CN115803451A - 用于检测核酸的无碱基位点的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于检测无碱基位点的方法。该方法可包括使溶液在基板之上流动，该基板具有与其偶联的多个寡核苷酸。这些寡核苷酸中的至少一个包括无碱基位点。该溶液可包含与反应性基团偶联的荧光团。该方法可包括使反应性基团与无碱基位点反应以将荧光团偶联到无碱基位点；以及使用来自荧光团的荧光检测无碱基位点。

Description

用于检测核酸的无碱基位点的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月11日提交的名称为“Compositions and Methods forDetecting an Abasic Site”的美国临时专利申请第63/077,119号的权益，该专利申请的全部内容以引用方式并入本文。
序列表
本专利申请包含已以ASCII格式电子提交的序列表，该序列表据此全文以引用方式并入。所述ASCII副本创建于2021年9月7日，命名为IP-2017-PCT_SL.txt，大小为752字节。
背景技术
簇扩增是扩增多核苷酸的方法，例如用于基因测序。靶多核苷酸被与流通池中的基板表面偶联的寡核苷酸引物(例如，P5和P7引物)捕获，并且在表面上的随机位置处形成“晶种”。进行扩增循环以在表面上的每个晶种周围形成扩增子的簇，例如，使用“桥式扩增”。
发明内容
本文提供的示例涉及检测无碱基位点。公开了用于执行此类检测的组合物和方法。
在本文的一些示例中提供了一种用于检测无碱基位点的方法。该方法可包括使溶液在基板之上流动，该基板具有与其偶联的多个寡核苷酸。寡核苷酸中的至少一个可包括无碱基位点。该溶液可包括与反应性基团偶联的荧光团。该方法可包括使反应性基团与无碱基位点反应以将荧光团偶联到无碱基位点；以及使用来自荧光团的荧光检测无碱基位点。
在一些示例中，无碱基位点是由对寡核苷酸的破坏产生的。
在一些示例中，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基可抑制从与无碱基位点偶联的相应荧光团的非辐射能量耗散。
在一些示例中，荧光团可包括分子转子染料，该分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。在一些示例中，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基可限制C-C键的旋转并且可使π-共轭组分彼此对准。
在一些示例中，与反应性基团偶联的分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(quidolimium)(噻唑橙)。
在一些示例中，与反应性基团偶联的荧光团选自由以下组成的组：
Figure BDA0004027873350000021
Figure BDA0004027873350000022
其中X是接头并且Z是反应性基团。
在一些示例中，无碱基位点包括醛。在一些示例中，反应性基团包括羟胺基团。在一些示例中，反应性基团包括肼基团。在一些示例中，使反应性基团与无碱基位点反应形成肟键联。
在本文的一些示例中提供了一种组合物。组合物可包括基板，该基板具有与其偶联的多个寡核苷酸。寡核苷酸中的至少一个可包括无碱基位点。组合物可包括与无碱基位点偶联的荧光团。无碱基位点可以能够使用来自荧光团的荧光检测。
在一些示例中，无碱基位点是由对寡核苷酸的破坏产生的。
在一些示例中，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基抑制从与无碱基位点偶联的相应荧光团的非辐射能量耗散。
在一些示例中，荧光团可包括分子转子染料，该分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。在一些示例中，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基限制C-C键的旋转并且使π-共轭组分彼此对准。在一些示例中，与反应性基团偶联的分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)。
在一些示例中，与反应性基团偶联的荧光团选自由以下组成的组：
Figure BDA0004027873350000031
Figure BDA0004027873350000032
其中X是接头并且Z是反应性基团。
在一些示例中，无碱基位点包括醛。在一些示例中，反应性基团包括羟胺基团。在一些示例中，反应性基团包括肼基团。在一些示例中，使反应性基团与无碱基位点反应形成肟键联。
在本文的一些示例中提供了一种方法。该方法可包括制备包含(i)糖基化酶、(ii)寡核苷酸和(iii)与反应性基团偶联的荧光团的溶液。该方法可包括使用糖基化酶在溶液中的寡核苷酸中产生无碱基位点。该方法可包括使反应性基团与无碱基位点反应以将荧光团偶联到无碱基位点。该方法可包括使用来自与无碱基位点偶联的荧光团的荧光测量糖基化酶的活性。该方法可包括在合成测序操作中使用糖基化酶。
在一些示例中，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基可抑制从与无碱基位点偶联的相应荧光团的非辐射能量耗散。
在一些示例中，荧光团可包括分子转子染料，该分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。在一些示例中，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基可限制C-C键的旋转并且可使π-共轭组分彼此对准。在一些示例中，与反应性基团偶联的分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)。
在一些示例中，与反应性基团偶联的荧光团选自由以下组成的组：
Figure BDA0004027873350000041
Figure BDA0004027873350000042
其中X是接头并且Z是反应性基团。
在一些示例中，无碱基位点包括醛。在一些示例中，反应性基团包括羟胺基团。在一些示例中，反应性基团包括肼基团。在一些示例中，使反应性基团与无碱基位点反应形成肟键联。
在一些示例中提供了一种用于测量糖基化酶活性的溶液。该溶液可包含(i)糖基化酶、(ii)寡核苷酸和(iii)与反应性基团偶联的荧光团。寡核苷酸可包括由溶液中的糖基化酶产生的无碱基位点。荧光团可偶联到无碱基位点。无碱基位点可以能够使用来自荧光团的荧光检测。
在一些示例中，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基可抑制从与无碱基位点偶联的相应荧光团的非辐射能量耗散。
在一些示例中，荧光团可包括分子转子染料，该分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。在一些示例中，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基可限制C-C键的旋转并且可使π-共轭组分彼此对准。在一些示例中，与反应性基团偶联的分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)。
