JP2023501222A

JP2023501222A - オリゴヌクレオチドを検出するための方法

Info

Publication number: JP2023501222A
Application number: JP2022525362A
Authority: JP
Inventors: インフアシェン，; デニスキーフ，; デボラパリサー，
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-10-30
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2023-01-18
Also published as: WO2021087164A1; EP4051791A4; US20220372560A1; EP4051791A1

Abstract

本開示は、サンプルにおけるオリゴヌクレオチドの存在及び／または量を検出するための方法を記載する。いくつかの態様では、本開示は、Ｐ－ＰＭＯが標的タンパク質の発現を調節する能力を評価する方法であって、方法は、Ｐ－ＰＭＯが投与された対象の１つ以上の組織から得られたサンプルについて先行請求項のいずれか１項に記載の方法を実施すること、及び組織におけるＰ－ＰＭＯに由来するＰＭＯのレベルを組織における標的タンパク質のレベルと比較することを含む、方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月３０日に出願された米国仮出願６２／９２８，３０１の利益を主張し、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

多くの疾患は、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドの投与を含む処置から利益を受け得る。例えば、ジストロフィン遺伝子が機能不全または非存在のジストロフィンタンパク質をもたらす１つ以上の変異を有するデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）などの障害において、ジストロフィンタンパク質生成中の遺伝子配列の所定の部分にわたって「スキップ」するためのオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の使用は、切断型であるが部分的に機能性のジストロフィンタンパク質をもたらす。しかしながら、有効なオリゴヌクレオチドの開発、ならびに有効な用量の予測のための精確な試験及びモデリングは、それを必要とする対象に投与されたオリゴヌクレオチドを検出するためのハイスループットであり、感度がよく、精確であり、再現性のある方法に対するアンメットニーズに悩まされている。そのような方法は、例えば、オリゴヌクレオチドが投与された対象からのサンプルにおいてそれらを精確かつ再現性よく検出し、また、定量することが必要とされる。

本開示は、オリゴヌクレオチドが投与された対象からのサンプルにおけるそれらの感度がよい検出を可能とする改善されたアッセイの開発に部分的に基づく。

いくつかの態様では、本開示は、（ａ）オリゴヌクレオチドを含むサンプルをオリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベーションする工程であって、オリゴヌクレオチドプローブは、サンプルにおけるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする、インキュベーションする工程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、捕捉剤で被覆された基材と共にインキュベーションする工程であって、捕捉剤は、オリゴヌクレオチドプローブと結合し、それにより過剰オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを基材と関連付けさせ、ハイブリダイズしたプローブが基材と関連付けられた後にプレートを任意に洗浄する、インキュベーションする工程；（ｃ）工程（ｂ）の後の基材を、基材について異なる特異性を有する２つ以上の異なる一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションする工程であって、基材は、工程（ｃ）の前、間または後に１つ以上の洗浄溶液で任意に洗浄され、オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、１回の洗浄工程または複数の洗浄工程中に基材に関連付けられたままである、インキュベーションする工程；（ｄ）工程（ｃ）の後の基材を検出剤と共にインキュベーションする工程であって、検出剤は、オリゴヌクレオチドプローブと相互作用して検出可能なシグナルを生成する、インキュベーションする工程；及び（ｅ）検出可能なシグナルを検出する工程を含む、方法を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、（ａ）ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）を含むサンプルをオリゴヌクレオチドプローブとインキュベーションする工程であって、オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のロック核酸（ＬＮＡ）残基を含み、サンプルにおけるＰＭＯとハイブリダイズする、インキュベーションする工程；（ｂ）工程（ａ）の生成物を、捕捉剤で被覆された基材と共にインキュベーションする工程であって、捕捉剤は、オリゴヌクレオチドプローブと結合し、それによりオリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたＰＭＯを基材に関連付けさせる、インキュベーションする工程；（ｃ）工程（ｂ）の後の基材を１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションする工程であって、基材は、工程（ｃ）の前、間または後に任意に洗浄され、オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたＰＭＯは、１回の洗浄工程または複数の洗浄工程の間に基材に関連付けられたままである、インキュベーションする工程；（ｄ）工程（ｃ）の後の基材を検出剤と共にインキュベーションする工程であって、検出剤は、オリゴヌクレオチドプローブと相互作用して検出可能なシグナルを生成する、インキュベーションする工程；及び（ｅ）検出可能なシグナルを検出する工程を含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、基材をミクロコッカスヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む。

いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、基材をミクロコッカスヌクレアーゼと共にインキュベーションし、次いで基材をマングビーンヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む。

いくつかの実施形態では、基材は、ミクロコッカスヌクレアーゼと共にインキュベーションされた後、マングビーンヌクレアーゼと共にインキュベーションされる前に洗浄される。

いくつかの実施形態では、サンプルは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のロック核酸（ＬＮＡ）残基を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）残基を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＬＮＡ残基をそれぞれ含む５’末端セグメント及び３’末端セグメントによって挟まれたＤＮＡ残基から構成される中央セグメントを含む。

いくつかの実施形態では、中央セグメントは、５～２０個の間のＤＮＡ残基から構成される。

いくつかの実施形態では、５’及び３’末端セグメントは、独立して、２～８個の間のＬＮＡ残基から構成される。

いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、基材を１つのみの一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む。

いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、基材を２つ以上の異なる一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む。

いくつかの実施形態では、基材は、２つ以上の異なる一本鎖特異的ヌクレアーゼと共に順次インキュベーションされ、基材は、各インキュベーション後に洗浄される。

いくつかの実施形態では、基材は、２つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼと同時にインキュベーションされる。

いくつかの実施形態では、１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼを含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼは、マングビーンヌクレアーゼを含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを含む。

いくつかの実施形態では、１つのみの一本鎖特異的ヌクレアーゼは、マングビーンヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、２つ以上の異なるヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを含む。

いくつかの実施形態では、サンプルは組織から得られ、方法は、工程（ｅ）で検出された検出可能なシグナルのレベルに基づいて組織におけるＰＭＯのレベルを定量する工程をさらに含む。

いくつかの実施形態では、組織は、血液、腎臓、肝臓、胃腸、肺、筋肉、脾臓、脳、脊髄、またはそれらの組み合わせから選択される。

いくつかの実施形態では、血液組織は、血漿であり、またはそれを含む。

いくつかの実施形態では、筋肉組織は、横隔膜、腓腹筋、前脛骨筋（ＴＡ）、二頭筋、心臓、及び／または大腿四頭筋である。

いくつかの実施形態では、サンプルは、２０～３０個の連続ヌクレオチドの配列を含むＰＭＯを含み、哺乳動物ジストロフィン遺伝子の少なくとも１つのエクソンから選択されるヌクレオチド配列を有する。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのエクソンは、２３、４４、４５、４６、５１、または５３から選択される。

いくつかの実施形態では、哺乳動物ジストロフィン遺伝子は、ヒトジストロフィン遺伝子である。

いくつかの実施形態では、ＰＭＯは、患者に過去に送達されており、ＰＭＯは、送達のためにペプチドにコンジュゲートされている（Ｐ－ＰＭＯ）。

いくつかの態様では、本開示は、Ｐ－ＰＭＯの組織分布を評価する方法であって、方法は、Ｐ－ＰＭＯが投与された対象の１つ以上の組織から得られた１つ以上のサンプルについて先行請求項のいずれか１項に記載の方法を実施することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、方法は、対象の２つ以上の組織から得られた２つ以上のサンプルについて実施される。

いくつかの実施形態では、方法は、異なるＰ－ＰＭＯについて繰り返される。

いくつかの態様では、本開示は、Ｐ－ＰＭＯが標的タンパク質の発現を調節する能力を評価する方法であって、方法は、Ｐ－ＰＭＯが投与された対象の１つ以上の組織から得られたサンプルについて先行請求項のいずれか１項に記載の方法を実施すること、及び組織におけるＰ－ＰＭＯに由来するＰＭＯのレベルを組織における標的タンパク質のレベルと比較することを含む、方法を提供する。

