KR20230065932A - 핵산의 무염기 부위를 검출하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

핵산의 무염기 부위를 검출하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

무염기 부위 검출 방법이 제공된다. 방법은 복수의 올리고뉴클레오티드가 커플링되어 있는 기재 위로 용액을 흐르게 하는 단계를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 무염기 부위를 포함한다. 용액은 반응성 기에 커플링된 형광단을 포함할 수 있다. 방법은 반응성 기를 무염기 부위와 반응시켜 형광단을 무염기 부위에 커플링시키는 단계; 및 형광단으로부터의 형광을 사용하여 무염기 부위를 검출하는 단계를 포함한다.

Description

핵산의 무염기 부위를 검출하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 11일에 출원되고 제목이 "무염기 부위를 검출하기 위한 조성물 및 방법"인 미국 임시 특허 출원 제63/077,119호의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 서식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 2021년 9월 7일에 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 IP-2017-PCT_SL.txt이고 크기는 752 바이트이다.
클러스터 증폭은 예를 들어 유전자 시퀀싱에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드 증폭에 대한 접근법이다. 표적 폴리뉴클레오티드는 플로우셀(flowcell)에서 기재(substrate) 표면에 커플링된 올리고뉴클레오티드 프라이머(예를 들어, P5 및 P7 프라이머)에 의해 포획되고 표면의 랜덤 위치에서 "시드"를 형성한다. 증폭 주기는 예를 들어 "브리지 증폭"을 사용하여 각 시드 주변의 표면에 앰플리콘 클러스터를 형성하기 위해 수행된다.
본원에 제공된 예는 무염기 부위를 검출하는 것과 관련된다. 이러한 검출을 수행하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
본원의 일부 예에서 무염기 부위를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 방법은 복수의 올리고뉴클레오티드가 커플링되어 있는 기재 위로 용액을 흐르게 하는 단계를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 무염기 부위를 포함할 수 있다. 용액은 반응성 기에 커플링된 형광단을 포함할 수 있다. 방법은 반응성 기를 무염기 부위와 반응시켜 형광단을 무염기 부위에 커플링시키는 단계; 및 형광단으로부터의 형광을 사용하여 무염기 부위를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 무염기 부위는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 생성된다.
일부 예에서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기가, 무염기 부위에 커플링된 각각의 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일(non-radiative energy dissipation)을 억제할 수 있다.
일부 예에서, 형광단은 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 C-C 결합의 회전을 제한할 수 있고 π-공액 성분을 서로 정렬시킬 수 있다.
일부 예에서, 반응성 기에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 반응성 기에 커플링된 형광단은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00001
및
Figure pct00002
, 상기 식에서, X는 링커이고 Z는 반응성 기임.
일부 예에서, 무염기 부위는 알데하이드를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기는 하이드록실아민 기를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기는 하이드라진 기를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기를 무염기 부위의 반응시키는 것은 옥심 결합을 형성한다.
본원의 일부 예에서 조성물이 제공된다. 조성물은 복수의 올리고뉴클레오티드가 커플링되어 있는 기재를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 무염기 부위를 포함할 수 있다. 조성물은 무염기 부위에 커플링된 형광단을 포함할 수 있다. 무염기 부위는 형광단으로부터의 형광을 사용하여 검출될 수 있다.
일부 예에서, 무염기 부위는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 생성된다.
일부 예에서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기가, 무염기 부위에 커플링된 각각의 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일을 억제한다.
일부 예에서, 형광단은 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 C-C 결합의 회전을 제한하고 π-공액 성분을 서로 정렬시킨다. 일부 예에서, 반응성 기에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 반응성 기에 커플링된 형광단은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00003
및
Figure pct00004
, 상기 식에서, X는 링커이고 Z는 반응성 기임.
일부 예에서, 무염기 부위는 알데하이드를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기는 하이드록실아민 기를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기는 하이드라진 기를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기를 무염기 부위의 반응시키는 것은 옥심 결합을 형성한다.
본원의 일부 예에서 방법이 제공된다. 방법은 (i) 글리코실라제, (ii) 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 반응성 기에 커플링된 형광단을 포함하는 용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 글리코실라제를 사용하여 용액에서 올리고뉴클레오티드의 무염기 부위를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 반응성 기를 무염기 부위와 반응시켜 형광단을 무염기 부위에 커플링시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 무염기 부위에 커플링된 형광단으로부터의 형광을 사용하여 글리코실라제의 활성을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 합성에 의한 시퀀싱 작업에서 글리코실라제를 사용하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기가, 무염기 부위에 커플링된 각각의 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일을 억제할 수 있다.
일부 예에서, 형광단은 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 C-C 결합의 회전을 제한할 수 있고 π-공액 성분을 서로 정렬시킬 수 있다. 일부 예에서, 반응성 기에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 반응성 기에 커플링된 형광단은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Figure pct00005
및
Figure pct00006
, 상기 식에서, X는 링커이고 Z는 반응성 기임.
일부 예에서, 무염기 부위는 알데하이드를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기는 하이드록실아민 기를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기는 하이드라진 기를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기를 무염기 부위의 반응시키는 것은 옥심 결합을 형성한다.
본원의 일부 예에서는 글리코실라제 활성을 측정하기 위한 용액이 제공된다. 용액은 (i) 글리코실라제, (ii) 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 반응성 기에 커플링된 형광단을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 용액에서 글리코실라제에 의해 생성된 무염기 부위를 포함할 수 있다. 형광단은 무염기 부위에 커플링될 수 있다. 무염기 부위는 형광단으로부터의 형광을 사용하여 검출될 수 있다.
일부 예에서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기가, 무염기 부위에 커플링된 각각의 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일을 억제할 수 있다.
일부 예에서, 형광단은 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 C-C 결합의 회전을 제한할 수 있고 π-공액 성분을 서로 정렬시킬 수 있다. 일부 예에서, 반응성 기에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 예에서, 반응성 기에 커플링된 형광단은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00007
및
Figure pct00008
, 상기 식에서, X는 링커이고 Z는 반응성 기임.
일부 예에서, 무염기 부위는 알데하이드를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기는 하이드록실아민 기를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기는 하이드라진 기를 포함한다. 일부 예에서, 반응성 기를 무염기 부위의 반응시키는 것은 옥심 결합을 형성한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 각 양태의 임의의 각각의 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 이들 양태 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징/예는 본원에 기재된 이점을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 본원에 기재된 다른 양태(들)의 임의의 특징과 함께 구현될 수 있음을 이해해야 한다.
도 1a 및 도 1b는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 야기되는 것과 같은 무염기 부위를 검출하기 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다.
도 2는 예를 들어 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 야기되는 무염기 부위를 검출하기 위한 예시적인 방법에서의 작업을 개략적으로 도시한다.
도 3a 내지 도 3c는 글리코실라제 활성을 측정하기 위한 것과 같은 무염기 부위의 양을 측정하기 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다.
도 4는 글리코실라제 활성을 측정하기 위한 것과 같은 무염기 부위의 양을 측정하기 위한 예시적인 방법의 작업을 개략적으로 도시한다.
본원에 제공된 예는 무염기 부위를 검출하는 것과 관련된다. 본원에 제공된 일부 예는 올리고뉴클레오티드에의 손상의 검출 또는 글리코실라제 활성 측정과 관련이 있다. 이러한 검출 및 측정을 수행하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
본원에서 무염기 부위는 DNA 무염기 부위를 지칭할 수 있다. DNA 무염기 부위(무퓨린/무피리미딘 부위 또는 "AP"라고도 함)는 예를 들어 DNA 글리코실라제에 의해 의도적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 글리코실라제는 "브리지 증폭"을 사용하여 생성된 앰플리콘을 선형화하는 것과 같은 하나 이상의 합성에 의한 시퀀싱("SBS") 작업에 사용될 수 있다. 예시적으로, Uracil-DNA 글리코실라제(UDG)는 dU 염기에서 무염기 부위를 생성하기 위해 사용될 수 있고, 무염기 부위는 엔도뉴클레아제에 의해 처리되어 포스포디에스테르 백본에서 절단을 생성하므로 앰플리콘을 선형화할 수 있다. DNA 무염기 부위는 예를 들어 산성 매질에 대한 노출과 같은 DNA에의 손상에 의해 의도하지 않게 생성될 수도 있다. 프라이머와 같은 올리고뉴클레오티드에의 손상을 검출하는 것은 이러한 손상에 의해 생성된 무염기 부위가 나중 작업에서 부주의하게 절단될 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 또한, 글리코실라제가 불충분한 속도로 앰플리콘에서 무염기 부위를 생성하는 경우 앰플리콘이 불충분하게 선형화되어 후속 SBS 작업에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 글리코실라제의 활성을 측정하는 것이 유용할 수 있다.
