KR20230123873A - 서열분석을 사용한 압타머의 선택 - Google Patents

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카산드라 샤먼
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

복수의 압타머 후보로부터 압타머를 선택하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 기재 내에 배치된 복수의 웰의 각각의 웰 내에 표적이 커플링된다. 웰 각각은 복수의 압타머 후보를 포함하는 유체와 접촉된다. 웰의 적어도 하나 내에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보가 표적에 커플링된다. 표적에 커플링되지 않은 임의의 압타머 후보는 제거된다. 웰 내에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머를 식별하기 위해 상기 제거 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보가 서열분석된다.

Description

서열분석을 사용한 압타머의 선택
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 21일자로 출원되고 발명의 명칭이 "Selecting Aptamers Using Sequencing"인 미국 가특허 출원 제63/128,669호의 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
생물학적 샘플에 존재할 수 있다는 특정 핵산 서열의 검출은, 일부 예로서, 미생물의 식별 및 분류, 감염성 질환의 진단, 유전적 이상의 검출 및 특성화, 암과 연관된 유전적 변화의 식별, 질환에 대한 유전적 감수성의 연구, 및 다양한 유형의 치료에 대한 반응의 측정을 위한 방법으로 사용되어 왔다. 특정 표적 분자에 결합하는 핵산 서열은 "압타머(aptamer)"로 지칭될 수 있고, 합성일 수 있거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다. 합성이든 생물학적 샘플로부터이든, 특정 핵산 서열을 검출하기 위한 일반적인 기술은 핵산 서열분석이다.
핵산 서열분석 방법은 Maxam 및 Gilbert에 의해 사용된 화학적 분해 방법 및 Sanger에 의해 사용된 가닥 신장 방법(strand elongation method)으로부터 진화되어 왔다. 현재는, 수백만 또는 심지어 수십억 개의 핵산을 단일 플로우 셀(flow cell) 상에서 병렬 처리할 수 있게 하는 몇몇 서열분석 방법이 사용되고 있는 중이다. 일부 플랫폼은 비드-기반 및 마이크로어레이 포맷을 포함하는데, 여기서는 실리카 비드들이 서열분석, 유전자형 결정, 또는 유전자 발현 프로파일링을 포함한 응용에서 그러한 포맷의 응용에 따라 프로브들로 기능화된다. 일부 서열분석 시스템은, "합성에 의한 서열분석"을 위해 또는 유전자형 결정을 위해, 서열분석 작업에 사용하기 위한 상이한 시약을 담지하는 복수의 상이한 저장소를 포함하는 기재를 이용한다.
본 명세서에 제공된 예는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하는 것에 관한 것이다. 이러한 선택을 수행하기 위한 장치 및 방법이 개시된다.
본 명세서의 일부 예는 복수의 압타머 후보로부터 압타머를 선택하는 방법을 제공한다. 본 방법은 기재 내에 배치된 복수의 웰의 각각의 웰 내에 표적을 커플링시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 복수의 압타머 후보를 포함하는 유체와 웰 각각을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은, 웰의 적어도 하나 내에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보를 표적에 커플링시키는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은 표적에 커플링되지 않은 임의의 압타머 후보를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 본 방법은, 웰 내에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머를 식별하기 위해 제거하는 단계 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보를 서열분석하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 복수의 웰의 각각의 웰 내에 표적을 커플링시키는 단계는 웰 각각 내에 제1 모이어티(moiety)를 커플링시키는 단계; 표적의 각각에 복수의 제2 모이어티를 커플링시키는 단계; 및 웰 각각 내에서 제2 모이어티를 제1 모이어티에 커플링시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 제1 모이어티는 스트렙타비딘을 포함하고, 제2 모이어티는 비오틴을 포함한다. 일부 예에서, 제1 모이어티는 포획 프라이머에 의해 웰 각각 내에 커플링된다. 일부 예에서, 서열분석을 수행하기 전에 포획 프라이머로부터 제1 모이어티를 분리한다.
일부 예에서, 기재는 제거하는 단계 후에 남아 있는 압타머 후보를 서열분석하는 데 사용되는 검출 회로를 포함한다.
일부 예에서, 복수의 웰은 플로우 셀을 포함하고, 플로우 셀을 통해 유체가 병렬로 유동된다.
일부 예에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보는 표적에 커플링될 때 변경되는 3차 구조를 갖는다.
일부 예에서, 본 방법은 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘을 생성하는 단계는, 표적으로부터 그러한 압타머 후보를 디커플링시키는 단계; 및 그러한 압타머 후보를 사용하여 앰플리콘을 생성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 사용하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, PCR은 웰과 구별되는 증폭 챔버에서 수행된다. 일부 예에서, 본 방법은 앰플리콘을 포함하는 유체와 웰 각각을 접촉시키는 단계; 웰 각각 내에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘을 표적에 커플링시키는 단계; 및 표적에 커플링되지 않은 임의의 앰플리콘을 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 서열분석된 임의의 압타머 후보는 표적에 커플링되지 않은 임의의 앰플리콘을 제거한 후에 남아 있는 임의의 앰플리콘을 포함한다. 일부 예에서, 본 방법은 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘의 추가 앰플리콘을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 예에서, 임의의 압타머 후보를 서열분석하는 단계는, 제거하는 단계 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보를 웰 내에 배치된 포획 프라이머에 커플링시키는 단계; 포획 프라이머에 커플링된 앰플리콘을 생성하기 위해 웰 내에서 증폭을 수행하는 단계; 및 포획 프라이머에 커플링된 앰플리콘을 서열분석하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 표적은 포획 프라이머의 각각을 통해 웰 내에 커플링된다. 일부 예에서, 포획 프라이머는 웰 내에서 제1 모이어티를 커플링시키고, 제2 모이어티가 웰 내에서 제1 모이어티 및 표적에 커플링된다. 일부 예에서, 포획 프라이머는 표적과 별개로 웰에 커플링된다. 일부 예에서, 압타머 후보 각각은 각각의 포획 프라이머에 상보적인 제1 및 제2 어댑터를 포함한다. 일부 예에서, 압타머 후보 각각은 제1 어댑터와 표적에 대해 선택적일 후보인 영역 사이에 배치된 제1 스페이서, 및 제2 어댑터와 표적에 대해 선택적일 후보인 영역 사이에 배치된 제2 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 예에서, 압타머 후보 각각은 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서의 일부 예는 복수의 압타머 후보로부터 압타머를 선택하기 위한 시스템을 제공한다. 시스템은 복수의 웰을 포함하는 기재를 포함할 수 있다. 시스템은 웰 각각 내에 커플링된 표적을 포함할 수 있다. 시스템은 복수의 압타머 후보를 포함하고 웰 각각과 접촉하는 유체를 포함할 수 있고, 여기서 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보는 표적에 커플링된다. 시스템은 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머를 식별하기 위해 웰 내에서 임의의 압타머 후보를 서열분석하기 위한 검출 회로를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 제1 모이어티가 웰 각각 내에 커플링된다. 일부 예에서, 복수의 제2 모이어티가 표적의 각각에 커플링된다. 일부 예에서, 제2 모이어티는 웰 각각 내에서 제1 모이어티에 커플링되어 웰 각각 내에 표적을 커플링시킨다. 일부 예에서, 제1 모이어티는 스트렙타비딘을 포함하고, 제2 모이어티는 비오틴을 포함한다. 일부 예에서, 제1 모이어티는 포획 프라이머에 의해 웰 각각 내에 커플링된다. 일부 예에서, 제1 모이어티는 포획 프라이머로부터 분리가능하다.
일부 예에서, 복수의 웰은 검출 회로 상에 배치된다.
일부 예에서, 복수의 웰은 플로우 셀을 포함하고, 플로우 셀을 통해 유체가 병렬로 유동된다.
일부 예에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보는 표적에 커플링될 때 변경되는 3차 구조를 갖는다.
일부 예에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘이 생성된다. 일부 예에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘은, 표적으로부터 그러한 압타머 후보를 디커플링시키는 단계; 및 그러한 압타머 후보를 사용하여 앰플리콘을 생성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 단계를 포함하는 단계를 사용하여 생성된다. 일부 예에서, 시스템은 PCR을 수행하기 위해 웰과 구별되는 증폭 챔버를 포함한다.
일부 예에서, 시스템은 앰플리콘을 포함하고 웰 각각과 접촉하는 유체를 추가로 포함하고, 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘은 표적에 커플링된다. 일부 예에서, 서열분석된 임의의 압타머 후보는 표적에 커플링되지 않은 임의의 앰플리콘을 제거한 후에 남아 있는 임의의 앰플리콘을 포함한다. 일부 예에서, 시스템은 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘의 추가 앰플리콘을 추가로 포함한다.
