代的尿唑，以及使所述4-取代的尿唑氧化以形成三唑啉二酮。
本文的一些示例提供一种组合物，所述组合物包含基底，和偶联到所述基底的加合物：
其中L包含与所述基底的连接子，F2包含官能团，并且每个X独立地为CH或N。
在一些示例中，所述加合物为：
在一些示例中，所述加合物为：
在一些示例中，所述加合物为：
在一些示例中，所述官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。在一些示例中，所述官能团为寡核苷酸。
在一些示例中，所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。在一些示例中，所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
本文的一些示例提供一种将官能团偶联到基底的方法。所述方法可包括提供偶联到基底的吲哚或吲唑，以及使所述吲哚或吲唑与包含寡核苷酸的第一不饱和环状二酮反应以形成将所述寡核苷酸偶联到所述基底的第一加合物。
在一些示例中，所述第一不饱和环状二酮为：
其中F3包含所述寡核苷酸并且每个X独立地为CH或N。在一些示例中，所述第一不饱和环状二酮为三唑啉二酮：
在一些示例中，所述吲哚或吲唑为：
其中Z为CH或N，L包含与所述基底的连接子，并且R为H、吸电子基团或供电子基团。在一些示例中，所述吲哚为1H-吲哚：
其中L为与所述基底的连接子。在一些示例中，所述第一加合物为：
其中F3包含所述寡核苷酸，并且每个X独立地为CH或N。
在一些示例中，所述方法还包括对所述第一加合物进行加热以使偶联到所述基底的所述吲哚或吲唑再生。在一些示例中，所述方法还包括在使偶联到所述基底的所述吲哚或吲唑再生之后，使所述吲哚或吲唑与第二不饱和环状二酮反应以形成第二加合物。在一些示例中，所述第二不饱和环状二酮包括官能团。在一些示例中，所述官能团选自由以下组成的组：第二寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。
在一些示例中，所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。在一些示例中，所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
在一些示例中，所述方法还包括提供包含所述寡核苷酸的4-取代的尿唑，以及使所述4-取代的尿唑氧化以形成包含所述寡核苷酸的所述不饱和环状二酮三唑啉二酮。
本文的一些示例提供一种组合物，所述组合物包含基底，和偶联到所述基底的加合物：
其中L包含与所述基底的连接子，F3包含寡核苷酸，每个X独立地为CH或N，并且Z为CH或N。
在一些示例中，所述加合物为：
在一些示例中，所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。在一些示例中，所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
本文的一些示例提供一种将官能团偶联到基底的方法。所述方法可包括提供偶联到基底的二烯，以及使所述二烯与包含寡核苷酸的不饱和环状二酮反应以形成将所述寡核苷酸偶联到所述基底的第一加合物。
在一些示例中，所述不饱和环状二酮为：
其中F3包含所述寡核苷酸并且每个X独立地为CH或N。
在一些示例中，所述不饱和环状二酮为三唑啉二酮：
在一些示例中，所述不饱和环状二酮为马来酰亚胺：
在一些示例中，所述不饱和环状二酮为4-环戊烯-1,3-二酮：
在一些示例中，所述二烯包括1,3-二烯。在一些示例中，所述1,3-二烯为：
其中L包含与所述基底的连接子。在一些示例中，所述加合物为：
其中L包含与所述基底的连接子，每个X独立地为CH或N，并且F3包含所述寡核苷酸。
在一些示例中，所述加合物为：
在一些示例中，所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。在一些示例中，所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
在一些示例中，所述方法还包括提供包含所述寡核苷酸的4-取代的尿唑，以及使所述4-取代的尿唑氧化以形成包含所述寡核苷酸的所述不饱和环状二酮三唑啉二酮。
本文的一些示例提供一种组合物，所述组合物包含基底，和偶联到所述基底的加合物：
其中L包含与所述基底的连接子，每个X独立地为CH或N，并且F3为寡核苷酸。
在一些示例中，所述加合物为：
在一些示例中，所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。在一些示例中，所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其它(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。
附图说明
图1A-图1E示意性地说明用于将官能团偶联到基底的方法中的示例性组合物和操作。
图2A-图2C示意性地说明用于将官能团偶联到基底的另一方法中的示例性组合物和操作。
图3A-图3B示意性地说明用于将官能团偶联到基底的另一方法中的示例性组合物和操作。
图4A-图4B示意性地说明用于将官能团偶联到基底的另一方法中的示例性组合物和操作。
图5示意性地说明用于将官能团偶联到基底的另一方法中的示例性组合物和操作。
具体实施方式
本文提供的示例涉及包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法。还公开了使用此类组合物的方法。
例如，一些先前已知的将寡核苷酸引物偶联到基底的方法可包括使用相对苛刻的试剂诸如氰尿酰氯、肼或乙醚来制备基底。另外，一些先前已知的偶联化学可以利用肼官能化的玻璃基底与带有5'-醛修饰的寡核苷酸之间的腙形成反应。因此，化学反应可以在约5的相对低的pH处进行，这对于寡核苷酸稳定性可能存在问题，并且可能增加在带正电的寡核苷酸与玻璃基底之间引发非特异性结合的可能性。此外，腙键可以可逆地形成，并且因此可以增加寡核苷酸可以逐渐与玻璃基底解偶联的可能性。在一些其他先前已知的方法中，使用相对苛刻的“点击化学”试剂诸如Cu(I)以及约7-11的相对高的pH将寡核苷酸引物偶联到聚合物基底诸如PAZAM，这对于寡核苷酸稳定性也可能存在问题。
相比之下，本文提供了一种用于制备官能化表面的方法，该官能化表面可以经由一种或多种替代的“点击化学”反应在近似中性或弱碱性pH条件下接受一种或多种官能团，诸如但不限于寡核苷酸。术语“点击化学”是指满足一个或多个标准的反应，例如，可以具有相对高的产率、可以范围相对较广、可以产生可以相对容易去除的副产物、可以相对简单地进行、可以使用相对容易去除的溶剂和试剂进行和/或可以使用相对温和的溶剂和试剂进行。附加地或另选地，“点击化学”反应在热力学上可以是有利的并且可以专门产生一种产物。
在一些示例中，可以使用不饱和环状二酮与二烯、吲唑或吲哚之间的反应将官能团偶联到基底。在本文提供的一些具体示例中，本示例中使用的不饱和环状二酮可以是包括连接到两个羰基官能团的偶氮部分的杂环化合物，例如可以具有诸如以下的结构：
其可以称为三唑啉二酮(TAD)，其中L包含与基底的连接子，并且可以使用二烯或吲哚将官能团偶联到该结构，从而将该官能团偶联到基底。TAD分子的结构可以通过电子共轭来使偶氮官能团稳定。然而，吸电子羰基和电子系统的对称性可以导致轨道控制的亲电反应性，在某些方面类似于碳烯或单态氧的亲电反应性。因此，TAD分子可以容易地参与超快狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应和烯型反应，并提供选择性和可预测的共价连接反应，该共价连接反应在需要催化剂的情况下在相对低的温度(例如，在室温或更低温度处，例如，处于或低于约20℃)处在等摩尔条件下具有相对高的产率。TAD分子对富电子π体系显示出相对高的动力学偏好，这允许对吲哚和替代取代的二烯具有相对良好的选择性。另外，TAD与吲哚或二烯之间的反应的加合物是与大量应用诸如但不限于本文提供的那些应用相容的稳健的杂环支架。作为附加特征，TAD分子在视觉上可以是彩色的，而它们与吲哚或二烯的反应加合物可以是无色的，这提供了评估反应效率的可分析的方法。可用于本发明的组合物和方法的不饱和环状二酮的其他非限制性示例在本文其他地方提供。
在一些示例中，表面偶联的TAD或其他不饱和环状二酮与具有诸如以下的结构的吲哚反应：
其可以称为1H-吲哚，其中F1包含官能团。在非限制性示例中，此类吲哚可以在“可逆点击”反应中与不饱和环状二酮诸如TAD可逆地反应，例如形成加合物：
其可以称为TAD和1H-吲哚的迈克尔加成(Michael-addition)加合物，并且官能团F1经由该加合物偶联到基底。可以与其他不饱和环状二酮反应的吲哚和吲唑的其他非限制性示例在本文其他地方提供。
在一些示例中，表面偶联的TAD与具有诸如以下的结构的1,3-二烯反应：
其可以称为反式，反式-1,3-己二烯，其中F2包含官能团。在一些示例中，此类二烯可以在“超快点击”反应中与不饱和环状二酮诸如TAD基本上不可逆地反应，例如形成加合物：
其可以称为狄尔斯-阿尔德环加成产物，并且官能团F2经由该产物偶联到基底。另选地，二烯可以与TAD或其他不饱和环状二酮与吲哚或吲唑之间的“可逆点击”反应的加合物在“反式点击(transClick)”反应中基本上不可逆地反应，例如形成加合物：
官能团F2经由该加合物偶联到基底，并且在该反应中吲哚被置换导致官能团F1与基底解离。
注意，诸如本文所述的反应可以用于在彼此不同的时间将任何合适数目和类型的官能团偶联到基底。例如，“可逆点击”反应可以用于经由不饱和环状二酮(例如，TAD)和吲哚或吲唑将第一官能团(F1)偶联到基底，并且“反式点击”反应随后可以用于使第一官能团经由吲哚或吲唑与基底解离并经由二烯将第二官能团(F2)偶联到表面。或者，例如，因为“可逆点击”反应是可逆的，所以偶联到表面的不饱和环状二酮(例如，TAD)可以通过将“可逆点击”反应的加合物加热到适当的温度以引起吲哚或吲唑的解离而再生。因此，偶联到表面的不饱和环状二酮(例如，TAD)然后可在另一个“可逆点击”反应(其本身可以是可逆的)中与另一个吲哚或吲唑反应以将另一个官能团偶联到基底，或者在“超快点击”反应中与二烯反应以将又一个官能团偶联到基底。
尽管一些示例可包括使用TAD或经由连接子偶联到基底的其他不饱和环状二酮，但应当理解，在其他示例中，不饱和环状二酮可以被官能化并且可以经由类似的“可逆点击”、“超快点击”或“反式点击”反应偶联到基底。例示性地，TAD具有诸如以下的结构：
其中F3包含官能团，并且其可以经由偶联到基底的二烯、吲哚或吲唑来偶联到基底。在一些示例中，与基于溶液的TAD反应的吲哚可以具有以下结构：
其中L包含与所述基底的连接子。吲哚可以在可逆的“可逆点击”反应中与TAD反应以形成加合物：
其是TAD和1H-吲哚的另一种迈克尔加成加合物，并且官能团F3经由该加合物可以偶联到基底。
在一些示例中，与基于溶液的TAD反应的二烯可以是1,3-二烯，其可以具有以下结构：