본원에서 제공된 바와 같이, (예를 들어, 글리코실라제 활성에 의해 또는 손상에 의해) 무염기 부위의 의도적 또는 비의도적 생성은 무염기 부위에 형광단을 커플링시킴으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 형광단은 무염기 부위와 반응하여 형광단을 무염기 부위에 커플링시키는 반응성 모이어티에 커플링될 수 있다. 예시적으로, 무염기 부위는 하이드록실아민 또는 하이드라진과 같은 반응성 모이어티와 반응할 때 형광단이 무염기 부위에 커플링되는 것을 통해 옥심을 형성하는 알데하이드를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 형광단이 무염기 부위에 커플링될 때 형광단으로부터의 형광이 발생하거나 향상될 수 있다. 예시적으로, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일을 억제할 수 있으며, 따라서 형광단으로부터의 형광 강도를 향상시키거나 심지어 형광단이 무염기 부위에 커플링된 경우에만 검출 가능하게 형광을 발하도록 할 수 있다.
먼저, 본원에서 사용되는 일부 용어에 대해 간략히 설명한다. 이어서, 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 야기되는 것과 같은 무염기 부위를 검출하거나 글리코실라제 활성을 측정하기 위한 일부 예시적인 조성물 및 예시적인 방법이 기재될 것이다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 "갖다", "갖는다", 및 "가진"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 청구항의 전제부에서든 또는 본문에서든, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형(open-ended) 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 ~를 갖는" 또는 "적어도 ~를 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계들을 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징부들 또는 구성요소들을 포함하지만, 또한 추가의 특징부들 또는 구성요소들을 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "실질적으로", "대략", 및, 예를 들어 처리에 있어서의 변동으로 인한 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 그들은 ±10% 이하, 예를 들어 ±5% 이하, 예를 들어 ±2% 이하, 예를 들어 ±1% 이하, 예를 들어 ±0.5% 이하, 예를 들어 ±0.2% 이하, 예를 들어 ±0.1% 이하, 예를 들어 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "혼성화하다"는 이중 가닥 "듀플렉스"를 형성하기 위해 중합체의 길이를 따라 제1 폴리뉴클레오티드를 제2 폴리뉴클레오티드에 비공유적으로 회합시키는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 2개의 DNA 폴리뉴클레오티드 가닥은 상보적인 염기쌍을 통해 회합될 수 있다. 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 회합 강도는 이들 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 서열 사이의 상보성에 따라 증가한다. 폴리뉴클레오티드 사이의 혼성화 강도는 듀플렉스의 50%가 서로 해리되는 용융 온도(Tm)를 특징으로 할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 당 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 포함하는 분자를 의미하는 것으로 의도되며, 일부 예에서는 핵염기도 포함된다. 핵염기가 결여된 뉴클레오티드는 "무염기"로 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 포스페이트 당 백본 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 뉴클레오티드의 예는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 디포스페이트(ADP), 아데노신 트리포스페이트(ATP), 티미딘 모노포스페이트(TMP), 티미딘 디포스페이트(TDP), 티미딘 트리포스페이트(TTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 디포스페이트(CDP), 시티딘 트리포스페이트(CTP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 디포스페이트(GDP), 구아노신 트리포스페이트(GTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 디포스페이트(UDP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 디포스페이트(dCDP), 데옥시시티딘 트리포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트(dUDP), 및 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 또한 천연 발생 뉴클레오티드와 비교하여 변형된 핵염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드 유형인 임의의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 변형된 핵염기의 예는 이노신, 자타닌, 하이포자타닌, 이소시토신, 이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸 시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸 아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필 구아닌, 2-프로필 아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-하이드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환된 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌 등을 포함한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 아데노신 5'-포스포설페이트와 같은 뉴클레오티드 유사체는 폴리뉴클레오티드로 혼입될 수 없다. 뉴클레오티드는 임의의 적절한 수의 포스페이트, 예를 들어 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 6개 초과의 포스페이트를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 서로 결합된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 중합체의 하나의 비제한적 예이다. 폴리뉴클레오티드의 예는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 및 이들의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열, 예컨대 RNA 또는 단일 가닥 DNA, 뉴클레오티드의 이중 가닥 서열, 예컨대 이중 가닥 DNA일 수 있거나, 뉴클레오티드의 단일 가닥 및 이중 가닥 서열의 혼합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 게놈 DNA, PCR 및 증폭 생성물을 포함한다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 dsDNA로 전환될 수 있으며 그 반대도 가능하다. 폴리뉴클레오티드는 거울상 이성질체 DNA와 같은 비-천연 발생 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 정확한 서열은 알려지거나 알려지지 않을 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, 발현된 서열 태그(EST) 또는 유전자 발현의 연속 분석(SAGE) 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전사 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 임의의 전술한 것의 프라이머 또는 증폭된 사본.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리머라제"는 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드로 중합함으로써 폴리뉴클레오티드를 조립하는 활성 부위를 갖는 효소를 의미하는 것으로 의도된다. 폴리머라제는 프라이밍된 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있고, 성장하는 프라이머에 뉴클레오티드를 순차적으로 추가하여 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 갖는 "상보적 사본" 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 또 다른 폴리머라제 또는 동일한 폴리머라제는 상보적인 사본 폴리뉴클레오티드의 상보적인 사본을 형성함으로써 표적 뉴클레오티드의 사본을 형성할 수 있다. 임의의 이러한 사본은 본원에서 "앰플리콘"으로 지칭될 수 있다. DNA 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합한 다음 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥(성장하는 앰플리콘)의 3' 말단에 있는 자유 하이드록실 기에 뉴클레오티드를 순차적으로 추가하여 표적 폴리뉴클레오티드 아래로 이동할 수 있다. DNA 폴리머라제는 DNA 주형에서 상보적인 DNA 분자를 합성할 수 있고 RNA 폴리머라제는 DNA 주형에서 RNA 분자를 합성할 수 있다(전사). 폴리머라제는 가닥 성장을 시작하기 위해 짧은 RNA 또는 DNA 가닥(프라이머)을 사용할 수 있다. 일부 폴리머라제는 사슬에 염기를 추가하는 부위의 업스트림 가닥을 대체할 수 있다. 이러한 폴리머라제는 가닥 치환이라고 할 수 있는데, 이는 폴리머라제에 의해 판독되는 주형 가닥에서 상보적 가닥을 제거하는 활성을 가짐을 의미한다. 가닥 치환 활성을 갖는 폴리머라제의 예는 Bst(바실루스 스테아로써모필루스) 폴리머라제, 엑소-Klenow 폴리머라제 또는 시퀀싱 등급 T7 엑소-폴리머라제의 큰 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 폴리머라제는 앞에 있는 가닥을 분해하여 뒤에 있는 성장 사슬로 효과적으로 교체한다(5' 엑소뉴클레아제 활성). 일부 폴리머라제는 뒤에 있는 가닥을 분해하는 활성을 갖는다(3' 엑소뉴클레아제 활성). 일부 유용한 폴리머라제는 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 돌연변이 또는 다른 방식으로 변형되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 뉴클레오티드가 유리 3' OH 기를 통해 첨가될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머 길이는 임의의 적합한 수의 염기 길이일 수 있으며 천연 및 비-천연 뉴클레오티드의 임의의 적합한 조합을 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 프라이머에 혼성화(상보적인 서열을 가짐)하는 "어댑터"를 포함할 수 있고, 프라이머의 유리 3' OH 기에 뉴클레오티드를 첨가함으로써 상보적인 사본 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 증폭될 수 있다. 프라이머는 기재에 커플링될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "기재"는 본원에 기재된 조성물에 대한 지지체로 사용되는 물질을 지칭한다. 기재 물질의 예는 유리, 실리카, 플라스틱, 석영, 금속, 금속 산화물, 유기-실리케이트(예를 들어, 다면체 유기 실세스퀴옥산(POSS)), 폴리아크릴레이트, 탄탈륨 산화물, 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. POSS의 예는 그 전체가 참고로 포함된 문헌[Kehagias et al., Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있다. 일부 예에서, 본 출원에서 사용되는 기재는 실리카-기반 기재, 예컨대 유리, 용융 실리카 또는 기타 실리카 함유 물질을 포함한다. 일부 예에서, 기재는 규소, 규소 질화물, 또는 실리콘 수소화물을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본 출원에서 사용되는 기재는 플라스틱 물질 또는 성분, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리카르보네이트, 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함한다. 플라스틱 물질의 예는 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스티렌, 및 시클릭 올레핀 중합체 기재를 포함한다. 일부 예에서, 기재는 실리카-기반 물질 또는 플라스틱 물질 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 예에서, 기재는 유리 또는 규소-기반 중합체를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일부 예에서, 기재는 금속을 포함할 수 있다. 일부 이러한 예에서, 금속은 금이다. 일부 예에서, 기재는 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 한 예에서, 표면은 탄탈륨 산화물 또는 주석 산화물을 포함한다. 아크릴아미드, 에논, 또는 아크릴레이트도 기재 재료 또는 구성요소로 활용될 수 있다. 다른 기재 물질은 갈륨 비소, 인듐 포스파이드, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 석영일 수 있거나 석영을 포함할 수 있다. 일부 다른 예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 GaAs 또는 ITO와 같은 반도체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 전술한 목록은 본 출원을 예시하기 위한 것이지만 이에 제한되지 않는다. 기재는 단일 재료 또는 복수의 상이한 재료를 포함할 수 있다. 기재는 복합재 또는 라미네이트일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 유기-실리케이트 물질을 포함한다. 기재는 편평하고, 둥글고, 구형, 막대형 또는 임의의 다른 적합한 형상일 수 있다. 기재는 강성 또는 가요성일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 비드 또는 플로우 셀이다.