일부 예에서, 시스템은, 웰 내에 배치되고, 제거 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보에 커플링된 포획 프라이머; 및 포획 프라이머에 커플링된 압타머 후보의 앰플리콘을 추가로 포함한다. 검출 회로는 포획 프라이머에 커플링된 앰플리콘을 서열분석하기 위한 것일 수 있다. 일부 예에서, 표적은 포획 프라이머의 각각을 통해 웰 내에 커플링된다. 일부 예에서, 포획 프라이머는 웰 내에서 제1 모이어티를 커플링시키고, 제2 모이어티가 웰 내에서 제1 모이어티 및 표적에 커플링된다. 일부 예에서, 포획 프라이머는 표적과 별개로 웰에 커플링된다. 일부 예에서, 압타머 후보 각각은 각각의 포획 프라이머에 상보적인 제1 및 제2 어댑터를 포함한다. 일부 예에서, 압타머 후보 각각은 제1 어댑터와 표적에 대해 선택적일 후보인 영역 사이에 배치된 제1 스페이서, 및 제2 어댑터와 표적에 대해 선택적일 후보인 영역 사이에 배치된 제2 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 예에서, 압타머 후보 각각은 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 설명되는 바와 같은 본 개시의 태양 각각의 임의의 각각의 특징부/예는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 결과를 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 이러한 태양들 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징부/예는 여기에서 설명된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 임의의 조합으로 본 명세서에서 설명된 바와 같은 다른 태양(들)의 임의의 특징부와 함께 구현될 수 있음을 이해할 것이다.
도 1a 내지 도 1i는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하기 위한 공정 흐름에 사용되는 예시적인 장치 및 동작을 개략적으로 도시한다.
도 2a 내지 도 2f는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하기 위한 대안적인 공정 흐름에 사용되는 예시적인 장치 및 동작을 개략적으로 도시한다.
도 3은 도 1a 내지 도 1i 또는 도 2a 내지 도 2f를 참조하여 설명되는 바와 같은 장치 또는 공정 흐름에 사용하기 위한 예시적인 압타머 후보를 개략적으로 도시한다.
도 4는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하기 위한 공정 흐름에서의 예시적인 동작을 개략적으로 도시한다.
본 명세서에 제공된 예는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하는 것에 관한 것이다. 이러한 선택을 수행하기 위한 장치 및 방법이 개시된다.
일부 압타머는 표적 분자, 예컨대, 효소, 항체, 단일 세포, 또는 관심 있는 임의의 다른 분자 표적에 대해 높은 선택성으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 가닥이다. 이러한 선택적 결합 동안, 압타머는 3차 구조를 얻을 수 있다. SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)는 압타머를 선택하는 공정이다. 이전에 공지된 SELEX 공정은 전형적으로, 표적이 커플링되는 매질을 함유하는 컬럼과 같은 종래의 고상 기재 상에서 수행된다. 압타머 후보를 포함하는 유체는 기재를 통해 유동된다. 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머가 표적에 커플링되는 한편, 다른 압타머는 커플링되지 않고, 따라서 기재 밖으로 유동한다. 이어서, 표적에 대해 선택적인 압타머는 표적으로부터 디커플링되고, 예를 들어, 96-웰 플레이트에서, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭된다. PCR 산물은 다시 기재를 통해 유동되고 증폭되어 추가 풍부화(enrichment)를 제공할 수 있다. 이어서, 증폭된 압타머는 표적에 커플링되어 가장 "성공적인" 압타머를 식별하기 위해 서열분석된다. 이러한 공정은 시간 및 노동 집약적일 수 있다.
비교하면, 본 명세서에 제공된 바와 같이, 본 발명의 장치 및 방법은 서열분석의 사용을 통해 SELEX 공정을 능률화하고 단순화할 수 있다. 더 구체적으로, 일부 예에서, 압타머를 선택하고 서열분석하기 위한 작업은 동일한 웰 내에서, 예를 들어 서열분석 시스템 내의 기재의 웰 내에서 수행될 수 있다. 선택 공정이 수행되는 기재는 압타머를 서열분석하는 데 사용하기 위한 검출 회로를 포함할 수 있다. 예시적으로, 표적은 웰 각각 내에 커플링될 수 있고, 복수의 압타머가 웰 각각 내로 유동한다. 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머가 표적에 커플링될 수 있고, 임의의 다른 압타머는 제거될 수 있다. 표적에 대해 선택적인 압타머는 증폭될 수 있고, 이어서, 예컨대, 웰 각각 내에 또한 커플링된 포획 프라이머를 사용하여, 웰 내에서 서열분석될 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 장치 및 방법은 이전에 공지된 SELEX 공정과 비교하여 재료 사용 및 폐기물이 상당히 적은 상당히 능률화되고 단순화된 공정을 제공할 수 있다.
먼저, 본 명세서에서 사용되는 일부 용어들이 간략하게 설명될 것이다. 이어서, 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하기 위한 일부 예시적인 방법, 및 관련 장치가 설명될 것이다.
용어
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함하다", "포함한다", 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 용어 "갖는"뿐만 아니라 "갖다", "갖는다", 및 "가진"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 청구항의 전제부에서든 또는 본문에서든, 용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 개방형(open-ended) 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 공정과 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 공정이 적어도 언급된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계들을 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특징부들 또는 구성요소들을 포함하지만, 또한 추가의 특징부들 또는 구성요소들을 포함할 수 있음을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "실질적으로", "대략", 및 "약"은, 예를 들어 가공에서의 변동으로 인한 작은 변동을 기재하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 변동은 ±10% 이하, 예를 들어 ±5% 이하, 예를 들어 ±2% 이하, 예를 들어 ±1% 이하, 예를 들어 ±0.5% 이하, 예를 들어 ±0.2% 이하, 예를 들어 ±0.1% 이하, 예를 들어 ±0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "혼성화"는 이중 가닥 "듀플렉스"를 형성하기 위해 이들 중합체의 길이를 따라 제1 폴리뉴클레오티드를 제2 폴리뉴클레오티드에 비공유결합으로 결합시키는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 2개의 DNA 폴리뉴클레오티드 가닥은 상보적 염기 쌍을 통해 결합할 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드와 제2 폴리뉴클레오티드 사이의 결합의 강도는 이들 폴리뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드의 서열 사이의 상보성에 따라 증가한다. 폴리뉴클레오티드들 사이의 혼성화 강도는 듀플렉스의 50%가 서로 해리되는 용융 온도(Tm)를 특징으로 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 당 및 적어도 하나의 포스페이트기를 포함하는 분자를 의미하고자 하는 것으로, 일부 실시예에서 또한 핵 염기를 포함한다. 핵 염기가 결여된 뉴클레오티드는 "무염기"로 지칭될 수 있다 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 펩티드 뉴클레오티드, 변형된 포스페이트 당 골격 뉴클레오티드, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 뉴클레오티드의 예는 아데노신 모노포스페이트(AMP), 아데노신 다이포스페이트(ADP), 아데노신 트라이포스페이트(ATP), 티디민 모노포스페이트(TMP), 티미딘 다이포스페이트(TDP), 티미딘 트라이포스페이트(TTP), 시티딘 모노포스페이트(CMP), 시티딘 다이포스페이트(CDP), 시티딘 트라이포스페이트(CTP), 구아노신 모노포스페이트(GMP), 구아노신 다이포스페이트(GDP), 구아노신 트라이포스페이트(GTP), 우리딘 모노포스페이트(UMP), 우리딘 다이포스페이트(UDP), 우리딘 트라이포스페이트(UTP), 데옥시아데노신 모노포스페이트(dAMP), 데옥시아데노신 다이포스페이트(dADP), 데옥시아데노신 트라이포스페이트(dATP), 데옥시티미딘 모노포스페이트(dTMP), 데옥시티미딘 다이포스페이트(dTDP), 데옥시티미딘 트라이포스페이트(dTTP), 데옥시시티딘 다이포스페이트 (dCDP), 데옥시티딘 트라이포스페이트(dCTP), 데옥시구아노신 모노포스페이트(dGMP), 데옥시구아노신 다이포스페이트(dGDP), 데옥시구아노신 트라이포스페이트(dGTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트(dUMP), 데옥시우리딘 다이포스페이트(dUDP) 및 데옥시우리딘 트라이포스페이트(dUTP)를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드"는 또한 천연 발생 뉴클레오티드와 비교하여 변형된 핵 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드의 유형인 임의의 뉴클레오티드 유사체를 포함하도록 의도된다. 예시적인 변형된 핵 염기는 이노신, 잔타닌, 하이포잔틴, 아이소시토신, 아이소구아닌, 2-아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-하이드록시메틸 시토신, 2-아미노아데닌, 6-메틸 아데닌, 6-메틸 구아닌, 2-프로필 구아닌, 2-프로필 아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 2-티오시토신, 15-할로우라실, 15-할로시토신, 5-프로피닐 우라실, 5-프로피닐 시토신, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실, 4-티오우라실, 8-할로 아데닌 또는 구아닌, 8-아미노 아데닌 또는 구아닌, 8-티올 아데닌 또는 구아닌, 8-티오알킬 아데닌 또는 구아닌, 8-하이드록실 아데닌 또는 구아닌, 5-할로 치환 우라실 또는 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌 등을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 특정 뉴클레오티드 유사체는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 아데노신 5'-포스포설페이트와 같은 뉴클레오티드 유사체에 혼입될 수 없다. 뉴클레오티드는 임의의 적합한 수의 포스페이트, 예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 6개 초과의 포스페이트를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 서로 결합된 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 중합체의 하나의 비제한적인 예이다. 