ES2351976T3 - Composiciones para mejorar el transporte y la eficacia antisentido de análogos de ácidos nucleicos en células. - Google Patents
Composiciones para mejorar el transporte y la eficacia antisentido de análogos de ácidos nucleicos en células. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para mejorar la capacidad de un oligómero antisentido de morfolino para unirse a una secuencia diana en un ácido nucleico, según se pone de manifiesto por (i) una disminución en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un codón de iniciación de la traducción de la proteína codificada, o ii) un aumento en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un sitio aberrante de corte y empalme en un pre-mARN que codifica dicha proteína cuando se corta y empalma correctamente, y donde el oligómero antisentido está compuesto por subunidades de morfolino enlazadas mediante uniones que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente, y que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, comprendiendo dicho método la conjugación al oligómero antisentido de un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de las secuencias (RRY)x ó (RYR)x, donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)-(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7.
Description
La invención se refiere a métodos para mejorar el suministro de moléculas, por ejemplo, agentes biológicos, dentro de las células, y en particular al suministro intracelular y la unión mejorada de análogos de ácidos nucleicos sustancialmente sin carga, particularmente oligómeros de morfolino con enlaces fosforodiamidato.
Arora, V. y P.L. Iversen (2000). "Antisense oligonucleotides targeted to the p53 gene modulate liver regeneration in vivo." Drug Metab Dipos 28(2):131-8. Astriab Fisher, A., D.Sergueev et al. (2002). "Conjugates of antisense oligonucleotides with the Tat and antennapedia cell-penetreting peptides: effects on cellular uptake, binding to target sequences, and biologic actions." Pharm Res 19(6):744-54. Astriab-Fisher, A., D.S. Sergueev et al. (2000). "Antisense inhibition of P-glycoprotein expression using peptide oligonucleotide conjugates." Biochem PharmacoI 60(1):83
90.
Devi, G.R. (2002). "Prostate cancer: status of current treatments and emerging antisense-based therapies." Curr Opin Mol Ther 4(2):138-48.
Devi, G.R., J.R. Oldenkamp et al. (2002). "Inhibition of human chorionic gonadotropin
beta-subunit modulates the mitogenic effect of c-myc in human prostate cancer cells."
Prostate 53(3):200·10.
Heasman, J., M. Kofron et al. (2000). "Beta-catenin signaling activity dissected in the
early Xenopus embryo: a novel antisense approach." Dev Biol 222(1):124-34.
Hudziak, R.M., E. Barofsky et al. (1996). "Resistance of morphollno phosphorodiamidate oligomers to enzymatic degradation." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6(4):267
72.
Iversen, P.L. (2001). Phosphoramidite Morpholino Oligomers. Antisense Drug Technology. S.T. Crooke. NewYork, Marcel Dekker, Inc.
Kang, S. H., M.J. Cho et al. (1998). "Up-regulation of luciferase gene expression with
antisense oligonucleotides: implications and applications In functional assay development." Biochemistry 37(18):6235-9.
Khromykh, AA, N. Kondratieva et al. (2003). "Significance in replication of the terminal
nucleotides of the flavivirus genome." J Virol 77(19):10623-9.
Kipshidze, N., E. Keane et al. (2001), "Local delivery of c-myc neutrally charged antisense oligonucleotides with transport catheter inhibits myointimal hyperplasia and
positively affects vascular remodeling in the rabbit balloon injury model." Catheter
Cardiovasc Interv 54(2):247-56.
Kipshidze, N.N., H.S. Kim et al. (2002). "Intramural coronary delivery of advanced antisense oligonucleotides reduces neointimal formation in the porcine stent restenosis model." J Am Coll Cardiol 39(10):1686-91. McCaffrey, A.P., L. Meuse et al. (2003). "A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice.' Hepatology 38(2):503-8. Moulton, H.M., M.C. Hase et al. (2003). "HIV Tat peptide enhances cellular delivery of antisense morpholino oligomers." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 13(1):31-43. Moulton, H.M., M.H. Nelson et al. (2004). "Cellular uptake of antisense morpholino oligomers conjugated to arginine rich peptides." Bioconjug Chern 15(2):290-9. Nasevicius, A. y S.C. Ekker (2000), "Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.' Nat Genet 26(2):216-20. Qin, G., M. Taylor et al. (2000). "In vivo evaluation of a morpholino antisense oligomer directed against tumor necrosis factor-alpha." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 10(1):11-6. Richard, J.P., K. Melikov et al. (2003). "Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake." J Biol Chem 278(1):585-90. Ricker, J.L., J.E. Mata et al. (2002). "c-myc Antlsense oligonucleotide treatment ameliorates murine ARPKD." Kidney Int 61 SuppI 1:125-131. Rothbard, J.B., E. Kreider et al. (2002). "Arginine-rich molecular transporters for drug delivery: role of backbone spacing in cellular uptake." J Med Chem 45(17):3612-8. Stein, D., E. Foster et al. (1997). "A specificity comparison of tour antisense types: morpholino, 2'-O-methyl RNA, DNA, and phosphorothioate DNA." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3):151-7. Stein, D.A, D.E. Skilling et al. (2001). "Inhibition of vesivirus infections in mammalian tissue culture with antisense morpholino oligomers." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 11(5):317-25. Summerton, J. y D. Weller (1997). "Morpholino antisense oligomers: design, preparation, and properties." Antisense Nucleic Acid Drug Dev 7(3):187-95. Tisne, C., B.P. Roques et al. (2004). "The annealing mechanism of HIV-1 reverse transcription primer onto the viral genome." J BioI Chem 279(5):3588-3595. Wender, P.A., D.J. Mitchell et al. (2000). "The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters." Proc Natl Acad Sci USA 97(24):13003-8. Yoo, H., P. Sazani et al. (1999). "PAMAM dendrimers as delivery agents for antisense oligonucleotides." Pharm Res 16(12):1799-804. Zuker, M. (2003). "Mfold web Server for nucleic acid holding and hybridization prediction." Nucleic Acids Res 31(13): 3406-15.
La utilidad práctica de muchos fármacos con actividad biológica potencialmente útil se ve a menudo bloqueada por la dificultad de suministro de tales fármacos a sus dianas. Los compuestos que se han de suministrar dentro de las células deben generalmente suministrarse desde un entorno extracelular en su mayor parte acuoso y penetrar seguidamente una membrana celular lipofílica para poder entrar en la célula. A menos que la sustancia sea transportada activamente mediante un mecanismo de transporte específico, muchas moléculas, particularmente moléculas grandes, son muy lipofílicas para solubilizarse en la práctica, o son demasiado hidrófilas para penetrar la membrana.
Un segmento de la proteína Tat del HIV que consiste en los restos de aminoácido 49-57 (Tat 49-57, que tiene la secuencia RKKRRQRRR) se ha utilizado para suministrar péptidos y proteínas biológicamente activos a células (por ejemplo, Barsoum et al., 1994, Publicación PCT Nº WO 94/04686). Tat (49-60) se ha utilizado para mejorar el suministro de oligonucleótidos fosforotioato (Astriab-Fisher, Sergueev et al. 2000; Astriab-Fisher, Sergueev et al. 2002). Se ha publicado que la Tat inversa, o rTat (5749) (RRRQRRKKR), suministra fluoresceína dentro de las células con una eficacia mejorada en comparación con Tat (49-57) (Wender, Mitchell et al. 2000; Rothbard, Kreider et al. 2002). Rothbard y Wender han descrito también otros polímeros de transporte ricos en arginina (Publicación PCT Nº WO 01/62297; Patente de los EE.UU. Nº 6,306,993; Publicación de Solicitud de Patente de los EE.UU. Nº 2003/0032593).
Los oligonucleótidos son una clase de compuestos farmacológicos potencialmente útiles cuyo suministro ha sido con frecuencia un impedimento para su uso terapéutico. Se ha descubierto que los oligómeros de morfolino con enlaces fosforodiamidato (PMOs, del inglés “phosphorodiamidate-linked morpholino oligomers”, véase, por ejemplo, Summerton y Weller, 1997) son más prometedores a este respecto que los análogos de oligonucleótidos con carga tales como los fosforotioatos. Los PMOs son moléculas antisentido solubles en agua, sin carga o sustancialmente sin carga, que inhiben la expresión génica impidiendo la unión o progresión de los componentes de la maquinaria de corte y empalme, o traslacional. También se ha demostrado que los PMOs inhiben o bloquean la replicación viral (Stein, Skilling et al. 2001; McCaffrey, Meuse et al. 2003). Son muy resistentes a la digestión enzimática (Hudziak, Barofsky et al. 1996). Los PMOs han demostrado tener una alta especificidad y eficacia antisentido in vitro en modelos libres de células y de cultivos celulares (Stein, Foster et al.
1997; Summerton y Weller, 1997), e in vivo en embriones de pez cebra, rana y erizo de mar (Heasman, Kofron et al. 2000; Nasevicius y Ekker, 2000), así como en modelos animales adultos, tales como ratas, ratones, conejos, perros y cerdos (véanse, por ejemplo, Arora e Iversen 2000; Qin, Taylor et al. 2000; Iversen 2001; Kipshidze, Keane et aI. 2001; Devi 2002; Devi, Oldenkamp et al. 2002; Kipshidze, Kim et al. 2002; Ricker, Mata et al. 2002).
Se ha demostrado que los oligómeros PMO antisentido se incorporan a las células y son más consistentemente eficaces in vivo, con menos efectos inespecíficos, que otros oligonucleótidos antisentido generalmente utilizados (véase, por ejemplo, P. Iversen, "Phosphoramidite Morpholino Oligomers", en Antisense Drug Technology, S.T. Crooke, ed., Marcel Dekker, lnc., New York, 2001). Sin embargo, sería deseable una mejora adicional en su incorporación y eficacia antisentido para poder explorar completamente su potencial.
La invención proporciona un método para mejorar la capacidad de un oligómero antisentido de morfolino, que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, para unirse a una secuencia diana en un ácido nucleico, según se pone de manifiesto por (i) una disminución en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un codón de iniciación de la traducción de la proteína codificada, o ii) un aumento en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un sitio aberrante de corte y empalme en un pre-mARN que codifica dicha proteína cuando se corta y empalma correctamente, y donde el oligómero antisentido está compuesto por subunidades de morfolino enlazadas mediante uniones que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente, y que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, comprendiendo dicho método conjugar al oligómero antisentido un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de estas secuencias (RRY)x ó (RYR)x, donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)-(CH2)n-NH-, donde n es 2 a 7.
Los ensayos adecuados para medir los efectos descritos se describen más abajo. En una realización, la conjugación del péptido proporciona esta actividad en un ensayo de traducción libre de células, como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, la actividad se ve mejorada por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez. En algunas realizaciones, la actividad puede verse mejorada por factores de 50, 100 ó más.
Alternativamente, o además, el péptido es eficaz para mejorar el transporte del oligómero antisentido de morfolino dentro de una célula, con relación al oligómero en su forma no conjugada. Preferiblemente, el transporte se ve mejorado por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez. En algunas realizaciones, la incorporación puede verse mejorada por factores de 50, 100 o más.
En los conjugados, el oligómero puede conjugarse al péptido a través de una subunidad Y, una subunidad de cisteína, o un resto enlazador no aminoacídico sin carga, como se describe más abajo.
En una realización, cada Y es una subunidad aminoacídica hidrófoba neutra -CO-(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7. Por ejemplo, cuando n es 5, Y es una unidad de ácido 6-aminohexanoico, abreviado en la presente memoria como Ahx. En una realización de este grupo, cada X comprende un resto de cadena lateral de guanidilo, como en una subunidad de arginina. Los péptidos preferidos de este tipo incluyen aquellos que comprenden dímeros de arginina que se alternan con subunidades Y aisladas, donde Y es preferiblemente Ahx. Se incluyen entre los ejemplos los péptidos que tienen la fórmula (RYR)4 o la fórmula (RRY)4, donde Y es preferiblemente Ahx. En este último caso, el análogo de ácido nucleico se une preferiblemente a una subunidad Y terminal.
El oligómero al que se conjuga el péptido, que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga, es un oligómero de morfolino. Preferiblemente, la cadena principal del oligómero es completamente sin carga. El oligómero de morfolino comprende subunidades de morfolino unidas por uniones que contienen fósforo, de uno a tres átomos de largo, entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente. Las uniones son preferiblemente uniones de tipo fosforodiamidato de dos átomos sin carga, conforme a la estructura:
donde Y1=O, Z=O, Pj es un resto de purina o pirimidina que forma pares de bases efi
caz para unirse, mediante un enlace de hidrógeno específico de base, a una base en un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi o alquilamino.
La conjugación de un péptido a un oligómero tal como se describe anteriormente forma un conjugado de péptido-oligómero que es más eficaz que el oligómero no conjugado en varias funciones, incluyendo: inhibir la expresión del mARN diana en un sistema de expresión proteica; inhibir el corte y empalme del pre-mARN diana; e inhibir la replicación de un virus, dirigiéndose a elementos que actúan en cis que controlan la replicación de ácido nucleico o la transcripción de ARN del virus.
Preferiblemente, el conjugado incluye un péptido que, cuando se conjuga con un oligómero antisentido, es eficaz para mejorar la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana, con relación al oligómero antisentido en su forma no conjugada, según se pone de manifiesto por:
- (i)
- una disminución en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un codón de iniciación de la traducción de la proteína codificada, o
- (ii)
- un aumento en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un sitio aberrante de corte y empalme en un pre-mARN que codifica dicha proteína cuando se corta y empalma correctamente.
Los ensayos adecuados para medir estos efectos se describen más abajo. En una realización, la conjugación del péptido proporciona esta actividad en un ensayo de traducción libre de células, tal como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, la actividad se ve mejorada por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez. En algunas realizaciones, la actividad puede verse mejorada por factores de 50, 100 ó más.
Alternativamente, o además, el péptido es eficaz para mejorar el transporte del oligómero dentro de una célula, con relación al oligómero en su forma no conjugada. Preferiblemente, el transporte se ve mejorado por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez. En algunas realizaciones, la actividad puede verse mejorada por factores de 50, 100 o más.
En los conjugados de la invención, el oligómero se conjuga preferiblemente al péptido a través de un resto enlazador que se selecciona entre una subunidad Y, una subunidad de cisteína, y un resto enlazador no aminoacídico sin carga.
En una realización, cada Y es una subunidad aminoacídica hidrófoba neutra -C(O)-(CH2)n-1(CHR)-NH-, donde n es de 2 a 7 y R es H. En una realización así, n es 5, de tal forma que Y es una subunidad de ácido 6-aminohexanoico. En una realización de esta clase, cada X es una cadena lateral de guanidilo, por ejemplo, como en las subunidades de arginina. Éstas incluyen conjugados en las que el péptido comprende dímeros de arginina que se alternan con subunidades Y aisladas. Son ejemplos de tales péptidos los péptidos que tienen la fórmula (RYR)4 y los péptidos que tienen la fórmula (RRY)4. En este último caso, el análogo de ácido nucleico se une preferiblemente a una subunidad Y terminal.
