JP2024500260A - 修飾捕捉プライマーを使用して標的ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅するための組成物及び方法 - Google Patents
修飾捕捉プライマーを使用して標的ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅するための組成物及び方法 Download PDFInfo
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Abstract
基材の表面で標的ポリヌクレオチドを捕捉するための組成物が提供される。組成物は、基材の表面に結合された、修飾核酸を含む複数の捕捉プライマーと、基材の表面に結合された、修飾核酸を含む複数の直交捕捉プライマーと、を含み得る。捕捉プライマーの修飾核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含み得る。直交捕捉プライマーの修飾核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含み得る。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１２月２１日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ」と題された米国特許仮出願第６３／１２８，６７５号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年１２月２１日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ」と題された米国特許仮出願第６３／１２８，６７５号の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＩＰ－２０５４－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは４，１７４バイトである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。当該ＡＳＣＩＩコピーは、ＩＰ－２０５４－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは４，１７４バイトである。
本出願は、クラスタ増幅に関する。
クラスタ増幅は、例えば、遺伝子シークエンシングにおける使用を意図する、ポリヌクレオチドを増幅するためのアプローチである。標的ポリヌクレオチドは、フローセル内の基材表面に結合されたプライマー（例えば、Ｐ５及びＰ７捕捉プライマー）によって捕捉され、表面上のランダムな場所に「シード」（seed）を形成する。増幅サイクルを実行して、各シードの周囲の表面上にクラスタを形成する。クラスタは、シードポリヌクレオチドのコピー及び相補コピー（一緒に「アンプリコン」と称され得る）を含む。例えば、図１は、基材上でのポリヌクレオチドの増幅を概略的に示す。基材領域１０１上の単一シード１１１の捕捉及び増幅は、シード１１１のアンプリコンで基材領域を実質的に充填し得、また合成ごとのシークエンシング（sequencing-by-synthesis）、又はＳＢＳに容易に使用され得るモノクローナルクラスタ１２１をもたらし得る（破線及び点線の円は、経時的なクラスタの拡大を表すことを意図するものである）。いくつかの状況では、基材は、それぞれのクラスタで充填され得るウェルなどの異なるクラスタに結合した領域を画定するようパターン化される。
本明細書で提供される例は、修飾捕捉プライマーを使用して標的ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅することに関する。かかる捕捉及び増幅を実施するための組成物及び方法が開示される。
いくつかの例では、基材の表面で標的ポリヌクレオチドを捕捉するための組成物が本明細書で提供される。組成物は、基材の表面に結合された複数の捕捉プライマーを含み得る。各捕捉プライマーは、修飾核酸を含み得る。組成物はまた、基材の表面に結合された複数の直交捕捉プライマーも含み得る。各直交捕捉プライマーは、修飾核酸を含み得る。
いくつかの例では、捕捉プライマーの修飾核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含む。いくつかの例では、捕捉プライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含む。いくつかの例では、修飾核酸及びＤＮＡは、捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布されている。いくつかの例では、修飾核酸は、捕捉プライマーの５’末端に配置されており、ＤＮＡは、捕捉プライマーの３’末端に配置されている。
いくつかの例では、直交捕捉プライマーの修飾核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含む。いくつかの例では、直交捕捉プライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含む。いくつかの例では、修飾核酸及びＤＮＡは、捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布されている。いくつかの例では、修飾核酸は、直交捕捉プライマーの５’末端に配置されており、ＤＮＡは、直交捕捉プライマーの３’末端に配置されている。
いくつかの例では、組成物は、第１の標的ポリヌクレオチドであって、捕捉プライマーに相補的である第１のアダプター、及び直交捕捉プライマーに相補的である第２のアダプターを各々含む、第１の標的ポリヌクレオチドを更に含む。組成物は、第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれに相補的である第２の標的ポリヌクレオチドを更に含み得る。
いくつかの例では、第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの第１のアダプターは、捕捉プライマーのそれぞれにハイブリダイズして第１の二本鎖を形成し、第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの第２のアダプターは、直交捕捉プライマーのうちのそれぞれにハイブリダイズして、第２の二本鎖を形成する。いくつかの例では、第１及び第２の二本鎖は各々、第２の標的ポリヌクレオチドの、第２の標的ポリヌクレオチドと相補的である第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれへのハイブリダイゼーションによって形成される第３の二本鎖のＴｍよりも大きい融解温度（melting temperature、Ｔｍ）を有する。いくつかの例では、第１及び第２の二本鎖は各々、約８０℃～約１１０℃であるＴｍを有する。いくつかの例では、第１及び第２の二本鎖は各々、約８５℃～約１０５℃であるＴｍを有する。いくつかの例では、第１及び第２の二本鎖は各々、約９０℃～約１００℃であるＴｍを有する。
いくつかの例では、第２の標的ポリヌクレオチドのうちの実質的にいずれも、第１の標的ポリヌクレオチドのいずれに対しても溶液中でハイブリダイズしない。
いくつかの例では、組成物は、約１％～約１００％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）、又は約５％～約８０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）を更に含む。
いくつかの例では、組成物は、約１００～約８００ｍＭのＮａ＋、又は約２００～約８００ｍＭのＮａ＋を更に含む。
いくつかの例では、捕捉プライマーは、修飾Ｐ５捕捉プライマーであり、直交捕捉プライマーは、修飾Ｐ７捕捉プライマーである。
いくつかの例では、捕捉プライマーの各々は、約５～約２０個の修飾核酸を含み、直交捕捉プライマーの各々は、約５～約２０個の修飾核酸を含む。
いくつかの例では、捕捉プライマーの各々は、少なくとも約９個の修飾核酸を含み、直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約９個の修飾核酸を含むか、又は捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１２個の修飾核酸を含み、直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１２個の修飾核酸を含むか、又は捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１５個の修飾核酸を含み、直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１５個の修飾核酸を含む。
いくつかの例では、基材の表面で標的ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅するための方法が本明細書で提供される。この方法は、組成物を流体と接触させることを含み得る。組成物は、基材の表面に結合された複数の捕捉プライマーであって、捕捉プライマーの各々が修飾核酸を含む、捕捉プライマーと、基材の表面に結合された複数の直交捕捉プライマーであって、直交捕捉プライマーの各々が修飾核酸を含む、直交捕捉プライマーと、を含み得る。流体は、第１の標的ポリヌクレオチドであって、捕捉プライマーに相補的である第１のアダプター、及び直交捕捉プライマーに相補的である第２のアダプターを各々含む、第１の標的ポリヌクレオチドと、第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれに相補的である第２の標的ポリヌクレオチドと、を含み得る。この方法は、流体における第２の標的ポリヌクレオチドの第１の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを阻害しながら、第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの第１のアダプターを、捕捉プライマーのうちのそれぞれにハイブリダイズさせて、第１の二本鎖を形成することと、第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの第２のアダプターを、直交捕捉プライマーのそれぞれにハイブリダイズさせて、第２の二本鎖を形成することと、次いで、第１の標的ポリヌクレオチドを増幅することであって、増幅することが、第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれのアンプリコンを生成することを含む、増幅することと、を含み得る。
いくつかの例では、捕捉プライマーの修飾核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含む。いくつかの例では、捕捉プライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含む。いくつかの例では、修飾核酸及びＤＮＡは、捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布されている。いくつかの例では、修飾核酸は、捕捉プライマーの５’末端に配置されており、ＤＮＡは、捕捉プライマーの３’末端に配置されている。
いくつかの例では、直交捕捉プライマーの修飾核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含む。いくつかの例では、直交捕捉プライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含む。いくつかの例では、修飾核酸及びＤＮＡは、捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布されている。いくつかの例では、修飾核酸は、直交捕捉プライマーの５’末端に配置されており、ＤＮＡは、直交捕捉プライマーの３’末端に配置されている。
いくつかの例では、第１及び第２の二本鎖は各々、第２の標的ポリヌクレオチドの、第２の標的ポリヌクレオチドと相補的である第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれへのハイブリダイゼーションによって形成される第３の二本鎖のＴｍよりも大きい融解温度（Ｔｍ）を有する。いくつかの例では、第１及び第２の二本鎖は各々、約８０℃～約１１０℃であるＴｍを有する。いくつかの例では、第１及び第２の二本鎖は各々、約８５℃～約１０５℃であるＴｍを有する。いくつかの例では、第１及び第２の二本鎖は各々、約９０℃～約１００℃であるＴｍを有する。
いくつかの例では、第２の標的ポリヌクレオチドのうちの実質的にいずれも、第１の標的ポリヌクレオチドのいずれに対しても溶液中でハイブリダイズしない。
いくつかの例では、ハイブリダイズは、約１％～約１００％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）、又は約５％～約８０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）において実施される。
いくつかの例では、ハイブリダイズは、約１００～約８００ｍＭのＮａ＋、又は約２００～約８００ｍＭのＮａ＋において実施される。
いくつかの例では、捕捉プライマーは、修飾Ｐ５捕捉プライマーであり、直交捕捉プライマーは、修飾Ｐ７捕捉プライマーである。
いくつかの例では、捕捉プライマーの各々は、約５～約２０個の修飾核酸を含み、直交捕捉プライマーの各々は、約５～約２０個の修飾核酸を含む。いくつかの例では、捕捉プライマーの各々は、少なくとも約９個の修飾核酸を含み、直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約９個の修飾核酸を含み、又は前記捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１２個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１２個の前記修飾核酸を含むか、又は捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１５個の修飾核酸を含み、直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１５個の修飾核酸を含む。
本明細書に記載されるような本開示の態様の各々の任意の対応する特徴／実施例は、適切な組み合わせで共に実施されてもよいことを理解されたい。また、これらの態様のうちの任意の１つ以上からの任意の特徴／実施例は、本明細書に記載されるような利点を得るために、任意の適切な組み合わせで本明細書に記載されるような他の態様の特徴のいずれかと共に実施されてもよいことを理解されたい。
本明細書で提供される実施例は、修飾捕捉プライマーを使用してポリヌクレオチドを捕捉及び増幅することに関する。かかる捕捉及び増幅を実施するための組成物及び方法が開示される。