폴리뉴클레오티드의 예는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 이들의 유사체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열, 예컨대 RNA 또는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA와 같은 뉴클레오티드의 이중 가닥 서열일 수 있거나, 뉴클레오티드의 단일 가닥 서열과 이중 가닥 서열의 혼합물을 포함할 수 있다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 게놈 DNA, 및 PCR 및 증폭 생성물을 포함한다. 단일 가닥 DNA(ssDNA)는 dsDNA로 전환될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지이다. 폴리뉴클레오티드는 거울상이성질체 DNA와 같은 비천연 발생 DNA를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 정확한 서열은 공지되거나 공지되지 않을 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 예이다: 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, 발현된 서열 태그(EST) 또는 유전자 발현의 연속 분석(SAGE) 태그), 게놈 DNA, 게놈 DNA 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 합성 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 프라이머 또는 전술한 것 중 어느 하나의 증폭된 카피.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "폴리머라제"는 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드로 중합시켜 폴리뉴클레오티드를 조립하는 활성 부위를 갖는 효소를 의미하는 것으로 의도된다. 폴리머라제는 프라이밍된 단일 가닥 표적 폴리뉴클레오티드에 결합할 수 있고, 성장하는 프라이머에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하여 표적 폴리뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 갖는 "상보적 카피" 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 그 후, 다른 폴리머라제 또는 동일한 폴리머라제가 상보적 카피 폴리뉴클레오티드의 상보적 카피를 형성함으로써 표적 뉴클레오티드의 카피를 형성할 수 있다. 임의의 이러한 카피는 본 명세서에서 "앰플리콘"으로 지칭될 수 있다 DNA 폴리머라제는 표적 폴리뉴클레오티드에 결합한 다음, 성장하는 폴리뉴클레오티드 가닥(성장 앰플리콘)의 3' 말단에서 유리 하이드록실기에 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가하여 표적 폴리뉴클레오티드 아래로 이동할 수 있다. DNA 폴리머라제는 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 분자를 합성할 수 있고, RNA 폴리머라제는 DNA 주형으로부터 RNA 분자를 합성할 수 있다(전사). 폴리머라제는 가닥 성장을 시작하기 위해 짧은 RNA 또는 DNA 가닥(프라이머)을 사용할 수 있다. 일부 폴리머라제는 이들이 사슬에 염기를 첨가하고 있는 부위 상류의 가닥을 치환할 수 있다. 이러한 폴리머라제는 가닥 치환인 것으로 언급될 수 있으며, 이는 폴리머라제에 의해 판독되는 주형 가닥으로부터 상보적 가닥을 제거하는 활성을 갖는 것을 의미한다. 가닥 치환 활성을 갖는 폴리머라제의 예는 Bst(바실루스 스테아로써모필루스) 폴리머라제, 엑소-Klenow 폴리머라제 또는 서열분석 등급 T7 엑소-폴리머라제의 큰 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 폴리머라제는 이들 전방의 가닥을 분해하여, 후방의 성장하는 사슬로 효과적으로 대체(5' 엑소뉴클레아제 활성)한다. 일부 폴리머라제는 이들 뒤의 가닥을 분해하는 활성(3' 엑소뉴클레아제 활성)을 갖는다. 일부 유용한 폴리머라제는 돌연변이에 의해 또는 그렇지 않으면 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하기 위해 변형되었다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 뉴클레오티드가 유리 3' OH 기를 통해 첨가될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 프라이머 길이는 임의의 적합한 수의 염기만큼 길 수 있으며, 임의의 적합한 천연 및 비천연 뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있다. (압타머와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는) 표적 폴리뉴클레오티드는 프라이머에 혼성화하는 (프라이머에 상보적인 서열을 가지는) "어댑터"를 포함할 수 있고, 프라이머의 유리 3' OH기에 뉴클레오티드를 첨가함으로써 상보적 카피 폴리뉴클레오티드를 생성하도록 증폭될 수 있다. 프라이머는 기재에 커플링될 수 있다. 서로 "상보적인" 프라이머들이 실질적으로 그들의 전체 길이를 따라 서로 혼성화할 수 있는 반면, 서로 "직교인" 프라이머들은 실질적으로 서로 혼성화하지 않고, 이들의 앰플리콘도 혼성화하지 않는다. "포획 프라이머"가 기재에 커플링되고 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 어댑터에 혼성화할 수 있는 프라이머를 의미하고자 하는 반면, "직교 포획 프라이머"는 기재에 커플링되고 그 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 어댑터에 혼성화할 수 있는 프라이머를 의미하는 것으로 의도된다. 제1 어댑터는 포획 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있고, 제2 어댑터는 직교 포획 프라이머의 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 포획 프라이머 및 직교 포획 프라이머는 서로 상이하고 독립적인 서열을 가질 수 있다.
일부 예에서, 포획 프라이머는 Illumina, inc.로부터 구매가능한 P5 또는 P7 프라이머이다. P5 및 P7 프라이머들은 서로 직교하는 프라이머들의 비제한적인 예이다. P5 및 P7 프라이머 서열은, 일부 예에서, 하기 서열을 가질 수 있다:
쌍형성된 판독 세트:
P5: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'
P7: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT-3'
단일 판독 세트:
P5: 5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'
P7: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA3'
여기서, G*는 G 또는 8-옥소구아닌이다.
일부 예에서, 부착된 올리고뉴클레오티드(예컨대, 프라이머 또는 P5 또는 P7 프라이머)는 5' 말단에 링커 또는 스페이서를 포함한다. 이러한 링커 또는 스페이서는 화학적 또는 효소적 절단을 허용하거나 일부 다른 바람직한 특성을 부여하기 위해, 예를 들어 중합체 또는 고체 지지체에 대한 공유 부착을 가능하게 하기 위해, 또는 절단 부위를 고체 지지체로부터 최적의 거리에 위치시키기 위한 스페이서로서 작용하기 위해 포함될 수 있다. 소정 경우에, 10개의 스페이서 뉴클레오티드는 중합체 또는 고체 지지체에 대한 P5 또는 P7 프라이머의 부착 지점들 사이에 위치할 수 있다. 일부 예에서, 폴리T(polyT) 스페이서가 사용되지만, 다른 뉴클레오티드들 및 이들의 조합이 또한 사용될 수 있다. 일례에서, 스페이서는 6T 내지 10T 스페이서이다. 일부 예에서, 링커는 인접한 다이올 또는 알릴 T와 같은 화학적으로 절단가능한 작용기를 포함하는 절단가능한 뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "앰플리콘"은, 폴리뉴클레오티드와 관련하여 사용될 때, 폴리뉴클레오티드를 카피하는 산물을 의미하며, 여기서 산물은 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 실질적으로 동일하거나 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. "증폭" 및 "증폭하는"은 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 제조하는 공정을 지칭한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 앰플리콘은 상보적 카피일 수 있다. 추가 앰플리콘은 제1 앰플리콘의 생성 후에, 표적 폴리뉴클레오티드로부터 또는 제1 앰플리콘으로부터 생성된 카피이다. 후속 앰플리콘은 표적 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적이거나 표적 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 동일한 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 소수의 돌연변이(예를 들어, 증폭 아티팩트에 기인함)가 그 폴리뉴클레오티드의 앰플리콘을 생성할 때 발생할 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "기재"는 본 명세서에 기재된 조성물에 대한 지지체로서 사용되는 재료를 지칭한다. 예시적인 기재 재료는 유리, 실리카, 플라스틱, 석영, 금속, 금속 산화물, 유기-실리케이트(예를 들어, 다면체 유기 실세스퀴옥산(POSS)), 폴리아크릴레이트, 탄탈륨 옥사이드, 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. POSS의 예는 그 전체가 참조로서 포함된 Kehagias 등의 문헌[Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원에 사용된 기재는 유리, 용융 실리카, 또는 다른 실리카-함유 재료와 같은 실리카계 기재를 포함한다. 일부 실시예에서, 기재는 규소, 질화규소, 또는 실리콘 수소화물을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 출원에 사용된 기재는 플라스틱 재료 또는 구성요소, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)를 포함한다. 예시적인 플라스틱 재료는 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리스티렌, 및 사이클릭 올레핀 중합체 기재를 포함한다. 일부 실시예에서, 기재는 실리카계 재료 또는 플라스틱 재료 또는 이들의 조합이거나 이를 포함한다. 특정 실시예에서, 기재는 유리 또는 규소계 중합체를 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일부 실시예에서, 기재는 금속을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시예에서, 금속은 금이다. 일부 실시예에서, 기재는 금속 산화물을 포함하는 적어도 하나의 표면을 갖는다. 일 실시예에서, 표면은 산화탄탈륨 또는 산화주석을 포함한다. 아크릴아미드, 에논 또는 아크릴레이트도 또한 기재 재료 또는 성분으로서 사용될 수 있다. 다른 기재 재료는, 이에 제한되지는 않으나, 갈륨 비소, 인듐 포스파이드, 알루미늄, 세라믹, 폴리이미드, 석영, 수지, 중합체 및 공중합체를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 석영일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 기재 및/또는 기재 표면은 GaAs 또는 ITO와 같은 반도체일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 전술한 목록은 본 출원을 예시하는 것으로 의도되며, 이들로 제한하고자 함이 아니다. 기재는 단일 재료 또는 복수의 상이한 재료를 포함할 수 있다. 기재는 복합체 또는 라미네이트일 수 있다. 일부 실시예에서, 기재는 유기-실리케이트 재료를 포함한다. 기재는 편평한, 둥근, 구형, 막대 형상, 또는 임의의 다른 적합한 형상일 수 있다. 기재는 강성 또는 가요성일 수 있다. 일부 실시예에서, 기재는 비드 또는 플로우 셀이다.