Los conjugados de péptido-oligómero de la invención son más eficaces que el oligómero no conjugado en varias funciones, incluyendo: inhibir la expresión del mARN diana en un sistema de expresión proteica, incluyendo sistemas de traducción libres de células; inhibir el corte y empalme del pre-mARN diana; e inhibir la replicación de un virus, dirigiéndose a elementos que actúan en cis que controlan la replicación de ácido nucleico o la transcripción de mARN del virus. Preferiblemente, la actividad se ve mejorada por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez.
Alternativamente, o además, el péptido es eficaz para mejorar el transporte del oligómero dentro de una célula, con relación al oligómero en su forma no conjugada. Preferiblemente, el transporte se ve mejorado por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez.
Se describe además una composición útil para el suministro intracelular de un análogo de ácido nucleico in vivo, que comprende un conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico, como se describe anteriormente, y una suspensión de microburbujas que contienen gas insoluble en un vehículo acuoso que comprende al menos un compuesto filmógeno seleccionado entre una proteína, tensioactivo, lípido, polisacárido, y combinaciones de los mismos. Preferiblemente, las microburbujas se resuspenden en un vehículo acuoso que comprende albúmina, y el gas insoluble se selecciona del grupo que consiste en perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano, y perfluoropentano.
Se describe además un análogo de ácido nucleico modificado, que comprende
- (i)
- una pluralidad de subunidades conectadas por uniones intersubunidad, y que soportan una secuencia de bases eficaz para hibridarse con un polinucleótido diana de secuencia complementaria, para formar un dúplex diana/antisentido; y
- (ii)
- portado sobre al menos seis uniones intersubunidad contiguas, un resto cargado de
estructura R1N=C(NH2)R2, donde R1 es H ó R; R2 es R, NH2, NHR, ó NR2, donde R es alquilo inferior o alquenilo inferior y puede incluir además oxígeno o nitrógeno; R1 y R2 pueden formar juntos un anillo; y el resto de cadena lateral está enlazado a dicha sub-unidad aminoacídica a través de R1 ó R2.
5 Preferiblemente, el resto con carga se selecciona del grupo que consiste en guanidilo (-N=C(NH2)NH-), amidinilo (-C(=NH)(NH2)), 2-aminohexahidropirimidilo (=HNH(NH2)NH-), 2-aminopiridinilo (-C(=N)(NH2)); y 2-aminopirimidonilo (-N-NH2)=N-). Más preferiblemente, el resto con carga es guanidilo. En una realización, las subunidades son subunidades de morfolino, y las uniones son uniones de tipo fosforodiamidato.
Éstos y otros objetivos y características de la invención resultarán más completamente evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención junto con los dibujos que la acompañan.
15 Breve Descripción de los Dibujos Las Figs. 1A-1D muestran varias subunidades de tipo morfolino preferidas que tienen grupos enlazadores de 5 átomos (A), seis átomos (B) y siete átomos (C-D) adecuados para formar polímeros. Las Figs. 2A-D muestran el segmento de subunidades que se repite de los oligonu
20 cleótidos de morfolino ilustrativos, que se construye usando las subunidades A-D, respectivamente, de la Figura 1. Las Figs. 3A-G muestran estructuras de cadenas laterales X ilustrativas, para usar en varias realizaciones de los transportadores de la invención. Las Figs. 4A-D muestran conjugados de oligómero-transportador y métodos para su
25 preparación, donde la Fig. 4C muestra la preparación de un conjugado que se escinde in vivo. La Fig. 5A muestra la adsorción de un conjugado de péptido-PMO marcado con fluoresceína (R9F2C-705-FL) con el tiempo, según se mide en células HeLa pLuc705 tratadas con 1 �M del conjugado.
30 La Fig. 5B muestra la absorción según aumenta la concentración, medida a 37ºC (�) y 17ºC (*), en células HeLa pLuc705 incubadas con R9F2C-705-FL durante 70 minutos. La Fig. 6 muestra la adsorción según aumenta la concentración en células HeLa pLuc705 incubadas con R9F2C-705-FL y con (D)-R9F2C-705-FL, sin tratamiento con tripsina (cuadrados y círculos rellenos, respectivamente), y con tratamiento con tripsina
35 (cuadrados y círculos sin relleno, respectivamente). La Fig. 7A muestra la penetración con el tiempo, determinada por citometría de flujo en células incubadas con 1 �M de conjugado de péptido-PMO marcado con fluoresceína (R9F2C-705-FL) y tratadas seguidamente con tripsina. La Fig. 7B muestra la penetración según aumenta la concentración, determinada por citometría de flujo, en células tratadas con R9F2C-705-FL, a 37ºC (�) ó 17ºC (*) durante 70 minutos, y tratadas seguidamente con tripsina. La Fig. 8 muestra el nivel de producción de luciferasa observado (expresado como RLU) en células HeLa pLuc705 tras 6 horas de incubación con 25 �M de cada una de las siguientes composiciones: los conjugados de PMO-transportador R9F2C-PMO; R9C-PMO; rTat(57-49)-C-PMO; y rTat(57-49)-PMO; una mezcla de R9F2C y PMO; R9F2C solo; PMO solo; y tampón PBS. El PMO utilizado fue la secuencia 705 (SEC ID Nº1). La Fig. 9 muestra la viabilidad de las células HeLa tras 24 horas de incubación con 25 �M de las composiciones relacionadas en la Fig. 8. La Fig. 10 muestra el nivel de producción de luciferasa referido a microgramo de proteína (RLU/�g de proteína) observado en células HeLa Luc705 tras 24 horas de incubación con los conjugados de PMO(705) con R9F2, R9I2, R8F3, y R9F4, respectivamente, donde en cada caso el PMO se unió a través de un resto de cisteína al extremo C-terminal (lado derecho) del péptido transportador tal como se muestra. La Fig. 11 muestra (A) el nivel de producción de luciferasa (RLU/�g de proteína), como en la Fig. 10, y (B) la fluorescencia en células HeLa pLuc705 tras 24 horas de incubación con conjugados de PMO(705) con R9F2, R6F2, y R5F2, donde en cada caso el PMO se unió a través de un resto de cisteína al extremo C-terminal del péptido transportador. La Fig.12 muestra el nivel de producción de luciferasa (RLU/�g de proteína), como en la Fig. 10, en células HeLa pLuc705, tras 24 horas de incubación con los conjugados de PMO con R9F2, R5F2R4, y F2R9, respectivamente, donde en cada caso el PMO se unió a través de un resto de cisteína al extremo C-terminal del péptido transportador. La Fig. 13 muestra las estructuras de grupos enlazadores bifuncionales que pueden usarse para enlazar polímeros transportadores a oligómeros antisentido. La Fig. 14 muestra el nivel de producción de luciferasa (RLU/�g de proteína), como en la Fig. 10, en células HeLa pLuc705, tras 24 horas de incubación con los conjugados R9F2-C-PMO y biotina-R9F2-C-PMO. La Fig. 15 muestra el nivel de producción de luciferasa (RLU/�g de proteína), como en la Fig. 10, en células HeLa pLuc705, tras 24 horas de incubación con varios conjugados de PMO(705)-péptido de transporte, como se muestra en la Tabla 1 de la presente memoria, a una concentración de 25 �M, donde en cada caso el PMO está enlazado al resto de cisteína C. La Fig. 16 muestra la producción de luciferasa (RLU/�g de proteína), en células HeLa pLuc705 tratadas con conjugados de PMO(705) antisentido con péptidos de transporte de secuencias diferentes, a una concentración de 1 �M (barras oscuras) o 5 �M (barras claras) en medio libre de suero durante 6 horas, donde en cada caso el PMO está enlazado al resto de cisteína C. La Fig. 17 muestra la producción de luciferasa (RLU/�g de proteína), en células HeLa pLuc705 tratadas con R9F2-C-PMO-705 (cuadrados rellenos) y los siguientes POMs de control que contenían dos o cuatro faltas de apareamiento, secuencias revueltas o irrelevantes: R9F2-C-7052MM (círculo relleno), R9F2-C-7054MM (�), R9F2-C-705SCR (V) y R9F2C-cmyc (*). La Fig. 18 muestra la producción de luciferasa (RLU/�g de proteína) en células HeLa pLuc705 tratadas con R9F2-C-PMO-705 medida en diferentes tiempos. Las Figs. 19A-G muestran ejemplos de otros tipos de oligómeros antisentido sin carga que pueden modificarse para contener los péptidos de transporte como se describe en la presente memoria. La Fig. 20 muestra un método para preparar un PMO que tiene una cadena lateral intersubunidad modificada que contiene restos con carga catiónica. Las Figs. 21-23 representan los resultados de la inhibición de la traducción libre de células por los conjugados de péptido-PMO dirigidos a secuencias virales situadas inmediatamente antes del extremo 5' del gen reportero de luciferasa de luciérnaga. La Fig. 23 representa los resultados obtenidos con la construcción del gen reportero pDCLD. La Fig. 24 muestra el nivel de producción de luciferasa observado (RLU por microgramo de proteína) en células HeLa pLuc705, tras 24 horas de tratamiento con 10 �M de cada uno de las siguientes composiciones: el conjugado de PMO (705-FL) con R9F2, (RRAhx)4, (RAhxR)4, (AhxRR)4, (RAhxR)3, (RAhxR)2R, (RAhxR)2, (RKAhx)4, o (RHAhx)4. Las Figs. 25A-B y 26A-B muestran que un péptido de transporte que contiene ácido 6aminohexanoico (Ahx), (RAhxR)4, es resistente a la degradación por proteinasa K, y que un péptido de transporte que contiene todos los aminoácidos naturales, R9F2, no era resistente a la degradación por proteinasa K. La Fig. 27 muestra la biodisponibilidad in vivo y el suministro intracelular relativo de PMO marcado con fluoresceína, no conjugado y conjugado con péptido, en células de nódulo linfático y bazo de ratón y en subpoblaciones de células de esos tejidos. La Fig. 28 muestra los resultados de la inhibición de la traducción libre de células por conjugados de péptido-PMO dirigidos a una región del gen c-myc humano que rodea el codón de iniciación de la traducción, fusionada con el gen reportero de luciferasa de luciérnaga. La Fig. 29 muestra la estructura secundaria predicha por ordenador del ARN que rodea el codón de iniciación de la traducción del virus del Dengue y la diana del PMO antisentido DEN AUG (subrayados, nucleótidos 87-106). El codón de iniciación AUG está en los nucleótidos 97-99.
I. Definiciones
"Alquilo" se refiere a un radical monovalente completamente saturado que contiene carbono e hidrógeno, que puede ser ramificado, lineal o cíclico (cicloalquilo). Son ejemplos de grupos alquilo el metilo, etilo, n-butilo, t-butilo, n-heptilo, isopropilo, ciclopropilo, ciclopentilo, etilciclopentilo, y ciclohexilo. Se prefieren en general grupos alquilo que tienen de uno a seis átomos de carbono, denominados "alquilo inferior", y ejemplificados por metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo, isoamilo, n-pentilo, e isopentilo. En una realización, alquilo inferior se refiere a alquilo C1 a C4.
Un análogo de ácido nucleico que tiene una cadena principal "sustancialmente sin carga" (también denominado "análogo de ácido nucleico sustancialmente sin carga") es uno que tiene como máximo una unión intersubunidad con carga (a pH fisiológico) por cada cuatro uniones sin carga (a pH fisiológico), preferiblemente como máximo una por cada ocho, y más preferiblemente como máximo una por cada dieciséis uniones sin carga. En una realización preferida, los análogos de ácido nucleico descritos en la presente memoria son completamente sin carga.
En general, los términos tales como "con carga", "sin carga", y "neutro" utilizados en la presente memoria se refieren al estado del grupo así descrito a pH fisiológico, esto es, aproximadamente 7,4.
La "cadena principal" de un análogo así se refiere a la estructura que soporta los restos de pares de bases, esto es, para un oligómero de morfolino, como se describe abajo, la "cadena principal" incluye las estructuras anulares del morfolino conectadas por uniones que contienen fósforo.
Una "secuencia diana" se refiere a una secuencia complementaria o casi complementaria a la que se dirige un oligómero antisentido, en virtud de su secuencia de bases, y es capaz de unirse de forma estable en condiciones fisiológicas de temperatura y pH.
El término "actividad antisentido", con referencia a oligómeros de bloqueo estérico, se refiere a la capacidad de un oligómero antisentido para unirse a su secuencia diana e inhibir la función de esa secuencia diana, o de secuencias muy próximas, por ejemplo, bloquear la traducción de un mARN, bloquear elementos que actúan en cis en la replicación de ARN viral, o bloquear el corte y empalme preciso del pre-ARN.
I. Conjugados de Compuesto-Transportador
A. Conjugados Peptídicos
En un aspecto, la invención proporciona un conjugado de péptido y oligómero, que comprende un oligómero que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, y, enlazado covalentemente al oligómero, un péptido como se define en la reivindicación 1.
Los ensayos adecuados para medir los efectos descritos se describen más abajo. En una realización, la conjugación del péptido proporciona esta actividad en un ensayo de traducción libre de células, tal como se describe en la presente memoria. Preferiblemente, la actividad se ve mejorada por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez.
Alternativamente, o además, el péptido es eficaz para mejorar el transporte del oligómero dentro de una célula, con relación al oligómero en su forma no conjugada. Preferiblemente, el transporte se ve mejorado por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez.
En los conjugados de la invención, el oligómero se conjuga preferiblemente al péptido a través de un resto enlazador que se selecciona entre una subunidad Y, una subunidad de cisteína, y un resto enlazador no aminoacídico sin carga.
En una realización, cada Y es una subunidad aminoacídica hidrófoba neutra -C(O)-(CH2)n-1(CHR)-NH-, donde n es de 2 a 7 y R es H. En una realización así, n es 5, de tal forma que Y es una subunidad de ácido 6-aminohexanoico (Ahx). En una realización de esta clase, cada X es una cadena lateral de guanidilo, por ejemplo, como en las subunidades de arginina. Éstas incluyen conjugados en las que el péptido comprende dímeros de arginina que se alternan con subunidades Y aisladas, donde Y es preferiblemente Ahx. Son ejemplos de tales péptidos el péptido que tiene la fórmula (RYR)4 y el péptido que tiene la fórmula (RRY)4, donde Y es preferiblemente Ahx. En este último caso, el oligómero se enlaza preferiblemente a una subunidad Y terminal.