在一些示例中，与反应性基团偶联的荧光团选自由以下组成的组：
Figure BDA0004027873350000051
Figure BDA0004027873350000052
其中X是接头并且Z是反应性基团。
在一些示例中，无碱基位点包括醛。在一些示例中，反应性基团包括羟胺基团。在一些示例中，反应性基团包括肼基团。在一些示例中，使反应性基团与无碱基位点反应形成肟键联。
应当理解，如本文所述的本公开的每个方面的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任何一个或多个方面的任何特征/示例可与如本文所述的其他方面的任何特征一起以任何适当组合实施以实现如本文所述的有益效果。
附图说明
图1A-图1B示意性地展示了用于检测无碱基位点(诸如由对寡核苷酸的破坏引起的)的示例组合物。
图2示意性地展示了用于检测无碱基位点(诸如由对寡核苷酸的破坏引起的)的示例方法中的操作。
图3A-图3C示意性地展示了用于测量无碱基位点的量(诸如用于测量糖基化酶活性)的示例组合物。
图4示意性地展示了用于测量无碱基位点的量(诸如用于测量糖基化酶活性)的示例方法中的操作。
具体实施方式
本文提供的示例涉及检测无碱基位点。本文提供的一些示例涉及检测对寡核苷酸的破坏或涉及测量糖基化酶活性。公开了用于执行此类检测和测量的组合物和方法。
本文的无碱基位点可以指DNA无碱基位点。DNA无碱基位点(也称为无嘌呤/无嘧啶位点或“AP”)可有意地产生，例如通过DNA糖基化酶。例如，糖基化酶可在一个或多个合成测序(“SBS”)操作中使用，诸如用于线性化使用“桥式扩增”产生的扩增子。例示性地，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)可用于在dU碱基处产生无碱基位点，并且然后可由核酸内切酶加工无碱基位点，以在磷酸二酯主链中产生切割并因此线性化扩增子。DNA无碱基位点也可无意地产生，例如通过对DNA的破坏，诸如暴露于酸性介质。检测对寡核苷酸(诸如引物)的破坏可以是有用的，因为由这种破坏产生的无碱基位点可能在稍后操作中不经意地被裂解。另外，测量糖基化酶的活性可以是有用的，因为如果糖基化酶以不足的速率在扩增子中产生无碱基位点，则扩增子可能线性化不足，这可能不利地影响后续SBS操作。
如本文所提供的，可通过将荧光团偶联到无碱基位点来检测无碱基位点的有意或无意产生(例如，由糖基化酶活性产生或由破坏产生)。例如，可将荧光团偶联到反应性部分，该反应性部分与无碱基位点反应并因此将荧光团偶联到无碱基位点。例示性地，无碱基位点可形成醛，当醛与反应性部分(诸如羟胺或肼)反应时形成肟，通过肟，荧光团偶联到无碱基位点。在一些示例中，当荧光团偶联到无碱基位点时，可开启或增强来自荧光团的荧光。例示性地，与无碱基位点相邻的核苷酸碱基可抑制从荧光团的非辐射能量耗散，并因此可增强来自荧光团的荧光强度或甚至使荧光团仅当与无碱基位点偶联时才可检测地发荧光。
首先，将简要解释本文使用的一些术语。然后，将描述用于检测无碱基位点(诸如由对寡核苷酸的破坏引起或用于测量糖基化酶活性)的一些示例组合物和示例方法。
术语
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”以及其他形式(诸如“包括(include/includes/included)”)的使用不是限制性的。术语“具有”以及其他形式(诸如“具有(have/has/had)”)的使用不是限制性的。如本说明书中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，上述术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。例如，当在过程的上下文中使用时，术语“包含”表示该过程至少包括所列举的步骤，但是也可包括额外步骤。当在化合物、组合物或设备的上下文中使用时，术语“包含”是指该化合物、组合物或设备至少包含所列举的特征或组分，但是也可包含额外特征或组分。
在本说明书通篇中使用的术语“基本上”、“大约”和“约”用于描述和说明小的波动，诸如由于处理中的变化所引起的小的波动。例如，它们可指小于或等于±10％，诸如小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。
如本文所用，“杂交”旨在表示将第一多核苷酸与第二多核苷酸沿着那些聚合物的长度非共价缔合以形成双链的“双链体”。例如，两个DNA多核苷酸链可通过互补碱基配对缔合。第一多核苷酸与第二多核苷酸之间的缔合强度随着那些多核苷酸内核苷酸序列之间的互补性增加而增加。多核苷酸之间的杂交强度可通过50％的双链体彼此解离时的解链温度(Tm)来表征。
如本文所用，术语“核苷酸”旨在表示包含糖和至少一个磷酸酯基团并且在一些示例中还包括核碱基的分子。缺乏核碱基的核苷酸可被称为“无碱基”。核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、肽核苷酸、修饰的肽核苷酸、修饰的磷酸糖主链核苷酸以及它们的混合物。核苷酸的示例包括腺苷一磷酸(AMP)、腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、胸苷一磷酸(TMP)、胸苷二磷酸(TDP)、胸苷三磷酸(TTP)、胞苷一磷酸(CMP)、胞苷二磷酸(CDP)、胞苷三磷酸(CTP)、鸟苷一磷酸(GMP)、鸟苷二磷酸(GDP)、鸟苷三磷酸(GTP)、尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UTP)、脱氧腺苷一磷酸(dAMP)、脱氧腺苷二磷酸(dADP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷一磷酸(dTMP)、脱氧胸苷二磷酸(dTDP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)、脱氧胞苷二磷酸(dCDP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷一磷酸(dGMP)、脱氧鸟苷二磷酸(dGDP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷一磷酸(dUMP)、脱氧尿苷二磷酸(dUDP)和脱氧尿苷三磷酸(dUTP)。