일부 실시예에서, 기재는 패턴화된 표면을 포함한다. "패턴화된 표면"은 기재의 노출된 층 상 또는 그 안의 상이한 영역들의 배열을 지칭한다. 예를 들어, 영역들 중 하나 이상은 하나 이상의 포획 프라이머가 존재하는 특징부일 수 있다. 특징부는 포획 프라이머가 존재하지 않는 틈새 영역(interstitial region)에 의해 분리될 수 있다. 일부 실시예에서, 패턴은 행과 열인 특징부의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 실시예에서, 패턴은 특징부 및/또는 틈새 영역의 반복 배열일 수 있다. 일부 실시예에서, 패턴은 특징부 및/또는 틈새 영역의 무작위 배열일 수 있다. 일부 실시예에서, 기재는 표면에 웰의 어레이(함몰부)를 포함한다. 웰은 실질적으로 수직 측벽에 의해 제공될 수 있다. 웰은, 포토리소그래피, 스탬핑 기법, 몰딩 기법 및 마이크로에칭 기법을 포함하지만 이로 한정되지 않는 다양한 기법들을 사용하여 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이 제조될 수 있다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 사용되는 기법은 어레이 기재의 조성 및 형상에 의존할 것이다.
기재의 패턴화된 표면의 특징부는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸) 아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM)와 같은 패턴화된 공유 결합 겔이 있는 유리, 규소, 플라스틱, 또는 다른 적합한 재료(들) 상의 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)의 어레이 중의 웰을 포함할 수 있다. 공정은 다수의 사이클을 갖는 서열분석 실행에 걸쳐서 안정적일 수 있는 서열분석을 위해 사용되는 겔 패드들을 생성한다. 웰에 대한 중합체의 공유 결합은 다양한 사용 중 구조화된 기재의 수명 전체에 걸쳐서 구조화된 특징부 내에 겔을 유지하는 데 도움이 된다. 그러나, 많은 실시예들에서, 겔이 웰에 공유 결합될 필요는 없다. 예를 들어, 일부 조건에서, 구조화된 기재의 어느 부분에도 공유 결합되지 않은 실란 비함유 아크릴아미드(SFA)가 겔 재료로서 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 구조화된 기재는 적합한 재료로 웰(예를 들어, 마이크로웰 또는 나노웰)을 패턴화시키고, 패턴화된 재료를 겔 재료(예를 들어, PAZAM, SFA 또는 이들의 화학적으로 변형된 변이체, 예컨대 SFA의 아지도 분해된(azidolyzed) 버전(아지도-SFA))로 코팅하고, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 연마를 통해서 겔 코팅된 재료의 표면을 연마하여 웰 내에 겔을 보유시키지만 웰들 사이의 구조화된 기재의 표면 상의 틈새 영역으로부터 실질적으로 모든 겔을 제거하거나 불활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 프라이머는 겔 재료에 부착될 수 있다. 다음으로, 복수의 표적 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 단편화된 인간 게놈 또는 이의 부분)를 포함하는 용액은 개별 표적 폴리뉴클레오티드가 겔 재료에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해 개별 웰에 시딩하도록 연마된 기재와 접촉될 수 있다; 그러나, 겔 재료의 부재 또는 불활성으로 인해 표적 폴리뉴클레오티드는 틈새 영역을 점유하지 않을 것이다. 표적 폴리뉴클레오티드의 증폭은 틈새 영역 내 겔의 부재 또는 비활성이 성장하는 클러스터의 외향 이동을 방지할 수 있기 때문에 웰로 한정될 것이다. 공정은 편리하게 제조가능하고, 확장가능하며, 종래의 마이크로-제조 또는 나노-제조 방법을 활용한다.
패턴화된 기재는 예를 들어 슬라이드 또는 칩으로 에칭된 웰을 포함할 수 있다. 웰의 에칭 및 기하학적 구조의 패턴은 다양한 상이한 형상 및 크기를 취할 수 있고, 이러한 특징부는 물리적으로 또는 기능적으로 서로 분리 가능할 수 있다. 이러한 구조적 특징부를 갖는 특히 유용한 기재는 미소구체와 같은 고체 입자의 크기를 선택할 수 있는 패턴화된 기재를 포함한다. 이러한 특성을 갖는 예시적인 패턴화된 기재는 BEAD ARRAY 기술과 관련하여 사용되는 에칭된 기재이다(Illumina, Inc., 샌디에이고, 캘리포니아).
일부 예에서, 기재는 플로우 셀의 적어도 일부를 형성하거나, 플로우 셀에 위치되거나 그에 커플링된다. 플로우 셀은 복수의 레인 또는 복수의 섹터로 분할되는 유동 챔버를 포함할 수 있다. 본 명세서에 제시된 방법 및 시스템에 사용될 수 있는 플로우 셀의 제조를 위한 예시적인 플로우 셀 및 기재는 Illumina, inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구매가능한 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "복수"는 둘 이상의 상이한 부재의 집단을 의미하도록 의도된다. 복수는 작은, 중간, 큰, 매우 큰 크기의 범위일 수 있다. 작은 복수의 크기는, 예를 들어, 수 개의 부재 내지 수십 개의 부재의 범위일 수 있다. 중간 크기의 복수는, 예를 들어, 수십 개의 부재 내지 약 100개의 부재 또는 수백 개의 부재의 범위일 수 있다. 큰 복수는, 예를 들어, 약 수백 개의 부재 내지 약 1000개의 부재, 수천 개의 부재 및 최대 수만 개의 부재의 범위일 수 있다. 매우 큰 복수는, 예를 들어, 수만 개의 부재 내지 약 수십만, 백만, 수백만, 수천만 및 최대 수억을 초과하는 부재의 범위일 수 있다. 따라서, 복수는 구성원의 수에 의해 측정되는 바와 같이, 위의 예의 범위 사이 및 그보다 큰 모든 크기와 같이, 2개부터 1억 개의 구성원을 훨씬 넘는 크기의 범위일 수 있 수 있다. 예시적인 폴리뉴클레오티드 복수는 예를 들어 약 1×105개 이상, 5×105개 이상 또는 1×106개 이상의 상이한 폴리뉴클레오티드의 집단을 포함한다. 따라서, 이러한 용어의 정의는 2를 초과하는 모든 정수 값을 포함하도록 의도된다. 복수의 상한은, 예를 들어, 샘플 내 폴리뉴클레오티드 서열의 이론적 다양성에 의해 설정될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 상이한 용어는 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 크기, 서열 또는 다른 특성의 임의의 특정 차이를 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 설명의 명확성을 위해, 여러 폴리뉴클레오티드 종을 포함하는 특정 방법 또는 조성물을 설명할 때 하나의 폴리뉴클레오티드 종을 다른 것으로부터 구별하기 위해 용어가 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "서열분석 시스템"은 폴리뉴클레오티드의 서열을 결정하도록 구성된 시스템을 지칭한다. 다양한 서열분석 시스템이 구매가능하다. 예시적으로, 서열분석 시스템은 Illumina, inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구매가능한 iSEQ™ 100 서열분석 시스템일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. iSEQ™ 100 서열분석 시스템은 상이한 서열분석 시약을 저장하는 저장소를 포함하는 미리충전된 카트리지를 사용하여 합성에 의한 서열분석을 수행하는 벤치탑(benchtop) 시스템이다. 서열분석 시스템의 다른 비제한적인 예는 Illumina, inc.로부터 구매가능한 cBot 2, NovaSeq 6000, 및 MiniSeq 시스템뿐만 아니라 다른 공급원으로부터의 서열분석 시스템을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "압타머"는 표적에 대해 선택적인 올리고뉴클레오티드를 야기하는 3차 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로 의도되는 한편, "압타머 후보"는 잠재적으로 표적에 대해 선택적일 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로 의도된다. 표적에 대해 "선택적"이라는 것은 그 표적에 커플링되고 다른 표적에는 커플링되지 않는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 이와 같이, 주어진 복수의 압타머 후보 중에서, 하나 이상의 압타머 후보는 잠재적으로 주어진 표적에 대해 선택적일 수 있고, 따라서 그러한 표적에 대한 압타머일 수 있다. 그러나, 임의의 주어진 복수의 압타머 후보가 주어진 표적에 대한 압타머를 반드시 포함할 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 압타머 후보는 (선택성을 나타내는) 표적에 압타머 후보를 커플링시키는 것 및 압타머 후보를 서열분석하는 것을 포함하는 작업을 사용하여 표적에 대해 선택적인 압타머로서 식별될 수 있다. 압타머 후보의 앰플리콘은, 그러한 앰플리콘이 압타머 후보의 카피이든 상보적인 카피인든, 그 자체로 압타머 후보일 수 있다. 압타머의 앰플리콘은 그 자체가 압타머일 수 있는데, 예를 들어, 여기서 앰플리콘은 (압타머의 상보적 카피와는 대조적으로 - 상보적 카피는 압타머 후보일 수 있지만 반드시 압타머일 필요는 없음) 압타머의 카피이다. 