일부 예에서, 기재는 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 기재의 노출된 층 내 또는 상의 상이한 영역의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 하나 이상의 영역은 하나 이상의 캡처 프라이머가 존재하는 특징부일 수 있다. 특징부는 캡처 프라이머가 존재하지 않는 틈새 영역에 의해 분리될 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 행과 열로 있는 특징부의 x-y 형식일 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 특징부 및/또는 틈새 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 예에서, 패턴은 특징부 및/또는 틈새 영역의 랜덤 배열일 수 있다. 일부 예에서, 기재는 표면에 웰(함몰부)의 어레이를 포함한다. 웰은 실질적으로 수직인 측벽에 의해 제공될 수 있다. 웰은 포토리소그래피, 스탬핑 기법들, 몰딩 기법들 및 마이크로에칭 기법들을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 다양한 기법들을 사용하여 당업계에 대체적으로 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 사용되는 기법은 어레이 기재의 조성 및 형상에 의존할 것이다.
기재의 패턴화된 표면의 특징부는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM)와 같은 패턴화된 공유 결합 겔이 있는 유리, 규소, 플라스틱, 또는 다른 적합한 물질 상의 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)의 어레이 중의 웰을 포함할 수 있다. 이 공정은 다수의 사이클의 시퀀싱 실행에서 안정적일 수 있는 시퀀싱에 사용되는 겔 패드를 생성한다. 웰에 대한 중합체의 공유결합은 다양한 용도에서 구조화된 기재의 수명 전체에 걸쳐 구조화된 특징부에 겔을 유지하는 데 도움이 된다. 그러나, 많은 예에서, 겔은 웰에 공유 결합될 필요가 없다. 예를 들어, 일부 조건에서, 구조화된 기재의 어느 부분에도 공유 결합되지 않은 실란 비함유 아크릴아미드(SFA)가 겔 재료로서 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 구조화된 기재는 적합한 물질을 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)로 패턴화시키고, 패턴화된 물질을 겔 물질(예를 들어, PAZAM, SFA 또는 이들의 화학적으로 변형된 변이체, 예컨대 SFA의 아지도화(azidolyzed) 버전(아지도-SFA))로 코팅하고, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 폴리싱을 통해서, 겔 코팅된 물질의 표면을 폴리싱하여 웰 내에 겔을 보유시키지만 웰들 사이의 구조화된 기재의 표면 상의 틈새 영역으로부터 실질적으로 모든 겔을 제거하거나 불활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 프라이머는 겔 물질에 부착될 수 있다. 복수의 표적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단편화된 인간 게놈 또는 이의 일부)를 포함하는 용액은 연마된 기재와 접촉하여 개별 표적 폴리뉴클레오티드가 겔 물질에 부착된 프라이머와의 상호 작용을 통해 개별 웰에 시딩될 수 있지만; 그러나 표적 폴리뉴클레오티드는 겔 물질의 부재 또는 불활성으로 인해 틈새 영역을 차지하지 않을 것이다. 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭은 틈새 영역에서 겔의 부재 또는 불활성이 성장하는 클러스터의 외부 이동을 억제할 수 있기 때문에 웰에 한정될 수 있다. 이 공정은 편리하게 제조 가능하고, 스케일링가능하며, 종래의 마이크로-제조 또는 나노-제조 방법들을 활용한다.
패턴화된 기재는 예를 들어 슬라이드 또는 칩으로 에칭된 웰을 포함할 수 있다. 에칭의 패턴 및 웰의 기하 구조는 다양한 상이한 형상 및 크기를 취할 수 있고, 이러한 특징은 물리적으로 또는 기능적으로 서로 분리될 수 있다. 이러한 구조적 특징을 갖는 특히 유용한 기재는 마이크로스피어와 같은 고체 입자의 크기를 선택할 수 있는 패턴화된 기재를 포함한다. 이러한 특성을 갖는 예시적인 패턴화된 기재는 BEAD ARRAY 기술과 관련하여 사용되는 에칭된 기재이다(Illumina, Inc., 샌디에이고, 캘리포니아).