其中L包含与所述基底的连接子。二烯可以在基本上不可逆的“超快点击”反应中与TAD或其他不饱和环状二酮反应，例如形成加合物：
其是另一种狄尔斯-阿尔德环加成产物，并且官能团F3经由该产物偶联到基底。
类似地，如上所述，因为“可逆点击”反应是可逆的，所以表面偶联的吲哚或吲唑可以通过将“可逆点击”反应的加合物加热到适当的温度以引起具有与其附接的官能团的TAD或其他不饱和环状二酮的解离而再生。因此，吲哚或吲唑然后可在另一个“可逆点击”反应(其本身可以是可逆的)中与另一个不饱和环状二酮(例如，TAD)反应以将另一个官能团偶联到基底。
首先，将简单地解释本文中所使用的一些术语。然后，将描述包含偶联到基底的官能团的一些示例性组合物，以及制备和使用它们的示例性方法。
术语
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包含(including)”以及如“包含(include)”、“包含(includes)”、和“包含(included)”等其它形式的使用不具限制性。术语“具有(having)”以及如“具有(have)”、“具有(has)”、和“具有(had)”等其它形式的使用不具限制性。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
在本说明书通篇中使用的术语“基本上”、“大约”和“约”用于描述和说明小的波动，诸如由于处理中的变化所引起的小的波动。例如，它们可以指小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。
如本文所用，术语“阵列”是指附接到一个或多个基底的一组不同分子，使得这些不同分子可根据相对位置彼此区分。阵列可包括各自位于基底上的不同可寻址位置处的不同分子。另选地或另外地，阵列可包括各自带有不同的一种或多种分子的单独的基底，其中可根据基底在基底所附接到的表面上的位置或根据基底在液体中的位置来识别不同的分子。
如本文所用，术语“共价连接的”或“共价键合的”是指形成特征在于原子之间共用电子对的化学键合。例如，共价连接的分子是指与基底形成化学键的分子，这与经由其他方式(例如，非共价键诸如静电相互作用)粘附到该表面形成比较。
如本文所用，其中“a”和“b”是整数的“Ca至Cb”或“Ca-b”是指特定基团中的碳原子数。即，该基团可含有“a”至“b”(包括端值)个碳原子。因此，例如，“C1至C4烷基”或“C1-4烷基”或“C1-4烷基”基团是指具有1至4个碳的所有烷基基团，即CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH-、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH2CH(CH3)-和(CH3)3C-。
如本文所用，术语“卤素”或“卤基”意指氟、氯、溴或碘，其中氟和氯是示例。
如本文所用，“烷基”是指完全饱和(即，不包含双键和三键)的直链或支链烃链。烷基基团可以具有1至20个碳原子(每当在本文中出现时，诸如“1至20”的数值范围是指给定范围内的每个整数；例如，“1至20个碳原子”意味着烷基基团可以由1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，最多至并包括20个碳原子组成，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烷基”)。烷基基团还可以是具有1至9个碳原子的中等大小烷基。烷基基团还可以是具有1至4个碳原子的低级烷基。烷基基团可以被命名为“C1-4烷基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C1-4烷基”或“C1-4烷基”表示烷基链中存在一个至四个碳原子，即，烷基链选自由甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基组成的组。典型的烷基基团包括但绝不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等。
如本文所用，“烯基”是指包含一个或多个双键的直链或支链烃链。烯基基团可以具有2至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“烯基”。烯基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小烯基。烯基基团还可以是具有2至4个碳原子的低级烯基。烯基基团可以被命名为“C2-4烯基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C2-4烯基”表示烯基链中存在两个至四个碳原子，即，烯基链选自由乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、丙烯-3-基、丁烯-1-基、丁烯-2-基、丁烯-3-基、丁烯-4-基、1-甲基-丙烯-1-基、2-甲基-丙烯-1-基、1-乙基-乙烯-1-基、2-甲基-丙烯-3-基、丁-1,3-二烯基、丁-1,2-二烯基和丁-1,2-二烯-4-基组成的组。典型的烯基基团包括但绝不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基和己烯基等。
包括烯基基团的基团包括任选取代的烯基、环烯基和杂环烯基基团。
如本文所用，“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链烃链。炔基基团可以具有2至20个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“炔基”。炔基基团还可以是具有2至9个碳原子的中等大小炔基。炔基基团还可以是具有2至4个碳原子的低级炔基。炔基基团可以被命名为“C2-4炔基”或类似的名称。仅以举例的方式，“C2-4炔基”或“C2-4炔基”表示炔基链中存在两个至四个碳原子，即，炔基链选自由乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基组成的组。典型的炔基基团包括但绝不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基等。
包括炔基基团的基团包括任选取代的炔基、环炔基和杂环炔基基团。
如本文所用，“芳基”是指在环骨架中仅包含碳的芳族环或环系(即，共用两个相邻碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基为环系时，该环系中的每个环均为芳族的。芳基基团可以具有6至18个碳原子，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“芳基”。在一些示例中，芳基基团具有6至10个碳原子。芳基基团可以被命名为“C6-10芳基”、“C6或C10芳基”或类似的名称。芳基基团的示例包括但不限于苯基、萘基、薁基和蒽基。
如本文所用，“杂环”是指包括碳原子连同另一个原子(杂原子)(例如氮、氧或硫)的环状化合物。杂环可以是芳族的(杂芳基)或脂族的。脂族杂环可以是完全饱和的或可含有一个或多个或者两个或更多个双键，例如杂环可以是杂环烷基。杂环可包括单个杂环或稠合的多个杂环。
如本文所用，“杂芳基”是指在环骨架中含有一个或多个杂原子(即，除碳之外的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳族环或环系(即，共用两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环系时，该环系中的每个环均是芳族的。杂芳基基团可以具有5至18个环成员(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂芳基”。在一些示例中，杂芳基基团具有5至10个环成员或者5至7个环成员。杂芳基基团可以被命名为“5至7元杂芳基”、“5至10元杂芳基”或类似的名称。杂芳基环的示例包括但不限于呋喃基、噻吩基、酞嗪基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、吲哚基、异吲哚基和苯并噻吩基。
如本文所用，“环烷基”意味着完全饱和的碳环基环或环系。示例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文所用，“环烯基”或“环烯烃”是指具有至少一个双键的碳环基环或环系，其中环系中没有环是芳族的。一个示例为环己烯基或环己烯。另一个示例为降冰片烯或降冰片烯基。
如本文所用，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指在环骨架中具有至少一个杂原子，具有至少一个双键的碳环基环或环系，其中环系中没有环是芳族的。在一些示例中，杂环烯基或杂环烯环或环系为3元、4元、5元、6元、7元、8元、9元或10元。
如本文所用，“环炔基”或“环炔烃”是指具有至少一个三键的碳环基环或环系，其中环系中没有环是芳族的。一个示例为环辛炔。另一个示例为双环壬炔。另一个示例为二苯并环辛炔(DBCO)。
如本文所用，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指在环骨架中具有至少一个杂原子，具有至少一个三键的碳环基环或环系，其中环系中没有环是芳族的。在一些示例中，杂环炔基或杂环炔环或环系为3元、4元、5元、6元、7元、8元、9元或10元。
如本文所用，“杂环烷基”意指在环骨架中含有至少一个杂原子的非芳族环状环或环系。杂环烷基可以稠合、桥接或螺接的方式接合在一起。杂环烷基可具有任何饱和度，前提条件是环系中的至少一个杂环不是芳族的。杂环烷基基团可以具有3至20个环成员(即，构成环骨架的原子(包括碳原子和杂原子)的数目)，但本定义还涵盖出现其中没有指定数值范围的术语“杂环烷基”。杂环烷基基团也可以是具有3至10个环成员的中等大小杂环烷基。杂环烷基基团也可以是具有3至6个环成员的杂环烷基。杂环烷基基团可以被命名为“3至6元杂环烷基”或类似的名称。在一些六元单环杂环烷基中，杂原子选自O、N或S中的一个至最多三个，并且在一些五元单环杂环烷基中，杂原子选自一个或两个选自O、N或S的杂原子。杂环烷基环的示例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、二氧戊环基、咪唑啉基、咪唑烷基、吗啉基、环氧乙烷基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、哌啶基、哌嗪基、二氧代哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、吡咯烷二酮基、4-哌啶酮基、吡唑啉基、吡唑烷基、1,3-二噁英基、1,3-二噁烷基、1,4-二噁英基、1,4-二噁烷基、1,3-氧硫杂环己烷基、1,4-氧硫杂环己烯基、1,4-氧硫杂环己烷基、2H-1,2-噁嗪基、三噁烷基、六氢-1,3,5-三嗪基、1,3-间二氧杂环戊烯基、1,3-二氧戊环基、1,3-二噻吩基、1,3-二噻烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、噁唑烷酮基、噻唑啉基、噻唑烷基、1,3-氧硫杂环戊烷基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢-1,4-噻嗪基、硫代吗啉基、二氢苯并呋喃基、苯并咪唑烷基和四氢喹啉。