如本文所用，术语“核苷酸”还旨在涵盖任何核苷酸类似物，核苷酸类似物是与天然存在的核苷酸相比包含修饰的核碱基、糖和/或磷酸酯部分的核苷酸类型。示例修饰的核碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、2-氨基腺嘌呤、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、15-卤代尿嘧啶、15-卤代胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶、4-硫脲嘧啶、8-卤代腺嘌呤或鸟嘌呤、8-氨基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫醇腺嘌呤或鸟嘌呤、8-硫代烷基腺嘌呤或鸟嘌呤、8-羟基腺嘌呤或鸟嘌呤、5-卤代尿嘧啶或胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤、7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤等。如本领域中所公知的，某些核苷酸类似物无法掺入多核苷酸中，例如，诸如腺苷5'-磷酸硫酸盐的核苷酸类似物。核苷酸可包含任何合适数量的磷酸盐，例如，三个、四个、五个、六个或多于六个磷酸盐。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指包含彼此键合的核苷酸的序列的分子。多核苷酸是聚合物的一个非限制性示例。多核苷酸的示例包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和它们的类似物。多核苷酸可以是核苷酸的单链序列诸如RNA或单链DNA、核苷酸的双链序列诸如双链DNA，或者可包括核苷酸的单链和双链序列的混合物。双链DNA(dsDNA)包括基因组DNA以及PCR和扩增产物。单链DNA(ssDNA)可被转化成dsDNA，反之亦然。多核苷酸可包括非天然存在的DNA，诸如对映体DNA。多核苷酸中的核苷酸的精确序列可以是已知的或未知的。以下是多核苷酸的示例：基因或基因片段(例如，探针、引物、表达序列标签(EST)或基因表达系列分析(SAGE)标签)、基因组DNA、基因组DNA片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、合成多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针、引物或上述任何一项的扩增拷贝。
如本文所用，“聚合酶”旨在表示具有通过将核苷酸聚合成多核苷酸来组装多核苷酸的活性位点的酶。聚合酶可结合带引物的单链靶多核苷酸，并且可相继地将核苷酸添加到生长的引物以形成具有与靶多核苷酸的序列互补的序列的“互补拷贝”多核苷酸。然后，另一种聚合酶或相同的聚合酶可通过形成所述互补拷贝多核苷酸的互补拷贝来形成靶核苷酸的拷贝。此类拷贝中的任一个在本文中可称为“扩增子”。DNA聚合酶可与靶多核苷酸结合，然后沿着靶多核苷酸向下移动，相继地将核苷酸添加到生长的多核苷酸链(生长的扩增子)的3'末端处的游离羟基。DNA聚合酶可从DNA模板合成互补DNA分子，并且RNA聚合酶可从DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可使用短RNA或DNA链(引物)来开始链生长。一些聚合酶可在它们将碱基添加到链的位点的上游置换该链。此类聚合酶可被称为链置换的，意味着它们具有从聚合酶读取的模板链去除互补链的活性。具有链置换活性的示例聚合酶包括但不限于Bst(嗜热脂肪芽胞杆菌)聚合酶、exo-Klenow聚合酶或测序级T7exo-聚合酶的大片段。一些聚合酶降解它们前面的链，有效地将其用后面生长的链替换(5'核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有降解它们后面的链的活性(3'核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或其它方式修饰以减少或消除3'和/或5'核酸外切酶活性。
如本文所用，术语“引物”是指可将核苷酸通过游离3'OH基团添加到其的多核苷酸。引物长度可以是任何合适数目的碱基长度并且可包括天然和非天然核苷酸的任何合适组合。靶多核苷酸可包括与引物杂交(具有与引物互补的序列)的“衔接子”，并且可通过向引物的游离3'OH基团添加核苷酸来扩增以便产生互补拷贝多核苷酸。引物可偶联到基板。
如本文所用，术语“基板”是指用作本文所述组合物的载体的材料。示例基板材料可包括玻璃、二氧化硅、塑料、石英、金属、金属氧化物、有机硅酸盐(例如，多面体有机倍半硅氧烷(POSS))、聚丙烯酸酯、氧化钽、互补金属氧化物半导体(CMOS)或它们的组合。POSS的示例可以是Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776-778页中所述的POSS，该文献以引用方式全文并入。在一些示例中，用于本申请的基板包括基于二氧化硅的基板，诸如玻璃、熔融二氧化硅或其它含二氧化硅的材料。在一些示例中，基板可包括硅、氮化硅或氢化硅(silicone hydride)。在一些示例中，用于本申请的基板包括塑料材料或组分，诸如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯和聚(甲基丙烯酸甲酯)。示例塑料材料包括聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯和环状烯烃聚合物基板。在一些示例中，基板是或包括基于二氧化硅的材料或塑料材料或它们的组合。在特定示例中，基板具有至少一个包含玻璃或基于硅的聚合物的表面。在一些示例中，基板可包括金属。在一些这样的示例中，金属是金。在一些示例中，基板具有至少一个包含金属氧化物的表面。在一个示例中，表面包含氧化钽或氧化锡。丙烯酰胺、烯酮或丙烯酸酯也可用作基板材料或组分。其它基板材料可包括但不限于砷化镓、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、聚合物和共聚物。在一些示例中，基板和/或基板表面可以是或包括石英。在一些其它示例中，基板和/或基板表面可以是或包括半导体，诸如GaAs或ITO。前述列表旨在说明但不限制本申请。基板可包含单一材料或多种不同材料。基板可以是复合物或层合物。在一些示例中，基板包含有机硅酸盐材料。基板可以是平坦的、圆形的、球形的、棒状的或任何其它合适的形状。基板可以是刚性的或柔性的。在一些示例中，基板是珠粒或流动池。
在一些示例中，基板包括图案化表面。“图案化表面”是指在基板的暴露层中或该暴露层上的不同区域的布置。例如，这些区域中的一个或多个区域可以是存在一种或多种捕获引物的特征部。特征部可由不存在捕获引物的间隙区域隔开。在一些示例中，图案可为呈行和列形式的特征部的x-y格式。在一些示例中，图案可为特征部和/或间隙区域的重复布置。在一些示例中，图案可为特征部和/或间隙区域的随机布置。在一些示例中，基板在表面中包括孔(凹陷)的阵列。孔可由基本上竖直的侧壁提供。孔可如本领域通常已知的那样使用多种技术来制造，这些技术包括但不限于光刻、压印技术、模制技术和微蚀刻技术。本领域的技术人员将会知道，所使用的技术将取决于阵列基板的组成和形状。