本明細書で提供される修飾捕捉プライマーは、従来既知の捕捉プライマーよりも協力に標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、そのため、標的ポリヌクレオチドが基材上に捕捉される効率を高めることができる。例示的には、より強い結合のため、従来既知の捕捉プライマーと比較して、より低い濃度の標的ポリヌクレオチドを使用しても基材上にクラスタを調製することができる。例えば、図２Ａ～図２Ｃを参照して以下に更に記載される様式における、従来既知のプライマーを使用するポリヌクレオチドの捕捉及び増幅が実施される条件下では、表面でのハイブリダイゼーション及び溶液ベースのアニーリングが、競合プロセスとして作用するため、捕捉又は増幅のために利用できないいくつかのポリヌクレオチドが生じてしまう。それに比較し、図３Ａ～３Ｈ、４、５Ａ～５Ｃ、及び６を参照して説明される本発明の方法では、本発明の捕捉プライマーは、競合プロセスとしての溶液ベースのアニーリングを低減又は阻害する条件下で実施されることを可能にし、そのため、捕捉及び増幅のためのポリヌクレオチドの有効性を実質的に増加させ、標的ポリヌクレオチドのより高い濃度の使用により、従来既知の捕捉プライマーと比較し基材上でのクラスタの調製を可能にし、また全体のシード時間を低減することが可能となる。
最初に、本明細書で使用されるいくつかの用語を簡単に説明する。次いで、本捕捉プライマーを使用してポリヌクレオチドを捕捉及び増幅するためのいくつかの例示的な組成物及び例示的な方法を記載する。
用語
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。「含む（including）」という用語、並びに他の形態、例えば、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含まれる（included）」の使用は、限定的ではない。更に、「有する（having）」という用語、並びに他の形態、例えば、「有する（have）」、「有する（has）」、及び「有した（had）」の使用は、限定的ではない。本明細書で使用されるとき、移行句又は請求項の本文において、「含む（comprise）」及び「含む（comprising）」という用語は、オープンエンドの意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、語句「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」と同義であると解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈において使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、又はデバイスの文脈で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、化合物、組成物、又はデバイスが少なくとも列挙された特徴又は構成要素を含むが、追加の特徴又は構成要素も含み得ることを意味する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。「含む（including）」という用語、並びに他の形態、例えば、「含む（include）」、「含む（includes）」、及び「含まれる（included）」の使用は、限定的ではない。更に、「有する（having）」という用語、並びに他の形態、例えば、「有する（have）」、「有する（has）」、及び「有した（had）」の使用は、限定的ではない。本明細書で使用されるとき、移行句又は請求項の本文において、「含む（comprise）」及び「含む（comprising）」という用語は、オープンエンドの意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、語句「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」と同義であると解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈において使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、又はデバイスの文脈で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、化合物、組成物、又はデバイスが少なくとも列挙された特徴又は構成要素を含むが、追加の特徴又は構成要素も含み得ることを意味する。
本明細書全体を通して使用される「実質的に」、「およそ（approximately）」、及び「約」という用語は、処理のばらつきなどに起因する小さな変動を説明及び考慮するために使用されている。例えば、それらは、±５％以下など、±２％以下など、±１％以下など、±０．５％以下など、±０．２％以下など、±０．１％以下など、±０．０５％以下などの、±１０％以下を指し得る。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズ」は、それらのポリヌクレオチドの長さに沿って第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドに非共有結合させて、二重の鎖となった「二本鎖」を形成することを意図する。例えば、２つのＤＮＡポリヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対合を介して会合し得る。第１及び第２のポリヌクレオチド間の会合の強度は、それらのポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列間の相補性と共に増加する。ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの強度は、二本鎖の５０％のポリヌクレオチド鎖が分離する融解温度（Ｔｍ）によって特徴付けられ得る。互いに「部分的に」ハイブリダイズしたポリヌクレオチドは、それらが互いに相補的な配列を有するが、かかる配列が、それらの長さの一部のみに沿って互いにハイブリダイズして部分二本鎖を形成することを意味する。ハイブリダイズすることが「できない」ポリヌクレオチドは、互いにハイブリダイズするように互いに接触し得る塩基の数が不十分な状態で、互いに物理的に分離されたものを含む。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、糖部分と、少なくとも１つのリン酸基を含む骨格成分と、及びいくつかの例では核酸塩基と、を含む分子を意味することを意図する。核酸塩基を欠くヌクレオチドは、「脱塩基」と称され得る。ヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、修飾ペプチドヌクレオチド、修飾ホスフェート骨格ヌクレオチド、及びそれらの混合物が含まれる。ヌクレオチドの例としては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、ウリジンリン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、デオキシアデノシンモノホスファート（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシサイミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシンモノホスファート（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジンモノホスファート（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）及びデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語はまた、任意の「ヌクレオチド類似体」を包含することが意図され、すなわち、天然に存在するヌクレオチドと比較して、修飾核酸塩基、糖部分、及び／又は骨格成分（ホスフェート又はアミドなど）を含むヌクレオチドのタイプを指すことも意図される。ヌクレオチド類似体はまた、「修飾核酸」と称され得る。例示的な修飾核酸塩基としては、イノシン、キサチアニン、ヒポキサチアニン、イソシトシン、イソグアニン、２－アミノプリン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、２－プロピルグアニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、１５－ハロウラシル、１５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル、４－チオウラシル、８－ハロゲンアデニン若しくはグアニン、８－アミノアデニン若しくはグアニン、８－チオールアデニン若しくはグアニン、８－チオアルキルアデニン若しくはグアニン、８－ヒドロキシルアデニン若しくはグアニン、５－ハロゲン置換ウラシル若しくはシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン等が挙げられる。当技術分野で知られているように、特定のヌクレオチド類似体、例えば、アデノシン５’－ホスホ硫酸塩などのヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチドに組み込まれることができない。ヌクレオチドの骨格成分は、任意の好適な数のホスフェート、例えば、３、４、５、６、又は６個を超えるホスフェートを含み得る。ヌクレオチド類似体には、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び５－ヒドロキシルブチニル－２’－デオキシウリジン（「スーパーＴ」）も含まれる。ＬＮＡは、リボース部分が２’酸素及び４’炭素を連結する追加の架橋を含むＲＮＡ様骨格を含む。ＰＮＡは、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位と、メチレン架橋及びカルボニル基を介して骨格に結合された核酸塩基と、を含む骨格を含む。スーパーＴは、５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン核酸塩基を含む。ＬＮＡ、ＰＮＡ、及びスーパーＴの例示的な構造を以下に示す。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、互いに結合したヌクレオチドの配列を含む分子を指す。ポリヌクレオチドは、ポリマーの非限定的な一例である。ポリヌクレオチドの例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、並びにロック核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）などの、それらの類似体が挙げられる。ポリヌクレオチドには、ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡなどのヌクレオチドの一本鎖配列や、二本鎖ＤＮＡなどのヌクレオチドの二本鎖配列や、又はヌクレオチドの一本鎖及び二本鎖配列の混合物が含まれ得る。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）には、ゲノムＤＮＡ並びにＰＣＲ及び増幅による産物が含まれる。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は、ｄｓＤＮＡに変換され得、逆もまた同様である。ポリヌクレオチドには、エナンチオマーＤＮＡ、ＬＮＡ、又はＰＮＡなどの非自然発生ＤＮＡが含まれ得る。ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの正確な配列は、既知であっても未知であってもよい。以下は、ポリヌクレオチドの例である：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、発現配列タグ（ＥＳＴ）、又は遺伝子発現（ＳＡＧＥ）タグの連続分析）、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離されたＤＮＡ、あらゆる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、前述のいずれかのプライマー又は増幅されたコピー。ポリヌクレオチドは、ＰＮＡ及びＲＮＡの、ＤＮＡ及びＲＮＡの、ＤＮＡ及びＰＮＡの、隣接するセクションなどの異なる種類のポリヌクレオチドの隣接セクションを含む「キメラ」構造を有し得る。
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに重合することによってポリヌクレオチドを組み立てる活性部位を有する酵素を意味することを意図している。ポリメラーゼは、プライミングされた一本鎖標的ポリヌクレオチドに結合し、ヌクレオチドをプライマーに連続的に付加して成長させ、標的ポリヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する「相補的コピー」ポリヌクレオチドを形成することができる。次いで、別のポリメラーゼ、又は同じポリメラーゼは、その相補的コピーポリヌクレオチドの相補的コピーを形成することによって、標的ヌクレオチドのコピーを形成することができる。かかるコピーのいずれも、本明細書では「アンプリコン」と称され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに結合し、次いで、標的ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド鎖の３’末端の遊離ヒドロキシル基に連続的に付加して成長させ（アンプリコン成長）つつ、標的ポリヌクレオチドを下流へ移動することができる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡ分子を合成し得、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型（転写）からＲＮＡ分子を合成し得る。ポリメラーゼは、短いＲＮＡ又はＤＮＡ鎖（プライマー）を使用して、鎖成長を開始し得る。いくつかのポリメラーゼは、それらが鎖に塩基を付加する部位の上流の鎖を置換し得る。かかるポリメラーゼは、鎖置換であるとも言われ得、これは、ポリメラーゼによって読み取られる鋳型鎖から相補鎖を除去する活性を有すると言われ得る。鎖置換活性を有する例示的なポリメラーゼには、Ｂｓｔ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus））ポリメラーゼの大断片、ｅｘｏ－Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ、又はシークエンシンググレードのＴ７ ｅｘｏ－ポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。いくつかのポリメラーゼは、それらの前の鎖を切断し、それを成長する鎖に効果的に置き換える（５’エキソヌクレアーゼ活性）。いくつかのポリメラーゼは、それらの後ろの鎖を分解する活性を有する（３’エキソヌクレアーゼ活性）。いくつかの有用なポリメラーゼは、３’及び／又は５’エキソヌクレアーゼ活性を低減又は排除するために変異又は他の方法で修飾されている。