Los conjugados de péptido-oligómero de la invención son más eficaces que el oligómero no conjugado en varias funciones, incluyendo: inhibir la expresión del mARN diana en un sistema de expresión proteica, incluyendo sistemas de traducción libres de células; inhibir el corte y empalme del pre-mARN diana; e inhibir la replicación de un virus, dirigiéndose a elementos que actúan en cis que controlan la replicación de ácido nucleico o la transcripción de mARN del virus. Preferiblemente, la actividad se ve mejorada por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez.
Alternativamente, o además, el péptido es eficaz para mejorar el transporte del oligómero dentro de una célula, con relación al oligómero en su forma no conjugada. Preferiblemente, el transporte se ve mejorado por un factor de al menos dos, más preferiblemente por un factor de al menos cinco, y, lo más preferido, por un factor de al menos diez.
B. Análogos de Ácido Nucleico
Los análogos de ácido nucleico incluidos en los conjugados de la invención son oligómeros de morfolino. Son oligómeros sintéticos sustancialmente sin carga capaces de unirse con especificidad de base a un secuencia diana de un polinucleótido, por ejemplo, análogos de oligonucleótidos antisentido.
Un oligómero de morfolino que tiene una cadena principal "sustancialmente sin carga" es uno que tiene como máximo una unión intersubunidad con carga (a pH fisiológico) por cada cuatro uniones sin carga (a pH fisiológico), preferiblemente como máximo una por cada ocho, y más preferiblemente como máximo una por cada dieciséis uniones sin carga. En una realización preferida, los oligómeros descritos en la presente memoria son completamente sin carga.
La secuencia de bases del oligómero proporcionada por los grupos que forman pares de bases soportados por su cadena principal, puede ser cualquier secuencia, donde los grupos soportados que forman pares de bases incluyen las bases A, T, C, G y U estándar o modificadas, o las bases no estándar inosina (I) y 7-deaza-G.
El oligómero de morfolino de la invención es un análogo de oligonucleótido compuesto por estructuras de subunidades de morfolino que tienen la forma que se muestra en la Fig. 1, donde (i) las estructuras se enlazan mediante uniones que contienen fósforo, de uno a tres átomos de longitud, preferiblemente de dos átomos de longitud, y preferiblemente sin carga, que unen el nitrógeno del morfolino de una subunidad al carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente, y (ii) Pi y Pj son restos de purina o pirimidina que forman pares de bases, eficaces para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido. El resto de purina o pirimidina que forma pares de bases es típicamente adenina, citosina, guanina, uracilo
o timina. La síntesis, estructuras y características de unión de los oligómeros de morfolino se detallan en las Patentes de los EE.UU. Nos. 5.698.685, 5.217.866, 5.142.047, 5.034.506, 5.166.315, 5.521.063 y 5.506.337.
La subunidad que se muestra en la Fig. 1B, que tiene una unión de dos átomos, se usa para las cadenas principales de unidades repetidas de 6 átomos, como se muestra en la Fig. 2B. En estas estructuras, el átomo Y1 que enlaza el carbono 5' del morfolino al grupo que contiene fósforo es oxígeno. El resto X que cuelga del fósforo es cualquier grupo estable que no interfiera con los enlaces de hidrógeno específicos de base e incluye alquilo, alcoxi, tioalcoxi, y alquilamino, incluyendo aminas cíclicas, todos los cuales pueden estar sustituidos de forma variable, siempre que el enlace específico de base no se rompa. Alquilo, alcoxi y tioalcoxi incluyen preferiblemente 1-6 átomos de carbono. Alquilamino se refiere preferiblemente a una sustitución con alquilo inferior (C1 a C6), y las aminas cíclicas son preferiblemente heterociclos con nitrógeno de 5 a 7 miembros que contienen opcionalmente 1-2 heteroátomos adicionales seleccionados entre oxígeno, nitrógeno y azufre. Z es oxígeno.
Un oligómero de morfolino preferido es un oligómero de morfolino con enlaces fosforodiamidato, denominado en la presente memoria PMO. Tales oligómeros se componen de estructuras de subunidades de morfolino que tienen la forma que se muestra en la Fig. 2B, donde las estructuras están enlazadas mediante uniones de tipo fosforodiamidato, donde X=NH2, NHR, o NR2 (donde R es alquilo inferior, preferiblemente metilo), Y=O y Z=O, que unen el nitrógeno del morfolino de una subunidad al carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente. Pi y Pj son restos de purina o pirimidina que forman pares de bases, eficaces para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido. También se prefieren estructuras que tienen una unión de tipo fosforodiamidato alterna, donde, en la Fig. 2B, X = alquilo inferior, tal como metoxi o etoxi, Y=NH o NR, donde R es alquilo inferior, y Z=O.
Las propiedades químicas deseables de los oligómeros basados en morfolinos incluyen la capacidad para hibridarse selectivamente con un ácido nucleico diana de bases complementarias, incluyendo ARN diana, con alta Tm, incluso con oligómeros tan cortos como 8-14 bases, la capacidad para ser transportados de forma activa dentro de células de mamífero, y la capacidad de un heterodúplex de oligómero:ARN para resistir la degradación por RNAsa.
Un oligómero de morfolino "sustancialmente sin carga" incluye como máximo una unión intersubunidad con carga por cada cuatro, preferiblemente por cada ocho, y más preferiblemente por cada dieciséis, uniones intersubunidad sin carga. Cualesquier unidades con carga son preferiblemente uniones de tipo fosforoamidato (o tiofosforoamidato) con carga, por ejemplo, una unión como se muestra en la Fig. 2B donde X es O-ó S-. Preferiblemente, los oligómeros de morfolino son completamente sin carga.
En una realización preferida, el oligómero de morfolino tiene una longitud de aproximadamente 8-40 subunidades. Más típicamente, el oligómero tiene una longitud de aproximadamente 8-20, aproximadamente 8-16, aproximadamente 10-30, o aproximadamente 12-25 subunidades. Para algunas aplicaciones, tales como oligómeros cortos antibacterianos, por ejemplo, pueden ser especialmente ventajosos con una longitud de aproximadamente 8-12 subunidades, particularmente cuando se unen a un transportador peptídico como se describe en la presente memoria.
C. Grupos Enlazadores
El péptido de transporte puede enlazarse al agente que se va a suministrar mediante una variedad de métodos que están disponibles para alguien con experiencia en la técnica. Los ejemplos ilustrativos se proporcionan en los Ejemplos 2-5 abajo y se ilustran en las Figs. 4A-D. En una realización, el péptido de transporte contiene un solo residuo de cisteína cuyo tiol de la cadena lateral se usa para el enlace, tal como se muestra en las Figs. 4B y 4C, donde la cisteína es una cisteína terminal. El grupo enlazador puede proporcionarse también por una subunidad hidrófoba tales como las definidas como Y, por ejemplo, �-alanina o una subunidad aminoacídica no � más larga, como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 4D.
Como se discute más abajo, el punto de enlace puede estar en varias posiciones a lo largo del transportador. En realizaciones seleccionadas, está en el extremo terminal del transportador. Típicamente, es adyacente (o incluso está entre ellos) a los restos hidrófobos del transportador. Pueden unirse múltiples transportadores a un único compuesto, si se desea; alternativamente, pueden conjugarse múltiples compuestos con un único transportador.
Cuando el compuesto es un PMO, el transportador, puede ligarse en el extremo 5' del PMO a través de un resto protector de amina, como se describe en los Ejemplos 2-3 y se ilustra en las Figs. 4A y 4D. Alternativamente, el transportador puede ligarse al extremo 3', por ejemplo, a través del nitrógeno de un anillo de morfolino, como se describe en el Ejemplo 4 y se muestra en la Fig. 4B, o a través de la cadena lateral de una unión intersubunidad, en un extremo, o bien en una unión interna.
El grupo enlazador entre el péptido de transporte y el PMO puede consistir también en aminoácidos naturales o no naturales (por ejemplo, ácido 6-aminohexanoico o
�-alanina) que se añaden al péptido en el extremo C-terminal y como se describe en el Ejemplo 2. El grupo enlazador puede comprender también un enlace directo entre el extremo carboxi terminal de un péptido de transporte y una amina o grupo hidroxilo del
PMO, formado por condensación favorecida, por ejemplo, por carbodiimida.
En general, el grupo enlazador puede comprender cualquier resto no reactivo que no interfiera con el transporte o la función del conjugado. El grupo enlazador incluye preferiblemente una cadena de hasta dieciséis átomos aproximadamente, incluyendo longitudes de hasta 12 o hasta 8 átomos, que comprende uniones seleccionadas entre alquilo, éter (por ejemplo, uniones de PEG), tioéter, éster, amida, amino, carbamato, o combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, las uniones se seleccionan entre alquilo, éter, y amida, cuando se desean uniones que sean estables (no escindibles) in vivo.
Los grupos enlazadores pueden seleccionarse entre aquéllos que son no escindibles en condiciones normales de uso, por ejemplo, los que contienen un enlace éter, tioéter, amida, o carbamato. En otras realizaciones, puede ser deseable incluir una unión entre el resto del transportador y un compuesto que sea escindible in vivo. Los enlaces que son escindibles in vivo se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ésteres de ácidos carboxílicos, que se hidrolizan enzimáticamente, y disulfuros, que se escinden en presencia de glutatión. Puede ser posible también escindir una unión escindible por acción fotolítica, tal como un éter orto-nitrofenílico, in vivo, aplicando radiación a la longitud de onda apropiada.
Por ejemplo, la preparación de un conjugado que tiene un grupo enlazador disulfuro, usando el reactivo 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP, del inglés "N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate") o succinimidiloxicarbonil-�-metil-�-(2piridilditio)tolueno (SMPT, del inglés "succinimidyloxycarbonyl �-methyl-�-(2pyridyldithio) toluene"), se describe en el Ejemplo 5 y se ilustra en la Fig. 4C. Los agentes enlazadores heterobifuncionales ilustrativos que contienen además un grupo disulfuro incluyen 3-[(4-azidofenil)ditio]propionato de N-hidroxisuccinimidiIo y otros que se describen en Vanin, E.F. y Ji, T.H., Biochemistry 20:6754-6760 (1981).
D. Péptidos y Conjugados Ilustrativos
A continuación se proporciona una Tabla de secuencias de péptidos de transporte y PMOs ilustrativos que se discuten en las siguientes secciones. En general, los péptidos incluyen un grupo amino N-terminal y un grupo amida (por ejemplo, NH2CYGRKKRRQRRR-CONH2) o carboxilo libre (por ejemplo, NH2-CYGRKKRRQRRRCOOH) C-terminal, o incluyen una acetamida N-terminal y un ácido C-terminal (por ejemplo, Ac-NH(RAhxR)4Ahx�Ala-OH). Los restos "Y" de los péptidos de la invención designados por las SEC ID Nos: 13-32 se indican en negrita, y los restos de cisteína internos que se utilizan para la unión con el PMO se muestran en cursiva. (Cuando no se muestra un resto enlazador de cisteína, el péptido se enlaza típicamente mediante su extremo C-terminal, esto es, por el lado derecho según se muestra).
Los péptidos ilustrativos que contienen subunidades de ácido 6-aminohexanoico (Ahx) se muestran en la Tabla 1 como SEC ID Nos: 33-41. La estructura del péptido de transporte (RAhxR)4 (SEC ID Nº: 34) conjugado a un PMO mediante un grupo enlazador Ahx-�Ala se muestra en la Figura 4D.
Tabla 1
(continuación)
II. Actividad Biológica de los Conjugados Transportador-PMO
5 Los transportadores peptídicos descritos en la presente memoria facilitan el suministro de oligómeros sustancialmente sin carga dentro de células eucariotas vivas, a la vez que mejoran considerablemente la actividad antisentido, como se demuestra más abajo para los PMOs. En una realización, el oligómero es un oligómero de morfolino sustancialmente sin carga como se describe anteriormente.
10 El suministro celular puede implicar compartimentos celulares citoplásmicos y nucleares. Por consiguiente, en realizaciones seleccionadas, el oligómero antisentido incluye una secuencia de bases eficaz para hibridarse con una secuencia diana que incluye un sitio de corte y empalme en un mARN preprocesado seleccionado (pre-mARN). El oligómero antisentido puede incluir también una secuencia de bases
15 eficaz para hibridarse con una secuencia diana que incluye un sitio de iniciación de la traducción en un mARN seleccionado. El oligómero antisentido puede incluir también una secuencia de bases específica eficaz para hibridarse con una secuencia diana requerida para la replicación viral. En otro aspecto, el oligómero antisentido puede ser un agente antibacteriano, por ejemplo, dirigiéndose al ARN ribosomal u otros ácidos nucleicos bacterianos, como se describe, por ejemplo, en las Publicaciones de Patentes PCT otorgadas en propiedad común con el solicitante de la presente Nos. WO O1/49775 y WO O1/42457 (Publicación de los EE.UU. Nº 2002/0082226).
Como se demuestra en la presente memoria, los péptidos de transporte como se describen anteriormente mejoran enormemente la entrada en la célula de los compuestos ligados, con relación a la incorporación del compuesto en ausencia del resto peptídico de transporte ligado, y con relación a la incorporación mediante un resto transportador ligado que no tenga subunidades Y. Tal incorporación mejorada se pone de manifiesto preferiblemente por un factor de aumento de uno, y preferiblemente un factor de aumento de más de dos, en la incorporación del compuesto a células de mamíferos, con relación a la incorporación del agente mediante un resto transportador ligado que no tenga subunidades Y. La incorporación se mejora preferiblemente por un factor de al menos veinte, y más preferiblemente por un factor de al menos cuarenta, con relación al compuesto no conjugado.
La incorporación se mide preferiblemente en células HeLa o en células sanguíneas mononucleares, particularmente células linfáticas o derivadas del bazo, tales como linfocitos o fibroblastos, mediante procedimientos tal como se describen abajo en los Materiales y Métodos, para las células HeLa, bajo los encabezados "Cultivos Celulares" por "Citometría de Flujo". Véanse también el Ejemplo 6, el Ejemplo 9, la Sección A abajo para la evaluación sólo del transporte, y la Sección B abajo para la evaluación del transporte y la actividad antisentido.
Un beneficio adicional del resto transportador es la mejora de la unión de un análogo ligado de ácido nucleico a su secuencia diana. En la presente memoria se demuestra que los restos transportadores de la invención disminuyen la concentración de un oligómero antisentido sin carga eficaz para conseguir actividad antisentido, según se mide en cultivos de tejidos y en sistemas libres de células. Los experimentos en cultivos de tejidos proporcionan indicaciones de actividad antisentido mejorada, que se debe al suministro intracelular mejorado, la actividad antisentido mejorada, por ejemplo, la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana, o una combinación de estos fenómenos.
