JP6259000B2 - 筋緊張性ジストロフィーのためのタンパク質置換治療に関する組成物および方法 - Google Patents

筋緊張性ジストロフィーのためのタンパク質置換治療に関する組成物および方法 Download PDF

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Description

本出願は、２００６年９月２１日に出願された米国仮出願第６０／８２６，３９６号の利益を主張し、この仮出願はその全体が本明細書中に援用される。この研究は、国立衛生研究所認可番号ＮＩＨ／ＡＲ４６８０６、ＮＩＨ／ＮＳ４８１４３およびＮＩＨ／ＮＳ４８８４３によって資金を提供され、政府は本発明に特定の権利を有する。
（Ｉ．背景）
１．１型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ１）は、常染色体優性であり、そして進行性衰弱、筋肉消耗、筋緊張症、および複数系の損傷（異常心臓伝導、神経精神病学的損傷、白内障）によって特徴付けられる。傷害は、筋緊張症および衰弱による手筋肉の優先関与に起因して初期ステージで起こる。呼吸減退、吸引、または心臓不整脈からの死は、通常数十年の重篤の傷害の後に５５の年齢の中央値で起こる。現在、支えるケアの他の処置はない。ＤＭ１は、筋緊張症ジストロフィープロテインキナーゼをコードする遺伝子ＤＭＰＫの３’非翻訳におけるＣＴＧ繰り返しの拡大によって引き起こされる。５０〜１００の繰り返しの小さなＣＴＧ繰り返し拡大をもつ個体は、一般に穏和で後期に発症する徴候を有し、その一方、１０００以上の繰り返しの大きな拡大は、幼年期における重篤な疾患をともなう。繰り返し長さと疾患重篤度との間の関連は、循環性血液細胞から単離されたＤＮＡでなされた。しかし、骨格筋および脳を含む多くの組織において、拡大されたＣＴＧ繰り返しの体性不安定性は、循環性血液細胞中に比較的短い拡大をもつ個体においてさえ、１，０００〜５，０００繰り返しのかなりより大きな拡大に至る（非特許文献１）。２型筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ２）は、ＤＭ１に類似しているが、より一般的でなく、そしてより重篤でない。ＤＭ２は、核酸結合性タンパク質をコードするＺＮＦ９遺伝子のイントロン１におけるＣＣＴＧ繰り返しの拡大によって引き起こされる。
Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ＣＡら、Ａｎｎ Ｎｅｕｏｌ １９９４；３５：１０４〜１０７
（ＩＩ．要旨）
２．開示されるのは、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）１型（ＤＭ１）および２型（ＤＭ２）に関するスクリーニング方法および組成物である。特に、本明細書に開示されるのは、ＤＭを処置することで有効な化合物のスクリーニングの方法である。また開示されるのは、ＤＭを処置し得る組成物である。
３．従って、１つの局面では、本明細書に開示されるのは、筋緊張性ジストロフィーにおけるタンパク質置換治療としてアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる方法である。
４．また開示されるのは、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡのＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を阻害し得るその他の化合物を見出すための高スループットスクリーニングの方法である。
５．また開示されるのは、エキソンスキッピングを引き起こし、そして筋緊張性ジストロフィーにおけるスプライシング欠陥を矯正する（ｃｏｒｒｅｃｔ）ためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる方法である。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）該リガンドを基材に捕捉させる工程；
ｂ）標識化タンパク質を該リガンドと混合する工程；
ｃ）薬剤を工程ｂ）の混合物と接触させる工程；
ｄ）該標識のレベルを決定する工程；および
ｅ）コントロールに対して該標識の量を比較する工程
を包含し、該標識レベルの減少は、該相互作用を阻害する薬剤を示す、方法。
（項目２）
上記タンパク質が、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しＲＮＡと相互作用するタンパク質、または、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しにより分離されたタンパク質である、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しと相互作用するタンパク質、または、上記ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しにより分離されたタンパク質が、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２またはＭＢＮＬ３である、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記リガンドが、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しを含むＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目５）
上記ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しの隣に、ＤＭＰＫ遺伝子に由来するＲＮＡ配列、または、基材への捕捉を可能にする配列が配置されている、項目４に記載の方法。
（項目６）
上記ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しリガンドが、上記基材に結合された相補的な核酸に結合させることによって、該基質に結合される、項目４に記載の方法。
（項目７）
上記相補的な核酸がビオチン化される、項目６に記載の方法。
（項目８）
上記ビオチン化核酸が、上記基材に結合されたストレプトアビジンと、ビオチンとの結合によって、該基材に結合される、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記相補的な核酸がオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、項目６に記載の方法。
（項目１０）
上記基材がポリスチレンプレートである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
上記標識が蛍光標識である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
上記蛍光のレベルが、蛍光計または蛍光プレートリーダーにより決定される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）基材に結合したタンパク質を標識化リガンドと混合する工程；
ｂ）薬剤を工程ａ）の混合物と接触させる工程；
ｃ）該標識のレベルを決定する工程；および
ｄ）コントロールに対して該標識の量を比較する工程
を包含し、該標識レベルの減少は、該相互作用を阻害する薬剤を示す、方法。
（項目１４）
上記リガンドが、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しＲＮＡを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
上記タンパク質が、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しＲＮＡが相互作用するタンパク質、または、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しによって分離されたタンパク質である、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
上記ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しと相互作用するタンパク質、または、上記ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しにより分離されたタンパク質が、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２またはＭＢＮＬ３である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
上記基材がニトロセルロースフィルタである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記標識が蛍光標識である、項目１３に記載の方法。
（項目１９）
第一のタンパク質と、核酸上の第一の認識エレメントとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）該第一のタンパク質、第二のタンパク質、および、第二の認識エレメントに隣接して該第一の認識エレメントを含む核酸、を含む細胞に薬剤を投与する工程であって、該第一のタンパク質は、該第一の認識エレメントに結合し、そして、該第二のタンパク質は該第二の認識エレメントに結合する、工程；ならびに
ｂ）該第一のタンパク質および該第二のタンパク質の共局在化を検出する工程
を包含し、コントロールに対する、該第一のタンパク質および第二のタンパク質の共局在化の減少は、該相互作用を阻害する薬剤を示す、方法。
（項目２０）
上記第一のタンパク質がＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２またはＭＢＮＬ３であり、上記第一の認識エレメントがポリＣＵＧ繰り返しＲＮＡである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
上記第二のタンパク質がＭＳ２であり、上記第二の認識エレメントが、ＭＳ２被膜タンパク質ＲＮＡ認識エレメントである、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
上記第一のタンパク質および上記第二のタンパク質のうち少なくとも一方がドナー蛍光色素を含み、そして、該第一のタンパク質および該第二のタンパク質のうち少なくとも一方がアクセプター色素を含み、該第一のタンパク質と該第二のタンパク質とが共局在化している場合に、該ドナー蛍光色素の励起が、該アクセプター色素を励起する蛍光の放出をもたらす、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
上記第一のタンパク質および上記第二のタンパク質のうち少なくとも一方が分割βガラクトシダーゼタンパク質の第一の半体を含み、そして、該第一のタンパク質および該第二のタンパク質のうち少なくとも一方が該分割βガラクトシダーゼタンパク質の第二の半体を含み、該第一のタンパク質と該第二のタンパク質とが共局在化している場合に、該βガラクトシダーゼ基質の加水分解が、蛍光の発光をもたらす、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
上記第一のタンパク質および上記第二のタンパク質のうち少なくとも一方が分割蛍光タンパク質の第一の半体を含み、そして、該第一のタンパク質および該第二のタンパク質のうち少なくとも一方が該分割蛍光タンパク質の第二の半体を含み、該第一のタンパク質と該第二のタンパク質とが共局在化している場合に、該分割蛍光タンパク質の励起が、蛍光の放出をもたらす、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
上記分割蛍光タンパク質がＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質（ＶＦＰ）である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
スプライス異常を改善する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）スプライシング調節因子、過剰発現されたポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しＲＮＡ、およびスプライス異常レポーター構築物を含む細胞に薬剤を導入する工程であって、該レポーター構築物は、標識化タンパク質をコードする１以上の遺伝子が隣に配置された、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しにより誘発されるスプライス異常に感受性の遺伝子を含む、工程；ならびに
ｂ）該標識化タンパク質のレベルを測定する工程；ならびに
ｃ）標識化タンパク質の割合を比較する工程
を包含し、標識化タンパク質の増加は、スプライス異常を改善する薬剤を示す、方法。
（項目２７）
項目２６に記載の方法であって、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧに感受性の上記遺伝子の隣に、第一の標識化タンパク質および第二の標識化タンパク質をコードする遺伝子が配置され、該第一のタンパク質と該第二のタンパク質とが示差的に標識され；そして、該方法がさらに、
ｄ）該第一の標識化タンパク質の該第二の標識化タンパク質に対する割合を比較する工程を包含し、高い割合は、スプライス異常を改善する薬剤を示す、方法。
（項目２８）
上記第一の標識化タンパク質および第二の標識化タンパク質が、それぞれ、ＹＦＰおよびＹ・ＣＦＰである、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧに感受性の上記遺伝子の隣に、単一の標識化タンパク質をコードする遺伝子が配置され、該標識化タンパク質の増加は、スプライス異常を改善する薬剤を示す、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
上記標識化タンパク質がＧＦＰである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
上記スプライシング調節因子が、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２、ＭＢＮＬ３、ＣＵＧ−ＢＰＩまたはＥＴＲ−３である、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
上記スプライス異常に感受性の遺伝子が、ＳＥＲＣＡ１エキソン２２またはＴＮＮＴ３の胎児エキソンである、項目２６に記載の方法。
（項目３３）
上記蛍光のレベルが、蛍光比色法または蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって決定される、項目２６に記載の方法。
（項目３４）
スプライス異常を改善する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）スプライシング調節因子、過剰発現されたポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しＲＮＡ、およびスプライス異常レポーター構築物を含む細胞に薬剤を導入する工程であって、該レポーター構築物は、ルシフェラーゼ遺伝子が隣に配置された、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧにより誘発されるスプライス異常に感受性の遺伝子を含む、工程；ならびに
ｂ）該ルシフェラーゼ活性を測定する工程
を包含し、リシフェラーゼ活性の増加は、スプライス異常を改善する薬剤を示す、方法。
（項目３５）
処置を必要とする被験体における筋ジストロフィ（ＤＭ）を処置する方法であって、ＭＢＮＬ１のポリＣＵＧｅｘｐｍＲＮＡとの相互作用を阻害する薬剤を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３６）
上記ＤＭが１型筋ジストロフィである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
上記薬剤がモルホリノである、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
上記モルホリノがＣＡＧ２５である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
上記モルホリノが配列番号３に示される、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
上記モルホリノがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
上記モルホリノが配列番号４または配列番号６に示される、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
上記薬剤がＰＮＡ−ＣＡＧである、項目３５に記載の方法。
（項目４３）
上記ＰＮＡ−ＣＡＧが、２回、３回、４回もしくは５回のＣＡＧ繰り返しから構成される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
上記薬剤がアミノグリコシド系抗生物質である、項目３５に記載の方法。
（項目４５）
処置を必要とする被験体における筋ジストロフィを処置する方法であって、スプライス異常を矯正する薬剤を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４６）
上記スプライス異常がイオンチャネル疾患をもたらす、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
上記薬剤がモルホリノである、項目４５に記載の方法。
（項目４８）
上記モルホリノがＣＡＧ２５である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
上記モルホリノが配列番号３に示される、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
上記モルホリノが塩素イオンチャネルＣｌＣ−１を標的とする、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
上記モルホリノがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
上記モルホリノが配列番号４または配列番号５に示される、項目５０に記載の方法。
（項目５３）
上記薬剤が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）−ＣＡＧである、項目４５に記載の方法。
（項目５４）
上記ＰＮＡ−ＣＡＧが、２回、３回、４回もしくは５回のＣＡＧ繰り返しから構成される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
上記薬剤がアミノグリコシド系抗生物質である、項目４５に記載の方法。
（項目５６）
上記抗生物質がネオマイシンまたはゲンタマイシンである、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
第一のタンパク質、第二のタンパク質、および、第二の認識エレメントに隣接して第一の認識エレメントを含む核酸、を含む細胞であって、該第一のタンパク質は該第一の認識エレメントに結合し、そして、該第二のタンパク質は該第二の認識エレメントに結合し、該第一のタンパク質および該第二のタンパク質のうち少なくとも一方は、分割蛍光タンパク質の第一の半体を含み、そして、該第一のタンパク質および該第二のタンパク質のうち少なくとも一方は、該分割蛍光タンパク質の第二の半体を含み、該第一のタンパク質と該第二のタンパク質とが共局在化している場合、該分割蛍光タンパク質の励起が、蛍光の放出をもたらす、細胞。
（項目５８）
ポリスチレンプレート、ポリＣＵＧｅｘｐｍＲＮＡ、捕捉オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、および、標識されたマッスルブラインドタンパク質を含む、キット。
（項目５９）
上記マッスルブラインドタンパク質が、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２またはＭＢＮＬ３である、項目５８に記載のキット。
（項目６０）
上記マッスルブラインドタンパク質が蛍光標識される、項目５８に記載のキット。
（項目６１）
ニトロセルロースフィルタプレート、標識化ポリＣＵＧｅｘｐｍＲＮＡ、およびマッスルブラインドタンパク質を含む、キット。
（項目６２）
上記マッスルブラインドタンパク質が、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２またはＭＢＮＬ３である、項目６１に記載のキット。
（項目６３）
上記ポリＣＵＧｅｘｐｍＲＮＡが蛍光標識される、項目６１に記載のキット。
（項目６４）
配列番号３に示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目６５）
配列番号４に示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目６６）
配列番号５に示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目６７）
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ペプチド核酸バックボーンを有する、項目６４〜６６のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目６８）
処置を必要とする被験体において筋ジストロフィを処置する方法であって、項目６７に記載のペプチド核酸を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目６９）
上記アンチセンスオリゴヌクレオチドがモルホリノである、項目６４〜６６のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
（項目７０）
処置を必要とする被験体において筋ジストロフィを処置する方法であって、項目６９に記載のモルホリノを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目７１）
タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）該タンパク質または標識化リガンドに薬剤を接触させる工程；
ｂ）該タンパク質を標識化リガンドと混合する工程；
ｃ）該タンパク質に結合した標識のレベルを決定する工程；および
ｄ）コントロールに対して該標識の量を比較する工程
を包含し、コントロールに対する、該タンパク質に結合した標識レベルの減少は、該相互作用を阻害する薬剤を示す、方法。
（項目７２）
タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）標識化タンパク質またはリガンドに薬剤を接触させる工程；
ｂ）該タンパク質をリガンドと混合する工程；
ｃ）該標識のレベルを決定する工程；および
ｄ）コントロールに対して該標識の量を比較する工程
を包含し、該タンパク質に結合した標識のレベルの減少は、該相互作用を阻害する薬剤を示す、方法。
（項目７３）
タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）該タンパク質および標識化リガンドを混合する工程；
ｂ）該タンパク質および標識化リガンドに薬剤を接触させる工程；ならびに
ｃ）コントロールに対して該タンパク質に結合したリガンドの量を比較する工程
を包含し、該タンパク質に結合した標識のレベルの減少は、該相互作用を阻害する薬剤を示す、方法。
（項目７４）
タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下：
ａ）該タンパク質または標識化リガンドを薬剤に接触させる工程；
ｂ）該薬剤の存在下で、該タンパク質および標識化リガンドを混合する工程；ならびに
ｃ）コントロールに対して該タンパク質に結合したリガンドの量を比較する工程
を包含し、該タンパク質に結合した標識のレベルの減少は、該相互作用を阻害する薬剤を示す、方法。
（図面の簡単な説明）
６．本明細書に援用され、そして本明細書の一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施形態を示し、そして説明とともに開示される組成物および方法を示す。
７．図１。（Ａ）出産後第２日（Ｐ２）、Ｐ１０、Ｐ２０、および６ヶ月におけるマウス筋肉におけるＳＥＲＣＡ１エキソン２２オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＲアッセイ。（Ａｄ）は、エキソン２２包含への出産後遷移を示す。この出産後遷移は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスおよびＭＢＮＬ１ノックアウトマウスでは存在しない。 （Ｂ）ＳＥＲＣＡ１のエキソン２２の包含は、終止コドンエキソン２２に至る。エキソン２２のスキッピングは、エキソン２３中の終止コドンに至る。Ｅｘ２２＋転写物は、停止コドンが最終エキソン接続部から５５ｎｔ内であるのでナンセンス仲介減衰を受けないことに注目のこと。 （Ｃ）ｐＳＥＲＦミニ遺伝子スプライス異常（ｓｐｌｉｃｅｏｐｈａｔｈｙ）レポーター構築物。ヒトＳＥＲＣＡ１エキソン２２およびその隣接イントロンはインタクトで含まれている。ＰＡ、ポリアデニル化シグナル。 （Ｄ）インビボにおける筋肉中のｐＳＥＲＦのエレクトロポーレーションは、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスと比較してＷＴで増加したエキソン２２包含を示す（エレクトロポーレーション後４日のＲＴ−ＰＣＲアッセイ）。 ８．図２。ＭＢＮＬ１タンパク質およびポリ（ＣＵＧ）転写物の合成、精製および蛍光標識化。（Ａ）以下のサンプルのＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色されたＳＤＳゲル：ＧＳＴ−ＭＢＮＬ１−４１−ｄｅｌ１０５（疎水性ドメインを除去するためにＣ末端が短縮されている）を発現する細菌の粗タンパク質溶解物；粗タンパク質の１４，０００ｇ遠心分離後の上清およびペレット；Ｎｉカラムクロマトグラフィー後のフロースルー；異なる濃度のイミダゾールまたはＥＤＴＡでのＮｉカラムから溶出された４つのサンプル。次に、溶出物ＩＩＩを、グルタチオンセファロースカラム（第２ゲル）上で精製した。フラクションＩおよびＩＩは、装填緩衝液での洗浄液である；フランションＩＩＩ〜Ｖは、１０ｍＭグルタチオンでの溶出液である。精製後のタンパク質の純度は＞９０％である。（Ｂ）フルオレセインでの両ＭＢＮＬ１−４１−ｄｅｌ１０５の蛍光標識（左）、およびＡＴＰに複合体化されたＴＡＭＲＡの取込みによる３’末端でのポリ（ＣＵＧ）１０９標識の産物。６２．５ｆｍｏｌ程度の薄いようなタンパク質およびＲＮＡの比較的小量が、アクリルアミドゲル（上部ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅ走査）およびマイクロプレート（下部走査）の両方で検出されることに注目のこと。 ９．図３。組み換えＭＢＮＬ１のポリ（ＣＵＧ）１０９との相互作用。（Ａ）ニトロセルロースフィルター結合アッセイにおいて、一定濃度の蛍光標識ポリ（ＣＵＧ）１０９を、減少する濃度（１００〜０．０１２ｎＭ）の、ＧＳＴと融合されたまたは融合されていないＭＢＮＬ−４１タンパク質と混合する。非結合ＲＮＡは、フィルターを通じて洗浄し、タンパク質結合ＲＮＡは保持される。右に列挙されたタンパク質濃度は、フィルターのウェルの２つの列に対応する。 図３。組み換えＭＢＮＬ１のポリ（ＣＵＧ）１０９との相互作用。（Ｂ）完全長およびＣ末端短縮ＧＳＴ−ＭＢＮＬ１−４１に対する飽和曲線の比較。ＧＳＴ−融合パートナーの存在またはＭＢＮＬ１のＣ末端から１０５ａａの欠失いずれも、ポリ（ＣＵＧ）１０９結合に顕著な影響を有さないことに注目のこと。 図３。組み換えＭＢＮＬ１のポリ（ＣＵＧ）１０９との相互作用。（Ｃ）ポリ（ＣＵＧ）１０９付着アッセイのための実験設計を示す図。捕捉オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、１２炭素リンカーを経由してビオチンで５’末端が標識される。ビオチンのストレプトアビジンとの相互作用の後、捕捉ＯＤＮのポリ（ＣＵＧ）の３’末端へのハイブリダイゼーションが続き、転写物をプレートにつなぐ。ポリ（ＣＵＧ）１０９−ＭＢＮＬ１相互作用は、過剰の蛍光標識されたＭＢＮＬ１タンパク質で実施される。 １０．図４。ポリ（ＣＵＧ）１０９−ＭＢＮＬ１相互作用のマイクロプレートフォーマットにおけるモニタリングのための条件の最適化。上のパネルにおいて、ゲル移動度シフトアッセイは、蛍光標識されたポリ（ＣＵＧ）１０９（０．５ｐｍｏｌ）の増加する濃度の完全長ＧＳＴ−切断組み換えＭＢＮＬ１との相互作用を示す。増加するＭＢＮＬ１濃度は、タンパク質との複合体中のポリ（ＣＵＧ）１０９の％および複合体の分子量（転写物あたりの結合したＭＢＮＬ１分子の増加する数）の両方に影響することに注目のこと。下方のパネルは、マイクロプレートフォーマットにおける相互作用を示し、プレートにつながれた非標識ポリ（ＣＵＧ）１０９への蛍光標識されたＭＢＮＬ１結合をともなう。 １１．図５。その他のＲＮＡ結合タンパク質ではなくＭＢＮＬ１でのトランスフェクションが、ＤＭ１／胎児パターンから成熟筋肉へのＴＮＮＴ３のスプライシング（胎児エキソン除外、１００ｂｐ）を駆動する。 １２．図６。ＭＢＮＬ１のための転写ユニットは、ニワトリβグロビン遺伝子座からの隔離体によって隣接される。これら要素は、隣接クロマチン文脈からの移入遺伝子発現を隔離することが示されており、移入遺伝子の均一性を改善する（Ｃｈｕｎｇ ＪＨら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９７７；９４（２）：５７５〜５８０）。ａｔｔＢ要素は、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼによる組み込みを仕向ける。ＣＢＡ、ニワトリβアクチン。Ｍｂｎｌｌに対するいくつかの一特異性抗体の存在に起因して、発現レベルをモニターするためにレポーター遺伝子またはエピトープの必要性はなかった。 １３．図７。ｐＬＬＣ７。ニワトリβアクチンプロモーターに結合されたＣＭＶエンハンサー；三重停止、３つのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター要素のコンカタマー（Ｎｏｖａｋ Ａら、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２０００；２８（３−４）：１４７〜１５５）；ＧＦＰ／ＮＥＯ、Ｂｉｚｙｍｅネオマイシン耐性−ＧＦＰ蛍光選択カセット（Ｈａｎｓｅｎ ＳＧら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００２；３２（５）：１１７８、１１８０、１１８２〜１１７８）；ＡｔｔＢ、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼのための組み込みシグナル。 １４．図８。ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐへのＭＢＮＬ１結合を阻害する化合物のための３分子蛍光相補アッセイ。ｌｕｃ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおいて、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐは、ＭＳ２コートタンパク質ＲＮＡ認識要素（ＭＳ２ＲＥ）で散在される。ＭＳ２コートタンパク質（ＭＳ２ＣＰ）およびＭＢＮＬ１は、分割Ｖｅｎｏｕｓ蛍光タンパク質（Ｎａｇａｉ Ｔら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２；２０（１）：８７〜９０）（ＶＦＰ）のＮ末端半分体およびＣ末端半分体との融合物としてそれぞれ発現される。キメラ転写物上のＭＳ２ＣＰ・ＶＦＰＮおよびＭＢＮＬ１・ＶＦＰＣのアセンブリは、ＶＦＰ蛍光活性に至る（Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ、Ｂｒｏｗｎ ＣＭ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１６）：３３４６〜３３５５）。ＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ相互作用の阻害は、ＶＦＰ蛍光の損失を引き起こす。 １５．図９は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおける移入遺伝子の図を示す。筋緊張性ジストロフィーのトランスジェニックマウスモデルを生成するために、拡大されたＣＴＧ繰り返しが、全長ヒト骨格アクチン遺伝子を含むＤＮＡフラグメント中の停止コドンから下流に挿入された。このフラグメントは、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスを派生するために用いられた。これらトランスジェニックマウスは、骨格筋において高レベルのＣＵＧ拡大ＲＮＡを発現することが見出された。それらはまた、筋緊張性ジストロフィーの主要な徴候である筋緊張症、および筋緊張性ジストロフィーに似る骨格筋中の組織学的変化を発症する。 １６．図１０は、ＭＢＮＬ１タンパク質が、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおけるＣＵＧ繰り返しＲＮＡのリボヌクレオ病巣中で隔離されることを示す。骨格筋の切片のこの高出力視野は、出生後２日で単一の核を示す。左パネルにおいて、ＣＵＧ拡大ＲＮＡのリボヌクレオ病巣は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションによって示される。中央パネルには、核中のＭＢＮＬ１タンパク質の分布が免疫蛍光によって示される。右のマージされたイメージは、ＭＢＮＬ１が、ＣＵＧ拡大ＲＮＡのリボヌクレオ病巣中に隔離されることを示す。 １７．図１１は、ＭＢＮＬ１がＳＥＲＣＡ１およびＺＡＳＰのためのオルタナティブスプライシングの正常発生調節のために必要であることを示す。左のパネルは、ＳＥＲＣＡ１のオルタナティブスプライシングの逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析、筋小胞体のカルシウム取込みポンプ、およびＺディスクの構造構成要素であるＺＡＳＰを示す。野生型マウスでは、ＳＥＲＣＡ１エキソン２２のオルタナティブスプライシングは、発生で調節される。出生後２日（Ｐ２）で、エキソン２２は、主にスキップされる。出生後２０日（Ｐ２０）までに、そして成体（Ａｄ）中で継続して、エキソン２２は主に含まれる。しかし、このオルタナティブスプライシングの遷移は、ＭＢＮＬ１欠損マウス（Ｍｂｎｌ１ΔＥ３／ΔＥ３）では生じない。失敗の類似のパターンが、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスで見られる。ＺＡＳＰのエキソン１１は、出生後発生の同じ間隔の間にオルタナティブスプライシング遷移を示す。エキソン１１包含からエキソン１１排除への遷移は、ＭＢＮＬ１欠損マウスまたはＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスでは起こらない。 １８．図１２は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおけるリボヌクレオ病巣からのＣＡＧ繰り返し置換ＭＢＮＬ１タンパク質からなるモルホリノを示す。このモルホリノは、ＣＡＧ繰り返しの全体が損傷され、そして長さが２５ヌクレオチド（ＣＡＧ２５）であった。リン酸緩衝化生理食塩水中に溶解されたＣＡＧ２５モルホリノを、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスの脛骨前部筋中に注入し、次いで、エレクトロポーレーションして筋細胞中への侵入を容易にした。対側性前部筋には生理食塩水単独を注入し、次いでエレクトロポーレーションした。脛骨前部におけるＭＢＮＬ１の分布は、抗ＭＢＮＬ１抗体Ａ２７６４での免疫蛍光によって決定した。生理食塩水を注入したマウスでは、ＭＢＮＬ１は、リボヌクレオ病巣中に隔離された（核は、ＤＡＰＩで対比染色される）。ＣＡＧ２５モルホリノで注入された筋肉では、ＭＢＮＬ１は、核全体により広く分布されるようになった。 １９．図１３は、ＳＥＲＣＡ１のオルタナティブスプライシングのＣＡＧ２５モルホリノで回復された適正な調節での処置の後、リボヌクレオ病巣からのＭＢＮＬ１の放出を示す（ＣＡＧ２５注入後３週間）。４匹の異なるＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおいて、ＣＡＧ２５モルホリノの脛骨前部中への注入は、ＳＥＲＣＡ１オルタナティブスプライシングの欠陥を改善した。モルホリノ処置筋肉は、「＋」によって示される。生理食塩水単独で注入された、対向する後脚における脛骨前部からの結果は、「−」で示される。モルホリノ注入の側部はランダムに決定され、そしてこの割り当ては、スプライシング分析が終了した後までブラインドにしたままであった。Ｈｅｔ．ｄｕｐｌ．は、ヘテロデュープレックスＰＣＲ産物を示す。 ２０．図１４は、ＺＡＳＰのオルタナティブスプライシングのＣＡＧ２５モルホリノで改善された調節での処置の後のリボヌクレオ病巣からのＭＢＮＬ１の放出を示す（ｎ＝４の異なるＨＳＡＬＲトランスジェニックマウス、ＣＡＧ２５注入の３週間後）。モルホリノ処置筋肉は、「＋」によって示される。生理食塩水単独で注入された対向する後脚中の脛骨前部からの結果は、「−」によって示される。モルホリノ注入の側部はランダムに決定され、そしてこの割り当ては、スプライシング分析が終了した後までブラインドにしたままであった。 ２１．図１５は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおけるＣＡＧ２５モルホリノ処置が、筋特異的クロライドイオンチャンネルＣｌＣ−１のオルタナティブスプライシングを改善したことを示す。ＣｌＣ−１のエキソン７ａは、発生的に調節されたオルタナティブスプライシングを示し、そしてＭＢＮＬ１がその正常調節のために必要であることは先に示された（Ｋａｎａｄｉａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０２：１９７８〜１９８０、２００３）。成体野生型（ＷＴ）マウスは、低レベルのエキソン７ａ包含を示す。ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスでは、エキソン７ａを含むＣｌＣ−１スプライス産物のフラクションが増加される。エキソン７ａの包含はフレームシフトを引き起こし、そしてＣｌＣ−１コード配列の大部分を短縮する未成熟終止コドンを生成する。注目すべきは、エキソン７ａを含む転写物は、ナンセンス仲介減衰を経由する加速された分解を有し、それ故、それらは、定常状態そしてこのゲル状では表示不足である。このゲル上のより高いバンドは、示されるようなその他のオルタナティブスプライス産物である（Ｍａｎｋｏｄｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ １０；３５〜４４、２００２）。ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスでは、ＣＡＧモルホリノの脛骨前部中への注入は、ＣｌＣ−１オルタナティブスプライシングの欠陥を改善した。モルホリノ処置された筋肉は「＋」によって示される。生理食塩水単独で注入された対向する後脚における脛骨前部からの結果は、「−」によって示される。 ２２．図１６は、表面膜におけるＣｌＣ−１クロライドチャンネルの発現が、ＣＡＧ２５モルホリノの注入後３週間で増加されることを示す。ＣｌＣ−１クロライドチャンネルに対する免疫蛍光が、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスからの脛骨前部筋肉の切片で示される。筋肉線維は、生理食塩水を注入されたＨＳＡＬＡ筋肉においてＣｌＣ−１のモザイク発現を示す。これら線維のいくつかは、ＣｌＣ−１タンパク質が完全に欠如している。ＣＡＧ２５モルホリノでの処置は、筋肉線維の表面膜での増加したＣｌＣ−１タンパク質に至る。 ２３．図１７は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスの脛骨前部中へのＣＡＧ２５モルホリノの注入後３週および６週での筋緊張症の改善を示すために筋電図を用いる。筋緊張症は、筋肉異常興奮性の状態であり、そこでは、筋肉線維は、繰り返す作用電位を呈示する。筋緊張性ジストロフィーのＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスモデルにおける筋緊張症は、ＣｌＣ−１についてのオルタナティブスプライシングの異常調節、および次の筋肉線維における塩素イオンチャンネルの減少によって引き起こされる。ＣｌＣ−１オルタナティブスプライシングの類似の異常が、ヒト筋緊張性ジストロフィーにおいて存在する。この実験では、垂直軸は、各時点における４匹のＨＳＡＬＲトランスジェニックマウス間の平均筋緊張症重篤度スコアを示す。各マウスについて、生理食塩水中に溶解されたＣＡＧ２５モルホリノが１つの後脚の脛骨前部筋肉に注入され、その一方、生理食塩水単独が、対向する側の脛骨前部中に注入された。モルホリノの注入の側部はランダムに割り当てられた。筋電図法が盲検調査者によって実施された。筋緊張症の重篤度は、４つのポイントスケールを基にグレード分けされた：０＝筋緊張症なし、１＝時々の筋緊張放電（ニードル挿入の２５％より少ない）、２＝豊富な筋緊張放電（ニードル挿入の２５〜７５％）、および３＝健康な筋緊張症（ほぼニードル挿入毎における筋緊張放電）。ＣＡＧモルホリノでのタンパク質置換療法は、注入後３週および６週で筋緊張症の顕著な減少を生じた（両方の時点でｐ＜０．００１）。 ２４．図１８は、フィルター結合スクリーニングアッセイが、アミノグリコシドファミリー中の化合物を、組み換えＭＢＮＬ１タンパク質の（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡとの相互作用を阻害する能力を有するとして識別することを示す。９の試験されたアミノグリコシド化合物の中で、ネオマイシン（左の曲線）およびゲンタマイシン（右の曲線）は、ＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐＲＮＡ−タンパク質複合体の形成を阻害する最も高い活性を示した。添加の順序は、化合物＋（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡ（５分インキュベート）、次いで組み換えＭＢＮＬ１タンパク質（１５分インキュベーション）、次いでフィルターへの付与である。 ２５．図１９は、ＣＡＧ２５モルホリノが、ＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐＲＮＡの相互作用をインビトロで阻害することを示す。ＭＢＮＬ１タンパク質の（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡとの相互作用は、増加する量のＣＡＧ２５モルホリノの存在下、ゲルシフトアッセイによって調べた。 ２６．図２０は、タンパク質蛍光よりも読み取り値を用い得るスプライス異常を改善する化合物のためのスクリーニングアッセイを示す。ＳＥＲＣＡ１エキソン２２および隣接イントロンを用い、ルシフェラーゼを用いてスプライス異常レポーター構築物を生成する。点変異をＳＥＲＣＡ１エキソン２２中に導入し、その結果、それは、もはや終止コドンをコードしない。このスプライス異常レポーター構築物がＣＯＳ細胞中に一時的にトランスフェクトされるとき、ＧＦＰタグ化ＭＢＮＬ１のための小量の発現構築物とともに同時トランスフェクトされるとき、このルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼの＞１０倍アップレギュレーションによって示されるように、ＭＢＮＬ１活性の高感度指標である。 ２７．図２１は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおけるスプライシングおよび筋緊張症に対するＣｌＣ−１のエキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチセンスモルホリノの効果を示す。ＣｌＣ−１のエキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチンスモルホリノは、全身麻酔下ＨＳＡＬＲマウスの脛骨前部筋肉中に注入された（配列５’−ＣＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号４））。反対側筋肉には、反転配列（５’−ＧＡＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＣＣ−３’（配列番号５））を有するモルホリノを注入した。筋線維中への取込みは、インビボエレクトロポーレーションによって高めた。どちらの側がアンチセンスモルホリノを受けたかはランダム化した。２１日後、筋緊張症を筋電図によって評価し、そして筋肉は、ＣｌＣ−１オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＴ分析のために回収した。筋電図法は盲検としてランダム化した。Ａ．オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＲ分析は、エキソン７ａ包含産物（バンド２および４、Ｂ中のスプライシング図を参照のこと）が、アンチセンスモルホリノで処理された筋肉中では減少するが、反転モルホノリによっては減少しないことを示す。同時に、このアンチセンスモルホリノは、機能的ＣｌＣ−１チャンネルをコードするスプライス産物のフラクションを増加する（バンド１）。グラフＣにおける定量化は、アンチセンスモルホリノが、エキソン７ａ包含の有意な減少を引き起こしたことを確認する（ｐ＜０．０００１）。このアンチセンスモルホリノでの処置は、アンチセンス処置筋肉における筋緊張症の有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．００００１）（Ｄ）。 ２７．図２１は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおけるスプライシングおよび筋緊張症に対するＣｌＣ−１のエキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチセンスモルホリノの効果を示す。ＣｌＣ−１のエキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチンスモルホリノは、全身麻酔下ＨＳＡＬＲマウスの脛骨前部筋肉中に注入された（配列５’−ＣＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号４））。反対側筋肉には、反転配列（５’−ＧＡＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＣＣ−３’（配列番号５））を有するモルホリノを注入した。筋線維中への取込みは、インビボエレクトロポーレーションによって高めた。どちらの側がアンチセンスモルホリノを受けたかはランダム化した。２１日後、筋緊張症を筋電図によって評価し、そして筋肉は、ＣｌＣ−１オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＴ分析のために回収した。筋電図法は盲検としてランダム化した。Ａ．オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＲ分析は、エキソン７ａ包含産物（バンド２および４、Ｂ中のスプライシング図を参照のこと）が、アンチセンスモルホリノで処理された筋肉中では減少するが、反転モルホノリによっては減少しないことを示す。同時に、このアンチセンスモルホリノは、機能的ＣｌＣ−１チャンネルをコードするスプライス産物のフラクションを増加する（バンド１）。グラフＣにおける定量化は、アンチセンスモルホリノが、エキソン７ａ包含の有意な減少を引き起こしたことを確認する（ｐ＜０．０００１）。このアンチセンスモルホリノでの処置は、アンチセンス処置筋肉における筋緊張症の有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．００００１）（Ｄ）。 ２７．図２１は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおけるスプライシングおよび筋緊張症に対するＣｌＣ−１のエキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチセンスモルホリノの効果を示す。ＣｌＣ−１のエキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチンスモルホリノは、全身麻酔下ＨＳＡＬＲマウスの脛骨前部筋肉中に注入された（配列５’−ＣＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号４））。反対側筋肉には、反転配列（５’−ＧＡＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＣＣ−３’（配列番号５））を有するモルホリノを注入した。筋線維中への取込みは、インビボエレクトロポーレーションによって高めた。どちらの側がアンチセンスモルホリノを受けたかはランダム化した。２１日後、筋緊張症を筋電図によって評価し、そして筋肉は、ＣｌＣ−１オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＴ分析のために回収した。筋電図法は盲検としてランダム化した。Ａ．オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＲ分析は、エキソン７ａ包含産物（バンド２および４、Ｂ中のスプライシング図を参照のこと）が、アンチセンスモルホリノで処理された筋肉中では減少するが、反転モルホノリによっては減少しないことを示す。同時に、このアンチセンスモルホリノは、機能的ＣｌＣ−１チャンネルをコードするスプライス産物のフラクションを増加する（バンド１）。グラフＣにおける定量化は、アンチセンスモルホリノが、エキソン７ａ包含の有意な減少を引き起こしたことを確認する（ｐ＜０．０００１）。このアンチセンスモルホリノでの処置は、アンチセンス処置筋肉における筋緊張症の有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．００００１）（Ｄ）。 ２７．図２１は、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおけるスプライシングおよび筋緊張症に対するＣｌＣ−１のエキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチセンスモルホリノの効果を示す。ＣｌＣ−１のエキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチンスモルホリノは、全身麻酔下ＨＳＡＬＲマウスの脛骨前部筋肉中に注入された（配列５’−ＣＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＡＧ−３’（配列番号４））。反対側筋肉には、反転配列（５’−ＧＡＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＣＡＣＧＧＡＣＣ−３’（配列番号５））を有するモルホリノを注入した。筋線維中への取込みは、インビボエレクトロポーレーションによって高めた。どちらの側がアンチセンスモルホリノを受けたかはランダム化した。