基板的图案化表面中的特征部可包括玻璃、硅、塑料或其他合适的具有图案化的且共价连接的凝胶(诸如，聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM))的材料上的孔阵列中的孔(例如，微孔或纳米孔)。该方法产生用于测序的凝胶垫，该凝胶垫在具有大量循环的测序运行中可为稳定的。聚合物与孔的共价连接可有助于在多种用途期间以及在结构化基板的整个寿命期间将凝胶保持为结构化特征。然而，在许多示例中，凝胶无需共价连接到孔。例如，在一些条件下，未共价附接到结构化基板的任何部分的不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)可用作凝胶材料。
在特定示例中，结构化基板可通过以下方法来制作：将合适材料图案化为具有孔(例如，微孔或纳米孔)，用凝胶材料(例如，PAZAM、SFA或其化学改性的变体，诸如SFA的叠氮化版本(叠氮-SFA))涂覆图案化材料，并且例如通过化学或机械抛光来抛光已涂覆凝胶的材料的表面，从而将凝胶保持在孔中，而从孔之间的结构化基板的表面上的间隙区域移除基本上所有凝胶或使基本上所有凝胶失活。可将引物附接到凝胶材料。然后可使包括多个靶多核苷酸(例如，片段化的人基因组或其部分)的溶液与已抛光的基板接触，使得单个靶多核苷酸将通过与附接到凝胶材料的引物的相互作用接种到单个孔中；然而，由于不存在凝胶材料或该凝胶材料失活，靶多核苷酸将不占用间隙区域。靶多核苷酸的扩增将被限制在孔中，因为间隙区域中不存在凝胶或凝胶失活可能抑制生长的簇的向外迁移。该过程是可方便地制造的且具有可扩展性，其利用常规的微米或纳米制造方法。
图案化基板可包括例如蚀刻到玻片或芯片中的孔。蚀刻的图案和孔的几何形状可采取各种不同的形状和大小，并且此类特征部可以是彼此可物理或功能分离的。具有此类结构特征部的特别有用的基板包括可选择固体颗粒的大小(诸如微球)的图案化基板。具有这些特性的示例图案化基板是与BEAD ARRAY技术(Illumina,Inc.,San Diego,Calif.)结合使用的蚀刻基板。
在一些示例中，本文所述的基板形成流动池的至少一部分或位于流动池中或联接到流动池。流通池可包括分成多个泳道或多个扇区的流动室。用于制造可用于本文阐述的方法和组合物中的流动池的示例流通池和基板包括但不限于可从Illumina,Inc.(SanDiego,CA)商购获得的那些。
如本文所用，术语“多个”旨在表示两个或更多个不同成员的群体。多个可在大小范围内从小、中等、大到非常大。小的多个的大小可在例如几个成员到数十个成员的范围内。中等大小的多个可在例如数十个成员到约100个成员或数百个成员的范围内。大的多个可在例如约数百个成员到约1000个成员、数千个成员和高达数万个成员的范围内。非常大的多个可在例如数万个成员到约数十万、一百万、数百万、数千万和多达或大于数亿个成员的范围内。因此，多个可在大小范围内从两个到远超一亿个成员以及介于和大于上述示例范围的所有大小，如通过成员数目所测量的。示例多核苷酸多个包括例如约1×105或更多个、5×105或更多个或1×106或更多个不同多核苷酸的群体。因此，术语的定义旨在包括大于二的所有整数值。可例如通过样品中多核苷酸序列的理论多样性来设置多个的上限。
如本文所用，术语“靶多核苷酸”旨在表示作为分析或动作的对象的多核苷酸。分析或动作包括使多核苷酸经受扩增、测序和/或其它程序。靶多核苷酸可包括在待分析的靶序列之外的核苷酸序列。例如，靶多核苷酸可包括一个或多个衔接子，包括用作引物结合位点的衔接子，该一个或多个衔接子侧接于待分析的靶多核苷酸序列。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。除非另外特别指出，否则不同的术语不旨在表示大小、序列或其它特性上的任何特定差异。为清楚起见，术语当描述包括若干多核苷酸种类的特定方法或组合物时可用于将一个多核苷酸种类与另一个种类区分开来。
如本文所用，术语“扩增子”当用于提及多核苷酸时，意在表示复制该多核苷酸的产物，其中该产物具有与该多核苷酸的核苷酸序列的至少一部分基本上相同或基本上互补的核苷酸序列。“扩增(Amplification)”和“扩增(amplifying)”是指制备多核苷酸的扩增子的过程。靶多核苷酸的第一扩增子可以是互补拷贝。附加的扩增子是在产生第一扩增子后，由靶多核苷酸或由第一扩增子形成的拷贝。后续的扩增子可具有与靶多核苷酸基本上互补或与靶多核苷酸基本上相同的序列。应当理解，当产生多核苷酸的扩增子时，该多核苷酸可能发生少量突变(例如，由于扩增伪影)。
如本文所用，术语“糖基化酶”是指水解糖基化合物的酶。在一些示例中，糖基化酶水解的糖基化合物可包含在多核苷酸中。多核苷酸可以是单链或双链的。DNA和RNA是糖基化酶可如本文所提供的方式对其使用的多核苷酸的非限制性示例。在一些示例中，可如本文所提供的方式使用的糖基化酶是“单官能的”，这旨在表示它们缺乏超出糖基化酶活性的附加活性。相比之下，“双功能”DNA糖基化酶也可切割DNA的磷酸二酯键。如本文所用，糖基化酶的“活性”可表达糖基化酶随时间变化水解糖基化合物的速率。
糖基化酶包括DNA糖基化酶，这些DNA糖基化酶识别和去除通过水解碱基与脱氧核糖之间的N-糖苷键而被破坏或错配的DNA碱基，从而产生包含与醛基团平衡的半缩醛基团的无碱基位点。单官能糖基化酶的非限制性示例包括：尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)，可用于在可能源自于胞嘧啶脱氨作用的dU碱基处产生无碱基位点；AlkA/AlkE/Mag1/MPG(N-甲基嘌呤DNA糖基化酶)，可用于在3-meA(3-烷基腺嘌呤)和次氧黄嘌呤处产生无碱基位点；MutY/mHYH，可用于在A:8-oxoG处产生无碱基位点；hSMUG1，可用于在U、hoU(5-羟基尿嘧啶)、hmU(5-羟基甲基尿嘧啶)或fU(5-甲酰基尿嘧啶)处产生无碱基位点；TDG或MBD4，可用于在T:G错配处产生无碱基位点；和AlkC或AlkD，可用于在烷基尿嘌呤处产生无碱基位点。
如本文所用，术语“荧光团”旨在表示响应于在不同于第一波长的第二波长处的光的激发而发射第一波长处的光的分子。由荧光团发射的光可被称为“荧光”，并且可通过合适的光学电路检测。除了可被认为是“辐射地”发射能量的发荧光之外，荧光团可“非辐射地”耗散能量，诸如通过分子或此类分子的一种或多种组分的旋转。非辐射能量耗散可减少荧光团可用于辐射地发射能量的能量量。示例荧光团是“分子转子染料”，该分子转子染料是指在两个π共轭组分之间具有碳-碳(“C-C”)单键旋转轴线的荧光团。当C-C键可自由旋转时，π共轭组分可能不彼此对准，并且因此分子基本上不会发荧光。相比之下，当C-C键的旋转受到限制以使π共轭组分彼此充分对准，从而使得那些组分的π轨道彼此重叠并形成延伸的π共轭组装体时，与π共轭组分未对准时相比，所得的延伸的π共轭组装体可以相对较高的强度可检测地发荧光。