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、ヌクレオチドが遊離３’ＯＨ基を介して付加され得るポリヌクレオチドとして定義される。プライマーは、ブロックが除去されるまで重合を防止する３’ブロックを含み得る。プライマーは、カップリング反応を可能にするか、又はプライマーを別の部分に結合することを可能にするための、５’末端の修飾を含み得る。プライマーは、例えば、ＵＶ光、化学物質、酵素などの適切な条件下で切断され得る、８－オキソ－Ｇなどの１つ以上の部分を含み得る。プライマーの長さは、任意の適切な数の塩基の長さであり得、天然及び／又は非天然ヌクレオチドの適切な組み合わせを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、プライマーにハイブリダイズする（それに相補的な配列を有する）「アダプター」を含み得、プライマーの遊離３’ＯＨ基にヌクレオチドを付加することによって相補的コピーポリヌクレオチドを生成するよう増幅され得る。「捕捉プライマー」は、基材に結合し、標的ポリヌクレオチドの第１のアダプターにハイブリダイズし得るプライマーを意味することが意図され、「直交捕捉プライマー」は、基材に結合し、その標的ポリヌクレオチドの第２のアダプターにハイブリダイズし得るプライマーを意味することが意図される。第１のアダプターは、捕捉プライマーの配列と相補的な配列を有し得、第２のアダプターは、直交捕捉プライマーのものと相補的な配列を有し得る。捕捉プライマー及び直交捕捉プライマーは、互いに異なる独立した配列を有し得る。追加的に、捕捉プライマー及び直交捕捉プライマーは、少なくとも１つの他の特性において互いに異なり得る。例えば、捕捉プライマー及び直交捕捉プライマーは、互いに異なる長さを有し得、該捕捉プライマー又は該直交捕捉プライマーのいずれかは、該捕捉プライマー又は該直交捕捉プライマーラックの他方が有さない非核酸部分（ブロッキング基又は除去部分など）を含み得、又はかかる特性の任意の好適な組み合わせを含み得る。「修飾捕捉プライマー」は、ＬＮＡ、ＰＮＡ、又はスーパーＴなどの複数の核酸類似体を含む捕捉プライマー、又は直交捕捉プライマーである。修飾捕捉プライマーは、ＤＮＡなどであるがこれらに限定されない複数の天然に存在する核酸を更に含み得る。
本明細書で使用される場合、「基材」という用語は、本明細書に記載の組成物の担体として使用される材料を指す。例示的な基材材料としては、ガラス、シリカ、プラスチック、石英、金属、金属酸化物、有機ケイ酸塩（例えば、多面体有機シルセスキオキサン（ＰＯＳＳ））、ポリアクリレート、酸化タンタル、相補金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）、又はそれらの組み合わせが挙げられ得る。ＰＯＳＳの一例は、Ｋｅｈａｇｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８６（２００９），ｐｐ．７７６－７７８に記載されているものであり得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、本出願で使用される基材としては、ガラス、縮合シリカ、又は他のシリカ含有材料などのシリカ系基材が挙げられる。いくつかの例では、基材は、シリコン、窒化ケイ素、又は水素化シリコーンを含み得る。いくつかの例では、本出願で使用される基材には、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、及びポリ（メチルメタクリレート）などのプラスチック材料又は成分が含まれる。例示的なプラスチック材料としては、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリスチレン、及び環状オレフィンポリマー基材が挙げられる。いくつかの例では、基材は、シリカ系材料又はプラスチック材料又はそれらの組み合わせであるか、又はそれらを含む。特定の例では、基材は、ガラス又はシリコン系ポリマーを含む少なくとも１つの表面を有する。いくつかの例では、基材は金属を含み得る。いくつかのかかる例では、金属は金である。いくつかの例では、基材は、金属酸化物を含む少なくとも１つの表面を有する。一例では、表面は、酸化タンタル又は酸化スズを含む。アクリルアミド、エノン、又はアクリレートはまた、基材材料又は成分として利用され得る。他の基材材料としては、ガリウムヒ素、インジウムホスフィド、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、石英、樹脂、ポリマー、石英、樹脂、ポリマー及びコポリマーが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの例では、基材及び／又は基材表面は、石英であり得るか、又は石英を含み得る。いくつかの他の例では、基材及び／又は基材表面は、ＧａＡｓ又はＩＴＯなどの半導体であり得るか、又はそれを含み得る。前述のリストは、本出願において例示することを意図しているが、限定するものではない。基材は、単一の材料又は複数の異なる材料を含み得る。基材は、複合材又は積層体であり得る。いくつかの例では、基材は、有機シリケート材料を含む。基材は、平坦、円形、球形、棒状、又は任意の他の好適な形状であり得る。基材は、剛性又は可撓性であり得る。いくつかの例では、基材はビーズ又はフローセルである。
いくつかの例では、表面はパターン化された表面である。「パターン化された表面」は、基材の露出層内又はその上における、異なる領域の配置を指す。例えば、１つ以上の領域は、１つ以上の捕捉プライマーが存在する特徴であり得る。この特徴は、捕捉プライマーが存在しない間隙領域によって分離され得る。いくつかの例では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの例では、パターンは、特徴及び／又は間隙領域の反復配列であり得る。いくつかの例では、パターンは、特徴及び／又は間隙領域のランダム配列であり得る。いくつかの例では、基材は、表面にウェル（窪み）のアレイを含む。ウェルは、実質的に垂直な側壁によって提供され得る。ウェルは、フォトリソグラフィ、スタンピング技術、成形技術、及びマイクロエッチング技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して、当該技術分野において一般的に知られているように製造することができる。当該技術分野において理解されるように、使用される技術は、アレイ基板の組成及び形状に依存する。
基材のパターン付き表面内の特徴としては、パターン化された、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）などの共有結合性のゲルが、ガラス、シリコン、プラスチック、又は他の適切な材料の上にアレイ状に並んだウェルなどが挙げられ得る。このプロセスは、シークエンシングのために使用されるゲルパッドを作成し、これは、多数のサイクルでシークエンシング操作にわたって安定であり得る。ポリマーをウェルに共有結合することは、様々な用途の間に、構造化基材の寿命全体にわたってゲルを構造化特徴部に維持するのに有用であり得る。しかしながら、多くの例では、ゲルは、ウェルに共有結合される必要はない。例えば、いくつかの条件では、構造化基材のどの部分にも共有結合されていないシランフリーのアクリルアミド（ＳＦＡ）をゲル材料として使用することができる。
特定の別の実施形態では、構造化基材は、ウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）を用いて適切な材料をパターニングし、パターニングされた材料をゲル材料（例えば、ＰＡＺＡＭ、ＳＦＡ、又はその化学修飾された変異体、例えばＳＦＡのアジド化型（アジド－ＳＦＡ）など）でコーティングし、ゲルでコーティングされた材料を、例えば化学的研磨又は機械的研磨によって研磨することによって作製することができ、それによって、ウェル内にゲルが保持されるが、ウェル間の構造化基材の表面の間隙領域からは、実質的に全てのゲルを除去されるか又は不活性化される。プライマーは、ゲル材料に結合され得る。次いで、標的ポリヌクレオチド（例えば、断片化されたヒトゲノム又はその一部）の溶液を、個々の標的ヌクレオチドがゲル材料に付着したプライマーとの相互作用を介して個々のウェルにシードされるように、研磨された基材と接触させ得るが、標的ポリヌクレオチドは、ゲル材料が存在しないか又はそれが不活性であるため、間隙領域を占有しない。標的ポリヌクレオチドの増幅は、間隙領域内のゲルの不在又は不活性により、クラスタの外向きの移動を防止するため、ウェル内に限局され得る。このプロセスは、簡便な製造が可能であり、スケーラブルであり、また従来のマイクロ又はナノ製造方法を利用するものである。
パターン化された基材としては、例えば、スライド又はチップにエッチングされたウェルが挙げられ得る。ウェルのエッチング及び幾何学形状のパターンは、様々な異なる形状及びサイズとすることができ、かかる特徴は、互いに物理的又は機能的に分離可能であり得る。かかる構造的特徴を有する特に有用な基材としては、ミクロスフェアなどの、固体粒子のサイズを選択し得るパターン化基材が挙げられる。これらの特性を有する例示的なパターン化された基材は、ＢＥＡＤアレイ技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）に関連して使用されるエッチングされた基材である。
いくつかの例では、本明細書に記載の基材は、フローセルの少なくとも一部を形成するか、又はフローセル内に位置するか、又はフローセルに結合される。フローセルは、複数のレーン又は複数のセクターに分割された流動チャンバーを含み得る。本明細書に記載の方法及び組成物で使用され得るフローセルの製造のためのフローセル及び基材の例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「直接」という用語は、基材の表面を覆う層に関して使用される場合、層が、例えば、接着層又はポリマー層などの有意な中間層なしで基材の表面を覆うことを意味することを意図する。表面を直接覆う層は、共有結合又は非共有結合などの任意の化学的又は物理的相互作用を通してこの表面に付着させることができる。
本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、「固定化された」という用語は、共有結合又は非共有結合を介した基材への直接的又は間接的な付着を意味することが意図される。特定の例では、共有結合を使用してもよく、又は、基材を使用することが意図される条件下、例えばポリヌクレオチドの増幅又はシークエンシングでポリヌクレオチドが静止したままであるか、又は基材に付着する任意の他の好適な結合を使用し得る。捕捉プライマーとして、又は標的ポリヌクレオチドとして使用されるポリヌクレオチドは、酵素による伸長のために３’末端が利用可能であり、配列の少なくとも一部が相補的配列にハイブリダイズすることができるよう、固定化され得る。固定化は、表面付着オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを介して起こり得、その場合、固定化オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、３’～５’の向きであり得る。代替的に、固定化は、共有結合などの塩基対合ハイブリダイゼーション以外の手段によって生じ得る。例示的には、化学リンカーを介して、化学的官能基を、本発明の捕捉プライマーの１つの５’末端に組み込み得る。捕捉プライマー上の化学的官能基は、１つ以上の非共有結合相互作用（例えば、静電、金属－配位子の結合、ハイブリダイゼーションなど）又は共有結合相互作用（例えば、銅クリック化学反応、銅フリークリック化学反応など）の任意の好適な組み合わせを介して基材表面に結合させることができる。
本明細書で使用するとき、「アレイ」という用語とは、相対的な位置に従って互いに区別することができる基材領域の集団を指す。アレイの異なる領域にある異なる分子（ポリヌクレオチドなど）は、アレイ内の領域の位置に従って互いに区別することができる。アレイの個々の領域は、特定の種類の１つ以上の分子を含み得る。例えば、基材領域は、特定の配列を有する単一の標的ポリヌクレオチドを含み得るか、又は基材領域は、同じ配列（又はその相補的配列）を有するいくつかのポリヌクレオチドを含み得る。アレイの領域は、同じ基材上で互いに異なる特徴を含み得る。例示的な特徴としては、基材中のウェル、基材中又は基材上のビーズ（又は他の粒子）、基材からの突出部、基材上の隆起部、又は基材内のチャネルが挙げられるが、これらに限定されない。アレイの領域は、互いに異なる基材上の異なる領域をそれぞれ含み得る。別個の基材に付着した異なる分子は、基材が会合する表面上の基材の位置に従って、又は液体若しくはゲル内の基材の位置に従って特定され得る。別個の基材が表面上に配置される例示的なアレイとしては、ウェル内にビーズを有するものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用するとき、「複数の」という用語は、２つ以上の異なるメンバーの集団を意味することを意図する。複数とは、小さい、中程度、大きい、から非常に大きいサイズの範囲であり得る。小さいサイズの複数とは、例えば、数メンバー～数十メンバーの範囲であり得る。中程度のサイズの複数とは、例えば、数十メンバー～約１００メンバー又は数百メンバーの範囲であり得る。大きい複数とは、例えば、約数百メンバー～約１０００メンバー、数千メンバー、及び数万メンバーの範囲であり得る。非常に大きな複数とは、例えば、数万メンバー～約数十万、数百万、数千万、又は数億以上のメンバーの範囲であり得る。したがって、複数は、２～１億以上にわたるサイズでもあり、並びに、上記の例示的な範囲の間の、及びそれ以上のメンバーの数として測定される全てのサイズの範囲であり得る。例示的なポリヌクレオチド複合体には、例えば、約１×１０５以上、５×１０５以上、又は１×１０６又はそれ以上の異なるポリヌクレオチドの集団が含まれる。したがって、この用語の定義は、２より大きい全ての整数値を含むことが意図される。複数値の上限は、例えば、試料中のポリヌクレオチド配列の理論的多様性によって設定され得る。
本明細書で使用される場合、「二本鎖」という用語は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが、相補的ポリヌクレオチド中のそれぞれのヌクレオチドに水素結合していることを意味することが意図される。「部分的に」二本鎖のポリヌクレオチドは、その少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％のヌクレオチドであって、その全てよりも少ないヌクレオチドが、相補的ポリヌクレオチド中のヌクレオチドに水素結合している。
本明細書で使用される場合、「一本鎖」という用語は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドのいずれも、相補的ポリヌクレオチド中のそれぞれのヌクレオチドに水素結合していないことを意味する。別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが「できない」ポリヌクレオチドは、一本鎖であり得る。