２１日後、筋緊張症を筋電図によって評価し、そして筋肉は、ＣｌＣ−１オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＴ分析のために回収した。筋電図法は盲検としてランダム化した。Ａ．オルタナティブスプライシングのＲＴ−ＰＣＲ分析は、エキソン７ａ包含産物（バンド２および４、Ｂ中のスプライシング図を参照のこと）が、アンチセンスモルホリノで処理された筋肉中では減少するが、反転モルホノリによっては減少しないことを示す。同時に、このアンチセンスモルホリノは、機能的ＣｌＣ−１チャンネルをコードするスプライス産物のフラクションを増加する（バンド１）。グラフＣにおける定量化は、アンチセンスモルホリノが、エキソン７ａ包含の有意な減少を引き起こしたことを確認する（ｐ＜０．０００１）。このアンチセンスモルホリノでの処置は、アンチセンス処置筋肉における筋緊張症の有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．００００１）（Ｄ）。 ２８．図２２は、単一筋線維からの全細胞電圧クランプが、ＣｌＣ−１エキソン７ａを標的にするアンチンスモルホリノでの処理がＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおける正常クロライド電流密度を回復することを示す。ＣｌＣ−１エキソン７ａの３’スプライス接続部を標的にするアンチセンスモルホリノは、全身麻酔下、ＨＳＡＬＲマウスの足趾筋肉中に注入した。筋線維中への取込みは、インビボエレクトロポーレーションによって促進した。このモルホリノは、フルオレセインでタグ化した。４日後、個々のＦＤＢ筋線維を単離した。線維の９０％以上がフルオレセイン取込を示し、そしてこれら線維のみを調べた。コントロールとして、対向する足趾に、反転配列を有するモルホリノを注入した。Ａ．上のパネルは、異なる膜電位におけるＣｌＣ−１電流を示す。ＨＳＡＬＲマウスにおけるピーク電流密度（中央パネル）は、野生型マウス（左パネル）におけるよりかなり低い。しかし、ＨＳＡＬＲマウスにおけるモルホリノ処置の後（右パネル）、電流密度は、野生型マウスに類似であるレベルまで回復する。Ｂ．この効果を定量化するために、下のパネル中のグラフは、膜電位に関連するクロライド電流密度を示す。反転モルホノリで処置された線維中、または非処置ＨＳＡＬＲ線維中では、電流密度は顕著に減少する（閉じた丸）。アンチンスモルホリノ（閉じた矩形）は、クロライド電流密度を正常レベルまで回復する（開いた丸または三角）。 ２９．図２３は、アンチンスモルホリノの設計を示す。図２３Ａは、ＣｌＣ−１エキソン７ａの包含がフレームシフトおよびエキソン７中の未成熟終止コドンを誘導することを示す。アンチンスモルホリノのＣｌＣ−１プレｍＲＮＡ中のエキソン７ａの３’スプライス部位へのアニーリングは、このエキソンのスプライスソームの認識を防ぐことが意図される。図２３Ｂは、ＣｌＣ−１プレｍＲＮＡ（上のストランド）のアラインメントを示し、エキソン７ａの３’または５’スプライス部位を標的にするアンチセンスモルホリノが示される。コントロールモルホリノは、３’スプライス部位ブロッカーの５’−３’反転である。エキソン配列は上の事例中にあり、イントロン配列は下の事例中にある。 ３０．図２４は、アンチセンスモルホリノが筋肉核に優先的に局在化し、そして筋細胞膜でのＣｌＣ−１発現を回復することを示す。図２４Ａ〜Ｃは、もＨＳＡＬＲ脛骨前部（ＴＡ）筋肉の断面を示し、注入後３週の３’カルボキシフルオレセイン標識アンチセンスモルホリノの分布を示す。このモルホリノは、ＣｌＣ−１プレｍＲＮＡの３’スプライス部位に相補的であった。筋線維は、小麦胚芽凝集素（ｗｇａ）によって輪郭を描き、そして核はＤＡＰＩによって強調される。図２４Ｄおよび２４Ｅは、ＦＤＢ線維の明視野（Ｄ）および蛍光（Ｅ）画像を示し、このアンチセンスモルホリノの優先核局在化を示す（注入後５日）。図２４Ｆおよび２４Ｇは、反転処理コントロール（Ｆ）と比較して、免疫蛍光は、アンチセンスモルホリノでの処置後３週でＨＳＡＬＲＴＡ筋肉における筋細胞膜ＣｌＣ−１タンパク質の増加を示す。 ３１．図２５は、アンチセンスモルホリノがＣｌＣ−１エキソン７ａのスプライシングを抑制することを示す。図２５Ａは、ＲＴ−ＰＣＲが、ＨＳＡＬＲマウスのＴＡ筋肉中へのアンチセンス（アンチ）モルホリノ（アンチセンス１＋アンチセンス２、各５μｇ）の注入後３週のエキソン７ａ包含の減少を示したことを示す。各マウスからの注入されたＴＡ筋肉の対は、「１、２、３」によって識別される。コントロールモルホリノ（ｉｎｖ）（１０μｇ）で注入された筋肉は、非処置ＨＳＡＬＲマウスとは異ならなかった。ＨＳＡＬＲマウスおよびＷＴマウスは、同じ（ＦＶＢ）近交バックグラウンドを有している。 図２５Ｂは、アンチセンスモルホリノ（２０μｇアンチセンス１ 対 ２０μｇ反転コントロール）の注入後８週で部分的に抑制されたままであるエキソン７ａの包含を示す。 図２５ｃは、ＣｌＣ−１アンチセンスモルホリノが、Ｔｉｔｉｎ ｍ−ｌｉｎｅエキソン５の誤調節されたオルタナティブスプライシングを矯正しなかったことを示す。 図２５Ｄおよび２５Ｅは、エキソン７ａを含むＣｌＣ−１スプライス産物の％がモルホリノ注入後３週（Ｄ）および８週（Ｅ）で示される。平均±標準偏差；群あたりｎ＝３；＊＊Ｐ＜０．００１；＊Ｐ＝０．０３５アンチセンス 対 反転処置コントロール；ｔ検定。 図２５Ｄおよび２５Ｅは、エキソン７ａを含むＣｌＣ−１スプライス産物の％がモルホリノ注入後３週（Ｄ）および８週（Ｅ）で示される。平均±標準偏差；群あたりｎ＝３；＊＊Ｐ＜０．００１；＊Ｐ＝０．０３５アンチセンス 対 反転処置コントロール；ｔ検定。 図２５Ｆは、ＣｌＣ−１ｍＲＮＡのレベルがアンチセンスモルホリノでの処置後３週で増加することを示す。ＣｌＣ−１ｍＲＮＡのレベルは、ハウスキーピング遺伝子ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写因子ＩＩＢに対する任意ユニットで表される。平均±標準偏差；群あたりｎ＝３；＊Ｐ＝０．０６ アンチセンス 対 反転処置コントロールについて；ｔ検定。 ３２．図２６は、アンチセンスモルホリノがＣｌＣ−１チャンネル機能をレスキューし、そしてＨＳＡＬＲマウスの骨格筋中の筋緊張症を逆転することを示す。図２６Ａは、反転（左）またはアンチセンス（中央）モルホリノいずれかでエレクトロポーレーションされたＨＳＡＬＲマウス、およびアンチセンスモルホリノでエレクトロポーレーションされたＷＴマウス（右）から単離された短趾屈筋（ＦＤＢ）線維から得られた代表的ＣｌＣ−１電流を示す。点線は、ゼロ電流レベルを表す。各線維から記録された容量性電流は、各パネルの挿入物に示される（スケールバー：垂直、３ｎＡ；水平、４ｍｓ）。２次オーダー指数（記号）と適合される、反転（丸）およびアンチセンス処理（矩形）ＨＳＡＬＲマウスおよびアンチセンス処理ＷＴマウス（三角）から得られたＦＤＢ線維中−１００ｍＶにおける正規化ＣｌＣ−１電流非活性化の重ね合わせトレース（実線）は、左手パネルへの挿入物中に示される。ＨＳＡＬＲマウスから得られたＦＤＢ線維の加速されたＣｌＣ−１非活性化動力学は、アンチセンスモルホリノでの処置後のみに正規化されることに注目のこと。図２６Ｂは、反転モルホリノで処理された１６〜１８日のＷＴマウス（開いた丸；ｎ＝１１）、アンチセンスモルホリノで処理されたＷＴマウス（開いた三角；ｎ＝１０）、反転モルホリノで処理されたＨＳＡＬＲマウス（黒丸；ｎ＝１２）、およびアンチセンスモルホリノで処理されたＨＳＡＬＲマウス（黒矩形、ｎ＝１６）のＦＤＢ線維から記録された平均瞬間ＣｌＣ−１電流密度の電圧依存性を示す。図２６Ｃは、（Ｂ）に示される同じ実験について平均の相対的Ｐｏ−Ｖ曲線を示す。各データセットを通じた円滑な曲線は、改変されたＢｏｌｔｚｍａｎｎ等式（Ｌｕｅｃｋ、Ｊ．Ｄ．ら（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９〜９４）を用いて生成された。図２６Ｄは、（Ｂ）に示される同じ実験について−１００ｍＶまでの電圧ステップから惹起されたＣｌＣ−１電流非活性化の迅速（Ａｆ／Ａｔｏｔａｌ）、緩慢（Ａｓ／Ａｔｏｔａｌ）、および非活性化（Ｃ／Ａｔｏｔａｌ）成分の平均の相対的寄与を示す。平均±ｓ．ｅ．ｍ．；＊Ｐ＜０．０５ その他の実験条件の各々に比較された反転処理ＨＳＡＬＲ線維；ｔ検定。図２６Ｅおよび２６Ｆは、筋緊張症が、アンチセンスモルホリノの注入後３週（Ｅ）および８週（Ｆ）で有意に減少したことを示す。平均±標準偏差；ｎ＝３〜７／群。アンチセンスモルホリノは、１つのＴＡ中に注入され、反転モルホリノは、対側ＴＡ中に注入され、そして腓腹筋が非処置コントロールとして供された。＊＊Ｐ＜０．０００１ アンチセンス 対 反転処置コントロール；ＡＮＯＶＡ。 ３３．図２７は、アンチセンスモルホリノが、エキソン７ａ包含を抑制し、ＣｌＣ−１タンパク質発現を回復し、そしてＭｂｎｌｌΔＥ３／ΔＥ３マウスにおける筋緊張症をレスキューすることを示す。図２７Ａは、ＲＴ−ＰＣＲが、アンチンスモルホリノ１の注入後（２０μｇアンチセンスまたは反転コントロール）３週におけるエキソン７ａの減少した包含を示すことを示す。図２７Ｂは、平均±標準偏差；（ｎ＝３／群）として（Ａ）で示されるスプライシング結果の定量化を示す；＊＊Ｐ＜０．００１ アンチセンス 対 反転処置コントロール；ｔ検定。図２７Ｃおよび２７Ｄは、ＣｌＣ−１に対する免疫蛍光が、反転処置コントロール（Ｃ）と比較したとき、アンチセンス（Ｄ）での注入後３週で増加することを示す。図２７Ｅは、ＭｂｎｌｌΔＥ３／ΔＥ３ＴＡ筋肉における筋緊張症が、アンチセンスモルホリノでの処置後３週で減少するが、反転コントロールで処置された筋肉では減少しないことを示す。平均±標準偏差；ｎ＝３／群；＊＊Ｐ＜０．０００１ アンチセンス 対 反転処置コントロール；ＡＮＯＶＡ。 ３４．図２８は、ＣｌＣ−１エキソン７ａを標的にするアンチセンスモルホリノの比較を示す。アンチセンスオリゴはＨＳＡＬＲマウスの、脛骨前部（ＴＡ）筋肉中に注入され、そして反転オリゴ（ｉｎｖ）（２０μｇ）は、対側ＴＡ中に注入された。組織は、ＲＴ−ＰＣＲによるＣｌＣ−１スプライシングの分析のために３週後に得た。３’スプライス部位を標的にするアンチセンスモルホリノ（アンチセンス１；２０μｇ）は、５’スプライス部位に対して向けられたアンチセンスモルホリノ（アンチセンス２；２０μｇ）より高いレベルのエキソン７ａスキッピングを誘導した。アンチセンス１単独（２０μｇ）の効果は、アンチセンス１および２の同時注入に類似していた（各群ｎ＝３；各群から２が示される）。 ３５．図２９は、アンチセンスモルホリノが、リボヌクレオ包含の形成に対して影響を持たなかったことを示す。インサイチュハイブリダイゼーションにおける蛍光および免疫蛍光は、反転（ａ−ｃ）およびアンチセンス（ｄ−ｆ）モルホリノでのＨＳＡＬＲＴＡ筋肉の注入後３週の筋肉核（青）中のＣＵＧｅｘｐＲＮＡおよびＭＢＮＬ１タンパク質の同時局在化を示す。 ３６．図３０は、ＣＡＧ繰り返しからなるペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーでのタンパク質置換療法を示す。図３０Ａは、２〜５ＣＡＧ繰り返しの範囲の長さのＰＮＡ−ＣＡＧ繰り返しオリゴが、（ＣＵＧ）１０９ヘアピンに侵入し得、そしてインビトロで拡大したＣＵＧ繰り返しヘアピンと効率的に相互作用し得ることを示す。図３０Ｂは、これらＰＮＡ−ＣＡＧオリゴがまた、インビトロでＭＢＮＬ１タンパク質との（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡの相互作用を阻害し得ることを示す。 ３７．図３１は、ＭＢＮＬ１タンパク質とＣＵＧ拡大ＲＮＡとの相互作用を阻害する化合物のためのスクリーニングを示し：蛍光異方性アッセイは、インビトロでのＣＵＧ拡大ＲＮＡの組み換えＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を示す。フルオレセイン標識（ＣＵＧ）３６ＲＮＡ（２ｎＭ）をＭＢＮＬ１タンパク質（１００ｎＭ）とインキュベートし、そして異方性を、１〜９０分の範囲の時点で測定した。蛍光異方性の増加する値は、フルオレセイン標識（ＣＵＧ）３６転写物のＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を示す。値は、４つの実験からの平均であり、そして誤差バーはＳＤを示す。 ３８．図３２は、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡの組み換えＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングするための蛍光異方性アッセイを示す。蛍光標識（ＣＵＧ）３６転写物（２ｎＭ）を最初アミノグリコシド化合物（１０または５０μＭ）と、次いで過剰量の組み換えＭＢＮＬ１タンパク質（１００ｎＭ）とインキュベートした。ＭＢＮＬ１タンパク質に結合したままであるＣＵＧ繰り返しＲＮＡのフラクションを算出するために（「％結合ＣＵＧｅｘｐ」、垂直軸）、結果を、アミノグリコシドが省略されたアッセイにおける最大蛍光異方性の％として表す。試験された化合物の中で、ネオマシインが、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡへのＭＢＮＬ１結合の最も強い阻害を示した。値は、これら測定からの平均＋／−ＳＤである。 ３９．図３３は、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡの組み換えＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングするための酵素相補アッセイの図を示す。（ＣＵＧ）１０９転写物を、ビオチン化された捕捉オリゴヌクレオチドを用いてストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートの表面につないだ。この捕捉オリゴは、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡの３’末端で相補的配列にアニールする。組み換えヒトＭＢＮＬ１は、βガラクトシダーゼのＰＬフラグメントとの融合として発現される。ＰＬは、βガラクトシダーゼの５５アミノ酸フラグメントである。予備実験は、ＭＢＮＬ１のＰＬフラグメントとの融合は、ＭＢＮＬ１タンパク質のＣＵＧ繰り返しＲＮＡへの結合を阻害しなかったことを決定した。試験化合物とのインキュベーションの後、非結合ＭＢＮＬ１−ＰＬを洗い流す（パネルＢ）。次に、βガラクトシダーゼの相捕性フラグメントを添加し、（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡと相互作用し続け、そしてそれによってマイクロタイタープレート上に保持されるＭＢＮＬ１−ＰＬの量を決定する。βガラクトシダーゼの相補性フラグメントのＰＬへの結合は、その酵素活性を再構築する。この活性は、次に、基質を添加することにより決定され、活性βガラクトシダーゼからの蛍光または化学的発光シグナルを提供する。 ４０．図３４は、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡの組み換えＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を阻害する化合物をスクリーニングするための酵素相補アッセイを示す。βガラクトシダーゼ酵素相補アッセイの操作は、２種類のインヒビターを用いて示された。左パネルでは、過剰の（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡがアッセイ反応に添加された。可溶性（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡは、ＭＢＮＬ１−ＰＬタンパク質に結合し、そしてマイクロタイタープレート上のその保持を防ぎ、減少したβガラクトシダーゼ活性によって反映される（相対的発光活性に関して垂直軸に表される）。右パネルには、ＣＵＧ−反復−ＲＮＡ−ヘアピン中にインターカーレートする能力を有する化合物（ＥｔＢｒ、エチジウムブロマイド；またはＳｙｂｒＧｒｅｅｎ染色）を示された濃度で添加した。両方の化合物は、プレート上に保持されたＭＢＮＬ１−ＰＬの量を低減し、減少したβガラクトシダーゼ活性によって反映される。 ４１．図３５は、ＣＡＧ繰り返しからなるペプチド核酸（ＰＮＡ）の注入が、筋緊張性ジストロフィーのＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスモデル中の筋電図筋緊張症の減少を引き起こしたことを示す。ＰＮＡ−（ＣＡＧ）６マーまたはＰＮＡ−（ＣＡＧ）９マー（すなわち、２または３ＣＡＧ繰り返し）は、単一機会で脛骨前部筋肉中に注入した。筋緊張症は、筋肉内注入後３週に筋電図によって評価した。コントロールとして、ビヒクル単独（リン酸緩衝化生理食塩水）を、対側肢の脛骨前部筋肉中に注入した。すべてのマウスは、処置の前に強い作用の筋緊張症を有した。どの肢にＰＮＡ 対 コントロールを受けたかについての割り当てはランダム化され、そしてＥＭＧ分析は、この割り当てが分からないようにして実施した。
ＩＶ．詳細な説明
４２．本発明の化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法を開示および説明する前に、これらは、他に特定されない限り、特定の合成方法または特定の組換え生物工学方法にも、他に特定されない限り、特定の試薬にも限定されず、当然のことながら、そのようなものとして変動し得ることが理解されるべきである。また、本明細書に使用される用語が、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定するとは意図されないことが理解されるべきである。
Ａ．定義
４３．本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「薬学的キャリア」への言及は、２つ以上のそのようなキャリアの混合物などを含む。
４４．範囲は、１つの「約」特定の値から、および／または別の「約」特定の値までとして表現され得る。このような範囲を表現する場合、別の実施形態は、この１つの特定の値から、および／またはその他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用して、近似として値を表現する場合、この特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。各々の範囲の終点が、他の終点に関していること、および他の終点とは独立していることの両方において有意であることがさらに理解される。本明細書に開示される多くの値が存在し、各々の値が、その値自体に加えて「約」その特定の値と本明細書に開示されていることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。値が開示される場合、当業者に適切に理解されるように、その値「未満またはそれに等しい」、「その値より大きいかまたはそれと等しい」および値間の可能性のある範囲もまた開示されることもまた理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０未満かまたは１０に等しい」ならびに「１０より大きいかまたは１０に等しい」もまた開示される。本出願を通して、データが多くの異なる様式で提供され、このデータが終点および開始点ならびにデータ点の任意の組み合わせの範囲を示すこともまた理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が開示される場合、１０と１５との間と同様に、１０より大きいおよび１５より大きい、１０より大きいかまたは１０に等しいおよび１５より大きいかまたは１５に等しい、１０未満および１５未満、１０未満かまたは１０に等しいおよび１５未満かまたは１５に等しいならびに１０に等しいおよび１５に等しいが開示されているとみなされることが理解される。
４５．本明細書および続く特許請求の範囲において、参照が、以下の意味を有すると定義される多くの用語に対してなされる。
４６．「必要に応じた（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」とは、続いて記載される事象または状況が生じても生じなくてもよく、この記載は、この事象または状況が生じた場合および生じなかった場合を含むことを意味する。
４７．「プライマー」は、一部の型の酵素的操作を支持することができ、そしてその酵素的操作が起こり得るように標的核酸とハイブリダイズし得る、プローブのサブセットである。プライマーは、酵素的操作を妨害しない当該分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体またはヌクレオチドアナログの任意の組み合わせから作製され得る。
４８．「プローブ」は、例えば、ハイブリダイゼーションを介して、代表的には配列特異的な様式で、標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該分野においてよく理解され、本明細書で考察される。代表的に、プローブは、当該分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体またはヌクレオチドアナログの任意の組み合わせから作製され得る。
４９．本出願を通して、ポリＣＵＧリピートＲＮＡまたはポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐＲＮＡに対して種々の参照がなされる。これらの用語が、この説明および特許請求の範囲を通して交換可能に使用され得ることが理解され、そして本明細書において意図される。同様に、本出願を通して、ポリＣＣＵＧリピートＲＮＡまたはポリ（ＣＣＵＧ）ｅｘｐに対する参照がなされる。これらの用語が、この説明および特許請求の範囲を通して交換可能に使用され得ることもまた理解され、そして本明細書において意図される。
５０．本出願を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、その全体において、本出願が属する技術水準をより完全に記載するために参考として本出願に援用される。開示された参考文献はまた、その参考文献が依拠される文において議論される、参考文献に含まれる資料（ｍａｔｅｒｉａｌ）に関して、個別かつ具体的に参考として本明細書に援用される。
５１．筋緊張性ジストロフィ１型（ＤＭ１）（成人における筋ジストロフィの最も一般的な形態（７，４００中に約１の頻度））は、筋肉、心臓および脳をおかす遺伝性疾患である。ＤＭ１は、変異体遺伝子に由来するｍＲＮＡが直接的な毒性作用を有する新規な疾患機構を含む。毒性の機能獲得型（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）の変異体ｍＲＮＡは、それがコードするタンパク質とはまったく無関係である。
５２．ＤＭ１は、ＤＭＰＫ（ＤＭプロテインキナーゼをコードする遺伝子）の３’非翻訳領域におけるＣＴＧリピートの拡大によって生じる（（１））。新規なＲＮＡ媒介性疾患の過程がＤＭ１において最近明らかとなった。変異体ＤＭＰＫ対立遺伝子の転写物形態は、拡大したＣＵＧリピートを含み、本明細書においてこれをポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐと称する。リピートを保持する転写物は、核から輸送されない（Ｔａｎｅｊａ ＫＬら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９５；１２８（６）：９９５−１００２；Ｄａｖｉｓ ＢＭら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９７；９４（１４）：７３８８−７３９３）。その代わり、これらは、核の病巣に蓄積する。ここで、タンパク質は、病巣にリクルートされ、一部のタンパク質は、ＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡに結合する（例えば、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ（ＭＢＮＬ）ファミリー（Ｍｉｌｌｅｒ ＪＷら、ＥＭＢＯ Ｊ ２０００；１９（１７）：４４３９−４４４８）内のタンパク質）。ＭＢＮＬの機能の１つは、プレ−ｍＲＮＡの可変スプライシングを制御することである。しかしながら、核の病巣内のＭＢＮＬタンパク質の隔離は、プレ−ｍＲＮＡの選択された群についての可変スプライシングの異常な制御をもたらす（Ｋａｎａｄｉａ ＲＮら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３；３０２（５６５２）：１９７８−１９８０；（６）。このことは、核の他の領域からのＭＢＮＬの枯渇の結果である。この制御欠陥は、本明細書において「スプライス異常（ｓｐｌｉｃｅｏｐａｔｈｙ）」という。ＤＭ１の症状（例えば、ミオトニー）は、スプライシングの制御に対する影響（すなわち、スプライス異常）に直接帰すことができる（Ｍａｎｋｏｄｉ Ａら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２００２；３５−４４）。ＤＭ１におけるスプライス異常が、有意な程度まで、ＭＢＮＬファミリー（ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ １（ＭＢＮＬ１）、ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ ２（ＭＢＮＬ２）およびｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ ３（ＭＢＮＬ３）を含む）におけるスプライシング因子の隔離によって説明することができるという証拠が本明細書に開示される。ＭＢＮＬファミリーにおけるスプライシング因子はまた、ＤＭ２におけるポリＣＣＵＧ拡大リピートの核の病巣に隔離される。例えば、以下が、本明細書に開示される：（１）ＭＢＮＬ１が、ＤＭ１筋肉細胞における核質から顕著に枯渇される。なぜなら、それは、リボ核（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｒ）の病巣にリクルートされるからである；（２）ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの発現およびＭＢＮＬ１の消散（ａｂｌａｔｉｏｎ）は、マウス骨格筋においてスプライシングの制御に対して同等の作用を有する；（３）ＤＭ１におけるスプライス異常は、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ発現マウスまたはＭＢＮＬ１ノックアウトマウスで観察されるものと顕著に類似する（Ｌｉｎ Ｘら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００６）；ならびに（４）ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ発現マウスにおけるスプライス異常は、ＭＢＮＬ１の過剰発現によって治される。したがって、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐおよびＭＢＮＬ１とのその相互作用は、治療のための有効な標的である。
５３．神経性障害の中でも、治療剤のハイスループットスクリーニングの使用を介して有効な処置を開発する可能性が、ＤＭ１の場合、特に魅力的である。ＤＭ１変異は、必須タンパク質の不在をもたらさず、また、変異体タンパク質の有害な作用も生成しない。その代わり、重要な問題はＭＢＮＬ１の誤局在（ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）であり、結果は、新生児（未熟）組織で通常発現されるスプライスアイソフォーム（ｓｐｌｉｃｅ ｉｓｏｆｏｒｍ）の、成体組織における異常な発現である（Ｌｉｎ Ｘら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００６）。前駆症状性（ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ）ＤＭ１患者（Ｍａｎｋｏｄｉ Ａら、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００１；１０：２１６５−２１７０）および低いポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの発現を有する表現型では正常なトランスジェニックマウス（Ｍａｎｋｏｄｉ Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０００；２８９（５４８５）：１７６９−１７７３）におけるリボ核の病巣の知見は、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの閾値下（ｓｕｂｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の蓄積は筋肉の機能に何の認識可能な影響も与えなかったことを示す。したがって、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの適度な減少またはリボ核の病巣からのＭＢＮＬ１の部分的な放出が、大きな治療効果に変換する。薬物療法に注目することによって、全身の治療効果は、疾患の進行の防止と同様に達成され得る。しかしながら、疾患の過程の性質に基づいて、表現型の逆転が達成され得ることも開示されている。例えば、骨格筋（内因的な再生能力が高い組織）において、ＤＭ１は、主に線維萎縮（際立った可逆性の病変）を生成し、線維症または壊死は少ししか生成しない。さらに、ＤＭ１は、表現型の異なる一面が、異なる転写物に対するスプライス異常の影響まで構成要素に分析（ｐａｒｓｅ）され得、それによって多くの異なる経路に影響を与え得る「複合的な（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）」疾患である。多くの場合において、スプライス異常は、不可逆的な細胞変性ではなく、機能障害をもたらし得る。例えば、ＤＭ１におけるミオトニーは、塩化物チャネロパシー（ｃｈａｎｎｅｌｏｐａｔｈｙ）に起因する機能的な欠陥であり（Ｍａｎｋｏｄｉ Ａら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２００２；３５−４４）、データは、これが、ＭＢＮＬ１のＡＡＶ媒介性過剰発現、またはミススプライシングされた（ｍｉｓ−ｓｐｌｉｃｅｄ）エキソンを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかによってトランスジェニックマウスモデルにおいて可逆的であることを示す。同様な論理によって、インスリンレセプターの異常なスプライシングに起因するインスリン抵抗性はまた、可逆的である可能性がある（Ｓａｖｋｕｒ ＲＳら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００１；２９（１）：４０−４７）。ＤＭ１に関連するスプライス異常を修正することによって、疾患が処置され得ることが、本明細書において理解される。例えば、ＭＢＮＬ１とポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐとの相互作用を阻害することによって、ＭＢＮＬ１が、可変スプライシングされた転写物に対するその作用を自由に再開し得るか、他のＣＵＧ相互作用タンパク質の隔離を阻害することによって、その正常な機能が修復され得る。ＭＢＮＬ１とポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐとの相互作用を阻害する１つの方法は、結合したＭＢＮＬ１を別の分子で置換することによる。
Ｂ．スクリーニングの方法
５４．タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する薬剤（ａｇｅｎｔ）をスクリーニングする方法が本明細書に開示され、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）にリガンドを捕捉させる工程；ｂ）標識化されたタンパク質とリガンドとを混合する工程；ｃ）薬剤と工程ｂの混合物とを接触させる工程；ｄ）標識のレベルを決定する工程；ならびにｅ）コントロールに対して標識の量を比較する工程、ここで、標識のレベルの減少は、相互作用を阻害する薬剤を示す。したがって、例えば、方法が開示される。
５５．本発明のタンパク質は、任意のポリＣＵＧまたはポリＣＣＵＧ相互作用タンパク質あるいはポリＣＵＧリピートまたはポリＣＣＵＧリピートによって隔離されるタンパク質であり得ることが理解される。本発明のタンパク質の例は、ＲＮＡ結合タンパク質のＭｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄファミリーのメンバー（ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２およびＭＢＮＬ３を含む）である。Ｍｕｃｌｅｂｌｉｎｄタンパク質は、可変スプライシングの制御において有意な役割を果たす。ＤＭ１疾患の過程の間、ＭＢＮＬタンパク質は、ポリＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡまたはポリＣＣＵＧｅｘｐ ＲＮＡとの相互作用を介して、リボ核の病巣内に隔離され、可変スプライシング機能の制御不全（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）をもたらす。
５６．「阻害する」、「阻害すること」および「阻害」とは、活性、応答、状態、疾患または他の生物学的パラメータを減少させることを意味する。これは、活性、応答、状態または疾患の完全な消散を含み得るが、これらに限定されない。これはまた、天然レベルまたはコントロールレベルと比較して、例えば、活性、応答、状態または疾患における１０％の低下を含み得る。したがって、低下は、天然レベルまたはコントロールレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％またはその間の低下の任意の量であり得る。
５７．本明細書に開示された方法は、基材に結合したリガンドに関する。「リガンド」とは、タンパク質によって結合され得る、任意のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸またはヌクレオチド鎖（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡの全ての形態を含む）をいい得ることが理解される。したがって、例えば、ポリＣＵＧリピートＲＮＡまたはポリＣＣＵＧリピートＲＮＡであるリガンドが本明細書に開示される。したがって、タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する因子をスクリーニングする方法が本明細書に開示され、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）基材にリガンドを捕捉させる工程；ｂ）標識化されたタンパク質とリガンドとを混合する工程；ｃ）薬剤と工程ｂの混合物とを接触させる工程；ｄ）標識のレベルを決定する工程；ならびにｅ）コントロールに対して標識の量を比較する工程、ここで、標識のレベルの減少は、相互作用を阻害する薬剤を示し、このリガンドは、ポリＣＵＧ ｍＲＮＡまたはポリＣＣＵＧリピートＲＮＡである。
５８．当業者が、タンパク質−リガンド相互作用の順序を逆転させることによって、アッセイが有効性を損なうことがないことを認識することも理解される。したがって、当業者は、結合したタンパク質および標識化されたタンパク質を含む方法もまた有効であることを認識する。したがって、タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する因子をスクリーニングする方法が本明細書に開示され、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）基材に結合したタンパク質と標識化されたリガンドとを混合する工程；ｂ）薬剤と工程ａの混合物とを接触させる工程；ｃ）標識のレベルを決定する工程；ならびにｄ）コントロールに対して標識の量を比較する工程、ここで、標識のレベルの減少は、相互作用を阻害する薬剤を示す。同様に、タンパク質とリガンドを混合する前に、薬剤と本方法のタンパク質またはリガンドとを接触させることもまた有効であることが理解される。したがって、相互作用を防止するために、工程ａの前に薬剤をリガンドまたはタンパク質と接触させる方法が本明細書に開示され、これもまた有効である。したがって、タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する因子をスクリーニングする方法が本明細書に開示され、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）薬剤とタンパク質または標識化されたリガンドとを接触させる工程；ｂ）タンパク質と標識化されたリガンドとを混合する工程；ｃ）標識のレベルを決定する工程；ならびにｄ）コントロールに対して標識の量を比較する工程、ここで、タンパク質に結合した標識のレベルの減少は、相互作用を阻害する薬剤を示す。
５９．基材とは、分子が結合され得る固体支持構造体をいう。基材は、任意の固体材料を含み得る。これは、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フッ化炭素、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物（ｐｏｌｙａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、感応化されたシラン、ポリプロピルフマラート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸のような材料を含む。基材は、薄膜、メンブレン、ボトル、ディッシュ、繊維、ゲル、編まれた繊維、成形されたポリマー、粒子、ビーズ、微粒子または組み合わせを含む任意の有用な形態を有し得る。基材は、多孔質であっても多孔質でなくてもよい。チップは、材料の矩形または正方形の小片である。基材のための有用な形態は、シート、フィルムおよびチップである。基材のための有用な形態は、マイクロタイターディッシュである。このようなディッシュは、例えば、ニトロセルロースの底部を有するポリスチレンディッシュまたはポリスチレンディッシュであり得る。
６０．本方法のリガンドまたはタンパク質を基材に結合させるために当該分野で公知の任意の方法を使用し得ることが意図される。このような結合は、例えば、タンパク質を基材に接触させることによって直接的にか、またはＧＳＴなどの分子の使用を介して間接的に生じ得る。加えて、基材への結合は、複数の結合反応を介して生じ得る。例えば、基材は、ビオチン化されたリガンド、タンパク質または中間オリゴヌクレオチド（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｒｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）が結合し得る、ストレプトアビジンでコーティングされ得る。ビオチン化オリゴヌクレオチドがストレプトアビジンに結合する場合、相補的なリガンドが、このオリゴヌクレオチドに結合し得る。例えば、中間オリゴヌクレオチドは、ビオチン化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含み得る。あるいは、リガンドには、ＤＭＰＫ遺伝子由来のＲＮＡ配列または基材への捕捉を可能にする他の配列が隣接し得る。
６１．開示された方法は、当該分野で公知の標識化された部分を検出する任意の手段を利用し得る。本明細書において、「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、以下が挙げられる：３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ ｒｅａｇｅｎｔ）、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴにおいて一般的に使用されるような）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテン、および例えば、放射性標識をペプチドに取り込むことによって検出可能にされ得るか、またはペプチドと特異的に反応性である抗体を検出するために使用され得るタンパク質。したがって、検出方法は、例えば、異方性（ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ）を含み得る。
６２．本明細書に使用されるように、標識としては、蛍光色素、結合対のメンバー（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）、金属（例えば、金）、または、例えば、着色した基質または蛍光を生成することによって検出され得る分子と特異的に相互作用し得るエピトープタグが挙げられ得る。タンパク質を検出可能に標識化するのに適切な物質としては、蛍光色素（蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）およびフルオロフォアとしても本明細書において既知である）および比色的な（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ）物質と反応する酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）が挙げられる。蛍光色素の使用は、これらが非常に少量で検出され得るので、本発明の実施に概して好ましい。さらに、複数の抗原を単一のアレイで反応させる場合において、各々の抗原を、同時検出のために異なる蛍光化合物で標識化することができる。アレイ上の標識化されたスポットを、蛍光計（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を使用して検出する。シグナルの存在は、特異的な抗体に結合した抗原を示す。
６３．フルオロフォアは、発光する化合物または分子である。代表的に、フルオロフォアは、１つの波長の電磁エネルギーを吸収し、第二の波長の電磁エネルギーを放出する。フルオロフォアの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１，５ ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８−ＡＮＳ；４−メチルウンベリフェロン；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−カルボキシナフトフルオレセイン；５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）；５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＡＴ）；５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；６−カルボキシローダミン６Ｇ；６−ＣＲ ６Ｇ；６−ＪＯＥ；７−アミノ−４−メチルクマリン；７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；７−ヒドロキシ−４−１メチルクマリン；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン（ＡＣＭＡ）；ＡＢＱ；酸性フクシン；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ；エクオリン（発光タンパク質）；ＡＦＰ−自己蛍光タンパク質（ＡｕｔｏＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）−（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ＳｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰを参照のこと）；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０ＴＭ；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０ＴＭ；アリザリンＣｏｍｐｌｅｘｏｎ；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ−Ｓ；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；ＡＭＣＡ−Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アニリンブルー；ステアリン酸アントロシル（Ａｎｔｈｒｏｃｙｌ ｓｔｅａｒａｔｅ）；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ；ＡＰＴＳ；Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ；Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｏｒａｎｇｅ Ｒ；Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｒｅｄ ６Ｂ；Ａｓｔｒａｚｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ ７ ＧＬＬ；アタブリン；ＡＴＴＯ−ＴＡＧＴＭ ＣＢＱＣＡ；ＡＴＴＯ−ＴＡＧＴＭ ＦＱ；オーラミン；Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ Ｇ；Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ；ＢＡＯ ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール（Ｂｉｓａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｏｘａｄｉａｚｏｌｅ））；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；硫酸ベルベリン（Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ Ｓｕｌｐｈａｔｅ）；βラクタマーゼ；ＢＦＰ、青色シフトしたＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）；青色蛍光タンパク質；ＢＦＰ／ＧＦＰ ＦＲＥＴ；Ｂｉｍａｎｅ；ビスベンゼミド（Ｂｉｓｂｅｎｚｅｍｉｄｅ）；ビスベンゼミド（Ｂｉｓｂｅｎｚｉｍｉｄｅ）（Ｈｏｅｃｈｓｔ）；ビス−ＢＴＣ；Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＦＦＧ；Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ ＳＶ；ＢＯＢＯＴＭ −１；ＢＯＢＯＴＭ−３；Ｂｏｄｉｐｙ４９２／５１５；Ｂｏｄｉｐｙ４９３／５０３；Ｂｏｄｉｐｙ５００／５１０；Ｂｏｄｉｐｙ；５０５／５１５；Ｂｏｄｉｐｙ ５３０／５５０；Ｂｏｄｉｐｙ ５４２／５６３；Ｂｏｄｉｐｙ ５５８／５６８；Ｂｏｄｉｐｙ ５６４／５７０；Ｂｏｄｉｐｙ ５７６／５８９；Ｂｏｄｉｐｙ ５８１／５９１；Ｂｏｄｉｐｙ ６３０／６５０−Ｘ；Ｂｏｄｉｐｙ ６５０／６６５−Ｘ；Ｂｏｄｉｐｙ ６６５／６７６；Ｂｏｄｉｐｙ Ｆｌ；Ｂｏｄｉｐｙ ＦＬ ＡＴＰ；Ｂｏｄｉｐｙ Ｆ１−セラミド；Ｂｏｄｉｐｙ Ｒ６Ｇ ＳＥ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−Ｘ結合体；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−Ｘ， ＳＥ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ ＡＴＰ；Ｂｏｄｉｐｙ ＴＲ−Ｘ ＳＥ；ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１；ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−３；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｕｌｐｈｏｆｌａｖｉｎ ＦＦ；ＢＴＣ；ＢＴＣ−５Ｎ；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムゾン−；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン−１ Ｃａ２＋色素；カルシウムグリーン−２ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−５Ｎ Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−Ｃ１８ Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフロールホワイト；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）；Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＴＭ；Ｃａｓｃａｄｅ Ｙｅｌｌｏｗ；カテコールアミン；ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；ＣＦＤＡ；ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）；ＣＦＰ／ＹＦＰ ＦＲＥＴ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ−ＮＥＲＦ；ＣＭＦＤＡ；セレンテラジン；セレンテラジンｃｐ；セレンテラジンｆ；セレンテラジンｆｃｐ；セレンテラジンｈ；セレンテラジンｈｃｐ；セレンテラジンｉｐ；セレンテラジンｎ；セレンテラジンＯ；クマリンファロイジン；Ｃ−フィコシアニン；ＣＰＭ Ｉ メチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣホルマザン；Ｃｙ２ＴＭ；Ｃｙ３．１ ８；Ｃｙ３．５ＴＭ；Ｃｙ３ＴＭ；Ｃｙ５．１ ８；Ｃｙ５．