如本文所用，“检测”荧光旨在表示从荧光团接收光、基于接收到的光生成电信号，并且使用电信号确定从荧光团接收到光。可使用任何合适的光学检测电路检测荧光，该光学检测电路可包括基于从荧光团接收的光生成电信号的光学检测器，和使用电信号确定从荧光团接收到光的电子电路。作为一个示例，光学检测器可包括有源像素传感器(APS)，该有源像素传感器包括放大光电探测器阵列，该放大光电探测器阵列被配置成基于由光电探测器接收的光生成电信号。APS可基于本领域已知的互补金属氧化物半导体(CMOS)技术。基于CMOS的检测器可包括场效应晶体管(FET)，例如金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)。在特定示例中，可使用具有单光子雪崩二极管(CMOS-SPAD)的CMOS成像仪以例如执行荧光寿命成像(FLIM)。在其它示例中，光学检测器可包括光电二极管，诸如雪崩光电二极管、电荷耦合器件(CCD)、低温光子检测器、反向偏置发光二极管(LED)、光敏电阻器、光电晶体管、光伏电池、光电倍增管(PMT)、量子点光电导体或光电二极管等。该光学检测电路还可包括硬件和软件的任何合适的组合，该组合与光学检测器可操作地通信以便从光学检测器接收电信号并且被配置成基于此种信号检测荧光，例如基于光学检测器检测到来自荧光团的光。例如，电子电路可包括存储器和耦合到存储器的处理器。存储器可存储用于使处理器从光学检测器接收信号并使用此种信号检测荧光团的指令。例如，指令可使处理器使用来自光学检测器的信号确定荧光在光学检测器的视野内发射，并使用此种确定来确定存在荧光团。
“测量”荧光旨在表示确定被检测到的荧光的相对或绝对量。例如，荧光的量可随时间变化，并且荧光量的变化可相对于初始荧光量或作为绝对荧光量来测量。例示性地，多个寡核苷酸中无碱基位点的量可随时间变化，例如响应于糖基化酶的作用，并且荧光团可偶联到无碱基位点。来自多个荧光团的荧光量可与无碱基位点的量和糖基化酶的活性相关。例如，上述电子电路的存储器可存储指令，这些指令使处理器一次或多次监测电信号的水平，并将这样的水平与无碱基位点的量或糖基化酶的活性相关。
用于检测诸如由对寡核苷酸的破坏引起的无碱基位点的组合物和方法
本文提供的一些示例涉及用于检测对寡核苷酸的破坏的方法。例如，可将寡核苷酸偶联到基板，例如在流通池内，用作产生待进行SBS操作的扩增子簇的引物。如果寡核苷酸被不正确储存(例如，温度过高或时间过长)，则可预期寡核苷酸中的至少一些会受到破坏，从而产生至少一个无碱基位点。此类无碱基位点可通过分别将荧光团偶联到其来检测。
例如，图1A-图1B示意性地展示了用于检测无碱基位点(诸如由对寡核苷酸的破坏引起的)的示例组合物。图1A中所示的组合物100包括基板101，该基板具有与其偶联的多个寡核苷酸110、120、130、140。在所示示例中，寡核苷酸110、120、130、140中的每一个寡核苷酸都是单链的，但是应当理解，这些寡核苷酸代替地可以是单链的。例如，寡核苷酸110包括糖-磷酸酯主链111和碱基112；寡核苷酸120包括糖-磷酸酯主链121和碱基122；寡核苷酸130包括糖-磷酸酯主链131和碱基132；并且寡核苷酸140包括糖-磷酸酯主链141和碱基142。寡核苷酸110、120、130、140可包括偶联到基板101的表面的引物。以如图1A中不同填充的框所建议的方式，寡核苷酸110的碱基112可具有与寡核苷酸130的碱基132相同的序列，并且寡核苷酸120的碱基122可具有与寡核苷酸140的碱基142相同的序列(和与寡核苷酸110、130的碱基不同的序列)。在一个非限制性的单纯例示性的示例中，寡核苷酸110、130是P5捕获引物，并且寡核苷酸120、140是P7捕获引物。可从Illumina,Inc.(San Diego,CA)商购获得的P5捕获引物具有序列5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3’(SEQ ID NO:1)。也可从Illumina,Inc.商购获得的P7捕获引物具有序列5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'(SEQ IDNO:2)。然而，应当理解，寡核苷酸的碱基可具有任何合适的一个或多个序列。
寡核苷酸中的至少一个可包括无碱基位点，该无碱基位点可能已经通过对寡核苷酸的破坏产生。例示性地，寡核苷酸140的一个碱基142在无碱基位点145处缺失。如图1A的插图所示，无碱基位点145可包括醛143，并且可具有相邻于醛的第一核苷酸，包括糖141a和(例示性地)嘧啶碱基142a，以及第二核苷酸，包括糖141b和(例示性地)嘌呤碱基142b。
如图1A所示，组合物100可包括可偶联到无碱基位点145的荧光团150。例如，荧光团150可偶联到反应性基团151，该反应性基团可与无碱基位点145反应，以便以如图1B所示的方式将荧光团150偶联到无碱基位点145。反应性基团151的非限制性示例包括羟胺和肼。例如，如图1B的插图所示，羟胺151与醛143反应以形成肟键联152，荧光团150通过该肟键联来偶联到无碱基位点145。无碱基位点145可以能够使用来自荧光团的荧光，例如，使用合适的检测电路160检测。
应当理解，荧光团150可包括任何合适的荧光团。与无碱基位点145相邻的核苷酸碱基可减少或抑制从偶联到该无碱基位点的荧光团150的非辐射能量耗散。例如，荧光团150可包括分子转子染料，该分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。与无碱基位点相邻的核苷酸碱基142a、142b可限制C-C键的旋转并将π共轭组分彼此对准。当偶联到无碱基位点145时，这种旋转限制与处于溶液中时的情况相比可增强荧光团150的荧光，或者甚至可能导致荧光团150开始发荧光。在一些示例中，与反应性基团151偶联的分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)。由接头X偶联到反应性基团Z的CCVJ的示例结构是：
Figure BDA0004027873350000161
偶联到反应性基团Z的DFHBI的示例结构是：
Figure BDA0004027873350000162
偶联到反应性基团Z的噻唑橙的示例结构是：
Figure BDA0004027873350000163
在非限制性示例中，Z为羟胺(-O-NH2)。在其它非限制性示例中，Z为肼(-NH-NH2)。Z可与醛143反应以形成荧光团150与无碱基位点145之间的肟键联。
应当理解，除分子转子染料之外的任何合适的荧光团都可适当地偶联到反应性基团，该反应性基团可偶联到无碱基位点。例示性地，偶联到反应性基团151的荧光团可选自由Alexa Fluor染料和1,8-萘二酰亚胺组成的组。Alexa Fluor染料可从ThermoFisherScientific(Waltham,Massachusetts)商购获得。在一个非限制性示例中，Alexa Fluor染料为Alexa Fluor 488。在一个非限制性示例中，1,8-萘二酰亚胺为6-二甲基氨基)-2-甲基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮(NP2)。由接头X与反应性基团Z偶联的Alexa Fluor488的示例结构是：
Figure BDA0004027873350000171
(2-(6-氨基-3-亚氨基-4,5-二磺酸基-3H-呫吨-9-基)-4-((2-(氨基氧基)乙基)氨基甲酰基)苯甲酸酯)。由接头X与反应性基团Z偶联的6-二甲基氨基)-2-甲基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮(NP2)的示例结构是：