いくつかの実施形態では、標的タンパク質は、ジストロフィンである。

本明細書に記載の実施形態による例示的なＥＬＩＳＡベースの検出アッセイのフローチャートである。

例示的なオリゴヌクレオチド設計スキーム及び本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプローブのための所定の例示的なアニーリング及び消化条件を比較するアッセイを示している。ａは、本明細書に記載される検出アッセイにおいて使用される例示的なオリゴヌクレオチドのための例示的なオリゴヌクレオチドプローブ設計スキームを示している。ホスホロチオエート（「ＰＴＯ」）改変塩基は太字で強調されており、ロック核酸（「ＬＮＡ」）改変塩基は太字で示されており、下線が引かれている。ｂ及びｃは、ＰＴＯ／ＤＮＡ及びＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出されたオリゴヌクレオチドのレベルの比較を示している。ｄは、ＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ及び３７℃または５０℃のアニーリング温度で実施されるアッセイを使用して検出されたオリゴヌクレオチドのレベルを示している。ｅは、ｐＨ５またはｐＨ７でマングビーンヌクレアーゼを伴わずにまたはマングビーンヌクレアーゼと共にインキュベーションされたＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの比較を示している。アッセイに「スパイク・イン」されたヌクレオチドの濃度がｘ軸に（ｐＭで）示されており、シグナル（ＲＦＵ）がｂ～ｅのｙ軸に示されている。

ＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを使用する本明細書に記載される例示的な検出アッセイの検証を示している。ａは、２つの異なるマウス血清サンプルにおける例示的な検出アッセイの定量を示している。棒グラフは、各血清サンプルにおいてｙ軸に測定されたオリゴヌクレオチドの濃度及びｘ軸に調製された標準溶液におけるオリゴヌクレオチドの濃度を示している。ｂは、マウス血清におけるオリゴヌクレオチド濃度を測定することによって得られた代表的な標準曲線を示している。中空の四角及び丸は、逆算されたＰＭＯ濃度を示している。直線の外観は、調製された標準及びマウス血清において測定されたオリゴヌクレオチドの検出可能なレベルを比較した場合の１００％の回収を示す。すべてのサンプルは二連で実行した。

［図４（ａ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ａ及びｂにおける左パネルは、全体の時間経過を示している；ａ及びｂにおける右パネルは、分割されたｘ軸を示しており、最初の８時間は、右パネルに対して拡大されている。［図４（ｂ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ａ及びｂにおける左パネルは、全体の時間経過を示している；ａ及びｂにおける右パネルは、分割されたｘ軸を示しており、最初の８時間は、右パネルに対して拡大されている。［図４（ｃ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ｃ～ｊは、心臓（ｃ）、横隔膜（ｄ）、腓腹筋（ｅ）、前脛骨筋（「ＴＡ」）（ｆ）、肺（ｇ）、腎臓（ｈ）、肝臓（ｉ）、及び脾臓（ｊ）において検出されたオリゴヌクレオチドのレベル（モル／ｇ組織）を示している。ｃ～ｊにおいて、中実黒色丸＝Ｐ－ＰＭＯＡ及び中空四角＝Ｐ－ＰＭＯＢ。［図４（ｄ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ｃ～ｊは、心臓（ｃ）、横隔膜（ｄ）、腓腹筋（ｅ）、前脛骨筋（「ＴＡ」）（ｆ）、肺（ｇ）、腎臓（ｈ）、肝臓（ｉ）、及び脾臓（ｊ）において検出されたオリゴヌクレオチドのレベル（モル／ｇ組織）を示している。ｃ～ｊにおいて、中実黒色丸＝Ｐ－ＰＭＯＡ及び中空四角＝Ｐ－ＰＭＯＢ。［図４（ｅ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ｃ～ｊは、心臓（ｃ）、横隔膜（ｄ）、腓腹筋（ｅ）、前脛骨筋（「ＴＡ」）（ｆ）、肺（ｇ）、腎臓（ｈ）、肝臓（ｉ）、及び脾臓（ｊ）において検出されたオリゴヌクレオチドのレベル（モル／ｇ組織）を示している。ｃ～ｊにおいて、中実黒色丸＝Ｐ－ＰＭＯＡ及び中空四角＝Ｐ－ＰＭＯＢ。［図４（ｆ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ｃ～ｊは、心臓（ｃ）、横隔膜（ｄ）、腓腹筋（ｅ）、前脛骨筋（「ＴＡ」）（ｆ）、肺（ｇ）、腎臓（ｈ）、肝臓（ｉ）、及び脾臓（ｊ）において検出されたオリゴヌクレオチドのレベル（モル／ｇ組織）を示している。ｃ～ｊにおいて、中実黒色丸＝Ｐ－ＰＭＯＡ及び中空四角＝Ｐ－ＰＭＯＢ。［図４（ｇ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ｃ～ｊは、心臓（ｃ）、横隔膜（ｄ）、腓腹筋（ｅ）、前脛骨筋（「ＴＡ」）（ｆ）、肺（ｇ）、腎臓（ｈ）、肝臓（ｉ）、及び脾臓（ｊ）において検出されたオリゴヌクレオチドのレベル（モル／ｇ組織）を示している。ｃ～ｊにおいて、中実黒色丸＝Ｐ－ＰＭＯＡ及び中空四角＝Ｐ－ＰＭＯＢ。［図４（ｈ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ｃ～ｊは、心臓（ｃ）、横隔膜（ｄ）、腓腹筋（ｅ）、前脛骨筋（「ＴＡ」）（ｆ）、肺（ｇ）、腎臓（ｈ）、肝臓（ｉ）、及び脾臓（ｊ）において検出されたオリゴヌクレオチドのレベル（モル／ｇ組織）を示している。ｃ～ｊにおいて、中実黒色丸＝Ｐ－ＰＭＯＡ及び中空四角＝Ｐ－ＰＭＯＢ。［図４（ｉ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ｃ～ｊは、心臓（ｃ）、横隔膜（ｄ）、腓腹筋（ｅ）、前脛骨筋（「ＴＡ」）（ｆ）、肺（ｇ）、腎臓（ｈ）、肝臓（ｉ）、及び脾臓（ｊ）において検出されたオリゴヌクレオチドのレベル（モル／ｇ組織）を示している。ｃ～ｊにおいて、中実黒色丸＝Ｐ－ＰＭＯＡ及び中空四角＝Ｐ－ＰＭＯＢ。［図４（ｊ）］オリゴヌクレオチドが注射されたマウスからのマウス血清及び組織におけるオリゴヌクレオチドの検出を示している。マウスに４．４ｍｇ／ｋｇでオリゴヌクレオチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ）を含む組成物の単回ボーラスでＩＶ注射し、Ｐ－ＰＭＯＡ（ａ）またはＰ－ＰＭＯＢ（ｂ）の濃度（ｐＭ）について示されているｘ軸に見られるように様々な時点で血清を分析した。ｃ～ｊは、心臓（ｃ）、横隔膜（ｄ）、腓腹筋（ｅ）、前脛骨筋（「ＴＡ」）（ｆ）、肺（ｇ）、腎臓（ｈ）、肝臓（ｉ）、及び脾臓（ｊ）において検出されたオリゴヌクレオチドのレベル（モル／ｇ組織）を示している。ｃ～ｊにおいて、中実黒色丸＝Ｐ－ＰＭＯＡ及び中空四角＝Ｐ－ＰＭＯＢ。

ペプチドにコンジュゲートされていないオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）及びペプチドにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド（Ｐ－ＰＭＯＡ及びＰ－ＰＭＯＢ）の測定された濃度（ｐＭ）を示している。ａは、所与のオリゴヌクレオチドが投与されたマウスからの血清及び様々な筋肉含有組織において検出されたオリゴヌクレオチドの絶対濃度を示している。ｂは、投薬されたオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＭＯまたはＰ－ＰＭＯ）の総モルに対して正規化されたオリゴヌクレオチドの濃度を示している。

血清（ａ）、心臓（ｂ）、横隔膜（ｃ）、ＴＡ（ｄ）、及び大腿四頭筋（ｅ）において測定された、６ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または４０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド（Ｐ－ＰＭＯとして）の投与後の経時的なマウスにおけるオリゴヌクレオチド濃度を示している。