５ＴＭ；Ｃｙ５ＴＭ；Ｃｙ７ＴＭ；シアンＧＦＰ；サイクリックＡＭＰ Ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒ（ＦｉＣＲｈＲ）；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；塩化ダンシル；ダンシルＤＨＰＥ；フッ化ダンシル；ＤＡＰＩ；Ｄａｐｏｘｙｌ；Ｄａｐｏｘｙｌ ２；Ｄａｐｏｘｙｌ ３’ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）；Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ；Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ（非比率（ｎｏｎ−ｒａｔｉｏ））；ＤｉＡ（４−Ｄｉ １６−ＡＳＰ）；ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ−脂肪親和性トレーサー（Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ Ｔｒａｃｅｒ）；ＤｉＤ（ＤｉｌＣ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）；ＤｉＩ（ＤｉｌＣ１８（３））；Ｉ ジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣｌ８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（ＤｉｌＣ１８（７））；ＤＭ−ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；ドーパミン；ＤｓＲｅｄ；ＤＴＡＦ；ＤＹ−６３０−ＮＨＳ；ＤＹ−６３５−ＮＨＳ；ＥＢＦＰ；ＥＣＦＰ；ＥＧＦＰ；ＥＬＦ ９７；エオジン；エリトロシン；エリトロシンＩＴＣ；エチジウムブロマイド；エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）；Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ；ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ；塩化ユーロピウム（１１１）；ＥＹＦＰ；Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ；ＦＤＡ；フォイルゲン（パラローザニリン）；ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；Ｆｌａｚｏ Ｏｒａｎｇｅ；Ｆｌｕｏ−３；Ｆｌｕｏ−４；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；フルオレセインジアセテート；Ｆｌｕｏｒｏ−Ｅｍｅｒａｌｄ；Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ（ヒドロキシスチルバミジン）；Ｆｌｕｏｒ−Ｒｕｂｙ；ＦｌｕｏｒＸ；ＦＭ １−４３ＴＭ；ＦＭ ４−４６；Ｆｕｒａ ＲｅｄＴＭ （高ｐＨ）；Ｆｕｒａ ＲｅｄＴＭ／Ｆｌｕｏ−３；Ｆｕｒａ−２；Ｆｕｒａ−２／ＢＣＥＣＦ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｙｅｌｌｏｗ １ＯＧＦ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｐｉｎｋ ３Ｇ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ Ｙｅｌｌｏｗ ５ＧＦ；ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ；（ＣＣＦ２）；ＧＦＰ （Ｓ６５Ｔ）；ＧＦＰ 赤色シフト（ｒｓＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型、非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型、ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰｕｖ；Ｇｌｏｘａｌｉｃ Ａｃｉｄ；Ｇｒａｎｕｌａｒ ｂｌｕｅ；ヘマトポルフィリン；Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８；Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２；Ｈｏｅｃｈｓｔ ３４５８０；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ）；ヒドロキシトリプタミン；Ｉｎｄｏ−１、高カルシウム；Ｉｎｄｏ−１ 低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ Ｃｆ；ＪＣ−１；ＪＯ ＪＯ−１；ＪＯ−ＰＲＯ−１；ＬａｓｅｒＰｒｏ；ラウルダン（Ｌａｕｒｏｄａｎ）；ＬＤＳ ７５１（ＤＮＡ）；ＬＤＳ ７５１（ＲＮＡ）；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＰＡＦ；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＳＦ；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ ＷＳ；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；カルセイン／エチジウムホモダイマー；ＬＯＬＯ−１；ＬＯ−ＰＲＯ−１；；ルシファーイエロー；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｂｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅ；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ；Ｌｙｓｏ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｂｌｕｅ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｇｒｅｅｎ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ；Ｍａｇ Ｇｒｅｅｎ；Ｍａｇｄａｌａ Ｒｅｄ（フロキシンＢ）；Ｍａｇ−Ｆｕｒａ Ｒｅｄ；Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−２；Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−５；Ｍａｇ−ｌｎｄｏ−１；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；Ｍａｒｉｎａ Ｂｌｕｅ；Ｉ Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ １０ ＧＦＦ；Ｍａｘｉｌｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ ８ ＧＦＦ；メロシアニン（Ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎ）；メトキシクマリン；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｏｒａｎｇｅ；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ−ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾキセジドール（ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘｅｄｉｄｏｌｅ）；ノルアドレナリン；Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ；ｉ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｙｅｌｌｏｗ；Ｎｙｌｏｓａｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｌａｖｉｎ Ｅ８Ｇ；Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ；Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８；Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５００；Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５１４；Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ；パラローザニリン（フォイルゲン）；ＰＢＦＩ；ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（Ｒｅｄ ６１３）；フロキシンＢ（Ｍａｇｄａｌａ Ｒｅｄ）；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＡＲ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＢＫＬ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ Ｒｅｖ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ ＲＰＡ；ホスフィン３Ｒ；ＰｈｏｔｏＲｅｓｉｓｔ；フィコエリトリン Ｂ ［ＰＥ］；フィコエリトリン Ｒ ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６ （Ｓｉｇｍａ）；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｂｌｕｅ Ｂｌａｃｋ；ＰＯＰＯ−１；ＰＯＰＯ−３；ＰＯ−ＰＲＯ−１；ＰＯ−Ｉ ＰＲＯ−３；プリムリン（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ）；Ｐｒｏｃｉｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；Ｐｙｒｏｚａｌ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｆｌａｖｉｎ ７ＧＦ；ＱＳＹ ７；キナクリンマスタード；レゾルフィン；ＲＨ ４１４；Ｒｈｏｄ−２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５ ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ ２００；ローダミンＢ ｅｘｔｒａ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン（Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ）；ローダミン：ファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ−フィコシアニン；Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）；ｒｓＧＦＰ；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５
Ｌ；Ｓ６５Ｔ；Ｓａｐｐｈｉｒｅ ＧＦＰ；ＳＢＦＩ；セロトニン；Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ２Ｂ；Ｓｅｖｒｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ ４Ｇ；Ｓｅｖｒｏｎ Ｉ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｒｅｄ Ｂ；Ｓｅｖｒｏｎ Ｏｒａｎｇｅ；Ｓｅｖｒｏｎ Ｙｅｌｌｏｗ Ｌ；ｓｇＢＦＰＴＭ（高輝度（ｓｕｐｅｒ ｇｌｏｗ）ＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰＴＭ（高輝度ＧＦＰ）；ＳＩＴＳ（プリムリン；スチルベンイソチオ硫酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ−１；ＳＮＡＦＬ−２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦ１；Ｓｏｄｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ；ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ；ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ；ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ；Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ；ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢおよびＣ；スルホローダミンＥｘｔｒａ；ＳＹＴＯ １１；ＳＹＴＯ １２；ＳＹＴＯ １３；ＳＹＴＯ １４；ＳＹＴＯ １５；ＳＹＴＯ １６；ＳＹＴＯ １７；ＳＹＴＯ １８；ＳＹＴＯ ２０；ＳＹＴＯ ２１；ＳＹＴＯ ２２；ＳＹＴＯ ２３；ＳＹＴＯ ２４；ＳＹＴＯ ２５；ＳＹＴＯ ４０；ＳＹＴＯ ４１；ＳＹＴＯ ４２；ＳＹＴＯ ４３；ＳＹＴＯ ４４；ＳＹＴＯ ４５；ＳＹＴＯ ５９；ＳＹＴＯ ６０；ＳＹＴＯ ６１；ＳＹＴＯ ６２；ＳＹＴＯ ６３；ＳＹＴＯ ６４；ＳＹＴＯ ８０；ＳＹＴＯ ８１；ＳＹＴＯ ８２；ＳＹＴＯ ８３；ＳＹＴＯ ８４；ＳＹＴＯ ８５；ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ；ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ；ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；Ｔｅｘａｓ ＲｅｄＴＭ；Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ−ＸＴＭ結合体；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＯＮ；Ｔｈｉｏｌｙｔｅ；チオゾールオレンジ；Ｔｉｎｏｐｏｌ ＣＢＳ（カルコフロールホワイト）；ＴＩＥＲ；ＴＯ−ＰＲＯ−１；ＴＯ−ＰＲＯ−３；ＴＯ−ＰＲＯ−５；ＴＯＴＯ−１；ＴＯＴＯ−３；Ｔｒｉｃｏｌｏｒ（ＰＥ−Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣ テトラメチルローダミンイソチオシアネート；Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ；Ｔｒｕ Ｒｅｄ；Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ；ウラニンＢ；Ｕｖｉｔｅｘ ＳＦＣ；ｗｔ ＧＦＰ；ＷＷ ７８１；Ｘ−ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；黄色ＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ−ＰＲＯ−１；ＹＯ−ＰＲＯ ３；ＹＯＹＯ−１；Ｙ０Ｙ０−３；Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ；チアゾールオレンジ（挿入色素（ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ））；量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）のような半導体ナノ粒子；またはケージド（ｃａｇｅｄ）フルオロフォア（光または他の電磁エネルギー供給源によって活性化され得る）あるいはこれらの組み合わせ。
６４．放射性核種のような改変単位（ｍｏｄｉｆｉｅｒ ｕｎｉｔ）は、本明細書に記載の任意の化合物に取り込まれ得るか、またはハロゲン化によって直接付着され得る。この実施形態で有用な放射性核種の例としては、トリチウム、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２４、アスタチン−２１０、炭素−１１、炭素−１４、窒素−１３、フッ素−１８が挙げられるが、これらに限定されない。別の局面において、放射性核種は、キレート化基（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）によって連結基または結合に付着され得、次にこのキレート化基は、化合物に直接付着されるか、またはリンカーによって結合される。この局面で有用な放射性核種の例としては、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６、Ｇａ−６８、Ｒｅ−１８８、Ｙ−９０、Ｓｍ−１５３、Ｂｉ−２１２、Ｃｕ−６７、Ｃｕ−６４およびＣｕ−６２が挙げられるが、これらに限定されない。これらのような放射性標識化技術は、放射性薬品産業において慣例的である。
６５．放射性標識化された化合物は、哺乳動物（例えば、ヒト）において神経学的疾患（例えば、神経変性疾患）もしくは精神状態を診断するか、またはこのような疾患もしくは状態の進行もしくは処置を追跡する画像化剤（ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）として有用である。放射性標識化された本明細書に記載の化合物は、陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）またはシングルフォトンエミッションＣＴ（ＳＰＥＣＴ）のような画像化技術と組み合わせて便利に使用され得る。
６６．標識化は、直接的または間接的のいずれかであり得る。直接的な標識化において、検出抗体（目的の分子に対する抗体）または検出分子（目的の分子に対する抗体によって結合され得る分子）は標識を含む。標識の検出は、検出抗体または検出分子の存在を示し、これは、今度は、それぞれ目的の分子または目的の分子に対する抗体の存在を示す。間接的な標識化において、追加の分子または部分が、免疫複合体と接触させられるか、または免疫複合体の部位で生成される。例えば、酵素のようなシグナル生成分子もしくは部分は、検出抗体または検出分子に付着され得るか、またはこれらと会合し得る。次に、シグナル生成分子が、免疫複合体の部位において検出可能なシグナルを生成し得る。例えば、酵素は、適切な基質を供給された場合、免疫複合体の部位において可視または検出可能な生成物を産生し得る。ＥＬＩＳＡは、この型の間接的な標識化を使用する。
６７．間接的な標識化の別の例として、目的の分子または目的の分子に対する抗体（一次抗体）のいずれかに結合し得る追加の分子（結合剤といわれ得る）（例えば、一次抗体に対する二次抗体）を、免疫複合体と接触させることができる。追加の分子は、標識またはシグナル生成分子もしくは部分を有し得る。追加の分子は、抗体であり得り、したがって二次抗体と称され得る。一次抗体への二次抗体の結合は、第一の（または一次）抗体および目的の分子とのいわゆるサンドウィッチを形成し得る。この免疫複合体は、二次免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下でかつ十分な期間、標識化された二次抗体と接触され得る。次に、一般的に、二次免疫複合体を洗浄し得、あらゆる非特異的に結合した、標識化された二次抗体を除去し得、そして、次に、二次免疫複合体に残存する標識を検出し得る。追加の分子は、ビオチン／アビジンの対のような互いに結合し得る分子または部分の対の一方であり得るか、またはそれを含み得る。この様式において、検出抗体または検出分子は、対の他方のメンバーを含まなければならない。
６８．間接的な標識化の他の様式としては、２工程アプローチによる一次免疫複合体の検出が挙げられる。例えば、目的の分子または対応する抗体への結合親和性を有する、抗体のような分子（第一の結合剤といわれ得る）を使用して、先に記載された二次免疫複合体を形成することができる。洗浄後、二次免疫複合体を、再度、免疫複合体の形成を可能にするのに有効な条件下でかつ十分な期間、第一の結合剤への結合親和性を有する別の分子（第二の結合剤といわれ得る）と接触させ得る（したがって、三次免疫複合体を形成する）。第二の結合剤は、検出可能な標識またはシグナル生成分子もしくは部分に連結され得、このように形成された三次免疫複合体の検出を可能にする。このシステムは、シグナル増幅を提供し得る。
６９．タンパク質または特定のタンパク質に対する抗体のような物質の検出を伴う免疫アッセイとしては、標識を用いない（ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ）アッセイ、タンパク質分離法（すなわち、電気泳動）、固体支持体捕捉アッセイ（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｃａｐｔｕｒｅ ａｓｓａｙ）またはインビボ検出が挙げられる。標識を用いないアッセイは、一般的に、サンプル中の特定のタンパク質または特定のタンパク質に対する抗体の存在または不在を決定する診断手段である。タンパク質分離法はさらに、サイズまたは正味電荷のようなタンパク質の物理的性質を評価するのに有用である。捕捉アッセイは、一般的に、サンプル中の特定のタンパク質または特定のタンパク質に対する抗体の濃度を定量的に評価するのにより有用である。最後に、インビボ検出は、物質の空間的な発現パターンを評価するのに有用である（すなわち、物質が被験体、組織または細胞に見出され得る場合）。
７０．濃度が十分であるならば、抗体−抗原相互作用によって生成された分子の複合体（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）は、裸眼に対して可視であるが、より少量でも、光のビームを散乱させるその能力に起因して検出および測定され得る。複合体の形成は、両方の反応物が存在することを示し、免疫沈降アッセイにおいて、一定の濃度の試薬抗体を使用して特定の抗原を測定し（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）、そして試薬抗原を使用して特異的な抗体を検出する（［Ａｂ−Ａｇ］ｎ）。試薬種が、細胞（血球凝集アッセイにおけるように）または極めて小さな粒子（ラテックス凝集アッセイにおけるように）に事前にコーティングされる場合、コーティングされた粒子の「クランピング」は、かなり低い濃度で可視である。これらの基本原理に基づく種々のアッセイは一般的に使用され、これらとしては、オークターロニー免疫拡散アッセイ、ロケット免疫電気泳動ならびに免疫比濁（ｉｍｍｕｎｏｔｕｒｂｉｄｏｍｅｔｒｉｃ）および比濁分析（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイが挙げられる。このようなアッセイの主要な制限は、標識を使用するアッセイと比較して、制限された感度（より低い検出限界）であり、いくつかの場合、非常に高濃度の分析物が複合体形成を実際に阻害し得る事実により、手順をより複雑にする安全装置（ｓａｆｅｇｕａｒｄ）を必要とすることである。これらの群（Ｇｒｏｕｐ）１のアッセイの一部は、まさに抗体の発見にまでさかのぼり、これらのうちのいずれも実際の「標識」（例えば、Ａｇ−ｅｎｚ）を有さない。標識を使用しない他の種類の免疫アッセイは、免疫センサー（ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ）に依存し、現在、抗体−抗原相互作用を直接検出できる種々の機器が市販されている。大半は、固定したリガンドを有するセンサー表面上にエバネセント波を生成することに依存し、これは、リガンドへの結合を継続的にモニタリングすることを可能にする。免疫センサーは、より低コストの専用機器の到来とともに動的な相互作用の容易な調査を可能にし、将来において免疫分析に広範な応用が見出され得る。
７１．特定のタンパク質を検出する免疫アッセイの使用は、電気泳動によるタンパク質の分離を含み得る。電気泳動は、電場に応じた溶液中の荷電した分子の移動である。移動の速度は、電場；分子の正味電荷、サイズおよび形状、ならびにまた分子が移動している媒体のイオン強度、粘度および温度に依存する。分析ツールとして、電気泳動は、単純、迅速かつ高感度である。これは、単一の荷電した種の特性を研究するために、そして分離技術として分析的に使用される。
７２．一般的に、サンプルを、紙、酢酸セルロース、デンプンゲル、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲルのような支持マトリクス内で泳動（ｒｕｎ）する。マトリクスは、加熱によって生じる対流混合（ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ ｍｉｘｉｎｇ）を抑制し、電気泳動（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｒｕｎ）の記録を提供する：泳動の終わりに、マトリクスを染色し、スキャン、オートラジオグラフィまたは保存に使用できる。加えて、最も一般的に使用される支持マトリクス−アガロースおよびポリアクリルアミド−は、これらが多孔質ゲルであるという点において、サイズによって分子を分離する手段を提供する。多孔質ゲルは、大きな高分子の移動を遅滞させるか、または一部の場合において完全に妨害し、一方でより小さな分子が自由に移動させることによって篩として働き得る。希釈アガロースゲルは、一般的に同一の濃度のポリアクリルアミドよりもより剛性であり、取扱いが容易であるので、アガロースは、核酸、大きなタンパク質およびタンパク質複合体のようなより大きな高分子を分離するために使用される。取扱いおよびより高い濃度にすることが容易なポリアクリルアミドは、遅滞のために小さなゲル孔サイズを必要とする大半のタンパク質および小さなオリゴヌクレオチドを分離するために使用される。
７３．タンパク質は、両性の化合物である；したがって、それらの正味電荷は、それらが懸濁される媒体のｐＨによって決定される。その等電点よりも高いｐＨを有する溶液中において、タンパク質は、正味の負電荷を有し、電場においてアノードに向かって移動する。その等電点より低いと、タンパク質は、正に荷電し、カソードに向かって移動する。さらに、タンパク質によって運ばれる正味電荷は、そのサイズとは無関係である−すなわち、分子の単位質量（または長さ、タンパク質および核酸が線状高分子である場合）あたりに運ばれる電荷は、タンパク質毎に異なる。したがって、所定のｐＨかつ非変性条件下において、タンパク質の電気泳動の分離は、分子のサイズおよび電荷の両方によって決定される。
７４．ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、ポリペプチドバックボーンの「周りを包むこと」によってタンパク質を変性させる陰イオン洗剤であり、そしてＳＤＳは、１．４：１の質量比でかなり特定的にタンパク質に結合する。そうすることにおいて、ＳＤＳは、ポリペプチドに、その長さに比例して負電荷を付与する。さらに、それらが、サイズによる分離のために必要なランダム−コイル立体配置を採る前に、タンパク質中のジスルフィド架橋を還元すること（変性）が通常必要である；このことは、２−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール（ＤＴＴ）によってなされる。したがって、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離において、移動は、そのポリペプチドの固有の電気的電荷ではなく、分子量によって決定される。
７５．分子量の決定は、特徴付けるべきタンパク質に沿った既知の分子量のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってなされる。線形関係が、ＳＤＳ変性されたポリペプチドまたは天然核酸の分子量の対数とそのＲｆとの間に存在する。Ｒｆを、分子が移動した距離対マーカー色素の先端が移動した距離の比として計算する。電気泳動による相対的な分子量（Ｍｒ）を決定する簡単な方法は、移動した距離対既知のサンプルのｌｏｇ１０ＭＷの標準曲線をプロットし、同一のゲルで移動した距離を測定した後、サンプルのｌｏｇＭｒをを読み取ることである。
７６．二次元電気泳動において、タンパク質を、最初に１つの物理的特性に基づいて分別し、第二の工程において別の特性に基づいて分別する。例えば、等電集束法が、チューブ状ゲルで便利に実行される第一の次元のために使用され得、そしてスラブゲルにおけるＳＤＳ電気泳動が、第二の次元のために使用され得る。手順の一例は、Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．、Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７−４０２１（１９７５）（二次元電気泳動法に関するこの教示について、その全体が参考として本明細書に援用される）のものである。他の例としては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＬおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，ＮＧ，Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４２１−５４２５（１９７７）、Ｏｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．，Ｄｉｓｃ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｌ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１：３２１３４９（１９６４）（各々、電気泳動法に関する教示について、その全体が参考として本明細書に援用される）に見出されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
７７．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０（１９７０）（電気泳動法に関する教示について、その全体が参考として本明細書に援用される）は、ＳＤＳで変性したタンパク質を分離するための非連続系を開示する。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中の主要なイオンは、塩化物であり、トレイリングイオン（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｉｏｎ）はグリシンである。したがって、分離ゲルおよび濃縮ゲルは、（異なる濃度およびｐＨの）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液から作製されるが、タンクの緩衝液は、Ｔｒｉｓ−グリシンである。全ての緩衝液は、０．１％ ＳＤＳを含む。
７８．現行の方法で意図される電気泳動を使用する免疫アッセイの一例は、ウェスタンブロット分析である。ウェスタンブロットまたは免疫ブロットは、タンパク質の分子量の決定および異なるサンプル中に存在するタンパク質の相対量の測定を可能にする。検出方法は、化学ルミネセンスおよび発色（ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ）検出を含む。ウェスタンブロット分析についての標準的な方法は、例えば、Ｄ．Ｍ．Ｂｏｌｌａｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ （第２版 １９９６）ならびにＥ．Ｈａｒｌｏｗ ＆ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８），米国特許第４，４５２，９０１号（各々、ウェスタンブロット法に関する教示について、その全体が参考として本明細書に援用される）に見出され得る。一般的に、タンパク質は、ゲル電気泳動（通常、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離される。タンパク質を、特別なブロット紙（例えば、ニトロセルロース）のシートに移すが、他の型の紙またはメンブレンが使用され得る。タンパク質は、ゲル上と同じ分離のパターンを保持する。ブロットを、一般的なタンパク質（例えば、乳汁タンパク質）とともにインキュベートし、ニトロセルロース上に残存するあらゆる粘着性の場所に結合させる。次に、その特異的なタンパク質に結合することができる抗体を、溶液に添加する。
７９．特定の固定した抗原へ特異的な抗体を付着させることは、通常、色素形成基質（例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）または化学ルミネセンス基質を使用する、間接的酵素免疫アッセイ技術によって容易に可視化され得る。プロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）のための他の可能性は、蛍光標識またはラジオアイソトープ標識（例えば、フルオレセイン、１２５Ｉ）の使用を含む。抗体結合を検出するためのプローブは、結合体化された抗−免疫グロブリン、結合体化されたブドウ球菌のプロテインＡ（ＩｇＧを結合する）またはビオチン化一次抗体に対するプローブ（例えば、結合体化されたアビジン／ストレプトアビジン）であり得る。
８０．技術の力（ｐｏｗｅｒ）は、特定のタンパク質を、その抗原性およびその分子量によって同時に検出することに見出される。タンパク質を、最初にＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて質量で分離し、次に、免疫アッセイ工程において特異的に検出する。したがって、異種のサンプルにおいて目的のタンパク質の分子量を見積もるために、タンパク質の標準（ラダー）を同時に泳動し得る。
８１．ゲルシフトアッセイまたは電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は、定性的な様式および定量的な様式の両方において、ＤＮＡ結合タンパク質とその同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）ＤＮＡ認識配列との間の相互作用を検出するために使用され得る。例示的な技術は、Ｏｒｎｓｔｅｉｎ Ｌ．，Ｄｉｓｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ−１：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｙ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１２１：３２１−３４９（１９６４）ならびにＭａｔｓｕｄｉａｒａ，ＰＴおよびＤＲ Ｂｕｒｇｅｓｓ，ＳＤＳ ｍｉｃｒｏｓｌａｂ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８７：３８６−３９６（１９８７）（各々、ゲルシフトアッセイに関する教示について、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載される。
８２．一般的なゲルシフトアッセイにおいて、精製されたタンパク質または粗製の細胞抽出物は、標識化された（例えば、３２Ｐ−放射性標識化された）ＤＮＡまたはＲＮＡプローブとインキュベートされ得、次に、非変性ポリアクリルアミドゲルを介して遊離のプローブから複合体を分離し得る。複合体は、未結合のプローブよりもゆっくりとゲルを通って移動する。結合タンパク質の活性に依存して、標識化されたプローブは、二本鎖かまたは一本鎖のいずれかであり得る。ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）の検出のために、精製されたタンパク質または部分的に精製されたタンパク質または核の細胞抽出物のいずれかが、使用され得る。ＲＮＡ結合タンパク質の検出のために、精製されたタンパク質または部分的に精製されたタンパク質、あるいは核または細胞質の細胞抽出物が使用され得る。推定上の結合部位に対するＤＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合タンパク質の特異性は、目的のタンパク質の結合部位を含むＤＮＡもしくはＲＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドあるいは他の無関連の配列を使用する競合実験によって確立される。特異的競合因子（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）および非特異的競合因子の存在において形成される複合体の性質および強度における差異は、特異的な相互作用の同定を可能にする。＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｆａｑ／ｇｅｌｓｈｆａｑ．ｈｔｍｌ＞（２００５年３月２５日に最後に訪問した）で利用可能なＰｒｏｍｅｇａ，Ｇｅｌ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ ＦＡＱ（ゲルシフト法に関する教示について、その全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと。
８３． ゲルシフト法は、ポリアクリルアミド電気泳動ゲルのようなゲル中のタンパク質を検出するための、例えば、クマシー（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ）青色染料のコロイド形態を使用することを含み得る。このような方法は、例えば、Ｎｅｕｈｏｆｆら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ６：４２７−４４８（１９８５）ならびにＮｅｕｈｏｆｆら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ９：２５５−２６２（１９８８）（各々、ゲルシフト法に関する教示について、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載される。先に参照された従来のタンパク質アッセイ法に加えて、組み合わせ洗浄およびタンパク質染色組成物が、米国特許第５，４２４，０００号（ゲルシフト法に関するその教示について、その全体が参考として本明細書に援用される）に記載される。この溶液は、リン酸、硫酸および硝酸ならびに酸性紫色色素（Ａｃｉｄ Ｖｉｏｌｅｔ ｄｙｅ）を含み得る。
８４．放射性免疫沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）は、血清中の抗体を特異的に検出するために、放射性標識された抗原を使用する高感度のアッセイである。この抗原は、血清と反応させられ、次いで例えばプロテインＡセファロースビーズのような特別な試薬を使用して沈殿させられる。結合した放射性標識免疫沈澱物は、次いで、一般的にはゲル電気泳動によって分析される。放射性免疫沈殿アッセイ（ＲＩＰＡ）は、ＨＩＶ抗体の存在を診断するための確認試験としてしばしば使用される。ＲＩＰＡはまた、当該分野においては、Ｆａｒｒアッセイ、Ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎアッセイ、放射線免疫Ｐｒｅｃｉｐｉｔｉｎアッセイ、放射性免疫沈澱分析、放射性免疫沈澱分析、および放射性免疫沈澱分析ともいわれる。
８５．目的の特定のタンパク質を分離および検出するために電気泳動を利用する上述の免疫アッセイはタンパク質サイズの評価を可能にする一方で、タンパク質濃度の評価についてはさほど高感度ではない。しかしながら、タンパク質またはタンパク質に特異的な抗体が固体支持体（例えば、チューブ、ウェル、ビーズまたはセル）上に結合され、サンプルからそれぞれ抗体または目的のタンパク質を捕捉する、支持体上のタンパク質またはタンパク質に特異的な抗体の検出方法と組み合わせた免疫アッセイもまた企図される。そのような免疫アッセイの例としては、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、プロテインアレイ、マルチプレックスビーズアッセイ、および磁気捕捉が挙げられる。
８６．放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）は、特異的抗体または他のレセプター系への非標識物質の結合を、直接的または間接的のいずれかで測定するために、放射性標識された物質（放射リガンド）を使用する、抗原−抗体反応を検出するための古典的定量アッセイである。例えば、バイオアッセイの使用の必要なしに血液中のホルモンレベルを試験するために、放射性免疫アッセイは使用される。抗体形成を誘導することができるより大きなキャリアタンパク質（例えば、ウシガンマグロブリンまたはヒト血清アルブミン）に結合体化される場合、非免疫原性物質（例えば、ハプテン）もまた、測定され得る。ＲＩＡは、放射性抗原（ヨウ素原子がタンパク質中のチロシン残基に導入され得るという容易さに起因して、しばしば放射性アイソトープである１２５Ｉおよび１３１Ｉが使用される）と、その抗原に対する抗体とを混合することを包含する。この抗体は、一般的に、チューブまたはビーズのような固体支持体に結合される。非標識または「寒冷」抗原を、次いで、既知の量で加え、置換された標識抗原の量を測定する。最初に、放射性抗原が抗体に結合する。寒冷抗原が加えられると、これら２つが抗体結合部位に対して競合し、より高濃度の寒冷抗原では、より多くが抗体に結合し、放射性改変体と置き換わる。この結合された抗原が、溶液中の非結合抗体から分離され、そして各々の放射能を使用して結合曲線をプロットする。
８７．酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、またはより一般的な用語えある酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）は、タンパク質に対して特異的な抗体を検出することができる免疫アッセイである。そのようなアッセイにおいては、抗体結合試薬または抗原結合試薬のいずれかに結合された検出可能な標識は、酵素である。その酵素の基質に曝露されると、この酵素は、例えば分光学的手段、蛍光光度的手段、または視覚的手段によって検出され得る化学的部分を産生するような様式で反応する。検出のために有用な試薬を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、アスパラギナーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、αグリセリンリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、グリコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＥＬＩＳＡ手法の説明については、Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９８０；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｏｌ．１ （Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，Ｍ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９２，ｐｐ．２０９−２５９；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｉｎ：ｖａｎ Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ら、（ｅｄｓ），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．７５９−８０３；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ． Ｅ．（ｅｄ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９１）；Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，”ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，”Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９５；米国特許第４，３７６，１１０号（これらの全体、特にＥＬＩＳＡ法に関する教示について、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。
８８．本明細書中で使用される標識を検出することができる任意の機器が、開示される方法のために適切であることが理解される。ルシフェラーゼ遺伝子のようなレポーター構築物および相補体を標識する方法のようなさらなる検出方法もまた、使用され得る。手短にまとめると、検出のために当該分野で知られている任意の手段が、開示される方法での使用のために許容可能である。
８９．第一のタンパク質、第二のタンパク質、および第二の認識エレメントに隣接する第一の認識エレメントを含む核酸を含む細胞が、本明細書中に開示される。ここで、その第一のタンパク質はその第一の認識エレメントに結合し、その第二のタンパク質はその第二のエレメントに結合し、この第一のタンパク質と第二のタンパク質のうちの少なくとも１つは、分割蛍光タンパク質の第一の半体を含み、ここで、この第一のタンパク質および第二のタンパク質の各認識部位への結合が、分割蛍光タンパク質のアセンブリおよび励起をもたらす。開示された細胞は、核酸上での第一のタンパク質と第一の認識エレメントとの相互作用を阻害する薬剤のスクリーニングのために使用され得ることが理解される。このスクリーニングは、ａ）薬剤を、第一のタンパク質、第二のタンパク質、および第二の認識エレメントに隣接する第一の認識エレメントを含む核酸を含む細胞に投与する工程であって、その第一のタンパク質はその第一の認識エレメントに結合し、その第二のタンパク質はその第二のエレメントに結合する工程；ならびにｂ）この第一のタンパク質および第二のタンパク質の共局在化（ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を検出する工程であって、コントロールに対するこの第一のタンパク質および第二のタンパク質の局在の減少が、相互作用を阻害する薬剤を示す工程、を包含する。本明細書中に開示される方法においては、第一のタンパク質は、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２、またはＭＢＮＬ３を含み得、そして第一の認識エレメントは、ポリＣＵＧまたはポリＣＣＵＧを含み得ることが理解される。第二のタンパク質は、例えばＭＳ２を含み得、そして第二の認識エレメントは、ＭＳ２コートタンパク質ＲＮＡ認識エレメントであり得る。開示されるタンパク質の相互作用は、１つ以上の構成要素が利用可能でない場合には利用可能ではない検出方法を容易にするために使用され得る。例えば、薬剤をスクリーニングする方法であって、上記第一のタンパク質および第二のタンパク質のうちの少なくとも１つがドナー蛍光色素を含み、この第一のタンパク質および第二のタンパク質のうちの少なくとも１つがアクセプター色素を含み、この第一のタンパク質および第二のタンパク質が共局在化している場合、このドナー蛍光色素の励起が、このアクセプター色素を励起させる蛍光放射をもたらす、スクリーニング方法が開示される。
９０．従って、一局面において、励起したときのアクセプター色素の蛍光およびこの蛍光の検出が、切断を示す。ドナー蛍光色素とアクセプター蛍光色素の慣習的な例としては、ＦＡＭとＴＡＭＲＡが挙げられる。別の局面において、上記アクセプター色素が、フルオロフォアから放射されたエネルギーを吸収し、それを蛍光ではなくむしろ熱として放出することによって、ドナー色素の蛍光をクエンチする。この局面においては、このドナー色素から放射される蛍光の検出が、切断を示す。ダーククエンチャーの例は、メチルレッド、ＤＡＢＣＹＬ、ＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭ、およびＥｃｌｉｐｓｅＴＭ Ｄａｒｋ Ｑｕｅｎｃｈｅｒである。メチルレッドは、ＦＡＭのような低波長の色素をクエンチするが、Ｃｙ５ＴＭのような高波長で放射するものには適していない。ＥｌｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒＴＭは、スペクトルのより高い末端をクエンチするように設計された。これは、Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄｙｅ ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅプローブおよびＳｃｏｒｐｉｏｎｓＴＭにおいて試験されている。これは、ＲＯＸおよびＴＡＭＲＡのような色素で試験された場合に、いずれに対しても良好な結果を与えるが、ＦＡＭ（低波長）のような色素に対してもメチルレッドと同等か、またはメチルレッドよりもよい。
９１．第一のタンパク質および第二のタンパク質の少なくとも１つが分割蛍光タンパク質の第一の半体を含み、この第一のタンパク質および第二のタンパク質の少なくとも１つが分割蛍光タンパク質の第二の半体を含み、この第一のタンパク質および第二のタンパク質が共局在化している場合にこの分割蛍光タンパク質の励起が蛍光放射をもたらす方法が、開示される。開示される方法において使用され得る分割蛍光タンパク質の１つの例は、Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質（ＶＦＰ）である。細胞中で共局在化をディスプレイする他の方法も理解される。例えば、第一のタンパク質および第二のタンパク質のうち少なくとも１つが分割βガラクトシダーゼタンパク質の第一の半体を含み、その第一のタンパク質および第二のタンパク質のうちの少なくとも１つが分割βガラクトシダーゼタンパク質の第二の半体を含み、この第一のタンパク質および第二のタンパク質が共局在化している場合に、βガラクトシダーゼの共局在化がルミネセンスの蛍光をもたらす方法が、開示される。
９２．スプライス異常（ｓｐｌｉｃｅｏｐａｔｈｙ）を改善する薬剤をスクリーニングする方法もまた、開示される。この方法は、ａ）スプライシング調節因子、過剰発現されたポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しＲＮＡ、およびスプライス異常レポーター構築物を含む細胞に薬剤を導入する工程であって、該レポーター構築物は、標識化タンパク質をコードする１以上の遺伝子が隣に配置された、ポリＣＵＧもしくはポリＣＣＵＧの繰り返しにより誘発されるスプライス異常に感受性の遺伝子を含む、工程；ｂ）該標識化タンパク質のレベルを測定する工程；ならびにｃ）標識化タンパク質の割合を比較する工程を包含し、標識化タンパク質の増加は、スプライス異常を改善する薬剤を示す。例えば、上記スプライス異常レポーターの核酸配列に隣接するレポータータンパク質が標識化タンパク質である方法が開示される。スプライシング調節因子の例としては、ＮＢＭＬ１、ＮＢＭＬ２、ＮＢＭＬ３、ＣＵＧ−Ｂ１、およびＥＴＲ−３が挙げられるが、これらに限定されないことが理解される。スプライス異常感受性の例としては、ＴＮＮＴ３およびＳＥＲＣＡ１が挙げられるが、これらに限定されないこともまた理解される。そのような標識化タンパク質は、同様に標識されていてもよいし、異なる標識を有していてもよいことが理解される。従って、例えば、ポリＣＵＧまたはポリＣＣＵＧに感受性の遺伝子に単一の標識化タンパク質をコードする遺伝子が隣接しており、上記第一のタンパク質および第二のタンパク質は異なって標識化されており、そして標識化タンパク質の増加が、スプライス異常を改善する薬剤を示す方法が開示される。そのような標識の例は、緑色蛍光タンパク質である。また、ポリＣＵＧまたはポリＣＣＵＧに感受性の遺伝子に第一の標識化タンパク質および第二の標識化タンパク質が隣接しており、この第一のタンパク質および第二のタンパク質は異なって標識化されている方法が開示される。この方法はさらに、ｄ）該第一の標識化タンパク質の該第二の標識化タンパク質に対する割合を比較する工程を包含し、高い割合は、スプライス異常を改善する薬剤を示す。従って、第一の標識化タンパク質および第二の標識化タンパク質がそれぞれＹＦＰおよびＹ・ＣＦＰで標識化されており、スプライス異常の改善は、ＹＦＰとＹ・ＣＦＰの割合を比較することによって測定され、ここで高割合は、スプライス異常を改善する薬剤を示す方法が開示される。また、タンパク質とリガンドとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングするための方法もまた、開示される。この方法は、ａ）ＭＢＮＬ１発現構築物およびポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ誘導性スプライス異常に感受性のスプライス異常レポーター構築物を含む細胞へ薬剤を導入する工程であって、このレポーター構築物は、イントロンに隣接されたポリＣＵＧ感受性エキソン、ならびに第一の標識化タンパク質および第二の標識化タンパク質をコードするエキソンを含み、ここでこの第一のタンパク質および第二のタンパク質は、異なって標識されている。
９３．あるいは、開示される方法は、標識化タンパク質を使用せずに達成され得る。例えば、ルシフェラーゼレポーターをコードするミニ遺伝子が、使用され得る。従って、スプライス異常を改善する薬剤のスクリーニング方法が開示され、この方法は、ａ）薬剤を、スプライシング調節因子タンパク質、ポリ（ＣＵＧ）もしくはポリ（ＣＣＵＧ）拡張ＲＮＡおよびスプライス異常レポーターを含む細胞に導入する工程であって、このスプライス異常レポーターは、ルシフェラーゼであるレポータータンパク質に隣接したスプライシングに感受性の核酸配列を含む、工程；ならびにルシフェラーゼ活性のレベルを測定する工程を包含する。