압타머는 임의의 적합한 유형의 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, DNA, RNA, 및/또는 본 명세서의 다른 곳에서 예시된 바와 같은 핵산 유사체를 포함할 수 있다. 압타머는 상호작용의 임의의 적절한 조합을 통해, 예를 들어 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 및 3차 구조의 형성의 임의의 적합한 조합을 통해, 표적에 커플링될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "표적"은 압타머를 선택하기에 바람직한 화학적 요소를 의미하는 것으로 의도된다. 표적은 뉴클레오티드가 아닌 화학적 실체를 포함할 수 있다. 예시적인 표적은 단백질 표적이다. 단백질은 일정 구조로 접혀 있는 일련의 폴리펩티드를 포함한다. 다른 예시적인 표적은 대사물 표적이다. 대사물 표적은 대사 동안 형성되거나 사용되는 화학적 요소이다. 추가의 예시적인 표적은 탄수화물, 지방산, 당(예컨대, 글루코스), 아미노산, 뉴클레오시드, 신경전달 물질, 인지질 및 중금속을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 본 개시내용에서, 분석물은 질환 상태 분석, 대사 건강 분석, 미생물군집 분석, 약물 상호작용 분석, 약물 반응 분석, 독성 분석, 또는 감염성 질환 분석과 같은 임의의 적합한 응용(들)의 맥락에서 표적에 대해 선택될 수 있다. 예시적으로, 대사물은 질환에 반응하여 상향조절되거나 하향조절되는 화학적 요소를 포함할 수 있다. 표적의 비제한적인 예는 키나제, 세린 하이드롤라제, 메탈로프로테아제, 질환-특이적 바이오마커, 예컨대 특정 질환에 대한 항원, 및 글루코스를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "3차 구조"를 갖는 올리고뉴클레오티드는 접힌 부분을 제자리에 유지하는 내부 가교결합을 갖는 3차원 3차 구조로 접히는 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로 의도된다. 이에 비해, 1차 구조(예를 들어, 함께 결합된 핵산의 특정 서열) 및 2차 구조(예를 들어, 국소 구조)를 갖지만, 접힌 부분을 제자리에 유지하는 내부 가교결합은 갖지 않는 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에서 사용되는 용어인 3차 구조를 갖는 것으로 간주되지 않을 수 있다. 압타머의 3차 구조는 압타머가 표적에 커플링될 때 변할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 요소가 "상이하다"는 것은 요소들 중 하나가 요소들을 서로 구별가능하게 하는 다른 요소에 대해 적어도 하나의 변형을 갖는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 서로 상이한 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 핵산에 의해 서로에 대해 다른 핵산 서열을 가질 수 있다. 다른 예로서, 서로 상이한 단백질들은 적어도 하나의 펩티드에 의해 서로에 대해 다른 펩티드 서열들을 가질 수 있다. 다른 예로서, 대사물들은 적어도 하나의 화학기에 의해 서로에 대해 다를 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같이, 상이한 압타머는 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 상이한 표적에 대해 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형광단"은 제1 파장과 상이한 제2 파장의 광으로 여기에 반응하는 제1 파장의 광을 방출하는 분자를 의미하는 것으로 의도된다. 형광단에 의해 방출되는 광은 "형광"으로 지칭될 수 있고 적합한 광학 검출 회로에 의해 검출될 수 있다.
형광은 임의의 적합한 광학 검출 회로를 사용하여 검출될 수 있으며, 이는 형광단으로부터 수신된 광에 기반하여 전기 신호를 생성하기 위한 광학 검출기 및 전기 신호를 사용하여 광이 형광단으로부터 수신되었음을 결정하기 위한 전자 회로를 포함할 수 있다. 하나의 예로서, 광학 검출기는 광 검출기에 의해 수신된 광에 기반하여 전기 신호를 생성하도록 구성된 증폭된 광 검출기의 어레이를 포함하는 능동 픽셀 센서(APS: active-pixel sensor)를 포함할 수 있다. APS는 당업계에 알려진 상보적 금속 산화물 반도체(CMOS) 기술을 기반으로 할 수 있다. CMOS 기반 검출기는 전계 효과 트랜지스터(FET), 예를 들어 금속 산화물 반도체 전계 효과 트랜지스터(MOSFET)를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 단일 광자 애벌런치 다이오드(CMOS-SPAD)를 갖는 CMOS 이미저가 예를 들어 형광 수명 이미징(FLIM)을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 광학 검출기는 포토다이오드, 예컨대 애벌런치 포토다이오드, 전하 커플링 소자(CCD), 극저온 광자 검출기, 역 바이어스 발광 다이오드(LED), 포토레지스터, 포토트랜지스터, 광전지, 광전자 증배관(PMT), 양자점 광전도체 또는 포토다이오드 등을 포함할 수 있다. 광학 검출 회로는 광학 검출기와 작동 가능하게 통신하는 하드웨어 및 소프트웨어의 임의의 적절한 조합을 추가로 포함하여 광학 검출기로부터의 전기 신호를 수신할 수 있고, 이러한 신호에 기반하여, 예를 들어 광학 검출기가 형광단으로부터 광을 검출하는 것을 기반으로 형광을 검출하도록 구성된다. 예를 들어, 전자 회로는 메모리 및 메모리에 커플링된 프로세서를 포함할 수 있다. 메모리는 프로세서가 광학 검출기로부터의 신호를 수신하고 이러한 신호를 사용하여 형광단을 검출하게 하기 위한 명령을 저장할 수 있다. 예를 들어, 명령은 광학 검출기로부터의 신호를 사용하여 프로세서가 광학 검출기의 시야 내에서 형광이 방출된다는 것을 결정하고 이러한 결정을 사용하여 형광단이 존재한다고 결정하게 할 수 있다. 기재는 광학 검출 회로를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하는 데 사용되는 하나 이상의 웰이 배치될 수 있는 광학 검출기를 포함할 수 있다.
서열분석을 사용한 압타머의 선택
상기에서 언급되고 하기에 더 자세히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 장치 및 방법은 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하는 데 사용될 수 있다. 압타머 선택 및 압타머 서열분석 둘 모두가 수행되는 복수의 웰 각각 내에 표적이 커플링될 수 있다. 복수의 압타머 후보(예를 들어, SELEX 압타머 라이브러리)는 표적을 압타머 후보와 접촉시키기 위해 웰에 도입될 수 있고, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보가 표적에 커플링되는 한편, 나머지 압타머 후보는 표적에 커플링되지 않은 상태로 남아서 세척될 수 있다. 표적에 커플링된 압타머 후보는 증폭될 수 있고, 표적에 대해 선택적인 압타머(들)를 식별하기 위해 웰에서 서열분석될 수 있다.
예를 들어, 도 1a 내지 도 1i는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하기 위한 공정 흐름에 사용되는 예시적인 장치 및 동작을 개략적으로 도시한다. 도 1a에 도시된 장치(100)는 복수의 저장소를 포함하는 기재(110)를 포함할 수 있다. 도 1a에 도시된 비제한적인 예에서, 저장소는 서로서로로서 공통되고 일체형으로 형성된 기재(110) 내에 제공되는 웰(121, 122, 123, 124)을 포함할 수 있다. 그러나, 웰(121, 122, 123, 124) 중 하나 이상 및 실제로는 웰(121, 122, 123, 124) 모두는 서로 물리적으로 분리될 수 있고 서로서로로서 공통 기재에 형성될 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 임의의 적합한 크기 및 배열의 웰이 임의의 적합한 수로 제공될 수 있다. 예를 들어, 기재(110)는 수천, 수만, 수십만, 또는 심지어 수백만 개의 웰을 포함할 수 있다. 웰(121, 122, 123, 124) 각각은 도 1h 및 도 1i를 참조하여 아래에서 추가로 설명되는 바와 같은 방식으로 후보 압타머를 증폭하고 서열분석하는 데 사용될 수 있는 제1 및 제2 포획 프라이머(111, 112) 각각을 복수 개로 포함할 수 있다. 장치(100)는, 예를 들어, 도 1i를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머를 식별하기 위해 웰 내에서 임의의 압타머 후보를 서열분석하기 위한 검출 회로(190)를 추가로 포함할 수 있다. 웰(121, 122, 123, 124)은 검출 회로(190) 상에 배치될 수 있거나 그에 달리 커플링될 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 검출 회로(190)는 CMOS 광학 검출기를 포함하고, 웰(121, 122, 123, 124)은 유체가 병렬로 통하여 유동될 수 있는 플로우 셀을 포함하고, CMOS는 플로우 셀 내에서 올리고뉴클레오티드의 서열분석 동안 형광을 검출한다.