定義
本出願において、別段文脈から明らかでない限り、（ｉ）用語「ａ」は、「少なくとも１つ」を意味するために理解され得る；（ｉｉ）用語「または」は、「及び／または」を意味するために理解され得る；（ｉｉｉ）用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、それ自体でまたは１つ以上の追加の成分または工程と共に提示されるかどうかにかかわらず、項目として挙げられた成分または工程を包含することが理解され得る；（ｉｖ）用語「約」及び「およそ」は、当業者によって理解されるように標準偏差を許容することが理解され得る；（ｖ）端点が含まれる範囲が提供される。

投与：本明細書で使用される場合、用語「投与」は典型的には、組成物である、または組成物に含まれる薬剤の送達を達成するための対象またはシステムへの組成物の投与を指す。当業者は、適切な状況において、対象、例えば、ヒトへの投与のために利用され得る多様な経路を知っている。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼、経口、非経口、局所などであり得る。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支点滴による）、口腔内、皮膚（例えば、表皮、皮内、皮間、経皮などに対する局所の１つ以上であり、またはそれを含み得る）、腸内、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、心室内（脳室内）、特定の器官内（例えば、肝内）、粘膜、鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内注入による）、膣、硝子体などであり得る。いくつかの実施形態では、投与は、単回用量のみを含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、固定数の用量の適用を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間で隔てられた複数の用量）及び／または周期的（例えば、共通の期間によって隔てられた個々の用量）投薬である投薬を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間での連続投薬（例えば、かん流）を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、薬剤が投与された対象からのサンプル（例えば、組織、血清など）における特定の投与された薬剤の濃度を決定するための診断またはモニタリングアッセイの１つ以上の結果に依存し得る。

ヌクレアーゼ：本明細書で使用される場合、用語「ヌクレアーゼ」は、結合を切断することが可能なポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、結合は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合である。いくつかの実施形態では、結合は、ペプチドとオリゴヌクレオチドとの間である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、一本鎖特異的ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、マングビーンヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼである。

核酸：本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖であり、またはそれに組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介するオリゴヌクレオチドであり、またはそれに組み込まれ得る化合物及び／または物質である。文脈から明らかであるように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指す；いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであり、またはそれを含む；いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、「核酸」は、核酸分子を指す。例えば、いくつかのそのような実施形態では、核酸は、ヌクレオチドまたはそのアナログを含む一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指し得る。そのような核酸はまた、用語「ポリヌクレオチド」と称され、及び／またはそれと互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に一本鎖である；いくつかの実施形態では、核酸は、部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然核酸残基であり、それを含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の合成核酸残基であり、それを含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸アナログであり、それを含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸アナログは、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、当該技術分野で知られている１つ以上の「ロック核酸」であり、それを含み、またはそれからなる。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’ＯＭｅＰ）である。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補性テンプレートに基づく重合による酵素合成（ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ）、組換え細胞またはシステムにおける複製、及び化学的合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００またはそれ以上の残基長である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。

オリゴヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、それを必要とする対象の意図に即して設計され得る、及び／またはそれを必要とする対象に投与され得る核酸のポリマーを指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含み、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）として機能する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０またはそれ以上の核酸塩基長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、複数のタイプの本明細書に記載される核酸であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、それを必要とする対象に投与される場合、ＡＳＯの非存在下では生成されない標的タンパク質またはその機能的部分の生成を容易化し得るＡＳＯである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、Ｐ－ＰＭＯ）にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結２’－Ｏ－メチルＲＮＡ（２’ＯＭｅＰ）である。

オリゴヌクレオチドプローブ：本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチドプローブ」は、アッセイ（例えば、検出アッセイ）において使用され得る核酸のポリマーを指す。本開示において、オリゴヌクレオチドプローブはまた、用語「プローブ」と称され、またはそれと互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドまたは候補オリゴヌクレオチドの存在または非存在を検出するように設計されたアッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドプローブ。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドを含むサンプルと接触する。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に記載される方法は、オリゴヌクレオチドプローブが検出するように設計されたオリゴヌクレオチドの存在及び、適切な場合、量を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ヌクレオチドまたはそのアナログを含む一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、複数のタイプの本明細書に記載される核酸であり、またはそれを含む。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ホスホロチオエート核酸（「ＰＴＯ」）及びＤＮＡ（ＰＴＯ／ＤＮＡ）であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ロック核酸及びＤＮＡ（ＬＮＡ／ＤＮＡ）を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＰＴＯまたはＬＮＡは、提供されたオリゴヌクレオチドプローブの５’及び３’末端に局在化されている。いくつかの実施形態では、提供されたオリゴヌクレオチドプローブの５’及び３’末端におけるＰＴＯまたはＬＮＡ残基の数は同じではない。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端は、３つのＬＮＡを有し得、その３’末端は、５つまた６つのＬＮＡを有し得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブにおけるヌクレオチドの特定の組み合わせ（例えば、ＬＮＡ／ＤＮＡ）は、ヌクレオチドの他の組み合わせ（例えば、ＰＴＯ／ＤＮＡ）と比較してアッセイ（例えば、検出アッセイ）において１つ以上の利点を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０核酸塩基長である。

一本鎖特異的ヌクレアーゼ：本明細書で使用される場合、用語「一本鎖特異的ヌクレアーゼ」は、一本鎖核酸ポリマーにおける結合を優先的に切断するヌクレアーゼを指す。いくつかの実施形態では、核酸ポリマーは、オリゴヌクレオチドプローブである。いくつかのそのような実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、過剰量で混合物に存在し、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、洗浄及び／または除去のためにプローブを切断する。いくつかのそのような実施形態では、複数のヌクレアーゼは、順次、または同時に使用される。いくつかの実施形態では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、マングビーンヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼである。

対象：本明細書で使用される場合、用語「対象」は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、いくつかの実施形態では出生前ヒト形態を含む）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害または病態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または病態にかかりやすい。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または病態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または病態のいかなる症状または特徴も示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または病態の感受性またはリスクに特有の１つ以上の特徴を有する人である。いくつかの実施形態では、対象は、患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または療法が適用される、及び／または適用された個体である。
［発明を実施するための形態］

本開示は、オリゴヌクレオチドが投与された対象のサンプルにおけるオリゴヌクレオチドを検出する方法を記載する。特に、本開示は、１つ以上のオリゴヌクレオチドが投与された対象からの１つ以上のサンプルにおける１つ以上のオリゴヌクレオチドを定量及び／または特定する方法を記載する。本明細書に記載の方法は、以前から利用可能なアッセイと比較して、予期しない感度、精度、及び再現性のある検出方法を提供する。

検出方法
本開示は、とりわけ、所与のサンプルにおけるオリゴヌクレオチドを検出する方法を提供する。これらの検出方法は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドを検出するための任意の以前から利用可能なアッセイよりもはるかに感度、精度、及び再現性がある。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの検出のために使用されるアッセイは、オリゴヌクレオチドプローブ共にインキュベーションする工程、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプローブを含む混合物を捕捉剤を含む表面と共にインキュベーションする工程、表面と共にインキュベーションされた混合物について１つ以上の消化工程を実施する工程、続いて、サンプルを、基材及びサンプルにおけるオリゴヌクレオチドを検出及び／または定量するための検出剤と接触させることを含む１つ以上の工程を実施する工程を含む。

いくつかの実施形態では、サンプルは、オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＰＭＯである。いくつかの実施形態では、サンプルは、オリゴヌクレオチドがｉｎｖｉｔｒｏで添加された血清または組織を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、オリゴヌクレオチドが投与された対象からの血清または組織を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、オリゴヌクレオチドが投与されなかった対象からの血清または組織を含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの存在及び／または量は、オリゴヌクレオチドプローブを使用して検出される。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを含むサンプルをオリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベーションすることは、オリゴヌクレオチドプローブとオリゴヌクレオチドの一部とのハイブリダイゼーションをもたらす。