（１．キット）
９４．本明細書中に開示される方法を実施するのに使用され得る試薬に関するキットが、本明細書中に開示される。このキットは、本明細書中で考察される任意の試薬もしくは試薬の組み合わせ、または開示される方法の実施において必要とされるかもしくは有益であることが理解されるものを含み得る。例えば、このキットは、本方法の特定の実施形態において考察される増幅反応を実施するためのプライマー、ならびに意図されるようにこのプライマーを使用するのに必要とされる緩衝液および酵素を含み得る。例えば、ＭＢＮＬ１とポリＣＵＧｅｘｐとの相互作用を阻害する薬剤をスクリーニングするためのキットが開示される。開示されるスクリーニング法によって同定される薬剤は、ＤＭ１を処置するために使用され得ることが理解される。従って、ＤＭ１を処置するために使用され得る薬剤をスクリーニングするためのキットが開示される。従って、例えば、ポリスチレンプレート、ポリＣＵＧｅｘｐｍＲＮＡ、捕捉オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、および、標識されたＭＢＮＬ１タンパク質を含むキットが開示される。ニトロセルロースフィルタプレート、標識化ポリＣＵＧｅｘｐｍＲＮＡ、およびＭＢＮＬ１を含むキットもまた、開示される。本明細書中に開示されるキットにおけるタンパク質またはポリＣＵＧｅｘｐは、当該分野において公知の任意の手段によって標識され得ることが、理解され、そして企図される。例えば、その標識は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、ＴＥＸＡＳ ＲＥＤ（登録商標）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒＣＰＴＭ、ＣＹ−ＣＨＲＯＭＥＴＭ、またはＰｈａｒＲＥＤＴＭのような蛍光標識であり得る。あるいは、この標識は、放射性標識、またはβガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはアルカリホスファターゼのような酵素的レポーターであり得る。
（２．処置方法）
９５．必要のある被験体において筋ジストロフィー（ＤＭ）を処置する方法が開示される。この方法は、この被験体に、ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２、もしくはＭＢＮＬ３のようなマッスルブラインドタンパク質と、ポリＣＵＧｅｘｐ ｍＲＮＡとの相互作用を阻害する薬剤を投与する工程を包含する。多くの異なる分子がこの任務を達成し得ることが理解され、そして本明細書中において企図される。例えば、この薬剤がＣＡＧ２５（配列番号３）のようなモルホリノまたは配列番号５に記載のモルホリノを含む、処置方法が本明細書中に開示される。開示される筋ジストロフィーの処置方法は、１型筋ジストロフィー（ＤＭ１）または２型筋ジストロフィー（ＤＭ２）を処置するために使用され得ることが、理解される。筋ジストロフィーの処置方法であって、薬剤が、例えばネオマイシンおよびゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質である方法もまた、開示される。さらに、必要のある被験体において筋ジストロフィーを処置する方法であって、この被験体にスプライス異常を改善する薬剤を投与する工程を包含する方法が、本明細書中に開示される。
９６．スプライス異常とは、オルタナティブスプライシングの異常な調節をいう。そのような制御不全は、マッスルブラインドタンパク質のようなスプライシング因子の分離（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）をもたらし得る。従って、例えば、必要のある被験体においてＤＭ１を処置する方法であって、この被験体にスプライス異常を改善する薬剤を投与する工程を包含する方法が、本明細書中で開示される。多くの異なる分子がこの任務を達成し得ることが理解され、そして本明細書中において企図される。例えば、上記薬剤がＣＡＧ２５（配列番号３）のようなモルホリノ、または配列番号３、４、５、６に記載のモルホリノを含む、処置方法が、本明細書中に開示される。筋ジストロフィーを処置する方法であって、上記薬剤が例えばネオマイシンおよびゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質である方法もまた、開示される。従って、例えば、筋ジストロフィーを処置する方法であって、上記薬剤が例えばネオマイシンおよびゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質である方法が、具体的に開示される。その必要のある被験体において２型筋ジストロフィー（ＤＭ２）を処置する方法であって、この被験体にスプライス異常を改善する薬剤を投与する工程を包含する方法もまた、本明細書中に開示される。その必要のある被験体において２型筋ジストロフィー（ＤＭ２）を処置する方法であって、この被験体にスプライス異常を改善する薬剤を投与する工程を包含する方法もまた、本明細書中に開示される。ＤＭ１の処置に関しては、多くの異なる分子がこの任務を達成し得る。例えば、上記薬剤がＣＡＧ２５（配列番号３）のようなモルホリノを含む処置方法が、本明細書中に開示され、そして例えばネオマイシンおよびゲンタマイシンのようなアミノグリコシド系抗生物質が、処置として使用され得る。
９７．ＤＭを処置する方法は、イオンチャネル疾患を、阻害、改善または逆転させることによってＤＭに影響し得ることが、さらに理解される。イオンチャネル疾患は、イオンチャネルコンダクタンスにおける減少である。チャネルイオン疾患はＣｌＣ−１のようなイオンチャネルのスプライス異常により生じ得ることが理解され、そして本明細書中で企図される。従って、必要のある被験体に、本明細書中に開示されるアンチセンスヌクレオチドを投与する工程を包含する、イオンチャネル疾患を処置する方法が本明細書中に開示される。
９８．「処置」、「処置する」、「処置すること」とは、疾患または状態の影響を低減させる方法を意味する。処置とはまた、症状のみならず、むしろ疾患または状態自体を低減する方法をいい得る。処置はまた、元々のレベルからの任意の低減であり得、そして疾患、状態、またはその疾患または状態の症状の完全な根絶であり得るが、これに限定されない。従って、開示される方法において、「処置」とは、確立された疾患の重篤度またはその疾患の進行における、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低減であり得る。例えば、前立腺癌の影響を低減するための開示された方法は、その疾患の被験体において、同じ被験体またはコントロールの被験体における元々のレベルと比較した場合に、その疾患の１つ以上の症状において１０％の低減が存在すれば、処置であるとみなされる。従って、この低減は、元々のレベルまたはコントロールのレベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれらの間の任意の量の低減であり得る。「処置」は、必ずしも疾患または状態を治癒することをいうのではなく、疾患または状態の外見の改善をいうものであることが、理解され、そして本明細書中で企図される。にもかかわらず、「処置」とは、疾患状態の根絶のみをいうのではなく、その状態の逆転もまた言い得ることが、完全に本明細書中で企図される。スプライス異常を矯正または改善することにより、疾患状態が処置されることもまた、理解される。したがって、本明細書中における「スプライス異常を改善する」または「スプライス異常を矯正する」とは、オルタナティブスプライシングの適正な調節への、程度、量、または作用の変化をもたらす、スプライス異常における任意の変化を意味する。
９９．開示される方法において使用されるモルホリノは、例えば配列番号３に記載されるＣＡＧ２５のような繰り返しヌクレオチドを含み得ることが理解される。本明細書中に開示される処置方法において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、または２５回の繰り返しを含み得、ここで２５回の繰り返しはＣＡＧ７５と呼ばれることが理解され、そして本明細書中で企図される。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全な繰り返しを含む必要はなく、繰り返しの一部を含み得ることが、さらに理解される。従って、ＣＡＧ２５は、８回の完全な繰り返しと１つのさらなるヌクレオチドである８．３回の繰り返しである。従って、２．３回、２．６回、３．３回、３．６回、４．３回、４．６回、５．３回、５．６回、６．３回、６．６回、７．３回、７．６回、８．３回、８．６回、９．３回、９．６回、１０．３回、１０．６回、１１．３回、１１．６回、１２．３１２．６回、１３．２回、１３．６回、１４．３回、１４．６回、１５．３回、１５．６回、１６．３回、１６．６回、１７．３回、１７．６回、１８．３回、１８．６回、１９．３回、１９．６回、２０．３回、２０．６回、２１．３回、２１．６回、２２．３回、２２．６回、２３．３回、２３．６回、２４．３回、および２４．６回を含む繰り返しが、本明細書中で開示される。
１００．開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノであるように改変され得ることが、さらに理解され、そして本明細書中で企図される。モルホリノとは、ＤＮＡのデオキシリボース環ではなく、モルホリノ環に結合し、この塩基はリン酸の代わりにホスホロジアミデート基を介して結合している標準的な核酸塩基を有する、合成オリゴヌクレオチドである。このモルホリノは、相補的ＲＮＡに結合し、他の分子によるこのＲＮＡへのアクセスをブロックすることにより作用する。従って、モルホリノである、配列番号３、配列番号４または配列番号５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、本明細書中に開示される。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示される場合、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドのモルホリノ改変体の使用が、本明細書中において企図されることが、理解される。従って、任意の開示される処置方法が、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得ることが理解される。従って、例えば、ＤＭの処置方法であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドがモルホリノオリゴヌクレオチドである方法が、具体的に本明細書中に開示される。ＤＭを処置する方法であって、ＰＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３、配列番号４、または配列番号５のモルホリノ改変体である方法もまた、開示される。モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドがＣＡＧであり、このＣＡＧが、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、または２５回の繰り返しを含み得る処置方法が、さらに開示される。従って、例えば、ＤＭの処置方法であって、ＣＡＧが２回、３回、４回または５回のＣＡＧの繰り返しを含む方法が、本明細書中に開示される。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全な繰り返しを含む必要はなく、繰り返しの一部を含み得ることが、さらに理解される。従って、ＣＡＧ２５は、８回の完全な繰り返しと１つのさらなるヌクレオチドである８．３回の繰り返しである。従って、２．３回、２．６回、３．３回、３．６回、４．３回、４．６回、５．３回、５．６回、６．３回、６．６回、７．３回、７．６回、８．３回、８．６回、９．３回、９．６回、１０．３回、１０．６回、１１．３回、１１．６回、１２．３１２．６回、１３．２回、１３．６回、１４．３回、１４．６回、１５．３回、１５．６回、１６．３回、１６．６回、１７．３回、１７．６回、１８．３回、１８．６回、１９．３回、１９．６回、２０．３回、２０．６回、２１．３回、２１．６回、２２．３回、２２．６回、２３．３回、２３．６回、２４．３回、および２４．６回を含む繰り返しが、本明細書中で開示される。
１０１．開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドへ糖骨格としてペプチド核酸を組み込むように改変され得ることが、さらに理解され、そして本明細書中で企図される。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成アナログであり、天然に存在する糖リン酸骨格が、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位によって置き換わっている。ＰＮＡは、高い親和性および配列選択性で、ワトソンークリック対合によって相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖にハイブリダイズし、ハイブリッド二本鎖を形成し得る。このＰＮＡの高い結合親和性は、部分的に、静電反発の欠如に起因している。ハイブリダイゼーションの安定性を与えるのに加えて、天然のポリアミド骨格が、酵素安定性のさらなる利益を提供し、このことがＰＮＡをプロテアーゼおよびヌクレアーゼの両方に耐性にしている。これらの特性が合わさって、ＰＮＡを、生化学的適用のための魅力的な試薬にしている。しかしながら、ＤＮＡまたはＲＮＡとは異なり、構造が陰性に荷電したリン酸骨格に起因して大部分が溶液中で延びる、ハイブリダイズしていない状態（一本鎖）では、ＰＮＡは、おそらく疎水性のヌクレオ塩基の衝突に起因して、複雑な球状の構造へと折り畳まれる傾向がある。実際に、ハイブリダイズしていない状態における２つの末端の間の近接性のアドバンテージにより、ステムレスＰＮＡ分子ビーコンの開発において、このコンホメーションでの衝突が利用されている。頑強性を向上させる試みで、ＰＮＡのＮ−（２−アミノエチル）グリシン骨格に対して、いくつかの改変がなされている（Ｄｒａｇｕｌｅｓｃａ−Ａｎｄｒａｓｉ，Ａｅｔら（２００６）ＪＡＣＳ １２８：１０２５８−１０２６７）。
１０２．１つの改変であるＧＰＮＡ（内部で結合したＤ−アルギニン側鎖を有するＰＮＡのアナログ）は、高い親和性および配列選択性でＲＮＡに結合し、哺乳動物細胞から容易に採取される。あるいは、単純な
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 の改変が、ランダムに折り畳まれたペプチド核酸（ＰＮＡ）を、右巻きの（ｒｉｇｈｔ−ｈａｎｄｅｄ）へリックスへと変換し得る。これらのコンホメーションでの予め組織されたらせん状のＰＮＡは、非常に高い親和性および配列選択性で、ＤＮＡおよびＲＮＡに結合する。本明細書中に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＮＡを含み得ることが理解される。従って、例えば、ＰＮＡ−ＣＡＧ２５が、本明細書中に開示される。骨格がＰＮＡとして改変されている配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、開示される。特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが開示される場合、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドのＰＮＡ改変体の使用もまた、本明細書中において企図されることが理解される。従って、任意の開示される処置方法が、ＰＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得ることが理解される。従って、例えば、ＤＭの処置方法であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドがペプチド核酸アンチセンスオリゴヌクレオチドである方法が、本明細書中で具体的に開示される。ＤＭの処置方法であって、ＰＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号３、配列番号４、および配列番号５のＰＮＡ改変体である方法もまた、開示される。ＰＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドがＰＮＡ−ＣＡＧであって、このＰＮＡ−ＣＡＧが２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３回、２４回、または２５回の繰り返しを含み得る処置方法が、さらに開示される。従って、例えば、ＤＭの処置方法であって、ＣＡＧが２回、３回、４回または５回のＣＡＧの繰り返しを含む方法が、本明細書中に開示される。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、完全な繰り返しを含む必要はなく、繰り返しの一部を含み得ることが、さらに理解される。従って、ＣＡＧ２５は、８回の完全な繰り返しと１つのさらなるヌクレオチドである８．３回の繰り返しである。従って、２．３回、２．６回、３．３回、３．６回、４．３回、４．６回、５．３回、５．６回、６．３回、６．６回、７．３回、７．６回、８．３回、８．６回、９．３回、９．６回、１０．３回、１０．６回、１１．３回、１１．６回、１２．３１２．６回、１３．２回、１３．６回、１４．３回、１４．６回、１５．３回、１５．６回、１６．３回、１６．６回、１７．３回、１７．６回、１８．３回、１８．６回、１９．３回、１９．６回、２０．３回、２０．６回、２１．３回、２１．６回、２２．３回、２２．６回、２３．３回、２３．６回、２４．３回、および２４．６回を含む繰り返しが、本明細書中で開示される。
１０３．従って、例えば、ＤＭ１を処置することは、任意の方法、またはＤＭ１に関連する症状または原因事象を軽減する様式でスプライス異常に影響する任意の薬剤の投与を包含し得る。例えば、スプライス異常を矯正するモルホリノは、ＣｌＣ１と結合するか、またはポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ上のＭＢＮＬ１を置き換える。
１０４．塩化物イオンチャネル（ＣｌＣ−１）エキソン７ａの３’スプライス部位を標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）が、ＤＭの２つのマウスモデルにおいてＣｌＣ−１オルタナティブスプライシングの欠陥を逆転させることが、本明細書中に開示される。このエキソンが含まれることを抑制することによって、このＡＯＮは、ＣｌＣ−１ ｍＲＮＡにおける全長リーディングフレームを回復し、ＣｌＣ−１ ｍＲＮＡのレベルをアップレギュレートし、表面の膜におけるＣｌＣ−１タンパク質の発現を増加させ、筋肉ＣｌＣ−１電流密度および非活性化動態を正常化し、そして筋放電を根絶する。これらの知見は、ＤＭにおけるミオトニーおよび塩化物イオンチャネル疾患はいずれも、ＣｌＣ−１の異常のオルタナティブスプライシングによって生じ、そしてアンチセンス誘導性でエキソンをとばす（ｓｋｉｐｐｉｎｇ）ことが、ＤＭにおけるオルタナティブスプライシングを矯正するための強力な方法を提示することを示す。従って、開示される方法は、ＤＭを処置する方法を含み、ミオトニーがスプライス異常により生じるイオンチャネル疾患の結果であることが、理解され、そして本明細書中で企図される。従って、必要のある被験体において筋ジストロフィーを処置する方法であって、この被験体にスプライス異常を矯正する薬剤を投与する工程を包含し、このスプライス異常はチャネルイオン疾患から生じるものである方法が、本明細書中で開示される。
３．組成物の細胞への送達
１０５．インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞に核酸を送達するために使用され得る多数の組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物は、大きく、以下の２つのクラスに分けられ得る：ウイルスベースの送達系および非ウイルスベースの送達系。例えば、核酸は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈降法、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、または、細胞中の遺伝的物質の転移によるか、あるいは、カチオン性リポソームのようなキャリアを介してなど、多数の直接的な送達系を介して送達され得る。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）、または、ＤＮＡのエレクトロポレーションおよび直接拡散のような物理−機械的方法を含め、適切なトランスフェクション手段は、例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，（１９９０）；およびＷｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔｕｒｅ，３５２，８１５−８１８，（１９９１）により記載される。このような方法は、当該分野で周知であり、そして、本明細書中に記載される組成物および方法と共に使用するために容易に適合可能である。特定の場合、方法は、大きなＤＮＡ分子と特異的に機能するよう修正される。さらに、これらの方法は、キャリアの標的化特徴を用いることによって、特定の疾患および細胞集団を標的とするために使用され得る。
ａ）核酸ベースの送達系
１０６．転移ベクターは、遺伝子を細胞内に送達するために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）、または、遺伝子を送達するための一般的な戦略の一部（例えば、組換えレトロウイルスまたは組換えアデノウイルスの一部として）であり得る（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：８３−８８，（１９９３））。
１０７．本明細書中で使用される場合、プラスミドまたはウイルスベクターは、例えば、ＭＢＮＬ１、ｐ（ＣＵＧ）ｅｘｐ、およびＣＡＧ２５のような開示される核酸、または他のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、分解させることなく細胞内に転移させる因子であり、そして、この因子が送達される細胞内での遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、神経向性ウイルス、シンドビスウイルスおよび他のＲＮＡウイルス（ＨＩＶ骨格を有するこれらのウイルスおよびレンチウイルスを含む）であり得る。これらのウイルスの特性（これらのウイルスをベクターとして使用するのに適切にする特性）を共有するあらゆるウイルスファミリーもまた好ましい。レトロウイルスとしては、マウスマロネー白血病ウイルスすなわちＭＭＬＶ、および、ＭＭＶＬのベクターとしての所望される特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大型の遺伝的搭載物（ｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｙｌｏａｄ）（すなわち、トランスジーン、または、マーカー遺伝子）を運ぶことが可能であり、そして、この理由から、一般に使用されるベクターとなっている。しかし、これらは、非増殖細胞においては有用ではない。アデノウイルスベクターは、比較的安定であり、かつ、扱いやすく、高い力価を持ち、そして、エアロゾル処方物において送達され得、そして、非分裂細胞にトランスフェクトし得る。ポックスウイルスベクターは、大きく、そして、遺伝子を挿入するためのいくつかの部位を有し、これらは、熱に対して安定性であり、そして、室温で貯蔵可能である。好ましい実施形態は、ウイルス抗原により誘引される宿主生物の免疫応答を抑制するように遺伝子操作されたウイルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８またはインターロイキン１０のコード領域を有する。
１０８．ウイルスベクターは、遺伝子を細胞に導入するために、化学物質または物理的な方法よりも高い相互作用（ｔｒａｎｓａｃｔｏｉｎ）能（遺伝子を導入する能力）を有し得る。代表的に、ウイルスベクターは、非構造的初期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびビリオン形成に必須の逆方向末端繰り返し、および、ウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ベクターとして加工される場合、ウイルスは、代表的に、１以上の初期遺伝子が除去され、そして、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが、除去したウイルスＤＮＡの代わりにウイルスゲノム内に挿入される。このタイプの構築物は、約８ｋｂまでの外来の遺伝物質を運び得る。除去した初期遺伝子の必須の機能は、代表的に、その初期遺伝子の遺伝子産物をトランスで発現するように加工された細胞株により供給される。
（１）レトロウイルスベクター
１０９．レトロウイルスは、レトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルスであり、あらゆるタイプ、サブファミリー、属、または向性を含む。レトロウイルスベクターは一般に、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）；本明細書中に参考として援用される）により記載されている。遺伝子治療にレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、米国特許第４，８６８，１１６号および同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願公開ＷＯ ９０／０２８０６およびＷＯ ８９／０７１３６；ならびにＭｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３））（これらの教示は、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
１１０．レトロウイルスは、本質的には、その核酸カーゴ（ｃａｒｇｏ）内に詰められたパッケージ（ｐａｃｋａｇｅ）である。この核酸カーゴは、パッケージングシグナルを有し、このシグナルは、複製された娘分子が、パッケージの外被内に効率的にパッケージングされることを確実にする。パッケージングシグナルに加え、複製のため、そして、複製されたウイルスのパッケージングのためにシスで必要とされる多数の分子が存在する。代表的には、レトロウイルスのゲノムは、タンパク質外被の作製に関与する、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含む。標的細胞に転移されるのは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子であり、代表的には、これらが、外来ＤＮＡで置き換えられる。レトロウイルスベクターは、代表的に、パッケージの外被内に組み込むためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写ユニットの開始点を示す配列、逆転写に必須のエレメント（逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位を含む）、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡ鎖の転換を導く末端繰り返し配列、ＤＮＡ合成の第二鎖の合成のためのプライミング部位としてはたらく、３’ＬＴＲに対して５’側にあるプリンリッチな配列、および、宿主ゲノム内へのＤＮＡ状態のレトロウイルスの挿入を可能にするＬＴＲの末端付近にある特定の配列、を含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を除去することで、約８ｋｂの外来配列をウイルスゲノム内に挿入することが可能になり、この外来配列は、逆転写され、そして、複製されると、新しいレトロウイルス粒子内にパッケージングされる。核酸のこの量は、各転写物のサイズに依存して、多くの遺伝子のうちの一つを送達するのに十分である。挿入配列中に、他の遺伝子と共に正または負のいずれかの選択マーカーを含めることが好ましい。
１１１．多くのレトロウイルスベクターでは複製機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）およびパッケージングタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）は除去されているので、ベクターは、代表的には、パッケージング細胞株に入れることによって生成される。パッケージング細胞株は、複製およびパッケージングの機構を含むが、いかなるパッケージングシグナルも含まない、レトロウイルスでトランスフェクトまたは形質導入された細胞株である。選択したＤＮＡを有するベクターがこれらの細胞株内にトランスフェクトされると、ヘルパー細胞によってシスで提供される機構により、関心のある遺伝子を含むベクターが複製され、そして、新しいレトロウイルス粒子内にパッケージングされる。これら機構についてのゲノムは、パッケージングされない。なぜならば、これらは、必須のシグナルを欠失しているからである。
（２）アデノウイルスベクター
１１２．複製欠損型アデノウイルスの構築が記載されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２１３−１２２０（１９８７）；Ｍａｓｓｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３（１９８６）；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７：２６７−２７４（１９８６）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１２２６−１２３９（１９８７）；Ｚｈａｎｇ「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｂｙ ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：８６８−８７２（１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用することの利点は、これらが他の細胞型に伝染し得る程度が制限されている点である。というのも、これらは、最初に感染した細胞内では複製し得るが、新しい感染性のウイルス粒子を形成できないからである。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質および多数の他の組織部位への直接的なインビボ送達の後に、高い遺伝子転移効率を達成することが示されている（Ｍｏｒｓｙ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６（１９９３）；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７（１９９３）；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２（１９９３）；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４：１５４−１５９（１９９３）；Ｌａ Ｓａｌｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８−９９０（１９９３）；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４（１９９２）；Ｒｉｃｈ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１−４７６（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：７５−８３（１９９４）；Ｇｕｚｍａｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３：１２０１−１２０７（１９９３）；Ｂｏｕｔ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）；Ｚａｂｎｅｒ，Ｃｅｌｌ ７５：２０７−２１６（１９９３）；Ｃａｉｌｌａｕｄ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５：１２８７−１２９１（１９９３）；およびＲａｇｏｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：５０１−５０７（１９９３））。組換えアデノウイルスは、特定の細胞表面レセプターに結合することによって、遺伝子の形質導入を達成し、その後、ウイルスは、野生型または複製欠損型のアデノウイルスと同じ様式で、レセプター媒介性のエンドサイトーシスにより内在化される（ＣｈａｒｄｏｎｎｅｔおよびＤａｌｅｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２−４７７（１９７０）；ＢｒｏｗｎおよびＢｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２：３８６−３９６（１９７３）；ＳｖｅｎｓｓｏｎおよびＰｅｒｓｓｏｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５：４４２−４４９（１９８５）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５（１９８４）；Ｓｅｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３（１９８４）；Ｖａｒｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：６０６１−６０７０（１９９１）；Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７３：３０９−３１９（１９９３））。
１１３．ウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づくものであり得、そして、これらのビリオンは、ヒト２９３細胞株のような細胞株において生成される。別の好ましい実施形態では、Ｅ１遺伝子およびＥ３遺伝子の両方が、アデノウイルスのゲノムから除去される。
（３）アデノ随伴ウイルスベクター
１１４．ウイルスベクターの別のタイプは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくものである。この不完全なパルボウイルスは、多くの細胞型に感染し得、そして、ヒトに対して非病原性であることから、好ましいベクターである。ＡＡＶ型のベクターは、約４〜５ｋｂを輸送し得、そして、野生型のＡＡＶは、１９番染色体内に安定に挿入することが知られる。この部位特異的な組み込み特性を含むベクターは好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡにより生産されるＰ４．１ Ｃベクターであり、これは、単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ−ｔｋ、および／または、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子のようなマーカー遺伝子を含み得る。
１１５．別のタイプのＡＡＶウイルスでは、ＡＡＶは、一対の逆方向末端繰り返し（ＩＴＲ）を含み、これらは、異種遺伝子に対し作動可能に連結された、細胞特異的な発現を指向するプロモーターを含む少なくとも１つのカセットに隣接して配置される。この文脈において、異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに対しネイティブではないあらゆるヌクレオチド配列または遺伝子を指す。
１１６．代表的には、ＡＡＶおよびＢ１９のコード領域は除かれ、安全な非細胞傷害性ベクターが得られる。ＡＡＶのＩＴＲまたはその修飾物は、感染性と部位特異的な組み込みとを与えるが、細胞傷害性は与えず、そして、プロモーターは、細胞特異的な発現を指向する。米国特許第６，２６１，８３４号は、ＡＡＶベクターに関連する題材に関して、本明細書中に参考として援用される。
１１７．したがって、開示されるベクターは、実質的に毒性を伴わずに、哺乳動物の染色体内に組み込むことが可能なＤＮＡ分子を提供する。
１１８．ウイルスおよびレトロウイルス中に挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助するために、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含み、そして、上流エレメントと応答性エレメントとを含み得る。
（４）大型搭載量（ｌａｒｇｅ ｐａｙｌｏａｄ）ウイルスベクター
１１９．大型のヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝学実験は、大型の異種ＤＮＡフラグメントがクローニングされ、増殖され、そして、ヘルペスウイルスの感染に許容性の細胞において確立され得る手段を提供した（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：３３−４１，１９９４；ＣｏｔｔｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６３３−６４４，１９９９）。これらの大型ＤＮＡウイルス（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ））は、特定の細胞に、１５０ｋｂを超えるヒト異種ＤＮＡのフラグメントを送達する能力を有する。ＥＢＶ組換え体は、感染したＢ細胞において、ＤＮＡの大きな断片をエピソームＤＮＡとして維持し得る。３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入物を有する個々のクローンは、遺伝的に安定であるようであった。これらのエピソームの維持は、特定のＥＢＶ核タンパク質であるＥＢＮＡ１（ＥＢＶの感染の間、構成的に発現される）を必要とする。さらに、これらのベクターは、トランスフェクションのために使用され得、ここで、大量のタンパク質がインビトロで一過性に生成され得る。ヘルペスウイルスのアンプリコン系もまた、２２０ｋｂを超えるＤＮＡの断片をパッケージングするため、そして、ＤＮＡをエピソームとして安定に維持し得る細胞に感染させるために使用される。
１２０．他の有用な系としては、例えば、複製性および宿主が制限された非複製性のワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
ｂ）非核酸ベースの系
１２１．開示される組成物は、種々の方法で標的細胞に送達され得る。例えば、組成物は、エレクトロポレーションによって、または、リポフェクションによって、または、リン酸カルシウム沈降法によって送達され得る。選択される送達機構は、一部は、標的とされる細胞のタイプに依存し、そして、送達が、例えばインビボまたはインビトロのいずれで生じるかに依存する。
１２２．したがって、開示されるＣＡＧ２５またはＭＢＮＬ１ベクターに加え、組成物は、例えば、リポソーム（例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソーム）のような脂質、または、タンパク質形質導入ドメインを含み得る。リポソームはさらに、所望される場合、特定の細胞の標的化を容易にするためのタンパク質を含み得る。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的器官に輸入性の血液に投与されても、気道の標的細胞へと気道内に吸入されてもよい。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００（１９８９）；Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号を参照のこと。タンパク質形質導入ドメインは、ＨＩＶ−１ ｔａｔタンパク質もしくは疱疹ウイルスＶＰ２２のような大型のタンパク質に由来するドメイン、または、Ｅｎｄｏ−ＰｏｒｔｅｒＴＭのような遺伝子操作ペプチドを含み得ることが理解される。さらに、化合物は、マクロファージのような特定の細胞型に対して標的化され得るマイクロカプセルの成分として投与され得、ここで、マイクロカプセルからの化合物の拡散または化合物の送達は、特定の速度または投薬量に設計される。
１２３．被験体の細胞内への外来性ＤＮＡの投与および取り込み（すなわち、遺伝子の形質導入またはトランスフェクション）を含む上記方法において、組成物の細胞への送達は、種々の機構を介してなされ得る。一例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のような市販のリポソーム調製物、ならびに、当該分野で標準的な手順に従って開発された他のリポソームを用いて、リポソームを介してなされ得る。さらに、開示される核酸またはベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から利用可能な技術であるエレクトロポレーションによって、ならびに、ＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機器（ＩｍａＲｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）によって、インビボで送達され得る。
１２４．物質は、溶液中、懸濁液中であり得る（例えば、マイクロ粒子、リポソームまたは細胞内に組み込まれ得る）。これらは、抗体、レセプター、またはレセプターリガンドを介して、特定の細胞型に対して標的化され得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へと標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；およびＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。これらの技術は、種々の他の特定の細胞型にも使用され得る。「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」のようなビヒクルおよび他の抗体結合体化リポソーム（脂質媒介性の薬物の結腸癌腫標的化を含む）、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡのレセプター媒介性標的化、リンパ球指向性の腫瘍標的化、ならびに、マウスの神経膠腫細胞のインビボでの高度に特異的な治療用レトロウイルスの標的化。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へと標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、レセプターは、構成的であるかまたはリガンドにより誘導されたかのいずれかの、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらのレセプターは、クラスリンで覆われた窪みにおいてクラスター形成し、クラスリンで覆われた小胞を介して細胞に入り、レセプターが振り分けられる酸性化されたエンドソームを通過し、次いで、細胞表面に再生利用されるか、細胞内に貯蔵されるか、または、リソソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化の経路は、栄養物の取り込み、活性タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性の侵入、リガンドの解離および分解、ならびに、レセプターレベルの調節のような種々の機能を果たす。多くのレセプターは、細胞型、レセプターの濃度、リガンドのタイプ、リガンドの結合価、およびリガンド濃度に依存して、１以上の細胞内経路に従う。レセプター媒介性のエンドサイトーシスの分子および細胞の機構が検討されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
１２５．細胞に送達され、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる予定の核酸は、代表的に、組み込み配列を含む。これらの配列は、しばしば、特にウイルスベースの系を使用する場合、ウイルスに関連する配列である。これらのウイルス組み込み系はまた、リポソームのような非核酸ベースの送達系を用いて送達される予定の核酸中にも組み込まれ得、その結果、この送達系中に含まれる核酸は、宿主のゲノム内に組み込まれるようになり得る。
１２６．宿主のゲノム中に組み込むための他の一般的な技術としては、例えば、宿主のゲノムとの相同組換えを促進するように設計された系が挙げられる。これらの系は、代表的に、宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有する、発現されるべき核酸に隣接して配置される配列に依存し、この宿主細胞ゲノムにおいて、ベクター核酸と標的核酸との間で組換えが起こり、送達した核酸を宿主ゲノム内に組み込ませる。相同組換えを促進するのに必要なこれらの系および方法は、当業者に公知である。
ｃ）インビボ／エキソビボ
１２７．上述のように、組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中で投与され得、そして、当該分野で周知の種々の機構（例えば、ネイキッドＤＮＡの取り込み、リポソーム融合、遺伝子銃によるＤＮＡの筋肉内注射、エンドサイトーシスなど）によって、インビボおよび／またはエキソビボで、被験体の細胞へと送達され得る。
１２８．エキソビボ法を採用する場合、細胞または組織は、取り出され、そして、当該分野で周知の標準的なプロトコールに従って、身体の外側で維持され得る。組成物は、例えば、リン酸カルシウム媒介性遺伝子送達、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはプロテオリポソームのようなあらゆる遺伝子転移機構によって、細胞内に導入され得る。形質導入された細胞は、次いで、（例えば、薬学的に受容可能なキャリア中に）注入され得るか、または、細胞または組織のタイプについて標準的な方法によって、被験体内へと同位置に移植して戻され得る。種々の細胞の被験体内への移植または注入についての標準的な方法は公知である。
４．発現系
１２９．細胞に送達される核酸は、代表的に、発現制御系を含む。例えば、ウイルスおよびレトロウイルスの系に挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を補助するために、プロモーターおよび／またはヘンハンサーを含む。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定された位置にあるときに機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的な相互作用に必要とされるコアエレメントを含み、そして、上流エレメントおよび応答性エレメントを含み得る。
ａ）ウイルスのプロモーターおよびエンハンサー
１３０．哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして、最も好ましくは、サイトメガロウイルスのようなウイルスのゲノム、または、異種の哺乳動物プロモーター（例えば、βアクチンプロモーター）から得られ得る。ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターおよび後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０の制限酵素消化フラグメントとして簡便に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７３：１１３（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｅ制限酵素消化フラグメントとして簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８：３５５−３６０（１９８２））。当然のことながら、宿主細胞または関連の種に由来するプロモーターもまた、本明細書において有用である。
１３１．エンハンサーは、一般に、転写開始部位から固定されない距離で機能し、転写ユニットに対して５’側（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３（１９８１））または３’側（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．３：１１０８（１９８３））のいずれかであり得るＤＮＡ配列をいう。さらに、エンハンサーは、イントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３３：７２９（１９８３））、ならびに、コード配列自体の内部（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．４：１２９３（１９８４））であり得る。これらは、通常、長さ１０ｂｐ〜３００ｂｐの間であり、そして、シスで機能する。エンハンサーは、プロモーター付近からの転写を高めるように機能する。エンハンサーはまた、しばしば、転写の調節を媒介する応答性エレメントを含む。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答性エレメントを含み得る。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。哺乳動物遺伝子に由来する多くのエンハンサー配列が現在知られるが（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）、代表的には、全身発現のために、真核生物細胞ウイルスに由来するエンハンサーを用いる。好ましい例は、複製起点（１００〜２７０ｂｐ）の後ろ側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）にあるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーである。
１３２．プロモーターおよび／またはエンハンサーは、光、または、その機能を誘引する特定の化学的事象のいずれかによって特異的に活性化され得る。系は、テトラサイクリンおよびデキサメタゾンのような試薬によって調節され得る。また、ガンマ線照射のような放射線、またはアルキル化化学療法薬への暴露によって、ウイルスベクターの遺伝子発現を高める方法もある。
１３３．特定の実施形態では、プロモーターおよび／またはエンハンサーの領域は、転写されるべき転写ユニットの領域の発現を最大にするための、構成的なプロモーターおよび／またはエンハンサーとして機能し得る。特定の構築物では、プロモーターおよび／またはエンハンサーの領域は、特定の時点において特定の細胞型においてのみ発現される場合でさえ、あらゆる真核生物細胞型において活性である。このタイプの好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）、およびレトロウイルスベクターのＬＴＦである。
１３４．あらゆる特定の調節性エレメントが、メラノーマ細胞のような特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するためにクローニングおよび使用され得ることが示されている。グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが、グリア起源の細胞において遺伝子を選択的に発現させるために使用されている。