如本文所用，取代的基团衍生自未取代的母体基团，其中已存在一个或多个氢原子与另一个原子或基团的交换。除非另外指明，否则当基团被认为是“取代的”时，这意味着该基团被一个或多个取代基取代，所述取代基独立地选自：C1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C6炔基、C1-C6杂烷基、C3-C7碳环基(任选被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、C3-C7碳环基-C1-C6-烷基(任选被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、5至10元杂环基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、5至10元杂环基-C1-C6-烷基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、芳基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、芳基(C1-C6)烷基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、5至10元杂芳基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、5至10元杂芳基(C1-C6)烷基(任选地被卤基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基和C1-C6卤代烷氧基取代)、卤基、氰基、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基(C1-C6)烷基(即，醚)、芳氧基、硫氢基(巯基)、卤基(C1-C6)烷基(例如，–CF3)、卤基(C1-C6)烷氧基(例如，–OCF3)、C1-C6烷硫基、芳硫基、氨基、氨基(C1-C6)烷基、硝基、O-氨甲酰基、N-氨甲酰基、O-硫代氨甲酰基、N-硫代氨甲酰基、C-酰氨基、N-酰氨基、S-亚磺酰氨基、N-亚磺酰氨基、C-羧基、O-羧基、酰基、氰酸根、异氰酸根、硫氰酸根、异硫氰酸根、亚磺酰基、磺酰基和氧代基(＝O)。在基团被描述为“任选地取代的”的任何地方，该基团可以被上述取代基取代。
在本文公开的化合物具有至少一个立构中心的情况下，它们可以作为单独的对映体或非对映体存在，或作为此类异构体(包括外消旋物)的混合物存在。分离单独的异构体或选择性合成单独的异构体通过应用本领域技术人员熟知的各种方法来实现。在本文公开的化合物被理解为以互变异构形式存在的情况下，所有互变异构形式都包括在所描绘的结构的范围内。除非另外指明，否则所有此类异构体和它们的混合物都包括在本文公开的化合物的范围内。此外，本文公开的化合物可以以一种或多种结晶或无定形形式存在。除非另外指明，否则所有此类形式都包括在本文公开的化合物的范围内，包括任何多晶型形式。此外，本文公开的一些化合物可以与水(即，水合物)或常见有机溶剂形成溶剂化物。除非另有指明，否则此类溶剂化物包括在本文公开的化合物的范围内。
如本文所用，术语“核苷酸(nucleotide)”打算意指包含糖和至少一个磷酸酯基团，并且在一些示例中还包含核碱基的分子。缺乏核碱基的核苷酸可被称为“无碱基(abasic)”的。核苷酸包含脱氧核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、经修饰的肽核苷酸、经修饰的磷酸糖主链核苷酸、和它们的混合物。核苷酸的示例包含单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、单磷酸胸苷(TMP)、二磷酸胸苷(TDP)、三磷酸胸苷(TTP)、单磷酸胞苷(CMP)、二磷酸胞苷(CDP)、三磷酸胞苷(CTP)、单磷酸鸟苷(GMP)、二磷酸鸟苷(GDP)、三磷酸鸟苷(GTP)、单磷酸尿苷(UMP)、二磷酸尿苷(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、单磷酸脱氧腺苷(dAMP)、二磷酸脱氧腺苷(dADP)、三磷酸脱氧腺苷(dATP)、单磷酸脱氧胸苷(dTMP)、二磷酸脱氧胸苷(dTDP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、二磷酸脱氧胞苷(dCDP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、单磷酸脱氧鸟苷(dGMP)、二磷酸脱氧鸟苷(dGDP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、单磷酸脱氧尿苷(dUMP)、二磷酸脱氧尿苷(dUDP)、和三磷酸脱氧尿苷(dUTP)。
如本文所用，术语“核苷酸”也打算涵盖任何核苷酸类似物，该核苷酸类似物是包含与天然存在的核苷酸相比经修饰的核碱基、糖、和/或磷酸酯部分的类型的核苷酸。示例性经修饰的核碱基包含肌苷、黄嘌呤(xathanine)、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代取代的尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮腺嘌呤等。如本领域中已知，某些核苷酸类似物无法并入到多核苷酸中，例如如5’-磷酰硫酸腺苷的核苷酸类似物。核苷酸可以包含任何适合数目的磷酸酯，例如三个、四个、五个、六个、或多于六个磷酸酯。
如本文所用，术语“多核苷酸(polynucleotide)”是指包含彼此结合的核苷酸序列的分子，并且可以与术语“寡核苷酸(oligonucleotide)”可互换地使用。术语“多核苷酸(polynucleotide)”和“寡核苷酸(oligonucleotide)”在本文中可互换地使用。除非另外具体地指示，否则不同术语并不意图表示大小、序列、或其它特性的任何具体差异。为了描述清楚起见，当描述包含若干多核苷酸物类的具体方法或组合物时，术语可用于区分一种多核苷酸物类与另一种物类。多核苷酸为聚合物的一个非限制性示例。多核苷酸的示例包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和它们的类似物。多核苷酸可以是核苷酸的单链序列，如RNA或单链DNA；核苷酸的双链序列，如双链DNA；或可以包含核苷酸的单链和双链序列的混合物。双链DNA(dsDNA)包含基因组DNA、以及PCR和扩增产物。单链DNA(ssDNA)可以转化成dsDNA并且反之亦然。多核苷酸可以包含非天然存在的DNA，如对映异构体DNA。多核苷酸中核苷酸的精确序列可为已知或未知的。以下为多核苷酸的示例：基因或基因片段(例如探针、引物、表达的序列标签(EST)或基因表达系列分析(SAGE)标签)、基因组DNA、基因组DNA片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、前述任一者的核酸探针、引物、或扩增复本。
如本文所用，“聚合酶(polymerase)”打算意指具有通过将核苷酸聚合成多核苷酸来组装多核苷酸的活性位点的酶。聚合酶可以结合引发的单链靶多核苷酸，并且可以将核苷酸依序添加到生长引物以形成具有与靶多核苷酸的序列互补的序列的“互补复制(complementary copy)”多核苷酸。接着，另一聚合酶或相同聚合酶可以通过形成该互补复制多核苷酸的互补复本形成靶核苷酸的复本。此类复本中的任一者可在本文中被称作“扩增子(amplicon)”。DNA聚合酶可以结合到靶多核苷酸并且然后沿靶多核苷酸向下移动，将核苷酸依序添加到生长多核苷酸链(生长扩增子)的3’端处的游离羟基基团。DNA聚合酶可以自DNA模板合成互补DNA分子并且RNA聚合酶可以自DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可以使用短RNA或DNA链(引物)来开始链生长。一些聚合酶可以使它们将碱基添加到链的位点上游的链移位。此类聚合酶可以称为链移位的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链移位活性的示例性聚合酶包含但不限于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus，Bst)聚合酶、外-克列诺(exo-Klenow)聚合酶、或测序级T7外-聚合酶的大片段。一些聚合酶使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换前方链(5’核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有使它们后面的链降解的活性(3’核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或以其它方式修饰以减少或消除3’和/或5’核酸外切酶活性。
如本文所用，术语“引物(primer)”是指核苷酸可以通过游离3’OH基团添加到上面的多核苷酸。引物长度可以是任何适合数目个碱基的长度，并且可以包含天然和非天然核苷酸的任何适合组合。靶多核苷酸可以包含“衔接子(adapter)”，该衔接子可与引物杂交(具有与引物互补的序列)，并且可以扩增以便通过将核苷酸添加到引物的游离3’OH基团来产生互补复制多核苷酸。引物可与基底耦合。
在一些示例中，在基底表面上使用的引物是可从Illumina公司商购获得的P5和P7引物。在一些示例中，P5和P7引物序列可以具有以下序列：
配对读段组：
P5：5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'
P7：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT-3'
单个读段组：
P5：5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'
P7：5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'
其中G*是G或8-氧代鸟嘌呤。