일부 예에서, 본원에 기재된 기재는 플로우 셀의 적어도 일부를 형성하거나 플로우 셀에 위치하거나 플로우 셀에 커플링된다. 플로우 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 구분되는 플로우 챔버를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 플로우 셀의 제조를 위한 플로우 셀 및 기재의 예는 Illumina, Inc.(샌디에이고, 캘리포니아)에서 상업적으로 입수 가능한 것들을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "복수"는 2개 이상의 상이한 구성원의 집단을 의미하는 것으로 의도된다. 복수는 크기가 소형, 중형, 대형, 초대형 범위일 수 있다. 소형 크기의 복수는 예를 들어 몇 개 구성원에서 수십 개의 구성원 범위일 수 있다. 중형 크기의 복수는 예를 들어 수십 개의 구성원에서 약 100개의 구성원 또는 수백개의 구성원 범위일 수 있다. 대형 복수는 예를 들어 약 수백개의 구성원에서 약 1000개의 구성원, 수천 개의 구성원 및 최대 수만개의 구성원 범위일 수 있다. 초대형 복수는 예를 들어 수만 개의 구성원에서 약 수십만, 백만, 수백만, 수천만 및 최대 수억 개 이상의 구성원 범위일 수 있다. 따라서, 복수는 구성원의 수에 의해 측정되는 바와 같이, 위의 예의 범위 사이 및 그보다 큰 모든 크기와 같이, 2개부터 1억개의 구성원을 훨씬 넘는 크기의 범위일 수 있 수 있다. 예시적인 폴리뉴클레오티드 복수는 예를 들어 약 1×105개 이상, 5×105개 이상 또는 1×106개 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드의 집단을 포함한다. 따라서, 당해 용어의 정의는 2보다 큰 모든 정수 값을 포함하도록 의도된다. 복수의 상한은 예를 들어 샘플에서 폴리뉴클레오티드 서열의 이론적인 다양성에 의해 설정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "표적 폴리뉴클레오티드"는 분석 또는 작용의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로 의도된다. 분석 또는 작용은 폴리뉴클레오티드를 증폭, 시퀀싱 및/또는 기타 절차에 적용하는 것을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드는 분석하고자 하는 표적 서열에 부가적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 분석될 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 측면(들)에 있는 프라이머 결합 부위로서 기능하는 어댑터를 포함하는 하나 이상의 어댑터를 포함할 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 다른 용어는 크기, 순서 또는 기타 특성의 특정 차이를 나타내기 위한 것이 아니다. 설명의 명확성을 위해 용어는 여러 폴리뉴클레오티드 종을 포함하는 특정 방법 또는 조성물을 설명할 때 폴리뉴클레오티드의 한 종을 다른 종과 구별하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "앰플리콘"은 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때 폴리뉴클레오티드를 복제한 산물을 의미하는 것으로 의도되며, 산물은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 실질적으로 동일하거나 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. "증폭" 및 "증폭하다"는 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 만드는 공정을 지칭한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 앰플리콘은 상보적 사본일 수 있다. 추가 앰플리콘은 제1 앰플리콘 생성 후 표적 폴리뉴클레오티드 또는 제1 앰플리콘에서 생성되는 복사본이다. 후속 앰플리콘은 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적이거나 표적 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 생성할 때 폴리뉴클레오티드의 소수의 돌연변이(예를 들어, 증폭 아티팩트로 인함)가 발생할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "글리코실라제"는 글리코실 화합물을 가수분해하는 효소를 지칭한다. 일부 예에서, 글리코실라제가 가수분해하는 글리코실 화합물은 폴리뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. DNA 및 RNA는 글리코실라제가 본원에 제공된 것과 같은 방식으로 사용될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다. 일부 예에서, 본원에 제공된 것과 같은 방식으로 사용될 수 있는 글리코실라제는 글리코실라제 활성 이외의 추가 활성이 결여되어 있음을 의미하는 것으로 의도되는 "일작용성"이다. 이에 비해, "이작용성" DNA 글리코실라제는 또한 DNA의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 글리코실라제의 "활성"은 글리코실라제가 글리코실 화합물을 시간의 함수로 가수분해하는 속도를 나타낼 수 있다.
글리코실라제는 DNA 글리코실라제를 포함하며, 이는 염기와 데옥시리보스 사이의 N-글리코시드 결합을 가수분해함으로써 손상되거나 짝이 맞지 않는 DNA 염기를 인식하고 제거하여 알데하이드 기와 평형인 헤미아세탈 기를 포함하는 무염기 부위를 생성한다. 일작용성 글리코실라제의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 시토신 탈아미노화로 인해 발생할 수 있는 dU 염기에서 무염기 부위를 생성하는 데 사용될 수 있는 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG); 3-meA(3-알킬아데닌) 및 하이포잔틴에서 무염기 부위를 생성하는 데 사용될 수 있는 AlkA/AlkE/Mag1/MPG(N-메틸 퓨린 DNA 글리코실라제); A:8-옥소G에서 무염기 부위를 생성하는 데 사용될 수 있는 MutY/mHYH; U, hoU(5-하이드록시우라실), hmU(5-하이드록시메틸우라실) 또는 fU(5-포르밀우라실)에서 무염기 부위를 생성하는 데 사용될 수 있는 hSMUG1; T:G 미스페어링에서 무염기 부위를 생성하는 데 사용될 수 있는 TDG 또는 MBD4;및 알키퓨린(alkypurine)에서 무염기 부위를 생성하는 데 사용될 수 있는 AlkC 또는 AlkD.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형광단"은 제1 파장과 상이한 제2 파장의 광으로 여기에 반응하는 제1 파장의 광을 방출하는 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 형광단에 의해 방출되는 광은 "형광"이라고 할 수 있으며 적합한 광학 회로에 의해 검출될 수 있다. 에너지를 "방사적으로" 방출하는 것으로 간주될 수 있는 형광에 더하여, 형광단은 분자 또는 이러한 분자의 하나 이상의 구성요소의 회전을 통해 에너지를 "비방사적으로" 산일시킬 수 있다. 비방사적 에너지 산일은 형광단이 에너지를 방사적으로 방출하는 데 사용할 수 있는 에너지의 양을 감소시킬 수 있다. 형광단의 예는 "분자 회전자 염료"이며, 이는 2개의 π-공액 성분 사이에 탄소-탄소("C-C") 단일 결합 회전축이 있는 형광단을 지칭한다. C-C 결합이 자유롭게 회전할 수 있는 경우, π-공액 성분이 서로 정렬되지 않을 수 있으며 분자가 실질적으로 형광을 발하지 않을 수 있다. 이에 비해, C-C 결합의 회전을 제한하여 π-공역 성분이 서로 충분히 정렬되어 이들 성분의 π-오비탈이 서로 중첩되어 확장된 π-공액 어셈블리를 형성하면, 형성된 확장된 π-공액 어셈블리는 π-공액 성분이 정렬되지 않은 경우에 비해 상대적으로 높은 강도로 검출 가능하게 형광을 발할 수 있다.
본원에 사용된, 형광을 "검출"한다는 것은 형광단으로부터 광을 수신하고, 수신한 광을 기반으로 전기 신호를 생성하고, 전기 신호를 사용하여 광이 형광단으로부터 수신되었음을 결정하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 형광은 임의의 적합한 광학 검출 회로를 사용하여 검출될 수 있으며, 이는 형광단으로부터 수신된 광에 기반하여 전기 신호를 생성하기 위한 광학 검출기 및 전기 신호를 사용하여 광이 형광단으로부터 수신되었음을 결정하기 위한 전자 회로를 포함할 수 있다. 하나의 예로서, 광학 검출기는 광 검출기에 의해 수신된 광에 기반하여 전기 신호를 생성하도록 구성된 증폭된 광 검출기의 어레이를 포함하는 능동 픽셀 센서(APS: active-pixel sensor)를 포함할 수 있다. APS는 당업계에 알려진 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS) 기술을 기반으로 할 수 있다. CMOS 기반 검출기는 전계 효과 트랜지스터(FET), 예를 들어 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(MOSFET)를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 단일 광자 애벌런치 다이오드(CMOS-SPAD)를 갖는 CMOS 이미저가 예를 들어 형광 수명 이미징(FLIM)을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 광학 검출기는 포토다이오드, 예컨대 애벌런치 포토다이오드, 전하 커플링 소자(CCD), 극저온 광자 검출기, 역 바이어스 발광 다이오드(LED), 포토레지스터, 포토트랜지스터, 광전지, 광전자 증배관(PMT), 양자점 광전도체 또는 포토다이오드 등을 포함할 수 있다. 광학 검출 회로는 광학 검출기와 작동 가능하게 통신하는 하드웨어 및 소프트웨어의 임의의 적절한 조합을 추가로 포함하여 광학 검출기로부터의 전기 신호를 수신할 수 있고, 이러한 신호에 기반하여, 예를 들어 광학 검출기가 형광단으로부터 광을 검출하는 것을 기반으로 형광을 검출하도록 구성된다. 예를 들어, 전자 회로는 메모리 및 메모리에 커플링된 프로세서를 포함할 수 있다. 메모리는 프로세서가 광학 검출기로부터의 신호를 수신하고 이러한 신호를 사용하여 형광단을 검출하게 하기 위한 명령을 저장할 수 있다. 예를 들어, 명령은 광학 검출기로부터의 신호를 사용하여 프로세서가 광학 검출기의 시야 내에서 형광이 방출된다는 것을 결정하고 이러한 결정을 사용하여 형광단이 존재한다고 결정하게 할 수 있다.