１３５．真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡの発現に影響を及ぼし得る、転写の終結に必須の配列を含み得る。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にあるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’の非翻訳領域はまた、転写終結部位を含む。転写ユニットもまた、ポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写されたユニットがプロセシングを受け、そして、ｍＲＮＡのように輸送される可能性を高めるという点である。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は、十分に確立されている。相同なポリアデニル化シグナルがトランスジーン構築物において使用されることが好ましい。特定の転写ユニットでは、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、そして、約４００の塩基から構成される。また、転写されるユニットは、他の標準的な配列を単独で含むか、または、上記配列と組み合わせて含み、構築物からの発現または構築物の安定性を向上させることが好ましい。
ｂ）マーカー
１３６．ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含み得る。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたかどうかを決定するために使用され、いったん送達されると、発現される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．ＣｏｌｉのｌａｃＺ遺伝子および緑色蛍光タンパク質である。
１３７．いくつかの実施形態では、マーカーは、選択マーカーであり得る。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログであるＧ４１８、ハイグロマイシンおよびピューロマイシンである。このような選択マーカーが首尾よく哺乳動物の宿主細胞内に転移されると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択的な圧力下に置かれた場合に生き延び得る。選択レジメンには、広く用いられる２つの別個のカテゴリーが存在する。第一のカテゴリーは、細胞の代謝と、補充培地とは無関係に増殖する能力を欠く変異細胞株の使用に基づくものである。２つの例は以下のとおりである：ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような養分を加えることなく増殖する能力を欠く。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要とされる特定の遺伝子を欠くので、これらは、欠けたヌクレオチドが補充培地中に提供されない限りは、生き延びることが出来ない。培地を補充することの代替は、インタクトなＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞に導入して、こうして、その増殖の要件を変更することである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補充培地においては生き延びることが出来ない。
１３８．第二のカテゴリーは、優性選択（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）（あらゆる細胞型において使用される選択スキームをいう）であり、これは、変異細胞株の使用を必要としない。これらのスキームは、代表的に、宿主細胞の増殖を停止させるために薬物を使用する。新規遺伝子を有するこれらの細胞は、薬物耐性を持つタンパク質を発現し、そして、選択を生き延びる。このような優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．およびＢｅｒｇ，Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９：１４２２（１９８０））またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３（１９８５））を使用する。これら３つの例は、それぞれ、適切な薬物Ｇ４１８もしくはネオマイシン（ジェネティシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を持つために、真核生物の制御下で細菌の遺伝子を用いる。他のものとしては、ネオマイシンアナログであるＧ４１８およびピューロマイシンが挙げられる。
Ｃ．組成物
１３９．開示される組成物を調製するために使用される成分、ならびに、本明細書中で開示される方法において使用される組成物自体が開示される。これらおよび他の材料が本明細書中で開示され、そして、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、種々の個々の組み合わせおよび集合的な組み合わせの各々の具体的な参照、ならびに、これらの化合物の並べ替えは、明白に開示されないかもしれないが、その各々が、本明細書中で具体的に企図および記載される、ということが理解される。例えば、特定のＣＡＧ２５アンチセンスオリゴヌクレオチドが開示および考察され、そして、このＣＡＧ２５アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む多数の分子に対してなされ得る多数の変更が考察される場合、具体的にそうでないと示されない限り、ＣＡＧ２５アンチセンスオリゴヌクレオチドと、起こり得る変更との組み合わせおよび並べ替えの各々および全てが具体的に企図される。したがって、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスが開示され、また、分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスと、組み合わせ分子の一例Ａ−Ｄが開示される場合、各々が個々に列挙されない場合であっても、各々は、個々に、かつ集合的に企図される。すなわち、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されているものとみなされることを意味する。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた開示される。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループが考慮され、開示される。この概念は、開示される組成物の作製方法および使用方法における工程を含む（がこれらに限定されない）本願の全ての局面に対して適用される。したがって、行われ得る種々の追加の工程が存在する場合、これらの追加の工程の各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態、または複数の実施形態の組み合わせと共に行われ得ることが理解される。
１４０．ＤＭ１またはＤＭ２を処置するために使用され得る組成物が本明細書中に開示される。例えば、ＣＡＧ２５および配列番号４に示されるアンチセンスオリゴヌクレオチドのような、ＤＭ１を処置し得るモルホリノが本明細書中に開示される。また、アミノグリコシド系抗生物質であるネオマイシンおよびゲンタマイシンのような小分子が開示される。図１８に開示されるもののような他のアミノグリコシド系のメンバーもまた、ＤＭ１またはＤＭ２の処置について開示されることが理解される。
１４１．本明細書中では、「モルホリノ」は、標準的な核酸塩基を持ち、ＤＮＡのデオキシリボース環ではなくモルホリノ環に結合する合成オリゴヌクレオチドをいい、そして、これらの塩基は、リン酸基の代わりにホスホロジアミデート基を介して連結される。モルホリノは、相補的なＲＮＡに結合し、他の分子によるＲＮＡへのアクセスをブロックすることによって作用する。本明細書中に開示されるように、モルホリノはまた、すでに相補的なＲＮＡ鎖に結合した分子を置き換えるためにも使用され得る。
１．相同性／同一性
１４２．本明細書中に開示される遺伝子およびタンパク質の任意の既知の改変体および誘導体、または、生じ得る改変体および誘導体を規定する１つの方法は、特定の既知配列に対する相同性の観点から改変体および誘導体を規定することによるものであることが理解される。例えば、配列番号１は、ＭＢＮＬ１の特定の配列を示し、そして、配列番号２は、配列番号１によりコードされるタンパク質（ＭＢＮＬ１タンパク質）の特定の配列を示す。具体的には、規定された配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の相同性を有する、本明細書中に開示されるこれらの遺伝性およびタンパク質ならびに他の遺伝子およびタンパク質の改変体が開示される。当業者は、２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルになるように２つの配列を整列させた後に計算され得る。
１４３．相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムにより行われ得る。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８））の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化されたインプリメンテーション（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェア Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））によって、または、目視（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によって行われ得る。
１４４．同じタイプの相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（これらは、少なくとも核酸の整列に関する題材に関して、本明細書中に参考として援用される）に開示されるアルゴリズムによって、核酸について得られ得る。
２．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
１４５．用語「ハイブリダイゼーション」は、代表的に、少なくとも２つの核酸分子（例えば、プライマーまたはプローブと、遺伝子）間の配列駆動性の相互作用を意味する。配列駆動性の相互作用とは、２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体間でヌクレオチド特異的な様式で起こる相互作用を意味する。例えば、ＣとのＧの相互作用またはＴとのＡの相互作用は、配列駆動性の相互作用である。代表的に、配列駆動性の相互作用は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面において起こる。２つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多数の条件およびパラメーターにより影響を及ぼされる。例えば、反応の塩濃度、ｐＨおよび温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響を及ぼす。
１４６．２つの核酸分子間の選択的なハイブリダイゼーションのためのパラメーターは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態では、選択的なハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として規定され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の段階のいずれかまたは両方の、温度および塩濃度の両方により制御される。例えば、選択的なハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそのハイブリダイゼーション相手から解離する溶融温度）よりも約１２〜２５℃低い温度での高イオン強度の溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）におけるハイブリダイゼーションと、その後の、洗浄温度がＴｍより約５℃〜２０℃低くなるように選択した温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄を含み得る。温度および塩の条件は、フィルタ上に固定した参照ＤＮＡのサンプルが、関心のある標識核酸に対してハイブリダイズされ、次いで、異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される、予備実験において容易に実験的に決定される。ハイブリダイゼーションの温度は、代表的に、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションについて、より高い。条件は、ストリンジェンシーを達成するために上述のように、または、当該分野で公知であるように使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７：１５４：３６７，１９８７（これらは、少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関連する題材について、本明細書中に参考として援用される））。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのための好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥにおける約６８℃（水溶液中）と、その後の６８℃での洗浄であり得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される場合、所望される相補性の程度が減少されるに従って、そしてさらに、可変性が探索される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔのリッチさに依存して、低下させられ得る。同様に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される場合、所望される相同性が増加されるに従って、そしてさらに、高い相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔのリッチさに依存して、増加され得る。これらは全て、当該分野で公知である。
１４７．選択的なハイブリダイゼーションを規定するための別の方法は、他の核酸に結合する核酸のうちの一つの量（割合）に注目することによるものである。例えば、いくつかの実施形態では、選択的なハイブリダイゼーション条件は、限定的な核酸の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％が非限定的な核酸に結合する場合のものである。代表的には、非限定的なプライマーは、例えば、１０倍、または１００倍、または１０００倍過剰である。このタイプのアッセイは、限定的なプライマーおよび非限定的なプライマーの両方が、例えば、そのｋｄを１０倍、または１００倍、または１０００倍下回る条件下、あるいは、一方の核酸分子のみが、１０倍、または１００倍、または１０００倍である条件下、あるいは、一方の核酸分子または両方の核酸分子が、そのｋｄを上回る条件下で行われ得る。
１４８．選択的なハイブリダイゼーションを規定するための別の方法は、所望の酵素的操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、酵素的に操作されるプライマーの割合に注目することによるものである。例えば、いくつかの実施形態では、選択的なハイブリダイゼーション条件は、プライマーの少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％が、酵素的な操作を促進する条件下で酵素的に操作される場合のものであり、例えば、酵素的な操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的なハイブリダイゼーション条件は、プライマー分子の少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％が伸長される場合のものである。好ましい条件としてはまた、操作を行う者により示唆される条件、または、操作を行う酵素に適切であると当該分野で示される条件が挙げられる。
１４９．まさに相同性に関して、本明細書中に開示される、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションレベルを決定するための種々の方法が存在することが理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションの種々の割合を提供し得るが、そうでないと示されない限り、任意の方法のパラメーターを満たすことで十分であることが理解される。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要とされる場合であり、かつ、ハイブリダイゼーションが任意のこれらの方法のうちの一つにおいて必要とされるパラメーター内で生じる限りは、このハイブリダイゼーションは、本明細書中に開示されるものとみなされる。
１５０．組成または方法が、集合的または単独でのいずれかで、ハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの基準のうちの任意のひとつを満たす場合、その組成または方法が本明細書中に開示されるものであるということを当業者が理解する、ということが理解される。
３．核酸
１５１．核酸ベースの種々の分子が本明細書中に開示され、これらとしては、例えば、ＣＡＧ２５、ならびに、本明細書中に開示される他のタンパク質をコードする核酸、ならびに、種々の機能的核酸が挙げられる。開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド代替物から構成される。これらおよび他の分子の非限定的な例は本明細書中で考察される。例えば、ベクターが細胞内で発現されるとき、発現されるｍＲＮＡは代表的にはＡ、Ｃ、ＧおよびＵから構成されることが理解される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外来性の送達により細胞または細胞環境中に導入される場合、アンチセンス分子は、細胞環境におけるアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチドアナログから構成されていることが有益であることが理解される。
ａ）ヌクレオチドおよび関連の分子
１５２．ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含む分子である。ヌクレオチドは、そのリン酸部分および糖部分を介して互いに連結され、ヌクレオチド間結合を形成し得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
１５３．ヌクレオチドアナログは、塩基部分、糖部分またはリン酸部分のいずれかにいくつかのタイプの修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドへの修飾は、当該分野で周知であり、そして、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび２−アミノアデニン、ならびに、糖部分もしくはリン酸部分における修飾が挙げられる。
１５４．ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドに類似する機能的特性を有するが、リン酸部分を含まない分子（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。ヌクレオチド代替物は、Ｗａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して互いに連結される分子である。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用したときに、二重らせん型の構造に従い得る。
１５５．また、他の型の分子（結合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに連結して、例えば、細胞への取り込みを高めることも可能である。結合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結され得る。このような結合体としては、コレステロール部分のような脂質部分が挙げられるがこれらに限定されない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）。
１５６．Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面としては、プリン塩基のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物のＣ２位、Ｎ１位およびＣ６位、ならびに、ピリミジン塩基のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物のＣ２位、Ｎ３位、Ｃ４位が挙げられる。
１５７．Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面で起こる相互作用であり、このＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面は、二重鎖ＤＮＡの主溝内で露出される。Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ面としては、プリンヌクレオチドのＮ７位と、Ｃ６位にある反応性基（ＮＨ２またはＯ）が挙げられる。
ｂ）配列
１５８．本明細書中に開示されるタンパク質分子（例えば、ＭＢＮＬ１）、または、ＣＡＧ２５の作製について本明細書中に開示される任意の核酸に関する、種々の配列が存在する。これらは全て、核酸によってコードされるか、または、核酸である。これらの遺伝子のヒトアナログ、ならびに、これらの遺伝子の他のアナログおよび対立遺伝子、ならびに、スプライス改変体および他のタイプの改変体の配列は、種々のタンパク質データベースおよび遺伝子データベースで入手可能である。本願出願当時に、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて入手可能なこれらの配列は、その全体、ならびに、その内部に含まれる個々の配列について、本明細書中に参考として援用される。Ｇｅｎｂａｎｋは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉにおいてアクセス可能であり得る。当業者は、配列の相違点および差異を区別する方法、ならびに、特定の配列に関連する組成物および方法を、他の関連する配列に対して調節する方法を理解する。本明細書中に開示され、かつ当該分野で公知の情報を仮定すると、プライマーおよび／またはプローブは任意の所与の配列について設計され得る。
ｃ）プライマーおよびプローブ
１５９．本明細書中に開示される核酸（例えば、本明細書中に開示されるポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ）と相互作用し得るプライマーおよびプローブを含む組成物が開示される。特定の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応を支援するために使用される。代表的には、プライマーは、配列特異的な様式で伸長され得る。配列特異的な様式でのプライマーの伸長は、任意の方法を含み、この方法において、そのプライマーがハイブリダイズされるか、または、他の方法で結合される核酸分子の配列および／または組成が、プライマーの伸長により生成される産物の組成または配列を定めるか、または、影響を与える。したがって、配列特異的な様式でのプライマーの伸長としては、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が挙げられるがこれらに限定されない。配列特異的な様式でプライマーを増幅する技術および条件が好まれる。特定の実施形態では、プライマーは、ＰＣＲまたは直接的な配列決定のような、ＤＮＡ増幅反応のために使用される。特定の実施形態では、プライマーは、非酵素的技術を用いても伸長され得ることが理解され、この技術では、例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、化学的に反応して、プライマーを配列特異的な様式で伸長するように修飾される。代表的には、開示されるプライマーは、開示される核酸またはその核酸の一領域とハイブリダイズするか、または、その核酸の相補体またはその核酸の一領域の相補体とハイブリダイズする。
１６０．特定の実施形態では、核酸との相互作用のためのプライマーまたはプローブのサイズは、ＤＮＡ増幅、または、プローブもしくはプライマーの単純なハイブリダイゼーションのような、プライマーの所望される酵素的操作を支援するあらゆるサイズであり得る。代表的なプライマーまたはプローブは、少なくとも６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、４６ヌクレオチド長、４７ヌクレオチド長、４８ヌクレオチド長、４９ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長、５２ヌクレオチド長、５３ヌクレオチド長、５４ヌクレオチド長、５５ヌクレオチド長、５６ヌクレオチド長、５７ヌクレオチド長、５８ヌクレオチド長、５９ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、６１ヌクレオチド長、６２ヌクレオチド長、６３ヌクレオチド長、６４ヌクレオチド長、６５ヌクレオチド長、６６ヌクレオチド長、６７ヌクレオチド長、６８ヌクレオチド長、６９ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長、７２ヌクレオチド長、７３ヌクレオチド長、７４ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、７６ヌクレオチド長、７７ヌクレオチド長、７８ヌクレオチド長、７９ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、８１ヌクレオチド長、８２ヌクレオチド長、８３ヌクレオチド長、８４ヌクレオチド長、８５ヌクレオチド長、８６ヌクレオチド長、８７ヌクレオチド長、８８ヌクレオチド長、８９ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、９１ヌクレオチド長、９２ヌクレオチド長、９３ヌクレオチド長、９４ヌクレオチド長、９５ヌクレオチド長、９６ヌクレオチド長、９７ヌクレオチド長、９８ヌクレオチド長、９９ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２５ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１７５ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、２２５ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長、２７５ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、３２５ヌクレオチド長、３５０ヌクレオチド長、３７５ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、４２５ヌクレオチド長、４５０ヌクレオチド長、４７５ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、５５０ヌクレオチド長、６００ヌクレオチド長、６５０ヌクレオチド長、７００ヌクレオチド長、７５０ヌクレオチド長、８００ヌクレオチド長、８５０ヌクレオチド長、９００ヌクレオチド長、９５０ヌクレオチド長、１０００ヌクレオチド長、１２５０ヌクレオチド長、１５００ヌクレオチド長、１７５０ヌクレオチド長、２０００ヌクレオチド長、２２５０ヌクレオチド長、２５００ヌクレオチド長、２７５０ヌクレオチド長、３０００ヌクレオチド長、３５００ヌクレオチド長、または４０００ヌクレオチド長である。
１６１．他の実施形態では、プライマーまたはプローブは、６ヌクレオチド長以下、７ヌクレオチド長以下、８ヌクレオチド長以下、９ヌクレオチド長以下、１０ヌクレオチド長以下、１１ヌクレオチド長以下、１２ヌクレオチド長以下、１３ヌクレオチド長以下、１４ヌクレオチド長以下、１５ヌクレオチド長以下、１６ヌクレオチド長以下、１７ヌクレオチド長以下、１８ヌクレオチド長以下、１９ヌクレオチド長以下、２０ヌクレオチド長以下、２１ヌクレオチド長以下、２２ヌクレオチド長以下、２３ヌクレオチド長以下、２４ヌクレオチド長以下、２５ヌクレオチド長以下、２６ヌクレオチド長以下、２７ヌクレオチド長以下、２８ヌクレオチド長以下、２９ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、３１ヌクレオチド長以下、３２ヌクレオチド長以下、３３ヌクレオチド長以下、３４ヌクレオチド長以下、３５ヌクレオチド長以下、３６ヌクレオチド長以下、３７ヌクレオチド長以下、３８ヌクレオチド長以下、３９ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、４１ヌクレオチド長以下、４２ヌクレオチド長以下、４３ヌクレオチド長以下、４４ヌクレオチド長以下、４５ヌクレオチド長以下、４６ヌクレオチド長以下、４７ヌクレオチド長以下、４８ヌクレオチド長以下、４９ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下、５１ヌクレオチド長以下、５２ヌクレオチド長以下、５３ヌクレオチド長以下、５４ヌクレオチド長以下、５５ヌクレオチド長以下、５６ヌクレオチド長以下、５７ヌクレオチド長以下、５８ヌクレオチド長以下、５９ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、６１ヌクレオチド長以下、６２ヌクレオチド長以下、６３ヌクレオチド長以下、６４ヌクレオチド長以下、６５ヌクレオチド長以下、６６ヌクレオチド長以下、６７ヌクレオチド長以下、６８ヌクレオチド長以下、６９ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、７１ヌクレオチド長以下、７２ヌクレオチド長以下、７３ヌクレオチド長以下、７４ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７６ヌクレオチド長以下、７７ヌクレオチド長以下、７８ヌクレオチド長以下、７９ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、８１ヌクレオチド長以下、８２ヌクレオチド長以下、８３ヌクレオチド長以下、８４ヌクレオチド長以下、８５ヌクレオチド長以下、８６ヌクレオチド長以下、８７ヌクレオチド長以下、８８ヌクレオチド長以下、８９ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、９１ヌクレオチド長以下、９２ヌクレオチド長以下、９３ヌクレオチド長以下、９４ヌクレオチド長以下、９５ヌクレオチド長以下、９６ヌクレオチド長以下、９７ヌクレオチド長以下、９８ヌクレオチド長以下、９９ヌクレオチド長以下、１００ヌクレオチド長以下、１２５ヌクレオチド長以下、１５０ヌクレオチド長以下、１７５ヌクレオチド長以下、２００ヌクレオチド長以下、２２５ヌクレオチド長以下、２５０ヌクレオチド長以下、２７５ヌクレオチド長以下、３００ヌクレオチド長以下、３２５ヌクレオチド長以下、３５０ヌクレオチド長以下、３７５ヌクレオチド長以下、４００ヌクレオチド長以下、４２５ヌクレオチド長以下、４５０ヌクレオチド長以下、４７５ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、５５０ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、６５０ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、７５０ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、８５０ヌクレオチド長以下、９００ヌクレオチド長以下、９５０ヌクレオチド長以下、１０００ヌクレオチド長以下、１２５０ヌクレオチド長以下、１５００ヌクレオチド長以下、１７５０ヌクレオチド長以下、２０００ヌクレオチド長以下、２２５０ヌクレオチド長以下、２５００ヌクレオチド長以下、２７５０ヌクレオチド長以下、３０００ヌクレオチド長以下、３５００ヌクレオチド長以下、または４０００ヌクレオチド長以下であり得る。
１６２．特定の実施形態では、この生成物は、少なくとも２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、４６ヌクレオチド長、４７ヌクレオチド長、４８ヌクレオチド長、４９ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長、５２ヌクレオチド長、５３ヌクレオチド長、５４ヌクレオチド長、５５ヌクレオチド長、５６ヌクレオチド長、５７ヌクレオチド長、５８ヌクレオチド長、５９ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、６１ヌクレオチド長、６２ヌクレオチド長、６３ヌクレオチド長、６４ヌクレオチド長、６５ヌクレオチド長、６６ヌクレオチド長、６７ヌクレオチド長、６８ヌクレオチド長、６９ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長、７２ヌクレオチド長、７３ヌクレオチド長、７４ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、７６ヌクレオチド長、７７ヌクレオチド長、７８ヌクレオチド長、７９ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、８１ヌクレオチド長、８２ヌクレオチド長、８３ヌクレオチド長、８４ヌクレオチド長、８５ヌクレオチド長、８６ヌクレオチド長、８７ヌクレオチド長、８８ヌクレオチド長、８９ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、９１ヌクレオチド長、９２ヌクレオチド長、９３ヌクレオチド長、９４ヌクレオチド長、９５ヌクレオチド長、９６ヌクレオチド長、９７ヌクレオチド長、９８ヌクレオチド長、９９ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２５ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１７５ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、２２５ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長、２７５ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、３２５ヌクレオチド長、３５０ヌクレオチド長、３７５ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、４２５ヌクレオチド長、４５０ヌクレオチド長、４７５ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、５５０ヌクレオチド長、６００ヌクレオチド長、６５０ヌクレオチド長、７００ヌクレオチド長、７５０ヌクレオチド長、８００ヌクレオチド長、８５０ヌクレオチド長、９００ヌクレオチド長、９５０ヌクレオチド長、１０００ヌクレオチド長、１２５０ヌクレオチド長、１５００ヌクレオチド長、１７５０ヌクレオチド長、２０００ヌクレオチド長、２２５０ヌクレオチド長、２５００ヌクレオチド長、２７５０ヌクレオチド長、３０００ヌクレオチド長、３５００ヌクレオチド長、または４０００ヌクレオチド長である。
１６３．他の実施形態では、この生成物は、２０ヌクレオチド長以下、２１ヌクレオチド長以下、２２ヌクレオチド長以下、２３ヌクレオチド長以下、２４ヌクレオチド長以下、２５ヌクレオチド長以下、２６ヌクレオチド長以下、２７ヌクレオチド長以下、２８ヌクレオチド長以下、２９ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、３１ヌクレオチド長以下、３２ヌクレオチド長以下、３３ヌクレオチド長以下、３４ヌクレオチド長以下、３５ヌクレオチド長以下、３６ヌクレオチド長以下、３７ヌクレオチド長以下、３８ヌクレオチド長以下、３９ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、４１ヌクレオチド長以下、４２ヌクレオチド長以下、４３ヌクレオチド長以下、４４ヌクレオチド長以下、４５ヌクレオチド長以下、４６ヌクレオチド長以下、４７ヌクレオチド長以下、４８ヌクレオチド長以下、４９ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下、５１ヌクレオチド長以下、５２ヌクレオチド長以下、５３ヌクレオチド長以下、５４ヌクレオチド長以下、５５ヌクレオチド長以下、５６ヌクレオチド長以下、５７ヌクレオチド長以下、５８ヌクレオチド長以下、５９ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、６１ヌクレオチド長以下、６２ヌクレオチド長以下、６３ヌクレオチド長以下、６４ヌクレオチド長以下、６５ヌクレオチド長以下、６６ヌクレオチド長以下、６７ヌクレオチド長以下、６８ヌクレオチド長以下、６９ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、７１ヌクレオチド長以下、７２ヌクレオチド長以下、７３ヌクレオチド長以下、７４ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７６ヌクレオチド長以下、７７ヌクレオチド長以下、７８ヌクレオチド長以下、７９ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、８１ヌクレオチド長以下、８２ヌクレオチド長以下、８３ヌクレオチド長以下、８４ヌクレオチド長以下、８５ヌクレオチド長以下、８６ヌクレオチド長以下、８７ヌクレオチド長以下、８８ヌクレオチド長以下、８９ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、９１ヌクレオチド長以下、９２ヌクレオチド長以下、９３ヌクレオチド長以下、９４ヌクレオチド長以下、９５ヌクレオチド長以下、９６ヌクレオチド長以下、９７ヌクレオチド長以下、９８ヌクレオチド長以下、９９ヌクレオチド長以下、１００ヌクレオチド長以下、１２５ヌクレオチド長以下、１５０ヌクレオチド長以下、１７５ヌクレオチド長以下、２００ヌクレオチド長以下、２２５ヌクレオチド長以下、２５０ヌクレオチド長以下、２７５ヌクレオチド長以下、３００ヌクレオチド長以下、３２５ヌクレオチド長以下、３５０ヌクレオチド長以下、３７５ヌクレオチド長以下、４００ヌクレオチド長以下、４２５ヌクレオチド長以下、４５０ヌクレオチド長以下、４７５ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、５５０ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、６５０ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、７５０ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、８５０ヌクレオチド長以下、９００ヌクレオチド長以下、９５０ヌクレオチド長以下、１０００ヌクレオチド長以下、１２５０ヌクレオチド長以下、１５００ヌクレオチド長以下、１７５０ヌクレオチド長以下、２０００ヌクレオチド長以下、２２５０ヌクレオチド長以下、２５００ヌクレオチド長以下、２７５０ヌクレオチド長以下、３０００ヌクレオチド長以下、３５００ヌクレオチド長以下、または４０００ヌクレオチド長以下である。
ｄ）機能的核酸
１６４．機能的核酸は、標的分子への結合、または、特定の反応の触媒のような特定の機能を持つ核酸分子である。機能的核酸分子は、以下のカテゴリーに分けられ得るが、これらに限定されることは意図されない。例えば、機能的核酸としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列が挙げられる。機能的核酸分子は、標的分子が備える特定の活性のアフェクター（ａｆｆｅｃｔｏｒ）、インヒビター、調節因子および刺激因子として機能し得るか、または、機能的核酸分子は、任意の他の分子とは無関係のデノボ活性を備え得る。
１６５．機能的核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは炭化水素鎖のようなあらゆる高分子と相互作用し得る。したがって、機能的核酸は、ＤＭＰＫまたはＣｌＣ１のｍＲＮＡと相互作用し得る。しばしば、機能的核酸は、標的分子と機能的核酸分子との間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況では、機能的核酸分子と標的分子との間の特異的な認識は、機能的核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づくのではなく、むしろ、特異的な認識が起こることを可能にする三次構造の形成に基づく。
１６６．アンチセンス分子は、基本的な塩基対形成または基本的でない塩基対形成のいずれかにより、標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨが媒介するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの分解により、標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、通常は標的分子上で起こるプロセシングの機能（例えば、転写または複製）を妨げるように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計され得る。標的分子の最も接近可能な領域を見つけることによって、アンチセンスの効率を最適化するための多数の方法が存在する。例示的な方法は、ＤＭＳおよびＤＥＰＣを用いた、インビトロ選択実験およびＤＮＡ修飾研究である。アンチセンス分子は、１０−６、１０−８、１０−１０または１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計および使用において助けとなる方法および技術の代表的なサンプルは、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：米国特許：第５，１３５，９１７号、同第５，２９４，５３３号、同第５，６２７，１５８号、同第５，６４１，７５４号、同第５，６９１，３１７号、同第５，７８０，６０７号、同第５，７８６，１３８号、同第５，８４９，９０３号、同第５，８５６，１０３号、同第５，９１９，７７２号、同第５，９５５，５９０号、同第５，９９０，０８８号、同第５，９９４，３２０号、同第５，９９８，６０２号、同第６，００５，０９５号、同第６，００７，９９５号、同第６，０１３，５２２号、同第６，０１７，８９８号、同第６，０１８，０４２号、同第６，０２５，１９８号、同第６，０３３，９１０号、同第６，０４０，２９６号、同第６，０４６，００４号、同第６，０４６，３１９号、および同第６，０５７，４３７号。
１６７．アプタマーは、好ましくは、特異的な方法で標的分子と相互作用する分子である。代表的には、アプタマーは、ステム−ループまたはＧ−四分体（Ｇ−ｑｕａｒｔｅｔ）のような規定された二次構造および三次構造へと折り畳まれる、長さ１５〜５０塩基の範囲の小さな核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許５，６３１，１４６号）およびテオフィリン（米国特許５，５８０，７３７号）のような小さな分子、ならびに、逆転写酵素（米国特許５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許５，５４３，２９３号）のような大きな分子に結合し得る。アプタマーは、１０−１２未満の標的分子からのｋｄで非常にしっかりと結合し得る。アプタマーは、１０−６、１０−８、１０−１０または１０−１２未満のｋｄで標的分子に結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高い程度の特異性で標的分子に結合し得る。例えば、標的分子と、分子上の１つの位置においてのみ異なる別の分子との間で、１０００倍を超える結合親和性の差を有するアプタマーが単離されている（米国特許５，５４３，２９３号）。アプタマーは、バックグラウンド結合分子に対するｋｄよりも少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍または１０００００倍低い、標的分子に対するｋｄを有することが好ましい。例えば、ポリペプチドの比較を行う場合、バックグラウンド分子は、異なるポリペプチドであることが好ましい。種々の異なる標的分子に結合するアプタマーの作製方法および使用方法の代表例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：米国特許第５，４７６，７６６号、同第５，５０３，９７８号、同第５，６３１，１４６号、同第５，７３１，４２４号、同第５，７８０，２２８号、同第５，７９２，６１３号、同第５，７９５，７２１号、同第５，８４６，７１３号、同第５，８５８，６６０号、同第５，８６１，２５４号、同第５，８６４，０２６号、同第５，８６９，６４１号、同第５，９５８，６９１号、同第６，００１，９８８号、同第６，０１１，０２０号、同第６，０１３，４４３号、同第６，０２０，１３０号、同第６，０２８，１８６号、同第６，０３０，７７６号、および同第６，０５１，６９８号。
１６８．リボザイムは、分子内または分子間のいずれかの化学的反応を触媒し得る核酸分子である。したがって、リボザイムは、触媒性の核酸である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。天然の系において見られるリボザイムに基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼタイプの反応を触媒する、ハンマーヘッド型リボザイム（例えば、以下の米国特許が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第５，３３４，７１１号、同第５，４３６，３３０号、同第５，６１６，４６６号、同第５，６３３，１３３号、同第５，６４６，０２０号、同第５，６５２，０９４号、同第５，７１２，３８４号、同第５，７７０，７１５号、同第５，８５６，４６３号、同第５，８６１，２８８号、同第５，８９１，６８３号、同第５，８９１，６８４号、同第５，９８５，６２１号、同第５，９８９，９０８号、同第５，９９８，１９３号、同第５，９９８，２０３号、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９８５８０５８、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９８５８０５７、ならびにＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ ９７１８３１２）、ヘアピン型リボザイム（例えば、以下の米国特許が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第５，６３１，１１５号、同第５，６４６，０３１号、同第５，６８３，９０２号、同第５，７１２，３８４号、同第５，８５６，１８８号、同第５，８６６，７０１号、同第５，８６９，３３９号および同第６，０２２，９６２号）およびテトラヒメナ型リボザイム（例えば、以下の米国特許が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第５，５９５，８７３号および同第５，６５２，１０７号）のような、多数の種々のタイプのリボザイムが存在する。また、天然の系においては見られないが、特定のデノボ反応を触媒するように遺伝子操作された多数のリボザイムも存在する（例えば、以下の米国特許が挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第５，５８０，９６７号、同第５，６８８，６７０号、同第５，８０７，７１８号および同第５，９１０，４０８号）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡまたはＤＮＡの基質を切断し、より好ましくは、ＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、代表的に、標的基質の認識および結合と、その後の切断により核酸基質を切断する。この認識はしばしば、大部分は、基本的な塩基対相互作用または基本的でない塩基対相互作用に基づいている。この特性は、リボザイムを、核酸の標的特異的な切断のための特に良好な候補としている。なぜならば、標的基質の認識は、標的基質の配列に基づいているからである。種々の異なる反応を触媒させるためのリボザイムの作製方法および使用方法の代表的な例は、以下の米国特許の非限定的なリストに見出され得る：米国特許第５，６４６，０４２号、同第５，６９３，５３５号、同第５，７３１，２９５号、同第５，８１１，３００号、同第５，８３７，８５５号、同第５，８６９，２５３号、同第５，８７７，０２１号、同第５，８７７，０２２号、同第５，９７２，６９９号、同第５，９７２，７０４号、同第５，９８９，９０６号および同第６，０１７，７５６号。
１６９．三重鎖を形成する機能的な核酸分子は、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸と相互作用し得る分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用するとき、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、この構造中に、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成およびＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成の両方に依存した複合体を形成する３本のＤＮＡ鎖が存在する。三重鎖分子は、これらが、高い親和性および特異性で標的領域に結合し得るので、好ましい。三重鎖形成分子は、１０−６、１０−８、１０−１０または１０−１２未満のＫｄで標的分子に結合することが好ましい。種々の異なる標的分子に結合させるための、三重鎖形成分子の作製方法および使用方法の代表例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，６４５，９８５号、同第５，６５０，３１６号、同第５，６８３，８７４号、同第５，６９３，７７３号、同第５，８３４，１８５号、同第５，８６９，２４６号、同第５，８７４，５６６号および同第５，９６２，４２６号。
１７０．外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、標的核酸分子に結合して複合体を形成する分子であり、そして、この複合体は、標的分子を切断するＲＮａｓｅ Ｐによって認識される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計され得る。ＲＮＡｓｅ Ｐは、細胞内でトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセシングする際に役立つ。細菌のＲＮＡｓｅ Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体を形成して、天然のｔＲＮＡ基質を模倣するＥＧＳを用いることによって、実質的にあらゆるＲＮＡ配列を切断するために補充され得る。（ＹａｌｅによるＷＯ ９２／０３５６６、ならびにＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：４０７−４０９（１９９０））。