本明細書で使用される場合、「標的ポリヌクレオチド」という用語は、分析又は作用の目的となるポリヌクレオチドを意味することが意図され、「ライブラリポリヌクレオチド」、「鋳型ポリヌクレオチド」、又は「ライブラリテンプレート」と称され得る。分析又は作用としては、ポリヌクレオチドを捕捉、増幅、シークエンシング、及び／又は他の手順に供することが挙げられる。標的ポリヌクレオチドは、分析される標的配列に追加されるヌクレオチド配列を含み得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、プライマー結合部位として機能するアダプターなどの１つ以上のアダプターを含み得、そのフランクの部分が、分析される標的ポリヌクレオチド配列である。捕捉プライマーにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの全てが伸長に適さないように、捕捉オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端を超えて延在するヌクレオチドを含み得る。特定の例では、複数の標的ポリヌクレオチドは、互いに異なる配列を有し得るが、互いに同じである第１及び第２のアダプターを有し得る。特定の標的ポリヌクレオチド配列に隣接し得る２つのアダプターは、互いに同じ配列、又は互いに相補的配列を有し得るか、又は２つのアダプターは、異なる配列を有し得る。したがって、複数の標的ポリヌクレオチド中の種は、例えば、シークエンシング（例えば、ＳＢＳ）によって評価される未知の配列領域が隣接した、既知の配列領域を含み得る。いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、単一の末端でアダプターを担持し、かかるアダプターは、標的ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端のいずれかに位置し得る。標的ポリヌクレオチドは、アダプターなしで使用され得、その場合、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドに存在する配列を直接用い得る。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書においては交換可能に使用される。用語の違いは、特に明記しない限り、サイズ、配列、又は他の特性の任意の特定の違いを示すことを意図するものではない。説明を明確にするために、いくつかのポリヌクレオチド種を含む特定の方法又は組成物を説明する際に、１つの種のポリヌクレオチドを別の種と区別するために用語を使い分けてもよい。
本明細書で使用するとき、「アンプリコン」という用語は、核酸に関して使用する場合、核酸の複製による生成物を意味し、この生成物は、核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と実質的に同じ又は相補的なヌクレオチド配列を有する。「増幅」及び「増幅すること」は、ポリヌクレオチドのアンプリコンを作製するプロセスを指す。標的ポリヌクレオチドの第１のアンプリコンは、典型的には相補的なコピーであり得る。更なるアンプリコンは、第１のアンプリコンの生成後に、標的ポリヌクレオチド又は第１のアンプリコンから作成されたコピーである。後続のアンプリコンは、標的ポリヌクレオチドと実質的に相補的であるか、又は標的ポリヌクレオチドと実質的に同一である配列を有し得る。ポリヌクレオチドの（例えば、増幅アーチファクトによる）少数の変異は、そのポリヌクレオチドのアンプリコンを生成するときに起こり得ることが理解されるであろう。
実質的に所与のポリヌクレオチドのアンプリコンのみを含む基材領域は、「モノクローナル」と称され得るが、互いに異なる配列を有するポリヌクレオチドのアンプリコンを含む基材領域は、「ポリクローナル」と称され得る。基材のポリクローナル領域は、それぞれモノクローナルである異なるサブ領域を含み得る。かかるモノクローナル領域は各々、より大きなポリクローナル領域内又はそれ自体であるかにかかわらず、「シード」から生成された「クラスタ」に対応し得る。「シード」は、単一の標的ポリヌクレオチドを指し得るが、「クラスタ」は、その標的ポリヌクレオチドのアンプリコンの集合体を指し得る。
ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅するための組成物及び方法
本明細書で提供される例は、修飾された捕捉プライマーが溶液から標的ポリヌクレオチドを捕捉することを可能にしながら、アニーリングを低減又は阻害する溶液ベースの条件下で使用され得る修飾捕捉プライマーを使用して、標的ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅する組成物及び方法に関する。比較すると、従来既知の捕捉プライマーは、溶液ベースのアニーリングが溶液からの標的ポリヌクレオチドの捕捉と競合する条件下で使用され得、かかる競合は、捕捉のための標的ポリヌクレオチドの利用可能性を低減する。
本明細書で提供される例は、修飾された捕捉プライマーが溶液から標的ポリヌクレオチドを捕捉することを可能にしながら、アニーリングを低減又は阻害する溶液ベースの条件下で使用され得る修飾捕捉プライマーを使用して、標的ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅する組成物及び方法に関する。比較すると、従来既知の捕捉プライマーは、溶液ベースのアニーリングが溶液からの標的ポリヌクレオチドの捕捉と競合する条件下で使用され得、かかる競合は、捕捉のための標的ポリヌクレオチドの利用可能性を低減する。
例えば、図２Ａ～図２Ｃは、従来既知の捕捉プライマーを使用して基材上のポリヌクレオチドを捕捉するためのプロセスフローにおける組成物及び操作を概略的に示す。図２Ａに示される組成物２０００は、捕捉プライマー２３１及びそれに結合された直交捕捉プライマー２３２を含む基材２００、並びに、標的ポリヌクレオチド、例えば、捕捉、増幅、及び合成によるシークエンシング（sequencing-by-synthesis、ＳＢＳ）を用いたシークエンシングを意図したポリヌクレオチド、を含有する流体（溶液）を含む。標的ポリヌクレオチドは、互いに相補的な配列を有する標的ポリヌクレオチド間の二本鎖（例示的に、二本鎖Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３）の形態を含むか、又はその形態で提供され得る。例えば、二本鎖Ｄ１は、配列２１１、第１のアダプター２２１、及び第２のアダプター２２２を含む第１の標的ポリヌクレオチドと、第１の標的ポリヌクレオチドに相補的である、例えば、相補的配列２１１’、第１の相補的アダプター２２１’、及び第２の相補的アダプター２２２’を含む、第２の標的ヌクレオチドと、を含み得る。同様に、二本鎖Ｄ２は、配列２１２、第１のアダプター２２１、及び第２のアダプター２２２を含む第１の標的ポリヌクレオチドと、第１の標的ポリヌクレオチドに相補的である、例えば、相補的配列２１２’、第１の相補的アダプター２２１’、及び第２の相補的アダプター２２２’を含む、第２の標的ヌクレオチドと、を含み得る。例えば、二本鎖Ｄ３は、配列２１３、第１のアダプター２２１、及び第２のアダプター２２２を含む第１の標的ポリヌクレオチドと、第１の標的ポリヌクレオチドに相補的である、例えば、相補的配列２１２’、第１の相補的アダプター２２１’、及び第２の相補的アダプター２２２’を含む、第２の標的ヌクレオチドと、を含み得る。配列２１１、２１２、及び２１３は、互いに異なっていてもよく、ＳＢＳを使用してそれらの配列を決定することが望ましい場合があり得る。第１のアダプター２２１は、好適な条件下でハイブリダイズすることができるように捕捉プライマー２３１に相補的であり得、第２のアダプター２２２は、適切な条件下でハイブリダイズすることができるように、直交捕捉プライマー２３２に相補的であり得る。具体的には図示されていないが、各捕捉プライマー２３１又は各直交捕捉プライマー２３２は、８－オキソ－Ｇなどの切断可能な部分を含み得る。
捕捉プライマー２３１は、例えば、Ｐ５捕捉プライマーであり得、直交捕捉プライマー２３２は、例えば、Ｐ７捕捉プライマーであり得る。Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されているＰ５捕捉プライマーは、配列５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’（配列番号１）を有する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．から市販されているＰ７捕捉プライマーは、配列５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’（配列番号２）を有する。第１のアダプター２２１は、例えば、相補的Ｐ５アダプター（ｃＰ５）であり得、第２のアダプター２２２は、例えば、相補的Ｐ７アダプター（ｃＰ７）であり得る。Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から市販されている相補的Ｐ５アダプターは、配列５’－ＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧＣＣＧＴＡＴＣＡＴＴ－３’（配列番号３）を有する。Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている相補的Ｐ７アダプターは、配列５’－ＴＣＧＴＡＴＧＣＣＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧ－３’（配列番号４）を有し得る。
後の増幅及びシークエンシングのために基材２００上の標的ポリヌクレオチドを捕捉しようとする前に、二本鎖Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３を、図２Ｂに示すような様式で溶融させ、捕捉プライマー２３１へのハイブリダイズに利用可能な第１のアダプター２２１を有する一本鎖標的ポリヌクレオチドと、直交捕捉プライマー２３２へのハイブリダイズに利用可能な第２のアダプター２２２を得る。かかる溶融は、例えば、二本鎖Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３が配置される溶液の温度及び／又は組成を変化させることによって実施され得る。例えば、二本鎖Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３は、二本鎖を現在の溶液温度で解離させるために、十分な量のホルムアミド溶液、例えば、約１％～１００％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）、又は約５％～約８０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）、又は約１０％～約５０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）、又は約１％～約２０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）に曝露され得る。追加的又は代替的に、溶液の温度は、現在の溶液組成物における二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を超えて上昇させ得る。二本鎖の特定のＴｍは、溶液の組成（例えば、塩（Ｎａ＋）濃度及びホルムアミド濃度、存在する場合）、並びに二本鎖中のポリヌクレオチドの長さ及び配列に依存し得ることが理解されよう。
図２Ｂを参照して説明されるように、二本鎖Ｄ１、Ｄ２、及びＤ３が溶融された後、第１のアダプター２２１は、捕捉プライマー２３１へのハイブリダイズに利用可能であり得、第２のアダプター２２２は、直交捕捉プライマー２３２へのハイブリダイズに利用可能であり得る。しかしながら、かかる溶融を引き起こした溶液及び温度条件はまた、第１のアダプター２２１がプライマー２３１を捕捉するためのハイブリダイズを阻害し得、また第２のアダプター２２２が直交捕捉プライマー２３２にハイブリダイズすることを阻害し得る。かかるハイブリダイゼーションを促進し、したがって、基材２００上の標的ポリヌクレオチドの捕捉を促進するために、標的ポリヌクレオチドが再び配置される溶液の温度及び／又は組成を変更することができる。例えば、十分な量のホルムアミドが、現在の溶液温度で溶液から除去され得る。追加的又は代替的に、溶液の温度は、現在の溶液組成物における、（ａ）第１のアダプター２２１及び捕捉プライマー２３１と、（ｂ）第２のアダプター２２２及び直交捕捉プライマー２３２との間の二本鎖の融解温度（Ｔｍ）未満に低下し得る。
図２Ｃに示される非限定的な例では、この、例えば溶液温度及び／又は組成物の条件の更なる変化は、配列２１１に結合された第２のアダプター２２２と捕捉プライマー２３２のうちの１つとの間のハイブリダイゼーション、及び配列２１３に結合された第１のアダプター２２１と捕捉プライマー２３１のうちの１つとの間のハイブリダイゼーションを容易にする。しかしながら、この条件の更なる変化はまた、溶液中の標的ポリヌクレオチド間のアニーリングを促進する。例えば、互いに相補的な配列をそれぞれ含む第１及び第２の標的ポリヌクレオチドは、例示的に、それらの長さに沿って再アニールして二重のＤ２を再形成する配列２１２及び２１２’などの、それらの長さに沿って互いに再アニールし得る。追加的に、互いに相補的ではない配列を含む第１及び第２の標的ポリヌクレオチドは、例えば、図２Ｃに示されるような方法で実質的にそれらのアダプターでのみアニールして二本鎖Ｄ４を形成する非相補的配列２１４及び２１１’などの、例示的には、アダプター２２１及び２２１’及びアダプター２２２及び２２２’で、互いに部分的にアニールし得る。溶液中でアニールして二本鎖を形成する標的ポリヌクレオチド、例示的には、図２Ｃに示される非限定的な例における配列２１２及び２１４を含む標的ポリヌクレオチドは、捕捉プライマー２３１又は直交捕捉プライマー２３２とハイブリダイズするためには利用不可能であり、そのため、捕捉され得ず、ましてや増幅又はシークエンシングも不可能である。
それと比較し、本発明の修飾捕捉プライマーは、例えば、溶液中でアニーリングが実質的に起こらない塩濃度、ホルムアミド含有量、及び／又は温度などの、溶液中でアニーリングが実質的に起こらない条件において、標的ポリヌクレオチドのアダプターとハイブリダイズすることができる。したがって、標的ポリヌクレオチドは、かかる溶液中で実質的にアニールしない場合があり、二本鎖を形成し、したがって、存在する捕捉プライマーとハイブリダイズするために利用可能なままであり得、その後、それらは増幅及びシークエンシングされ得るか、又はそうでなければ所望に応じて使用され得る。追加的に、本発明の修飾捕捉プライマーは、標的ポリヌクレオチドの溶液中の捕捉プライマー又はアダプターへの任意の非特異的又は非生産的ハイブリダイゼーションを阻害する条件下で、標的ポリヌクレオチドのアダプターとハイブリダイズすることができ、それにより、実質的に全てのハイブリダイゼーションのイベントが生産的であり、シークエンシングされ得る二本鎖をもたらすことが予想され得る。
図３Ａ～図３Ｈは、本発明の捕捉プライマーを使用して基材上のポリヌクレオチドの捕捉及び増幅のための例示的なプロセスフローにおける例示的な組成物及び操作を概略的に示す。図３Ａに示される組成物３０００は、捕捉プライマー３３１及びそれに結合された直交捕捉プライマー３３２を含む基材３００、並びに、標的ポリヌクレオチド、例えば、捕捉、増幅、及び合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）を用いたシークエンシングを意図したポリヌクレオチド、を含有する流体（溶液）を含む。標的ポリヌクレオチドは、互いに相補的な配列を有する標的ポリヌクレオチド間の二本鎖（例示的に、二本鎖Ｄ５、Ｄ６、及びＤ７）の形態を含むか、又はその形態で提供され得る。例えば、図２Ａを参照して説明したものと同様の方法で、二本鎖Ｄ５は、配列３１１、第１のアダプター３２１、及び第２のアダプター３２２を含む第１の標的ポリヌクレオチドと、第１の標的ポリヌクレオチドに相補的である、例えば、相補的配列３１１’、第１の相補的アダプター３２１’、及び第２の相補的アダプター３２２’を含む、第２の標的ヌクレオチドと、を含み得る。例えば、二本鎖Ｄ６は、配列３１２、第１のアダプター３２１、及び第２のアダプター３２２を含む第１の標的ポリヌクレオチドと、第１の標的ポリヌクレオチドに相補的である、例えば、相補的配列３１２’、第１の相補的アダプター３２１’、及び第２の相補的アダプター３２２’を含む、第２の標的ヌクレオチドと、を含み得る。例えば、二本鎖Ｄ７は、配列３１３、第１のアダプター３２１、及び第２のアダプター３２２を含む第１の標的ポリヌクレオチドと、第１の標的ポリヌクレオチドに相補的である、例えば、相補的配列３１２’、第１の相補的アダプター３２１’、及び第２の相補的アダプター３２２’を含む、第２の標的ヌクレオチドと、を含み得る。配列３１１、３１２、及び３１３は、互いに異なっていてもよく、ＳＢＳを使用してそれらの配列を決定することが望ましい場合があり得る。第１のアダプター３２１は、好適な条件下でハイブリダイズすることができるように捕捉プライマー３３１に相補的であり得、第２のアダプター３２２は、適切な条件下でハイブリダイズすることができるように、修飾された直交捕捉プライマー３３２に相補的であり得る。