형광을 "측정한다"는 것은 검출되는 형광의 상대적 또는 절대량을 결정하는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 형광의 양은 시간의 함수로서 변할 수 있고, 형광의 양의 변화는 초기 형광의 양에 대해 측정되거나, 형광의 절대 양으로 측정될 수 있다. 예시적으로, 복수의 올리고뉴클레오티드에서 무염기 부위의 양은 시간의 함수로서 예를 들어 글리코실라제에 의한 작용에 따라 변할 수 있고, 형광단은 무염기 부위에 커플링될 수 있다. 복수의 형광단으로부터의 형광의 양은 무염기 부위의 양 및 글리코실라제의 활성과 상관될 수 있다. 예를 들어, 전술한 전자 회로의 메모리는 프로세서가 전기 신호의 수준을 한 번 이상 모니터링하고 이러한 수준(들)을 무염기 부위의 양 또는 글리코실라제의 활성과 연관시키도록 하는 명령을 저장할 수 있다.
올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 야기되는 것과 같은 무염기 부위를 검출하기 위한 조성물 및 방법
본원에 제공된 일부 예는 올리고뉴클레오티드에의 손상을 검출하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 SBS 작업이 수행될 앰플리콘의 클러스터를 생성하기 위한 프라이머로서 사용하기 위해 예를 들어 플로우 셀 내에서 기재에 커플링될 수 있다. 올리고뉴클레오티드가 부적절하게(예를 들어, 너무 높은 온도에서 또는 너무 오래 동안) 저장되면 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부가 손상되어 적어도 하나의 무염기 부위가 생성될 것으로 예상될 수 있다. 이러한 무염기 부위(들)는 각각 형광단을 커플링함으로써 검출될 수 있다.
예를 들어, 도 1a 및 도 1b는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 야기되는 것과 같은 무염기 부위를 검출하기 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다. 도 1a에 예시된 조성물(100)은 복수의 올리고뉴클레오티드(110, 120, 130, 140)가 커플링된 기재(101)를 포함한다. 도시된 예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드(110, 120, 130, 140)는 단일 가닥이지만, 대신에 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥일 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드(110)는 당-포스페이트 백본(111) 및 염기(112)를 포함하고; 올리고뉴클레오티드(120)는 당-포스페이트 백본(121) 및 염기(122)를 포함하고; 올리고뉴클레오티드(130)는 당-포스페이트 백본(131) 및 염기(132)를 포함하고; 올리고뉴클레오티드(140)는 당-포스페이트 백본(141) 및 염기(142)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드(110, 120, 130, 140)는 기재(101)의 표면에 커플링된 프라이머를 포함할 수 있다. 도 1a의 다르게 채워진 박스들에 의해 제안된 것과 같은 방식으로, 올리고뉴클레오티드 110의 염기 112는 올리고뉴클레오티드 130의 염기 132와 동일한 서열을 가질 수 있고, 올리고뉴클레오티드 120의 염기 122는 올리고뉴클레오티드 140의 염기 142와 동일한 서열(및 올리고뉴클레오티드 110, 130의 염기와는 다른 서열)을 가질 수 있다. 순수하게 예시적인 하나의 비제한적 예에서, 올리고뉴클레오티드 110, 130은 P5 포획 프라이머이고, 올리고뉴클레오티드 120, 140은 P7 포획 프라이머이다. Illumina, Inc.(샌디에이고, 캘리포니아)에서 상업적으로 입수 가능한 P5 포획 프라이머는 서열 5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'(SEQ ID NO: 1)을 갖는다. Illumina, Inc.에서 또한 상업적으로 입수 가능한 P7 포획 프라이머는 서열 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'(SEQ ID NO: 2)을 갖는다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 염기는 임의의 적합한 서열 또는 서열들을 가질 수 있음이 이해될 것이다.
올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 그 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 생성되었을 수 있는 무염기 부위를 포함할 수 있다. 예시적으로, 올리고뉴클레오티드(140)의 염기(142) 중 하나가 무염기 부위(145)에서 누락되어 있다. 도 1a의 삽입도에 도시된 바와 같이, 무염기 부위(145)는 알데하이드(143)를 포함할 수 있고, 당(141a) 및 (예시적으로) 피리미딘 염기(142a)를 포함하는 제1 뉴클레오티드, 및 이에 인접한, 당(141b) 및 (예시적으로) 퓨린 염기(142b)를 포함하는 제2 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
도 1a에 예시된 바와 같이, 조성물(100)은 무염기 부위(145)에 커플링될 수 있는 형광단(150)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같은 방식으로 형광단(150)은 형광단(150)을 무염기 부위(145)에 커플링시키기 위해 무염기 부위(145)와 반응할 수 있는 반응성 기(151)에 커플링될 수 있다. 반응성 기(151)의 비제한적 예는 하이드록실아민 및 하이드라진을 포함한다. 예를 들어, 도 1b의 삽입도에 도시된 바와 같이, 하이드록실아민(151)은 알데하이드(143)와 반응하여 옥심 결합(152)을 형성하고 이를 통해 형광단(150)은 무염기 부위(145)에 커플링된다. 무염기 부위(145)는 예를 들어 적합한 검출 회로(160)를 사용하여 형광단으로부터의 형광을 사용하여 검출 가능할 수 있다.
형광단(150)은 임의의 적합한 형광단을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 무염기 부위(145)에 인접한 뉴클레오티드 염기(들)는 그 무염기 부위에 커플링된 형광단(150)으로부터 비방사적 에너지 산일을 감소시키거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 형광단(150)은 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함할 수 있다. 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기(142a, 142b)는 C-C 결합의 회전을 제한할 수 있고 π-공액 성분을 서로 정렬시킬 수 있다. 이러한 회전 제한은 무염기 부위(145)에 커플링될 때 용액에 있을 때와 비교하여 형광단(150)의 형광을 향상시킬 수 있거나 심지어 형광단(150)이 형광을 내기 시작하도록 할 수 있다. 일부 예에서, 반응성 기(151)에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 링커 X에 의해 반응성 기 Z에 커플링된 CCVJ의 예시 구조는 다음과 같다:
Figure pct00009
반응성 기 Z에 커플링된 DFHBI의 예시 구조는 다음과 같다:
Figure pct00010
반응성 기 Z에 커플링된 티아졸 오렌지의 예시 구조는 다음과 같다:
Figure pct00011
. 비제한적 예에서, Z는 하이드록실아민(-O-NH2)이다. 다른 비제한적 예에서, Z는 하이드라진(-NH-NH2)이다. Z는 알데하이드(143)와 반응하여 형광단(150)과 무염기 부위(145) 사이에 옥심 결합을 형성할 수 있다.
분자 회전자 염료 이외의 임의의 적합한 형광단이 무염기 부위에 커플링될 수 있는 반응성 기에 적절하게 커플링될 수 있음이 이해될 것이다. 예시적으로, 반응기(151)에 커플링된 형광단은 Alexa Fluor 염료 및 1,8-나프탈렌 디이미드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. Alexa Fluor 염료는 ThermoFisher Scientific(Waltham, Massachusetts)에서 상업적으로 입수 가능하다. 하나의 비제한적 예에서, Alexa Fluor 염료는 Alexa Fluor 488이다. 하나의 비제한적 예에서, 1,8-나프탈렌 디이미드는 6-디메틸아미노)-2-메틸-1H-벤조[데]이소퀴놀린-1,3(2H)-디온(NP2)이다. 링커 X에 의해 반응성 기 Z에 의해 커플링된 Alexa Fluor 488의 예시 구조는 다음과 같다:
Figure pct00012
(2-(6-아미노-3-이미니오-4,5-디설포나토-3H-잔텐-9-일)-4-((2-(아미노옥시)에틸)카르바모일)벤조에이트). 링커 X에 의해 반응성 기 Z에 커플링된 6-디메틸아미노)-2-메틸-1H-벤조[데]이소퀴놀린-1,3(2H)-디온(NP2)의 예시 구조는 다음과 같다:
Figure pct00013
비제한적 예에서, Z는 하이드록실아민(-O-NH2)이다. 다른 비제한적 예에서, Z는 하이드라진(-NH-NH2)이다. Z는 알데하이드(143)와 반응하여 형광단(150)과 무염기 부위(145) 사이에 옥심 결합을 형성할 수 있다.