Figure BDA0004027873350000172
在非限制性示例中，Z为羟胺(-O-NH2)。在其它非限制性示例中，Z为肼(-NH-NH2)。Z可与醛143反应以形成荧光团150与无碱基位点145之间的肟键联。
图2示意性地展示了用于检测无碱基位点(诸如由对寡核苷酸的破坏引起的)的示例方法。图2中所示的方法200可包括使溶液在基板之上流动，该基板具有与其偶联的多个寡核苷酸(操作202)。寡核苷酸中的至少一个可包括无碱基位点。在一些示例中，无碱基位点是由对该寡核苷酸的破坏产生的。该溶液可包括与反应性基团偶联的荧光团。例如，可使包含合适的溶剂(诸如水或缓冲液)和偶联到反应性基团151的荧光团150的溶液在参考图1A描述的基板100之上流动，并且寡核苷酸140可包括可通过对寡核苷酸的破坏产生的无碱基位点145。
图2中所示的方法200可包括使反应性基团与无碱基位点反应以将荧光团偶联到无碱基位点(操作204)。例如，反应性基团151可与醛143反应，以如参考图1B所描述的方式将荧光团150偶联到无碱基位点145。图2中所示的方法200可包括使用来自荧光团的荧光检测无碱基位点(操作206)。例如，合适的检测电路160可检测来自荧光团150的荧光，使用该荧光可检测到无碱基位点145。参考图1A-图1B描述荧光团150和反应性基团151的非限制性示例，以及与无碱基位点相邻的核苷酸碱基可导致荧光团150开始发荧光或可增强荧光团150的荧光的示例方式。
用于测量无碱基位点，诸如测量糖基化酶的活性的组合物和方法
应当理解，尽管如参考图1A-图1B和图2描述的示例可用于检测表面偶联的单链寡核苷酸上的无意产生的无碱基位点，但是本发明的组合物和方法可适当地用于检测并且在一些示例中用于测量任何多核苷酸上的有意和无意产生的无碱基位点，所述任何多核苷酸为例如单链或双链的并且偶联到表面(或其它元件)或处于溶液中的多核苷酸。
本文提供的一些示例涉及用于测量无碱基位点的量，诸如测量糖基化酶的活性的方法。例如，如上所述，糖基化酶可用于在多核苷酸中有意地产生无碱基位点，例如以线性化供用于合成测序的簇。糖基化酶的活性越大，糖基化酶产生无碱基位点的速度越快。然而，不同批次的糖基化酶可能具有与彼此不同的活性，或者给定批次的糖基化酶的活性可能随时间推移而降低。因此，使用对糖基化酶产生的无碱基位点的量的测量来测量糖基化酶的活性可以是有用的，例如，使得糖基化酶的使用可持续足够量的时间以实现期望产物，或者使得如果糖基化酶的活性过低，则可丢弃糖基化酶。在一些示例中，溶液中糖基化酶的活性可通过以下步骤测量：将荧光团偶联到由此类糖基化酶产生的无碱基位点，并且测量来自溶液的荧光随时间的变化。在一些示例中，糖基化酶是一种单功能糖基化酶。
例如，图3A-图3C示意性地展示了用于测量无碱基位点的量(诸如用于测量糖基化酶活性)的示例组合物。图3A中所示的组合物300包含溶液中的多个寡核苷酸310、320、330。在所示示例中，寡核苷酸310、320、330中的每一个寡核苷酸都是双链的，但是应当理解，这些寡核苷酸代替地可以是单链的。例如，寡核苷酸310包括与第一碱基312偶联的第一糖-磷酸酯主链311和偶联到与第一碱基312杂交的第二碱基312’的第二糖-磷酸酯主链311’；寡核苷酸320包括与第一碱基322偶联的第一糖-磷酸酯主链321和偶联到与第一碱基322杂交的第二碱基322’的第二糖-磷酸酯主链321’；并且寡核苷酸330包括与第一碱基332偶联的第一糖-磷酸酯主链331和偶联到与第一碱基332杂交的第二碱基332’的第二糖-磷酸酯主链331’。以如图3A中不同填充的框所建议的方式，寡核苷酸310的碱基312可具有与寡核苷酸320的碱基322和寡核苷酸330的碱基332相同的序列。然而，应当理解，寡核苷酸的碱基可具有任何合适的序列。
溶液还可包含糖基化酶360、与反应性基团351偶联的荧光团350和合适的溶剂(诸如水或缓冲液)。寡核苷酸310、320、330可包括由溶液中的糖基化酶360产生的无碱基位点。糖基化酶360产生无碱基位点的速率部分地取决于糖基化酶的活性。例如，在图3A所示的特定时间，给定糖基化酶360可作用于寡核苷酸330，例如使用所述寡核苷酸的序列。在图3B所示的特定时间，糖基化酶360的作用可已经在寡核苷酸330和310中产生了无碱基位点345。经稍后的时间(未具体示出)，糖基化酶360在寡核苷酸上的作用可产生另外的无碱基位点345。
荧光团350可偶联到无碱基位点345，并且可使用来自荧光团的荧光测量无碱基位点的量。例如，如图3B的插图中所示，无碱基位点345可以如参考图1A描述的方式包括醛，并且可具有相邻于醛的第一核苷酸，包括糖341a和(例示性地)嘧啶碱基342a，以及第二核苷酸，包括糖341b和(例示性地)嘌呤碱基342b。如图3C所示，荧光团350可偶联到无碱基位点345。例如，荧光团350可偶联到反应性基团351，该反应性基团可与无碱基位点345反应，以便以如图3B所示的方式将荧光团350偶联到无碱基位点345。反应性基团351的非限制性示例包括羟胺和肼。例如，如图3C的插图所示，羟胺351与醛343反应以形成肟键联352，荧光团350通过该肟键联来偶联到相应无碱基位点345。可使用来自荧光团的荧光，例如，使用合适的检测电路370，测量无碱基位点345的量。糖基化酶360的活性可使用荧光强度随时间的变化来确定。随后可将糖基化酶用于另一种体外过程，诸如SBS操作(例示性地但不限于将簇线性化)。
在一些示例中，如果示例性地，具有无碱基位点的荧光团的反应速率比糖基化酶产生无碱基位点的速率快，使得任何新形成的无碱基位点均可相对快速地偶联到相应荧光团，从而导致荧光的开启或增强，则可实现实时检测。随着时间的推移，荧光的增加可与糖基化酶产生的无碱基位点的数目直接相关。动力学曲线的斜率(荧光对时间)可用于表示糖基化酶的活性。在其它示例中，逐步检测可用于比较糖基化酶的批次与批次间活性。例如，在第一步中，糖基化酶可与多核苷酸(诸如DNA或RNA)反应以产生无碱基位点，然后是第二步骤，其中荧光团与无碱基位点反应以开启或增强荧光。
应当理解，荧光团350可包括任何合适的荧光团。所述与无碱基位点345相邻的核苷酸碱基可减少或抑制从偶联到该无碱基位点的荧光团350的非辐射能量耗散。例如，荧光团350可包括分子转子染料，该分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。与无碱基位点相邻的核苷酸碱基342a、342b可限制C-C键的旋转并将π共轭组分彼此对准。当偶联到无碱基位点345时，这种旋转限制与处于溶液中时的情况相比可增强荧光团350的荧光，或者甚至可能“开启”来自荧光团350的荧光。在一些示例中，与反应性基团351偶联的分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)，以上提供了其示例结构，其中Z可与醛343反应以形成荧光团350与无碱基位点345之间的肟键联。