捕捉プライマー３３１の各々は、第１のアダプター３２１と相補的な第１のアダプター３２１’との間の二本鎖のＴｍと比較して、捕捉プライマー３３１と第１のアダプター３２１との間の二本鎖のＴｍを増加させる複数の核酸を含み得る。例えば、捕捉プライマー３３１の修飾核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含み得、それらの各々は、第１のアダプター３２１と相補的な第１のアダプター３２１’との間の二本鎖のＴｍと比較して、捕捉プライマー３３１と第１のアダプター３２１との間の二本鎖のＴｍを増加させることが予想され得る。捕捉プライマー３３１は、ＤＮＡを更に含み得る。修飾核酸及びＤＮＡは、捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布され得る。例えば、捕捉プライマー３３１の配列は、１つ以上のＤＮＡ分子、続いて１つ以上の修飾核酸、続いて１つ以上のＤＮＡ分子、続いて１つ以上の修飾核酸などを含み得る。代替的に、修飾核酸は、捕捉プライマーの５’末端に配置され得、ＤＮＡは、例えば、図４を参照して以下に記載されるような様式で、捕捉プライマーの３’末端に配置され得る。具体的に図示されていないが、各捕捉プライマー３３１は、８－オキソ－Ｇなどの切断可能な部分も含み得る。
同様に、直交捕捉プライマー３３２の各々は、第２のアダプター３２２と相補的な第２のアダプター３２２’との間の二本鎖のＴｍと比較して、直交捕捉プライマー３３２と第２のアダプター３２２との間の二本鎖のＴｍを増加させる複数の修飾核酸を含み得る。例えば、直交捕捉プライマー３３２の修飾核酸は、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含み得、それらの各々は、第２のアダプター３２２と相補的な第２のアダプター３２２’との間の二本鎖のＴｍと比較して、直交捕捉プライマー３３２と第２のアダプター３２２との間の二本鎖のＴｍを増加させることが予想され得る。直交捕捉プライマー３３２は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含み得る。修飾核酸及びＤＮＡは、直交捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布され得る。例えば、直交捕捉プライマー３３２の配列は、１つ以上のＤＮＡ分子、続いて１つ以上の修飾核酸、続いて１つ以上のＤＮＡ分子、続いて１つ以上の修飾核酸などを含み得る。代替的に、修飾核酸は、捕捉プライマーの５’末端に配置され得、ＤＮＡは、例えば、図４を参照して以下に記載されるような様式で、捕捉プライマーの３’末端に配置され得る。具体的に図示されていないが、直交捕捉プライマー３３２の各々はまた、８－オキソ－Ｇなどの切断可能な部分を含み得る。
捕捉プライマー３３１の修飾核酸は、直交捕捉プライマー３３２の同じタイプの修飾核酸であり得るが、必ずしもそうである必要はないことに留意されたい。例示的に、捕捉プライマー３３１及び直交捕捉プライマー３３２は、ＬＮＡを含み得、捕捉プライマー３３１及び直交捕捉プライマー３３２は、ＰＮＡを含み得、又は、捕捉プライマー３３１及び直交捕捉プライマー３３２は、スーパーＴを含み得る。代替的に、捕捉プライマー３３１はＬＮＡを含み得、一方で直交捕捉プライマー３３２はＰＮＡ又はスーパーＴを含み得、捕捉プライマー３３１はＰＮＡを含み得、一方で直交捕捉プライマー３３２はＬＮＡ又はスーパーＴを含み得、又は、捕捉プライマー３３１はスーパーＴを含み得、一方で直交捕捉プライマー３３２はＬＮＡ又はＰＮＡを含み得る。更に他の例では、直交捕捉プライマー３３２はＬＮＡを含み得、一方で捕捉プライマー３３１はＰＮＡ又はスーパーＴを含み得、直交捕捉プライマー３３２はＰＮＡを含み得、一方で捕捉プライマー３３１はＬＮＡ又はスーパーＴを含み得、又は、直交捕捉プライマー３３２はスーパーＴを含み得、一方で捕捉プライマー３３１はＬＮＡ又はＰＮＡを含み得る。
ＬＮＡは、２’及び４’炭素を接続するリンカーを唯一の違いとして、ＤＮＡに酷似している。ＰＮＡは、ポリペプチドと同様に、カルボン酸基及びアミノ基により構造化される。ＳｕｐｅｒＴは、ブチン基を有する修飾チミジン塩基を含む。ＬＮＡ及びスーパーＴ塩基修飾の場合、分子構造の剛性の増加及びより強い塩基スタッキングは、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖（３２１－３２１’又は３２２－３２２’）と比較して、二重相互作用（３２１－３３１又は３２２－３３２）の結合エネルギーを増加させ得る。一方、非荷電ＰＮＡ（３２１－３３１又は３２２－３３２）を含む二本鎖の融点は、静電反発の低減により、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖（３２１－３２１’又は３２２－３２２’）と比較して増加し得る。捕捉プライマー配列がかかる修飾核酸を含むように修飾される場合、表面／溶液二本鎖（３２１－３３１又は３２２－３３２）間の融点は、溶液／溶液ＤＮＡ二本鎖（３２１－３２１’又は３２２－３２２’）の融点よりも顕著に高くなり得る。これにより、標的ポリヌクレオチド３１１、３１２、３１３は、溶液中のアダプターの再アニーリングを可能にしない一連の条件（例えば、塩濃度、ホルムアミド濃度、及び温度）でシードされることが可能になる。したがって、標的ポリヌクレオチド３１１、３１２、３１３は、図２Ｃを参照して説明されるように、アダプター再アニーリングから実質的に損失を伴わずにシードされ得る。
後の増幅及びシークエンシングのために基材３００上の標的ポリヌクレオチドを捕捉しようとする前に、二本鎖Ｄ５、Ｄ６、及びＤ７を、図３Ｂに示すような様式で溶融させ、捕捉プライマー３３１へのハイブリダイズに利用可能な第１のアダプター３２１を有する一本鎖標的ポリヌクレオチドと、直交捕捉プライマー３３２へのハイブリダイズに利用可能な第２のアダプター３２２を得る。図２Ｂを参照して説明したものと同様の方法で、かかる溶融は、例えば、二本鎖Ｄ５、Ｄ６、及びＤ７が配置される溶液の温度及び／又は組成を変化させることによって実施され得る。例えば、二本鎖Ｄ５、Ｄ６、及びＤ７は、二本鎖を現在の溶液温度で解離させるために、十分な量の溶液中のホルムアミド、例えば、約１％～１００％のホルムアミド（ｖ／ｖ）、又は約５％～約８０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）、又は約１０％～約５０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）、又は約１％～約２０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）に曝露され得る。追加的又は代替的に、溶液の温度は、現在の溶液組成物における二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を超えて上昇させ得る。二本鎖の特定のＴｍは、溶液の組成（例えば、塩（Ｎａ＋）濃度及びホルムアミド濃度、存在する場合）、並びに二本鎖中のポリヌクレオチドの長さ及び配列に依存し得ることが理解されよう。
図３Ｂを参照して説明されるように、二本鎖Ｄ５、Ｄ６、及びＤ７が溶融された後、第１のアダプター３２１は、捕捉プライマー３３１にハイブリダイズし得、第２のアダプター３２２は、図３Ｃに示されるような様式で二本鎖Ｄ５、Ｄ６、及びＤ７を溶融するために使用される同じ条件で直交捕捉プライマー３３２にハイブリダイズし得る。すなわち、かかる溶融を引き起こした溶液及び温度条件はまた、第１のアダプター３２１がプライマー３３１を捕捉するためのハイブリダイズを阻害し得ず、また第２のアダプター３２２が直交捕捉プライマー３３２にハイブリダイズすることを阻害し得ない。代わりに、かかる条件は、アダプター３２１と相補的アダプター３２１’との間のいかなるアニーリングも阻害し得、アダプター３２２と相補的アダプター３２２’との間の任意の再アニーリングは、図２Ｃを参照して説明されるような任意の二本鎖の形成を阻害し得る。したがって、標的ポリヌクレオチドの各々は、捕捉のために利用可能なままであり得、例えば、必ずしもホルムアルデヒドの濃度を低下させることなく、例えば、必ずしもホルムアミドの濃度を低下させることなく、二本鎖Ｄ５、Ｄ６、及びＤ７を溶融するために使用された条件を必ずしも変化させることなく、基材上に捕捉され得る。
図３Ｃに示される非限定的な例では、溶液中の標的ポリヌクレオチド間のアニーリングを阻害する条件では、標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの第１のアダプター３２１は、捕捉プライマー３３１のそれぞれにハイブリダイズして第１の二本鎖を形成し、標的ポリヌクレオチドのいくつかの第２のアダプター３２２は、直交捕捉プライマー３３２のそれぞれにハイブリダイズして第２の二本鎖を形成する。第１及び第２の二本鎖の各々は、第２の標的ポリヌクレオチドが相補的である第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれへのハイブリダイゼーションによって形成される第３の二本鎖のＴｍよりも高い融解温度（Ｔｍ）を有し得る。例示的に、配列３１２に結合された第１のアダプター３２１は、捕捉プライマー３３１のうちの１つにハイブリダイズして、二本鎖Ｄ８を形成し、配列３１１に結合された第２のアダプター３２２は、直交捕捉プライマー３３２のうちの１つにハイブリダイズして二本鎖Ｄ９を形成し、配列３１３に結合された第２のアダプター３２２は、直交捕捉プライマー３３２のうちの１つにハイブリダイズして、二本鎖Ｄ１０を形成する。
第１のアダプター３２１と捕捉プライマー３３１との間の二本鎖のＴｍは、第１のアダプター３２１と相補的な第１のアダプター３２１’との間の二本鎖のＴｍよりも大きくてもよく、例えば、第１のアダプター３２１と相補的な第１のアダプター３２１’との間の二本鎖のＴｍを少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約２０℃、又は少なくとも約２５℃超え得る。同様に、第２のアダプター３２２と直交捕捉プライマー３３２との間の二本鎖のＴｍは、第２のアダプター３２２と相補的な第２のアダプター３２２’間の二本鎖のＴｍよりも大きくてもよく、例えば、第１のアダプター３２１と相補的な第１のアダプター３２１’との間の二本鎖のＴｍを少なくとも約５℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約２０℃、又は少なくとも約２５℃超え得る。したがって、標的ポリヌクレオチドは、好適には、第１のアダプター３２１と捕捉プライマー３３１との間の二本鎖のＴｍを下回る温度で、第２のアダプター３２２と直交捕捉プライマー３３２との間の二本鎖のＴｍを下回る温度で、基材３００上に捕捉され得、それは、第１のアダプター３２１と相補的な第１のアダプター３２１’との間の二本鎖のＴｍより上であり、第２のアダプター３２２と相補的な第２のアダプター３２２’との間の二本鎖のＴｍより上である。
例示的に、図３Ｃに示される二本鎖Ｄ８、Ｄ９、及びＤ１０のＴｍは、図２Ａ及び図２Ｃを参照して記載された二本鎖Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４のいずれかのＴｍを超え得る。例えば、二本鎖Ｄ８、Ｄ９、及びＤ１０は、各々、約８０℃～約１１０℃、例えば、約８５℃～約１０５℃、又は約９０℃～約１００℃の融解温度（Ｔｍ）を有し得る。それと比較し、二本鎖Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４のＴｍは、約８０℃未満、例えば、約７５℃未満、約７０℃未満、約６５℃未満、又は約６０℃未満であり得る。溶液中のアダプター間の二本鎖のＴｍと比較して、アダプターと表面プライマーとの間の二本鎖の有意に異なるＴｍの結果として、第２の標的ポリヌクレオチドの実質的にいずれも、第１の標的ポリヌクレオチドのいずれかに溶液中でハイブリダイズしない。したがって、二本鎖Ｄ８、Ｄ９、及びＤ１０は、二本鎖Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４が形成され得ない特定の条件で、容易に形成され得る。二本鎖は、例えばポアソン分布に従って、異なる位置で基材３００の表面上に形成され得る。具体的に図示されていないが、基材３００は、例えば、二本鎖がそれぞれ形成され得る異なる領域を画定するようにパターン化されてもよく、その中で増幅を使用してその後クラスタが形成され得ることが理解されるであろう。追加的に、図３Ａ～３Ｈを参照して説明される例は、平坦な基材の使用を示唆するように示されているが、例えば、それぞれ標的ポリヌクレオチドによってシードされ、かつ実質的にモノクローナルクラスタが形成され得るウェルなど、より複雑な基材が使用され得ることは明らかであろう。
図３Ｄに示されるように、図３Ｃを参照して記載された初期ハイブリダイゼーション後、標的ポリヌクレオチド３１１、３１２、３１３の各々は、それぞれ、それぞれのアンプリコン３１１’、３１２’、及び３１３’を形成するように増幅され得る。かかる増幅に続いて、標的ポリヌクレオチド３１１、３１２、３１３は、図３Ｅに示されるような様式で脱水素化され得る一方で、アンプリコン３１１’、３１２’、及び３１３’は、基材３００に共有結合したままである。かかる脱水素化は必ずしも実施される必要はないことに留意されたい。例えば、脱水素の標的ポリヌクレオチド３１１、３１２、３１３の代わりに、かかるポリヌクレオチドは、基材にハイブリダイズしたままであり得、当技術分野で知られているような、ＥｘＡｍｐと称され得る鎖浸潤プロセスを使用して更に増幅され得る。
図３Ｆに示されるように、図３Ｄ～図３Ｅを参照して記載された初期増幅後、得られたアンプリコンは、基材３００上の他の捕捉プライマー又は直交捕捉プライマーにハイブリダイズし得るように屈曲し得る。例えば、アンプリコン３１１’の相補的な第１のアダプター３２１’は、捕捉プライマー３３１のうちの１つにハイブリダイズし得、アンプリコン３１２’の相補的な第２のアダプター３２２’は、直交捕捉プライマー３３２のうちの１つにハイブリダイズし得、アンプリコン３１３’の相補的な第１のアダプター３２１’は、捕捉プライマー３３１のうちの１つにハイブリダイズし得る。アンプリコンアダプターとそれぞれの捕捉プライマー又は直交捕捉プライマーとの間の二本鎖は、二本鎖Ｄ８、Ｄ９、及びＤ１０と同様の、又は同じＴｍを有し得、したがって、標的ポリヌクレオチドの更なる増幅を促進するようにハイブリダイズしたままであり得る。