いくつかの実施形態では、検出方法は、サンプルをオリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベーションする工程を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションまたはインキュベーションは、アニーリングを含む。いくつかの実施形態では、アニーリングを含むそのようなハイブリダイゼーションまたはインキュベーションは、１つ以上のアニーリング温度で行われる。いくつかのそのような実施形態では、アニーリング温度は、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、または６５℃である。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを含むサンプルは、オリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベーションする前に１つ以上の消化工程に供されて、オリゴヌクレオチド及び／またはサンプルからペプチドが切断され、除去される。いくつかの実施形態では、１つ以上の消化工程は、ヌクレアーゼ（例えば、トリプシン）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の消化工程は、複数のヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ペプチドとオリゴヌクレオチドとの間の結合を切断するヌクレアーゼである。

いくつかの実施形態では、検出方法は、サンプル／オリゴヌクレオチドプローブ混合物を、捕捉剤で被覆されたプレートと共にインキュベーションする工程を含む。いくつかのそのような実施形態では、捕捉剤は、オリゴヌクレオチドプローブに（例えば、共有結合した標識を介して）結合し、それによりオリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプレートと関連付けさせる。

いくつかの実施形態では、検出方法は、サンプル／オリゴヌクレオチドプローブ混合物が捕捉剤で被覆されたプレートと共にインキュベーションされた後にプレートを洗浄する工程を含む。いくつかのそのような実施形態では、洗浄は、プレートと関連付けられていないオリゴヌクレオチドプローブ及び／またはオリゴヌクレオチドを除去する。

いくつかの実施形態では、検出方法は、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブが関連付けられているプレート（このオリゴヌクレオチドプローブはそれぞれ、オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされている場合があり、またはされていない場合がある）を１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む。いくつかの実施形態では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、一本鎖特異的ヌクレアーゼは、マングビーンヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ミクロコッカスヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼはいずれとも、本明細書に記載される検出方法において使用される。

いくつかのそのような実施形態では、インキュベーションは、ミクロコッカスヌクレアーゼとのインキュベーションと、それに続くマングビーンヌクレアーゼとのインキュベーションを含む。いくつかのそのような実施形態では、ミクロコッカスヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼとのインキュベーション間にプレートを洗浄する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、ミクロコッカスヌクレアーゼのみを含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、マングビーンヌクレアーゼのみを含む。同じヌクレアーゼ（例えば、マングビーンヌクレアーゼ）を含む実施形態では、任意の洗浄工程が、第１のインキュベーションと第２のインキュベーション（例えば、いずれとも同じヌクレアーゼを含むインキュベーション）との間に含まれ得る。

いくつかの実施形態では、ミクロコッカスヌクレアーゼ及び／またはマングビーンヌクレアーゼは、過剰の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを優先的に切断する。いくつかの実施形態では、マングビーンヌクレアーゼは、そのような切断についてミクロコッカスヌクレアーゼよりも高い特異性を有する。

いくつかの実施形態では、１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションされた基材は、検出剤と共にさらにインキュベーションされる。いくつかの実施形態では、検出剤が１つ以上の成分と共にインキュベーションされる場合、検出可能なシグナルが生成される。いくつかのそのような実施形態では、検出剤は、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、共有結合した標識を有する）と相互作用して検出可能なシグナルを生成する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、オリゴヌクレオチドプローブがオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみ生成される。

いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルが検出される。いくつかの実施形態では、検出は、比色分析である。いくつかの実施形態では、検出は、非比色分析である。いくつかのそのような実施形態では、検出は、光学的密度の測定であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、検出は、設定された励起波長及び／または発光波長を使用する蛍光検出を使用して決定される。

いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、プローブ特異的標的化部位を使用して生成される。いくつかの実施形態では、プローブ特異的標的化部位は、コンジュゲートされた酵素剤（例えば、抗体酵素コンジュゲート）を含む。いくつかの実施形態では、プローブ特異的標的化部位コンジュゲートは、抗体コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートは、酵素部位（例えば、アルカリホスファターゼ）にコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を含む。いくつかの実施形態では、好適な基質（例えば、好適なアルカリホスファターゼ基質、例えば、２’－［２－ベンゾチアゾイル］－６’－ヒドロキシベンゾチアゾールホスフェート［ＢＢＴＰ］）がアッセイプレートに添加され、後続の反応が行われて、蛍光シグナルの生成が可能となるように好適な時間インキュベーションされる。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの生成を可能とするための好適な期間は、２時間未満、９０分未満、６０分未満、４５分未満、または３０分未満である。いくつかの実施形態では、蛍光シグナルの生成を可能とするための好適な期間は、適切には３０分である。いくつかの実施形態では、蛍光励起は、４００～５００ｎｍの範囲、４１０～４９０ｎｍの範囲、４２０～４８０ｎｍの範囲、４３０～４７０ｎｍの範囲、４４０～４６０ｎｍの範囲、４４０～４５０ｎｍの範囲、またはおよそ４４４ｎｍで生じる。いくつかの実施形態では、蛍光発光検出は、５００～６００ｎｍの範囲、５１０～５９０ｎｍの範囲、５２０～５８０ｎｍの範囲、５３０～５７０ｎｍの範囲、５４０～５６０ｎｍの範囲、５５０～５６０ｎｍの範囲、またはおよそ５５５ｎｍで生じる。当業者は、代替的な検出剤及び関連するシグナル検出方法が本明細書に記載されるアッセイにおいて使用するのに好適であり得ることを認識する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアッセイは、他の既存のまたは過去に使用されていたアッセイよりも低い検出レベルで所与のサンプルにおけるオリゴヌクレオチドの存在及び／または量を検出することが可能である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのレベルは、検出レベル未満である。いくつかの実施形態では、検出されるオリゴヌクレオチドのレベルは、所与のサンプルに含まれるすべてのオリゴヌクレオチドを検出する。いくつかの実施形態では、検出されるオリゴヌクレオチドのレベルは、対象に投与されたオリゴヌクレオチドの量と同等またはそれ未満である。いくつかのそのような実施形態では、同等またはそれ未満の量は、対象における希釈によるものであり、検出レベルによるものではない。すなわち、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドプローブを含む本明細書に記載されるアッセイは、所与のサンプルに存在するオリゴヌクレオチドの量を精確に定量することが可能である。

オリゴヌクレオチド設計
いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のオリゴヌクレオチドの検出において使用するための１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブを提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のタイプの核酸（例えば、ロック核酸及びデオキシリボ核酸）であり、またはそれを含む。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に記載の方法における本開示のオリゴヌクレオチドプローブの使用は、以前から利用可能な検出方法と比較して改善されたオリゴヌクレオチドの検出をもたらす。例えば、本明細書に記載される方法の使用は、所与のサンプルにおける１つ以上のオリゴヌクレオチドの検出において、サンプルにおけるオリゴヌクレオチドの検出のために以前から利用可能な方法と比較して改善された精度、感度、及び／または再現性を示す。

オリゴヌクレオチドプローブ
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上の核酸であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上の改変核酸であり、またはそれを含む。例えば、いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＰＴＯ及びＤＮＡ核酸であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、ＬＮＡ及びＤＮＡ核酸であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、例えば、ＰＴＯ及びＤＮＡまたは、例えば、ＬＮＡ及びＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドプローブは、ＰＴＯまたはＬＮＡ残基がオリゴヌクレオチドプローブの３’及び５’末端に存在し、かつＤＮＡを含む中央領域を挟むように配置される。いくつかの実施形態では、ＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、３’末端にビオチン標識及び／または５’末端にジゴキシゲニン標識を含む。

オリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＰＭＯであり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドに連結される（例えば、Ｐ－ＰＭＯを生成するために）。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドを含むサンプルは、オリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベーションする前に１つ以上の消化工程に供されて、オリゴヌクレオチド及び／またはサンプルからペプチドが切断され、除去される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが約１０～１００個の間のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが約１２～８５個の間のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが約１５～６０個の間のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが約２０～５０個の間のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、長さが約２５～３５個の間のオリゴヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチド検出アッセイの使用方法
本開示によって提供される洞察の前に、オリゴヌクレオチドを検出するための関連するアッセイは、再現性、精度、及び／または感度が制限されていた。本開示の方法は、いかなる特定の状況におけるオリゴヌクレオチド検出のいかなる特定のタイプの検出に制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの送達に対する患者の反応をモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、研究及び開発の進行中の候補オリゴヌクレオチドの有効性及び毒性の評価において使用され得る。