在一些示例中，所连接的寡核苷酸(如引物或者P5或P7引物)在5'末端处包括连接子或间隔区。可以包括此类连接子或间隔区，以便允许化学或酶促裂解，或者赋予一些其他期望的特性，例如以实现与聚合物或固体载体的共价连接，或充当间隔区以将裂解位点定位成与固体载体相距最佳距离。在某些情况下，10个间隔区核苷酸可以定位于P5或P7引物与聚合物或固体载体的连接点之间。在一些示例中，使用polyT间隔区，但也可以使用其他核苷酸以及它们的组合。在一个示例中，间隔区是6T至10T间隔区。在一些示例中，连接子包括可裂解核苷酸，该可裂解核苷酸包含可化学裂解的官能团，如邻二醇或烯丙基T。
如本文所用，术语“扩增子(amplicon)”当关于多核苷酸使用时打算意指复制多核苷酸的产物，其中产物具有与多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分基本上相同或基本上与多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。“扩增(amplification)”和“扩增(amplifying)”是指制造多核苷酸的扩增子的工艺。靶多核苷酸的第一扩增子可以是互补的复本。额外扩增子为在产生第一扩增子之后从靶多核苷酸或从第一扩增子产生的复本。后续扩增子可具有与靶多核苷酸基本上互补或与靶多核苷酸基本上一致的序列。应理解，当产生多核苷酸的扩增子时，可出现该多核苷酸的少量突变(例如由于扩增伪影)。
如本文所用，术语“硅烷”是指含有一个或多个硅原子的有机或无机化合物。无机硅烷化合物的非限制性示例为SiH4或其中氢被一个或多个卤素原子替代的卤代SiH4。有机硅烷化合物的非限制性示例为X-RC-Si(ORD)3，其中X为不可水解的有机基团，诸如氨基、乙烯基、环氧基、甲基丙烯酸根基、硫、烷基、烯基或炔基；RC为间隔基，例如-(CH2)n-，其中n为0至1000；每个RD独立地选自氢、任选取代的烷基、任选取代的烯基、任选取代的炔基、任选取代的碳环基、任选取代的芳基、任选取代的5至10元杂芳基和任选取代的5至10元杂环基，如本文所定义。在一些示例中，硅烷可以是交联的，使得X-RC-Si(ORD)3的-ORD基团的氧原子附接到相邻有机硅烷化合物X-RC-Si(ORD)3的硅原子。此外，硅烷化合物可以通过X-RC-Si(ORD)3部分与表面上的氧原子的共价结合而附接到基底表面。因此，在一些示例中，所述的硅烷包括以下结构：
如本文所用，术语“硅烷”可包括不同硅烷化合物的混合物。在一些示例中，X为降冰片烯基基团。在一些示例中，X为双环壬炔基基团。在一些示例中，X为含烯烃或含炔烃基团。在一些示例中，X为烯烃或炔烃。在一些示例中，RC连接子为C2-6亚烷基基团。
如本文所用，术语“基底”是指包括固体载体的材料。基底可包含限定固体载体或设置在固体载体上的聚合物。示例性基底材料可包含玻璃、二氧化硅、塑料、石英、金属、金属氧化物、有机硅酸酯(例如，多面体有机倍半硅氧烷(POSS))、聚丙烯酸酯、氧化钽、互补金属氧化物半导体(CMOS)、或它们的组合。POSS的示例可以是描述于Kehagias等人，《微电子工程改造(Microelectronic Engineering)》86(2009)，第776-778页中的POSS，该文献以全文引用的方式并入。例示性地，含POSS的单体可以快速聚合达到胶凝点，以提供POSS树脂(被官能化以包括POSS的聚合物)，在该树脂上可以进行软材料官能化。在一些示例中，本申请中使用的基底包含二氧化硅类基底，如玻璃、熔融硅石、或其它含二氧化硅材料。在一些示例中，基底可以包含硅、氮化硅、或氢化硅酮。在一些示例中，本申请中使用的基底包含塑料材料或组分，如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯、和聚(甲基丙烯酸甲酯)。示例性塑料材料包含聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯、和环烯烃聚合物基底。在一些示例中，基底为或包含二氧化硅类材料或塑料材料或它们的组合。在具体示例中，基底具有至少一个包括玻璃或硅类聚合物的表面。在一些示例中，基底可包含金属。在一些此类示例中，金属为金。在一些示例中，基底具有至少一个包括金属氧化物的表面。在一个示例中，表面包括氧化钽或氧化锡。丙烯酰胺、烯酮、或丙烯酸酯也可用作基底材料或组分。其它基底材料可包含但不限于砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物、和共聚物。在一些示例中，基底和/或基底表面可以是或包含石英。在一些其它示例中，基底和/或基底表面可为或包含例如GaAs或ITO的半导体。前述列表旨在说明但不限于本申请。基底可包括单一材料或多种不同材料。基底可以是复合物或层合物。在一些示例中，基底包括有机硅酸酯材料。基底可以是平坦的、圆形的、球形的、杆状的、或任何其它适合的形状。基底可以是刚性的或柔性的。在一些示例中，基底为珠粒或流通池。
在一些示例中，基底包含图案化表面。“图案化表面(patterned surface)”是指在基底的暴露层中或上的不同区域的布置。举例来说，区域中的一者或多者可以是其中存在一个或多个捕获引物的特征部。特征部可以由其中不存在捕获引物的间隙区域分隔开。在一些示例中，图案可为成行和成列的x-y形式的特征部。在一些示例中，图案可以是重复布置的特征部和/或间隙区域。在一些示例中，图案可为随机布置的特征部和/或间隙区域。在一些示例中，基底在表面中包含孔(凹陷)的阵列。孔可由基本上竖直的侧壁提供。在一些示例中，基底在表面中包含柱形件(凸起)的阵列。孔和柱形件可如本领域通常已知的那样使用多种技术来制造，这些技术包括但不限于光刻、压印技术、模制技术、纳米压印光刻和微蚀刻技术。本领域的技术人员将会知道，所使用的技术将取决于阵列基底的组成和形状。例示性地，直径在约50nm至约500nm之间的柱形件可以称为纳米柱形件，并且可以具有与直径类似的尺寸的高度。
基底的图案化表面中的特征部可包含玻璃、硅、塑料或其他合适材料上的特征部阵列(例如，孔，诸如微孔或纳米孔，或柱形件诸如纳米柱形件)，其中具有图案化的共价连接凝胶，如聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。该工艺产生用于测序的凝胶垫，该凝胶垫在具有大量循环的测序运行中可为稳定的。聚合物与孔的共价连接可有助于在多种用途期间的结构化基底的整个寿命期间将凝胶保持为结构化特征部。然而，在许多示例中，凝胶不需要共价连接到孔。举例来说，在一些条件下，不共价连接到结构化基底的任何部分的无硅烷丙烯酰胺(SFA)可用作凝胶材料。
在具体示例中，结构化基底可通过以下方法来制造：将适合材料图案化为具有孔(例如，微孔或纳米孔)，用凝胶材料(例如，PAZAM、SFA或它们化学改性的变体，如SFA的叠氮化形式(叠氮-SFA))涂覆图案化材料，并且例如通过化学或机械抛光来抛光已涂覆凝胶的材料的表面，从而将凝胶保持在孔中，但从孔之间的结构化基底的表面上的间隙区域去除基本上所有凝胶或使基本上所有凝胶失活。引物可以连接到凝胶材料。包含多种靶多核苷酸(例如片段化人类基因组或它的部分)的溶液接着可与抛光基底接触，使得个别靶多核苷酸将通过与连接到凝胶材料的引物的相互作用来对个别孔接种；然而，由于不存在凝胶材料或凝胶材料无活性，靶多核苷酸将不占据间隙区域。因为间隙区域中不存在凝胶或凝胶无活性可以阻止生长丛集的向外迁移，所以靶多核苷酸的扩增可以限制于孔中。该工艺可方便地制造、可扩展、且利用常规微型或纳米制造方法。
图案化基底可包含例如在载片或芯片中提供蚀刻的孔。孔的蚀刻的图案和几何形状可呈多种不同形状和大小，并且此类特征部可在物理上或功能上与彼此分开。具有此类结构特征部的尤其有用的基底包含可以选择如微球体的固体粒子的大小的图案化基底。具有这些特性的示例图案化基板是与珠粒阵列技术(加利福尼亚州圣地亚哥Illumina公司(Illumina,Inc.,San Diego,Calif.))结合使用的蚀刻基板。纳米压印光刻(NIL)可用于提供孔。
在一些示例中，本文所描述的基底形成流通池的至少部分、或位于流通池中、或与流通池耦合。流通池可包含划分成多个泳道或多个分区的流动腔室。本文所阐述的方法和组合物中可以使用的示例性流通池和用于制造流通池的基底包含但不限于可购自Illumina公司(加利福尼亚州圣地亚哥)的那些。
如本文所用，术语“结构”是指键合到基底的化合物，例如共聚物。例如，共聚物可以例如经由叠氮基基团共价键合到基底。
如本文所用，术语“聚合物”是指包含许多重复亚基或重复单元的分子。聚合物结构的非限制性示例包括直链、支链或超支链聚合物。直链聚合物的非限制性示例包括嵌段共聚物或无规/统计共聚物。支链聚合物的非限制性示例包括星型聚合物、包括疏水性和亲水性链段两者的星型或星型嵌段聚合物、包括疏水性和亲水性链段两者的H型聚合物、哑铃型聚合物、梳型聚合物、刷状聚合物、树枝化聚合物、梯状物和树枝状体。聚合物可以是交联的或轻度交联的。如本文所述的聚合物可以是直链、支链、超支链或树枝状的。本文所述的聚合物还可以呈聚合物纳米颗粒的形式。聚合物结构的其他示例包括但不限于环嵌段聚合物和螺旋-循环-螺旋聚合物。具有多于一种类型的重复单元的聚合物可以排列为嵌段共聚物、无规共聚物，或交替共聚物，或它们的混合物。最终共聚物结构可以是不同的结构，包括例如无规共聚物、嵌段共聚物、梳型聚合物或星型聚合物结构。不同种类的聚合物主链包括但不限于聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚氨酯、聚硅氧烷、硅酮、聚丙烯醛、聚磷腈、多异氰酸酯、多元醇、多糖、多肽以及它们的组合。在一些示例中，聚合物包括聚丙烯酰胺主链。在一些其他示例中，聚合物包括聚丙烯酸酯主链。在另外一些其他示例中，聚合物包括聚氨酯主链。在另外一些其他示例中，聚合物包括聚磷腈主链。在另外一些其他示例中，聚合物包括树枝状体主链。
如本文所用，术语“荧光团”旨在表示响应于在不同于第一波长的第二波长处的光的激发而发射第一波长处的光的分子。由荧光团发射的光可被称为“荧光”，并且可通过合适的光学电路检测。
如本文所用，“检测”荧光旨在表示从荧光团接收光、基于接收到的光生成电信号，并且使用电信号确定从荧光团接收到光。可使用任何合适的光学检测电路检测荧光，该光学检测电路可包括基于从荧光团接收的光生成电信号的光学检测器，和使用电信号确定从荧光团接收到光的电子电路。作为一个示例，光学检测器可包括有源像素传感器(APS)，该有源像素传感器包括放大光电探测器阵列，该放大光电探测器阵列被配置成基于由光电探测器接收的光生成电信号。APS可基于本领域已知的互补金属氧化物半导体(CMOS)技术。基于CMOS的检测器可包括场效应晶体管(FET)，例如金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)。在特定示例中，可使用具有单光子雪崩二极管(CMOS-SPAD)的CMOS成像仪以例如执行荧光寿命成像(FLIM)。在其它示例中，光学检测器可包括光电二极管，诸如雪崩光电二极管、电荷耦合器件(CCD)、低温光子检测器、反向偏置发光二极管(LED)、光敏电阻器、光电晶体管、光伏电池、光电倍增管(PMT)、量子点光电导体或光电二极管等。该光学检测电路还可包括硬件和软件的任何合适的组合，该组合与光学检测器可操作地通信以便从光学检测器接收电信号并且被配置成基于此种信号检测荧光，例如基于光学检测器检测到来自荧光团的光。例如，电子电路可包括存储器和耦合到存储器的处理器。存储器可存储用于使处理器从光学检测器接收信号并使用此种信号检测荧光团的指令。例如，指令可使处理器使用来自光学检测器的信号确定荧光在光学检测器的视野内发射，并使用此种确定来确定存在荧光团。