应当理解，除分子转子染料之外的任何合适的荧光团都可适当地偶联到反应性基团，该反应性基团可偶联到无碱基位点。例示性地，偶联到反应性基团351的荧光团可选自由Alexa Fluor染料和1,8-萘二酰亚胺组成的组。在一个非限制性示例中，Alexa Fluor染料是Alexa Fluor 488，其示例结构如上所示，其中Z可与醛343反应以在荧光团350与无碱基位点345之间形成肟键联。在一个非限制性示例中，1,8-萘二酰亚胺为6-二甲基氨基)-2-甲基-1H-苯并[de]异喹啉-1,3(2H)-二酮(NP2)，其示例结构如上所示，其中Z可与醛343反应以在荧光团350与无碱基位点345之间形成肟键联。
图4示意性地展示了用于测量无碱基位点的量(诸如用于测量糖基化酶活性)的示例方法中的操作。图4中所示的方法400可包括制备包含(i)糖基化酶、(ii)寡核苷酸和(iii)与反应性基团偶联的荧光团的溶液(操作402)。例如，可通过将糖基化酶360、寡核苷酸310、320、330和与反应性基团351偶联的荧光团350(诸如参考图3A所述)一起混合在合适的溶剂(诸如水或缓冲液)中来制备溶液。
图4中所示的方法400还可包括使用糖基化酶在溶液中的寡核苷酸中产生无碱基位点(操作404)。例如，以如参考图3A-图3B所描述的方式，糖基化酶360可作用于寡核苷酸310、320、330，并从而产生无碱基位点345。图4中所示的方法400还可包括使反应性基团与无碱基位点反应以将荧光团偶联到无碱基位点(操作406)。例如，以如参考图3C描述的方式，反应性基团351可与无碱基位点345反应以将荧光团350偶联到无碱基位点。图4中所示的方法400还可包括使用来自偶联到无碱基位点的荧光团的荧光测量糖基化酶的活性(操作408)。例如，可使用荧光强度随时间的变化，例如以如参考图3A-图3C所描述的方式，测量糖基化酶360的活性。
图4中所示的方法400还可包括在合成测序操作中使用糖基化酶。例示性地，糖基化酶360可用于使扩增子(诸如可在簇扩增期间形成)线性化，例如可用于在扩增子的限定位置处产生无碱基位点，此后可在无碱基位点处切割那些扩增子的主链。应当理解，糖基化酶替代地可用于任何其它类型的操作中，并且不限于在SBS中使用。
附加实施例
以下实施例仅是说明性的，并且不旨在是限制性的。
实施例1.CCVJ1羟胺的合成
在一个实施例中，合成与反应性基团羟胺偶联的分子转子染料CCVJ1。
简而言之，使用以下反应制备由叔丁氧基羰基(Boc)保护的O-(2-氨基乙基羟胺)：
Figure BDA0004027873350000211
CCVJ1核心通过2-氰基乙酸和9-甲酰基久洛尼定的醛醇缩合合成，然后与使用三氟乙酸(TFA)脱保护的O-(2-氨基乙基羟胺)反应，以获得CCVJ1羟胺，使用了以下反应：
Figure BDA0004027873350000212
实施例2.NP2羟胺的合成
在另一个实施例中，合成与反应性羟胺偶联的荧光团NP2。
简而言之，如下反应中所示，从可商购获得的4-溴-1,8-萘二甲酸酐开始，通过与如实施例1中所述制备的Boc保护的O-(2-氨基乙基)羟胺缩合来合成萘二酰亚胺的核心结构。然后通过4位溴的亲核芳香族取代来安装二甲胺。使用TFA进行BoC脱保护和后处理后，获得NP2羟胺。
Figure BDA0004027873350000221
实施例3.DFHBI羟胺的合成
在另一个实施例中，合成与反应性基团羟胺偶联的分子转子染料DFHBI。
简而言之，在回流下，将4-羟基-3,5-二氟苯甲醛与N-乙酰基甘氨酸在乙酸酐中缩合。所得化合物与脱保护的O-(2-氨基乙基)羟胺(参见实施例1)反应，这将噁唑环转化成咪唑以获得DFHBI羟胺，如下文反应方案所示：
Figure BDA0004027873350000222
实施例4.噻唑橙羟胺的合成
在另一个实施例中，合成与羟胺反应性基团偶联的荧光团噻唑橙。
简而言之，如下文反应方案中所示，N取代的喹诺酮和N取代的苯并噻唑化合物分别通过SN2与碘甲烷和溴乙酸反应制备，并且彼此反应以获得噻唑橙核心结构，该噻唑橙核心结构与Boc(叔丁氧基羰基)保护的O-(2-氨基乙基)羟胺反应，然后使用TFA进行脱保护(参见实施例1)，以获得噻唑橙羟胺。在以下反应方案中，Et3N表示三甲胺，PyBOP表示苯并三唑-1-基-氧三吡咯烷基膦六氟磷酸盐(偶联试剂)，EDC表示1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(替代偶联试剂)，DIEA表示N-N-二异丙基乙胺(偶联反应中使用的碱)，DMF表示二甲基甲酰胺，并且DCM表示二氯甲烷。
Figure BDA0004027873350000231
根据这些实施例，可理解，可合成与反应性基团偶联的不同染料。
其它实施例
虽然上文描述了各种例示性实施例，但是对于本领域的技术人员将显而易见，在不脱离本发明的情况下可在其中做出各种变化和修改。所附权利要求旨在涵盖落入本发明的真实实质和范围内的所有此类变化和修改。
应当理解，如本文所述的本公开的每个方面的任何相应特征/示例可以任何适当组合一起实施，并且来自这些方面中的任何一个或多个方面的任何特征/示例可与如本文所述的其他方面的任何特征一起以任何适当组合实施以实现如本文所述的有益效果。
Figure IDA0004027873420000011

Claims (42)

1.一种用于检测无碱基位点的方法，所述方法包括：
使溶液在基板之上流动，所述基板具有与其偶联的多个寡核苷酸，
所述寡核苷酸中的至少一个包括无碱基位点，
所述溶液包含与反应性基团偶联的荧光团；
使所述反应性基团与所述无碱基位点反应以将所述荧光团偶联到所述无碱基位点；以及
使用来自所述荧光团的荧光检测所述无碱基位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述无碱基位点是通过对所述寡核苷酸的破坏产生的。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与所述无碱基位点相邻的核苷酸碱基抑制从与所述无碱基位点偶联的相应荧光团的非辐射能量耗散。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述荧光团包括分子转子染料，所述分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。
5.根据权利要求4所述的方法，其中与所述无碱基位点相邻的核苷酸碱基限制所述C-C键的旋转并且使所述π共轭组分彼此对准。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中与所述反应性基团偶联的所述分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中与所述反应性基团偶联的所述荧光团选自由以下组成的组：
Figure FDA0004027873340000021
Figure FDA0004027873340000022
其中X是接头并且Z是反应性基团。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述无碱基位点包括醛。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述反应性基团包括羟胺基团。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述反应性基团包括肼基团。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中使所述反应性基团与所述无碱基位点反应形成肟键联。