本開示は、前例のない感度を達成し、また、再現性及び精度を示す検出方法を提供する。そのような方法は、オリゴヌクレオチドの開発及び使用の任意の部分、例えば、前臨床候補スクリーニングから、患者からの１つ以上のサンプルにおけるオリゴヌクレオチドのレベルをｉｎｖｉｖｏでモニタリングすることまでのために使用され得る。いくつかの実施形態では、そのようなｉｎｖｉｖｏモニタリングには、例えば、全体血清レベルモニタリング、または、特定の器官または組織（例えば、筋肉）に到達するオリゴヌクレオチドの量を決定するためのその器官または組織からの特定のサンプルにおけるレベルのモニタリングが含まれ得る。いくつかの実施形態では、そのようなｉｎｖｉｖｏモニタリングには、例えば、器官または組織（例えば、腎臓、筋肉など）からのサンプルにおけるレベルを検出して、特定の器官または組織におけるオリゴヌクレオチドの負荷または濃度をモニタリングすることが含まれ得る。いくつかの実施形態では、器官または組織は、血液、血漿、血清、皮膚、肺、心臓、腓腹筋、二頭筋、前脛骨筋（ＴＡ）、大腿四頭筋、横隔膜、中枢神経系組織（例えば、脳、脊髄）、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上である。

いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に投与されたオリゴヌクレオチドを検出するための改善されたオリゴヌクレオチドプローブを利用する。例えば、いくつかの実施形態では、それを必要とする対象には、１つ以上のオリゴヌクレオチドが投与される。いくつかのそのような実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブは、対象に投与された及び／または投与されている１つ以上のオリゴヌクレオチドを検出するために設計及び使用され得る。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、オリゴヌクレオチドまたは候補オリゴヌクレオチドを投与すること及び／または検出することを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、複数のタイプのオリゴヌクレオチドを投与すること及び／または検出することを含む。

いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの検出は、投与後に行われる。いくつかの実施形態では、検出は、投与から約０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、４８、もしくは７２時間またはそれ以上後に行われる。いくつかの実施形態では、検出は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０週またはそれ以上後に行われる。いくつかの実施形態では、検出は、一定間隔で（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０週またはそれ以上毎に）実施される。いくつかの実施形態では、投与は、オリゴヌクレオチドの最初の投与である。いくつかの実施形態では、投与は、オリゴヌクレオチドの最新の投与であるが、必ずしも最初の投与である必要はない。

いくつかの実施形態では、サンプルは、オリゴヌクレオチドが投与された対象からの血清及び／または組織を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、オリゴヌクレオチドが投与されなかった対象（例えば、オリゴヌクレオチドまたはプラセボオリゴヌクレオチドを摂取した対照対象）からの血清及び／または組織を含む。

デュシェンヌ型筋ジストロフィー
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、筋肉変性／減耗をもたらすＸ連鎖潜性型の筋ジストロフィーであり、現在、最終的に死につながる。ＤＭＤは、およそ３５００人の男性のうち１人に発症する。ＤＭＤは、破壊されたリーディングフレーム及び機能性ジストロフィンタンパク質の発現及び／または生成のいくつかの、ほとんどの、またはすべての喪失をもたらすジストロフィン遺伝子の１つ以上の変化によって引き起こされる。ジストロフィンは、筋肉組織内の重要な構造的成分であり、ジストロフィンの変化または非存在は、筋肉細胞における異常な膜機能をもたらす。

ジストロフィン遺伝子はＸ染色体に位置し、男性（ＸＹ性染色体）は、その遺伝子についてヘミ接合性であり、典型的には女性よりも重度の症状を示し、進行することを意味する。症状は、早期身体障害及び死亡率を含むことが知られている。いくつかの場合では、男性の症状発達軌跡は、青年期までの可動性の喪失、十代後期までの呼吸及び心臓機能の欠陥、ならびに早期成人期における死亡を含み得る。一方、ヘテロ接合型ジストロフィン変異を保有する女性（ＸＸ性染色体）は典型的には、より軽度の表現型を示す。リーディングフレームを温存するジストロフィン遺伝子の変化は、より軽度の生命を脅かさないベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）をもたらす。

ジストロフィン遺伝子は、７９個のエクソンを有する大きなものであり、ＤＭＤにおける最も一般的な遺伝子的変化には、１つ以上のエクソンのゲノム欠失が含まれる。最も一般的には、そのような欠失は、その遺伝子のエクソン４４～５５の周りまたはその中及び／または５’末端における領域を含む。現在、ＤＭＤのための既知の治癒法はないが、コルチコステロイドの従前の使用に加えて、所定のアンチセンス－オリゴヌクレオチドベースの治療剤が、ＤＭＤを有する患者において使用するために承認されている。

オリゴヌクレオチドによって誘導されるエクソンスキッピングに基づく処置は、機能性タンパク質に翻訳される機能性ジストロフィンｍＲＮＡを生成するスプライシングプロセス中の標的化されたエクソンスキッピングを介して作用する。このプロセスは、ｐｒｅ－ｍＲＮＡにおける隣接エクソン－イントロン接合を互いに近接させ、イントロンの末端に存在するホスホジエステル結合の切断を可能とし、最終的にエクソンを一緒にスプライシングするための複雑な多重粒子細胞機構を使用する。当該技術分野で現在よく知られているように、所定のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の使用は、転写されたｐｒｅ－ｍＲＮＡ分子における所定のエラーが、スプライシングされるときに成熟コーディングｍＲＮＡ転写産物からバイパスまたは除去されることを容易化し得る。例えば、ジストロフィン遺伝子のアウトオブフレーム変異のスキッピングは、リーディングフレームの復元及び機能性の（切断型ではあるが）ジストロフィンタンパク質の生成をもたらし得る。

ＤＮＡ及び／またはＲＮＡ骨格またはそのアナログに基づく様々なタイプのオリゴヌクレオチド、ならびに改善された細胞浸透のための様々なタイプのペプチドに対するオリゴヌクレオチドコンジュゲートが存在する。それにもかかわらず、患者からのサンプルにおけるそのようなオリゴヌクレオチドを精確かつ感度よく検出する能力のアンメットニーズが依然として存在する。処置がオリゴヌクレオチドの使用を含むことになる場合、それらのオリゴヌクレオチドの精確で、感度がよく、再現性のある検出が可能となることが極めて重要である。本開示によって提供される技術は、そのようなオリゴヌクレオチドの精確で、感度がよく、再現性のある検出を提供する。

本開示は、以下の実施例によってさらに説明される。この実施例は、例示的な目的のためにのみ提供される。本開示の範囲または内容をどのようにも限定するものとして解釈されるべきではない。

本開示は、サンプルにおける１つ以上のオリゴヌクレオチドを検出する方法を例示する。

実施例１：オリゴヌクレオチド検出アッセイ
本例は、サンプルにおけるオリゴヌクレオチドの検出のための例示的なアッセイを記載する。本開示のアッセイは、オリゴヌクレオチドを検出するために使用される任意の現在利用可能なアッセイを上回り、それを超える検出能力を驚くべきことに有意に改善する。本明細書に記載のアッセイは、他の利用可能な検出方法と比較して、改善された精度、感度及び再現性を示す。

本例では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（Ｐ－ＰＭＯ）として、ペプチド及びオリゴヌクレオチドを含む組成物において最初に提供された。

プローブ配列及び設計
本アッセイは、オリゴヌクレオチドの検出のためのロック核酸（ＬＮＡ）／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを使用した。ＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、各オリゴヌクレオチドプローブの５’及び３’末端でＬＮＡ塩基を用いて設計し、図２のように、ホスホロチオエート（ＰＴＯ）／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブと比較した（ＰＴＯ／ＤＮＡプローブの説明については、例えば、Ｂｕｒｋｉｅｔａｌ．，２０１５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２５（５），ｐｐ．２７５－８４を参照されたい）。