如本文所用，术语“加合物”旨在意指两个或更多个分子之间的化学反应的产物，其中产物含有发生反应的分子的所有原子。
如本文所用，术语“连接子”旨在意指一个或多个分子，一个元素经由该分子附接到另一个元素。例如，连接子可以将分子附接到基底。连接子可以是共价的，或可以是非共价的。共价连接子的非限制性示例包括烷基链、聚醚、酰胺、酯、芳基基团、聚芳基等。非共价连接子的非限制性示例包括主-客体复合、环糊精/降冰片烯、金刚烷与β-CD的包合复合、DNA杂交相互作用等。
如本文所用，术语“官能团”旨在意指可以与一个或多个其他分子相互作用的一个或多个分子。如本文所用，称为“官能化”的元素意指该元素包括官能团。例如，官能团可以共价键合到一个或多个其他分子，例如，可以与一个或多个其他分子可逆地或基本上不可逆地反应以形成产物。或者，例如，官能团可以与一个或多个其他分子非共价结合。官能团的非限制性示例包括寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。例示性地，包括寡核苷酸(诸如引物)的官能团可以与另一个寡核苷酸(诸如待扩增或测序的多核苷酸)杂交。或者，包括标记物的官能团可包括荧光团或FRET(共振能量转移)配偶体，并且来自荧光团或FRET配偶体的荧光的检测可以用于表征标记物所附接的分子。
包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法
如上所述和如下文更详细描述的，本发明的组合物和方法提供了将任何合适的官能团偶联到基底的简单方式，并且在一些示例中使用常见的反应组分将不同的官能团相继偶联到基底。在诸如参考图1A-图1E和2A-图2C所述的示例中，不饱和环状二酮经由连接子偶联到基底，并且官能化的吲哚、官能化的吲唑或官能化的二烯与其反应以形成反应加合物，官能团经由该反应加合物偶联到基底。在诸如参考图3A-图3B所述的其他示例中，吲哚或吲唑经由连接子偶联到基底，并且官能化的不饱和环状二酮与其反应以形成反应加合物，官能团经由该反应加合物偶联到基底。在诸如参考图4A-图4B所述的其他示例中，二烯经由连接子偶联到基底，并且官能化的不饱和环状二酮与其反应以形成反应加合物，官能团经由该反应加合物偶联到基底。
图1A-图1E示意性地说明用于将官能团偶联到基底的方法中的示例性组合物和操作。尽管图1A-图1E说明可以用于本发明的组合物和操作中的分子的具体示例，但应当理解，可以适当地使用其他分子。
现在参考图1A，组合物100包含经由相应的连接子(L)偶联到基底101的多个不饱和环状二酮110。例示性地，不饱和环状二酮可以具有以下结构：
其中L包含与基底101的连接子并且每个X独立地为CH或N。在一些示例中，诸如图1A中所示，不饱和环状二酮110可包括具有以下结构的TAD分子：
在其他示例中，不饱和环状二酮110可包括具有以下结构的马来酰亚胺分子：
在另外其他示例中，不饱和环状二酮110可包括具有以下结构的4-环戊烯-1,3-二酮分子：
本文其他地方提供了连接子(L)的非限制性示例。基底101可包含设置在固体载体上的聚合物，或可包括不具有设置在其上的聚合物的固体载体。在一些示例中，固体载体可包含诸如本文其他地方所述的任何基底材料。聚合物(如果包括的话)可包括诸如本文其他地方所述的任何合适的聚合物，例示性地被官能化以包括POSS的聚合物。基底可以用硅烷处理以促进聚合物和/或不饱和环状二酮的捕获。L可以以任何合适的方式偶联到基底101(例如，偶联到固体载体或偶联到设置在固体载体上的聚合物)。例如，可以使用具有相关官能团的单体来使聚合物刷生长。
不饱和环状二酮可以与包含第一官能团(F1)的吲哚或吲唑分子反应以形成将第一官能团偶联到基底的第一加合物。例如，以诸如图1A中所示的方式，TAD分子110可以与包含第一官能团(F1)的吲哚分子120反应以形成将第一官能团偶联到基底的第一加合物。不饱和环状二酮可以在任何合适的反应温度(例如，室温)处与溶解在与二酮分子和吲哚或吲唑分子相容的任何合适溶剂(例如，极性质子溶剂诸如水或醇，或极性非质子溶剂诸如乙腈、酯或醚)中的吲哚或吲唑分子120接触。在图1A中所示的非限制性示例中，吲哚分子120可以具有以下结构：
其可以称为1H-吲哚，并且其中F1包含第一官能团。然而，不饱和环状二酮可以与任何合适的吲哚或吲唑，例如具有以下结构的分子反应：
其中R为H、吸电子基团或供电子基团，并且Z为CH或N。例示性地，吲唑可以具有以下结构：
其可以称为1H-吲唑。
第一官能团可以是或包括诸如本文其他地方所述的任何合适的一个或多个分子。在非限制性示例中，第一官能团(F1)可以选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子(诸如PEG)、亲水性大分子、催化剂和标记物。例示性地，第一官能团(F1)可以是或包括寡核苷酸。
不饱和环状二酮与吲哚或吲唑的反应可以提供包含多个第一加合物分子130的组合物，该第一加合物分子可以具有以下结构：
其可以称为迈克尔加成加合物，并且其中X、Z、R、L和F1如本文其他地方所定义。例示性地，在图1B中所示的具体示例中，TAD分子110和吲哚分子120的反应可以提供包含多个第一加合物分子130的组合物100'，该第一加合物分子可以具有以下结构：
基于本文提供的教导，可以容易地设想例如使用不饱和环状二酮与吲哚或吲唑之间的迈克尔加成反应将F1偶联到基底的其他加合物。
不饱和环状二酮分子110与吲哚或吲唑分子120之间的反应可以是可逆的，并且可以称为“可逆点击”反应。因此，在一些示例中，可以将加合物分子130加热到合适的温度以使偶联到基底的不饱和环状二酮分子110再生并以诸如图1C中保留偶联基底101的TAD分子和解离的吲哚分子所说明的方式引起吲哚或吲唑分子120(和与其偶联的第一官能团F1)的解离。例如，可以将基底101加热到至少50℃的温度，或约50℃至约100℃的温度，或约60℃至约90℃的温度，或约60℃至约80℃的温度以使偶联到基底的不饱和环状二酮分子110再生并引起吲哚或吲唑分子120的解离。作为一种选择，在使不饱和环状二酮分子110再生之后，二酮分子可以以诸如参考图1A-图1C所述的方式与另一个官能化的吲哚或吲唑反应。类似地，此类反应可以是可逆的，并且因此不饱和环状二酮分子110可以再次再生以用于进一步的反应。
注意，加合物分子130的反应性可以显著低于不饱和环状二酮110，例如，其反应性可以显著低于TAD。因此，吲哚或吲唑分子120可以被认为是“保护”不饱和环状二酮(例如，TAD分子)。因此，在一些示例中，可以认为不饱和环状二酮110通过加热以逆转“可逆点击”反应或通过在“反式点击”反应(诸如下文进一步描述)中使加合物分子130与二烯反应而“去保护”。就这一点而言，注意用作保护剂的吲哚或吲唑分子120可包含官能团，或可以不包含官能团。另外，在一些示例中，只有吲哚或吲唑分子的子组与加合物分子130解离(无论是通过“反式点击”还是“可逆点击”)，并且偶联到基底的剩余吲哚分子可以继续保护不饱和环状二酮不参与不期望的化学或生物化学反应。在一些示例中，吲哚或吲唑分子120包含可以抑制基底结垢的官能团诸如亲水性分子(诸如PEG)，并且在其中基底用于多核苷酸测序的示例中，可以有助于提高更长测序运行的测序质量。
不饱和环状二酮可以与包含第二官能团(F2)的二烯反应以形成将第二官能团偶联到基底的第二加合物。二烯可包括1,3-二烯，其可包括在二烯的任何碳上的取代，并且可包括可以设想增加反应性的任何合适的杂原子取代方案。在一些示例中，以诸如图1D中所示的方式，TAD分子110可以与包含第二官能团(F2)的1,3-二烯140反应以形成将第二官能团偶联到基底的第二加合物。在TAD分子110以诸如参考图1A-图1C所述的方式再生之前，TAD分子110可以已经，但不是必须已经预先与吲哚120反应以形成加合物130。在图1D中所示的组合物102中，TAD分子110可以与溶解在与TAD分子和二烯分子相容的任何合适溶剂(例如，极性质子溶剂诸如水或醇，或极性非质子溶剂诸如乙腈、酯或醚)中的1,3-二烯分子140接触。
在图1D中所示的非限制性示例中，1,3-二烯分子140可以具有以下结构：
(反式，反式-1,3-己二烯)。然而，应当理解，可以适当地使用许多其他二烯。例如，二烯分子140相反可以是例如具有以下结构的2,4-二烯：
(反式，反式-2,4-己二烯)。在另外其他示例中，二烯可包括例如具有以下结构的丹尼谢夫斯基二烯(Danishefsky's diene)：
(1-甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-丁-1,3-二烯)。在另外其他示例中，二烯可包括丹尼谢夫斯基二烯的衍生物，诸如例如具有以下结构的布拉萨尔二烯(Brassard diene)：
(1,3-烷氧基-1-三甲基甲硅烷氧基-1,3-丁二烯)，其中R基团中的至少一个基团可包括F2并且R基团中的另一个基团可例示性地包括甲基或乙基；或诸如例如具有以下结构的拉瓦尔二烯(Rawal diene)：
(1-二烷基氨基-3-三甲基甲硅烷氧基-1,3-丁二烯)，其中R基团中的至少一个基团可包括F2并且R基团中的另一个基团可例示性地包括甲基或乙基。可类似地使用Chan二烯。
在一些示例中，二烯的第二官能团(F2)可以选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。例示性地，第二官能团为寡核苷酸。在其中不饱和环状二酮110在与二烯分子140反应之前由加合物130再生的一些示例中，二烯分子140的第二官能团(F2)可以不同于吲哚分子120的第一官能团(F1)。例示性地，第一官能团可包括寡核苷酸并且第二官能团可包括除寡核苷酸以外的要素，诸如亲水性分子、亲水性大分子、催化剂或标记物。或者，第一官能团可包括第一寡核苷酸并且第二官能团可包括不同于第一寡核苷酸的第二寡核苷酸。另选地，二烯分子140的第一官能团(F2)可以与吲哚分子120的第一官能团(F1)相同。
在图1E中所示的非限制性示例中，TAD分子110的[4+2]环化反应可以提供包含多个第二加合物分子150的组合物102'，该第二加合物分子可以具有以下结构：
其中L为与基底的连接子并且F2为第二官能团。然而，基于本发明的教导，可以设想其他不饱和环状二酮和/或其他二烯之间的反应的其他加合物。例示性地，不饱和环状二酮
与反式，反式-1,3-己二烯的反应可以产生加合物：
其中X为CH或N。在其中不饱和环状二酮为马来酰亚胺的示例中，加合物可以具有以下结构：
在其中不饱和环状二酮为4-环戊烯-1,3-二酮的示例中，加合物可以具有以下结构：