Los sistemas de traducción libres de células proporcionan un medio de evaluar, independientemente del transporte, el efecto de mejora del péptido conjugado en la capacidad del oligómero antisentido para unirse a su diana y, por bloqueo estérico, inhibir la traducción de secuencias más allá del extremo 3' (o inhibir el corte y empalme aberrante, como en el ensayo del Ejemplo 6). Los ensayos de traducción libres de células diseñados para probar el efecto antisentido de los conjugados R9F2-PMO y (RAhxR)4-PMO demuestran un factor de mejora de la actividad antisentido de entre 10 y 500 veces comparado con el PMO no conjugado (véanse, por ejemplo, el Ejemplo 8 y las Figuras 21-23 y 28). Los términos "mejorar la capacidad para inhibir la traducción" o "capacidad mejorada para inhibir la traducción" proporcionados por el péptido conjugado, tal como se usan en la presente memoria, se refieren preferiblemente a la actividad antisentido (inhibidora de la traducción) según se mide en dicho sistema libre de células, tal como se describe en los Materiales y Métodos, abajo, bajo el encabezado "Ensayos de traducción libres de células". Véanse también el Ejemplo 9 y la Sección C abajo.
A. Suministro de oligómeros de morfolino dentro de las células mediado por transportador
La incorporación celular de tres sustancias de ensayo, que incluían (1) PMO no conjugado (SEC ID Nº1; también designado en la presente memoria "705" o "PMO 705"), (2) una mezcla de PMO no conjugado y el péptido de transporte R9F2 (SEC ID Nº13)-C, y (3) un conjugado covalente del PMO y el péptido de transporte (R9F2-C-705), se determinó por microscopía de fluorescencia en cuatro líneas celulares: HeLa pLuc705 derivadas de HeLa S3, HeLa, NIH3T3, y Jurkat. HeLa pLuc/705 (Kang, Cho et al. 1996) es una línea celular HeLa S3 transfectada de manera estable con un plásmido que lleva la secuencia codificadora de luciferasa interrumpida por un intrón 2 mutado de la �-globina humana (Gene Tools, Philomath, OR). Otras líneas celulares se obtuvieron de la ATCC (Manassas, VA). Los PMOs se marcaron en 3' con fluoresceína como se describe en el Ejemplo 1. Para evitar artefactos, todas las imágenes de fluorescencia se tomaron de células vivas, y no se usó agente de fijación ni medios de montaje.
En las cuatro líneas celulares, las imágenes de fluorescencia de las células tratadas con 705-FL (SEC ID Nº2) solo, o con una mezcla de PMO 705-FL no conjugado y R9F2-C (SEC ID Nº13), estaban esencialmente desprovistas de fluorescencia. En las células tratadas con el conjugado R9F2-C-PMO, se observó fluorescencia en el 100% de las células, aunque los patrones variaban entre las diferentes líneas celulares como sigue. Las células NIH3T3 tenían una fluorescencia citosólica y nuclear muy brillante y difusa con menos zonas punteadas que otras líneas celulares. Las células HeLa tenían mayormente fluorescencia difusa con más zonas punteadas distinguibles que NIH3T3. Las células HeLa S3 se vio que tenían una fluorescencia citosólica difusa menos intensa pero con una zona fluorescente muy brillante localizada cerca del o en el núcleo. Las células Jurkat tenían el menor nivel de fluorescencia de estas líneas celulares.
La asociación del conjugado con las células es un proceso bastante rápido. Como se muestra en la Fig. 5A, la fluorescencia de las células incubadas con R9F2-CPMO aumentó con los minutos y alcanzó la intensidad máxima entre los 30 y 45 minutos en un periodo de estudio de 900 minutos. La fluorescencia de las células incubadas a 37ºC era similar a las incubadas a 17ºC en un intervalo de concentraciones de 0,1 a 5 �M (Fig. 5B). La adsorción resultó ser saturable, con un aumento en la fluorescencia observada entre 0,1 y 1 �M, pero no entre 1 y 5 �M.
Como se ha publicado previamente (Moulton, Hase et al. 2003), la mayor parte del péptido Tat que se llega a asociar con las membranas celulares no penetra en el interior. Debido a que el conjugado unido a la membrana puede mejorar artificialmente la aparición de fluorescencia celular, se usó un tratamiento con tripsina en el presente caso para reducir o eliminar la contribución del conjugado unido a la membrana (Moulton, Hase et al. 2003; Richard, Melikov et al. 2003).
Por tanto, se incubaron células HeLa o NIH3T3 con el conjugado, y seguidamente se trataron con tripsina, como se describe abajo en Materiales y Métodos, se lavaron y se volvieron a sembrar en placas. Las células tratadas con tripsina tenían mucha menos fluorescencia que las células no tratadas con tripsina (Fig. 6), aunque los patrones de fluorescencia eran similares.
Como se muestra también en la Fig. 6, ambos conjugados con L-transportador y D-transportador dieron perfiles de asociación y penetración idénticos; por tanto, la disminución en la fluorescencia tras el tratamiento con tripsina no puede atribuirse únicamente a la digestión por parte de la tripsina del péptido R9F2C. Esto sugiere que el conjugado se asocia con proteínas de membrana, que son digeridas por la tripsina.
Habiendo demostrado que la tripsina puede eliminar eficazmente la mayor parte del péptido unido a la membrana, los factores que afectan a la penetración del conjugado pudieron estudiarse en las células tratadas con tripsina por citometría de flujo. Como se muestra en la Fig. 7A, se observan aumentos graduales de fluorescencia, debidos a la penetración del conjugado, hasta los 700 minutos desde la incubación. Se ve también que la penetración es dependiente de la temperatura y la concentración, como se muestra en la Fig. 7B. El perfil que se muestra en la Fig. 7B es similar al mostrado por el marcador de endocitosis FM4-64 (un colorante lipofílico fluorescente que marca la membrana plasmática y a continuación sufre endocitosis de manera dependiente del tiempo, temperatura y energía). La penetración del conjugado se inhibió casi completamente en las células pre-incubadas con el inhibidor metabólico NaN3, lo que indica que la penetración del conjugado de péptido-PMO es un proceso dependiente de energía.
B. Actividad Antisentido en Cultivo Celular
Se ensayaron varios conjugados de oligómero-resto transportador conforme a la invención para determinar su actividad antisentido in vitro (Ejemplo 6). Los datos que se describen abajo se obtuvieron dirigiendo una secuencia de corrección de corte y empalme de �-globina fusionada a luciferasa. Específicamente, el ensayo utiliza células HeLa transfectadas de manera estable con el plásmido pLuc/705, que tiene un gen de luciferasa interrumpido por un intrón de �-globina humana mutado en el nucleótido 705, causando así un corte y empalme incorrecto. Un oligonucleótido antisentido que se dirige al sitio de corte y empalme 705, cuando se suministra eficazmente, corrige el corte y empalme y permite la expresión de la luciferasa. Para una descripción adicional del plásmido y el ensayo, véanse, por ejemplo, Kang, Cho et al. 1998; Yoo, Sazani et al. 1999. Dado que el núcleo celular es el sitio de corte y empalme del pre-mARN, estos datos demuestran el suministro del oligómero al núcleo celular.
Se ha demostrado previamente que un conjugado de PMO antisentido de 18 monómeros (SEC ID Nº1) con el oligopéptido rTat(57-49) (SEC ID Nº12) inhibe el corte y empalme aberrante en este ensayo (Moulton, Hase et al. 2003). Se llevaron a cabo ensayos comparativos usando conjugados de rTat(57-49) y conjugados que contenían moléculas de transporte de la invención, como se muestra en la Fig. 8.
Como se muestra en la Figura, un conjugado que consistía en un PMO antisentido enlazado, por un resto de cisteína, al péptido que tiene la secuencia Arg9Phe2 (R9F2, SEC ID Nº13), era mucho más eficaz suprimiendo el corte y empalme aberrante que los conjugados que contenían los péptidos rTat(57-49) (RRRQRRKKR) y R9, enlazados también al PMO por un resto de cisteína.
La Fig. 9 proporciona el nivel de células HeLa viables tras 24 horas de incubación con varios de estos conjugados a una concentración de 25 �M, mostrando la baja toxicidad de los conjugados.
Las Figs. 10-14 muestran el efecto de varias modificaciones estructurales del transportador en la actividad antisentido de los conjugados de PMO-transportador. En cada figura, los resultados se expresan en unidades de luz relativas referidas a microgramo de proteína, basadas en la expresión de luciferasa en el ensayo pLuc705 descrito anteriormente. En los conjugados representados en estas figuras, el PMO está ligado, por un resto de cisteína, al extremo C-terminal o lado derecho de la secuencia del transportador según se ha escrito, y al extremo 5', o lado izquierdo según se ha escrito, del PMO.
La Fig.10 muestra el efecto de variar la naturaleza o longitud del segmento hidró
filo del transportador. Como se muestra, los transportadores que contenían fenilalanina
(Phe o F) resultaron ser más eficaces que los transportadores que contenían isoleuci
5 na (Ile o I). El aumento de la longitud del segmento hidrófobo de 2 a 3 y a 4 subunidades aminoacídicas no se vio que aumentara la eficacia.
El número total de argininas en el transportador resulta ser importante, a la vista
de los datos que se muestran en la Fig. 11. Como se muestra en ella, en los oligopép
tidos de la serie RnF2, los oligopéptidos donde n era 6 o menos eran mucho menos
10 eficaces que aquellos donde n era 8 ó 9. Véase también Moulton, Nelson et al., 2004, que se incorpora a la presente memoria en su totalidad por referencia. Como se muestra en la Fig. 12, la posición del segmento hidrófobo puede alterarse. En los datos representados por F2R9, el segmento R9 está en el extremo C-terminal y está ligado al PMO. De manera importante, los datos demuestran que la
15 secuencia de las subunidades catiónicas puede ser no contigua (R5F2R4). Se proporcionan más ejemplos en la Fig. 15, más abajo. La Tabla 2 abajo muestra el nivel de producción de luciferasa (esto es, actividad antisentido) en células HeLa pLuc705 tras 24 horas de incubación con los conjugados R9F2-PMO, enlazados por un grupo enlazador escindible o un grupo enlazador no es
20 cindible de longitud variable, donde en cada caso el PMO estaba ligado por un resto de cisteína al extremo C-terminal del transportador peptídico. Las estructuras de los grupos enlazadores bifuncionales usados en este estudio se muestran en la Fig. 13. Como se muestra en la Tabla, el uso de un grupo enlazador escindible (disulfuro) (véase, por ejemplo, la Fig. 4C), no tuvo un efecto importante sobre la actividad. Véase
25 también Moulton, Nelson at aI., 2004.
Tabla 2. Efecto del grupo enlazador sobre la actividad antisentido de los conjugados R9F2-C-PMO (705-FL).
- Tratamiento
- Tipo de grupo enlazador Longitud del grupo enlazador (Å) RLU/�g de proteína (intervalo)
- Vehículo control (H2O)
- N/A N/A 1 (0,1)
- R9F2C-705-FL
- tio-maleimida 6,8 102 (4,9)
- R9F2C-EMCS-705-FL
- tio-maleimida 9,4 141 (4,3)
- R9F2C-KMUS-705-FL
- tio-maleimida 15,7 171 (14,3)
- R9F2C-SMPB-705-FL
- tio-maleimida 11,6 123 (2,1)
- R9F2C-SMCC-705-FL
- tio-maleimida 11,6 86 (1,4)
- Tratamiento
- Tipo de grupo enlazador Longitud del grupo enlazador (Å) RLU/�g de proteína (intervalo)
- R9F2C-SBAP-705-FL
- tio-éter 6,2 98 (3,2)
- R9F2C-SPDP-705-FL
- disulfuro 6,8 109 (2,9)
- R9F2C-LCSPDP-705-FL
- disulfuro 15,6 181 (7,8)
Como se muestra en la Figura 14, la ligación de biotina al conjugado (biotina
R9F2-PMO) se vio que aumentaba la actividad a dosis altas tras 6 horas de incubación
(no se muestra), pero no se vio efecto, o muy poco, a las 24 horas.
5 Se realizaron experimentos adicionales para evaluar el efecto de la posición del segmento hidrófobo y del punto de ligación del PMO en el transportador. Las Figs. 15 y 16 muestran los resultados del ensayo pLuc/705 llevado a cabo con los conjugados de PMO 705 (SEC ID Nº1) enlazado a los péptidos de transporte que tienen las SEC ID Nº13 y 16-26 como se muestra en la Tabla 1. En cada conjugado, el PMO está en
10 lazado por un resto de cisteína (C) C-terminal o interno. Como demuestran los datos, los transportadores en los que las subunidades Y eran internas (esto es, flanqueadas por subunidades X) funcionaron en general tan bien o mejor que aquellas en las que las subunidades Y están en un extremo. El punto de enlace podía estar adyacente a las subunidades Y o alejado de las subunidades Y.
15 Para determinar si la presencia del transportador afecta adversamente la especificidad antisentido del PMO, como se ha observado para los transportadores Tat (Moulton, Hase et al. 2003), el ensayo se llevó a cabo con los conjugados R9F2-C-PMO de tres PMOs de control con secuencias faltas de apareamiento, designadas 7052MM (dos faltas de apareamiento, SEC ID Nº2), 7054MM (cuatro faltas de apa
20 reamiento, SEC ID Nº3) y 705SCR (revuelta, SEC ID Nº4) (véase la Tabla 1 para ver la secuencias). Hasta con la concentración más alta ensayada, los tres conjugados de control no mostraron actividad antisentido; esto es, no restauraron la actividad luciferasa corrigiendo el defecto en el sitio de corte y empalme 705 (Figura 17). Por consiguiente, no hubo indicación de efectos adversos sobre la especificidad por parte del
25 transportador.
La microscopía de fluorescencia y el ensayo de corrección del corte y empalme se usaron también para determinar el tiempo requerido por el conjugado para entrar en el citoplasma y núcleo de las células. Se trataron células HeLa, NIH3T3 o HeLapLuc/705 con el conjugado R9F2-C-PMO durante 20 minutos y se adquirieron las imá30 genes. Se usó una tinción nuclear, dihidroetidio (DHE, Molecular Probes, Eugene, OR), para localizar el núcleo. Se vio fluorescencia verde difusa en el citoplasma y en el
núcleo, y superpuesta con el rojo intenso del DHE en el núcleo.
En el ensayo de corrección del corte y empalme, la producción de luciferasa funcional se monitorizó con el tiempo, demostrándose que la luciferasa se producía tan solo después de 120 minutos de incubación con R9F2-C-705-PMO (Fig. 18).