例示的な配列及びオリゴヌクレオチド
本例では、オリゴヌクレオチドは、ペプチドがコンジュゲートされたアンチセンスオリゴヌクレオチド及びペプチドにコンジュゲートされていないアンチセンスオリゴヌクレオチドから誘導した。具体的には、図２ａに示されているように、配列（５’－ＧＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＣＣＴＧＡＡＡＴ－３’；配列番号１）を有するマウスジストロフィンエクソン２３（Ｍ２３Ｄ）に対する２５－ｍｅｒのＰＭＯアンチセンス配列をインハウスで設計し、商業的オリゴヌクレオチド供給業者に発注した。ペプチドがコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドについては、Ｍ２３ＤＰＭＯと２つの細胞浸透性ペプチド（Ｐ－ＰＭＯＡ及び／またはＰ－ＰＭＯＢを生成するためのペプチドＡまたはＢ）（その各々は１８アミノ酸を含有する）のうち１つとのコンジュゲーションによってペプチド－ＰＭＯ（「Ｐ－ＰＭＯ」）を合成した。

オリゴヌクレオチドプローブ
Ｐ－ＰＭＯＡ及びＰ－ＰＭＯＢの各々のための相補性オリゴヌクレオチドプローブを設計し、Ｅｘｉｑｏｎ（ＬＮＡ／ＤＮＡプローブ；Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）またはＩＤＴ（ＰＴＯ／ＤＮＡプローブ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）に発注した。図２ａに示されているように、Ｍ２３ＤＰＭＯのためのオリゴヌクレオチドプローブは、「切断型」１９－ｍｅｒＬＮＡ／ＤＮＡプローブ（３’－ＴＴＴＧＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴ－５’；配列番号２；図２ａにおいて太字で強調され、下線が引かれているＬＮＡ塩基）及び「全長」２５－ｍｅｒＰＴＯ／ＤＮＡプローブ（３’－ＣＣＧＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣＧＡＡＴＧＧＡＣＴＴＴＡ－５’；配列番号３；図２ａにおいて太字で強調されているＰＴＯ塩基）。両方のプローブをアッセイ開発中に試験し、アッセイ方法論をまとめた後、切断型プローブをすべての後続のアッセイ（例えば、定量アッセイ、例えば、ＰＭＯレベルのｉｎｖｉｖｏ検出及び定量など）のために使用した。両方のオリゴヌクレオチドプローブを３’末端でビオチンで及び５’末端でジゴキシゲニンで二重標識した。凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドプローブをヌクレアーゼ非含有水に１０μＭで懸濁してストック溶液を調製した。ＰＭＯ及びＰ－ＰＭＯを蒸留水に１０ｍｇ／ｍｌストックで懸濁した。プローブを分注し、－２０℃で保存し、ＰＭＯ及びＰ－ＰＭＯを分注し、－７０℃で保存した。すべてのプローブ、ＰＭＯ、及びＰ－ＰＭＯを６５℃で１５分間加熱し、簡潔にボルテックスしてからＥＬＩＳＡを開始した。

ＥＬＩＳＡベースの検出アッセイ
５．０％マウス血清中の標準曲線及び品質対照のためのＰＭＯまたはＰ－ＰＭＯ段階希釈物、ならびに５．０ｍｇ／ｍｌまたは１．０ｍｇ／ｍｌ組織ホモジネートを、５１．２ｎＭのＰＭＯ／Ｐ－ＰＭＯの開始濃度を用いて０．１％ｖ／ｖのＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００が補充された１ｘＴＥ緩衝液を使用して作製した。血清サンプルを２０倍希釈し、組織をホモジナイズし、同じ緩衝液で５．０ｍｇ／ｍｌまたは１．０ｍｇ／ｍｌ組織ホモジネートまで希釈した。２００μＬのキャリブレータ溶液、品質対照、及び／またはサンプルをサーモミキサーＣ（６００ｒｐｍ）でディープ１．０－ｍＬ９６ウェルプレートで３７℃で一晩、２０μＬの４０ｍｇ／ｍｌトリプシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから凍結乾燥粉末として購入した）で処置して、ペプチド成分を切断し、ＰＭＯを放出させた。４０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（０．１％血清を有する）中の２．５ｎＭオリゴヌクレオチドプローブを各ウェルに添加した。次いでプレートを密閉し、６５℃で１５分間（６００ｒｐｍ）インキュベーションし、室温で１５分間冷却した。次いでプレートを５０℃で３０分間（５００ｒｐｍ）インキュベーションしてオリゴヌクレオチドプローブをＰＭＯとハイブリダイズさせた。次いで１５０マイクロリットルのハイブリダイズした溶液をＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎで被覆されたプレート（洗浄緩衝液：５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．６、０．１％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を使用して事前洗浄した－すべての後続洗浄工程のために同じ洗浄緩衝液を使用した）に移し、３７℃で３０分間インキュベーションして、ビオチン標識プローブをＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎで被覆されたプレートに結合させた。次いでプレートを３回洗浄し、１５０μＬの０．２Ｕ／μｌのミクロコッカスヌクレアーゼ（５０ｍＭトリス－ＨＣＬ；ｐＨ８．２、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ、及び０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン中）を各ウェルに添加し、３７℃で１．５時間（１５０ｒｐｍ）インキュベーションした。次いでプレートを３回洗浄し、１２０μＬの０．３Ｕ／μＬのマングビーンヌクレアーゼ（３０ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ８．２、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、１ｍＭのＺｎＳＯ４；ｐＨ５．０中）を各ウェルに添加し、３７℃で１．５時間（１５０ｒｐｍ）インキュベーションした。プレートを３回洗浄し、１５０μＬのアルカリホスファターゼにコンジュゲートされた抗ジゴキシゲニン抗体を０．２５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０を有するＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（ＴＢＳ）ブロッキング緩衝液に１：５，０００の希釈率で添加し、３７℃で３０分間インキュベーションし、３回洗浄した。次いで、１２５μＬのＡｔｔｏＰｈｏｓ基質を各ウェルに添加し、プレートをアルミニウムホイル内に密閉し、３７℃で３０分間（１５０ｒｐｍ）インキュベーションした。４４４ｎｍの励起及び５５５ｎｍの発光での蛍光の強度をＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｅｒｖｉｃｅＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭＴ５マイクロプレートリーダーによって測定した。

ＰＴＯ／ＤＮＡ対ＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブ

本例のＥＬＩＳＡベースの検出アッセイにおいて比較した場合、ＰＴＯ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドが６４ｐＭ未満で存在した場合に最小蛍光シグナルをもたらした（図２ｂ及び２ｃを参照されたい）。驚くべきことに、対照的に、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドプローブは、低いオリゴヌクレオチド濃度の場合を含めて、ＰＴＯ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブよりも有意に高い蛍光シグナルをもたらした。シグナル対ノイズ比及び定量限界も、ＰＴＯを含有するオリゴヌクレオチドプローブと比較して、ＬＮＡを含有するオリゴヌクレオチドプローブを使用して改善された。例えば、ＰＴＯ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブについての定量の下限（「ＬＬＯＱ」）は、８ｐＭ未満であり（Ｓ：Ｎは２未満となった；以下の表１を参照されたい）、このタイプのプローブについての過去の報告（Ｂｕｒｋｉｅｔａｌ．，２０１５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２５（５），ｐｐ．２７５－８４）と一致している。対照的に、２ｐＭの濃度のオリゴヌクレオチドがＬＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出され、着実なＳ：Ｎが観察された（Ｓ：Ｎ＝５．２）。

アニーリング及び消化
本例はまた、既存のアッセイに対する所定の手順的改変を記載し、これは驚くべきことにかつ有意に、精度、再現性を改善し、サンプルにおけるオリゴヌクレオチドの検出限界をピコモル濃度まで低下させた。