不饱和环状二酮110(例如，TAD)与二烯分子140(例如，1,3-二烯)之间形成第二加合物分子150的反应(其非限制性示例在图1E中示出)可以是基本上不可逆的。当此类反应通过图1D中所示的方案进行(例如，通过使不饱和环状二酮110与二烯分子140接触)时，此类反应可以称为“超快点击”反应。然而，图1E中所示的第二加合物分子150另选地可以通过不同的反应方案获得。更具体地，二烯分子140相反可以例如通过以诸如图1F中所示的方式使组合物100'与包含二烯分子140的合适溶剂接触而与第一加合物分子130反应。在图1F中所示的组合物101”中，二烯分子140可以从加合物分子130中置换吲哚或吲唑分子120，从而使第一官能团F1与基底101解离并将第二官能团F2偶联到基底以形成图1E中所示的组合物102'的第二加合物分子150。因此，可以认为吲哚分子120在加合物分子130与二烯分子140反应之前“保护”不饱和环状二酮110(诸如TAD)。
应当理解，诸如参考图1A-图1F所述的偶联到基底101的不饱和环状二酮110可以使用任何合适的操作组合来制备。例如，TAD分子110可以经由氧化机制经由4-取代的尿唑(其中尿唑的4-取代基例如经由连接子L偶联到基底)来制备。例如，图2A-图2C示意性地说明用于将官能团偶联到基底的另一方法中的示例性组合物和操作。如图2A中所示，基底101可以被官能化从而包括例如使用可从Silicones–PCC Group(Nanjing,China)商购获得的异氰酸酯经由连接子L与其偶联的异氰酸酯111。异氰酸酯111可以与具有以下结构的化合物112接触并与其发生缩合反应：
其可以称为N-氨基乙氧基氨基甲酸酯或氨基甲酸肼。在一些示例中，化合物112可以通过使肼(N2H4)与以下化合物反应来获得：
如图2B中所示，异氰酸酯111和化合物112的反应产物113可以具有以下结构：
其中L为与基底的连接子。然后反应产物113可以进行碱介导的环化反应以形成以诸如图2C中所示的方式偶联到基底并具有以下结构的4-取代的尿唑114：
其中L为与基底的连接子。4-取代的尿唑114可以被氧化以形成经由连接子L偶联到基底101的TAD分子110，诸如参考图1A和图1D所述。多种氧化条件可以用于将4-取代的尿唑114转化为TAD分子110，诸如使用原位产生的N2O4氧化、过酸条件、高价碘化物物质、过硫酸氢钾、次氯酸盐、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷溴(DABCO-Br)或氯酸盐。
注意，4-取代的尿唑114的反应性可以显著低于TAD分子110。因此，4-取代的尿唑114可以被认为提供“保护性”基团，并且可以不被氧化以形成TAD分子110，直到其即将旨在以诸如参考图1A-图1F所述的方式使TAD分子与二烯或吲哚反应之前。可以适当地使用用于偶联其他类型的不饱和环状二酮的方案，诸如本文其他地方所述的那些方案。
如上文进一步指出的，尽管在一些示例中，不饱和环状二酮偶联到基底并与溶液中的官能化的二烯、吲唑或吲哚反应，但在其他示例中，二烯、吲唑或吲哚可以偶联到基底并与溶液中的官能化的不饱和环状二酮反应。
例如，图3A-图3B示意性地说明用于将官能团偶联到基底的另一方法中的示例性组合物和操作。现在参考图3A，组合物300包含经由相应的连接子(L)偶联到基底301的多个吲哚或吲唑分子320。吲哚或吲唑分子320可以具有以下结构：
其中Z为CH或N；L包含与基底的连接子；并且R为H、吸电子基团或供电子基团。在图3A中所示的非限制性示例中，吲哚分子320可以具有以下结构：
其中L为与基底301的连接子。参考图1A-图1F提供吲哚和吲唑的其他示例性结构。本文其他地方提供了L和基底的非限制性示例。基底301可包含设置在固体载体上的聚合物(例如，被官能化以包括POSS的聚合物)，或可包括不具有设置在其上的聚合物的固体载体。
吲哚或吲唑分子可以与包含官能团(F3)的不饱和环状二酮反应以形成将官能团偶联到基底的加合物。例如，以诸如图3A中所示的方式，吲哚分子320与包含官能团(F3)的TAD分子310反应以形成将官能团偶联到基底的加合物。例如，吲哚或吲唑分子320可以与溶解在与不饱和环状二酮分子和吲哚或吲唑分子相容的任何合适溶剂(例如，极性质子溶剂诸如水或醇，或极性非质子溶剂诸如乙腈、酯或醚)中的不饱和环状二酮310接触。
不饱和环状二酮可以具有以下结构：
其中X为CH或N，并且其中F3包含官能团。在图3A中所示的非限制性示例中，不饱和环状二酮可包括具有以下结构的TAD分子310：
另选地，不饱和环状二酮可包括马来酰亚胺或被官能化以在4位包括F3的4-环戊烯-1,3-二酮。官能团可以是或包括诸如本文其他地方所述的任何合适的一个或多个分子。在非限制性示例中，官能团(F3)可以选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。例示性地，官能团(F3)可以是或包括寡核苷酸。
不饱和环状二酮在溶液中和偶联到基底的吲哚或吲唑分子的反应可以提供包含多个加合物分子的组合物，该加合物分子可以具有以下结构：
其中Z为CH或N；L包含与基底的连接子；R为H、吸电子基团或供电子基团；F3包含官能团，并且每个X独立地为CH或N。在图3B中所示的非限制性示例中，TAD分子310和吲哚分子320的反应可以提供包含多个加合物分子330的组合物300'，该加合物分子可以具有以下结构：
其中L为与基底的连接子并且F3为官能团。
如本文其他地方所述，不饱和环状二酮与吲哚或吲唑分子之间的反应可以是可逆的，并且可以称为“可逆点击”反应。因此，在一些示例中，可以将此类反应的加合物加热到合适的温度以使偶联到基底的吲哚或吲唑分子再生并以类似于参考图1C所述的方式引起不饱和环状二酮(和分别与其偶联的官能团F3)的解离。例如，可以将基底301加热到至少50℃的温度，或约50℃至约100℃的温度，或约60℃至约90℃的温度，或约60℃至约80℃的温度，或约80℃至约100℃的温度，或约90℃至约100℃的温度以使偶联到基底的吲哚或吲唑分子320再生并引起不饱和环状二酮(例如，TAD)分子310的解离。作为一种选择，在使吲哚或吲唑分子320再生之后，吲哚或吲唑分子可以以诸如参考图3A所述的方式与另一个官能化的不饱和环状二酮分子反应。类似地，此类反应可以是可逆的，并且因此吲哚或吲唑分子320可以再次再生用于进一步的反应，例如用于与第二不饱和环状二酮分子反应以形成第二加合物。第二不饱和环状二酮分子可包括官能团，例如选自由以下组成的组的官能团：第二寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。第二寡核苷酸可以具有与偶联到较早偶联的不饱和环状二酮的寡核苷酸相同的序列或不同的序列。在其中不饱和环状二酮包括TAD的示例中，TAD分子可以如参考图2A-图2C所述类似地制备，例如可以通过提供4-取代的尿唑(其中4-取代基为官能团(诸如寡核苷酸))，并使4-取代的尿唑氧化以形成包括官能团F3(例如，寡核苷酸)的TAD来制备。
图4A-图4B示意性地说明用于将官能团偶联到基底的另一方法中的示例性组合物和操作。更具体地，可以将二烯偶联到基底，并且可以使包含官能团的不饱和环状二酮与二烯反应以将官能团偶联到表面。参考图1A-图1F提供的二烯分子的示例可以被官能化以包括将二烯偶联到表面的连接子L，而不是包括官能团本身。现在参考图4A，组合物400包含经由相应的连接子(L)偶联到基底401的多个二烯分子440。在例示的示例中，二烯分子440可以具有以下结构：
其中L为与基底401的连接子，但可以使用任何其他合适的1,3-二烯、2,4-二烯、丹尼谢夫斯基二烯、布拉萨尔二烯或拉瓦尔二烯代替。本文其他地方提供了L和基底的非限制性示例。基底401可包含设置在固体载体上的聚合物(例如，被官能化以包括POSS的聚合物)，或可包括不具有设置在其上的聚合物的固体载体。
以诸如图4A中所示的方式，二烯分子440与包含官能团(F3)的不饱和环状二酮(例如TAD)分子410反应以形成将官能团偶联到基底的加合物。例如，偶联到基底的二烯分子440可以与溶解在与不饱和环状二酮分子和二烯分子相容的任何合适溶剂(例如，极性质子溶剂诸如水或醇，或极性非质子溶剂诸如乙腈、酯或醚)中的不饱和环状二酮分子410接触。不饱和环状二酮分子可以具有以下结构：
其中X为CH或N，并且F3包含官能团。在图4A中所示的非限制性示例中，不饱和环状二酮可包括具有以下结构的TAD分子410：
其中F3包含所述官能团。在另外其他示例中，不饱和环状二酮可包括马来酰亚胺：
或4-环戊烯-1,3-二酮：
官能团可以是或包括诸如本文其他地方所述的任何合适的一个或多个分子。在非限制性示例中，官能团(F3)可以选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。例示性地，官能团(F3)可以是或包括寡核苷酸。
不饱和环状二酮和二烯分子的反应可以提供包含多个加合物分子的组合物，该加合物分子可以具有以下结构：
其中每个X独立地为CH或N；L包含与基底的连接子；并且F3包含官能团。在图4B中所示的非限制性示例中，TAD分子410和二烯分子440的反应可以提供包含多个加合物分子430的组合物400'，该加合物分子可以具有以下结构：
基于本文的教导，可以容易地设想其他二烯与其他不饱和环状二酮之间的其他加合物。不饱和环状二酮与二烯分子之间的反应可以是基本上不可逆的，并且可以称为“超快点击”反应。
使用包含偶联到基底的官能团的组合物的方法
如本文其他地方所述，寡核苷酸是可以例如以诸如参考图1A-图1F、图2A-图2C、图3A-图3B或图4A-图4B所述的方式偶联到基底的官能团的一个非限制性示例。以诸如本文所述的方式偶联到基底的寡核苷酸可以用于多种扩增技术中。可以使用的示例性技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多取代扩增(MDA)或随机引物扩增(RPA)或它们的组合。在一些示例中，用于扩增的一种或多种引物可以偶联到基底。利用两种或更多种附接引物物质的形式使得能够进行桥式扩增(BridgeAmp)或动力学排阻扩增(ExAmp)，其中扩增子可以在位于已经拷贝的模版序列侧翼的两个附接引物之间形成桥状结构。扩增也可以用附接到基底的一种扩增引物和溶液中的第二引物进行(例如，乳液PCR)。
附加地或另选地，以诸如本文所述的方式偶联到基底的寡核苷酸可以用于测定靶多核苷酸的序列。例如，靶多核苷酸可以诸以如本文所述的方式偶联(例如，杂交)到与基底共价结合的多个引物中的一个引物。可以使用多个引物来扩增靶多核苷酸以形成基底结合的扩增子簇。基底结合的扩增子簇可以与标记的核苷酸(例如，荧光标记的核苷酸)和聚合酶接触，使得在核苷酸被聚合酶掺入时产生可检测的信号(例如，荧光)，并且此类信号可以用于鉴定核苷酸并由此确定靶多核苷酸的核苷酸序列。
工作实施例
在以下实施例中更详细地公开了另外的示例，这些实施例并非旨在以任何方式限制权利要求书的范围。
实施例1.偶联到包含寡核苷酸的TAD的嵌段共聚物
在一个示例中，制备包含二烯的第一嵌段共聚物(BCP1)，然后使用以下反应方案使二烯与包含寡核苷酸(P5或P7引物)的TAD反应以形成第二嵌段共聚物(BCP2)：