도 2는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 야기되는 것과 같은 무염기 부위를 검출하기 위한 예시적인 방법을 개략적으로 도시한다. 도 2에 예시된 방법(200)은 복수의 올리고뉴클레오티드가 커플링된 기재 위로 용액을 흐르게 하는 단계(작업 202)를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드는 무염기 부위를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 무염기 부위는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 생성된다. 용액은 반응성 기에 커플링된 형광단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 용매(예컨대 물 또는 완충액) 및 반응성 기(151)에 커플링된 형광단(150)을 포함하는 용액은 도 1a를 참조하여 설명된 기재(100) 위로 흐를 수 있고, 올리고뉴클레오티드(140)는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 생성될 수 있는 무염기 부위(145)를 포함할 수 있다.
도 2에 예시된 방법(200)은 반응성 기를 무염기 부위와 반응시켜 형광단을 무염기 부위에 커플링시키는 단계(작업 204)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응성 기(151)는 알데하이드(143)와 반응하여 도 1b를 참조하여 설명된 것과 같은 방식으로 형광단(150)을 무염기 부위(145)에 커플링시킬 수 있다. 도 2에 예시된 방법(200)은 형광단으로부터의 형광을 사용하여 무염기 부위를 검출하는 단계(작업 206)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 검출 회로(160)는 검출될 수 있는 무염기 부위(145)를 사용하여 형광단(150)으로부터의 형광을 검출할 수 있다. 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기(들)는 형광단(150)이 형광을 발하기 시작하게 하거나 형광단(150)의 형광을 향상시킬 수 있는 형광단(150) 및 반응성 기(151)의 비제한적 예는 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명된다.
글리코실라제의 활성 측정과 같은 무염기 부위를 측정하기 위한 조성물 및 방법
비록 도 1a 및 도 1b 그리고 도 2를 참조하여 기술된 것과 같은 예가 표면 커플링된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 표면에서 의도하지 않게 생성된 무염기 부위를 검출하는 데 사용될 수 있지만, 본 발명의 조성물 및 방법은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 단일 가닥 또는 이중 가닥이고, 표면(또는 다른 요소)에 커플링되거나 용액에 있는 폴리뉴클레오티드에서 의도적으로 및 비의도적으로 생성된 무염기 부위를 검출하고 일부 예에서는 측정하는 데 적절하게 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본원에 제공된 일부 예는 글리코실라제의 활성 측정과 같은 무염기 부위의 양을 측정하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 위에서 언급한 바와 같이, 글리코실라제는 예를 들어 합성에 의한 시퀀싱에 사용하기 위해 클러스터를 선형화하기 위해 폴리뉴클레오티드에서 무염기 부위를 의도적으로 생성하는 데 사용될 수 있다. 글리코실라제의 활성이 클수록 글리코실라제가 무염기 부위를 더 빨리 생성한다. 그러나, 글리코실라제의 다른 배치는 서로 다른 활성을 가질 수 있거나 소정의 글리코실라제 배치(batch)의 활성은 시간이 지남에 따라 감소할 수 있다. 이와 같이, 글리코실라제에 의해 생성된 무염기 부위의 양의 측정을 사용하여 글리코실라제의 활성을 측정하는 것이 유용할 수 있으므로, 예를 들어, 글리코실라제가 원하는 생성물을 얻기에 충분한 시간 동안 사용될 수 있도록, 또는 글리코실라제의 활성이 너무 낮은 경우 폐기될 수 있도록 한다. 일부 예에서, 용액 중의 글리코실라제의 활성은 이러한 글리코실라제에 의해 생성된 무염기 부위에 형광단을 커플링시키고 용액으로부터의 형광 시간의 함수로서 변화를 측정함으로써 측정될 수 있다. 일부 예에서, 글리코실라제는 일작용성 글리코실라제이다.
예를 들어, 도 3a 내지 도 3c는 글리코실라제 활성을 측정하기 위한 것과 같은 무염기 부위의 양을 측정하기 위한 예시적인 조성물을 개략적으로 도시한다. 도 3a에 예시된 조성물(300)은 용액 중 복수의 올리고뉴클레오티드(310, 320, 330)를 포함한다. 도시된 예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드(310, 320, 330)는 이중 가닥이지만, 대신에 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥일 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드(310)는 제1 염기(312)에 커플링된 제1 당-포스페이트 백본(311) 및 제1 염기(312)에 혼성화된 제2 염기(312')에 커플링된 제2 당-포스페이트 백본(311')을 포함하고; 올리고뉴클레오티드(320)는 제1 염기(322)에 커플링된 제1 당-인산 백본(321) 및 제1 염기(322)에 혼성화된 제2 염기(322')에 커플링된 제2 당-인산 백본(321')을 포함하고; 올리고뉴클레오티드(330)는 제1 염기(332)에 커플링된 제1 당-포스페이트 백본(331) 및 제1 염기(332)에 혼성화된 제2 염기(332')에 커플링된 제2 당-포스페이트 백본(331')을 포함한다. 도 3a의 다르게 채워진 박스들에 의해 제안된 것과 같은 방식으로, 올리고뉴클레오티드(310)의 염기(312)는 올리고뉴클레오티드(320)의 염기(322) 및 올리고뉴클레오티드(330)의 염기(332)와 동일한 서열을 가질 수 있다. 그러나, 올리고뉴클레오티드의 염기는 임의의 적합한 서열 또는 서열들을 가질 수 있음이 이해될 것이다.
용액은 글리코실라제(360), 반응성 기(351)에 커플링된 형광단(350) 및 적합한 용매(예컨대 물 또는 완충액)를 추가로 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드(310, 320, 330)는 용액에서 글리코실라제(360)에 의해 생성된 무염기 부위를 포함할 수 있다. 글리코실라제(360)가 무염기 부위를 생성하는 속도는 부분적으로 글리코실라제의 활성에 따라 달라진다. 예를 들어, 도 3a에 도시된 특정 시간에, 소정의 글리코실라제(360)는 예를 들어 그 올리고뉴클레오티드의 서열을 사용하여 올리고뉴클레오티드(330)에 대해 작용할 수 있다. 도 3b에 도시된 특정 시간에, 글리코실라제(360)의 작용은 올리고뉴클레오티드(330 및 310)에서 무염기 부위(345)를 생성했을 수 있다. 나중에(구체적으로 설명되지 않음) 올리고뉴클레오티드에 대한 글리코실라제(360)의 작용은 추가 무염기 부위(345)를 생성할 수 있다.
형광단(350)은 무염기 부위(345)에 커플링될 수 있고, 무염기 부위의 양은 형광단으로부터의 형광을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 도 3b의 삽입도에 도시된 바와 같이, 무염기 부위(345)는 도 1a를 참조하여 기술된 것과 같은 방식으로 알데하이드를 포함할 수 있고, 당(341a) 및 (예시적으로) 피리미딘 염기(342a)를 포함하는 제1 뉴클레오티드, 및 이에 인접한, 당(341b) 및 (예시적으로) 퓨린 염기(342b)를 포함하는 제2 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 도 3c에 예시된 바와 같이, 형광단(350)은 무염기 부위(345)에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 도 3b에 도시된 바와 같은 방식으로 형광단(350)은 형광단(350)을 무염기 부위(345)에 커플링시키기 위해 무염기 부위(345)와 반응할 수 있는 반응성 기(351)에 커플링될 수 있다. 반응성 기(351)의 비제한적 예는 하이드록실아민 및 하이드라진을 포함한다. 예를 들어, 도 3c의 삽입도에 도시된 바와 같이, 하이드록실아민(351)은 알데하이드(343)와 반응하여 옥심 결합(352)을 형성하고 이를 통해 형광단(350)은 각각의 무염기 부위(345)에 커플링된다. 무염기 부위(345)의 양은 예를 들어 적합한 검출 회로(370)를 사용하여 형광단으로부터의 형광을 사용하여 측정될 수 있다. 글리코실라제(360)의 활성은 시간의 함수로서 형광 강도의 변화를 사용하여 결정될 수 있다. 이어서 글리코실라제는 SBS 작업(예시적으로 클러스터를 선형화하지만 이에 제한되지 않음)과 같은, 또 다른 시험관 내 공정에서 사용될 수 있다.