図３Ｇは、別の増幅操作後の図３Ｆの組成物を示す。理解できるように、組成物は、アンプリコン３１１’の更なるアンプリコン３１１と、アンプリコン３１２’の更なるアンプリコン３１２と、アンプリコン３１３’の更なるアンプリコン３１３と、を含む。かかる更なるアンプリコンは、それらに由来して生成されたアンプリコンにハイブリダイズすることができる。溶液は、図３Ｈに示されるような方法で捕捉プライマー又は直交捕捉プライマーからアンプリコンのアダプターを脱水素化するように増加させることができる。増幅操作は、アンプリコン３１１、３１１’、３１２、３１２’、３１３、及び３１３’の更なるアンプリコンを生成するために、任意の好適な回数繰り返され得る。増幅操作は、例えば、標的ポリヌクレオチド３１１、３１２、又は３１３のアンプリコンを用いて、実質的にモノクローナルクラスタでそれぞれの基材領域（具体的に図示されていない）を実質的に占有するように、任意の好適な回数形成され得る。例えば、基材領域の各々内のアンプリコンは、少なくとも約６０％の１つの選択された標的ポリヌクレオチドのアンプリコン、又は少なくとも約７０％のアンプリコンの１つの選択された標的ポリヌクレオチドのアンプリコン、又は少なくとも約８０％の１つの選択された標的ポリヌクレオチドのアンプリコン、又は少なくとも約９０％の１つの選択された標的ポリヌクレオチドのアンプリコン、又は少なくとも約９５％の１つの選択された標的ポリヌクレオチドのアンプリコン、又は少なくとも約９８％の１つの選択された標的ポリヌクレオチドのアンプリコン、又は少なくとも約９９％の１つの選択された標的ポリヌクレオチドのアンプリコン、又は１００％の１つの選択された標的ポリヌクレオチドのアンプリコン、を含み得る。
上記のように、いくつかの例では、特定の捕捉プライマー及び直交捕捉プライマーは、非ヌクレオチド部分を含み得る。かかる非ヌクレオチド部分としては、捕捉プライマーの一部が選択的に除去され得る除去部分が挙げられるが、これらに限定されない。除去部分は、任意の好適なプライマーの長さに沿った任意の好適な位置に位置し得、互いに同じタイプの除去部分であり得るが、必ずしもそうである必要はない。図３Ｅ～３Ｈを参照して記載されるような所望の数の更なる増幅操作に続いて、捕捉プライマー３３１又は直交捕捉プライマー３３２の一部は、適切な酵素又は試薬を除去部分と反応させることによって除去され得る。
本発明の捕捉プライマー及び直交捕捉プライマーは、それらの捕捉プライマー又は直交捕捉プライマーと、標的ポリヌクレオチドのアダプターとの間の二本鎖のＴｍを十分に増加させる修飾核酸の任意の好適な数、種類、及び配置を含み得る。図４は、ポリヌクレオチドと、いくつかの例による本発明の捕捉プライマーの１つとの間の例示的な二本鎖を概略的に示す。図４に示す非限定的な例では、修飾核酸４４１（ＰＮＡ又はＬＮＡなど）は、捕捉プライマー３３１の５’末端に配置されており、ＤＮＡ４４２は、捕捉プライマーの３’末端に配置されている。任意のＴスペーサー４４３が、ＤＮＡ４４２と基材４００の表面（例えば、フローセル）との間に配置されている。修飾核酸４４１及びＤＮＡ４４２は、一緒に、「キメラ」グラフト化プライマー構造を提供すると考えられ得る。標的ポリヌクレオチドは、修飾核酸４４１の配列に相補的である第１の部分配列３４１を含むアダプター３２１に結合されたライブラリ鋳型３１１、及びＤＮＡ４４２の配列に相補的である第２のサブ配列３４２を含み得る。代替的に、修飾核酸（ＰＮＡ、ＬＮＡ、又はスーパーＴなど）及びＤＮＡは、上記で更に記載されるような方法で、捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布される。直交捕捉プライマー３３２は、図４に示される捕捉プライマー３３１と同様に構成され得るが、例えば、異なる配列を有するキメラグラフト化プライマー構造を含み得る。代替的に、修飾核酸（ＰＮＡ、ＬＮＡ、又はスーパーＴなど）及びＤＮＡは、更に上記のような方法で、直交捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布され得る。
いくつかの例では、捕捉プライマー３３１の各々は、約５～約２０個の修飾核酸を含み得、直交捕捉プライマー３３２の各々は、約５～約２０個の修飾核酸を含み得る。しかしながら、修飾核酸の数が、基材表面で二本鎖形成を可能にすると共に、溶液中での二本鎖形成を抑制する条件での適切なＴｍを得るように、最適に調整され得、また捕捉プライマー及び直交捕捉プライマーの各々が、同じ修飾核酸の数、タイプ又は分布を含む必要はないことは理解されるとおりである。例示的に、捕捉プライマーの各々は、少なくとも約９個の修飾核酸を含み得、直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約９個の修飾核酸を含み得、又は、捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１２個の修飾核酸を含み得、直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１２個の修飾核酸を含み得、又は、捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１５個の修飾核酸を含み得、直交捕捉プライマーの各々は、少なくとも約１５個の修飾核酸を含み得る。
捕捉プライマー３３１及び直交捕捉プライマー３３２は、修飾核酸を含むが、それらは特に問題なければ捕捉プライマー２３１及び２３２と同様又は同じ配列を有し得ることに留意されたい。すなわち、捕捉プライマー３３１は、修飾Ｐ５捕捉プライマーであり得、直交捕捉プライマーは、修飾Ｐ７捕捉プライマーである。例えば、捕捉プライマー３３１は、本明細書の他の箇所に提供される配列を有するＰ５プライマーであり得るか、又はそれを含み得、その際、Ｐ５ＤＮＡ塩基の少なくともいくつかは、それらのＰＮＡ、ＬＮＡ、又はスーパーＴ類似体で置き換えられる。追加的又は代替的に、直交捕捉プライマー３３２は、本明細書の他の箇所に提供される配列を有するＰ７プライマーであり得るか、又はそれを含み得、その際、Ｐ７ＤＮＡ塩基の少なくともいくつかは、それらのＰＮＡ、ＬＮＡ、又はスーパーＴ類似体で置き換えられる。様々な長さのＬＮＡを含むキメラＰ５及びＰ７配列の非限定的な例、キメラＰ５若しくはＰ７配列とそれらのそれぞれのアダプターｃＰ５又はｃＰ７（７５０ｍＭ Ｎａ＋）との間の二本鎖の計算されたＴｍを、以下の表１に示すが、太字はＬＮＡを示し、太字ではない文字はＤＮＡを示す。市販のＰ５及びＰ７配列、並びにＰ５若しくはＰ７配列とそれらのそれぞれのアダプターｃＰ５又はｃＰ７との間の二本鎖の計算されたＴｍを、参照のために示す。
表１に提供される例から、Ｐ５配列について、１５個のＤＮＡ塩基をＬＮＡと置き換えることが、その配列とｃＰ５アダプターとの間の二本鎖のＴｍを約２１℃増加させることができることが理解され得、１２個のＤＮＡ塩基をＬＮＡに置き換えることが、その配列とｃＰ５アダプターとの間の二本鎖のＴｍを約１６℃増加させ、９つのＤＮＡ塩基をＬＮＡと置き換えることが、その配列とｃＰ５アダプターとの間の二本鎖のＴｍを約１１℃増加させることができる。追加的に、表１に提供される例から、Ｐ７配列について、１５個のＤＮＡ塩基をＬＮＡと置き換えることが、その配列とｃＰ７アダプターとの間の二本鎖のＴｍを約２１℃増加させ得ることが理解され得、１２個のＤＮＡ塩基をＬＮＡに置き換えることが、その配列とｃＰ７アダプターとの間の二本鎖のＴｍを約１７℃増加させ、９つのＤＮＡ塩基をＬＮＡと置き換えることが、その配列とｃＰ７アダプターとの間の二本鎖のＴｍを約１２℃増加させることができる。本明細書で提供されるような捕捉プライマー又は直交捕捉プライマーで使用するための任意の好適なＴｍを提供するために、任意の配列における修飾核酸の数が、本明細書で提供されることが理解されよう。
本発明の修飾捕捉プライマーを実施するための１つの考慮事項は、かかるプライマーが、クラスタ生成及びシークエンシングに使用され得るように、リコンビナーゼ、一本鎖結合タンパク質、及びポリメラーゼなどの好適な酵素と適合性を有することである。図４を参照して説明したようなＰＮＡ又はＬＮＡを含むキメラ構造は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、以下の参考文献：Ｌｅｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）ｏｎ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ，」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４（２０）：ｅ１４２，１１ｐａｇｅｓ（２００６）、及びＭｉｓｒａ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ－ＤＮＡ ｃｈｉｍｅｒａ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｒｅ ｎｏｖｅｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１９１７－１９２５（１９９８）に記載されているものと同様の様式で、かかる酵素と適合性を有すると予想される。ＬＮＡについての更なる情報は、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，「Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＬＮＡ）：ｆｉｎｅ－ｔｕｎｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ，」Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：１－７（２００１）に見つけることができる。図４を参照して説明されるようなキメラ構造の３’末端にＤＮＡを提供することは、酵素が相互作用する可能性のある位置に未修飾のＤＮＡ塩基を配置することによって予想される酵素活性を維持するのに役立ち得る一方で、キメラ構造の５’末端に修飾核酸を提供して、アダプターへの結合の強度を向上させることができる。
追加的に、本明細書の他の箇所に記載され、当業者には理解されるように、任意の所与の二本鎖のＴｍは、その二本鎖が配置される溶液の組成に基づいて変化し得る。例えば、ホルムアルデヒドを溶液に添加することは、所与の二本鎖のＴｍを減少させ得、一方、溶液に塩を添加することは、所与の二本鎖のＴｍを増加させ得る。したがって、本明細書で提供される例示的なＴｍ（及びＴｍ間の差）は純粋に例示的であり、二本鎖が配置される溶液の特定の組成に基づいて変化し得る。図５Ａ～５Ｃは、本発明の捕捉プライマーによるポリヌクレオチドの捕捉に対する条件の例示的な効果を示すプロットである。図５Ａに示す非限定的な例では、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のパーセントを、０％ｖ／ｖのホルムアミド及び７５０ｍＭのＮａ＋を含む溶液中、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリキャプチャプライマー（曲線５０１）との間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖、及びｃＰ７とＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー（曲線５０２）との間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖における、温度の関数として示す。ＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマーは、配列ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣ（８－オキソＧ）ＡＧＡＴ（配列番号１３）を有し（配列中、太字はＬＮＡを示す）、ｃＰ７と二本鎖形成したときに２０℃のＴｍを有するようモデル化した。
図５Ａでは、約７７℃の温度は、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリキャプチャプライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍに対応し（曲線５０１）、約９１℃の温度は、ｃＰ７とＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍに対応（曲線５０２）し得ることが分かる。約８５℃を超える温度で、曲線５０１は、ｄｓＤＮＡのパーセントが、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖に対してわずかに（例えば、１％未満に）なることを示す。追加的に、約９０℃未満の温度では、曲線５０１は、ｄｓＤＮＡのパーセントが、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖に対して約１００％となることを示す。したがって、図５Ａから、約８５℃～９０℃の温度で、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリプライマーとの間のハイブリダイゼーションが実質的に完全に阻害され得る一方で、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションが非常に安定した二本鎖を形成することが理解され得る。したがって、この温度範囲内で、鋳型ポリヌクレオチドは、高効率で溶液から捕捉され得、図２Ｃを参照して説明されるような溶液ベースのアニーリングプロセスからの競合を実質的に含まない。かかる操作を実施するのに好適な特定の温度範囲は、溶液の特定の組成に応じて変化し得ることが理解されよう。任意の他の捕捉プライマー及びアダプター配列は、同様の二本鎖形成の温度依存性を示すことが予想され得る。
例えば、図５Ｂに示される非限定的な例では、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリキャプチャプライマー（曲線５０３）との間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖、及びｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマーの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖（曲線５０４）のＴｍを、７５０ｍＭのＮａ＋の塩濃度（％ｖ／ｖ）の関数として示す。図５Ａと同様に、０％ｖ／ｖホルムアミドでは、約７７℃の温度が、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリキャプチャプライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍに対応し（曲線５０３）、約９１℃の温度が、ｃＰ７とＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍに対応する（曲線５０４）ことが理解され得る。ホルムアミドの濃度が増加するにつれて、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリキャプチャプライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖、及びｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖、の両方において、Ｔｍが減少する。例えば、約５％ｖ／ｖホルムアミドの濃度で、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約６９℃に減少し、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約８８℃に減少する。約１０％ｖ／ｖホルムアミドの濃度で、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約６６℃に減少し、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約８５℃に減少する。約１５％ｖ／ｖホルムアミドの濃度で、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約６３℃に減少し、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約８２℃に減少する。約２０％ｖ／ｖホルムアミドの濃度で、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約５８℃に減少し、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約７９℃に減少する。