BCP2的NH2基团与基底反应以将BCP2共价偶联到玻璃或二氧化硅载体。该反应在附接的异氰酸酯、活化的羧酸或迈克尔受体上进行。TAD-二烯反应有明显的视觉指示，因为TAD分子是颜色很深(红紫色)，并且在它们的反应(消耗)时，溶液逐渐变为无色。包含寡核苷酸的TAD分子的浓度使用UV或比色监测来监测，并且可以实时地加满。
根据该反应方案，可以理解的是，包含期望的官能团(诸如寡核苷酸(例如，引物))的不饱和环状二酮(诸如TAD)可以与偶联到基底(诸如设置在固体载体上的聚合物)的二烯反应，从而将官能团偶联到基底。
实施例2.偶联到包含寡核苷酸的TAD的图案化孔
图5示意性地说明用于将官能团偶联到基底的另一方法中的示例性组合物和操作。图5中所示的组合物(a)包括其上设置有聚合物树脂的玻璃固体载体，该玻璃固体载体使用纳米压印光刻(NIL)进行图案化以形成孔。使用NIL进行图案化的方法描述于WO2018/119053和WO2018/118932中，每篇文献的全部内容以引用方式并入本文。制备基底的方法描述于WO2014/133905中，该文献的全部内容以引用方式并入本文。在本实施例中，孔包含偶联到诸如参考图2A-图2C所述的4-取代的尿唑的聚合物(“尿唑聚合物”)。使用DABCO-Br对组合物(a)进行氧化以形成组合物(b)，其中孔包含偶联到诸如参考图1A所述的TAD分子的聚合物(“TAD聚合物”)。使组合物(b)与不具有官能团的吲哚分子(“吲哚保护剂”)反应以形成组合物(c)，其中孔包含偶联到诸如参考图1B所述的TAD-吲哚反应的加合物的聚合物，但省略官能团F1。使组合物(c)以诸如参考图1F所述的方式与被官能化以包括寡核苷酸引物(P5/P7)(“P5/P7-二烯接枝/置换”)的实施例3的二烯反应以形成组合物(d)，其中孔包含偶联到诸如参考图1E所述的TAD-二烯加合物的聚合物。在一些示例中，一部分纳米孔将在该方法中被官能化，留下可用于反应的剩余数量的TAD部分。
形成组合物(c)的吲哚“可逆点击”反应是温和的并且可以在室温处进行。可以使用大量过量的吲哚分子以便对聚合物偶联的TAD分子提供完全或基本上完全的保护，从而防止或抑制这些分子在下游化学或生物化学操作期间的后续反应。另外，组合物(c)的吲哚-TAD加合物与官能化的二烯形成组合物(d)的“反式点击”反应可以是特定的且基本上不可逆的交换反应，其也是温和的、非蚀刻性的并因此与许多不同类型的基底相容，并且可以在室温处进行数分钟。寡核苷酸官能化的二烯置换至少一些先前偶联到基底的吲哚保护剂分子。
根据该反应方案，可以理解的是，包含期望的官能团(诸如寡核苷酸(例如，引物))的二烯可以与偶联到基底(诸如设置在固体载体上的聚合物)的吲哚保护的TAD反应，从而将官能团偶联到基底。
实施例3.偶联到包含寡核苷酸的二烯的嵌段共聚物
在另一个示例中，制备包含4-取代的尿唑的第一嵌段共聚物(BCP1)，然后使用DABCO-Br(通过使DABCO与Br2在合适的溶剂诸如DCM或CHCl3中反应来制备)对尿唑进行氧化以形成包含TAD的第三嵌段共聚物(BCP3)，并且使用以下反应方案使TAD与包含寡核苷酸(P5或P7引物)的二烯反应以形成第四嵌段共聚物(BCP4)：
BCP4的NH2基团与基底反应，以实施例1中所述的方式将BCP4共价偶联到固体载体。根据下文所示的方案进行另外的反应以制备含有TAD/不饱和环状二酮的聚合物。下文所示的第一方案使用可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合。然后，使用类似的化学反应(即通过剩余的TAD单元的共价连接，并非所有TAD单元都在聚合物涂覆步骤期间被消耗，因此留下大部分剩余用于与二烯低聚物反应)，使这些聚合物与二烯反应以形成与表面附接的低聚官能化的材料。下文所示的后续方案详述了制备下文第一反应方案中使用的单体Az-TAD的方法。
/>
根据这些反应方案，可以理解的是，包含期望的官能团(诸如寡核苷酸(例如，引物))的二烯可以与偶联到基底(诸如设置在固体载体上的聚合物)的尿唑保护的不饱和环状二酮(诸如TAD)反应，从而将官能团偶联到基底。
另外的注释
应理解，如本文中所描述的本公开的方面中的每一者的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任一者或多者的任何特征/示例可以与如本文中所描述的其它(多个)方面的特征中的任一者以任何适当组合一起实施，以实现如本文中所描述的益处。
虽然上文描述了各种说明性示例，但本领域的技术人员将显而易见，可在不脱离本发明的情况下在其中作出各种改变和修改。所附权利要求书打算涵盖落入本发明的真正精神和范围内所有此类改变和修改。

Claims (82)

1.一种将官能团偶联到基底的方法，所述方法包括：
提供偶联到基底的不饱和环状二酮；以及
使所述不饱和环状二酮与包含第一官能团的吲哚或吲唑反应以形成将所述第一官能团偶联到所述基底的第一加合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为：
其中L包含与所述基底的连接子并且每个X独立地为CH或N。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为三唑啉二酮：
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为马来酰亚胺：
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为4-环戊烯-1,3-二酮：
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述吲哚或吲唑为：
其中F1包含所述第一官能团；R为H、吸电子基团或供电子基团；
并且Z为CH或N。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述吲哚为1H-吲哚：
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述吲哚为1H-吲唑：
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一加合物为：
其中L包含与所述基底的连接子并且每个X独立地为CH或N。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一加合物为：
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述第一加合物进行加热以使偶联到所述基底的所述不饱和环状二酮再生。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述第一加合物与包含第二官能团的二烯反应以形成将所述第二官能团偶联到所述基底的第二加合物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述二烯包括1,3-二烯。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述1,3-二烯为：
其中F2包含所述第二官能团。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二加合物为：
其中L包含与所述基底的连接子。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述第二官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二官能团为寡核苷酸。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述第一官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一官能团为寡核苷酸。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中提供偶联到所述基底的所述不饱和环状二酮包括：
提供偶联到所述基底的4-取代的尿唑；以及
使所述4-取代的尿唑氧化以形成三唑啉二酮。
23.一种组合物，所述组合物包含：
基底；以及
偶联到所述基底的加合物：
其中L包含与所述基底的连接子；F1包含第一官能团；每个X独立地为CH或N；R为H、吸电子基团或供电子基团；并且Z为CH或N。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述加合物为：
25.根据权利要求23或权利要求24所述的组合物，其中所述第一官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述第一官能团为寡核苷酸。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的组合物，其中所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
29.一种将官能团偶联到基底的方法，所述方法包括：
提供偶联到基底的不饱和环状二酮；以及
使所述不饱和环状二酮与包含官能团的二烯反应以形成将所述官能团偶联到所述基底的加合物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为：
其中L为与所述基底的连接子并且每个X独立地为CH或N。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为三唑啉二酮：
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为马来酰亚胺：
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为4-环戊烯-1,3-二酮：
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述二烯包括1,3-二烯。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述1,3-二烯为：
其中F2包含所述官能团。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述加合物为：
其中L包含与所述基底的连接子。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的方法，其中所述官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述官能团为寡核苷酸。
39.根据权利要求29至38中任一项所述的方法，其中所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
41.根据权利要求29至40中任一项所述的方法，其中提供偶联到所述基底的所述不饱和环状二酮包括：
提供偶联到所述基底的4-取代的尿唑；以及
使所述4-取代的尿唑氧化以形成三唑啉二酮。
42.一种组合物，所述组合物包含：