예시적으로, 장치(100)는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하기 위한 서열분석 시스템에 사용하기 위한 것일 수 있다. 예시적으로, 서열분석 시스템은 Illumina, inc.(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 구매가능한 iSEQ™ 100 서열분석 시스템일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. iSEQ™ 100 서열분석 시스템은, 도 1a 및 도 1b에 도시된 장치(100)와 유사한 방식으로, 상이한 서열분석 시약을 저장하는 저장소를 포함하는 미리충전된 카트리지를 사용하여 합성에 의한 서열분석을 수행하는 벤치탑 시스템이다. 그러나, 장치(100)는 Illumina, inc.로부터 구매가능한 cBot 2, NovaSeq 6000, 또는 MiniSeq 시스템과 같은 임의의 다른 서열분석 시스템, 또는 다른 공급원으로부터의 서열분석 시스템을 함께 사용하도록 적합하게 적응될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
압타머를 찾아내기에 바람직할 수 있는 표적이 웰(121, 122, 123, 124) 각각 내에 커플링될 수 있다. 표적의 비제한적인 예는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다. 표적은 임의의 적합한 결합을 통해, 예를 들어 도 2a 내지 도 2f를 참조하여 아래에서 추가로 설명되는 바와 같은 방식으로 포획 프라이머를 통해 직접 커플링될 수 있다. 대안적으로, 표적은 서로 상호작용하는 모이어티들을 통해 간접적으로 커플링될 수 있다. 예를 들어, 도 1a에 도시된 바와 같은 방식으로, 제1 모이어티(130)는 웰(121, 122, 123, 124) 각각 내에, 예를 들어 임의의 적합한 결합을 통해, 커플링될 수 있다. 웰(121, 122, 123, 124)은 복수의 분자(140)를 포함하는 유체와 접촉될 수 있으며, 분자 각각은 임의로 절단가능한 임의의 적합한 결합을 통해 서로 커플링된 제2 모이어티(150)와 표적(160)을 포함할 수 있다. 제1 모이어티(130)와 웰(121, 122, 123, 124) 사이, 그리고 제2 모이어티(150)와 표적(160) 사이의 각각의 결합은 NTA-His-태그, Spytag-Spycatcher, 상보적 올리고뉴클레오티드에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화, 구리(I)-촉매된 클릭 반응, 또는 변형-촉진된 아지드-알킨 고리화첨가와 같은 임의의 적합한 상호작용을 통해 형성될 수 있다. 임의의 적합한 수의 이러한 결합은, 프로테이나제를 사용하여 절단될 수 있는 단백질 또는 8-옥소-G와 같은 절단가능한 모이어티를 포함할 수 있으며, 이는 아래에서 더 자세히 설명되는 바와 같은 방식으로 기재로부터 하나 이상의 요소를 디커플링하는 데 사용될 수 있습니다.
도 1b에 도시된 바와 같은 방식으로, 제2 모이어티(150)는 웰(121, 122, 123, 124) 각각 내에 표적(160)을 커플링시키기 위해 제1 모이어티(130)에 커플링될 수 있다. 서로 공유적으로 또는 비공유적으로 상호작용하는 임의의 적합한 모이어티들은 제1 및 제2 모이어티(130, 150)에 대해 제공될 수 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 제1 모이어티(130)는 스트렙타비딘을 포함하고 제2 모이어티(150)는 비오틴을 포함한다. 다른 비제한적인 예에서, 제1 모이어티(130)는 비오틴을 포함하고, 제2 모이어티(150)는 스트렙타비딘을 포함한다. 대안적으로, 표적(160)은, 선택적으로 8-옥소-G와 같은 절단가능한 모이어티 또는 프로테이나제를 사용하여 절단될 수 있는 단백질을 포함하는, NTA-His-태그, Spytag-Spycatcher, 상보적 올리고뉴클레오티드에 대한 올리고뉴클레오티드의 혼성화, 구리(I)-촉매된 클릭 반응, 또는 변형-촉진된 아지드-알킨 고리화첨가와 같은 임의의 적합한 상호작용을 통해 웰(121, 122, 123, 124) 각각 내에 커플링될 수 있다. 단순화를 위해, 단일 제1 모이어티(130), 단일 제2 모이어티(150), 및 단일 표적(160)이 웰 각각 내에 있는 것으로 도시되어 있지만, 임의의 적합한 수의 제1 및 제2 모이어티 및 표적이 웰 각각 내에 커플링될 수 있고, 각각의 웰은 동일한 수 또는 상이한 수의 모이어티 또는 표적을 가질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 도 1b에 도시된 바와 같은 예에서, 포획 프라이머(111, 112)는 표적(160)과는 별개로 웰(121, 122, 123, 124)에 커플링될 수 있다.
도 1c에 도시된 바와 같은 방식으로, 시스템(100)은, 복수의 압타머 후보(171, 172, 173, 174)를 포함하고 웰(121, 122, 123, 124) 각각과 접촉하는 유체를 포함할 수 있다. 압타머 후보(171, 172, 173, 174) 각각은 어댑터(들)(181, 182)를 포함할 수 있는데, 어댑터(들)를 통해 그러한 압타머 후보는 도 1h를 참조하여 아래에서 설명되는 바와 같은 방식으로 증폭을 위해 포획 프라이머(111 또는 112)에 각각 커플링될 수 있다. 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보는 표적(160)에 커플링된다. 예를 들어, 도 1d에 도시된 바와 같이, 압타머 후보(174)가 웰(124) 내에서 표적(160)에 커플링되는 한편, 압타머 후보(171, 172, 173)는 웰(121, 122, 123) 내에서 표적(160)에 커플링되지 않은 상태로 남아 있고 도 1e에 도시된 바와 같은 방식으로, 예를 들어, 웰(121, 122, 123, 124)을 통해 완충액을 유동시킴으로써, 제거될 수 있다. 일부 예에서, 표적(160)에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보는 표적에 커플링될 때 변경되는 3차 구조를 가질 수 있다. 도 1d에 의해 제시된 바와 같이, 압타머 후보(171, 172, 173, 174) 중 적어도 일부는 압타머 후보가 표적(160)에 대해 선택적일 때 그 표적에 커플링될 수 있는 단일 가닥 루프 및 단일 가닥 줄기를 포함하는 헤어핀 구조를 포함할 수 있다.
표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘이 생성될 수 있다. 예를 들어, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘을 생성하는 것은 표적으로부터 압타머 후보를 디커플링하는 것 및 압타머 후보를 사용하여 앰플리콘을 생성하기 위해 PCR을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1e에 도시된 압타머 후보(174)는 표적(160)으로부터 디커플링될 수 있고, 그러한 압타머 후보의 앰플리콘을 생성하기 위해 PCR이 수행될 수 있다. 압타머 후보(174)와 표적(160) 사이의 이러한 디커플링은, 염 농도 또는 pH가 압타머의 3차 구조에 또는 압타머-표적 계면을 안정화시키는 힘에 불리하게 되는 열 또는 완충액 교환과 같은, 표적과 압타머 사이의 상호작용을 방해하는 임의의 적합한 반응 조건(들)을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 예에서, 장치(100)는 PCR을 수행하기 위해 웰(121, 122, 123, 124)과 구별되는 증폭 챔버를 포함할 수 있다. 이어서, 도 1f에 도시된 바와 같은 방식으로, 웰(121, 122, 123, 124) 각각 내의 표적(160)은 압타머 후보(174)의 앰플리콘(174)을 포함하는 유체와 접촉된다. 앰플리콘(174) 및 압타머 후보(174)는 이들이 동등한 구조이기 때문에 본 명세서에서 동일한 도면 번호를 사용하여 지칭된다는 점에 유의한다; 예를 들어, 앰플리콘(174)은 또한 표적 160에 대한 압타머 후보이고, 압타머 후보(174)와 유사하게 표적에 커플링될 것으로 예상된다. 도 1d를 참조하여 설명되는 것과 유사한 방식으로, 예를 들어, 복수의 앰플리콘(174)이 각각의 표적(160)에 커플링되는 도 1g에 도시된 바와 같이, 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘(174)이 표적에 커플링된다. 그러나, 압타머 후보를 표적으로부터 디커플링하고 그 압타머 후보를 사용하여 앰플리콘을 생성하기 위해 PCR을 사용하는 추가 작업은 생략될 수 있다는 것에 유의한다.
이어서, 압타머 후보(174)(그의 임의의 앰플리콘을 포함함)를 서열분석하는 데 장치(100)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적(160)에 커플링되지 않은 압타머 후보를 제거한 후 표적(150)에 커플링된 상태로 남아 있는 임의의 압타머 후보가 서열분석될 수 있다. 도 1g에 도시된 압타머 후보(174)(그의 임의의 앰플리콘을 포함함)는 도 1e를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로 표적(160)으로부터 디커플링될 수 있고, 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘의 추가 앰플리콘을 생성하는 것을 포함하여 압타머 후보(174)의 앰플리콘을 생성하는 데 클러스터 증폭이 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 1a를 참조하여 상기에 언급된 바와 같이, 포획 프라이머(111, 112)는 웰(121, 122, 123, 124) 내에 배치될 수 있다. 포획 프라이머(111) 및 포획 프라이머(112)는 서로 직교일 수 있으며, 예를 들어, 포획 프라이머(111)는 P5 프라이머를 포함할 수 있고 포획 프라이머(112)는 P7 프라이머를 포함할 수 있다. 포획 프라이머(111, 112)는 표적(160)에 커플링되지 않은 임의의 압타머 후보(및 앰플리콘)가 제거된 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보(그의 임의의 앰플리콘을 포함함)(174)에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 도 1a를 참조하여 상기에 언급된 바와 같이, 압타머 후보(171, 172, 173, 174)는 어댑터(들)(181, 182)를 포함할 수 있는데, 어댑터(들)를 통해 그러한 압타머 후보는 증폭을 위해 포획 프라이머(111 또는 112)에 각각 커플링될 수 있다.