１７１．同様に、ＲＮＡの、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ Ｐ指向性切断は、真核生物細胞内で所望の標的を切断するために利用され得る（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８００６−８０１０（１９９２）；ＹａｌｅによるＷＯ ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ ９５／２４４８９；ＹｕａｎおよびＡｌｔｍａｎ，ＥＭＢＯ Ｊ １４：１５９−１６８（１９９５）ならびにＣａｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７−２６３１（１９９５））。種々の異なる標的分子の切断を促進するための、ＥＧＳ分子の作製方法および使用方法の代表例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出される：米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，６２４，８２４号、同第５，６８３，８７３号、同第５，７２８，５２１号、同第５，８６９，２４８号および同第５，８７７，１６２号。
４．ペプチド
ａ）タンパク質改変体
１７２．本明細書中で考察されるように、ＭＢＮＬ１タンパク質には多数の改変体が存在し、これらは、公知であり、かつ、本明細書において企図される。公知の機能的なＭＢＮＬ１系統改変体に加えて、開示される方法および組成物においても機能するＭＢＮＬ１タンパク質の誘導体も存在する。タンパク質の改変体および誘導体は、当業者に十分に理解され、そして、アミノ酸配列の修飾を含み得る。例えば、アミノ酸配列の修飾は、代表的に、以下の３つのクラスのうち１以上に分類される：置換改変体、挿入改変体または欠失改変体。挿入としては、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに、単一もしくは複数のアミノ酸残基の配列間挿入が挙げられる。挿入は、通常、例えば、１〜４の残基のオーダーでの、アミノ末端またはカルボキシル末端の融合よりも小さい挿入である。実施例に記載されるもののような免疫原性融合タンパク質誘導体は、インビトロでの架橋によって、または、融合物をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養によって、標的配列に免疫原性を付与するのに十分に大きなペプチドを融合させることにより作製される。欠失は、タンパク質配列からの１以上のアミノ酸残基の除去により特徴づけられる。代表的に、ほんの約２〜６残基がタンパク質分子内の任意の１つの部位において欠失される。これらの改変体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドの部位特定変異を誘発させ、それによって、改変体をコードするＤＮＡをもたらし、その後、このＤＮＡを組換え細胞培養において発現させることによって調製される。公知配列を有するＤＮＡにおける所定の部位で置換変異を作製するための技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発である。アミノ酸置換は、代表的に、１残基であるが、一度に多数の異なる位置において生じ得る；挿入は、通常、約１〜１０アミノ酸残基のオーダーである；そして、欠失は、約１〜３０残基の範囲である。欠失または挿入は、好ましくは、隣接する対でなされる（すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入）。置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組み合わせは、最終的な構築物に到達するように組合され得る。変異は、リーディングフレーム外の配列で行わなければならず、そして、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造を生じ得る相補的な領域を作製しない。置換改変体は、少なくとも１つの残基が除かれ、その場所に異なる残基が挿入されたものである。このような置換は、一般に、以下の表１および２に従ってなされ、そして、保存的置換と称される。
１７３．
Figure 0006259000
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 １７４．機能または免疫学的同一性における実質的な変化は、表２にあるものよりも保存的でない置換を選択すること、すなわち、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはらせんの立体配座）、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩、を維持することに関する、これらの作用がより有意に異なる残基を選択することによって、つくられる。一般に、タンパク質の特性における最大の変化を生み出すと予測される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはスレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、リルまたはアラニル）で置換される置換；（ｂ）システインまたはプロリンが任意の他の残基で置換される置換；（ｃ）電気陽性側鎖（例えば、リシル、アルギニルまたはヒスチジル）が電気陰性残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）で置換される置換；あるいは、（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）で置換される置換であり、この場合、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化のための部位数を増やすことによるものである。
１７５．例えば、１つのアミノ酸残基の、生物学的および／または化学的に類似する別の残基での置き換えは、保存的置換として当業者に公知である。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基を別の残基で置き換えること、または、１つの極性残基を別の残基で置き換えることである。この置換は、例えば、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；およびＰｈｅ，Ｔｙｒのような組み合わせを含む。明確に開示された配列の各々のこのような保存的に置換された改変体は、本明細書に提供されるモザイクポリペプチド内に包含される。
１７６．置換変異誘発または欠失変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）のための部位を挿入するために用いられ得る。システインまたは他の不安定な残基の欠失もまた望ましくあり得る。潜在的なタンパク質分解の部位（例えば、Ａｒｇ）の欠失または置換は、例えば、塩基性残基のうちの１つを欠失するか、または、１つの残基をグルタミニル残基もしくはヒスチジル残基で置換することによって達成される。
１７７．特定の翻訳後誘導体化は、発現されるポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、頻繁に翻訳後脱アミド化を受けて、対応するグルタミル残基およびアスパリル残基になる。あるいは、これらの残基は、穏やかな酸性条件下で脱アミド化を受ける。他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリジンの水酸化、セリル残基またはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のＯ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ｐｐ７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに、ある場合においては、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
１７８．本明細書中に開示されるタンパク質の改変体および誘導体を規定する１つの方法は、特定の公知配列に対する相同性／同一性の観点から改変体および誘導体を規定することによるものであることが理解される。例えば、配列番号１は、ＭＢＮＬ１の特定の配列を示し、そして、配列番号２は、ＭＢＮＬ１タンパク質の特定の配列を示す。具体的には、規定された配列に対して少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、本明細書中に開示されるこれらのタンパク質および他のタンパク質の改変体が開示される。当業者は、２つのタンパク質の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルになるように２つの配列を整列させた後に計算され得る。
１７９．相同性を計算する別の方法は、公開されたアルゴリズムにより行われ得る。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１））の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８））の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化されたインプリメンテーション（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェア Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））によって、または、目視（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によって行われ得る。
１８０．同じタイプの相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：４８−５２，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７７０６−７７１０，１９８９、Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６，１９８９（これらは、少なくとも核酸の整列に関する題材に関して、本明細書中に参考として援用される）に開示されるアルゴリズムによって、核酸について得られ得る。
１８１．保存的な変異および相同性の説明は、特定の配列に対して少なくとも７０％の相同性を有し、そこで、改変が保存的変異である実施形態のような、あらゆる組み合わせにおいて、一緒に組み合わされ得ることが理解される。
１８２．本明細書が種々のタンパク質およびタンパク質配列を考察する際、これらのタンパク質配列をコードし得る核酸もまた開示されることが理解される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての変性配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびに、タンパク質配列の開示される改変体および誘導体をコードする全ての核酸（変性核酸を含む）を包含する。したがって、特定の核酸配列の各々は本明細書中に完全には書かれない可能性があるが、これらの配列の各々および全ては、事実上、開示されるタンパク質配列によって、本明細書中に開示および記載されることが理解される。例えば、配列番号２に示されるタンパク質配列をコードし得る多くの核酸配列のうちの１つが、配列番号１に示される。どの特定のＤＮＡ配列が生物内でそのタンパク質（開示されるタンパク質の特定の改変体が本明細書中に開示される）をコードするかを示すアミノ酸配列はないが、そのタンパク質が由来する特定の生物においてそのタンパク質をコードする公知の核酸配列もまた公知であり、そして、本明細書において開示および記載されることが理解される。
１８３．開示される組成物中に組み込まれ得る多数のアミノ酸およびペプチドのアナログが存在することが理解される。例えば、多数のＤアミノ酸、または表１および表２に示されるアミノ酸とは異なる機能的置換を有するアミノ酸が存在する。天然に存在するペプチドの逆の立体異性体ならびに、ペプチドアナログの立体異性体が開示される。これらのアミノ酸は、選択したアミノ酸でｔＲＮＡ分子に電荷を与え、そして、部位特異的な方法でペプチド鎖内にアナログのアミノ酸を挿入するために例えばアンバーコドンを利用する構築物を遺伝子操作することによって、容易にポリペプチド鎖内に組み込まれ得る（Ｔｈｏｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１）、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：１９７−２１６（１９９５）、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３（１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）（これらは全て、少なくともアミノ酸アナログに関連する題材について、本明細書中に参考として援用される）。
１８４．ペプチドを模倣するが、天然のペプチド結合を介して接続されていない分子が生成され得る。例えば、アミノ酸またはアミノ酸アナログのための結合としては、以下が挙げられ得る：ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨＨ２ＳＯ−−（これらおよび他の結合は、以下に見出され得る：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（１９８３年３月），Ｖｏｌ．１，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般的な総説）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ ３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ，ＥＰ ４５６６５ ＣＡ（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）（これらは各々、本明細書中に参考として援用される））。特に好ましい非ペプチド結合は，−−ＣＨ２ＮＨ−−である。ペプチドアナログは、結合原子間に１つ以上の原子、例えば、β−アラニン、γ−アミノ酪酸などを有し得ることが理解される。
１８５．アミノ酸アナログおよびペプチドアナログは、しばしば、より経済的な生産、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、効力、効能など）、変更された特異性（例えば、生物学的活性の広域スペクトル）、減少した抗原性などのような、増強されたかもしくは所望される特性を有する。
１８６．Ｄ−アミノ酸はペプチダーゼなどにより認識されないので、Ｄ−アミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。同じタイプのＤ−アミノ酸でのコンセンサス配列の１以上のアミノ酸の体系的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）は、より安定なペプチドを生成するために使用され得る。システイン残基は、２以上のペプチドを互いに環化または結合させるために使用され得る。これは、ペプチドを特定の立体配座に拘束するために有益であり得る（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）、本明細書中に参考として援用される）。
５．薬学的キャリア／薬学的生成物の送達
１８７．本明細書中に開示される組成物はまた、インビボで、薬学的に受容可能なキャリア中で投与され得る。「薬学的に受容可能」とは、生物学的に、または、他の点でも望ましくない物質ではない物質を意味し、すなわち、この物質は、あらゆる望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、その物質が含まれる薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することもなく、核酸またはベクターと共に、被験体に投与され得る。キャリアは、本来、当業者に周知であるように、活性成分のあらゆる分解を最小限にし、そして、被験体におけるあらゆる有害な副作用を最小限にするように選択される。
１８８．組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所など（局所的な鼻腔内投与または吸入による投与を含む）で投与され得る。本明細書中で使用される場合、「局所的な鼻腔内投与」は、外鼻孔のうち一方または両方を通した鼻および鼻の通路内への組成物の送達を意味し、噴霧機構もしくは飛沫化機構（ｄｒｏｐｌｅｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）による、または、核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含み得る。吸入による組成物の投与は、噴霧もしくは飛沫化機構による送達を介して、鼻または口を通してなされ得る。送達はまた、挿管により呼吸系の任意の領域（例えば、肺）に直接なされ得る。必要とされる組成物の正確な量は、被験体の種、年齢、体重および全身状態、処置されるアレルギー性障害の重篤度、使用される特定の核酸もしくはベクター、その投与様式などに依存して、被験体ごとに異なる。したがって、組成物ごとについて正確な量を特定することは不可能である。しかし、適切な量は、本明細書中の教示を考慮して、慣用的に過ぎない実験を用いて、当業者により決定され得る。
１８９．組成物の非経口投与は、使用される場合、一般に、注射により特徴付けられる。注射可能物は、液体の溶液もしくは懸濁液として、注射前に液体中で懸濁溶液とするのに適切な固体形態として、または、エマルジョンとしてのいずれかで、従来の形態で調製され得る。非経口投与のためのより最近修正されたアプローチは、一定の投薬量が維持されるような、低速放出または持続放出の系を用いることを含む。例えば、米国特許第３，６１０，７９５号（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
１９０．物質は、溶液中、懸濁液中であり得る（例えば、マイクロ粒子、リポソームまたは細胞内に組み込まれ得る）。これらは、抗体、レセプター、またはレセプターリガンドを介して、特定の細胞型に対して標的化され得る。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へと標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，２：４４７−４５１，（１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６０：２７５−２８１，（１９８９）；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３，（１９８８）；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，４：３−９，（１９９３）；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：４２１−４２５，（１９９２）；ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＭｃＫｅｎｚｉｅ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１２９：５７−８０，（１９９２）；ならびにＲｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４２：２０６２−２０６５，（１９９１））。これらの技術は、種々の他の特定の細胞型にも使用され得る。「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」のようなビヒクルおよび他の抗体結合体化リポソーム（脂質媒介性の薬物の結腸癌腫標的化を含む）、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡのレセプター媒介性標的化、リンパ球指向性の腫瘍標的化、ならびに、マウスの神経膠腫細胞のインビボでの高度に特異的な治療用レトロウイルスの標的化。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織へと標的化するためにこの技術を使用する例である（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：６２１４−６２２０，（１９８９）；ならびにＬｉｔｚｉｎｇｅｒおよびＨｕａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１１０４：１７９−１８７，（１９９２））。一般に、レセプターは、構成的であるかまたはリガンドにより誘導されたかのいずれかの、エンドサイトーシスの経路に関与する。これらのレセプターは、クラスリンで覆われた窪みにおいてクラスター形成し、クラスリンで覆われた小胞を介して細胞に入り、レセプターが振り分けられる酸性化されたエンドソームを通過し、次いで、細胞表面に再生利用されるか、細胞内に貯蔵されるか、または、リソソーム内で分解されるかのいずれかである。内在化の経路は、栄養物の取り込み、活性タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見性の侵入、リガンドの解離および分解、ならびに、レセプターレベルの調節のような種々の機能を果たす。多くのレセプターは、細胞型、レセプターの濃度、リガンドのタイプ、リガンドの結合価、およびリガンド濃度に依存して、１以上の細胞内経路に従う。レセプター媒介性のエンドサイトーシスの分子および細胞の機構が検討されている（ＢｒｏｗｎおよびＧｒｅｅｎｅ，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：６，３９９−４０９（１９９１））。
ａ）薬学的に受容可能なキャリア
１９１．抗体を含む組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて治療的に使用され得る。
１９２．適切なキャリアおよびその処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ １９９５に記載される。代表的には、処方物を等張にするために、適切な量の薬学的に受容可能な塩が処方物中で使用される。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液およびデキストロース溶液が挙げられるがこれらに限定されない。溶液のｐＨは好ましくは、約５〜約８であり、そしてより好ましくは、約７〜約７．５である。さらなるキャリアとしては、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス（このマトリクスは、成形された物品（例えば、フィルム、リポソームまたはマイクロ粒子）の形状である）のような持続放出調製物が挙げられる。例えば、投与経路および投与される組成物の濃度に依存して、特定のキャリアがより好ましくあり得ることは当業者に明らかである。
１９３．薬学的なキャリアは当業者に公知である。これらは、最も代表的には、ヒトに薬物を投与するための標準的なキャリアであり、滅菌水、生理食塩水および生理学的ｐＨの緩衝化溶液などの溶液が挙げられる。組成物は、筋肉内または皮下で投与され得る。他の化合物は、当業者により使用される標準的な手順に従って投与される。
１９４．薬学的組成物は、選択した分子に加えて、キャリア、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性剤などを含み得る。薬学的組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などのような１以上の活性成分を含み得る。
１９５．薬学的組成物は、局所的な処置または全身性の処置のどちらが所望されているか、そして、処置される領域に依存して、多数の方法で投与され得る。投与は、局所的に（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口的に、吸入によって、または、非経口的に（例えば、静脈内への点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内への注射による）なされ得る。開示される抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮で投与され得る。
１９６．非経口投与のための調製物としては、滅菌の水性もしくは非水性の溶液、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能な有機エステル類（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンもしくは懸濁液（生理食塩水および緩衝化媒体を含む）が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル溶液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体および養分の補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、電解質補充剤（例えば、リンゲルのデキストロース液に基づくもの）などが挙げられる。例えば、抗菌剤、抗酸化物質、キレート化剤および不活性ガスなどのような保存料および他の添加物もまた存在し得る。
１９７．局所投与のための処方物としては、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体および粉末が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、増粘剤などが、必要であるか、または望ましくある場合がある。
１９８．経口投与のための組成物としては、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル剤、サシェ剤、または錠剤が挙げられる。増粘剤、矯味矯臭薬、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望ましくあり得る。
１９９．組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸のような無機酸と、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸のような無機酸との反応により、または、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムのような無機塩基と、モノアルキル、ジアルキル、トリアルキルならびにアリールアミンおよび置換エタノールアミンのような有機塩基との反応により形成される、薬学的に受容可能な酸付加塩もしくは塩基付加塩として投与され得る。
ｂ）治療的用途
２００．組成物を投与するための有効な投薬量およびスケジュールは、経験的に決定され得、そして、このような決定は、当該分野の技術範囲内である。組成物の投与のための投薬量の範囲は、障害の症状が影響を受ける所望の作用を生じるのに十分多い量である。投薬量は、有害な副作用（例えば、好ましくない交差反応、アナフィラキシー反応など）を引き起こす程度まで多くあるべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、または、他の薬物がレジメン中に含まれているかどうか、によって変化し、そして、当業者により決定され得る。投薬量は、あらゆる逆の徴候（ｃｏｕｎｔｅｒｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）の事象において個々の医師により調節され得る。投薬量は変化し得、そして、毎日、１日ごと、または数日ごとに、１回以上の用量の施薬において投与され得る。ガイダンスは、薬学的製品の定められたクラスについての適切な投薬量に関する文献において見出され得る。例えば、抗体に適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｆｅｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｏｇｅｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ Ｒｉｄｇｅ，ＮＪ．，（１９８５）ｃｈ．２２およびｐｐ．３０３−３５７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈａｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７７）ｐｐ．３６５−３８９において見出され得る。単独で使用される抗体の代表的な一日の投薬量は、上述の要因に依存して、１日につき体重１ｋｇあたり約１μｇ〜１００ｍｇまで、またはそれ以上の範囲であり得る。
２０１．ＤＭ１を処置、阻害または予防するための、開示される組成物（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドモルホリノ、またはＰＮＡ）の投与後に、治療用抗体の効能は、当業者に周知の種々の方法で評価され得る。例えば、当業者は、本明細書中に開示されるモルホリノのような組成物は、その組成物が疾患に伴う症状を減少させること、または、ＭＢＮＬ１の核病巣の壊死巣分離を減少させることを観察することによって、被験体においてＤＭ１を処置または阻害する際に有効であることを理解する。
２０２．本明細書中に開示されるポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐとのＭＢＮＬ１の相互作用を阻害する組成物は、ＤＭ１の危険性がある患者または被験体に、予防的に投与され得る。
６．開示された組成物を用いるスクリーニングによって同定された組成物／コンビナトリアル化学
ａ）コンビナトリアル化学
２０３．開示された組成物は、開示された組成物と所望の方法で相互作用する可能性のある分子または高分子を同定するために、任意のコンビナトリアル技術のための標的として使用され得る。コンビナトリアル技術またはスクリーニング法において開示された組成物を用いた場合、阻害もしくは刺激のような特定の所望の特性または標的分子の機能を持つ分子（例えば、高分子）が同定されることが理解される。ＣＡＧ２５のような、開示される方法を用いた場合に同定および単離される分子もまた開示される。
２０４．例えば、ＭＢＮＬ１とポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐとの間の相互作用を阻害する分子を同定するための開示される方法は、ハイスループットの手段を用いて行われ得ることが理解される。例えば、推定のインヒビターは、相互作用を迅速に同定するために蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いて、同定され得る。この技術の根底にある理論は、２つの分子が空間的に近い位置にあるとき、すなわち、バックグラウンドレベルを超えるレベルで相互作用するとき、シグナルが生成されるか、または、シグナルが消光され得るというものである。次いで、種々の実験（例えば、推定のインヒビターを追加することを含む）が行われ得る。インヒビターが、２つのシグナルを発する分子間の相互作用と競合する場合、シグナルは空間的に互いに離れる。そして、これは、使用されるシグナルのタイプに依存して、シグナルの減少または増加をもたらす。このシグナルの減少または増加は、推定のインヒビターの存在または非存在と相関し得る。あらゆるシグナルを発する手段が使用され得る。例えば、任意の２つの開示される分子間の相互作用のインヒビターを同定する方法が開示され、この方法は、第一の分子と第二の分子とを、推定のインヒビターの存在下で一緒に接触させる工程（ここで、第一の分子または第二の分子は蛍光ドナーを含み、第一の分子または第二の分子（代表的には、ドナーを含まない方の分子）は、蛍光アクセプターを含む）と；推定のインヒビターの存在下、および、推定のインヒビターの非存在下で、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を測定する工程（ここで、推定のインヒビターの非存在下でのＦＲＥＴ測定値と比較した場合の、推定のインヒビターの存在下でのＦＲＥＴの減少は、２分子間の結合の阻害を意味する）とを包含する。このタイプの方法は、細胞系を用いても行われ得る。
２０５．コンビナトリアル化学は、代表的には反復プロセスで、低分子または他の高分子のいずれかを結合し得る低分子または高分子を単離するためのあらゆる方法を含むがこれらに限定されない。タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび糖は、高分子の例である。例えば、所与の機能、触媒性またはリガンド結合性を持つオリゴヌクレオチド分子は、ランダムオリゴヌクレオチドの複合混合物から単離され得、これは、「インビトロ遺伝学（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」と称されている（Ｓｚｏｓｔａｋ，ＴＩＢＳ １９：８９，１９９２）。ランダムでかつ規定された配列を持つ分子の大きなプールを合成し、そして、この複合混合物（例えば、１００μｇの１００ヌクレオチドＲＮＡ中に約１０１５の別個の配列がある）を、いくらかの選択および富化のプロセスに供する。アフィニティクロマトグラフィーと、カラム上のリガンドに結合した分子のＰＣＲ増幅との繰り返しのサイクルにより、ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）は、１０１０のＲＮＡ分子のうち１つが、低分子色素に結合するようなやり方で折り畳まれると推定した。このようなリガンド結合挙動を示すＤＮＡ分子もまた単離されている（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ，１９９２；Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ，１９９２）。小さな有機分子、タンパク質、抗体、および当業者に公知の他の高分子についても、同様の目標を目指す技術が存在する。小さな有機物ライブラリをベースとしようと、オリゴヌクレオチドをベースとしようと、抗体をベースとしようと、所望の活性についての分子のセットのスクリーニングは、広く、コンビナトリアル化学と称される。コンビナトリアル技術は、分子間の結合相互作用を規定するため、そして、高分子が核酸である場合に、しばしばアプタマーと呼ばれる、特異的な結合活性を有する分子を単離するために、特に適している。
２０６．新規の活性または修飾された活性のいずれかを有するタンパク質を単離するための多数の方法が存在する。例えば、ファージディスプレイライブラリは、特異的な標的と相互作用する多数のペプチドを単離するために使用されている（例えば、米国特許第６，０３１，０７１号；同第５，８２４，５２０号；同第５，５９６，０７９号；および同第５，５６５，３３２号（これらは、少なくとも、コンビナトリアル化学に関するファージディスプレイおよび方法に関する題材について、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。
２０７．所与の機能を有するタンパク質を単離するための好ましい方法は、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）１２９９７−３０２（１９９７））によって記載される。このコンビナトリアル化学の方法は、タンパク質の機能力と、核酸の遺伝力とを合わせたものである。ＲＮＡ分子が生成され、このＲＮＡ分子の３’末端に、ピューロマイシン分子が共有結合される。この修飾されたＲＮＡ分子のインビトロ翻訳は、翻訳されたＲＮＡによってコードされる、矯正されたタンパク質をもたらす。さらに、伸長され得ないペププチジルアクセプターであるピューロマイシンの付着に起因して、大きくなるペプチド鎖は、ＲＮＡに付着されたピューロマイシンに付着される。したがって、タンパク質分子は、この分子をコードする遺伝物質に付着される。ここで、通常のインビトロ選択手順が、機能的ペプチドを単離するために行われ得る。ペプチド機能についての選択手順が完了すると、選択した機能的ペプチドをコードする核酸を増幅するために、従来の核酸操作手順が行われる。遺伝物質の増幅の後、新規ＲＮＡが、３’末端にピューロマイシンを持った状態で転写され、新規ペプチドが翻訳され、そして、別の選択の機能的ラウンドが行われる。こうして、タンパク質の選択は、核酸選択技術と同じように、反復様式で行われ得る。翻訳されるペプチドは、ピューロマイシンに付着されたＲＮＡの配列によって制御される。この配列は、最適な翻訳のために遺伝子操作された（すなわち、終止コドンなし、など）ランダム配列に由来するものであり得るか、または、既知ペプチドの機能の改善もしくは変更を探すための、既知のＲＮＡ分子の変性配列であり得る。核酸増幅およびインビトロ翻訳の条件は、当業者に周知であり、そして、好ましくは、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（Ｒｏｂｅｒｔｓ Ｒ．Ｗ．およびＳｚｏｓｔａｋ Ｊ．Ｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４（２３）１２９９７−３０２（１９９７））におけるものと同様に行われる。
２０８．ペプチドを単離するために設計されたコンビナトリアル法のための別の好ましい方法は、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｈｅｎ Ｂ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５（２４）：１４２７２−７（１９９８））に記載される。この方法は、２−ハイブリッド技術を利用および修正したものである。酵母の２−ハイブリッド系は、タンパク質：タンパク質相互作用の検出および解析に有用である。最初に酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて記載された２−ハイブリッド系は、関心のあるタンパク質に特異的な新規調節性分子を同定するための、強力な分子遺伝学技術である（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−６（１９８９））。Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は、選択した分子に結合する、合成ペプチド配列もしくは遺伝子操作されたペプチド配列間の新規な相互作用が同定され得るように、この技術を修正した。このタイプの技術の利点は、選択が、細胞内環境においてなされることである。この方法は、酸性活性化ドメインに付着されるペプチド分子のライブラリを利用する。
２０９．当業者に周知の方法論、種々のコンビナトリアルライブラリと組み合わせて用いることで、所望の標的に結合するか、または、所望の標的と相互作用する、低分子または高分子を単離および特徴付けることが可能である。これらの化合物の相対的な結合親和性が比較され得、そして、当業者に周知の競合結合研究を用いて最適な化合物が同定される。
２１０．所望の標的に結合する分子を単離するための、コンビナトリアルライブラリを作製するための技術およびコンビナトリアルライブラリをスクリーニングするための技術は、当業者に周知である。代表的な技術および方法は、以下の文献に見出され得るがこれらに限定されない：米国特許第５，０８４，８２４号、同第５，２８８，５１４号、同第５，４４９，７５４号、同第５，５０６，３３７号、同第５，５３９，０８３号、同第５，５４５，５６８号、同第５，５５６，７６２号、同第５，５６５，３２４号、同第５，５６５，３３２号、同第５，５７３，９０５号、同第５，６１８，８２５号、同第５，６１９，６８０号、同第５，６２７，２１０号、同第５，６４６，２８５号、同第５，６６３，０４６号、同第５，６７０，３２６号、同第５，６７７，１９５号、同第５，６８３，８９９号、同第５，６８８，６９６号、同第５，６８８，９９７号、同第５，６９８，６８５号、同第５，７１２，１４６号、同第５，７２１，０９９号、同第５，７２３，５９８号、同第５，７４１，７１３号、同第５，７９２，４３１号、同第５，８０７，６８３号、同第５，８０７，７５４号、同第５，８２１，１３０号、同第５，８３１，０１４号、同第５，８３４，１９５号、同第５，８３４，３１８号、同第５，８３４，５８８号、同第５，８４０，５００号、同第５，８４７，１５０号、同第５，８５６，１０７号、同第５，８５６，４９６号、同第５，８５９，１９０号、同第５，８６４，０１０号、同第５，８７４，４４３号、同第５，８７７，２１４号、同第５，８８０，９７２号、同第５，８８６，１２６号、同第５，８８６，１２７号、同第５，８９１，７３７号、同第５，９１６，８９９号、同第５，９１９，９５５号、同第５，９２５，５２７号、同第５，９３９，２６８号、同第５，９４２，３８７号、同第５，９４５，０７０号、同第５，９４８，６９６号、同第５，９５８，７０２号、同第５，９５８，７９２号、同第５，９６２，３３７号、同第５，９６５，７１９号、同第５，９７２，７１９号、同第５，９７６，８９４号、同第５，９８０，７０４号、同第５，９８５，３５６号、同第５，９９９，０８６号、同第６，００１，５７９号、同第６，００４，６１７号、同第６，００８，３２１号、同第６，０１７，７６８号、同第６，０２５，３７１号、同第６，０３０，９１７号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０４５，６７１号、同第６，０４５，７５５号、同第６，０６０，５９６号、および同第６，０６１，６３６号。
２１１．コンビナトリアルライブラリは、多数の異なる合成技術を用いて、広範な分子のアレイから作製され得る。例えば、縮合２，４−ピリミジンジオンを含むライブラリ（米国特許６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピランを含むライブラリ（米国特許６，０１７，７６８号および同第５，８２１，１３０号）、アミドアルコールを含むライブラリ（米国特許５，９７６，８９４号）、ヒドロキシ−アミノ酸アミドを含むライブラリ（米国特許５，９７２，７１９号）、炭化水素を含むライブラリ（米国特許５，９６５，７１９号）、１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオンを含むライブラリ（米国特許５，９６２，３３７号）、環式化合物を含むライブラリ（米国特許５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミドを含むライブラリ（米国特許５，９４８，６９６号）、チオフェンを含むライブラリ（米国特許５，９４２，３８７号）、三環式テトラヒドロキノリンを含むライブラリ（米国特許５，９２５，５２７号）、ベンゾフランを含むライブラリ（米国特許５，９１９，９５５号）、イソキノリンを含むライブラリ（米国特許５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントインを含むライブラリ（米国特許５，８５９，１９０号）、インドールを含むライブラリ（米国特許５，８５６，４９６号）、イミダゾール−ピリド−インドールおよびイミダゾール−ピリド−ベンゾチオフェンを含むライブラリ（米国特許５，８５６，１０７号）、置換２−メチレン−２，３−ジヒドロチアゾールを含むライブラリ（米国特許５，８４７，１５０号）、キノリンを含むライブラリ（米国特許５，８４０，５００号）、ＰＮＡを含むライブラリ（米国特許５，８３１，０１４号）、タグを含むライブラリ（米国特許５，７２１，０９９号）、ポリケチドを含むライブラリ（米国特許５，７１２，１４６号）、モルホリノ−サブユニットを含むライブラリ（米国特許５，６９８，６８５号および同第５，５０６，３３７号）、スイルファミドを含むライブラリ（米国特許５，６１８，８２５号）、およびベンゾジアゼピンを含むライブラリ（米国特許５，２８８，５１４号）。
２１２．本明細書中で使用される場合、コンビナトリアルの方法およびライブラリには、従来のスクリーニング方法およびライブラリ、ならびに、反復プロセスにおいて使用される方法およびライブラリが含まれる。
７．同様の機能を持つ組成物
２１３．本明細書中に開示される組成物は、ＭＢＮＬ１の置き換え、または、ポリＣＵＧｅｘｐｍＲＮＡの結合のような特定の機能を有するものと理解される。本明細書中には、開示される機能を行うための特定の構造的要件が開示され、そして、開示される構造に関連する同じ機能を行い得る種々の構造が存在すること、および、これらの構造が最終的に同じ結果（例えば、ＭＢＮＬ１とポリＣＵＧｅｘｐｍＲＮＡとの間の相互作用の阻害）を達成すること、が理解される。
２１４．本願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記述するために、その全体が、本願において本明細書により参考として援用される。開示される参考文献はまた、その参照に拠る文脈において考察される、これらの参考文献に含まれる題材について、個別かつ具体的に本明細書中に参考として援用される。
２１５．本発明において、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、種々の修正および改変がなされ得ることは、当業者に明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書中に開示される本発明の説明および実施を考慮すれば、当業者に明らかとなる。この説明および例は、例示的なものとしてのみ見做され、そして、本発明の真の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
Ｄ．実施例
２１６．以下の実施例は、本明細書において特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法が、いかにして作製および評価されるかの完全な開示および説明を当業者に提供する目的で提示され、そして、純粋に例として役立てることが意図され、開示を制限することは意図されない。数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するために尽力したが、いくらかの誤差および逸脱が考慮されるべきである。そうでないと示されない限り、部は重量部であり、温度は℃であるか、または、周囲の温度であり、そして、圧力は、ほぼ大気圧付近である。
１．実施例１：ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐにおけるＭＢＮＬの壊死巣分離はスプライス異常につながる
２１７．変異対立遺伝子の転写は、拡張されたＣＵＧ繰り返しを含むＤＭＰＫ ｍＲＮＡを生成する。変異転写物は、別個のＲＮＡ核（リボ核）病巣に蓄積する。病巣内のＲＮＡは、完全なプロセシングを受けたＤＭＰＫ ｍＲＮＡである（Ｔａｎｅｊａ ＫＬ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９５；１２８（６）：９９５−１００２）。Ｒｅｄｄｙおよび共同研究者らは、ＭＢＮＬ１のｓｉＲＮＡ媒介性の欠失が、ＤＭ１筋芽細胞におけるリボ核病巣の多くを排除することを見出し、ＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ相互作用が病巣形成の重要な決定要素であることを示唆した（Ｄａｎｓｉｔｈｏｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５；２８０（７）：５７７３−５７８０）。マッスルブラインド（ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ）様（ＭＢＮＬ）ファミリー（ＭＢＮＬ１、ＭＢＮＬ２およびＭＢＮＬ３を含む）内のタンパク質に結合するＲＮＡは、リボ核病巣において分離される。ＭＢＮＬタンパク質は、ＤＭ１細胞においてポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐとの強い共局在化を示し、結果として、核質から激減させられる（Ｌｉｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００６；Ｍａｎｋｏｄｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００１；１０：２１６５−２１７０）。ＭＢＮＬ１およびＭＢＮＬ２は、成熟な骨格筋、心臓および脳において発現される（Ｆａｒｄａｅｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００２；１１（７）：８０５−８１４；Ｋａｎａｄｉａ ＲＮ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ Ｐａｔｔｅｒｎｓ ２００３；３（４）：４５９−４６２）。ＭＢＮＬ３は、主として胎盤で発現される。ＭＢＮＬ１機能の欠失は、選択した群のプレｍＲＮＡ（例えば、インシュリンレセプターおよび塩素イオンチャネル１）についての選択的スプライシングの調節異常につながる。過剰発現されると、３つ全てのＭＢＮＬファミリーメンバーが、スプライシングを調節し得る（Ｈｏ ＴＨ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１５）：３１０３−３１１２）。他のスプライシング因子（例えば、ＣＵＧ−ＢＰ１）は、ＤＭ１におけるスプライス異常に寄与し得る（Ｓａｖｋｕｒ ＲＳ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００１；２９（ｌ）：４０−４７；Ｐｈｉｌｉｐｓ ＡＶ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８；２８０（５３６４）：７３７−７４１）が、これらは、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの核病巣においては分離されない。発生上不適切なスプライスアイソフォームの発現は、インシュリン抵抗性およびミオトニーのようなＤＭ１の徴候および症状につながる。
２．実施例２：ＤＭ１のマウスモデル
２１８．ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスは、３’ＵＴＲに（ＣＵＧ）２５０を含むヒトの骨格筋アクチンｍＲＮＡを発現する。これらのマウスは、専ら骨格筋において高レベルのポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを発現し、そして、筋緊張性ミオパシー９を発症する（以下を参照のこと）。Ｍｂｎｌ１ΔＥ３／ΔＥ３マウス（Ｓｗａｎｓｏｎラボにおいて誘導されたもの）は、Ｍｂｎｌ１の標的対立遺伝子がホモ接合性である。これらのマウスは、筋緊張性ミオパシーを発症するが、このミオパシーは、ＨＳＡＬＲマウスにおけるものよりも重篤度が低いようである５。Ｍｂｎｌ１ノックアウトマウスもまた、白内障、進行性（最終的に致死）の心臓病およびＣＮＳ機能の異常のような、ＤＭ１の複数の全身性特徴を発症する。
３．実施例３：ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの構造とＭＢＮＬ１への結合