일부 예에서, 예를 들어, 형광단과 무염기 부위의 반응 속도가 글리코실라제가 무염기 부위를 생성하는 속도보다 빠르면 임의의 새로 형성된 무염기 부위가 각각의 형광단에 비교적 빠르게 커플링할 수 있어 형광을 발생시키거나 향상시켜 실시간 검출이 달성될 수 있다. 시간이 지남에 따라 형광의 증가는 글리코실라제가 생성하는 무염기 부위의 수와 직접적으로 관련될 수 있다. 동역학 곡선의 기울기(형광 대 시간)는 글리코실라제의 활성을 나타내는 데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 단계적 검출은 글리코실라제의 배치-대-배치 활성을 비교하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 단계에서 글리코실라제는 무염기 부위를 생성하기 위해 폴리뉴클레오티드(예컨대 DNA 또는 RNA)와 반응할 수 있으며, 두 번째 단계에서는 형광단이 무염기 부위와 반응하여 형광을 발생시키거나 향상시킨다.
형광단(350)은 임의의 적합한 형광단을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 무염기 부위(345)에 인접한 뉴클레오티드 염기(들)는 그 무염기 부위에 커플링된 형광단(350)으로부터 비방사적 에너지 산일을 감소시키거나 억제할 수 있다. 예를 들어, 형광단(350)은 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함할 수 있다. 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기(342a, 342b)는 C-C 결합의 회전을 제한할 수 있고 π-공액 성분을 서로 정렬시킬 수 있다. 이러한 회전 제한은 무염기 부위(345)에 커플링될 때 용액에 있을 때와 비교하여 형광단(350)의 형광을 향상시킬 수 있거나 심지어 형광단(350)으로부터 형광을 "발생"시킬 수 있다. 일부 예에서, 반응성 기(351)에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택되며, Z가 알데하이드(343)와 반응하여 형광단(350)과 무염기 부위(345) 사이에 옥심 결합을 형성할 수 있는 예시적인 구조가 위에 제공되어 있다.
분자 회전자 염료 이외의 임의의 적합한 형광단이 무염기 부위에 커플링될 수 있는 반응성 기에 적절하게 커플링될 수 있음이 이해될 것이다. 예시적으로, 반응기(351)에 커플링된 형광단은 Alexa Fluor 염료 및 1,8-나프탈렌 디이미드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 비제한적 예에서, Alexa Fluor 염료는 Alexa Fluor 488이며, Z가 알데하이드(343)와 반응하여 형광단(350)과 무염기 부위(345) 사이에 옥심 결합을 형성할 수 있는 예시적인 구조가 위에 제공되어 있다. 하나의 비제한적 예에서, 1,8-나프탈렌 디이미드는 6-디메틸아미노)-2-메틸-1H-벤조[데]이소퀴놀린-1,3(2H)-디온(NP2)이며, Z가 알데하이드(343)와 반응하여 형광단(350)과 무염기 부위(345) 사이에 옥심 결합을 형성할 수 있는 예시적인 구조는 위에 도시되어 있다.
도 4는 글리코실라제 활성을 측정하기 위한 것과 같은 무염기 부위의 양을 측정하기 위한 예시적인 방법의 작업을 개략적으로 도시한다. 도 4에 예시된 방법(400)은 (i) 글리코실라제, (ii) 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 반응성 기에 커플링된 형광단을 포함하는 용액을 제조하는 단계(작업 402)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용액은 도 3a를 참조하여 설명된 것과 같이 물 또는 완충액과 같은 적합한 용매에서 글리코실라제(360), 올리고뉴클레오티드(310, 320, 330) 및 반응성 기(351)에 커플링된 형광단(350)을 함께 혼합하여 제조될 수 있다.
도 4에 예시된 방법(400)은 글리코실라제를 사용하여 용액에서 올리고뉴클레오티드의 무염기 부위를 생성하는 단계(작업 404)를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3a 및 도 3b를 참조하여 설명한 바와 같은 방식으로, 글리코실라제(360)는 올리고뉴클레오티드(310, 320, 330)에 작용하여 무염기 부위(345)를 생성할 수 있다. 도 4에 예시된 방법(400)은 또한 반응성 기를 무염기 부위와 반응시켜 형광단을 무염기 부위에 커플링시키는 단계(작업 406)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3c를 참조하여 설명한 바와 같은 방식으로. 반응성 기(351)는 무염기 부위(345)와 반응하여 형광단(350)을 무염기 부위에 커플링시킬 수 있다. 도 4에 예시된 방법(400)은 또한 무염기 부위에 커플링된 형광단으로부터의 형광을 사용하여 글리코실라제의 활성을 측정하는 것(작업 408)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 3a 내지 3c를 참조하여 설명된 것과 같은 방식으로, 예를 들어, 글리코실라제(360)의 활성은 시간의 함수로서 형광 강도의 변화를 사용하여 측정될 수 있다.
도 4에 도시된 방법(400)은 합성에 의한 시퀀싱 작업에서 글리코실라제를 사용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예시적으로, 글리코실라제(360)는 앰플리콘을 선형화하는 데 사용될 수 있으며 예컨대 클러스터 증폭 동안 형성될 수 있으며 예를 들어 앰플리콘의 정의된 위치에서 무염기 부위를 생성하는 데 사용할 수 있으며, 그 후 해당 앰플리콘의 백본이 무염기 부위에서 절단될 수 있다. 대신에 글리코실라제가 임의의 다른 유형의 작업에 사용될 수 있고 SBS에서의 사용에 제한되지 않음이 이해될 것이다.
추가 예
하기 실시예는 순전히 예시적이며 제한하려는 의도가 아니다.
실시예 1. CCVJ1 하이드록실아민의 합성
일 실시예에서, 반응성 기 하이드록실아민에 커플링된 분자 회전자 염료 CCVJ1이 합성된다.
요약하자면, tert-부틸옥시카르보닐(Boc)에 의해 보호된 O-(2-아미노에틸 하이드록실아민)은 다음 반응을 사용하여 제조된다:
Figure pct00014
다음 반응을 사용하여 2-시아노아세트산과 9-포르밀줄로리딘의 알돌 축합을 통해 CCVJ1 코어를 합성한 다음, 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하여 탈보호된 O-(2-아미노에틸 하이드록실아민)과 반응시켜 CCVJ1 하이드록실아민을 수득한다:
Figure pct00015
.
실시예 2. NP2 하이드록실아민의 합성
또 다른 실시예에서, 반응성 하이드록실아민에 커플링된 형광단 NP2가 합성된다.
요약하자면, 하기 반응에 나타낸 바와 같이, 상업적으로 입수 가능한 4-브로모-1,8-나프탈산 무수물로부터 출발하여, 나프탈렌 디이미드의 코어 구조는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 Boc 보호된 O-(2-아미노에틸)하이드록실아민과의 축합을 통해 합성된다. 그런 다음 디메틸아민은 위치 4 브롬의 친핵성 방향족 치환을 통해 설치된다. NP2 하이드록실아민은 TFA 및 워크업을 사용한 BoC 탈보호 후에 수득된다.
Figure pct00016
.
실시예 3. DFHBI 하이드록실아민의 합성
또 다른 실시예에서, 반응성 기 하이드록실아민에 커플링된 분자 회전자 염료 DFHBI가 합성된다.
요약하자면, 4-하이드록시-3,5-디플루오로벤즈알데하이드는 환류 하에 아세트산 무수물에서 N-아세틸글리신과 축합된다. 아래 반응식에 나타낸 바와 같이 생성된 화합물을 탈보호된 O-(2-아미노에틸) 하이드록실아민과 반응시키고(실시예 1 참조), 옥사졸 고리를 이미다졸로 전환하여 DFHBI 하이드록실아민을 수득한다:
Figure pct00017
.