したがって、図５Ｂから、任意の所与の濃度のホルムアミド（例えば、約１％～約２０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）、又は約５％～約２０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ））において、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションが実質的に完全に阻害され得る一方で、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマーのハイブリダイゼーションが非常に安定した二本鎖を形成し得る温度範囲が存在することが理解され得る。したがって、この温度範囲内で、鋳型ポリヌクレオチドは、高効率で溶液から捕捉され得、図２Ｃを参照して説明されるような溶液ベースのアニーリングプロセスからの競合を実質的に含まない。任意の他の捕捉プライマー及びアダプター配列は、同様の二本鎖形成のホルムアミド濃度依存性を示すことが予想され得る。
別の例として、図５Ｃに示される非限定的な例では、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリキャプチャプライマー（曲線５０５）との間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖、及びｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖（曲線５０６）のＴｍを、塩濃度（ｍＭ Ｎａ＋）の関数として示す。７５０ｍＭのＮａ＋では、約７２℃の温度が、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリキャプチャプライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍに対応し（曲線５０５）、約８９℃の温度が、ｃＰ７とＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍに対応する（曲線５０６）ことが理解され得る。塩の濃度が減少するにつれて、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリキャプチャプライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖、及びｃＰ７とＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖、の両方において、Ｔｍが減少する。例えば、約５００ｍＭのＮａ＋の濃度で、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約７０℃まで減少し、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約８７℃に減少する。約１００ｍＭのＮａ＋の濃度で、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約５５℃に減少し、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約７７℃に減少する。約０ｍＭのＮａ＋の濃度で、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約４２℃に減少し、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマー間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖のＴｍは約５８℃に減少する。
したがって、図５Ｃから、任意の所与の濃度の塩（例えば、約１００～約８００ｍＭのＮａ＋、又は２００～約８００ｍＭのＮａ＋の濃度）では、ｃＰ７とＰ７標準ライブラリ捕捉プライマーとの間のハイブリダイゼーションが実質的に完全に阻害され得る一方で、ｃＰ７及びＬＮＡ修飾Ｐ７捕捉プライマーのハイブリダイゼーションが非常に安定した二本鎖を形成し得る温度範囲が存在することが理解され得る。したがって、この温度範囲内で、鋳型ポリヌクレオチドは、高効率で溶液から捕捉され得、図２Ｃを参照して説明されるような溶液ベースのアニーリングプロセスからの競合を実質的に含まない。任意の他の捕捉プライマー及びアダプター配列は、同様の二本鎖形成の塩濃度依存性を示すことが予想され得る。
本明細書に記載される例示的な組成物は、ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅するための任意の好適な方法で使用され得ることが理解されよう。例えば、図６は、本修飾プライマーを使用してポリヌクレオチドを捕捉及び増幅するための方法６００における操作の例示的な流れを示す。方法６００は、図３Ａ～図３Ｈを参照して説明された組成物３０００を使用して実施され得るが、方法６００は、任意の他の好適な組成物を使用しても実施され得る。
ここで図６を参照すると、方法６００は、（ａ）基材の表面に結合された複数の捕捉プライマーであって、各々修飾核酸を含む、捕捉プライマーと、（ｂ）基材の表面に結合された複数の直交捕捉プライマーであって、各々修飾核酸を含む、直交捕捉プライマーと、を含む組成物を提供することを含み得る（操作６１０）。組成物は、図３Ａを参照して説明される組成物３０００と同様であり得、例えば、基材３００に結合された捕捉プライマー３３１及び直交捕捉プライマー３３２を含み得る。
図６に示される方法６００は、（ａ）第１の標的ポリヌクレオチドであって、捕捉プライマーに相補的である第１のアダプター、及び直交捕捉プライマーに相補的である第２のアダプターを各々含む、第１の標的ポリヌクレオチドと、（ｂ）第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれに相補的である第２の標的ポリヌクレオチドと、を含む、流体を提供することを更に含み得る。流体は、図３Ａを参照して説明したように同様に構成されてもよく、例えば、各々が第１のアダプター３２１及び第２のアダプター３２２に結合されている標的ポリヌクレオチド３１１、３１２、３１３を含み得、また各々が相補的な第１のアダプター３２１’及び相補的な第２のアダプター３２２’に結合している相補的標的ポリヌクレオチド３１１’、３１２’、３１３’を含み得る。
図６に示される方法６００は、組成物を流体と接触させることを更に含み得る（操作６３０）。例えば、操作６１０で提供される組成物は、操作６２０で提供される流体と接触され得る。例示的に、組成物はフローセルに提供され得、流体はフローセル内の組成物と接触するように流れる。
図６に示される方法６００は、第２の標的ポリヌクレオチドの第１の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを阻害しながら、（ａ）第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの第１のアダプターを、捕捉プライマーのうちのそれぞれにハイブリダイズさせて、第１の二本鎖を形成することと、（ｂ）第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの第２のアダプターを、直交捕捉プライマーのうちのそれぞれにハイブリダイズさせて第２の二本鎖を形成することと、を更に含み得る（操作６４０）。例えば、図３Ｂ～図３Ｃを参照して説明されるような様式で、プライマーを捕捉するための第１のアダプターのハイブリダイゼーション、及び直交捕捉プライマーに対する第２のアダプターのハイブリダイゼーションは、第１及び第２の標的ポリヌクレオチドの互いのアニーリングを阻害する条件下で実施され得る。例示的な条件は、本明細書の他の場所に記載されている。同じ条件のセットを使用して、第１及び第２のポリヌクレオチドの互いの解離を引き起こし、第１のポリヌクレオチドのアダプターの本発明の捕捉プライマーへのハイブリダイゼーションを促進するために使用され得ることに留意されたい。これと比較し、従来既知の捕捉プライマーを使用する場合、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの互いに解離を引き起こす第１の条件と、それに続く、第１のポリヌクレオチドのアダプターの従来既知の捕捉プライマーへのハイブリダイゼーションの促進を引き起こす第２の条件と、の２つの条件が必要となり得る。
図６に示される方法６００は、第１の標的ポリヌクレオチドを増幅することを更に含み得、この増幅は、第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれのアンプリコンを生成することを含む（操作６５０）。かかるアンプリコンが生成され得る様式の非限定的な例は、図３Ｄ～３Ｈを参照して提供される。
したがって、従来公知の捕捉プライマーでは、非生産的な再ハイブリダイゼーション複合体が溶液中で形成され得る条件下で使用され得る一方で、本発明の修飾捕捉プライマー（直交捕捉プライマーを含む）では、溶液／溶液二本鎖と比較して、表面／溶液二本鎖のより強い結合（及びより高いＴｍ）を付与する、修飾核酸を含む配列を使用することにより、この欠点を克服する。表面／溶液と溶液／溶液二本鎖との間のＴｍの差は、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ、スーパーＴ、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る修飾捕捉プライマー配列を使用することによって達成され得る。捕捉プライマーに塩基修飾を組み込むことにより、標的ポリヌクレオチドのアダプターが表面にハイブリダイズすることができるが、溶液中の他のアダプターにハイブリダイズすることができない温度レジームが存在することとなる。
したがって、本発明の修飾捕捉プライマーは、以下の利点のうちの１つ以上を提供する：
Ａ）ライブラリ捕捉がより効率的である。適切な場合、標的ポリヌクレオチドのインプットの使用をより低い濃度で行い得る。
Ｂ）表面の捕捉物の「フローセル上」での変性後が高温で実施され得、これにより、適時にハイブリダイゼーションを促進する温度に到達するための冷却をわざわざ統合する必要性が低減若しくは排除され得、及び／又は
Ｃ）ライブラリの大部分を必要とするフローセルが、シードのために複数の流体プッシュを利用し得、例えば、サンプル調製の開始からシークエンシングデータを得るまでのターンアラウンド時間（ＴＡＴ）を大幅に増加させることができる。本捕捉プライマーによって提供されるより高いシード効率では、より少ない流体プッシュでより高濃度の標的ポリヌクレオチドを使用することが可能である。これは、シード中の時間を節約し得る。
Ａ）ライブラリ捕捉がより効率的である。適切な場合、標的ポリヌクレオチドのインプットの使用をより低い濃度で行い得る。
Ｂ）表面の捕捉物の「フローセル上」での変性後が高温で実施され得、これにより、適時にハイブリダイゼーションを促進する温度に到達するための冷却をわざわざ統合する必要性が低減若しくは排除され得、及び／又は
Ｃ）ライブラリの大部分を必要とするフローセルが、シードのために複数の流体プッシュを利用し得、例えば、サンプル調製の開始からシークエンシングデータを得るまでのターンアラウンド時間（ＴＡＴ）を大幅に増加させることができる。本捕捉プライマーによって提供されるより高いシード効率では、より少ない流体プッシュでより高濃度の標的ポリヌクレオチドを使用することが可能である。これは、シード中の時間を節約し得る。
本発明の組成物及び方法は、上記の特定の操作での使用に限定されないことが理解されよう。例えば、図３Ａ～３Ｈは、「架橋増幅」又は「表面結合ポリメラーゼ連鎖反応」と一致する操作と見なされ得るが、本発明の組成物及び方法は、他の増幅モダリティとの使用に容易に適合され得ることが理解されよう。１つのかかる増幅モダリティは、「排除増幅」又はＥｘＡｍｐである。排除増幅法は、基材領域当たり単一の標的ポリヌクレオチドの増幅及び基材領域におけるアンプリコンの実質的にモノクローナルな集団の生成を可能にし得る。例えば、基材領域内の第１の捕捉標的ポリヌクレオチドの増幅速度は、基材領域における標的ポリヌクレオチドのより遅い輸送速度及び捕捉に対して急速であり得る。したがって、基材領域に捕捉された第１の標的ポリヌクレオチドは、急速に増幅され、基材領域全体を占有し、したがって同じ基材領域における更なる標的ポリヌクレオチドの捕捉を阻害し得る。代替的に、第２の標的ポリヌクレオチドが第１のポリヌクレオチドの後に同じ基材領域に結合する場合、第１のポリヌクレオチドの比較的急速な増幅は、合成によってシークエンシングを実施するのに十分に強いシグナルをもたらすよう、基材領域の十分な占有をもたらし得る。排除増幅の使用はまた、モノクローナル基材領域の超ポアソン分布をもたらし得る。すなわち、実質的にモノクローナルであるアレイ内の基材領域の画分は、ポアソン分布によって予測される画分を超え得る。
有用なクラスタの超ポアソン分布を増加させることは、より実質的にモノクローナル基材領域がより高い品質のシグナル、したがって改善されたＳＢＳをもたらし得るため、有用である。しかしながら、標的ポリヌクレオチドの基材領域へのシードは、空間ポアソン分布に従い得、占有された基材領域の数を増加させるためのトレードオフは、ポリクローナル基材領域の数を増加させる。より高いスーパーポアソン分布を得る１つの方法は、シードが迅速に発生し、続いてシードされた標的ポリヌクレオチド間で遅延することである。「動的遅延」と呼ばれる遅延は、生化学反応速度論を通じて生じると考えられるため、シードされたある標的ポリヌクレオチドを他のシードされた標的よりも早く開始させる。排除増幅法は、リコンビナーゼが配列マッチを媒介するときに、リコンビナーゼを使用して、プライマー（例えば、基材領域に結合したプライマー）の二本鎖ＤＮＡ（例えば、標的ポリヌクレオチド）への浸入を促進することによって機能する。本発明の組成物及び方法は、本発明の捕捉プライマー及び直交捕捉プライマーの、リコンビナーゼが配列マッチを媒介するときの標的ポリヌクレオチドへの浸入を促進するためのリコンビナーゼと共に使用するために適合され得る。実際、本発明の組成物及び方法は、サーマルＰＣＲ、化学変性ＰＣＲ、及び酵素媒介法などの任意の表面ベースのポリヌクレオチド増幅方法と共に使用するために適合され得る（これは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）又はＥｘＡｍｐと称され得る）。