２１９．ポリ（ＣＵＧ）ＲＮＡは、病因性に拡張されると、インビトロで安定なヘアピン構造を形成する（Ｎａρｉｅｒａｌａ Ｍ，Ｋｒｚｙｚｏｓｉａｋ ＷＪ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２（４９）：３１０７９−３１０８５；Ｔｉａｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｒｎａ ２０００；６：７９−８７）。ヘアピンのステムは、Ｇ・ＣおよびＣ・Ｇの塩基対が、周期的なＵ・Ｕミスマッチによって隔てられた、広範な二重鎖ＲＮＡの領域である。ＭＢＮＬ１は、インビトロで、拡張されていないポリ（ＣＵＧ）よりも、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐに優先的に結合し、構造化された（二重鎖）形態のポリ（ＣＵＧ）を認識することが示唆された（Ｍｉｌｌｅｒ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２０００；１９（１７）：４４３９−４４４８）。比較すると、ＭＢＮＬ１によるスプライシングの調節の生理学的標的は、短く、６〜８ｎｔのイントロン性スプライスエンハンサー／リプレッサーエレメントである。
４．実施例４：進行性の筋緊張性ミオパシー（ＰＭＭ）：複合的な表現型
２２０．ＤＭ１におけるＰＭＭは、他の形態のジストロフィにおける筋肉の表現型とは異なる。ＰＭＭは、異なる遺伝子、そして、結果的には異なる経路、に対するスプライス異常の独立した影響から生じる、複合的かつ付加的な表現型である。
ａ）ミオトニー
２２１．ミオトニーは、筋線維において生成された活動電位が走ることによって引き起こされる、自発的な収縮の後の筋弛緩の遅延である。ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスにおいて、ミオトニーは、ＣｌＣ−１塩素イオンチャネルの選択的スプライシングの調節異常と、筋細胞膜のＣｌコンダクタンスの７０％を超える減少とを伴う（Ｍａｎｋｏｄｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ２００２；３５−４４）。ＣｌＣ−１スプライシングの並行した異常と、ＣｌＣ−１タンパク質の欠失とは、ヒトＤＭ１およびＤＭ２において生じる。ＤＭ１におけるミオトニーが、ＣｌＣ−１のスプライシングに対する影響から生じる塩素イオンチャネル疾患であるというさらなる証拠から、誤って調節されたエキソンのスプライシングを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチド、または、ＡＡＶ媒介性のＭＢＮＬ１の過剰発現のいずれかによるＣｌＣ−１スプライス異常の逆転は、ＨＳＡＬＲマウスにおけるミオトニーの消散につながる（Ｍ Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｒ Ｋａｎａｄｉａ，Ｔ Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）。医薬はミオトニーの部分的な緩和を提供するが、ミオトニーが重篤である場合にはあまり有効ではなく、したがって、広く処方されない。ミオトニーは、また初期の欠陥によって妨害される腕の筋肉において最も重篤であるので、手先の器用さと顕著に干渉し、肉体的欠陥に寄与する。さらに、ミオトニーの重篤度と、ＤＭ１の欠陥との間には明白な相関が存在し、筋緊張性の放電に起因するカルシウムおよび機械的過負荷は、ミオパシーを加速し得ることを示唆する。
ｂ）インシュリン抵抗性
２２２．ＤＭ１は、骨格筋におけるインシュリン抵抗性によって特徴付けられる。Ｃｏｏｐｅｒおよび共同研究者らは、スプライス異常が、インシュリンレセプターの選択的スプライシングに影響を及ぼすことを示した（Ｓａｖｋｕｒ ＲＳ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２００１；２９（１）：４０−４７）（ＩＮＳＲ）。ＤＭ１の筋肉において発現される優勢なＩＮＳＲアイソフォームは、エキソン１１がスキップされた非筋肉アイソフォームであり、これは、より低いシグナル伝達能を有する。ハイブリッドなＩＧＦ−１／インシュリンレセプターが骨格筋において形成するので、ＩＮＳＲのスプライス異常はまた、ＩＧＦ−１のシグナル伝達にも影響し得る。
ｃ）ミオパシー
２２３．いくつかの要因が、ＤＭ１におけるミオパシーの病因に寄与し得る：（１）インシュリンおよびＩＧＦ−１レセプターを介したシグナル伝達の減少のような、同化作用の影響の減少に起因した単純な萎縮；（２）ＤＭ１の筋線維において観察される異常な細胞骨格組織のような、構造的異常；（３）線維ごとの筋核数の増加（ＤＭ１における最初期の組織学的変化）により反映されるような、核機能の異常；（４）ＤＭ１の最も重篤かつ先天的な形態を特徴付ける異常な筋発生によって反映されるような、効果のない再生／修復；（５）筋線維および拡張された末端分枝における脱神経様の変化（核濃縮症の核凝集、角状の萎縮線維（ａｎｇｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｉｃ ｆｉｂｅｒ））、ならびに、筋内神経における軸索の増殖によって反映されるような、神経−筋栄養供給（ｔｒｏｐｈｉｃ ｓｕｐｐｏｒｔ）の減少；ならびに（６）ミオトニーに起因するカルシウムの過負荷。
５．実施例５：ＭＢＮＬ１の壊死巣分離：筋のスプライス異常における中心的役割
２２４．ＤＭ１におけるスプライス異常は、発生調節の共通した時間的パターンを共有する選択した群のプレｍＲＮＡを標的とする（Ｌｉｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００６）。スプライス異常により影響を受けるエキソンは、通常、野生型マウスにおける生後初期の発生の間に、同調性のスプライシングの切替を受ける。しかし、ＭＢＮＬ１の欠失、または、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの発現は、これらのスプライシング移行の同じ失敗を生じる。ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウス、ＭＢＮＬ１ノックアウトマウス、ならびにヒトのＤＭ１およびＤＭ２におけるスプライス異常は、高度に一致している。ＤＭ１およびＤＭ２の筋断片の免疫蛍光検査は、ＭＢＮＬ１が、核質内のどこかで顕著に欠失されるような程度まで、リボ核病巣内に補充されることを示す（Ｌｉｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００６）。まとめると、これらの結果は、ＭＢＮＬ１が、ＭＢＮＬ１は、スプライス異常の病因において中心的な役割を担うことを示す。さらに、マウスモデルにおける表現型の結果は、明らかに、ＭＢＮＬ１タンパク質の核供給に関して、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐのレベルにより影響される。例えば、表現型が正常であり、かつ、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの閾値以下の蓄積を有するＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスの系統において、ＭＢＮＬ１のヌル異種接合性との交配（ＭＮＢＬ１タンパク質を５０％低下させる）は、スプライス異常、ミオトニーおよびミオパシーをもたらす。また、ＡＡＶ−ＭＢＮＬ１発現ベクターの筋肉内注射は、ＨＳＡＬＲマウスにおけるミオトニーの消散およびスプライス異常の矯正をもたらす。
６．実施例６：ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐにより誘導されるスプライス異常を矯正する化合物についての細胞ベースのアッセイ
２２５．アッセイは、以下の２つの構成部分を有する：（１）ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐにより誘導されるスプライス異常を示す細胞；および（２）スプライス異常の重篤度を報告するミニジーン構築物。レポーターを開発するために、およそ７０の選択的スプライシングを受けたエキソンを、ＨＳＡＬＲマウスおよびＤＭ１筋において解析して、スプライス異常により最も影響を受けるエキソンを同定した。スプライス異常により影響を受けた１６のエキソンのうち、ＳＥＲＣＡ１のエキソン２２が、最も重篤に影響を受けたものの１つであり、そして、ＳＥＲＣＡ１の遺伝子構造は、自身を、レポーターアッセイに十分に適合させる。エキソン２２をスキップするＳＥＲＣＡ１ ｍＲＮＡの割合は、野生型における３±０．７％からＨＳＡＬＲマウスにおける７８±４％へと増加し、そして、ＤＭ１およびＤＭ２における対応する変化は同様であった（Ｌｉｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００６）。ＳＥＲＣＡ１エキソン２２は、通常、野生型の筋肉において出生後のスプライシングの切替を受けるが、ＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスおよびＭＢＮＬ１ノックアウトマウスにおいて、この切替は起こっていない（図１Ａ）。エキソン２２および２３は、ＳＥＲＣＡ１翻訳についての代替的な終止コドンを含む（図１Ｂ）。ミニジーン構築物ｐＳＥＲＦをクローニングして、エキソン２２をスキップするもの、およびエキソン２２を含むものの相対的な頻度について、蛍光の読み出しを行った。ｐＳＥＲＦは、ＳＥＲＣＡ１エキソン２２と、その隣接するイントロンとを含む（図１Ｃ）。隣接するエキソンからのスプライスドナーおよびアクセプターのシグナルを、黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）および青色蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）についてのコード領域に融合する。これらのタンパク質の単色放射分離は、両方のタンパク質が同時に発現されるときに、ｅＹＦＰ成分およびｅＣＦＰ成分とを分解することで事足りる。両方の蛍光タンパク質は、モノマーとして機能し、そして、迅速な成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）時間を有する。通常の成熟な骨格筋に特徴的なスプライシングの結果は、エキソン２２を含むものである（図１Ａ、レーン４）。ｐＳＥＲＦのエキソン２２を含む（ｅｘ２２＋）転写物は、ｅＹＦＰのみをコードする。ＤＭ１の筋肉に特徴的なスプライシングは、エキソン２２をスキップする（ｅｘ２２−、図１Ａ、レーン５〜１２）。ｅｘ２２−転写物は、ｅＹＦＰ−ｅＣＦＰ融合タンパク質（Ｙ・ＣＦＰ）をコードする。ｐＳＥＲＦが野生型の筋肉において適切にスプライシングを受け、そして、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐに応答して誤って調節されることを調べるため、ｐＳＥＲＦを、野生型マウスまたはＨＳＡＬＲマウスにおいてインビボでエレクトロポレーションし、そして、４日後にＲＮＡの解析のために筋肉を回収した。予測されたとおり、エキソン２２を含むものは、ＨＳＡＬＲマウスにおいて低く、そして、野生型の筋肉において高かった（図１Ｄ）。これらの結果は、ｐＳＥＲＦがポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐにより誘導されるスプライス異常を報告し得ることを示す。
２２６．本明細書中に開示されるように、スプライス異常の矯正は、ＤＭ１の基本的な症状を改善する。スプライス異常アッセイは、ＤＭ１における治療可能性を持つ化合物の同定についていくつかの利点を有する。スプライス異常は、ＤＭ１の症状に直接的に関係する、ＲＮＡ媒介性の疾患プロセスの下流の結果である。スプライス異常のスクリーニングは、スプライシング機構またはＲＮＡプロセシングの上流のいずれかに作用する、以下の所望の作用のうちいずれかを有する化合物を捕捉し得る：（１）ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ ＲＮＡ分解の加速；（２）ＭＢＮＬ１活性のアップレギュレーション（転写後）；（３）核病巣における壊死巣分離からのＭＢＮＬ１の放出；および（４）ＣＵＧ−ＢＰ１のような、スプライシングの欠陥を改善する他のスプライシング調節因子への作用。ＭＢＮＬ１によるポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの認識を阻害する化合物についてのスクリーニングの点で、スプライス異常アッセイは、その生理学的標的であるＳＥＲＣＡ１プレｍＲＮＡ内のスプライスエンハンサーエレメントと比較して、その病理学的標的であるポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ ＲＮＡとのＭＢＮＬ１の相互作用を示差的に阻害する化合物を同定する。最終的に、アッセイ結果の分散は小さい。読み出しは、いずれかのアイソフォームの絶対的なレベルではなく、単一の転写ユニットから生成される２つのスプライス生成物の比によって決定される。この設計は、ウェルへの細胞の不均一な送達、または、細胞の代謝もしくは生存に対する化合物の非特異的な阻害作用から生じる分散を最小限にする。選択的スプライシングのＲＮＡベースのアッセイにおいて、２つの選択的スプライシング生成物の相対的な割合についての分散係数は、通常、３％より小さく、これは、遺伝子発現の多くの測定値よりも小さい。本明細書中に開示されるアッセイについての読み出しは、ｐＳＥＲＦタンパク質生成物の直接的な蛍光決定が理論上正確であり得るので、少なくともこの小ささである。
ａ）概要
２２７．ＭＢＮＬ１およびポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを過剰発現する細胞株を、まず、ＭＢＮＬ１を過剰発現させ、次いで、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを発現させる、という、安定なトランスフェクションの連続的な段階において得られ得る。両方の場合において、遺伝子移入は、バクテリオファージΦＣ３１に由来するインテグラーゼによる補助を受けて、全長の一コピーのトランスジーン組み込みを達成する。ＭＢＮＬ１構築物およびポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ構築物の段階的な導入は、細胞におけるＭＢＮＬ１およびポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの発現の最適な比を選択する際、より大きな柔軟性を提供する。スプライス異常は、各段階において、レポーター構築物ｐＳＥＲＦの一過的なトランスフェクションにより定量される。手順の順序は以下のとおりである：
２２８．１．ＭＢＮＬ１発現構築物であるｐＭ１（図６）で細胞を安定にトランスフェクトする。ｐＳＥＲＦの一過的なトランスフェクションにより、これらの株においてスプライシングを調べる。Ｙ・ＣＦＰに対するＹＦＰの高い比を有し、かつ、エキソン２２を含むものが多い株を選択する。
２２９．２．ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ発現構築物であるｐＬＬＣ７（図７）で安定にトランスフェクトする。ＧＦＰ−ネオマイシン耐性カセットの均一な発現を示す細胞株を選択する。
２３０．３．ｃｒｅリコンビナーゼを用いて、ＬＬＣ７トランスジーン内のＧＦＰ−ネオマイシン耐性カセットを除く。組換えが、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの発現を活性化したこと、そして、細胞が、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの核病巣を生じることを確認する。
２３１．４．ｐＳＥＲＦの一過的なトランスフェクションによりスプライシングを調べる。Ｙ・ＣＦＰに対するＹＦＰの低い比を有し、かつ、ＳＥＲＣＡ１エキソン２２を含まないものが多い株（すなわち、ＤＭ１の筋肉に特徴的なスプライシングパターン）を選択する。
ｂ）細胞株を安定にトランスフェクトして、ＭＢＮＬ１を過剰発現させ、そして、「筋肉様（ｍｕｓｃｌｅ−ｌｉｋｅ）」のスプライシング結果を得る
２３２．スプライス異常により影響を受けることが現在知られる全てのエキソンは、骨格筋における正常な調節のためにＭＢＮＬ１を必要とし、そして、ＭＢＮＬ１の非存在下では、ＤＭ１様のスプライス異常を示す（Ｌｉｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００６）。これらのエキソンのいくつかは、ＣＵＧ−ＢＰ１およびＭＢＮＬ１による拮抗する調節を示す：正常な筋肉のスプライシングパターンは、ＭＢＮＬ１によって促進され、ＤＭ１または非筋肉細胞に特徴的なパターンは、ＣＵＧ−ＢＰ１によって促進される（Ｈｏ ＴＨ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１５）：３１０３−３１１２；Ｐｈｉｌｉｐｓ ＡＶ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８；２８０（５３６４）：７３７−７４１）。形質転換した細胞株におけるＭＢＮＬ１のレベルは一般に低いが、ＣＵＧ−ＢＰ１の発現は、ほぼ偏在性である。予測されたとおり、形質転換した細胞株における基本的なスプライシングの結果は、ＤＭ１において観察されたものと同様である（Ｈｏ ＴＨ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１５）：３１０３−３１１２）。しかし、細胞株におけるＭＢＮＬ１の過剰発現は、スプライシングの結果を正常な成熟した筋肉に特徴的なパターンに導くのに十分である（迅速なトロポニンＴに関しては、例えば図５を、そして、ＳＥＲＣＡ１に関しては、例えば図１３を参照のこと）。こうして、ｐＭ１（図６）を用いて、ＭＢＮＬ１を過剰発現し、かつ、野生型の骨格筋と同様のスプライシング表現型を示す、安定にトランスフェクトされた細胞株を得る。最初、労力は、２９３細胞またはＣＯＳ細胞に集中した。これらの付着性の形質転換細胞株は、ＭＢＮＬ１のスプライシング機能を評価するために、３８４ウェル形式での細胞ベースのアッセイにおいて、そして、ミニジーンアッセイにおいてこれまでに使用されてきている。安定なトランスフェクションは、プラスミド内にａｔｔＢエレメントを組み込み、そして、ｐＣＭＶＩｎｔと同時にトランスフェクトして、ΦＣ３１インテグラーゼを発現させることによって補助され得る。このインテグラーゼは、ａｔｔＢエレメントを含むプラスミドの哺乳動物ゲノム内への組換えを媒介する。組み込みは不可逆的であり、そして、バクテリオファージのａｔｔＰ組み込みエレメントに相同な配列を有する数百の部位のいずれかにおいて生じ得る。このようにして、ΦＣ３１は、同じ細胞株における、構築物の段階的な導入に使用され得る。このインテグラーゼは、多様な起源の細胞株において有効であり、そして、常に、全長の構築物の一コピーの組み込みをもたらす（Ｃｈａｌｂｅｒｇ ＴＷ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００６；３５７（ｌ）：２８−４８）。組み込みは、転写により活性となり、トランスジーンの発現を支える領域において生じる傾向がある（Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８（５）：６４６−６５３）。ΦＣ３１インテグラーゼによって補助された安定なトランスフェクションは、かなり効率的である。
ｃ）手順
２３３．Ｄｒ Ｃａｌｏｓ（Ｃｈａｌｂｅｒｇ ＴＷ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００６；３５７（ｌ）：２８−４８）により以前に規定された条件を用い、ｐＭ１およびｐＣＭＶＩｎｔ（ΦＣ３１インテグラーゼ発現構築物）で同時に２９３細胞トランスフェクトする。ｐＣＭＶＩｎｔ：ｐＭ１の比は５０：１である。細胞を、トランスフェクションから２４時間後に１：３０にスプリットし、そして、翌日、ハイグロマイシン選択培地に移す。選択から１０〜１４日後にクローンを単離する。クローンは、以下について解析する：（１）ｐＳＥＲＦでのトランスフェクションによるスプライシングの結果、その後の、ＲＴ−ＰＣＲおよび蛍光解析；ならびに、（２）免疫蛍光および免疫ブロット法によるＭＢＮＬ１の過剰発現。本明細書中には、内因性のＭＢＮＬ１の発現レベルは低く、そして、エキソン２２を含むものは５％より少ないことが開示される。抗ＭＢＮＬ１ポリクローナル抗体Ａ２７６４が作られ、これは、免疫ブロット法および免疫蛍光により単一特異的であることが示された（Ｌｉｎ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００６）。最適な細胞株は、トランスフェクトを行っていないコントロールと比較して、高い頻度のエキソン２２含有（高いＹＦＰ：Ｙ・ＣＦＰ比）、細胞ごとにむらのない核ＭＢＮＬ１の増加、および、免疫ブロット法によるＭＢＮＬ１タンパク質の全体的な増加、を示すものである。
（１）ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを発現する安定にトランスフェクトされた細胞株
（ａ）ＭＢＮＬ１およびポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ発現の均一性
２３４．毒性ＲＮＡであるポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ、およびその主要な細胞内結合タンパク質であるＭＢＮＬ１の化学量論に依存する疾患状態に関して、治療作用に最も応答性の細胞系は、全細胞が、ＭＢＮＬ１を分離するのにちょうど十分なレベルでポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを発現し、そして、強いスプライス異常表現型を誘導するものである。この理想からの逸脱は、治療化合物に対するアッセイの応答性を低下させる。トランスジーン発現の細胞ごとのむらは、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐに独特の問題であるようである。閾値以下のポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ蓄積を有する細胞は、スプライス異常を生じることはないが、高負荷量のポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを有する細胞は、治療作用に対して「抵抗性」である。いずれの場合も、細胞は、化合物を検査のためには反応が鈍くなり、そして、これに応じてスクリーニング力が低下する。
（ｂ）ｐＬＬＣ７構築物を用いた全体的なアプローチ
２３５．拡張されたＣＵＧ繰り返しの発現のための構築物は、不安定性およびトランスジーンのサイレンシングの問題を呈する。これらの問題を克服するため、最適な安定性およびポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ発現の均一性について安定にトランスフェクトされた細胞株を作製するために、３つの段階が採用される。第一に、ΦＣ３１インテグラーゼを用いて、全長の１コピーの組み込みを達成する。トランスジーンは、最初、ＧＦＰ−ネオマイシン耐性選択カセットを発現する。第二に、ＦＡＣＳを用いて、選択カセットを均一に発現する細胞株を選択する。クローンの最初の単離および選択の間には、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐのあらゆる有害な影響が回避される。第三に、ｃｒｅリコンビナーゼを用いてｎｅｏ−ＧＦＰカセットを切除し、そして、３’ＵＴＲにおけるポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ伴うルシフェラーゼの発現を活性化させる。
（ｃ）拡張されたＣＴＧ繰り返しの不安定性
２３６．１５０を超える繰り返しのＣＴＧ繰り返し区域は、Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターにおける強い短縮傾向を有し（Ｋａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ １９９５；１０（２）：２１３−２１８）、そして、２５０を超える長さの繰り返しをクローニングすることは困難である。不可避なことに、拡張されたＣＴＧ繰り返しを含むプラスミド調製はどれも、多様な拡張長さの不均一な混合物から構成され、そして、同じストックから播種された細菌培養物が、調製ごとにかなりの多様性を示す。このことは、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ発現構築物の使用に対して、直接的な影響を有する：拡張されたポリ（ＣＴＧ）化合物の遺伝的不安定性、一過的なトランスフェクションに固有の問題、すなわち、トランスフェクション効率におけるアッセイごとの多様性、および、異なる用量のプラスミドを受ける細胞間の不均一なトランスジーンの発現。このことは、スクリーニングの有効性を低下させ、そして、スクリーニング施設にアッセイを移すことに関する問題を生じ、安定なトランスフェクションを、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを発現させるための好ましい方法として選択させることになる。
（２）トランスジーンのサイレンシング
２３７．哺乳動物細胞への遺伝子移入は、多様なトランスジーンサイレンシングに供される。サイレンシングは、代表的には、安定なトランスフェクションのための従来の手順により生成される大きな複数コピーのトランスジーンアレイにおいて生じるような、配列の繰り返しにより増強される。トランスジーンのサイレンシングは、特に、繰り返しのエレメントを含むトランスジーンについて顕著である。拡張されたＣＴＧ繰り返しは、最も強いヌクレオソーム位置決定エレメントであり（Ｗａｎｇ ＹＨ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｊ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９５；２５（２）：５７０−５７３）、そして、これらの配列は、トランスジーンサイレンシングの特に強力な誘導因子である。これらのサイレンシングの作用は、特質上、細胞間で多様であり、そして、クローン性の単離体において半遺伝性である。こうして、安定にトランスフェクトされた細胞株を得るための従来の方法は、複合的な、複数コピー（数十〜数百のコピー）のトランスジーンアレイをもたらす。これらの細胞株は、サブクローン、または、経時的な大量培養物において、多様なサイレンシング、顕著なポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ蓄積の細胞ごとの多様性、および不安定な発現を示すことが予測される。
（３）ＤＭＰＫの３’ＵＴＲ
２３８．変異ＤＭＰＫ ｍＲＮＡの病原性は、ＤＭＰＫ ３’ＵＴＲ内ではあるが、繰り返し区域の外側にあるエレメントにより影響され得る（Ａｍａｃｋ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ２００１；１０（１８）：１８７９−１８８７）。したがって、ＤＭＰＫ ３’ＵＴＲは、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの病原性に影響し得るシスエレメントを維持するよう、構築物中に組み込まれている。
ｄ）Ｂｉｚｙｍｅ選択カセット（ＧＦＰに融合されたネオマシインホスホトランスフェラーゼ）
２３９．このカセットは、最初にネオマイシン耐性により、そして続いて、蛍光によりクローンを選択することを可能にする（Ｈａｎｓｅｎ ＳＧ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００２；３２（５）：１１７８，１１８０，１１８２−１１７８）。ＢｉｚｙｍｅをコードするｃＤＮＡに、３つのＳＶ４０転写終結部位のコンカタマーが続く（Ｎｏｖａｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓｉｓ ２０００；２８（３−４）：１４７−１５５）（「三重停止（ｔｒｉｐｌｅ ｓｔｏｐ」）。この三重停止エレメントは、試験され、そして、ｃｒｅリコンビナーゼによるＢｉｚｙｍｅ選択カセットおよび三重停止の切除後まで、下流のルシフェラーゼおよびＣＴＧ繰り返しの転写を完全に防止することが示された。
ｅ）手順
２４０．本明細書中に開示される方法において誘導された細胞は、ＬＬＣ７およびｐＣＭＶＩｎｔを同時にトランスフェクトされ、そして、上述のように、Ｇ４１８耐性クローンについて選択されたものである。最初に、（ＣＴＧ）３００−３５０を含むＬＬＣ７クローンを選択する。ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを含む転写物の核保持の閾値は、明確には規定されていない。しかし、Ｃ２Ｃ１２細胞およびトランスジェニックマウスにおける観察は、１５０回の繰り返しを持つ転写物が核により保持されること、そして、核保持の程度は、拡張の長さがより長くなるにつれ増加することを示す（Ａｍａｃｋ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １９９９；８（１１）：１９７５−１９８４）。ＣＴＧ拡張のクローニングのための上限に近い繰り返しの長さから開始することにより、比較的完全な核保持が達成され得る。このことにより、バックグラウンドのルシフェラーゼ活性を減少させ、そして、ヒトＤＭ１において観察されるほぼ完全な核保持をより類似して近似する。次に、均一なＧＦＰ蛍光を有するクローンをＦＡＣＳにより選択する。これらのクローンは、ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクターを一過的にトランスフェクトし、次いで、ＧＦＰ発現を失ったクローンを逆選択する。クローンを、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＭＢＮＬ１免疫蛍光、および、ｐＳＥＲＦでの一過的なトランスフェクションの後のスプライシングの解析により比較する。ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐのリボ核病巣を検出するためのＦＩＳＨと、ＭＢＮＬ１を検出するための免疫蛍光との組み合わせは、確立された手順である。スプライス異常を示す細胞において予測される結果は、リボ核病巣におけるＭＢＮＬ１の壊死巣分離である。最適なクローンは、一貫したリボ核病巣におけるＭＢＮＬ１の壊死巣分離を示し、そして、ｐＳＥＲＦのスプライシングにより、ＳＥＲＣＡ１エキソン２２をスキップしたアイソフォームに戻ることが予測される（ＹＦＰ：Ｙ・ＣＦＰの蛍光の比は低い）。
ｆ）ｐＳＥＲＦ蛍光スプライシングレポーターの較正および分散
２４１．ｅＣＦＰについての放出スペクトルおよび励起スペクトルの以前の報告は、幾分多様であり、そして、Ｙ・ＣＦＰのｅＹＦＰ構成成分とｅＣＦＰ構成成分との間のＦＲＥＴ相互作用の可能性が存在する（Ｐｏｌｌｉｔｔ ＳＫ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｎ ２００３；４０（４）：６８５−６９４）。細胞中のｅＹＦＰ、ｅＣＦＰおよびＹ・ＣＦＰ融合タンパク質について全単色放射解析を行い、そして、Ｙ・ＣＦＰにおけるＦＲＥＴの程度を決定する。この作業は、Ｖａｒｉａｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ蛍光計を用いて行う。強力なＦＲＥＴ相互作用が、Ｙ・ＣＦＰからのシグナルを直接決定するための方法（すなわち、ＣＦＰを励起し、ＹＦＰの放出波長において読み取り、交差励起について調節する）を提供し得る。あるいは、ＦＲＥＴの測定は、各々が、最少の交差励起を提供する波長において励起される場合、ｅＹＦＰ放出とｅＣＦＰ放出の比の単純な解析を超えるいかなる利点も提供し得ない。これらの実験の成果は、同時に発現されるときのＹＦＰ：Ｙ・ＣＦＰの比を決定するために最適な波長を選択することである。本明細書中に開示されるストラテジーは、既知の比のｅＹＦＰおよびＹ・ＣＦＰを解析し、そして、エキソン２２を含むもののＲＴ−ＰＣＲ解析によって決定されたＲＮＡスプライシングの結果に対して校正する、という、混合型実験において調べられる。安定なトランスフェクションは、特定のクローンにおいて達成されるＭＢＮＬ１またはポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの発現のレベルに依存して、種々の異なるスプライシング結果を示すクローンを生成するようである。そうであるならば、最終的なアッセイについて選択されていないが、多様な程度のエキソン２２含有を示す、「中間」クローンのこのパネルは、蛍光計を用いたインタクトな細胞から得られる蛍光読み出しの校正と、その後の、スプライシング解析のためのＲＮＡ抽出に使用される。この様式において、ウェルごと、およびアッセイごとの蛍光読出しの分散は、スプライシング結果の全スペクトルにわたって決定される。このような「中間」クローンが利用可能でない場合、スプライシング結果の全スペクトルが、（非改変の）２９３細胞をｐＳＥＲＦおよび増加する量のｐＭ１でトランスフェクトし、エキソン２２を含むレベルを高めることによって、再構成され得る。いずれかのアプローチにより、エキソン２２を含む転写物の分画と、ｅＣＦＰ／ｅＹＦＰ活性の比との間の関係性が確実なものとなる：ｅＹＦＰは、全スプライシング結果の構成成分であるのに対し、ｅＣＦＰは、エキソン２２を含むレベルの増加に正比例して徐々に少なくなる。これらの結果から、ウェルとＺ因子との間の分散係数が計算され（Ｚｈａｎｇ ＪＨ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ １９９９；４（２）：６７−７３）、そして、スプライス異常に対する影響について、検出限界が推定され得る。
２４２．このアッセイを達成するために、細胞をｐＳＥＲＦでトランスフェクトし、２４時間後に、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐプレートフィルタを用いて９６ウェルに分配する。１０μＭの最終濃度で試験化合物を加える。２４時間後にｐＳＥＲＦスプライシングの蛍光解析を判定する。ポジティブな結果は、追試ウェルを用いて繰り返し実験で確認し、その後、他のアッセイを用いて評価する。
７．実施例７：インビボでのＭＢＮＬ１のポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐとの相互作用を阻害する化合物についての細胞ベースのアッセイ
２４３．ＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ相互作用の阻害は、ＤＭ１における理論上の治療対象である。スプライス異常アッセイは、この活性を持つ化合物を同定し得る。しかし、ＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ相互作用のインヒビターについてのより直接的なスクリーニングは、より高感度であり得るか、または、異なるセットの化合物を同定し得る。例えば、スプライス異常スクリーニングは、その生理学的な標的（スプライスエンハンサーエレメント）ならびにその病理学的な標的（ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ）のＭＢＮＬ１による認識を阻害する化合物について、ネガティブな結果を与え得る。それにもかかわらず、これらの化合物は、多様な濃度における病理学的相互作用を優先的に阻害し得るか、または、さらなる構造活性の関係性の調査により、病理学的相互作用を優先的に標的とするように改変され得る骨格を提供し得る。
ａ）ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを含有する転写物の細胞質への放出を誘発する化合物についてのアッセイ
２４４．ＭＢＮＬ１のｓｉＲＮＡ媒介性のノックダウンは、ＤＭ１の筋芽細胞における病巣の約７０％の減少をもたらした。これらの観察に基づくと、ＭＢＮＬ−１ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ相互作用は、ＤＭ１の筋芽細胞におけるリボ核病巣形成の主な決定因子であることが決定された（Ｄａｎｓｉｔｈｏｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５；２８０（７）：５７７３−５７８０）。本明細書中には、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ転写物が、インビトロで、精製組換えＭＢＮＬ１の存在下で非常に高い分子量の形成を示すことが開示される（図４）。これらの高分子量複合体が細胞内で形成する場合、これは、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを含むｍＲＮＡの核保持をもたらす。これらの知見は、ＭＢＮＬ１認識の阻害が、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを含むｍＲＮＡの核細胞質輸送および翻訳の増加をもたらすことを示す。
ｂ）３’非翻訳領域にポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを含有するｍＲＮＡの翻訳に対するＭＢＮＬ１の作用
２４５．２９３細胞を、ｐＬＬＣ７の拡張された繰り返し（約３００回の繰り替えし、ｌｕｃＣＵＧ３００）、または、非繰り返しバージョン（ｌｕｃＣＵＧφ）で安定にトランスフェクトする。これらの細胞は、ｌｕｃ ｍＲＮＡの強力な発現を有するが、ＭＢＮＬ１の穏やかな内因性の発現を有することが予測される。これらの細胞を用いて、ルシフェラーゼ活性、核病巣およびｌｕｃ ｍＲＮＡの分布に対する、ＭＢＮＬ１のノックダウン（ＭＢＮＬ１コード領域を標的とするｓｉＲＮＡの使用（Ｄａｎｓｉｔｈｏｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００５；２８０（７）：５７７３−５７８０））または過剰発現（ｐＭ１の一過的なトランスフェクション）の作用を、核 対 細胞質画分で比較し得る。ＭＢＮＬ１ノックダウンと比較すると、ＭＢＮＬ１の過剰発現は、核病巣を増加させ、ルシフェラーゼ活性を低下させ、そして、ｌｕｃＣＵＧ３００についてｍＲＮＡの核細胞質比を増加させるが、ｌｕｃＣＵＧφについては増加させない。
ｃ）核病巣からのポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ含有ｍＲＮＡを放出する化合物についてのアッセイ
２４６．本明細書中に開示される細胞株は、さらに改変することなく、細胞質放出アッセイにおいて用いられ得る。ルシフェラーゼ活性について、クローンを、ＭＢＮＬ１のｓｉＲＮＡノックアウトの存在下および非存在下で比較する。ルシフェラーゼ活性のアップレギュレーションによって決定した、ＭＢＮＬ１ノックダウンに最も応答性のクローンを選択する。
ｄ）細胞におけるＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ相互作用についての蛍光相補性アッセイ
２４７．ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐのＦＩＳＨ検出をＭＢＮＬ１の免疫蛍光検出と組み合わせて共局在化を示すことにより、細胞内でポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐとＭＢＮＬ１との間の相互作用を評価する。ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐとＭＢＮＬ１との相互作用は、ＭＢＮＬ１に対する抗体を用いたポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ転写物の免疫沈降により、細胞溶解物において実証され得る（Ｘ Ｌｉｎ，Ｃ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，未公開）。しかし、いずれの方法も、スクリーニングアッセイに大いに馴染みやすいわけではない。したがって、蛍光相補性アッセイを用いて、細胞におけるＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの結合を検出および定量する。このアプローチは、三分子蛍光相補性蛍光相補性（ＴｒｉＦＣ）法（Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ，Ｂｒｏｗｎ ＣＭ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１６）：３３４６−３３５５）を改変したものである。
ｅ）実験系
２４８．系は、３つの構成成分を含む：（１）バクテリオファージＭＳ２被膜タンパク質によって認識されるＲＮＡエレメントに隣接してポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを含むキメラ転写物；（２）Ｖｅｎｕｓ蛍光タンパク質のＣ末端部分（ＶＦＰＣ）に融合されたＭＢＮＬ１タンパク質；および（３）ＶＦＰのＮ末端部分（ＶＦＰＮ）に融合されたＭＳ２被膜タンパク質（ＭＳ２ＣＰ）。３つ全ての構成成分が同時に発現される場合、基底状態での予測される結果は、強いＶＦＰ蛍光である。なぜならば、ＭＢＮＬ１・ＶＦＰＣおよびＭＳ２ＣＰ・ＶＦＰＮがキメラポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ転写物に非常に近接した位置で組み立てられる一方で、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ−ＭＢＮＬ１相互作用を阻害する化合物が、ＶＦＰ蛍光を減少させるからである。ｍＲＮＡの隣接領域への２つのタンパク質の結合を検出するための方法としての、ＴｒｉＦＣの特異性および感度は、最初に、ジップコード結合タンパク質であるＩＭＰ１およびＭＳ２ＣＰについて実証された（Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ，Ｂｒｏｗｎ ＣＭ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１６）：３３４６−３３５５）。ＴｒｉＦＣは、ＭＳ２ＣＰ・ＶＦＰＮとＭＰ１・ＶＦＰＣとが、３’ＵＴＲにおいて隣接するＭＳ２およびＩＭＰ１認識エレメントを含む転写物と同時に発現されたときに、強い蛍光シグナルを生じた。ＭＳ２ＣＰまたはＩＭＰ１の結合を排除したＲＮＡ標的における変異は、蛍光シグナルの消失をもたらした（Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ，Ｂｒｏｗｎ ＣＭ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１６）：３３４６−３３５５）。結果は、他のＲＮＡ結合タンパク質およびそのそれぞれのＲＮＡ認識エレメントでも同様であった。バックグラウンドは低く、ＶＦＰは、明るい蛍光、単肢の構造、および迅速な成熟という利点を有した（Ｎａｇａｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２；２０（１）：８７−９０）。
（１）ＴｒｉＦＣアッセイを開発するための手順
２４９．三分子複合体の組み立てのためのｍＲＮＡ標的を発現する細胞株を開発するために、キメラポリ（ＣＴＧ）ｅｘｐ−ＭＳ２ＲＥ挿入物を含む改変「ＣＴＧドナープラスミド」をクローニングする。このフラグメントを、直接ｐＬＬＣ７にサブクローニングする（図７）。このキメラ配列は、拡張されたＣＴＧ繰り返しの２つの区域を含み、その各々が、各々ＭＳ２ＲＥの二量体から構成される２つのＭＳ２結合部位で中断された、１３０の繰り返しから構成される（図８を参照のこと）。ＧＦＰ−ネオマイシン耐性カセットの均一な発現を持つ細胞株を選択した後に、カセットを、ｃｒｅリコンビナーゼで除去する。
２５０．分割Ｖｅｎｕｓタンパク質のＮ末端部分およびＣ末端部分（ＶＦＰＮおよびＶＦＰＣ）にタグ化された、ＭＳ２ＣＰおよびＭＢＮＬ１という、２つの融合タンパク質を構築する。ＭＳ２ＣＰ・ＶＦＰＮは、ＭＳ２結合部位に対し高い親和性を保持することが示されている（Ｒａｃｋｈａｍ Ｏ，Ｂｒｏｗｎ ＣＭ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１６）：３３４６−３３５５）。ＭＢＮＬ１−ＶＦＰＣ融合タンパク質は、ポリ（ＣＴＧ）ｅｘｐに対する高い親和性を保持することが予測される。なぜなら、ｅＧＦＰでタグ化されたＭＢＮＬ１が、そのポリ（ＣＴＧ）ｅｘｐの結合およびスプライシングの調製活性を保持していたからである（Ｈｏ ＴＨ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ ２００４；２３（１５）：３１０３−３１１２；Ｆａｒｄａｅｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００１；２９（１３）：２７６６−２７７１）。
２５１．三分子相互作用の特異性および局在性を調べる。キメラポリ（ＣＴＧ）ｅｘｐ・ＭＳ２ＲＥを安定に発現する細胞と、ＭＳ２結合部位を持たないポリ（ＣＴＧ）ｅｘｐを発現するコントロール細胞とを、ＭＳ２ＣＰ・ＶＦＰＮ、ＭＢＮＬ１−ＶＦＰＣまたはこの両方をコードする構築物で一過的にトランスフェクトする。Ｖｅｎｕｓタンパク質の蛍光検出を、ポリ（ＣＴＧ）ｅｘｐのＦＩＳＨ検出と組み合わせる。
２５２．キメラポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ−ＭＳ２ＲＥ転写物へのＭＢＮＬ１−ＶＦＰＣの結合が強いＶＦＰ蛍光を生じると、ＭＢＮＬ１−ＶＦＰＣ構築物の安定なトランスフェクションが行われる。Ｖａｒｉａｎ蛍光計を用いて、ウェルごとおよびアッセイごとの分散の解析を行い、そして、安定にトランスフェクトされた細胞はキメラ転写物およびＭＢＮＬ１−ＶＦＰＣを発現し、一過的にトランスフェクトされた細胞は、ＭＳ２ＣＰ・ＶＦＰＮを発現する。
８．実施例８：インビトロでのＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ相互作用を阻害する化合物についての生化学アッセイ
２５３．単純な構成成分を用いた生化学スクリーニングは、おそらく、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐへのＭＢＮＬ１の結合のインヒビターを検出するための最も好感度の手段である。生化学スクリーニングは、細胞障害性、化合物の不安定性、不透過性、またはタンパク質結合といった理由に起因して、細胞ベースのスクリーニングでは捕捉されない化合物を同定し得る。それにもかかわらず、このような化合物は、インビボで活性を改善するように改変され得る骨格を提供し得、さらに、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐに結合する単純な化合物を同定し、そして、ＭＢＮＬ１の適度な置き換えを示し、次いで、ポリポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ二重鎖の周期性に従って間隔が空いた二量体もしくは多量体の構造の化合物を提供することによって、結合親和性を高める可能性がある。最後に、生化学スクリーニングは、細胞ベースのスクリーニングからの当たりの二次的な評価のための重要なツールを提供する。
２５４．ＭＢＮＬ１タンパク質は、疎水性かつ塩基性（ｐＨ８．９）であるので、細菌中で合成されたタンパク質の大部分は、変性されるか、または、封入体中にある。ヒトＭＢＮＬ１を、Ｃ末端においてポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）で、Ｎ末端においてグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位でタグ化することにより、ＧＳＴ−ＭＢＮＬ１−ＨｉＳ６を、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において高レベルで発現させた。約９５％の全長ＭＢＮＬ１を生じる精製物を現像した（図２Ａ）：（１）Ｎｉカラム上でのアフィニティクロマトグラフィー；（２）ＧＳＴ−セファロース上でのアフィニティクロマトグラフィー、その後プロテアーゼ切断によるＭＢＮＬ１−Ｈｉｓ６の放出；および（３）交換バッファを用いたＧ２５−セファデックス。最初、ＭＢＮＬ１−Ｈｉｓ６の沈殿がいくつかの保存バッファ中で見られた。しかし、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中の溶解性は良好であった。収率は、ＭＢＮＬ１のアイソフォームに依存して、細菌培養１Ｌあたり１〜１０ｍｇのＭＢＮＬ１タンパク質である。ＭＢＮＬ１−４１ｋＤアイソフォームおよびＭＢＮＬ１−４２ｋＤアイソフォーム（同様の結合活性およびスプライシング因子活性を有するようである、図５以下を参照のこと）、ならびに、Ｃ末端の疎水性配列を除去して、Ｅ．ｃｏｌｉからの可溶性タンパク質の収率を改善させた短縮型形態のものを用いて、精製スキームを最適化させた。短縮型タンパク質は、４つ全てのジンクフィンガーと、ＭＢＮＬファミリーメンバー間で保存されている他の領域とを含み、そのポリ（ＣＵＧ）結合活性はインタクトなままである。重要なことに、精製した組み換え型ＭＢＮＬ１は、試験転写物と共にインキュベートしたときに、リボヌクレアーゼ活性を示さない。
２５５．ポリ（ＣＵＧ）１０９のインビトロ転写のための構築物を調製し、そして、非放射活性標識転写物の酵素的合成および精製のための条件を最適化した（図２Ｂ）。ポリ（ＣＵＧ）１０９転写物は、３’末端にＡリッチな配列を含む。さらに、ポリ（ＣＵＧ）区域の５’側にあるＡヌクレオチドを排除するように修飾されたＴ７プロモーターに対し、三重繰り返しを直接融合させる。このことにより、ＲＮＡの折り畳みまたはＭＢＮＬ１結合に影響を及ぼし得るポリ（ＣＵＧ）区域内での未熟な終結または内部標識を回避しつつ、蛍光標識したＡＴＰを用いた場合には高い比活性までの生合成による標識を可能となる。さらに、Ａリッチな３’テイルは、二次構造を欠き、そしてまた、マイクロタイタープレートの表面に付着されたオリゴヌクレオチドによるポリ（ＣＵＧ）１０９の捕捉のための係留配列として機能する。結合アッセイの前に、転写物を８０℃で変性させ、そして、ポリ（ＣＵＧ）１０９の単一ヘアピン構造としての折り畳みを好む条件下で再生させる。
２５６．次に、溶液中でのＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）１０９結合のための最適な条件（イオン強度、一価カチオン、Ｍｇ＋＋および他の付加物、温度）を規定した。ニトロセルロースフィルタ結合アッセイによって決定したとき、試験した全ての型の組み換え型ＭＢＮＬ１（ＧＳＴが融合したもの、または、切断したもの、全長のもの、または、Ｃ末端疎水性領域の短縮型、４２ｋＤアイソフォームまたは４２ｋＤアイソフォーム）が、低いタンパク質濃度でポリ（ＣＵＧ）１０９に結合した（図３、Ｋｄ値 約１０ｎＭ）。このアッセイにおいて、標識したＲＮＡのニトロセルロースへの非特異的な結合は非常に低かった（最大のポジティブシグナルの０．２％より低い）。以下に記載するように、本明細書中には、図３における異なる形態の組み換え型ＭＢＮＬ１の結合活性を試験するために使用したものと同様の、非放射性マイクロタイタープレートフィルタ結合アッセイを含む方法が開示される。