12.一种组合物，包含：
基板，所述基板具有与其偶联的多个寡核苷酸，
所述寡核苷酸中的至少一个包括无碱基位点；以及
与所述无碱基位点偶联的荧光团，所述无碱基位点能够使用来自所述荧光团的荧光检测。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述无碱基位点是通过对所述寡核苷酸的破坏产生的。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的组合物，其中与所述无碱基位点相邻的核苷酸碱基抑制从与所述无碱基位点偶联的相应荧光团的非辐射能量耗散。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中所述荧光团包括分子转子染料，所述分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中与所述无碱基位点相邻的核苷酸碱基限制所述C-C键的旋转并且使所述π共轭组分彼此对准。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的组合物，其中与所述反应性基团偶联的所述分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)。
18.根据权利要求12至14中任一项所述的组合物，其中与所述反应性基团偶联的所述荧光团选自由以下组成的组：
Figure FDA0004027873340000031
Figure FDA0004027873340000032
其中X是接头并且Z是反应性基团。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的组合物，其中所述无碱基位点包括醛。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的组合物，其中所述反应性基团包括羟胺基团。
21.根据权利要求13至19中任一项所述的组合物，其中所述反应性基团包括肼基团。
22.根据权利要求13至21中任一项所述的组合物，其中使所述反应性基团与所述无碱基位点反应形成肟键联。
23.一种方法，包括：
制备包含(i)糖基化酶、(ii)寡核苷酸和(iii)与反应性基团偶联的荧光团的溶液；
使用所述糖基化酶在所述溶液中的所述寡核苷酸中产生无碱基位点；
使所述反应性基团与所述无碱基位点反应以将所述荧光团偶联到所述无碱基位点；
使用来自与所述无碱基位点偶联的所述荧光团的荧光测量所述糖基化酶的活性；以及
在合成测序操作中使用所述糖基化酶。
24.根据权利要求23所述的方法，其中与所述无碱基位点相邻的核苷酸碱基抑制从与所述无碱基位点偶联的相应荧光团的非辐射能量耗散。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述荧光团包括分子转子染料，所述分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。
26.根据权利要求25所述的方法，其中与所述无碱基位点相邻的核苷酸碱基限制所述C-C键的旋转并且使所述π共轭组分彼此对准。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中与所述反应性基团偶联的所述分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)。
28.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中与所述反应性基团偶联的所述荧光团选自由以下组成的组：
Figure FDA0004027873340000051
Figure FDA0004027873340000052
其中X是接头并且Z是反应性基团。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述无碱基位点包括醛。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述反应性基团包括羟胺基团。
31.根据权利要求23至29中任一项所述的方法，其中所述反应性基团包括肼基团。
32.根据权利要求23至31中任一项所述的方法，其中使所述反应性基团与所述无碱基位点反应形成肟键联。
33.一种用于测量糖基化酶活性的溶液，所述溶液包含：
(i)糖基化酶、(ii)寡核苷酸和(iii)与反应性基团偶联的荧光团，
所述寡核苷酸包括由所述溶液中的所述糖基化酶产生的无碱基位点，
所述荧光团偶联到所述无碱基位点，以及
所述无碱基位点能够使用来自所述荧光团的荧光检测。
34.根据权利要求33所述的溶液，其中与所述无碱基位点相邻的核苷酸碱基抑制从与所述无碱基位点偶联的相应荧光团的非辐射能量耗散。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的溶液，其中所述荧光团包括分子转子染料，所述分子转子染料包含由可旋转C-C键分开的π共轭组分。
36.根据权利要求35所述的溶液，其中与所述无碱基位点相邻的核苷酸碱基限制所述C-C键的旋转并且使所述π共轭组分彼此对准。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的溶液，其中与所述反应性基团偶联的所述分子转子染料选自由以下组成的组：9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ1)、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羟基亚苄基)-1,2-二甲基-1-H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)和1-甲基-4-[(3-甲基-2(3H)-苯并噻唑亚基)甲基]喹啉(噻唑橙)。
38.根据权利要求33或权利要求34所述的溶液，其中与所述反应性基团偶联的所述荧光团选自由以下组成的组：
Figure FDA0004027873340000061
Figure FDA0004027873340000062
其中X是接头并且Z是反应性基团。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的溶液，其中所述无碱基位点包括醛。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的溶液，其中所述反应性基团包括羟胺基团。
41.根据权利要求33至39中任一项所述的溶液，其中所述反应性基团包括肼基团。
42.根据权利要求33至41中任一项所述的溶液，其中使所述反应性基团与所述无碱基位点反应形成肟键联。
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