基底；以及
偶联到所述基底的加合物：
其中L包含与所述基底的连接子，F2包含官能团，并且每个X独立地为CH或N。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述加合物为：
44.根据权利要求42所述的组合物，其中所述加合物为：
45.根据权利要求42所述的组合物，其中所述加合物为：
46.根据权利要求42至45中任一项所述的组合物，其中所述官能团选自由以下组成的组：寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述官能团为寡核苷酸。
48.根据权利要求42至47中任一项所述的组合物，其中所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。
49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
50.一种将官能团偶联到基底的方法，所述方法包括：
提供偶联到基底的吲哚或吲唑；以及
使所述吲哚或吲唑与包含寡核苷酸的第一不饱和环状二酮反应以形成将所述寡核苷酸偶联到所述基底的第一加合物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述第一不饱和环状二酮为：
其中F3包含所述寡核苷酸并且每个X独立地为CH或N。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述第一不饱和环状二酮为三唑啉二酮：
53.根据权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述吲哚或吲唑为：
其中Z为CH或N，L包含与所述基底的连接子，并且R为H、吸电子基团或供电子基团。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述吲哚为1H-吲哚：
其中L为与所述基底的连接子。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述第一加合物为：
其中F3包含所述寡核苷酸，并且每个X独立地为CH或N。
56.根据权利要求50至55中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述第一加合物进行加热以使偶联到所述基底的所述吲哚或吲唑再生。
57.根据权利要求56所述的方法，所述方法还包括在使偶联到所述基底的所述吲哚或吲唑再生之后，使所述吲哚或吲唑与第二不饱和环状二酮反应以形成第二加合物。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述第二不饱和环状二酮包括官能团。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述官能团选自由以下组成的组：第二寡核苷酸、亲水性分子、亲水性大分子、催化剂和标记物。
60.根据权利要求50至59中任一项所述的方法，其中所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
62.根据权利要求50至61中任一项所述的方法，所述方法还包括：
提供包含所述寡核苷酸的4-取代的尿唑；以及
使所述4-取代的尿唑氧化以形成包含所述寡核苷酸的所述不饱和环状二酮三唑啉二酮。
63.一种组合物，所述组合物包含：
基底；以及
偶联到所述基底的加合物：
其中L包含与所述基底的连接子，F3包含寡核苷酸，每个X独立地为CH或N，并且Z为CH或N。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述加合物为：
65.根据权利要求63或权利要求64所述的组合物，其中所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
67.一种将官能团偶联到基底的方法，所述方法包括：
提供偶联到基底的二烯；以及
使所述二烯与包含寡核苷酸的不饱和环状二酮反应以形成将所述寡核苷酸偶联到所述基底的第一加合物。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为：
其中F3包含所述寡核苷酸并且每个X独立地为CH或N。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为三唑啉二酮：
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为马来酰亚胺：
71.根据权利要求68所述的方法，其中所述不饱和环状二酮为4-环戊烯-1,3-二酮：
72.根据权利要求67至71中任一项所述的方法，其中所述二烯包括1,3-二烯。
73.根据权利要求70所述的方法，其中所述1,3-二烯为：
其中L包含与所述基底的连接子。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述加合物为：
/>
其中L包含与所述基底的连接子，每个X独立地为CH或N，并且F3包含所述寡核苷酸。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述加合物为：
76.根据权利要求67至75中任一项所述的方法，其中所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
78.根据权利要求67至77中任一项所述的方法，所述方法还包括：
提供包含所述寡核苷酸的4-取代的尿唑；以及
使所述4-取代的尿唑氧化以形成包含所述寡核苷酸的所述不饱和环状二酮三唑啉二酮。
79.一种组合物，所述组合物包含：
基底；以及
偶联到所述基底的加合物：
其中L包含与所述基底的连接子，每个X独立地为CH或N，并且F3为寡核苷酸。
80.根据权利要求79所述的组合物，其中所述加合物为：
/>
81.根据权利要求79或80所述的组合物，其中所述基底包含设置在固体载体上的聚合物。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述聚合物被官能化以包括多面体低聚倍半硅氧烷(POSS)。
CN202180088146.4A 2021-01-05 2021-12-30 包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法 Pending CN116710491A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163133955P 2021-01-05 2021-01-05
US63/133,955 2021-01-05
PCT/US2021/065625 WO2022150219A1 (en) 2021-01-05 2021-12-30 Compositions including functional groups coupled to substrates, and methods of making the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116710491A true CN116710491A (zh) 2023-09-05

Family

ID=80168162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180088146.4A Pending CN116710491A (zh) 2021-01-05 2021-12-30 包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20220220242A1 (zh)
EP (1) EP4274857A1 (zh)
JP (1) JP2024505324A (zh)
KR (1) KR20230128281A (zh)
CN (1) CN116710491A (zh)
AU (1) AU2021416526A1 (zh)
CA (1) CA3199918A1 (zh)
TW (1) TW202241972A (zh)
WO (1) WO2022150219A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9012022B2 (en) * 2012-06-08 2015-04-21 Illumina, Inc. Polymer coatings
US9512422B2 (en) 2013-02-26 2016-12-06 Illumina, Inc. Gel patterned surfaces
EP3320399A1 (en) * 2015-07-07 2018-05-16 Illumina, Inc. Selective surface patterning via nanoimprinting
EP3559745B1 (en) 2016-12-22 2024-02-14 Illumina, Inc. Imprinting apparatus
CN110248725B (zh) 2016-12-22 2022-08-02 伊鲁米那股份有限公司 包括树脂膜和图案化的聚合物层的阵列

Also Published As

Publication number Publication date
CA3199918A1 (en) 2022-07-14
AU2021416526A9 (en) 2024-06-27
JP2024505324A (ja) 2024-02-06
KR20230128281A (ko) 2023-09-04
TW202241972A (zh) 2022-11-01
US20220220242A1 (en) 2022-07-14
AU2021416526A1 (en) 2023-06-22
EP4274857A1 (en) 2023-11-15
WO2022150219A1 (en) 2022-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11618808B2 (en) Catalyst-free surface functionalization and polymer grafting
US11447582B2 (en) Polymers and DNA copolymer coatings
CN116710491A (zh) 包含偶联到基底的官能团的组合物及制备其的方法
CN115803451A (zh) 用于检测核酸的无碱基位点的组合物和方法
CN117396571A (zh) 包括流体通道的流体装置及其制造方法
JP2024526028A (ja) 流体チャネルを含む流体デバイス及びその作製方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40101758

Country of ref document: HK