更なるコメント
様々な例示的な実施例が上述されているが、本発明から逸脱することなく、様々な変更及び修正がその中で行われ得ることは、当業者には明らかであろう。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲内にある、かかる全ての変更及び修正を網羅することを意図している。
様々な例示的な実施例が上述されているが、本発明から逸脱することなく、様々な変更及び修正がその中で行われ得ることは、当業者には明らかであろう。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲内にある、かかる全ての変更及び修正を網羅することを意図している。
本明細書に記載されるような本開示の態様のそれぞれの任意の対応する特徴／実施例は、適切な組み合わせで共に実施されてもよいことを理解されたい。また、これらの態様のうちの任意の１つ以上からの任意の特徴／実施例は、本明細書に記載されるような利点を得るために、任意の適切な組み合わせで本明細書に記載されるような（複数の）他の態様の特徴のいずれかと共に実施されてもよいことを理解されたい。
Claims (48)
- 基材の表面で標的ポリヌクレオチドを捕捉するための組成物であって、
前記基材の前記表面に結合された複数の捕捉プライマーであって、前記捕捉プライマーの各々が修飾核酸を含む、複数の捕捉プライマーと、
前記基材の前記表面に結合された複数の直交捕捉プライマーであって、前記直交捕捉プライマーの各々が修飾核酸を含む、複数の直交捕捉プライマーと、を含む、組成物。 - 前記捕捉プライマーの前記修飾核酸が、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含む、請求項１に記載の組成物。
- 前記捕捉プライマーが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
- 前記修飾核酸及び前記ＤＮＡが、前記捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布されている、請求項３に記載の組成物。
- 前記修飾核酸が、前記捕捉プライマーの５’末端に配置されており、前記ＤＮＡが、前記捕捉プライマーの３’末端に配置されている、請求項３に記載の組成物。
- 前記直交捕捉プライマーの前記修飾核酸が、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記直交捕捉プライマーが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含む、請求項６に記載の組成物。
- 前記修飾核酸及び前記ＤＮＡが、前記捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布されている、請求項７に記載の組成物。
- 前記修飾核酸が、前記直交捕捉プライマーの５’末端に配置されており、前記ＤＮＡが、前記直交捕捉プライマーの３’末端に配置されている、請求項７に記載の組成物。
- 第１の標的ポリヌクレオチドであって、前記捕捉プライマーに相補的である第１のアダプター、及び前記直交捕捉プライマーに相補的である第２のアダプターを各々含む、第１の標的ポリヌクレオチドと、
前記第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれに相補的である第２の標的ポリヌクレオチドと、を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの前記第１のアダプターが、前記捕捉プライマーのそれぞれにハイブリダイズして第１の二本鎖を形成し、前記第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの前記第２のアダプターが、前記直交捕捉プライマーのうちのそれぞれにハイブリダイズして、第２の二本鎖を形成する、請求項１０に記載の組成物。
- 前記第１及び第２の二本鎖が各々、前記第２の標的ポリヌクレオチドの、前記第２の標的ポリヌクレオチドと相補的である前記第１の標的ポリヌクレオチドの前記それぞれへのハイブリダイゼーションによって形成され得る第３の二本鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも大きいＴｍを有する、請求項１１に記載の組成物。
- 前記第１及び第２の二本鎖が各々、約８０℃～約１１０℃である融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１１又は１２に記載の組成物。
- 前記第１及び第２の二本鎖が各々、約８５℃～約１０５℃である融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第１及び第２の二本鎖が各々、約９０℃～約１００℃である融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記第２の標的ポリヌクレオチドのうちの実質的にいずれも、前記第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいずれに対しても溶液中でハイブリダイズしない、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
- 約１％～約１０００％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）を更に含む、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
- 約５％～約８０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）を更に含む、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
- 約１００～約８００ｍＭのＮａ＋を更に含む、請求項１１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
- 約２００～約８００ｍＭのＮａ＋を更に含む、請求項１１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記捕捉プライマーが、修飾Ｐ５捕捉プライマーであり、前記直交捕捉プライマーが、修飾Ｐ７捕捉プライマーである、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記捕捉プライマーの各々が、約５～約２０個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々が、約５～約２０個の前記修飾核酸を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記捕捉プライマーの各々が、少なくとも約９個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々が、少なくとも約９個の前記修飾核酸を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記捕捉プライマーの各々が、少なくとも約１２個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々が、少なくとも約１２個の前記修飾核酸を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記捕捉プライマーの各々が、少なくとも約１５個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々が、少なくとも約１５個の前記修飾核酸を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物。
- 基材の表面で標的ポリヌクレオチドを捕捉及び増幅するための方法であって、
組成物を流体と接触させることであって、前記組成物が、
前記基材の前記表面に結合された複数の捕捉プライマーであって、前記捕捉プライマーの各々が修飾核酸を含む、複数の捕捉プライマーと、
前記基材の前記表面に結合された複数の直交捕捉プライマーであって、前記直交捕捉プライマーの各々が修飾核酸を含む、複数の直交捕捉プライマーと、を含み
前記流体が、
第１の標的ポリヌクレオチドであって、前記捕捉プライマーに相補的である第１のアダプター、及び前記直交捕捉プライマーに相補的である第２のアダプターを各々含む、第１の標的ポリヌクレオチドと、
前記第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれに相補的である第２の標的ポリヌクレオチドと、を含む、接触させることと、
一方で、前記流体における前記第２の標的ポリヌクレオチドの前記第１の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを阻害することと、
前記第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの前記第１のアダプターを、前記捕捉プライマーのそれぞれにハイブリダイズさせて、第１の二本鎖を形成することと、
前記第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいくつかの前記第２のアダプターを、前記直交捕捉プライマーのそれぞれにハイブリダイズさせて、第２の二本鎖を形成させることと、次いで、
前記第１の標的ポリヌクレオチドを増幅することであって、前記増幅することが、前記第１の標的ポリヌクレオチドのそれぞれのアンプリコンを生成することを含む、増幅することと、を含む、方法。 - 前記捕捉プライマーの前記修飾核酸が、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記捕捉プライマーが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含む、請求項２６又は請求項２７に記載の方法。
- 前記修飾核酸及び前記ＤＮＡが、前記捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布されている、請求項２８に記載の方法。
- 前記修飾核酸が、前記捕捉プライマーの５’末端に配置されており、前記ＤＮＡが、前記捕捉プライマーの３’末端に配置されている、請求項２８に記載の方法。
- 前記直交捕捉プライマーの前記修飾核酸が、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はスーパーＴを含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記直交捕捉プライマーが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を更に含む、請求項３１に記載の方法。
- 前記修飾核酸及び前記ＤＮＡが、前記捕捉プライマーの５’末端と３’末端との間に分布されている、請求項３２に記載の方法。
- 前記修飾核酸が、前記直交捕捉プライマーの５’末端に配置されており、前記ＤＮＡが、前記直交捕捉プライマーの３’末端に配置されている、請求項３２に記載の方法。
- 前記第１及び第２の二本鎖が各々、前記第２の標的ポリヌクレオチドの、前記第２の標的ポリヌクレオチドと相補的である前記第１の標的ポリヌクレオチドの前記それぞれへのハイブリダイゼーションによって形成され得る第３の二本鎖の融解温度（Ｔｍ）よりも大きいＴｍを有する、請求項２６～３４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び第２の二本鎖が各々、約８０℃～約１１０℃である融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２６～３５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び第２の二本鎖が各々、約８５℃～約１０５℃である融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２６～３６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１及び第２の二本鎖が各々、約９０℃～約１００℃である融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の標的ポリヌクレオチドのうちの実質的にいずれも、前記第１の標的ポリヌクレオチドのうちのいずれに対しても溶液中でハイブリダイズしない、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズが、約１％～約１００％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）において実施される、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズが、約５％～約８０％のホルムアミド（％ｖ／ｖ）において実施される、請求項２６～４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズが、約１００～約８００ｍＭのＮａ＋において実施される、請求項２６～４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズが、約２００～約８００ｍＭのＮａ＋において実施される、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉プライマーが、修飾Ｐ５捕捉プライマーであり、前記直交捕捉プライマーが、修飾Ｐ７捕捉プライマーである、請求項２６～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉プライマーの各々が、約５～約２０個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々が、約５～約２０個の前記修飾核酸を含む、請求項２６～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉プライマーの各々が、少なくとも約９個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々が、少なくとも約９個の前記修飾核酸を含む、請求項２６～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉プライマーの各々が、少なくとも約１２個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々が、少なくとも約１２個の前記修飾核酸を含む、請求項２６～４６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉プライマーの各々が、少なくとも約１５個の前記修飾核酸を含み、前記直交捕捉プライマーの各々が、少なくとも約１５個の前記修飾核酸を含む、請求項２６～４７のいずれか一項に記載の方法。
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