C. Actividad Antisentido en Sistemas Libres de Células
Para investigar la actividad antisentido de los conjugados de manera independiente del transporte celular, se ensayaron PMOs conjugados con péptidos y no conjugados en un sistema de traducción libre de células, para determinar su capacidad para bloquear estéricamente la traducción de un gen reportero más allá del extremo 3'. Los efectos de varios PMOs antisentido sobre la traducción de ARN transcrito in vitro a partir de plásmidos que contenían varias secuencias de nucleótidos virales fusionadas directamente antes del extremo 5' de la región codificadora de la luciferasa de luciérnaga (fLUC), se midieron mediante reacciones de traducción in vitro en un sistema comercialmente disponible de productos de lisis de reticulocitos de conejo (RRL, del inglés "rabbit reticulocyte lysate"), como se describe en el Ejemplo 9. Específicamente, se fusionaron tres regiones diferentes del virus de tipo 2 del Dengue al gen fLUC y a una región que rodea el codón de iniciación AUG del gen c-myc humano. También se eligió como diana una secuencia del virus de la hepatitis murina (MHV, del inglés "murine hepatitis virus") que rodea el codón de inicio del gen 1ab (Neuman, B.W, et al., J. Virol. 2004, en imprenta).
Como se muestra en las Figuras 21-23 y 28, se descubrió que la conjugación de los oligómeros antisentido a los transportadores peptídicos de la invención aumentaba la eficacia de los PMOs antisentido por un factor de entre 10 y 500 veces, según quedó reflejado por la concentración requerida para alcanzar un 50% de inhibición de la expresión de la secuencia diana (EC50). La conjugación a R9F2 mejoró la eficacia antisentido del PMO en comparación con el PMO no conjugado por un factor tan alto como 500 veces (Figuras 21-23). Como se muestra en la Figura 28, se obtuvieron resultados similares usando el péptido (RAhxR)4 (SEC ID Nº34) conjugado a un PMO antic-myc (SEC ID Nº5).
Aunque el alcance de la invención no está limitado por el mecanismo, la actividad antisentido mejorada observada con los conjugados peptídicos de la invención en los sistemas de traducción libres de células, pueden deberse a una disrupción localizada de la estructura secundaria del ARN por parte del péptido. Una construcción usada en los ensayos con RRL, pDCLD, contiene las 204 bases más hacia el extremo 5' del genoma del virus del Dengue, que codifican los 35 aminoácidos iniciales de la poliproteína, colocada en el mismo marco de lectura que el gen fLUC. La estructura del ARN predicha por ordenador para esta región, que se muestra en la Figura 29, y que se generó usando el programa de replegado de ARN "mfold" (Zuker 2003), indica abundante estructura secundaria. La estructura secundaria que se muestra en la Figura 29 coincide también con la predicha por Khromykh et al. para la misma región de un flavivirus distinto pero relacionado, el virus Kunjin (Khromykh, Kondratieva et al. 2003).
La capacidad de los PMOs antisentido no conjugados para hibridarse y bloquear la traducción puede inhibirse por ciertas estructuras secundarias, como resulta ser el caso para este segmento de ARN, como se muestra en la Figura 23. En este ejemplo, el PMO no conjugado fue incapaz de producir un 50% de reducción de la traducción a pesar de aumentar su concentración. Sin embargo, el PMO conjugado con el péptido R9F2 tiene una actividad antisentido enormemente mejorada, produciendo cerca del 100% de supresión de la traducción del gen reportero a la misma concentración (Fig. 23).
D. Biodistribución in vivo
Los experimentos con cultivos de tejidos de varios sistemas experimentales demostraron claramente que los péptidos de transporte de la invención mejoran el suministro a los compartimentos intracelulares, incluyendo el citoplasma y el núcleo. Para extrapolar estas observaciones a un sistema in vivo, se realizó un análisis comparativo de incorporación de PMO y PMO conjugado en células de bazo y nódulos linfáticos en ratones. Como se describe en el Ejemplo 10 y se muestra en la Figura 27, el péptido de transporte R5F2R4 (SEC ID Nº20) mejoró enormemente el suministro a las células del bazo y nódulos linfáticos en total, y a subpoblaciones específicas de células de estos tejidos, incluyendo linfocitos positivos CD4 y CD8, monocitos, macrófagos y células
B. Además, como se describe en el Ejemplo 10, se demostró que los PMOs conjugados con péptidos tenían un tiempo de residencia importante en las células de bazo y derivadas de nódulos linfáticos cuatro días después de que hubiera terminado un régimen de tratamiento con multidosis de PMO en ratones.
III. Aplicaciones
Los transportadores y conjugados de la invención son particularmente útiles para dirigir un oligómero antisentido sustancialmente sin carga, tal como un PMO, a un núcleo celular, exponiendo la célula a un conjugado que comprende el oligómero enlazado covalentemente a un péptido de transporte como se describe anteriormente. Los transportadores son eficaces para suministrar el oligómero antisentido a través de ambas membranas celular y nuclear, y para mejorar la actividad antisentido del oligómero, como se ha demostrado anteriormente.
El suministro nuclear permite dirigirse a sitios de corte y empalme, lo que puede implementarse para generar proteínas dominantes/negativas, que conserven, por ejemplo, la función de retroalimentación de una proteína, pero no su actividad enzimática. Esto se consigue inhibiendo selectivamente sitios donadores o aceptores de corte y empalme en el pre-mARN que eliminan del mRNA maduro cortado y empalmado uno
o más exones que codifican funciones no deseadas. Las dianas génicas adecuadas para esta estrategia incluyen, pero sin limitarse a ellas, CD86, c-FLlP, CTLA-4, TGF-b y c-myc.
El sitio de iniciación de la traducción (esto es, el codón de iniciación AUG) es otra diana útil para la terapia antisentido, como lo son los elementos que actúan en cis requeridos para la replicación o transcripción viral.
La inhibición de la replicación viral puede conseguirse bloqueando la traducción de proteínas virales esenciales, o dirigiéndose a regiones del genoma viral requeridas para la replicación de ácidos nucleicos o para la transcripción del mARN. Estos elementos que actúan en cis se localizan con frecuencia en las regiones no traducidas (UTRs, del inglés "untranslated regions") del genoma viral y se encuentran típicamente en uno de los extremos 5' y 3' del genoma, o en ambos. Los ejemplos de estos elementos incluyen sitios internos de entrada al ribosoma (IRES, del inglés "internal ribosome entry sites") como los que se encuentran en el virus de la hepatitis C (VHC), secuencias reguladoras de la transcripción (TRS, del inglés "transcriptional regulatory sequences") como las que se encuentran en el coronavirus humano que causa el síndrome sistémico respiratorio adquirido (SARS, del inglés "systemic acquired respiratory síndrome"), secuencias de ciclación (CS, del inglés "cyclization sequences") como las que se encuentran en flavivirus, y el sitio de unión del cebador tARN (PBS, del inglés "primer binding site") encontrado en retrovirus tales como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Con frecuencia, estos elementos tienen características estructurales secundarias abundantes y son recalcitrantes a la unión de los oligómeros antisentido. Se cree que la conjugación de los péptidos como se describe en la presente memoria a oligómeros antisentido sustancialmente sin carga permite la disrupción de tales estructuras secundarias y mejoró así la unión de los oligómeros a sus dianas. Por tanto, los métodos y composiciones de la invención descritos en la presente memoria proporcionan la capacidad de alcanzar más eficazmente estas regiones de los geno-mas virales e inhibir la replicación viral.
Los conjugados de PMO encuentran uso, en general, en cualquier indicación en la que se desee el suministro de un oligonucleótido a una célula, incluyendo las aplicaciones antisentido. Tales indicaciones incluyen, pero sin limitarse a ellas, trastornos proliferativos o isquemia, dirigiéndose a p53; enfermedad del riñón poliquístico, reste
nosis, y cáncer, dirigiéndose a c-myc; inflamación pulmonar o choque séptico, dirigiéndose a TNF-�; alteración del metabolismo de los fármacos, dirigiéndose a las enzimas P450; cáncer de próstata, dirigiéndose al receptor de �-HCG o andrógenos, glioblastoma, dirigiéndose a la integrina �V. El tratamiento de células pluripotenciales con oli5 gonucleótidos antisentido dirigidos a genes que se expresan preferencialmente en tales células, puede usarse también para el tratamiento del cáncer (por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE.UU. en tramitación junto con la presente y otorgada en propiedad común con el solicitante de la presente 09/679,475; Publicación PCT Nº WO 01/25405). El tratamiento de enfermedades infecciosas usando oligonucleótidos anti10 sentido dirigidos a genes virales o secuencias que actúan en cis implicadas en la replicación o transcripción, pueden usarse como tratamientos terapéuticos antivirales (por ejemplo, las Solicitudes de Patentes de los EE.UU. en tramitación junto con la presente y otorgadas en propiedad común con el solicitante de la presente 10/272,865, publicación nº US 2002/0171335; 10/422,671, publicación nº US 2003/0224353; 15 60/493,990; 60/493,043; 60/514,064; y 60/532,701). El tratamiento de ciertas afecciones inmunológicas puede facilitarse usando oligonucleótidos antisentido conjugados con péptidos que pueden proporcionar el suministro intracelular específicamente a linfocitos sin tratar o activados (por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE.UU. en tramitación junto con la presente y otorgada en propiedad común con el solicitante de
20 la presente 60/505,418). Los conjugados son particularmente útiles en el tratamiento de trastornos proliferativos vasculares tales como restenosis. Las áreas de lesión de los vasos incluyen, por ejemplo, restenosis o estrechamiento repetido del lumen vascular después de una intervención vascular, tal como la angioplastia con balón de la arteria coronaria, con o
25 sin inserción de stent. Se cree que la restenosis se produce en aproximadamente un 30% a un 60% de las lesiones tratadas por angioplastia y en aproximadamente un 20% de las lesiones tratadas con stents, de 3 a 6 meses después del procedimiento (véase, por ejemplo, Dev, N.B. et at. Cathet. Cardiovasc. Diagn. 45(3):337-45, 1998). La estenosis puede producirse también después de una operación para hacer un by
30 pass en la arteria coronaria, en la que se realiza cirugía cardiaca para redirigir, o hacer pasar por un bypass, la sangre alrededor de las arterias obstruidas y mejorar el suministro de sangre y oxígeno al corazón. En tales casos, la estenosis puede producirse en los segmentos de vasos sanguíneos transplantados, y particularmente, en el punto de unión de los vasos reemplazados. La estenosis puede producirse también en las
35 anastomosis creadas para diálisis. En este aspecto, se emplea un conjugado de PMO, que se dirige preferiblemente a c-myc, en un stent revestido, en una solución de impregnación para el tratamiento de las venas safenas, o suministrado de otra forma en el sitio de la lesión vascular. Las composiciones en microburbujas, tal como se describe más abajo, se han encontrado particularmente útiles en el suministro de moléculas ligadas, tales como oligonucleótidos, en áreas de trombosis o lesión vascular, por ejemplo, en endotelio dañado (véanse, por ejemplo, Kipshidze et al., 2001, 2002; Kim et al. 2001; Publicación PCT Nº WO 2000/02588) así como en órganos seleccionados tales como el hígado y el riñón. Una composición anti-restenosis preferida es un PMO anti-c-myc (por ejemplo, SEC ID Nº5) conjugado con un péptido de transporte (RAhxR)4 (SEC ID Nº34) mediante un grupo enlazador Ahx-�Ala (como se muestra en la Fig. 4D).
IV. Composiciones que Contienen Conjugados de PMO-Transportador y Suspensiones Portadoras en forma de Microburbujas
Se ha comprobado que las suspensiones acuosas de microburbujas que contienen gas insoluble son vehículos eficaces para el suministro de oligonucleótidos, incluyendo los PMOs, como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU. otorgadas en propiedad común con el solicitante de la presente 5,849,727 y 6,117,858 y la Solicitud de Patente de los EE.UU. en tramitación 10/668.988. En general, la composición comprende una suspensión líquida, preferiblemente una suspensión acuosa, de microburbujas que contienen un gas insoluble en sangre. Las microburbujas tienen preferiblemente de 0,1 a 10 �m de diámetro. En general, puede usarse cualquier gas insoluble en sangre que sea no tóxico y gaseoso a la temperatura corporal. El gas insoluble debería tener un coeficiente de difusión y solubilidad en sangre más bajos que el nitrógeno o el oxígeno, que difunden en la atmósfera interna del vaso sanguíneo. Son ejemplos de gases útiles los gases nobles, por ejemplo, helio o argón, así como gases fluorocarbonados y hexafluoruro de azufre. En general, se prefieren los gases perfluorocarbonados, tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropano, perfluorobutano y perfluoropentano.
Las microburbujas gaseosas se estabilizan mediante un revestimiento fluido filmógeno, para evitar la coalescencia y para proporcionar una interfase para la unión de moléculas a las microburbujas. El fluido es preferiblemente una solución o suspensión acuosa de uno o más componentes seleccionados entre proteínas, tensioactivos, lípidos, incluyendo fosfolípidos, y polisacáridos. En realizaciones preferidas, los componentes se seleccionan entre proteínas, compuestos tensioactivos, y polisacáridos. Las proteínas adecuadas incluyen, por ejemplo, albúmina, gamma globulina, apotransferrina, hemoglobina, colágeno, y ureasa. Se prefieren las proteínas humanas, por ejemplo, albúmina de suero humana (HSA, del inglés "human serum albumin").
Los tensioactivos convencionales incluyen compuestos tales como alcoholes de poliéteres alquílicos, alcoholes de poliéteres alquilfenólicos, y etoxilatos de alcohol, que tienen grupos alquilo superiores (por ejemplo, 6-20 átomos de carbono), alcanolamidas de ácidos grasos o aductos de óxido de alquileno de las mismas, y monoésteres de glicerol de ácidos grasos. Los tensioactivos particularmente proyectados para usarse en las composiciones de agentes de contraste en forma de microburbujas se describen, por ejemplo, en las Patentes de Nycomed Imaging US 6,274,120 (ácidos grasos, ésteres polihidroxialquílicos tales como ésteres de pentaeritritol, etilenglicol o glicerol, alcoholes y aminas grasos, y ésteres o amidas de los mismos, aldehídos y cetonas lipofílicos, derivados lipofílicos de azúcares, etc.), US 5,990,263 (PEG terminado en metoxi acilado con, por ejemplo, 6-hexadecanoiloxihexadecanoilo), y US 5,919,434.