本実施例では、アニーリング温度及び消化条件の両方を変化させ、分析した（図２ｄ及び２ｅを参照されたい）。オリゴヌクレオチドアニーリング温度を既存のアッセイのものと比べて上昇させた場合、シグナルの改善が観察された（図２ｄ）。シグナル強度は、マングビーン（ＭＢ）ヌクレアーゼを使用する第２の消化工程の存在または非存在下で未変化であった（図２ｅ）。しかしながら、残留一本鎖オリゴヌクレオチドがマングビーン（ＭＢ）ヌクレアーゼの存在下で、特にｐＨ５で消化された場合、Ｓ：Ｎは改善された（以下の表２を参照されたい）。

検出アッセイをマウス血清において定量した。５％マウス血清に希釈された既知の濃度のＰＭＯをスパイク・インすることによって作製された少なくとも８つの調製された標準（キャリブレータ）を使用して標準曲線の精度及び再現性を分析した。図３ａ及び３ｂは、４つの異なる血清で調製され、２つの独立したアッセイで実行されたＰ－ＰＭＯ標準を用いた検出アッセイの再現性及び精度を示している。品質対照サンプルは、逆算された濃度が２５％未満のＣＶを有していた場合に許容可能とみなされた。表３及び４は、異なるＰ－ＰＭＯを使用した異なる血清調製物におけるアッセイの精度を示している。ＣＶは概して、１ｐＭのＬＬＯＱでのＰ－ＰＭＯＡの検出（２９．７％）を除き、２０％未満であった。バッチ間変動は、１ｐＭでのＰ－ＰＭＯＡ（２０．３％）を除き、アッセイ間で２０％未満であった。

この実施例に記載の検出アッセイをまた、いくつかのマウス組織を利用して検証した。アッセイは、トリプシン消化（この消化は、ＰＭＯからペプチド（「Ｐ」）を切断する）後のＰＭＯのレベルを検出及び測定する。Ｐ－ＰＭＯレベルは、本明細書に記載されるようなアッセイによって決定されるＰＭＯレベルの検出を介して推定される。組織におけるＰＭＯ取り込みは少ないこと、及びＰ－ＰＭＯを生成するためのペプチドコンジュゲーションは、組織への取り込みを容易化することが知られている；よって、組織において検出されたＰＭＯの大部分は、Ｐ－ＰＭＯによって媒介された取り込みによるものと推測される。表５は、表に列挙されたこれらの組織にわたるＬＬＯＱで得られた平均検出値を示している。変動は、アッセイにわたって、どのＰ－ＰＭＯが使用されたかとは無関係に、分析されたすべての組織について２５％未満であった。

ｉｎｖｉｖｏサンプルを使用した動的検出
ＣＤ１マウスにおいてＰ－ＰＭＯＡの血清レベル（ＰＭＯの測定による）を２週間の期間にわたって測定した。Ｐ－ＰＭＯレベルをオリゴヌクレオチドプローブを使用して決定して、その送達ペプチドにコンジュゲートされたＰＭＯのレベルを検出した。図４ａは、５分後の２．３μＭ（－／＋０．２μＭ）の初期血清濃度を示している；左パネル及び右パネルは同じデータを示しているが、右パネルは分割されたｘ軸を有する）。

検出されたＰ－ＰＭＯＡ濃度は、最初の８時間にわたって急速に低下し、その時、検出された濃度は３．３ｎＭ（－／＋１．１ｎＭ）であった。Ｐ－ＰＭＯＡ血清レベルは、１週間比較的安定のままであり、その時、検出された濃度は１．２ｎＭ（－／＋０．３８ｎＭ）であった。２週後、検出された濃度は６０９ｐＭ（－／＋３２７ｐＭ）であった。Ｐ－ＰＭＯＢを分析した場合に同様のデータが観察された（図４ｂ）。

図４ｃ、４ｄ、４ｅ、４ｆ、４ｇ、４ｈ、４ｉ、及び４ｊに示されているように、いくつかの組織におけるＰ－ＰＭＯレベルも決定した。標的組織（心臓、横隔膜、腓腹筋、前脛骨筋（ＴＡ））において、検出可能なＰ－ＰＭＯ濃度が初期低下した（０．５～２時間の時点）。その後、これらの組織において検出されたＰ－ＰＭＯ濃度は、少なくとも３日間、相対的に一定のままであった。Ｐ－ＰＭＯレベルは、研究全体を通して検出可能（かつ定量可能）なままであった。最初の通過器官（例えば、肺、腎臓）において、より高い濃度のＰ－ＰＭＯが検出された。経時的かつ投薬から３日後、Ｐ－ＰＭＯ濃度は着実に低下した。腎臓におけるクリアランスは遅くなり、オリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ）についての既知のクラスの効果と一致する。Ｐ－ＰＭＯＡ及びＰ－ＰＭＯＢはいずれとも、分析された各時点で血清及びすべての組織において同様の薬物レベルを示した。

オリゴヌクレオチドの持続性を試験するために、血清及び様々な組織をまた、最後の投薬後２週間分析した。ＰＭＯ及びＰ－ＰＭＯで処置されたマウスの両方についての血清レベルは、１ｎＭの範囲内で測定された。この時点で、組織における全体のオリゴヌクレオチドレベルも同様であった（図５ａ）。

投与された用量の差を説明するために、薬物レベル（例えば、Ｐ－ＰＭＯＡ及びペプチドにコンジュゲートされていない対応するＰＭＯ）を投薬された総モル数に対して正規化した。図５ｂは、投薬されたＰ－ＰＭＯのモル数が、ペプチドにコンジュゲートされていないＰＭＯのモル数の４３分の１であったが、Ｐ－ＰＭＯは、血清及び組織においてペプチドにコンジュゲートされていないＰＭＯよりもはるかに高い濃度で検出されたことを実証している。さらに、そのオリゴヌクレオチド濃度は、Ｐ－ＰＭＯ処置後にいくつかの標的組織においてペプチドにコンジュゲートされていないＰＭＯでの処置と比較して少なくとも６０倍高かった。

これらのデータは、最後の投薬後少なくとも２週間、オリゴヌクレオチドを検出するための本アッセイの予想外の感度を実証している。投与後のさらに長い期間の後のオリゴヌクレオチドレベルの評価は、例えば、オリゴヌクレオチドレベルが有効性と相関し得る場合、臨床的に有用となり得るであろう。よって、この実施例に記載の本検出アッセイの感度を決定するために、血清及びいくつかの筋肉組織におけるＰＭＯレベルを、薬物投与後（例えば、オリゴヌクレオチド投与後、例えば、Ｐ－ＰＭＯ投与後）１３週間モニタリングした。図６ａは、Ｐ－ＰＭＯＢが、投与後最大で４週間、６または１２ｍｇ／ｋｇで投薬されたマウスの血清において検出可能であったが、アッセイの検出限度内で投与後８週までに検出可能ではなくなったことを示している。２０及び４０ｍｇ／ｋｇの用量で、Ｐ－ＰＭＯＢは、投与後８週の時点で血清において依然として検出可能であったが、１３週までにもはや検出可能ではなくなった。所定の例示的な骨格筋（６ｂ心臓、６ｃ横隔膜、６ｄＴＡ、及び６ｅ大腿四頭筋）の分析は、投与後最大で１３週間（研究の継続期間）ですべての組織において検出可能なオリゴヌクレオチドを示した。

任意の他の利用可能なアッセイと比べた本開示のアッセイの利点は、他のアッセイによって過去に検出不可能であったレベルでの検出のための本明細書に記載の方法を使用して、投与後１３週の時点でＰ－ＰＭＯレベルの信頼できる精確な定量を可能とする感度の上昇によって実証される。投与後１３週の時点で検出された平均Ｐ－ＰＭＯ濃度は、心臓において３～１０ピコモル／ｇ；横隔膜において１～９０ピコモル／ｇ；ＴＡにおいて１．８～１５．８ピコモル／ｇ；及び大腿四頭筋において０．６～５．７ピコモル／ｇであった。