２５７．また、本明細書中には、可溶性の放射標識したＭＢＮＬ１タンパク質を、マイクロタイタープレートの表面に係留されたポリ（ＣＵＧ）１０９と相互作用させることを含む方法も開示される。インビトロ転写されたポリ（ＣＵＧ）１０９への結合能およびバックグラウンド活性（標識したＭＢＮＬ１の非特異的結合）について、異なる市販のマイクロタイタープレートがある。プレートにポリ（ＣＵＧ）１０９を係留させるために、ポリ（ＣＵＧ）１０９転写物のＡリッチな３’末端に相補的で、プレートへの付着のために、５’においてビオチンまたは反応基のいずれかで標識された（図３Ｃにはビオチンの場合が示される）、「捕捉」オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を使用した。驚くべきことに、ストレプトアビジンでコーティングしたポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）は、捕捉オリゴヌクレオチドの直接的な共有結合による付着を可能にした反応性の表面化学を持つプレートよりも、ポリ（ＣＵＧ）１０９へのより高い結合能を有し、そして、ＭＢＮＬ１タンパク質のより低いバックグラウンド結合を示した。次に、結合部位を飽和させる捕捉ＯＤＮの濃度（１２．５ｐｍｏｌ／１００μｌ／ウェル）および捕捉ＯＤＮを飽和するポリ（ＣＵＧ）１０９の濃度（ウェルごとに５ｐｍｏｌを加え、０．５ｐｍｏｌが捕捉ＯＮＤに結合した）を決定した。さらに、タンパク質上の一級アミンとフルオレセイン−ＥＸ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）との結合によるＭＢＮＬ１タンパク質の蛍光標識のための条件を決定した。ゲルおよびマイクロプレートにおいて、標識したタンパク質について、検出限界と線形性の範囲を決定した（図２Ｂ）。組換え型ＭＢＮＬ１とポリ（ＣＵＧ）１０９との相互作用をゲルシフトアッセイにより調べ、ＭＢＮＬ１の転写物に対する割合の増加が、１つの転写物ごとの多くのタンパク質分子の結合に起因して、高分子量複合体の形成をもたらすという予言を確実なものとした（図４、上パネル）。最後に、蛍光標識したＭＢＮＬ１の、プレート上に係留させたポリ（ＣＵＧ）１０９転写物への結合の効率を決定し（図４、下パネル）、これは、６．２５ｎＭ程度の低いＭＢＮＬ１濃度に対して感受性であり、そして、５０倍のダイナミックレンジを示した。
ａ）フィルタ保持アッセイ
２５８．このアッセイの２つの構成成分である、蛍光標識したポリ（ＣＵＧ）１０９（図２Ｂ）および組み換え型のＭＢＮＬ１（図２Ａ）を現像し、そして、ＭＢＮＬ１のポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐへの結合のための最適な条件（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ Ｍｇ＋＋、０．１ｍＭ ＤＴＴ）を規定した（予備的研究を参照のこと）。ニトロセルロースフィルタを用いて、パイロット結合アッセイを行った（図３Ａ）。次に、これらの同じ試薬および条件を用いて、市販のフィルタプレートを試験した。ＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎＨＴＳニトロセルロースフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）が、これまでに、同様の目的のために使用されている（Ｂｉｔｔｋｅｒ ＪＡ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２；２０（１０）：１０２４−１０２９）。このプレートは、ハイスループットスクリーニングにおいて自動で取り扱われるために設計されたもので、図３Ａにおけるフィルタ結合アッセイと同様のタンパク質結合特性を有するようである。
ｂ）ＲＮＡ付着アッセイ
２５９．ＭＢＮＬ１−ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐ相互作用のインヒビターのための代替的なアッセイは、マイクロタイタープレートへと非標識ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐを係留させ、そして、ＲＮＡ結合に起因してプレート上に保持される蛍光標識したＭＢＮＬ１の量を測定することを必要とする（図３Ｃ）。ポリ（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡの合成および係留の方法は、予備的研究において記載し、そして、図３Ｃに図式化される。精製した組み換え型ＭＢＮＬ１の蛍光標識の結果を、図２Ｂに示す。標識のための結合効率は、ＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒタンパク質標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いると、ＧＳＴ−ＭＢＮＬ１ １分子につき約２〜６の蛍光色素、であった。これらのアッセイには、ＧＳＴ−ＭＢＮＬ１を使用する。なぜならば、ＧＳＴ融合パートナーの存在は、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐに対するＭＢＮＬ１の親和性に影響を及ぼさないようであり（図３Ａ）、そして、ＭＢＮＬ１の質量の増加は、ＲＮＡ結合部位における蛍光色素付着のより低い危険性を伴って、より高い蛍光活性を可能にするからである。本明細書中に記載するように、ストレプトアビジンでコーティングしたポリスチレンマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）は、ポリ（ＣＵＧ）１０９への最高の結合能と、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐの非存在下でのＭＢＮＬ１結合の最低のバックグラウンドとを提供するものとして特筆された。これらのアッセイのための材料の要件は、蓋然性が高い。１０〜１００ｎＭの濃度のＭＢＮＬ１が適切である（レーン４〜６、図４、下パネル）。各ウェルにつき１００μｌの場合、これらの濃度では、少なくとも２０００ウェルに１ｍｇのタンパク質で十分である。フィルタ結合アッセイを上回る、ＲＮＡ付着アッセイの潜在的な利点は、インヒビターへのより高い感受性である。なぜならば、ＲＮＡ付着アッセイは、ポリ（ＣＵＧ）１０９からのＭＢＮＬ１の置き換えの多様な程度を検出するとしても、フィルタ上での保持を誘導するには、ポリ（ＣＵＧ）１０９に結合した残留ＭＢＮＬ１分子はただ１つで十分であるからである。潜在的な不利益は、ウェルの吸入を含むより多くの液体を取り扱う工程を必要とする点であり、これは、このアッセイを、ハイスループットまでスケールアップできないワークステーションの手順に留まらせ得る。
２６０．本明細書中に開示されるように、ポリ（ＣＵＧ）ｅｘｐは、その高い安定性の二次構造に起因して、リボヌクレアーゼの切断に対しかなりの抵抗性を示す（Ｔｉａｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｒｎａ ２０００；６：７９−８７）。しかし、フィルタ結合アッセイにおいて蛍光標識を含み、そして、プレート付着アッセイにおいては係留を媒介するポリ（ＣＵＧ）１０１９転写物のＡリッチな３’末端は、この様式においては保護されない。このテイルの配列は、ＲＮＡｓｅに対する感受性を与えるジヌクレオチドの組み合わせを避けるように特別に設計されている。フィルタ結合アッセイに、相補的なモルホリノを加えること、または、プレート付着アッセイにおいて「捕捉」オリゴヌクレオチドとしてモルホリノを使用すること、によって、さらなる保護が達成される。無関係で、定まった形のないＲＮＡを試験バッファに加え、そして、短いインキュベーション時間を採用することで、ＲＮＡｓｅ活性をさらに低くする。
９．実施例９：ＣｌＣ−１スプライシングの矯正は、筋ジストロフィのマウスモデルにおいて塩素イオンチャネル疾患およびミオトニーを排除する
２６１．最も一般的な成人が罹患する筋ジストロフィである１型ＤＭ（ＤＭ１）は、ＤＭプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）をコードする遺伝子の３’非翻訳領域におけるＣＴＧ繰り返しの拡張によって引き起こされる（Ｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：７９９−８０８）。証拠が、ＤＭ１は、ＤＭＰＫ蛋白質の異常発現によって引き起こされるのではなく、拡張されたＣＵＧ繰り返し（ＣＵＧｅｘｐ）を含む変異ＤＭＰＫ転写物による毒性獲得機能が関与することを示唆している（Ｏｓｂｏｒｎｅ，ＲＪ．，ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，ＣＡ．（２００６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ
１５ Ｓｐｅｃ Ｎｏ ２：Ｒ１６２−１６９）。ＣＵＧｅｘｐ区画を含む転写物は、選択的スプライシングの調節異常またはスプライス異常を誘発する（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：７３７−７４１）。プレｍＲＮＡの特定の群に選択的に影響を及ぼすスプライシングの欠陥は、マッスルブラインド（ＭＢＮＬ）ファミリーにおけるスプライシング因子の活性の低下（Ｋａｎａｄｉａ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：１９７８−１９８０）、ＣＵＧ結合タンパク質１のレベルの上昇（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：７３７−７４１；Ｃｈａｒｌｅｔ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：４５−５３）、またはこれらの両方からの結果と考えられる。ＭＢＮＬタンパク質の活性の低下は、ＣＵＧｅｘｐＲＮＡの核病巣におけるこれらのタンパク質の壊死素分離に寄与し得る（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｅｍｂｏ Ｊ １９：４４３９−４４４８；Ｌｉｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １５：２０８７−２０９７）。
２６２．ＣＵＧｅｘｐＲＮＡを発現するトランスジェニックマウスが、ＤＭ１において観察されるものと同様の、ミオトニーおよび塩素イオンチャネル１（ＣｌＣ−１）のスプライシング欠陥を示したことが本明細書中に開示される（Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：３５−４４）。ＨＳＡＬＲモデルにおけるミオトニーは、ＣｌＣ−１ ｍＲＮＡにおけるエキソン７ａの異常な包含から生じるもので、これは、筋線維におけるエキソン７ａスプライシングの抑制に必要とされる因子であるＭＢＮＬ１の壊死巣分離に起因するものである（Ｋａｎａｄｉａ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：１９７８−１９８０）。この機構は、いくつかのラインの事実によって支持される：（１）エキソン７ａの包含は、ＣｌＣ−１ ｍＲＮＡにおけるフレームシフトと、未熟な終止コドンの導入を引き起こす（Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：３５−４４；Ｃｈａｒｌｅｔ，Ｂ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：４５−５３）；（２）エキソン７ａ＋アイソフォームによりコードされる短縮型ＣｌＣ−１タンパク質は、チャネル活性を持たない（Ｂｅｒｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６３：２３７１−２３７５）；そして（３）マウスにおけるＭｂｎｌ１の破壊は、ＣｌＣ−１エキソン７ａ包含およびミオトニーに増加につながる（Ｋａｎａｄｉａ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：１９７８−１９８０）。ＤＭ１におけるミオトニーが、ＣｌＣ−１の欠失から生じるという仮説は、ＤＭ１のマウスモデルが筋肉の塩素コンダクタンスの７０〜８０％の低下を示す（Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：３５−４４；Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９−９４）という観察を、ＣｌＣ−１コンダクタンスの７５％の低下が、筋線維における筋緊張性の放電を引き起こすのに十分である（Ｆｕｒｍａｎ，Ｒ．Ｅ．，およびＢａｒｃｈｉ，Ｒ．Ｌ．（１９７８）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ４：３５７−３６５）というこれまでの評価と組み合わせたものに基づいている。しかし、ＣｌＣ−１のダウンレーションの機構およびＤＭ１におけるミオトニーに対するその要件は、議論の余地がある。ナトリウムチャネルまたはカリウムチャネルに対する作用もまた、ＤＭ１に伴うミオトニーにおいて関与している（Ｆｒａｎｋｅ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４２５：３９１−４０５；Ｒｅｎａｕｄ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９：６７８−６８０；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １７：１２６４−１２７０）。さらに、ＤＭ１における塩素イオンチャネル疾患は、異常なスプライシングではなく、ＣｌＣ−１転写のダウンレギュレーションから生じるという事実が報告されている（Ｅｂｒａｌｉｄｚｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０３：３８３−３８７）。ＣｌＣ−１の選択的なスプライシングと、塩素イオンチャネル疾患と、ＤＭ１におけるミオトニーとの間の因果関係を提供するために、モルホリノＡＯＮを用いて、エキソン７ａの包含を選択的に抑制した。
ａ）結果
２６３．エキソン７ａの包含を抑制するためのストラテジーを図２３Ａに図示する。モルホリノＡＯＮは、ＣｌＣ−１プレｍＲＮＡにおけるエキソン７ａの３’または５’スプライス部位に相補的であった（図２３Ｂ）。組織の取り込みを調べるために、カルボキシフルオレセイン標識したモルホリノをＨＳＡＬＲマウスの前脛骨（ＴＡ）筋に注射した。組織切片の検査は、アンチセンスモルホリノの取り込みが針の軌道に限定されることを示した。ＡＯＮの取り込みおよび分布を改善するために、ＡＯＮ注射後に、電圧パルスを用いて筋線維を電気穿孔した。これにより、ＴＡ筋全体でのアンチセンスモルホリノの取り込みがもたらされた（図２４Ａ〜Ｃ）。特筆すべきは、ＡＯＮは、核および細胞質の両方に存在していたが、核に優先的に蓄積しているようであった（図２４Ａ、Ｅ）。
２６４．ＨＳＡＬＲマウスにおけるスプライシングに対するモルホリノの作用を決定するため、ＡＯＮ注射後にＴＡ筋から総ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲによるＣｌＣ−１スプライシングの解析は、アンチセンスモルホリノが、エキソン７ａの包含を抑制する意図された作用を有する一方で、逆方向の配列を持つコントロールモルホリノは、対側のＴＡにおけるＣｌＣ−１スプライシングに対し作用しなかったことを示した（図２５Ａ、Ｄ）。３’スプライス部位を標的とするＡＯＮ、または、３’スプライス部位を標的とするＡＯＮおよび５’のスプライス部位を標的とするＡＯＮの同時注射は、５’スプライス部位のみを標的とするものよりも有効であった（図２８）。モルホリノＡＯＮの単回の注射後に、エキソン７ａの有効かつ持続的なスキップが達成された。エキソン７ａの包含は、単回の注射から少なくとも３週間後まで、野生型（ＷＴ）レベルまで抑制され（図２５Ａ、Ｄ）、そして、エキソン７ａの部分的な除外が、８週間後もなお明らかであった（図２５Ｂ、Ｅ）。特筆すべきことに、アンチセンスモルホリノは、ＣＵＧｅｘｐＲＮＡおよびＭＢＮＬ１タンパク質を含む核病巣の形成に影響を与えず（図２９）、そればかりか、Ｔｉｔｉｎ（図２５Ｃ）、ＺＡＳＰまたはＳｅｒｃａｌ（Ｌｉｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １５：２０８７−２０９７）のようなＤＭ１において誤調節されている他の遺伝子の選択的スプライシングも矯正しない。これらのデータは、モルホリノＡＯＮが、ＤＭに関連するスプライス異常またはＭＢＮＬ１壊死巣分離の全般的な逆転をもたらすのではなく、ＣｌＣ−１スプライシング欠陥を特異的に矯正することを示す。
２６５．モルホリノＡＯＮは、その標的ＲＮＡの分解を誘導することなくスプライシングの結果に影響を与える（Ｍｅｒｃａｔａｎｔｅ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ １ ：２１１−２３０）。したがって、エキソン７ａ包含の抑制の予測される影響は、ＣｌＣ−１ ｍＲＮＡにおける未熟な終止コドンを排除すること、そして、それによって、ナンセンス媒介性の崩壊経路を介したその分解を減少させることであった（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９２：Ｃ１２９１−１２９７）。この予測と一致して、アンチセンスモルホリノを用いた処置は、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより決定するとき、ＣｌＣ−１ ｍＲＮＡのレベルの増加をもたらしたが、逆方向配列を持つコントロールモルホリノはもたらさなかった（図２５Ｆ）。これらの結果は、ＣｌＣ−１発現に対するＣＵＧｅｘｐＲＮＡの作用が、主として、転写後レベルにおけるものであることを示す。さらに、モルホリノＡＯＮを用いた処置は、Ｃ末端に対して指向される抗体を用いた免疫蛍光法により示されるように、筋細胞膜におけるＣｌＣ−１タンパク質のレベルを増加させた（図２４Ｆ、Ｇ）。
２６６．本明細書中では、単一の短趾屈筋（ＦＤＢ）線維の全細胞パッチクランプ解析を、未処置のＨＳＡＬＲマウスのＦＤＢ線維において、ＣｌＣ−１電流密度が低下され、そして、チャネルの非活性化が加速されることを示すために使用した（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９−９４）。したがって、ＣｌＣ−１チャネル機能に対するＡＯＮ処置の作用が決定された。１０〜１２日齢の野生型およびＨＳＡＬＲのマウスの後肢フットパッドに、カルボキシフルオレセイン標識したアンチセンスまたは逆方向のモルホリノを注射／電子穿孔した。注射から３〜５日後に、パッチクランプ解析を行い、この時点で、線維は、有効な電圧クランプを維持するのに十分な小ささだった（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９−９４）。個々のＦＤＢ線維を単離し、そして、緑色蛍光を示す線維において、肉眼的にＣｌＣ−１チャネル活性を測定した（図２４Ｄ、Ｅ）。モルホリノＡＯＮ注射の３日後には早くも、ＣｌＣ−１電流密度（図２６Ａ、Ｂ）および非活性化の動力学（図２６Ｄ）が野生型の値にレスキューしたが、逆方向のモルホリノで処置した線維では電流密度も非活性化動力学も、未処置のＨＳＡＬＲ線維のものとは異なった。野生型およびＡＯＮ処置線維で観察されたチャネルの非活性化のより遅い速度は、おそらく、チャネル通門に対する電流依存的な作用に起因するものではない。なぜなら、プレパルスでの野生型におけるＣｌＣ−１電流の大きさの半分への減少は、チャネル非活性化の動力学を有意には変化させないからである（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９−９４）。ＣｌＣ−１活性のレスキューは、チャネル活性化におけるシフトに起因するものではなかった。なぜなら、相対的なチャネル開放確率（Ｐｏ）の電圧依存性は、アンチセンスおよび逆方向を注射したＨＳＡＬＲおよび野生型の線維の間で、異ならなかったからである（図２６Ｃ）。これらの結果は、ＣｌＣ−１スプライス異常のモルホリノＡＯＮによるレスキューが、正常なＣｌＣ−１電流密度およびチャネル非活性化の動力学を完全に再生するのに十分であることを示す。
２６７．インビボでの筋の生理学に対するエキソン７ａ包含抑制の作用を決定した。盲検試験者による筋電図検査（ＥＭＧ）解析は、ミオトニーが、アンチセンスモルホリノの注射後にＨＳＡＬＲマウスのＴＡ筋において顕著に減少したかまたは存在しなかったのに対し、逆方向のものを注射した対側のＴＡにおけるミオトニーは、注射していない筋肉のものと異ならなかったことを明らかにした（図２６Ｅ、Ｆ）。ミオトニーの減少は、３週および８週の時点でのエキソン７ａのスキップの程度と相関しており、アンチセンスモルホリノの単回注射が、ミオトニーの持続性の減少を提供したことを示す。
２６８．マウスにおけるＭｂｎｌ１ エキソン３のホモ接合性の欠失（Ｍｂｎｌ１ΔＥ３／ΔＥ３）は、筋肉からのＭｂｎｌ１タンパク質の喪失と、ＤＭ１患者およびＨＳＡＬＲマウスと同様のスプライス異常、ＣｌＣ−１発現および活性の減少、ならびに、ミオトニーをもたらした（Ｋａｎａｄｉａ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：１９７８−１９８０；Ｌｉｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １５：２０８７−２０９７；Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９−９４）。このモデルにおけるＡＯＮの作用を調べるために、アンチセンスモルホリノまたは逆方向コントロールを、Ｍｂｎｌ１ΔＥ３／ΔＥ３マウスのＴＡ筋に注射した。ＨＳＡＬＲトランスジェニックモデルの場合と同様に、アンチセンスモルホリノは、エキソン７ａの包含を抑制し（図２７Ａ、Ｂ）、筋細胞膜におけるＣｌＣ−１タンパク質の発現を増加させ（図２７Ｃ、Ｄ）、そして、Ｍｂｎｌ１ΔＥ３／ΔＥ３マウスにおけるミオトニーを減少させた（図２７Ｅ）。したがって、ＤＭにおけるスプライス異常の病理は糖尿病の主題であるが、アンチセンスモルホリノによるミオトニーのレスキューは、ＣｌＣ−１のスプライシング欠陥が生成されるのと全く同じ様式には依存しない。
ｂ）考察
２６９．ＤＭ１の病理の現在のモデルは、拡張されたＣＵＧ繰り返しを含むＤＭＰＫ ｍＲＮＡが、スプライシング因子の機能を変化させ、そして、特定の群のプレｍＲＮＡについての選択的スプライシングの調節不全をもたらすことであると仮定する（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ａ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：７３７−７４１）。使用上の観点から、このモデルに伴う１つの難点は、選択的スプライスアイソフォーム間の機能的な相違、または、２つの選択的スプライス生成物の比を変えることの生物学的な結果を決定することが容易ではないことである。さらに、数十〜数百の転写物がこうしてスプライシングに影響を受けたことを考慮すると、任意の特定のスプライシング変化の表現型の結果を確認することは困難であり得る。本研究の重要な知見は、ＣｌＣ−１の選択的スプライシングの誤調節が、ＨＳＡＬＲマウスおよびＭｂｎｌ１ΔＥ３／ΔＥ３マウスの両方において、ＤＭ１の基本的な症状であるミオトニーの発症に必須であること、である。これらの結果は、ＣＵＧｅｘｐ誘導性のスプライス異常がＤＭ１の臨床的特徴を生じることに直接的に関与しているという、今日までで最もはっきりとした徴候を提供する。さらに、これらの結果は、任意の特定のスプライシング変化の機能的な重要性を分析するためのアプローチを示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＭ１細胞において特定のスプライシング欠陥を矯正するため、または、野生型細胞においてＤＭ１様の作用を誘導するために使用され得る。
２７０．ミオトニーは、ＤＭ１が最も頻繁に認識される症状であり、そして、手および前腕の筋肉における優先的な関与に起因して、手の器用さを損ね、肉体的欠陥の一因となる。ＤＭ１細胞およびモデル系において観察される異常なカルシウムホメオスタシス（Ｂｅｎｄｅｒｓ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００：１４４０−１４４７；Ｂｅｎｄｅｒｓ，Ａ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｓｃａｎｄ １５６：３５５−３６７）、ならびに、筋小胞体のＳＥＲＣＡ１カルシウム再取り込みポンプの選択的スプライシングに対するＤＭ１の作用（Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １４：２１８９−２２００；Ｌｉｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １５：２０８７−２０９７）を鑑みると、筋緊張性の放電に起因した過剰なカルシウム放出は、ＤＭ１筋線維の変質を悪化させるようでもある。これまでの研究は、ＤＭ１におけるナトリウムチャネルまたはカルシウム活性型カリウムチャネルの関与を示していたが（Ｆｒａｎｋｅ，Ｃ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ４２５：３９１−４０５；Ｒｅｎａｕｄ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９：６７８−６８０；Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｍ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ １７：１２６４−１２７０）、本研究の第二の知見は、ＤＭ１に関連するミオトニーは、主として塩素イオンチャネル疾患からの結果であるということの確認である。
２７１．ＨＳＡＬＲマウスおよびＭｂｎｌ１ΔＥ３／ΔＥ３マウスの両方において、筋細胞膜における機能的ＣｌＣ−１チャネルの数が顕著に減少し、チャネルの非活性化の割合が増加し、そして、最大ＣｌＣ−１チャネル開放率が低下した（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９−９４）。チャネル非活性化において観察される加速、および最大チャネル開放率の低下は、これまでに報告された、エキソン７ａによりコードされるタンパク質産物によって与えられるドミナントネガティブな作用と一致している（Ｂｅｒｇ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ６３：２３７１−２３７５）。ＨＳＡＬＲ筋におけるＡＯＮの電子穿孔がエキソン７ａを含む転写物のレベルを低下させ（図２５Ｄ、Ｅ）、全長ＣｌＣ−１転写物を増加させ（図２５Ｆ）、そして、ＣｌＣ−１電流密度（図２６Ｂ）および非活性化通門（図２６Ｄ）を完全に正常にしたという観察は、ＤＭ１における塩素イオンチャネル疾患が、トランスドミナントなＲＮＡベースの機構とタンパク質ベースの機構の複雑な組み合わせを必要とするという主張を支持する。
２７２．ＡＯＮは、プレｍＲＮＡにアニーリングし、そして、スプライシング因子のスプライス部位またはシス作用性の調節性エレメントへのアクセスをブロックすることによって、ＲＮＡのプロセシングに影響を与える（Ｄｏｍｉｎｓｋｉ，Ｚ．，ａｎｄ ＫｏＩｅ，Ｒ．（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：８６７３−８６７７）。構成的にスプライスを受けるエキソンのスキップを誘導するＡＯＮは、ジストロフィンのｍＲＮＡにおいて、終止コドンを迂回するか、または、適切なリーディングフレームを再生するために使用されている（Ｄｕｎｃｋｌｅｙ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ７：１０８３−１０９０；Ｗｉｌｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ Ｄｉｓｏｒｄ ９：３３０−３３８；Ａｌｔｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ Ｍｅｄ １２：１７５−１７７）。エキソン７ａは、ＡＯＮに対して増大した感受性を示し得る。なぜなら、選択的なエキソンにおけるスプライシングシグナルは本質的に弱い傾向があり、そして、このエキソンは、通常、ある割合のＣｌＣ−１転写物において通常スキップされるからである（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９２：Ｃ１２９１−１２９７）。しかし、エキソン７ａを包含するＣｌＣ−１ ｍＲＮＡは、未熟な終止コドンを含み、そして、迅速な分解を受ける（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９２：Ｃ１２９１−１２９７）。したがって、これらのスプライシング生成物は安定な状態では過小表示され、そして、ＡＯＮ誘導性のエキソンスキップの真の効果は決定されなかった。この制限にもかかわらず、処置された筋線維における、エキソン７ａ＋アイソフォームの野生型レベルへの減少、および、ＣｌＣ−１チャネル活性の正常化は、この介入が、非常に有効であり、そして驚くほど持続性であることを示す。
２７３．これらの結果は、ＤＭ１の症状が、選択的スプライシングの正常なパターンを再生するための標的化された非遺伝子治療的アプローチを用いて逆転可能であることを示す、最初のものである。抗ミオトニー特性を持ついくつかの薬物が現在利用可能であるが、これらは、症状の部分的な軽減を提供するだけであり、そして、その効能および安全性を支持する管理された治験がないことから、ＤＭ１におけるその使用は制限されている（Ｔｒｉｐ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２００６） Ｃｏｃｈｒａｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔ Ｒｅｖ：ＣＤ００４７６２）。本明細書中の結果は、ＣｌＣ−１スプライシング欠陥を標的とすることは、ＤＭ１におけるミオトニーの処置に大いに有効であることを示す。
ｃ）方法
（１）オリゴヌクレオチドの設計
２７４．モルホリノオリゴヌクレオチド（Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ ＬＬＣ）は、ＣｌＣ−１ ３’スプライス部位を標的とする５’−ＣＣＡＧＧＣＡＣＧＧＴｃｔｇｃａａｃａｇａｇａａｇ−３’（配列番号４）、５’−ｇａａｇａｇａｃａａｃｇｔｃｔｇｇｃａｃｇｇａｃｃ−３’（配列番号５）の逆方向コントロール、およびＣｌＣ−１ ５’スプライス部位を標的とする５’−ｇｇａａｇｔｇａａａｃｔｔｇｃＣＴＣＣＡＴＣＡＧＧ−３’（配列番号６）であった。
（２）モルホリノの注射
２７５．ＨＳＡｌＲマウス（Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６９−１７７３）またはＭｂｎｌ１ＡＥ３／ＡＥ３マウス（Ｋａｎａｄｉａ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：１９７８−１９８０）を、１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および３ｍｇ／ｋｇアセプロマジンを腹腔内注射することにより麻酔した。ＴＡ筋を、ウシヒアルロニダーゼ（１５μｌ、０．４Ｕ／μｌ）（Ｓｉｇｍａ）の筋肉内注射により前処理した（ＭｃＭａｈｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：１２６４−１２７０）。２時間後、合計２０μｌ容量のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０μｇまたは２０μｇのモルホリノを、３０ゲージ針を用いて注射した。次いで、筋肉の長軸に対して並行に置いた電極を用いて、ＴＡ筋を電気穿孔した。電気穿孔パラメーターは、１００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚでの１０回のパルス、そして、各パルスごとに２０ｍｓの持続期間であった。アンチセンスモルホリノまたは逆方向配列を持つコントロールモルホリノを、反対側の肢のＴＡ筋に注射した。アンチセンスモルホリノを与えるＴＡの決定は無作為化し、そして、ＥＭＧ解析が終了するまでは、調査する人に、この割り当てを伏せたままにした。他の解析は、伏せることなく行った。注射したオリゴの分布を決定する実験のために、アンチセンスモルホリノを、カルボキシフルオレセインで標識し、そして、４％パラホルムアルデヒド中での固定を行ってか、または固定なしに、蛍光顕微鏡により、筋肉の凍結切片（１０μＭ）を調べた。いくつかの切片は、ＴＲＩＴＣ−小麦麦芽アグルチニン（Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２３：４３３１−４３４３）（ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で同時に標識して、筋線維の表面の膜および核を染色した。
（３）ＲＮＡの解析
２７６．モルホリノ注射から３週間または８週間後にマウスを屠殺した。ＴＡ筋を取り出し、液体窒素中で凍結した。ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて総ＲＮＡを単離した。以前に記載されたようにして（Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：３５−４４）、オリゴｄＴを用いてｃＤＮＡ合成を開始した。ＣｌＣ−１およびＴｉｔｉｎの選択的スプライシングについてのアッセイは、先に記載されたとおりであった（Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：３５−４４；Ｌｉｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １５：２０８７−２０９７）。プライマーの配列は、以下のとおりであった：
２７７．
ＣｌＣ−１フォワード：ＣｌＣｍ−７ ５’−ＴＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＣＴＣＡＣＡＣＴＣＡＡＧＧ−３’（配列番号７）およびリバース：ＣｌＣｍ−３０ ５’−ＣＡＣＧＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧ−３’（配列番号８）；ｍＴｉｔｉｎフォワード：ｍＴＴＮ１ ５’−ＧＴＧＴＧＡＧＴＣＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧ−３’（配列番号９）およびリバース：ｍＴＴＮ２ ５’−ＣＣＡＣＣＡＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＡＴＴＴＣ−３’（配列番号１０）。
２７８．ＲＴ−ＰＣＲ生成物（２２サイクル）をアガロースゲル上で分離し、ＳＹＢＲグリーンＩＩで染色し、そして、レーザフルオルイメージャ（ｆｌｕｏｒｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で走査した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いてバンドの強度を定量した。ＣｌＣ−１ ｍＲＮＡの総レベルを、ハウスキーピング遺伝子であるＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写因子ＩＩＢに対して、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により決定した。
（４）免疫蛍光
２７９．ＴＡ筋の凍結横断切片（１０μＭ）を、先に記載されたようにして（Ｋａｎａｄｉａ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０３：１１７４８−１１７５３）、アフィニティ精製したウサギポリクローナル抗ＣｌＣ−１抗体（１：５０；Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で染色した。ＣｌＣ−１ヌルマウスおよび野生型ＦＶＢマウスからの筋切片を、各スライド上でネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとした。０．２５μＭごとに分けた８つの画像からなるＺ平面のスタックを記録し、Ａｕｔｏｑｕａｎｔ ｖ９．３ソフトウェア（Ａｕｔｏｑｕａｎｔ Ｉｍａｇｉｎｇ）を用いて解析した。Ｍｅｔａｖｕｅソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＭａｘｉｍｕｍ−ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎの像を得た。露光時間および閾値は、アンチセンス 対 逆方向のコントロールの全ての比較で同一であった。
（５）ＣｌＣ−１電流の肉眼的記録
２８０．アンチセンスモルホリノまたは逆方向モルホリノのＦＤＢ線維への送達は、後肢フットパッドの注射および電気穿孔により行った。簡単に述べると、１２〜１４日齢のＨＳＡＬＲマウスを、１００ｍｇ／ｋｇケタミン、１０ｍｇ／ｋｇキシラジン、および３ｍｇ／ｋｇアセプロマジンの腹腔内注射により麻酔した。次いで、後肢フットパッドに、ウシヒアルロニダーゼを注射し、その１時間後に、２０μｇ（１０μｌ、ＰＢＳ中２μｇ／μｌ）のアンチセンスまたは逆方向のカルボキシフルオレセイン標識したモルホリノを注射した。注射直後のフットパッドの電気穿孔（１００Ｖ／ｃｍ、１Ｈｚで２０回のパルス、および各パルスにつき２０ｍｓ）により、モルホリノの取り込みを促進した（ＤｉＦｒａｎｃｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ４７：２８１−２８８）。注射／電気穿孔の３〜５日後、先に記載されたようにして個々のＦＤＢ筋線維を単離した（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９−９４）。４０倍（１．４ ＮＡ）の対物レンズおよびＴＩＬＬ ＩＭＡＧＯ ＱＥ冷却型ＣＣＤカメラを用いて、単一のＦＤＢ線維の明視野および蛍光（４８８ｎｍ励起）の像を得た。はっきりとした横紋、きれいな表面および緑色蛍光を示す線維だけを、電気生理学的記録のために選択した。ＣｌＣ−１電流を測定し、そして、どこかに詳細に記載されるアプローチと同一のアプローチ（Ｌｕｅｃｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎ Ｐｈｙｓｉｏｌ １２９：７９−９４）を用いて、全細胞パッチクランプ実験（Ｈａｍｉｌｌ，Ｏ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ３９１：８５−１００）において解析した。異なるサイズの線維にわたるデータを比較するために、ＣｌＣ−１電流密度（ｐＡ／ｐＦ）を計算した。
（６）筋電図検査法（ＥＭＧ）
２８１．先に記載されたようにして（Ｋａｎａｄｉａ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：１９７８−１９８０）、ＥＭＧを全身麻酔下で行った。ＨＳＡＬＲマウスおよびＭｂｎｌ１ΔＥ３／ΔＥ３マウスにおけるミオトニーの、像および筋電図検査法によるビデオ記録が、これまでの報告に示される（Ｋａｎａｄｉａ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０２：１９７８−１９８０；Ｍａｎｋｏｄｉ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６９−１７７３）。試験した各筋肉について、最低でも１５回の針の挿入を行った。筋緊張性の放電を、４点のスケールでグレード分けした：０、ミオトニーなし；１、針挿入の５０％未満における偶発的な筋緊張性の放電；２、針挿入の５０％より多くでの筋緊張性の放電；３、ほぼ挿入ごとの筋緊張性の放電。
（７）統計的解析
２８２．群のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される図２６におけるパッチクランプのデータを除いて、平均±ｓ．ｄ．として表す。群間の比較は、示されるように、両側ｔ−検定または二元配置ＡＮＯＶＡにより行った。
１０．実施例１０：ＣＡＧ繰り返しから構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーを用いたタンパク質置き換え治療
２８３．これまでに、拡張されたＣＵＧ繰り返しのＲＮＡが安定なヘアピン構造を形成することが示されていた（Ｔｉａｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ２０００；６：７９−８７）。図３０Ａは、２〜５回の範囲の長さのＣＡＧ繰り返しのＰＮＡ−ＣＡＧ繰り返しオリゴが、（ＣＵＧ）１０９ヘアピンに入り込み、そして、インビトロにおいて、拡張されたＣＵＧ繰り返しへパイン構造と効率的に相互作用することを示す。図３０Ｂは、これらのＰＮＡ−ＣＵＧオリゴがまた、インビトロでの（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡのＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を阻害し得ることを示す。図３０Ａは、レーザフルオルイメージャで走査した非変性ポリアクリルアミドゲルによって行われたもので、フルオレセイン標識した（ＣＵＧ）１０９転写物（１０ｎＭ）の移動を示す。この転写物を、異なる長さのＣＡＧ繰り返し配列（ＰＮＡ−ＣＡＧ−６，Ｎｔｅｒｍ−ＣＡＧＣＡＧ；ＰＮＡ−ＣＡＧ−９，Ｎｔｅｒｍ−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧ；ＰＮＡ−ＣＡＧ−１２，Ｎｔｅｒｍ−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ（配列番号１４）；またはＰＮＡ−ＣＡＧ−１５，Ｎｔｅｒｍ−ＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧ）（配列番号１５））を含む種々の濃度（８μＭ、４μＭ、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ）のＰＮＡと３０分間インキュベートした。図３０Ｂは、５つのＰＮＡ濃度（４μＭ、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．２５μＭ）と、組換え型ＭＢＮＬ１（２００ｎＭ）とのさらなる３０分間のインキュベーション工程の後のものを含むバリエーションを提供する。各パネルのレーン「Ｃ」は、ＰＮＡまたはＭＢＮＬ１なしのフルオレセイン標識した（ＣＵＧ）転写物の移動を示すコントロールである。この転写物の急速な移動は、ヘアピン形成により引き起こされる。パネル「Ａ」は、ＣＡＧ繰り返しのＰＮＡが（ＣＵＧ）１０９転写物と相互作用して、そのゲル上での移動を遅らせ得ることを示す。パネル「Ｂ」のレーン「Ｃ＋」は、ＰＮＡなしの（ＣＵＧ）１０９転写物およびＭＢＮＬ１タンパク質を含むコントロールを示す。これらのレーンは、不均一な高分子量ＲＮＡ−タンパク質複合体の形成に起因して、（ＣＵＧ）１０９転写物の拡がったスメアを示す。ＰＮＡを加えることで、拡張されたＣＵＧ繰り返しＲＮＡからＭＢＮＬ１タンパク質が置き換えられ、これらの複合体を破壊し、そして、（ＣＵＧ）１０９転写物のくっきりとしたバンドを再構成する。したがって、本明細書中には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、筋ジストロフィにおけるタンパク質置き換え治療としての使用が開示される。筋ジストロフィは、処置に対して極めて感受性にする独特の疾患プロセスを有することが本明細書中に開示される：ある群のタンパク質、マッスルブラインド（ＭＢＮＬ）タンパク質の機能は、このタンパク質が、ＣＵＧ繰り返しを含む変異ＲＮＡ上に固定される（すなわち、タンパク質が分離される）ことにより損なわれる。本明細書中に開示されるこれ以前の実施例は、モルホリノ化学を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド：ＣＡＧ２５の使用に関するものであった。この実施例では、同じ配列（ＣＵＧ繰り返しに対してアンチセンスのＣＡＧ繰り返し）を持つが、異なる化学、すなわちペプチド核酸（ＰＮＡ）を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた有効であることが実証された。
１１．実施例１１：ＰＮＡ−ＣＡＧを用いたＤＭのマウスモデルのインビボ処置
２８４．図３５は、ＣＡＧ繰り返しから構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）の注射が、筋ジストロフィのＨＳＡＬＲトランスジェニックマウスモデルにおいて、筋電図検査法によるミオトニーの減少を引き起こしたことを示す。ＰＮＡ−（ＣＡＧ）６マーまたはＰＮＡ−（ＣＡＧ）９マー（すなわち、２回もしくは３回のＣＡＧ繰り返し）を、単回で前脛骨筋に注射した。筋肉内注射から３週間後に、ミオトニーを筋電図検査法により評価した。コントロールとして、ビヒクルのみ（リン酸緩衝化生理食塩水）を対側の肢の前脛骨筋に注射した。全てのマウスは、処置前、強い活動ミオトニーを有した。どちらの肢にＰＮＡ 対 コントロールを与えたかの割り当てについては、無作為化し、そして、この割り当てを伏せたまま、ＥＭＧ解析を行った。
１２．実施例１２：ＭＢＮＬ１タンパク質とＣＵＧ拡張ＲＮＡとの相互作用を阻害する化合物についてのスクリーニング：蛍光異方性アッセイは、インビトロでのＣＵＧ拡張ＲＮＡと組み換え型ＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を示す
２８５．フルオレセイン標識した（ＣＵＧ）３６ＲＮＡ（２ｎＭ）をＭＢＮＬ１タンパク質（１００ｎＭ）と共にインキュベートし、そして、１〜９０分の範囲の時点で異方性を測定した。蛍光異方性の値の増加は、フルオレセイン標識した（ＣＵＧ）３６転写物のＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を示す。値は、４回の実験からの平均であり、エラーバーはＳＤを示す。
１３．実施例１３：ＣＵＧ繰り返しＲＮＡと組み合え型ＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を阻害する化合物についてスクリーニングするための蛍光異方性アッセイ
２８６．ＭＢＮＬ１タンパク質は、安定な二次構造（ヘアピン構造）を形成するＣＵＧ繰り返しＲＮＡと結合することが知られる。アミノグリコシド系抗生物質がＭＢＮＬ１タンパク質のＣＵＧ繰り返しＲＮＡとの相互作用を阻害し得るかどうかを決定するために、アミノグリコシド系抗生物質を調べた。アミノグリコシドは構造化したＲＮＡと結合することが知られるので、アミノグリコシドを選択した。フルオレセイン標識した（ＣＵＧ）３６転写物（２ｎＭ）をまず、アミノグリコシド化合物（１０μＭまたは５０μＭ）と、次いで、過剰量の組み換え型ＭＢＮＬ１タンパク質（１００ｎＭ）とインキュベートした。ＭＢＮＬ１タンパク質と結合したままのＣＵＧ繰り返しＲＮＡの割合（「％結合ＣＵＧｅｘｐ」、縦軸）を計算するために、結果は、アミノグリコシドが除かれたアッセイにおける最大蛍光異方性の割合として表す。試験した化合物の中でも、ネオマイシンは、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡへのＭＢＮＬ１結合の最も強い阻害を示した。値は、３回の実験からの平均±ＳＤである。
１４．実施例１４：ＣＵＧ繰り返しＲＮＡと組み換え型ＭＢＮＬ１タンパク質との相互作用を阻害する化合物についてスクリーニングするための、酵素による相補性アッセイの図式
２８７．（ＣＵＧ）１０９転写物を、ビオチン化した捕捉オリゴヌクレオチドを用いて、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレートの表面に係留させる。捕捉オリゴは、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡの３’末端にある相補的な配列にアニールする。組み換え型ヒトＭＢＮＬ１を、β−ガラクトシダーゼのＰＬフラグメントとの融合物として発現させる。ＰＬは、β−ガラクトシダーゼの５５アミノ酸フラグメントである。予備的実験は、ＰＬフラグメントとのＭＢＮＬ１の融合物が、ＭＢＮＬ１タンパク質のＣＵＧ繰り返しＲＮＡへの結合を阻害しなかったと判定した。試験化合物とインキュベートした後、非結合のＭＢＮＬ１−ＰＬを洗い流した（パネルＢ）。次に、β−ガラクトシダーゼのもう片方のフラグメントを加えて、（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡと相互作用し続けて、それによって、マイクロタイタープレート上に保持されているＭＢＮＬ１−ＰＬの量を決定する。β−ガラクトシダーゼのもう片方のフラグメントのＰＬへの結合は、その酵素活性を再生する。次いで、基質を加えて、活性なβ−ガラクトシダーゼからの蛍光または化学発光を生じさせて、この活性を決定する。
１５．実施例１５：ＣＵＧ繰り返しＲＮＡと組み換え型ＭＢＮＬ１タンパク質の相互作用を阻害する化合物についてスクリーニングするための酵素による相補性アッセイ
２８８．β−ガラクトシダーゼの酵素による相補性アッセイが働くことを、２種のインヒビターを用いて実証した。左パネルでは、過剰の可溶性（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡをアッセイ反応に加えた。可溶性（ＣＵＧ）１０９ＲＮＡは、ＭＢＮＬ１−ＰＬタンパク質に結合し、そして、そのマイクロタイタープレート上の保持を妨害し、これは、β−ガラクトシダーゼ活性の減少（相対的発光活性として縦軸に表される）により反映された。右パネルでは、示される濃度のＣＵＧ繰り返し−ＲＮＡヘアピン内に入り込む能力を持つ化合物（ＥｔＢｒ、エチジウムブロマイド；またはＳｙｂｒＧｒｅｅｎ色素）を加えた。両方の化合物が、プレート上に保持されるＭＢＮＬ１−ＰＬの量を減らし、これは、β−ガラクトシダーゼ活性の減少により反映された。これらの結果は、酵素による相補性アッセイが、ＭＢＮＬ１タンパク質への結合、または、ＣＵＧ繰り返しＲＮＡへの結合のいずれかによって、ＭＢＮＬ１−ＣＵＧ相互作用を阻害する化合物を同定し得ることを示す。
（Ｅ．参考文献）
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Claims (10)

  1. 被験体における塩化物イオンチャネルＣｌＣ−１のスプライス異常を矯正するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣｌＣ−１プレ−ｍＲＮＡのイントロン６とエキソン７ａの間の接続部、または、ＣｌＣ−１プレ−ｍＲＮＡのエキソン７ａとイントロン７ａの間の接続部のいずれかに対して相補的な核酸塩基配列を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
  2. モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  3. ＰＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  4. 配列番号４または配列番号６から選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
  5. 被験体における筋ジストロフィーの治療に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、該被験体における塩化物イオンチャネルＣｌＣ−１のスプライス異常を矯正し、そして、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣｌＣ−１プレ−ｍＲＮＡのイントロン６とエキソン７ａの間の接続部、または、ＣｌＣ−１プレ−ｍＲＮＡのエキソン７ａとイントロン７ａの間の接続部のいずれかに対して相補的な核酸塩基配列を有する、組成物。
  6. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドがモルホリノである、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記薬剤が、ペプチド核酸である、請求項５に記載の組成物。
  8. 前記薬剤が、結合体を含む、請求項５に記載の組成物。
  9. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号４または配列番号６の核酸塩基配列を有する、請求項５〜８のいずれかに記載の組成物。
  10. 請求項１〜４のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、または、請求項５〜９のいずれかに記載の組成物を含む、薬学的組成物。
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