Pueden usarse también otros polímeros filmógenos sintéticos; véanse, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. Nos. 6,068,857 (Weitschies) y 6,143,276 (Unger), que describen microburbujas que tienen una cubierta polimérica biodegradable, donde el polímero se selecciona entre, por ejemplo, poli(ácido láctico), un polímero de acrilato, poliacrilamida, policianoacrilato, un poliéster, poliéter, poliamida, polisiloxano, policarbonato, o polifosfazeno, y varias composiciones de copolímeros de los mismos, tales como un copolímero de ácido láctico-ácido glicólico.
Tales composiciones se han usado como agentes de contraste para ultrasonido diagnóstico, y se han descrito también para aplicaciones terapéuticas, tales como mejora de la penetración de fármacos (Tachibana et al. Patente de los EE.UU. Nº 5,315,998), como trombolíticos (Porter, Patente de los EE.UU. Nº 5,648,098), y para el suministro de fármacos (Unger, Patente de los EE.UU. Nº 6,143,276; Klaveness et al., Patente de los EE.UU. Nº 6,261,537; Porter et al., Patente de los EE.UU. Nº 6,117,858).
En una realización, el portador es una suspensión de microburbujas de dextrosa/albúmina que contienen perfluorocarbono conocida como PESDA (del inglés, "perfluorocarbon-exposed sonicated dextrose/albumin", dextrosa/albúmina sonicada expuesta a perfluorocarbono). La albúmina de suero humana (HSA) se metaboliza fácilmente en el cuerpo y ha sido ampliamente utilizada como agente de contraste. La composición puede prepararse como se describe en las Patentes de los EE.UU. en propiedad común con el solicitante de la presente 5,849,727 y 6,117,858. Brevemente, se sonica una solución de dextrosa/albúmina a la vez que se perfunde con el gas fluorocarbonado. Las microburbujas se forman preferiblemente en ambiente de N2 agotado, preferiblemente libre de N2, típicamente introduciendo un gas con N2 agotado (en comparación con el aire ambiental) o libre de N2 en la interfase entre la sonda de sonicación y la solución. Se ha comprobado que las microburbujas formadas de esta forma son significativamente más pequeñas y estables que las formadas en presencia de aire ambiental. (Véase, por ejemplo, Porter et al., Patente de los EE.UU. Nº 6,245,747.)
Las microburbujas se conjugan con un compuesto que va a ser suministrado, tal como un conjugado de PMO-transportador, simplemente incubando la suspensión de microburbujas, con agitación si es necesario, con una formulación líquida del compuesto. La incubación puede llevarse a cabo a temperatura ambiente, o a temperaturas moderadamente más altas, siempre que no se comprometa la estabilidad del fármaco o las microburbujas. Se cree que los compuestos incubados con tales suspensiones se unen no covalentemente en la interfase entre gas y fluido de las microburbujas, y que, tras la administración, la propiedad del gas insoluble (por ejemplo, perfluorocarbono) de fluidizar la membrana celular mejora la entrada en la célula para el compuesto.
V. Oligonucleótidos Antisentido Modificados
En otro aspecto, la invención proporciona oligómeros antisentido que están modificados con restos con carga de estructura R1N=C(NH2)R2, donde R1 es H ó R, y R2 es R, NH2,NHR, ó NR2, donde R es alquilo inferior o alquenilo inferior y puede incluir además oxígeno o nitrógeno; R1 y R2 pueden formar juntos un anillo; y el resto de la cadena lateral está enlazado a la subunidad aminoacídica mediante R1 ó R2. Específicamente, el oligómero comprende una secuencia de subunidades conectadas por uniones intersubunidad, donde la secuencia de subunidades soporta una secuencia de bases eficaz para hibridarse con un polinucleótido diana de secuencia complementaria, para formar un dúplex diana/antisentido; y, portado sobre al menos seis uniones intersubunidad contiguas, un resto con carga como se describe anteriormente. En una realización preferida, los restos con carga se seleccionan independientemente del grupo que consiste en guanidilo (-HN=C(NH2)NH-), amidinilo (-C(=NH)(NH2)), 2-aminohexahidropirimidilo (=HN-CH(NH2)NH-), 2-aminopiridinilo (-C(-N)(NH2)), y 2aminopirimidonilo (-HN-C(NH2)=N-) (véase la Fig. 3).
Preferiblemente, el oligómero es un oligómero sin carga. Los ejemplos de oligómeros antisentido sin carga se muestran en las Figs. 19A-G. Puede incorporarse también a los oligómeros un número pequeño de uniones con carga, por ejemplo, fosforotioato o, más preferiblemente, fosforoamidato con carga, preferiblemente menos de una unión con carga por cada cuatro uniones sin carga. Las uniones sin carga que se muestran en la Fig. 19 incluyen uniones carbonato (19A, R=O) y carbamato (19A, R=NH2); uniones alquilfosfonato y fosfotriéster (19B, R=alquilo u O-alquilo); uniones amida (19C); sulfonas (19D, R1, R2 = CH2); sulfonamidas (19D, R1=NH, R2=CH2, o viceversa); sulfamatos (19D, R1, R2 = NH); tioformacetilo (19E) y 3'-metilen-Nmetilhidroxiamino (19F). Los tipos preferidos de oligómeros antisentido sin carga incluyen oligonucleótidos con enlaces alquilfosfonato, fosfotriéster y fosforamidato o fosforodiamidato. En las Figs. 19A-G, B representa un resto de purina o pirimidina que forma pares de bases, eficaz para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido, preferiblemente seleccionado entre adenina, citosina, guanina, timina y uracilo. Aunque las Figs. 19A-F representan anillos de desoxirribosa, las subunidades pueden comprender también, por ejemplo, anillos de ribosa sustituidos o anillos de morfolino, como se describe anteriormente.
En una realización preferida, el oligómero comprende subunidades de morfolino, por ejemplo, como se muestra en la Fig. 1, enlazadas por uniones de tipo fosforodiamidato, como se muestra en la Fig. 2B. En este caso, el resto con carga está preferiblemente ligado al átomo de fósforo de la unión, mediante el grupo lateral X, que es típicamente amino.
Por ejemplo, la Fig. 20 muestra la preparación de un oligómero de morfolino con enlaces fosforodiamidato que tiene una cadena lateral de tipo amino modificada. Los PMOs se sintetizan convenientemente mediante subunidades de morfolino activadas en 5' que tienen protegido un nitrógeno del morfolino, como se muestra, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. Nº 5,185,444. Tales subunidades, que tienen cadenas laterales de dialquilamino, pueden almacenarse a baja temperatura durante meses antes de usarse (véase, por ejemplo, Summerton y Weller, Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195, 1997). Como se describe, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. Nº 5,378,841, que se incorpora a la presente memoria por referencia, una subunidad así, que tiene una cadena lateral de dimetilamino, se preparó por reacción de la subunidad de 5'-hidroxi-morfolino N-protegida con diclorofosfato de dimetilamino (POCI2N(CH3)2). Tales dicloruros fosforoamídicos N-sustituidos (POCI2NRR') pueden prepararse por reacción de la amina deseada, por ejemplo, dimetilamina-HCl en este caso, con oxicloruro de fósforo.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención. Materiales y Métodos Síntesis de Péptidos y Morfolinos
Todos los péptidos fueron sintetizados, por encargo, por Global Peptide Services (Ft. Collins, CO) o en AVI BioPharma (Corvallis, OR) y se purificaron a >90% de pureza (véase el Ejemplo 2 abajo). Los PMOs se sintetizaron en AVI BioPharma conforme a métodos conocidos, como se describe, por ejemplo, en Summerton y Weller, 1993, 1997, y la Patente de los EE.UU. Nº 5,185,444.
Cultivo Celular
HeLa pLuc/705 (Kang, Cho et al. 1998) es la línea celular HeLa S3 transfectada de manera estable con un plásmido que lleva la secuencia que codifica la luciferasa interrumpida por un intrón 2 mutado de la �-globina humana (Gene Tools, Philomath, OR). Otras líneas celulares se obtuvieron de la ATCC (Manassas, VA). Todas las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con glutamina 2mM, 100 �g/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina (DME/F12) y suero bovino fetal (FBS, del inglés "fetal bovine serum") (Hyclone, Ogden, UT) al 10%. Todos los ensayos se llevaron a cabo con células en crecimiento exponencial en medio de cultivo que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10% a menos que se especifique lo contrario. Microscopía de Fluorescencia
Las células se dispusieron en una placa de 48 pocillos. Al día siguiente se retiró el medio condicionado y se añadieron a los pocillos las sustancias a ensayar en medio de nueva aportación. Tras la incubación, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS, del inglés "phosphate-buffered saline") tres veces y se visualizaron directamente en el medio de cultivo con un microscopio invertido Nikon Diaphot 300. Las imágenes se capturaron con una cámara digital Olympus conectada a un ordenador usando el software MagnaFire (Optronics, Goleta, CA). Fluorometría
Se trataron células HeLa pLuc705 dispuestas en una placa de 48 pocillos con medio que contenía la sustancia a ensayar. Tras la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS.
Para medir la suma de la fluorescencia unida a membrana con la que había penetrado, las células se lisaron directamente en los pocillos por adición de 100 �l de tampón de lisis celular (Promega, Madison, WI) a cada pocillo. Se recogieron los productos de la lisis celular. La fluorescencia total se determinó mezclando 20 �l de los productos de la lisis celular y 80 �l de Na2CO3 0,1 M (pH 11) y midiendo con un lector de microplacas para fluorescencia/luminiscencia FIx 800 con excitación a 485 nm y emisión a 524 nm.
Para medir el conjugado que había penetrado, el conjugado unido a membrana se eliminó por tratamiento con tripsina, como sigue. Se añadió tripsina (100 �l, 10%, Hyclone, Logan, UT) a cada pocillo y se incubó durante 6 minutos a 37ºC, y a continuación se añadieron 300 �l de medio de cultivo. Las células se centrifugaron y se lavaron con PBS y seguidamente se lisaron con 100 �l de tampón de lisis celular. La fluorescencia de los productos de lisis celular se midió como se describe anteriormente.
Citometría de Flujo
Para analizar la penetración de los conjugados de péptido-PMO marcados con fluoresceína por citometría de flujo, se trataron las células HeLa pLuc705 en una placa de 48 pocillos con medio que contenía la sustancia a ensayar. Tras la incubación, las células se lavaron tres veces con PBS, y se añadieron 100 �l de tripsina (véase arriba) a cada pocillo, y a continuación se incubó durante 6 minutos a 37ºC y se añadieron 300 �l de medio de cultivo. Las células se centrifugaron y se lavaron una vez con PBS, y seguidamente se resuspendieron en 500 �l de un tampón que contenía PBS con FBS al 1% y NaN3 al 0,2%. Los datos de flujo se recogieron usando un citómetro BD FACSCalibur™, y los datos se analizaron usando FCS Express 2 (De Novo Software, Thornhill, Ontario, Canadá). Ensayos de traducción libres de células
Plásmidos. Se subclonó la secuencia que codifica la luciferasa de luciérnaga (fLUC) en el sitio de clonación múltiple del plásmido pCi-Neo (Promega) en los sitios SalIy NotI y el plásmido resultante se denominó pCNlucr. Subsiguientemente, se subclonaron dos regiones de nucleótidos diferentes del virus tipo 2 del Dengue (DEN2, número de entrada en GenBank AY037116) en los sitios NheIy SalI de pCNlucr. Esto colocó las secuencias de DEN2 inmediatamente antes del codón de iniciación del gen fLUC. Se construyeron dos plásmidos diferentes: pCNDEN3'Cslucr, que contenía los nucleótidos 10606 a 10646 de DEN2, y pCNDEN5'Cslucr, que contenía los nucleótidos 119 a 161 de DEN2. Los PMOs dirigidos hacia estas regiones (DEN3'CS y DEN5'CS) se indican en la Tabla 1 como SEC ID Nos. 7 y 6, respectivamente.
Se construyó en el mismo vector (pCNlucr) una construcción similar usando una porción del genoma del virus de la hepatitis murina (MHV), insertando los nucleótidos 188 a 230 de MHV (número de entrada de GenBank AF029248) en los sitios Nhely SaIl de pCNlucr. Este fragmento de MHV contiene los nucleótidos -22 a +21 con relación a la "A" del AUG del gen Orf 1 a de MHV y genera una proteína de fusión con el gen reportero de luciferasa. El PMO que se dirige a esta región es la SEC ID Nº9.
Se preparó una cuarta construcción plasmídica (pDCLD) usando un vector derivado de pUC que colocaba una porción mayor de la secuencia de DEN2 (número de entrada de GenBank U87411, nucleótidos 1 a 204), que contenía el extremo 5' de la secuencia que codifica la poliproteína de DEN2, inmediatamente antes del extremo 3' y en el mismo marco de lectura del gen fLUC. Un PMO que se dirige a esta región (DEN AUG) se indica como SEC ID Nº8 en la Tabla 1. El PMO DEN AUG se dirige al codón de iniciación de la poliproteína de DEN2 y su diana está resaltada en la Figura 29 (nucleótidos 87-106).
Se creó una quinta construcción plasmídica con una región de 30 pares de bases que rodea el codón de iniciación ATG del gen c-myc humano (5'AGCCTCCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTA-3', SEC ID Nº42, número de entrada de GenBank V00568) subclonada en los sitios NheIy SaIl de pCNlucr y se denominó pCNmycluc. Esto colocó las secuencias que codifican c-myc en el marco de lectura de las secuencias del gen fLUC que codifican los aminoácidos (c-myc:fLUC). Un PMO dirigido a esta región de c-myc, designado AVI-4126, se indica como SEC ID Nº5.
Transcripción y traducción. Todos los plásmidos descritos anteriormente incluyen el promotor de la ARN polimerasa de T7 antes del extremo 3' de las secuencias virales y de fLUC y permiten que se produzca el ARN a partir de estos plásmidos, tras linearizarlos con NotIo SnaBI, usando el kit y el protocolo Megascript (Ambion) basado en la polimerasa de T7.
Los ensayos de traducción in vitro se llevaron a cabo usando ARN transcrito, a una concentración final de 1 nM en cada reacción, con 12 �l de productos de lisis de reticulocitos de conejo tratados con nucleasa (Promega), además de PMO, R9F2-PMO,
o agua. La mezcla de reacción de traducción (10 �l) se mezcló seguidamente con 50 �l del reactivo para ensayo de luciferasa (Promega) según instrucciones del fabricante, y la emisión de luz se leyó en un luminómetro de microplacas FLx 800 (BIOTEC Instruments). Las reacciones se ensayaron para determinar las unidades relativas de luz con el programa KC Junior (BIO-TEC) usando la función de luminiscencia y un ajuste de sensibilidad de 125. En los experimentos aquí descritos, se ensayaron doce reacciones al mismo tiempo, incluyendo las reacciones de control en agua en el primer y último pocillo de cada fila. Las unidades relativas de luz (RLU, del inglés "relative light units") producidas por cada reacción se refirieron a la media de todas las reacciones de control y se expresaron como el porcentaje de inhibición de la expresión de luciferasa, o bien como unidades relativas de luz en función de la concentración de PMO, como se describe en el Ejemplo 8.