실시예 4. 티아졸 오렌지 하이드록실아민의 합성
또 다른 실시예에서, 하이드록실아민 반응성 기에 커플링된 형광단 티아졸 오렌지가 합성된다.
요약하자면, 하기 반응식에 나타낸 바와 같이, N 치환된 퀴놀론 및 N 치환된 벤조티아졸 화합물을 각각 메틸 아이오다이드 및 브로모아세트산과의 SN2 반응을 통해 제조하고, 이를 서로 반응시켜 티아졸 오렌지 코어 구조를 수득하고, 이를 Boc(tert-부틸옥실카르보닐) 보호된 O-(2-아미노에틸) 하이드록실아민과 반응시킨 다음, TFA(실시예 1 참조)를 사용하여 탈보호하여 티아졸 오렌지 하이드록실아민을 수득하였다. 하기 반응식에서, Et3N은 트리메틸아민을 나타내고, PyBOP는 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오르포스페이트(커플링제)를 나타내고, EDC는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(대안적인 커플링제)를 나타내고, DIEA는 N-N-디이소프로필에틸아민(커플링 반응에 사용되는 염기)을 나타내고, DMF는 디메틸포름아미드를 나타내고, DCM은 디클로로메탄을 나타낸다.
Figure pct00018
이들 실시예로부터, 반응성 기에 커플링된 상이한 염료가 합성될 수 있음을 이해할 수 있다.
다른 실시예
상기에서 다양한 예시적인 실시예가 설명되었지만, 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 속하는 이러한 모든 변경 및 수정을 포함하도록 의도된다.
본원에 기재된 바와 같은 본 개시내용의 각 양태의 임의의 각각의 특징/예는 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 이들 양태 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징/예는 본원에 기재된 이점을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 본원에 기재된 다른 양태(들)의 임의의 특징과 함께 구현될 수 있음을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> ILLUMINA, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING AN ABASIC SITE <130> IP-2017-PCT <140> <141> <150> 63/077,119 <151> 2020-09-11 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 caagcagaag acggcatacg a 21

Claims (42)

  1. 무염기 부위 검출 방법으로서,
    복수의 올리고뉴클레오티드가 커플링되어 있는 기재 위로 용액을 흐르게 하는 단계로서,
    올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 무염기 부위를 포함하고,
    용액은 반응성 기에 커플링된 형광단을 포함하는, 단계;
    반응성 기를 무염기 부위와 반응시켜 형광단을 무염기 부위에 커플링시키는 단계; 및
    형광단으로부터의 형광을 사용하여 무염기 부위를 검출하는 단계를 포함하는, 무염기 부위 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 무염기 부위는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 생성되는, 무염기 부위 검출 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기가, 무염기 부위에 커플링된 각각의 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일(non-radiative energy dissipation)을 억제하는, 무염기 부위 검출 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 형광단이, 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함하는, 무염기 부위 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 C-C 결합의 회전을 제한하고 π-공액 성분을 서로 정렬시키는, 무염기 부위 검출 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 반응성 기에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 무염기 부위 검출 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기에 커플링된 형광단이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 무염기 부위 검출 방법:
    Figure pct00019
    및
    Figure pct00020
    , 상기 식에서, X는 링커이고 Z는 반응성 기임.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 무염기 부위가 알데하이드를 포함하는, 무염기 부위 검출 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기가 하이드록실아민 기를 포함하는, 무염기 부위 검출 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기가 하이드라진 기를 포함하는, 무염기 부위 검출 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기를 무염기 부위와 반응시키는 것이 옥심 결합을 형성하는, 무염기 부위 검출 방법.
  12. 조성물로서,
    복수의 올리고뉴클레오티드가 커플링되어 있는 기재로서,
    올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 무염기 부위를 포함하는 기재; 및
    상기 무염기 부위에 커플링된 형광단을 포함하며, 당해 무염기 부위는 형광단으로부터의 형광을 사용하여 검출가능한, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 무염기 부위는 올리고뉴클레오티드에의 손상에 의해 생성되는, 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기가, 무염기 부위에 커플링된 각각의 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일을 억제하는, 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 형광단이, 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함하는, 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 C-C 결합의 회전을 제한하고 π-공액 성분을 서로 정렬시키는, 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 반응성 기에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  18. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기에 커플링된 형광단이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물:
    Figure pct00021
    및
    Figure pct00022
    , 상기 식에서, X는 링커이고 Z는 반응성 기임.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 무염기 부위가 알데하이드를 포함하는, 조성물.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기가 하이드록실아민 기를 포함하는, 조성물.
  21. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기가 하이드라진 기를 포함하는, 조성물.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기를 무염기 부위와 반응시키는 것이 옥심 결합을 형성하는, 조성물.
  23. 방법으로서,
    (i) 글리코실라제, (ii) 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 반응성 기에 커플링된 형광단을 포함하는 용액을 제조하는 단계;
    글리코실라제를 사용하여 용액에서 올리고뉴클레오티드의 무염기 부위를 생성하는 단계;
    반응성 기를 무염기 부위와 반응시켜 형광단을 무염기 부위에 커플링시키는 단계;
    무염기 부위에 커플링된 형광단으로부터의 형광을 사용하여 글리코실라제의 활성을 측정하는 단계; 및
    합성에 의한 시퀀싱 작업에서 글리코실라제를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기가, 무염기 부위에 커플링된 각각의 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일을 억제하는, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 형광단이, 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 C-C 결합의 회전을 제한하고 π-공액 성분을 서로 정렬시키는, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 반응성 기에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  28. 제23항 또는 제24항에 있어서, 반응성 기에 커플링된 형광단이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:
    Figure pct00023
    및
    Figure pct00024
    , 상기 식에서, X는 링커이고 Z는 반응성 기임.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 무염기 부위가 알데하이드를 포함하는, 방법.
  30. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기가 하이드록실아민 기를 포함하는, 방법.
  31. 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기가 하이드라진 기를 포함하는, 방법.
  32. 제23항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기를 무염기 부위와 반응시키는 것이 옥심 결합을 형성하는, 방법.
  33. 글리코실라제 활성 측정을 위한 용액으로서,
    (i) 글리코실라제, (ii) 올리고뉴클레오티드, 및 (iii) 반응성 기에 커플링된 형광단,
    용액에서 글리코실라제에 의해 생성된 무염기 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드,
    무염기 부위에 커플링되는 형광단, 및
    형광단으로부터의 형광을 사용하여 검출될 수 있는 무염기 부위를 포함하는 용액.
  34. 제33항에 있어서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기가, 무염기 부위에 커플링된 각각의 형광단으로부터의 비방사적 에너지 산일을 억제하는, 용액.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 형광단이, 회전 가능한 C-C 결합에 의해 분리된 π-공액 성분을 포함하는 분자 회전자 염료를 포함하는, 용액.
  36. 제35항에 있어서, 무염기 부위에 인접한 뉴클레오티드 염기는 C-C 결합의 회전을 제한하고 π-공액 성분을 서로 정렬시키는, 용액.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 반응성 기에 커플링된 분자 회전자 염료는 9-(2-카르복시-2-시아노비닐)-줄로리딘(CCVJ1), (Z)-4-(3,5-디플루오로-4-하이드록시벤질리덴)-1,2-디메틸-1-H-이미다졸-5(4H)-온(DFHBI), 및 1-메틸-4-[(3-메틸-2(3H)-벤조티아졸릴리덴)메틸]퀴돌리미움(티아졸 오렌지)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용액.
  38. 제33항 또는 제34항에 있어서, 반응성 기에 커플링된 형광단이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용액:
    Figure pct00025
    및
    Figure pct00026
    , 상기 식에서, X는 링커이고 Z는 반응성 기임.
  39. 제33항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 무염기 부위가 알데하이드를 포함하는, 용액.
  40. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기가 하이드록실아민 기를 포함하는, 용액.
  41. 제33항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기가 하이드라진 기를 포함하는, 용액.
  42. 제33항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 반응성 기를 무염기 부위와 반응시키는 것이 옥심 결합을 형성하는, 용액.
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