重要なことに、本明細書に記載のアッセイにおいて検出された極めて低濃度のオリゴヌクレオチドは、他の過去に記載されたアッセイ（Ｂｕｒｋｉｅｔａｌ．，２０１５，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２５（５），ｐｐ．２７５－８４）ではそのような低いレベルで検出可能でも定量可能でもなく、本開示のアッセイの優位性を実証している。また、２つの異なるｉｎｖｉｖｏ研究からのデータ（図４及び６におけるデータによって表される）を、ｉｎｖｉｔｒｏサンプルを用いたＥＬＩＳＡアッセイ（例えば、図１におけるものなど）を使用して得られたデータと比較した場合、結果は同様であり、本開示のアッセイ（複数可）の再現性を実証している。心臓、ＴＡ及び横隔膜についての１週目のデータを（６ｍｇ／ｋｇの用量で図４及び図６に示される研究間で）比較し、いくつかの個々の外れ値（ＴＡ及び横隔膜についてそれぞれ２つ）が存在したが、データ（外れ値を除く）は研究間で全体的に同等であり、再現性があった。２つの異なる研究からのレベルは、図４及び図６に示されるデータでそれぞれ表されているように、アッセイされた各組織について１週目の時点で以下のとおりであった：心臓、３６対５５ピコモル／ｇ；横隔膜、４２対４３ピコモル／ｇ；ＴＡ、１５対２３ピコモル／ｇ。
表

均等物
本発明をその詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示し、限定しないことが意図されていることを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims

（ａ）オリゴヌクレオチドを含むサンプルをオリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベーションする工程であって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記サンプルにおける前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする、前記インキュベーションする工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、捕捉剤で被覆された基材と共にインキュベーションする工程であって、前記捕捉剤は、前記オリゴヌクレオチドプローブと結合し、それにより過剰オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを前記基材と関連付けさせ、前記ハイブリダイズしたプローブが前記基材と関連付けられた後にプレートを任意に洗浄する、前記インキュベーションする工程；
（ｃ）工程（ｂ）の後の前記基材を、前記基材について異なる特異性を有する２つ以上の異なる一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションする工程であって、前記基材は、工程（ｃ）の前、間または後に１つ以上の洗浄溶液で任意に洗浄され、前記オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、１回の洗浄工程または複数の洗浄工程中に前記基材に関連付けられたままである、前記インキュベーションする工程；
（ｄ）工程（ｃ）の後の前記基材を検出剤と共にインキュベーションする工程であって、前記検出剤は、前記オリゴヌクレオチドプローブと相互作用して検出可能なシグナルを生成する、前記インキュベーションする工程；ならびに
（ｅ）前記検出可能なシグナルを検出する工程
を含む、方法。
（ａ）ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）を含むサンプルをオリゴヌクレオチドプローブとインキュベーションする工程であって、前記オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のロック核酸（ＬＮＡ）残基を含み、前記サンプルにおけるＰＭＯとハイブリダイズする、前記インキュベーションする工程；
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、捕捉剤で被覆された基材と共にインキュベーションする工程であって、前記捕捉剤は、前記オリゴヌクレオチドプローブと結合し、それにより前記オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたＰＭＯを前記基材と関連付けさせる、前記インキュベーションする工程；
（ｃ）工程（ｂ）の後の前記基材を１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションする工程であって、前記基材は、工程（ｃ）の前、間または後に任意に洗浄され、前記オリゴヌクレオチドプローブ及びハイブリダイズしたＰＭＯは、１回の洗浄工程または複数の洗浄工程の間に前記基材に関連付けられたままである、前記インキュベーションする工程；
（ｄ）工程（ｃ）の後の前記基材を検出剤と共にインキュベーションする工程であって、前記検出剤は、前記オリゴヌクレオチドプローブと相互作用して検出可能なシグナルを生成する、前記インキュベーションする工程；ならびに
（ｅ）前記検出可能なシグナルを検出する工程
を含む、方法。
工程（ｃ）は、前記基材をミクロコッカスヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む、請求項１に記載の方法。
工程（ｃ）は、前記基材を前記ミクロコッカスヌクレアーゼと共にインキュベーションし、次いで前記基材を前記マングビーンヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む、請求項３に記載の方法。
前記基材は、前記ミクロコッカスヌクレアーゼと共にインキュベーションされた後、前記マングビーンヌクレアーゼと共にインキュベーションされる前に洗浄される、請求項４に記載の方法。
前記サンプルは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）を含む、請求項１に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のロック核酸（ＬＮＡ）残基を含む、請求項１に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）残基を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドプローブは、ＬＮＡ残基をそれぞれ含む５’末端セグメント及び３’末端セグメントによって挟まれたＤＮＡ残基から構成される中央セグメントを含む、請求項２または７に記載の方法。
前記中央セグメントは、５～２０個の間のＤＮＡ残基から構成される、請求項９に記載の方法。
前記５’及び３’末端セグメントは、独立して、２～８個の間のＬＮＡ残基から構成される、請求項１０または１１に記載の方法。
工程（ｃ）は、前記基材を１つのみの一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む、請求項２に記載の方法。
工程（ｃ）は、前記基材を２つ以上の異なる一本鎖特異的ヌクレアーゼと共にインキュベーションすることを含む、請求項２に記載の方法。
前記基材は、前記２つ以上の異なる一本鎖特異的ヌクレアーゼと共に順次インキュベーションされ、前記基材は、各インキュベーション後に洗浄される、請求項１３に記載の方法。
前記基材は、前記２つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼと共に同時にインキュベーションされる、請求項１３に記載の方法。
前記１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼを含む、請求項２に記載の方法。
前記１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼは、マングビーンヌクレアーゼを含む、請求項２に記載の方法。
前記１つ以上の一本鎖特異的ヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを含む、請求項２に記載の方法。
前記１つのみの一本鎖特異的ヌクレアーゼは、マングビーンヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
前記２つ以上の異なるヌクレアーゼは、ミクロコッカスヌクレアーゼ及びマングビーンヌクレアーゼを含む、請求項１３または１４に記載の方法。
前記サンプルは組織から得られ、前記方法は、工程（ｅ）で検出された前記検出可能なシグナルのレベルに基づいて前記組織におけるＰＭＯのレベルを定量する工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
前記組織は、血液、腎臓、肝臓、胃腸、肺、筋肉、脾臓、脳、脊髄、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２１に記載の方法。
前記血液組織は、血漿または血清であり、またはそれを含む、請求項２２に記載の方法。
前記筋肉組織は、横隔膜、腓腹筋、二頭筋、前脛骨筋（ＴＡ）、心臓、及び／または大腿四頭筋である、請求項２２に記載の方法。
前記サンプルは、２０～３０個の連続ヌクレオチドの配列を含むＰＭＯを含み、哺乳動物ジストロフィン遺伝子の少なくとも１つのエクソンから選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
少なくとも１つのエクソンは、エクソン２３、４４、４５、４６、５１、または５３から選択される、請求項２５に記載の方法。
前記哺乳動物ジストロフィン遺伝子は、ヒトジストロフィン遺伝子である、請求項２５または２６に記載の方法。
前記ＰＭＯは、患者に過去に送達されており、前記ＰＭＯは、送達のためにペプチドにコンジュゲートされていた（Ｐ－ＰＭＯ）、請求項２～２７のいずれか１項に記載の方法。
Ｐ－ＰＭＯの組織分布を評価する方法であって、前記方法は、前記Ｐ－ＰＭＯが投与された対象の１つ以上の組織から得られた１つ以上のサンプルについて先行請求項のいずれか１項に記載の方法を実施することを含む、前記方法。
前記方法は、前記対象の２つ以上の組織から得られた２つ以上のサンプルについて実施される、請求項２９に記載の方法。
前記方法は、異なるＰ－ＰＭＯについて繰り返される、請求項２９または３０に記載の方法。
Ｐ－ＰＭＯが標的タンパク質の発現を調節する能力を評価する方法であって、前記方法は、Ｐ－ＰＭＯが投与された対象の組織から得られたサンプルについて先行請求項のいずれか１項に記載の方法を実施すること、及び前記組織における前記Ｐ－ＰＭＯに由来するＰＭＯのレベルを前記組織における前記標的タンパク質のレベルと比較することを含む、前記方法。
前記方法は、前記対象の２つ以上の組織から得られた２つ以上のサンプルについて実施される、請求項３２に記載の方法。
前記方法は、異なるＰ－ＰＭＯについて繰り返される、請求項３２または３３に記載の方法。
前記標的タンパク質は、ジストロフィンである、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。