Digestión por Proteasa de los Conjugados de Péptido-PMO
Los experimentos para medir la resistencia de los conjugados de péptido-PMO a la digestión por proteasa se realizaron como sigue. Se colocó proteinasa K (10 unidades) en 0,1 ml de tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,2), CaCl2 5 mM y se añadieron 40 �g de conjugado de péptido-PMO (R9F2-C-705) (SEC ID Nº13- C-SEC ID Nº1). Después de 5 minutos o de 2 horas a 37ºC, las muestras se congelaron en hielo seco hasta su análisis por espectroscopía de masas MALDI-TOF.
Ejemplo 1. Incorporación de fluorescencia 3' a un PMO
Se disolvió una carboxifluoresceína protegida y activada, por ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimida y dipivalato de 6-carboxifluoresceína, comercialmente disponible de Berry&Associates, Inc. (Dexter, MI), en NMP (0,05 M), y la solución se añadió a una columna de síntesis de PMOs (véase "Síntesis de Morfolinos", arriba) en un volumen suficiente para cubrir la resina. La mezcla se incubó a 45ºC durante 20 minutos, y a continuación la columna se purgó y se añadió una segunda porción similar de carboxifluoresceína protegida y activada a la columna y se incubó a 45ºC durante 60 minutos. La columna se purgó y se lavó con NMP, y el oligómero se escindió de la resina usando 1 ml de solución de escisión (ditiotreitol 0,1 M en NMP que contenía trietilamina al 10%). La resina se lavó tres veces con 300 �l de solución de escisión, e inmediatamente se añadieron 4 ml de hidróxido de amonio concentrado y se incubó 16 horas a 45ºC para retirar los grupos protectores de las bases. El oligómero de morfolino se precipitó añadiendo 8 volúmenes de acetona, la mezcla se centrifugó, y el sedimento se lavó con 15 ml de CH3CN. El sedimento lavado se disolvió de nuevo en 4 ml de H2O y se liofilizó. El producto se analizó por espectrometría de masas MALDI-tiempo de vuelo (MALDI-TOF, del inglés "time of flight") y cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC, del inglés "high pressure Iiquid chromatography"). Ejemplo 2. Síntesis Peptídica y Ligación del Péptido de Transporte
Los péptidos se sintetizaron por Síntesis Peptídica en Fase Sólida Fmoc, denominada en la presente memoria SPPS (del inglés "Solid Phase Peptide Synthesis"). Se utilizó una resina de alcohol p-benciloxibencílico para la síntesis de péptidos con un ácido C-terminal, mientras que para las amidas peptídicas se usó una resina Rink Amide MBHA. Ambas resinas están disponibles en Novabiochem (San Diego, CA). Un ciclo típico de síntesis comenzaba con la desprotección N-terminal mediante piperidina al 20%. A continuación, los aminoácidos protegidos con N-�-Fmoc se acoplaban a la cadena peptídica creciente por activación con hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU, del inglés "2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3tetramethyluronium hexafluorophosphate") en presencia de N,N-diisopropiletilamina (DlEA). Las cadenas laterales de arginina se protegieron con el grupo protector 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo (Pbf), de cisteína con tritilo, y las cadenas laterales de lisina con t-butoxicarbonilo (Boc). El ciclo se repitió hasta que se añadieron todos los aminoácidos, en dirección carboxi a amino, en la secuencia deseada. La escisión de la resina de síntesis y la desprotección de las cadenas laterales se llevó a cabo simultáneamente tratando la peptidil-resina con una solución de H2O al 2,5%, triisopropilsilano (TIS) al 2,5% y ácido trifluoroacético (TFA) al 95%. Para los péptidos que contenían un resto de cisteína, se añadió 1,2-etanoditiol (EDT) al 2,5% a la mezcla de escisión. Los péptidos brutos se aislaron por precipitación con un exceso de diez volúmenes de dietiléter.
Para la purificación se usó HPLC de fuerte intercambio iónico utilizando la resina Source 15S (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), y a continuación una desalinización en fase inversa empleando la resina Amberchrom 300M (Tosoh Bioscience, Montgomeryville, PA). Los péptidos desalados se liofilizaron y se analizaron para determinar su identidad y pureza por espectrometría de masas (MS, del inglés "mass spectrometry") MALDI-TOF, HPLC de fuerte intercambio iónico (SCX) y electroforesis capilar (CE, del inglés "capillary electrophoresis").
Los péptidos que contienen varias uniones hidrófobas en el extremo C-terminal se prepararon como sigue. Los péptidos se prepararon para su condensación directa con un grupo amina o hidroxi del PMO mediante la inclusión de combinaciones de aminoácidos naturales y/o no naturales en el extremo C-terminal del péptido durante la SPPS. Específicamente, las uniones se componían de los aminoácidos glicina, betaalanina, y/o ácido 6-aminohexanoico, usados en combinaciones diferentes de uno o dos restos. La síntesis de los péptidos fue por lo demás idéntica a la síntesis de otros ácidos peptídicos.
Las secuencias peptídicas que contienen cadenas laterales con grupos amino, tales como rTat y pTat (Tabla 1), se prepararon usando el grupo protector de cadenas laterales con grupos amino 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)etilo (Dde). Los grupos lisina-Dde resistieron la escisión de la resina y la desprotección de los grupos protectores de otras cadenas laterales aminoacídicas. Estas aminas de las cadenas laterales permanecen enmascaradas por Dde durante la conjugación con el PMO, y se desprotegen subsiguientemente por tratamiento con hidrazina al 2% en DMF.
La ligación en 5' de un péptido de transporte mediante un enlace de tipo amida se realizó como sigue. Se preparó un éster de benzotriazolilo de un péptido para hacer reactivo su extremo C-terminal disolviendo el ácido peptídico (15 �mol), HBTU (14,25 �mol) y HOBt (15 �mol) en 200 �l de NMP y se añadió DIEA (22,5 �mol). Inmediatamente después de la adición de DIEA, la solución peptídica se añadió a 1 ml de una solución 12 mM de 3'-acetil-PMO, funcionarizado en 5' con piperazina, en DMSO. Después de 180 minutos a 30ºC, la reacción se diluyó con agua a cuatro veces su volumen. El conjugado bruto se purificó primero a través de una columna de intercambio catiónico débil de CM-Sepharose (Sigma, St. Louis, MO), para retirar el PMO no conjugado, y seguidamente a través de una columna de fase inversa (columna HLB, Waters, Milford, MA). El conjugado se liofilizó y se analizó por MS-MALDI-TOF, SCX
HPLC, y CE.
Ejemplo 3. Acetilación en 3' del PMO y Ligación en 5' del Péptido de Transporte
Se añadió anhídrido acético (0,1 M), disuelto en N-metil-2-pirrolidinona (NMP) que contenía N-etil-morfolina al 1% (v/v), a un producto de síntesis de PMO cuando el oligómero estaba todavía unido a la resina de síntesis. Después de 90 minutos a temperatura ambiente, el oligómero se lavó con NMP, se escindió de la resina de síntesis, y se concluyó como se describe anteriormente. El producto se analizó por espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI-TOF) y HPLC. El producto deseado incluía un grupo acetilo en posición 3' y se protegió en su extremo 5' con piperazina, que se usó para la conjugación, como se describe más abajo y se muestra en la Fig. 4A.
El reactivo enlazador, éster de N-(�-maleimidobutiriloxi)succinimida (GMBS), se disolvió en 50 �l de DMSO, y la solución se añadió al oligómero (2-5 mM) en tampón fosfato sódico (50mM, pH 7,2) en una proporción en moles de PMO/GMBS de 1:2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos, y el producto se precipitó usando un exceso de 30 volúmenes de acetona, y seguidamente se disolvió de nuevo en agua. El aducto de PMO-GMBS se liofilizó y se analizó por MALDITOF y HPLC. El aducto se disolvió a continuación en tampón fosfato (50mM, pH 6,5, EDTA 5 mM) que contenía CH3CN al 20%, y se añadió el péptido de transporte, en una proporción en moles de péptido a PMO de 2:1 (basada en una concentración de PMO determinada por su absorbancia a 260nm). La reacción se agitó a temperatura ambiente en oscuridad durante 2 horas. El conjugado se purificó primero a través de una columna de intercambio catiónico de CM-Sepharose (Sigma, St. Louis, MO), para retirar el PMO no conjugado, y seguidamente a través de una columna de fase inversa (columna HLB, Waters, Milford, MA). El conjugado se liofilizó y se analizó por MALDITOF y electroforesis capilar (CE). El producto final contenía aproximadamente un 70% de material que correspondía al PMO de longitud completa conjugado al péptido de transporte, componiéndose el resto de conjugados de secuencias más cortas, una pequeña cantidad de PMO no conjugado, de longitud completa y en fragmentos, y una cantidad muy pequeña (aproximadamente un 2%) de péptido no conjugado. La determinación de la concentración usada en todos los experimentos se basó en la absorbancia total a 260 nm, incluyendo todas las secuencias de PMO más cortas en la muestra. Ejemplo 4. Ligación en 3' del Péptido de Transporte
Se disolvió un PMO que tenía una amina secundaria libre (nitrógeno del anillo de morfolina) en el extremo 3' (véase la Fig. 4B) en tampón fosfato sódico 100 mM, pH 7,2, para obtener una solución 2-5 mM. El reactivo enlazador, GMBS, se disolvió en 100 �l de DMSO y se añadió a la solución de PMO en una proporción de PMO/GMBS de 1:2. La mezcla se agitó a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 min, y seguidamente se pasó a través de una columna de filtración en gel P2 (Biorad) para retirar el exceso de GMBS y los productos secundarios de la reacción.
El aducto GMBS-PMO se liofilizó y se disolvió de nuevo en tampón fosfato 50 mM, pH 6,5 para obtener una solución 2-5 mM. Se añadió un péptido de transporte, representado por T-SH en la Fig. 4B, a la solución de GMBS-PMO en una proporción en moles de péptido a PMO de 2:1. (El tiol –SH es la cadena lateral de un único resto de cisteína.) La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas o a 4ºC durante una noche. El conjugado se purificó pasándolo a través de una columna de filtración en gel de Excellulose (Pierce Chemical) para retirar el exceso de péptido, a continuación a través de una columna de intercambio catiónico de CM-Sepharose (Sigma) para retirar el PMO no conjugado, y finalmente a través de una columna de fase inversa Amberchrom (Rohm and Haas) para retirar la sal. El conjugado se liofilizó y se caracterizó por MS y HPLC. Ejemplo 5. Preparación de un Conjugado de PMO-Péptido que Tiene un Grupo Enlazador Escindible
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 3 o el Ejemplo 4, empleando 3-(2piridilditio)propionato de N-succinimidiIo (SPDP) o succinimidiloxicarbonil-�-metil-�-(2piridilditio)tolueno (SMPT) como reactivo enlazador (véase la Fig. 4C), en lugar de GMBS. Ejemplo 6. Incorporación de Conjugados de PMO-Péptido Marcados
Se transfectaron de manera estable células HeLa con el plásmido pLuc/705, que tiene un gen de luciferasa interrumpido por un intrón de la �-globina humana mutado en el nucleótido 705, causando así un corte y empalme incorrecto (Kang et al., 1998; Kole et al., 2001; Yan et al., 2002). Debido a que los transcritos cortados y empalmados incorrectamente no producen proteínas reporteras funcionales, no se observan señales del reportero a menos que se induzca el corte y empalme original con un oligómero corrector del corte y empalme. Un oligómero antisentido que se dirige al sitio de corte y empalme 705 (que tiene la SEC ID Nº1, también designada "PMO 705"), cuando se suministra eficazmente, corrige el corte y empalme y permite la expresión de la luciferasa.
Este ensayo mide la capacidad de los oligómeros bloqueadores estéricos para entrar en las células y los núcleos, bloquear el corte y empalme incorrecto del premARN, y ocasionar así la expresión de un gen reportero. Evita la confusión de la cito-toxicidad con la actividad que puede afectar a los ensayos de regulación por disminución, ya que las células deben ser capaces de llevar a cabo el procesamiento y traducción del ARN para producir una señal. Debido a que los oligómeros deben entrar en las células y en los núcleos de las células para producir una señal en el ensayo, resulta muy útil para medir la incorporación y la eficacia de los restos de suministro. Además, como no hay señal, o hay muy poca, antes de la corrección del corte y empalme, el ensayo tiene una relación favorable de señal frente a ruido. Estas lecturas inequívocamente positivas permiten hacer comparaciones cuantitativas convenientes entre los efectos de diferentes transportadores sobre el suministro del oligómero (Moulton et al., 2003, Astriab-Fisher et al., 2002).
El transcurso de la incorporación de varios conjugados de PMO-transportador con fluoresceína, como se describe anteriormente, en células HeLa pLuc/705, se estudió por espectroscopia de fluorescencia. Los experimentos se realizaron generalmente por triplicado. Según el procedimiento general, se añadió el medio de cultivo que contenía la sustancia a ensayar en una concentración especificada a las células HeLa pLuc/705 dispuestas en una placa de 48 pocillos. Tras la incubación, en cada tiempo, las células se lavaron con PBS tres veces, y el producto de lisis de las células se recogió como se describe en el apartado "Fluorometría", arriba. La cantidad de luciferasa funcional se determinó mezclando 30 �l del producto de lisis celular y 50 �l del Reactivo para Ensayo de Luciferasa (LAR, del inglés "Luciferase Assay Reagent") (Promega, WI) y midiendo la producción de luz usando un lector de microplacas para fluorescencia/luminiscencia FIx 800 (Bio-tek, Vermont). Las unidades relativas de luz se refirieron a �g de proteína determinados por el método del ácido bicincónico (BCA, del inglés "bicinchonicic acid"), siguiendo el procedimiento del fabricante (Pierce, IL). Ejemplo 7. Preparación de PMO que Tiene Uniones Intersubunidad Modificadas
A. Preparación de Cl2P(O)NH-(CH2)n-NH-C(=NH)-NH2
Se pone a reflujo durante 12 horas una suspensión que contiene 0,1 mol de RNH2-HCI, donde R = -(CH2)n-NH-C(=NH)-NH2 (por ejemplo, hidrocloruro de 2aminoetilguanidina), en 0,2 mol de oxicloruro de fósforo (POCI3) y seguidamente se destila a presión reducida para dar la diclorofosforamida N-sustituida.