도 1i에 도시된 바와 같은 방식으로, 압타머 후보(174)(또는 그의 앰플리콘)의 어댑터(181)는 포획 프라이머(111)에 커플링될 수 있고, 압타머 후보의 어댑터(182)는 포획 프라이머(112)에 커플링될 수 있다. 브리지 증폭, 또는 다른 적합한 표면-기반 증폭 공정은 도 1i에 도시된 바와 같은 방식으로 압타머 후보(또는 앰플리콘)(174)의 앰플리콘(174, 174')의 클러스터를 생성하는 데 사용될 수 있다. 제2 모이어티(150) 및 표적(160)은 단순화를 위해 도 1i에서 생략되고, 웰에 남아 있을 수 있거나, 예를 들어, 모이어티(130)에 표적(160)을 결박하는 링커 또는 표면에 대해 모이어티(130)를 절단하는 링커를 절단함으로써 제거될 수 있다는 점에 유의한다. 검출 회로(190)는, 예를 들어 당업계에 공지된 방식으로 합성에 의한 서열분석을 사용하여, 포획 프라이머에 커플링된 앰플리콘(174, 174')을 서열분석하기 위한 것일 수 있다. 예시적으로, 폴리머라제는 각각의 앰플리콘(174, 174')의 서열에 기초하여 표지된 (예를 들어, 형광 표지된) 뉴클레오티드를 사용하여 프라이머(111 또는 112)를 연장시키는 데 사용될 수 있고, 검출 회로(190)는 이러한 뉴클레오티드의 표지에 의해 생성된 신호를 사용하여 이러한 뉴클레오티드가 첨가된 서열을 식별할 수 있다. 서열분석된 압타머 후보(또는 그의 앰플리콘(174))는 표적(160)에 대한 압타머로 간주될 수 있는데, 예를 들어, 이는 이러한 압타머 후보가 다중 작업을 통해 표적(160)에 커플링되어 표적에 대한 선택성을 나타내기 때문이다.
도 1a를 참조하여 상기에 언급된 바와 같이, 압타머 선택 공정에 대한 표적은 포획 프라이머를 사용하는 것과 같은 임의의 적합한 방식으로 웰 내에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 도 2a 내지 도 2f는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하기 위한 대안적인 공정 흐름에 사용되는 예시적인 장치 및 동작을 개략적으로 도시한다. 도 2a에 도시된 예에서, 제1 모이어티는 포획 프라이머에 의해 웰 각각 내에 커플링되고, 예를 들어, 제1 모이어티(230)가 포획 프라이머(211)를 통해 기재(210)에 커플링되는 한편, 제1 모이어티(230')는 포획 프라이머(212)를 통해 기재(210)에 커플링된다. 포획 프라이머(211) 및 포획 프라이머(212)는 서로 직교일 수 있으며, 예를 들어, 포획 프라이머(211)는 P5 프라이머를 포함할 수 있고 포획 프라이머(212)는 P7 프라이머를 포함할 수 있다. 제1 모이어티(230, 230')는 도 1a를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로 제2 모이어티(150) 및 표적(160)을 포함하는 분자(140)를 포함하는 유체와 접촉될 수 있다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 제2 모이어티(150)가 (예를 들어, 구체적으로 도시되지 않은 웰 내에서) 포획 프라이머(211)를 통해 표적 분자(160)를 기재(210)에 커플링시키기 위해 제1 모이어티(230)에 커플링될 수 있는 한편, 다른 제2 모이어티(150)는 (예를 들어, 구체적으로 도시되지 않은 동일한 웰 또는 다른 웰 내에서) 포획 프라이머(212)를 통해 표적분자(160)를 기재(210)에 커플링시키기 위해 제1 모이어티(230')에 커플링될 수 있다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 표적(160)에 대해 선택적인 압타머 후보(또는 그의 앰플리콘)(174)는, 예를 들어 도 1d 및 도 1g를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로, 표적에 커플링될 수 있다. 도 2d에 도시된 바와 같이, 압타머 후보(174)는 도 1e를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로 증폭을 위해 표적(160)으로부터 디커플링될 수 있다.
일부 예에서, 제1 모이어티(230, 230')는 포획 프라이머(211, 212)로부터 분리가능할 수 있다. 이와 같이, 도 2e에 도시된 바와 같은 방식으로, 제1 모이어티(230, 230'), 제2 모이어티(150), 및 표적(160)은 제1 모이어티(230, 230')를 그의 각각의 포획 프라이머(211, 212)로부터 분리함으로써 기재(210)로부터 디커플링될 수 있다. 예시적으로, 포획 프라이머(211, 212)는, 서열분석을 수행하기 전에, 제1 모이어티(230, 230'), 및 그에 커플링된 임의의 요소를 분리하기 위해 절단될 수 있는 8-옥소-G와 같은 절단가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2f에 도시된 바와 같이, 압타머 후보(174) 및 그의 앰플리콘(174')의 어댑터(181, 181')는 각각의 포획 프라이머(211)에 혼성화될 수 있고, 압타머 후보 및 그의 앰플리콘의 어댑터(182, 182')는 도 1h 및 도 1i를 참조하여 설명되는 바와 같이 증폭 및 서열분석을 위해 각각의 포획 프라이머(212)에 혼성화될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용 전반에 걸쳐 제공되는 바와 같은 예에서, 표적(160), 링커(들), 제1 모이어티, 및 제2 모이어티 중 임의의 적합한 것은 분해될 수 있고 따라서, 프로테이나제를 사용하여, 기재 및/또는 포획 프라이머로부터 디커플링되는 단백질을 포함할 수 있다.
표적이 접촉되는 압타머 후보는 임의의 적합한 서열 및 성분을 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 도 3은 도 1a 내지 도 1i 또는 도 2a 내지 도 2f를 참조하여 설명되는 바와 같은 장치 또는 공정 흐름에 사용하기 위한 예시적인 압타머 후보를 개략적으로 도시한다. 도 3에 도시된 비제한적인 예에서, 압타머 후보(171, 172, 173, 174) 각각은 잠재적으로 표적에 대해 선택적일 수 있는 올리고뉴클레오티드 하위서열(영역)(171", 172", 173", 174")뿐만 아니라, 올리고뉴클레오티드 하위서열에 커플링된 어댑터(181, 182)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 하위서열(171", 172", 173", 174")은 서로 상이할 수 있다. 각각의 어댑터(181)는 선택적인 스페이서(300), 포획 프라이머(111)에 상보적인 포획 프라이머 어댑터(311), 및 압타머 후보의 PCR 증폭을, 적절한 경우에 그리고 이러한 작업이 공정 흐름에 포함되는 경우에, 수행하는 데 사용될 수 있는 선택적 PCR 어댑터(320)를 포함할 수 있다. 유사하게, 각각의 어댑터(182)는 선택적인 스페이서(300), 포획 프라이머(112)에 상보적인 포획 프라이머 어댑터(312), 및 압타머 후보의 PCR 증폭을, 적절한 경우에 그리고 이러한 작업이 공정 흐름에 포함되는 경우에, 수행하는 데 사용될 수 있는 선택적 PCR 어댑터(320)를 포함할 수 있다. 스페이서(300)는 포획 프라이머 어댑터(311)가 올리고뉴클레오티드 하위서열이 표적(160)에 적절하게 커플링되는 것을 억제하지 않을 수 있도록 올리고뉴클레오티드 하위서열(171", 172", 173", 174")과 포획 프라이머 어댑터(311 또는 312) 사이에 적절한 거리를 제공할 수 있다. 예시적으로, 스페이서(300)는 5개 이상의 뉴클레오티드, 10개 이상의 뉴클레오티드, 또는 15개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
임의의 적합한 시스템, 방법 및 조성물이 본 교시에 기초하여 압타머를 선택하는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 도 4는 서열분석을 사용하여 압타머를 선택하기 위한 공정 흐름에서의 예시적인 동작을 개략적으로 도시한다. 도 4에 도시된 방법(400)은 기재 내에 배치된 복수의 웰의 각각의 웰 내에 표적을 커플링시키는 단계(동작(410))를 포함한다. 예를 들어, 도 1a를 참조하여 설명되는 표적(160)은, 예를 들어, 도 2a를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로 포획 프라이머와 같은 적합한 링커를 통해, 각각의 웰 내에서 기재에 직접 커플링될 수 있다. 또는, 예를 들어, 표적(160)은 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로, 기재에 커플링된 제1 모이어티 및 표적에 커플링되고 제1 모이어티에 커플링되는 제2 모이어티를 통해 각각의 웰 내에서 기재에 간접적으로 커플링될 수 있다. 도 4에 도시된 방법(400)은 또한 웰 각각을 복수의 압타머 후보를 포함하는 유체와 접촉시키는 단계(동작(420))를 포함한다. 예를 들어, 웰은 도 1c를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로 압타머 라이브러리(171, 172, 173, 174)와 접촉될 수 있거나, 도 1f를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로 압타머(174)의 앰플리콘과 접촉될 수 있다. 도 4에 도시된 방법(400)은 웰의 적어도 하나 내에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보를 표적에 커플링시키는 단계(동작(430))를 포함한다. 예를 들어, 압타머 후보(174)(또는 그의 임의의 앰플리콘)는 도 1d, 도 1g, 또는 도 2c를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로 표적(160)에 커플링될 수 있다. 도 4에 도시된 방법(400)은 표적에 커플링되지 않은 임의의 압타머 후보를 제거하는 단계(동작(440))를 포함한다. 예를 들어, 도 1e를 참조하여 설명되는 바와 같은 방식으로, 압타머 후보(171, 172, 173)가 웰을 통해 완충액을 유동시킴으로써 제거될 수 있는 한편, 압타머 후보(174)는 그러한 유동에도 불구하고 표적(160)에 커플링된 채로 유지된다. 도 4에 도시된 방법(400)은, 웰 내에서, 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머를 식별하기 위해 제거하는 단계 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보를 서열분석하는 단계(동작(450))를 포함한다. 예를 들어, 압타머 후보(174)(또는 그의 앰플리콘)의 앰플리콘이 생성될 수 있고, 이러한 앰플리콘은 서열분석될 수 있다.
추가 주석
본 명세서에서 설명되는 바와 같은 본 개시의 태양 각각의 임의의 각각의 특징부/예는 본 명세서에서 설명된 바와 같은 결과를 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 함께 구현될 수 있고, 이러한 태양들 중 임의의 하나 이상으로부터의 임의의 특징부/예는 여기에서 설명된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 임의의 조합으로 본 명세서에서 설명된 바와 같은 다른 태양(들)의 임의의 특징부와 함께 구현될 수 있음을 이해할 것이다.
다양한 예시적인 예가 위에서 설명되어 있지만, 본 발명을 벗어나지 않고 다양한 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 속하는 이러한 모든 변경 및 수정을 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ILLUMINA, INC. <120> SELECTING APTAMERS USING SEQUENCING <130> IP-2055-PCT <140> WO PCT/US2021/063835 <141> 2021-12-16 <150> US 63/128,669 <151> 2020-12-21 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 Primer - Paired read <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga gauctacac 29 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 Primer - Paired read <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n = G or 8-oxoguanine <400> 2 caagcagaag acggcatacg anat 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 Primer - Single read <400> 3 aatgatacgg cgaccaccga 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P7 Primer - Single read <400> 4 caagcagaag acggcatacg a 21

Claims (42)

  1. 복수의 압타머 후보로부터 압타머를 선택하는 방법으로서,
    기재 내에 배치된 복수의 웰의 각각의 웰 내에 표적을 커플링시키는 단계;
    복수의 압타머 후보를 포함하는 유체와 상기 웰 각각을 접촉시키는 단계;
    상기 웰의 적어도 하나 내에서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보를 상기 표적에 커플링시키는 단계;
    상기 표적에 커플링되지 않은 임의의 압타머 후보를 제거하는 단계; 및
    상기 웰 내에서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머를 식별하기 위해 상기 제거하는 단계 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보를 서열분석하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복수의 웰의 각각의 웰 내에 상기 표적을 커플링시키는 단계는,
    상기 웰 각각 내에 제1 모이어티(moiety)를 커플링시키는 단계;
    상기 표적의 각각에 복수의 제2 모이어티를 커플링시키는 단계; 및
    상기 웰 각각 내에서 상기 제2 모이어티를 상기 제1 모이어티에 커플링시키는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 모이어티는 스트렙타비딘을 포함하고, 상기 제2 모이어티는 비오틴을 포함하는, 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 제1 모이어티는 포획 프라이머에 의해 상기 웰 각각 내에 커플링되는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 서열분석을 수행하기 전에 상기 포획 프라이머로부터 상기 제1 모이어티를 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재는 상기 제거하는 단계 후에 남아 있는 상기 압타머 후보를 서열분석하는 데 사용되는 검출 회로를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 웰은 플로우 셀을 포함하고, 상기 플로우 셀을 통해 상기 유체가 병렬로 유동되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보는 상기 표적에 커플링될 때 변경되는 3차 구조를 갖는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘을 생성하는 단계는,
    상기 표적으로부터 그러한 압타머 후보를 디커플링시키는 단계; 및
    그러한 압타머 후보를 사용하여 상기 앰플리콘을 생성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 사용하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 PCR은 상기 웰과 구별되는 증폭 챔버에서 수행되는, 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 앰플리콘을 포함하는 유체와 상기 웰 각각을 접촉시키는 단계;
    상기 웰 각각 내에서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘을 상기 표적에 커플링시키는 단계; 및
    상기 표적에 커플링되지 않은 임의의 앰플리콘을 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 서열분석된 임의의 압타머 후보는 상기 표적에 커플링되지 않은 임의의 앰플리콘을 제거하는 단계 후에 남아 있는 임의의 앰플리콘을 포함하는, 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘의 추가 앰플리콘을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 압타머 후보를 서열분석하는 단계는,
    상기 제거하는 단계 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보를 상기 웰 내에 배치된 포획 프라이머에 커플링시키는 단계;
    상기 포획 프라이머에 커플링된 앰플리콘을 생성하기 위해 상기 웰 내에서 증폭을 수행하는 단계; 및
    상기 포획 프라이머에 커플링된 상기 앰플리콘을 서열분석하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 표적은 상기 포획 프라이머의 각각을 통해 상기 웰 내에 커플링되는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 포획 프라이머는 상기 웰 내에서 제1 모이어티를 커플링시키고, 제2 모이어티가 상기 웰 내에서 상기 제1 모이어티 및 상기 표적에 커플링되는, 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 포획 프라이머는 상기 표적과 별개로 상기 웰에 커플링되는, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압타머 후보 각각은 각각의 포획 프라이머에 상보적인 제1 및 제2 어댑터를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 압타머 후보 각각은 상기 제1 어댑터와 상기 표적에 대해 선택적일 후보인 영역 사이에 배치된 제1 스페이서, 및 상기 제2 어댑터와 상기 표적에 대해 선택적일 후보인 상기 영역 사이에 배치된 제2 스페이서를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압타머 후보 각각은 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  22. 복수의 압타머 후보로부터 압타머를 선택하기 위한 시스템으로서,
    복수의 웰을 포함하는 기재;
    상기 웰 각각 내에 커플링된 표적;
    복수의 압타머 후보를 포함하고 상기 웰 각각과 접촉하는 유체 - 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보는 상기 표적에 커플링됨 -; 및
    상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머를 식별하기 위해 상기 웰 내에서 임의의 압타머 후보를 서열분석하기 위한 검출 회로를 포함하는, 시스템.
  23. 제22항에 있어서,
    제1 모이어티가 상기 웰 각각 내에 커플링되고;
    복수의 제2 모이어티가 상기 표적의 각각에 커플링되고;
    상기 제2 모이어티는 상기 웰 각각 내에서 상기 제1 모이어티에 커플링되어 상기 웰 각각 내에 상기 표적을 커플링시키는, 시스템.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제1 모이어티는 스트렙타비딘을 포함하고, 상기 제2 모이어티는 비오틴을 포함하는, 시스템.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 제1 모이어티는 포획 프라이머에 의해 상기 웰 각각 내에 커플링되는, 시스템.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제1 모이어티는 상기 포획 프라이머로부터 분리가능한, 시스템.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 웰은 상기 검출 회로 상에 배치되는, 시스템.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수의 웰은 플로우 셀을 포함하고, 상기 플로우 셀을 통해 상기 유체가 병렬로 유동되는, 시스템.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보는 상기 표적에 커플링될 때 변경되는 3차 구조를 갖는, 시스템.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 앰플리콘이 생성되는, 시스템.
  31. 제30항에 있어서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 압타머 후보의 상기 앰플리콘은,
    상기 표적으로부터 그러한 압타머 후보를 디커플링시키는 단계; 및
    그러한 압타머 후보를 사용하여 상기 앰플리콘을 생성하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 단계를 포함하는 단계를 사용하여 생성되는, 시스템.
  32. 제31항에 있어서, 상기 PCR을 수행하기 위해 상기 웰과 구별되는 증폭 챔버를 포함하는, 시스템.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 앰플리콘을 포함하고 상기 웰 각각과 접촉하는 유체를 추가로 포함하고, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘은 상기 표적에 커플링되는, 시스템.
  34. 제33항에 있어서, 서열분석된 임의의 압타머 후보는 상기 표적에 커플링되지 않은 임의의 앰플리콘을 제거한 후에 남아 있는 임의의 앰플리콘을 포함하는, 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 상기 표적에 대해 선택적인 임의의 앰플리콘의 추가 앰플리콘을 추가로 포함하는, 시스템.
  36. 제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 웰 내에 배치되고, 상기 제거 후에 남아 있는 임의의 압타머 후보에 커플링된 포획 프라이머; 및
    상기 포획 프라이머에 커플링된 상기 압타머 후보의 앰플리콘을 추가로 포함하고,
    상기 검출 회로는 상기 포획 프라이머에 커플링된 상기 앰플리콘을 서열분석하기 위한 것인, 시스템.
  37. 제36항에 있어서, 상기 표적은 상기 포획 프라이머의 각각을 통해 상기 웰 내에 커플링되는, 시스템.
  38. 제37항에 있어서, 상기 포획 프라이머는 상기 웰 내에서 제1 모이어티를 커플링시키고, 제2 모이어티가 상기 웰 내에서 상기 제1 모이어티 및 상기 표적에 커플링되는, 시스템.
  39. 제36항에 있어서, 상기 포획 프라이머는 상기 표적과 별개로 상기 웰에 커플링되는, 시스템.
  40. 제36항에 있어서, 상기 압타머 후보 각각은 각각의 포획 프라이머에 상보적인 제1 및 제2 어댑터를 포함하는, 시스템.
  41. 제40항에 있어서, 상기 압타머 후보 각각은 상기 제1 어댑터와 상기 표적에 대해 선택적일 후보인 영역 사이에 배치된 제1 스페이서, 및 상기 제2 어댑터와 상기 표적에 대해 선택적일 후보인 상기 영역 사이에 배치된 제2 스페이서를 추가로 포함하는, 시스템.
  42. 제22항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압타머 후보 각각은 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 시스템.
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