B. Preparación de la Subunidad de Morfolino Activada
Se disolvió 1 mmol de una subunidad 5'-hidroxilada, con la base protegida y tritilada en el nitrógeno del morfolino (Estructura 1, Fig. 20), preparada por métodos estándar (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº 5,378,841), en 5 ml de diclorometano. Se añaden 6 mmol de N-etilmorfolina y 2 mmol de Cl2P(O)NH-(CH2)n-NHC(=NH)-NH2, preparado como se describe arriba, y a continuación 0,5 mmol de N-metilimidazol. Cuando la reacción ha terminado, según se evalúa por cromatografía de capa fina, la mezcla de reacción se lava con NaH2P04 acuoso y se concentra. El residuo se separa en fracciones en una columna de gel de sílice, eluyendo con acetona/cloroformo en proporción 1:4, para dar la subunidad activada (Estructura 2, Fig. 20).
C. Oligomerización
El monómero activado 2 se hace reaccionar con una subunidad unida a un soporte por el O en 5' para dar el dímero 3 unido al soporte. El dímero se somete a destritilación y se hace reaccionar de manera similar con más subunidades activadas preparadas del modo descrito anteriormente. Ejemplo 8. Los PMOs Conjugados con Péptidos Presentan Propiedades Mejoradas de Bloqueo Estérico en Reacciones de Traducción Libres de Células en Comparación con el PMO no Conjugado
Para investigar la actividad antisentido de los conjugados de manera independiente del transporte celular, se ensayaron PMOs conjugados con péptidos y no conjugados en un sistema de traducción libre de células, para determinar su capacidad para bloquear estéricamente la traducción de un gen reportero más allá del extremo 5'.
El efecto de varios PMOs antisentido y conjugados de PMO y péptido sobre la traducción in vitro de ARN libre de células, transcrito in vitro a partir de plásmidos que contenían varias secuencias virales de nucleótidos fusionadas directamente antes del extremo 5' de la región codificadora de la luciferasa de luciérnaga (fLUC), se midió en un sistema de productos de lisis de reticulocitos de conejo (RRL). Como se muestra en las Figs. 21-23, la conjugación de R9F2 (SEC ID Nº13) a los PMOs aumentó la eficacia de los PMOs antisentido por un factor comprendido entre 10 y 500, basado en la concentración requerida para alcanzar un 50% de inhibición de la expresión de la diana. Las Figuras 21-23 representan los resultados de estos análisis usando tres regiones diferentes del virus de tipo 2 del Dengue fusionadas al gen fLUC, como se describe anteriormente en Materiales y Métodos. La región del genoma de ARN del virus del Dengue usada en la construcción pDCLD se sabe que tiene abundante estructura secundaria (Khromykh, Kondratleva et al., 2003), como se muestra en la Figura 29.
Se colocó una construcción plasmídica con una región de 30 pares de bases que rodea el codón de iniciación ATG del gen c-myc humano en el marco de lectura de las secuencias del gen fLUC que codifican los aminoácidos (c-myc:fLUC). Un PMO dirigido a esta región de c-myc, AVI-4126, se indica como SEC ID Nº5. La Figura 28 muestra el efecto antisentido mejorado que la conjugación del péptido (RAhxR)4 confiere al PMO dirigido a c-myc en el sistema de RRL de traducción in vitro.
También se obtuvieron resultados dirigiéndose a una secuencia de MHV que rodea el codón de iniciación del gen 1ab (Neuman, B.W. et al., J. Virol. (2004), en imprenta). En todos los casos descritos anteriormente, la conjugación con R9F2 mejoró la eficacia antisentido del PMO en comparación con el PMO no conjugado por un factor tan alto como 500. Ejemplo 9. Los Péptidos de Transporte que Contienen Aminoácidos No Naturales Muestran un Suministro Mejorado dentro de las Células, Actividad Antisentido Mejora-da y Resistencia a la Proteólisis Enzimática
Se investigó la incorporación celular y la actividad antisentido, usando el ensayo de corrección del corte y empalme en la posición 705 descrito en el Ejemplo 6, para varios conjugados de la invención que comprendían PMOs conjugados con péptidos que contenían dímeros de aminoácidos catiónicos alternados con ácido 6aminohexanoico (Ahx). En la Figura 24 se muestran los datos para varios de estos conjugados que emplean péptidos de transporte que contienen Ahx (SEC ID Nos. 3335 y 37-41). La Figura 24 muestra el nivel de producción de luciferasa en células HeLa pLuc/705 tras 24 horas de tratamiento con cada uno de las siguientes composiciones: el PMO (705-FL, SEC ID Nº1) conjugado con R9F2 (SEC ID Nº13), (RRAhx)4 (SEC ID Nº33), (RAhxR)4 (SEC ID Nº34), (AhxRR)4 (SEC ID Nº35), (RAhxR)3 (SEC ID Nº37), (RAhxR)2R (SEC ID Nº38), (RAhxR)2 (SEC ID Nº39), (RKAhx)4 (SEC ID Nº40), o (RHAhx)4 (SEC ID Nº41). Se observó que los péptidos de transporte que contenían Ahx, que tenían al menos ocho restos de arginina, funcionaban tan bien o mejor que R9F2 en este ensayo.
Se investigó también la sensibilidad a proteasa de los péptidos de transporte, como sigue. Cada uno de los conjugados de péptido-PMO, R9F2-705-FL y (RAhxR)4705-FL, se mezcló con Proteinasa K en 100 �l de tampón Tris 50 mM, CaCl2 5 mM. La muestra se incubó a 37ºC durante 5 minutos o, en un análisis diferente, 2 horas, y seguidamente se colocó sobre hielo seco hasta su análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF. Los resultados se muestran en las Figuras 25 y 26, respectivamente.
La Fig. 25 muestra que el péptido de transporte que contenía todos los aminoácidos naturales, R9F2-C (pico de MW a 8331), no era resistente a la degradación por proteinasa K, ya que se convirtió rápidamente en el PMO libre de péptido (pico de MW a 6632). El conjugado de R9F2-C-PMO también era sensible a la degradación por tripsina (datos no mostrados). La Fig. 26 muestra que el péptido de transporte que contenía Ahx, (RAhxR)4 (pico de MW a 8332), era resistente a la degradación por proteinasa K. Ejemplo 10. Distribución y Biodisponibilidad in vivo del PMO Conjugado a Péptido Comparado con el PMO No Conjugado
Los resultados en cultivos de tejidos de varios sistemas experimentales demuestran claramente que los péptidos de transporte descritos en la presente invención mejoran el suministro a los compartimentos intracelulares, incluyendo el citoplasma y el núcleo. Para extrapolar estas observaciones a un sistema in vivo, se realizó un análisis comparativo de incorporación de PMO y PMO conjugado con un péptido en células de bazo y nódulo linfático en ratones.
Se inyectaron por vía intravenosa (vena de la cola) 0,5 ml de PBS que contenía 150 �g de un PMO marcado en 3' con fluoresceína (secuencia revuelta DSscr, 5'-AGT CTC GAC TTG CTA CCT CA-3'-FL; SEC ID Nº10), o el mismo PMO conjugado con R9F2R4 (SEC ID Nº20) a través de un grupo enlazador de cisteína en el extremo 5' (R9F2R4-C-DSscr-FL), a hembras de ratón Y10A adultas de 9 meses (F1 de B10.A y A.B1; dos ratones por tratamiento). Después de 24 horas, los ratones se sacrificaron, se sacaron el bazo y cuatro nódulos linfáticos de cada ratón, se prepararon suspensiones celulares individuales y se analizaron sin teñir para detectar la fluorescencia por citometría de flujo. El aparato se configuró para detectar linfocitos por dispersión frontal/lateral.
La Figura 27 muestra que las células de los bazos y los nódulos linfáticos tenían una incorporación sustancialmente mayor del PMO conjugado con el péptido (R9F2R4PMO-FL) en comparación con el PMO no conjugado (PMO-FL). Además, los esplenocitos se tiñeron para detectar subpoblaciones diferentes de linfocitos mediante marcadores de superficie celular específicos (CD4 y CD8 para linfocitos, CD19 para células B y CD11b para monolitos/macrófagos). Se realizaron análisis de citometría de flujo de los linfocitos teñidos para detectar la fluorescencia del PMO marcado con fluoresceína. Todas estas subpoblaciones mostraron una incorporación mejorada del PMO conjugado con péptido en comparación con el PMO no conjugado, como se muestra en la Figura 27.
El efecto de múltiples inyecciones de PMO conjugado con péptido sobre la incorporación relativa y tiempo de residencia in vivo se analizó como sigue. Se inyectaron por vía intravenosa (vena de la cola) 150 �g de R5F2R4-C-DSscr-FL a hembras de ratón Y10A de nueve meses (n=3) en los días 0, 3, 5, y 7. Once días después de las inyecciones, los ratones se sacrificaron y se prepararon suspensiones celulares individuales del bazo y cuatro nódulos linfáticos de cada ratón. El análisis de citometría de flujo sin tinción de ambas preparaciones celulares se realizó como se describe anteriormente. Un porcentaje considerable de esplenocitos (6,6% ± 2,6) y linfocitos (4,3% ± 0,7) resultó positivo con respecto a la incorporación de R5F2R4-C-DSscr-FL.
Tabla del Listado de Secuencias
Claims (11)
1. Un método para mejorar la capacidad de un oligómero antisentido de morfolino para unirse a una secuencia diana en un ácido nucleico, según se pone de manifiesto por (i) una disminución en la expresión de una proteína codificada, con relación
5 a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un codón de iniciación de la traducción de la proteína codificada, o ii) un aumento en la expresión de una proteína codificada, con relación a la observada con el oligómero no conjugado, cuando la unión del oligómero antisentido a su secuencia diana es eficaz para bloquear un sitio aberrante
10 de corte y empalme en un pre-mARN que codifica dicha proteína cuando se corta y empalma correctamente, y donde el oligómero antisentido está compuesto por subunidades de morfolino enlazadas mediante uniones que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente, y que tiene una cadena principal sustancialmente
15 sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, comprendiendo dicho método la conjugación al oligómero antisentido de un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de las secuencias (RRY)x ó (RYR)x, donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)-(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7.
- 20 2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho oligómero de morfolino se conjuga a dicho péptido mediante un resto enlazador.
3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho aminoácido neutro es ácido 6-aminohexanoico.
4. El método de la reivindicación 1, en el que el péptido tiene la fórmula (RYR)4.
- 25 5. El método de la reivindicación 1, en el que el péptido tiene la fórmula (RRY)4, y el análogo de ácido nucleico se enlaza a una subunidad Y terminal.
6. El método de la reivindicación 1, en el que dichas subunidades de morfolino están unidas por uniones de tipo fosforodiamidato sin carga, conforme a la estructura:
donde Y1=O, Z=O, Pj es un resto de purina o pirimidina que forma pares de bases eficaz para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi, o alquilamino incluyendo dialquilamino.
7. Un oligómero antisentido de morfolino compuesto por subunidades de morfolino enlazadas por uniones que contienen fósforo entre el nitrógeno del morfolino de
5 una subunidad y un carbono exocíclico en la posición 3 del morfolino de una subunidad adyacente, y que tiene una cadena principal sustancialmente sin carga y una secuencia de bases dirigida a una diana, y enlazado covalentemente al oligómero antisentido, un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de las secuencias (RRY)x ó (RYR)x,
10 donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)-(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7.
8. Un método para mejorar la incorporación celular de un oligómero antisentido de morfolino, comprendiendo el método conjugar con el agente un péptido portador que consta de 8 a 16 restos de aminoácido y que contiene una de las secuencias
15 (RRY)x ó (RYR)x, donde x= 2 a 4, e Y es un aminoácido neutro de fórmula -C(O)(CH2)n-NH-, donde n es de 2 a 7.
9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho oligómero de morfolino se conjuga a dicho péptido mediante un resto enlazador.
- 10.
- El método de una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que dicho 20 aminoácido neutro es ácido 6-aminohexanoico.
11. El método de la reivindicación 8, en el que el péptido tiene la fórmula (RYR)4.
12. El método de la reivindicación 8, en el que el péptido tiene la fórmula (RRY)4, y el análogo de ácido nucleico se enlaza a una subunidad Y terminal.
- 13.
- El método de la reivindicación 8, en el que dichas subunidades de morfolino 25 están unidas por uniones de tipo fosforodiamidato sin carga, conforme a la estructura:
donde Y1=O, Z=O, Pj es un resto de purina o pirimidina que forma pares de bases eficaz para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi, o alquilamino incluyendo dialquilami
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US20040082509A1 (en) | 1999-10-12 | 2004-04-29 | Christophe Bonny | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
US8183339B1 (en) | 1999-10-12 | 2012-05-22 | Xigen S.A. | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
DE602004028930D1 (de) * | 2003-04-29 | 2010-10-14 | Avi Biopharma Inc | Zusammensetzungen zur verbesserung der antisense-wirksamkeit und des transports von nukleinsäureanalog in zellen |
US20050222068A1 (en) * | 2003-10-23 | 2005-10-06 | Mourich Dan V | Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells |
US20050203041A1 (en) * | 2003-09-23 | 2005-09-15 | Mourich Dan V. | Antisense compound and method for selectively killing activated T cells |
US20050171044A1 (en) * | 2003-12-24 | 2005-08-04 | Stein David A. | Oligonucleotide compound and method for treating nidovirus infections |
WO2005072527A2 (en) * | 2004-01-23 | 2005-08-11 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense oligomers and methods for inducing immune tolerance and immunosuppression |
US20050288246A1 (en) | 2004-05-24 | 2005-12-29 | Iversen Patrick L | Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method |
ES2361325T3 (es) | 2004-06-28 | 2011-06-16 | The University Of Western Australia | Oligonucleótidos antisentido para inducir la omisión de exón y métodos de uso de los mismos. |
USRE48960E1 (en) | 2004-06-28 | 2022-03-08 | The University Of Western Australia | Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof |
EP1766012B1 (en) | 2004-07-02 | 2011-05-25 | AVI BioPharma, Inc. | Antisense antibacterial method and compound |
US8129352B2 (en) * | 2004-09-16 | 2012-03-06 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection |
US8357664B2 (en) * | 2004-10-26 | 2013-01-22 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection |
EP1656951A1 (en) * | 2004-11-12 | 2006-05-17 | Xigen S.A. | Conjugates with enhanced cell uptake activity |
US20100256041A1 (en) * | 2004-11-12 | 2010-10-07 | Christophe Bonny | Conjugate Molecule Compounds With Enhanced Cell Uptake Activity |
AU2006213686A1 (en) * | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Avi Bio Pharma, Inc. | Antisense composition and method for treating muscle atrophy |
US20060240032A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-26 | Hinrichs David J | Immunomodulating compositions and methods for use in the treatment of human autoimmune diseases |
US7790694B2 (en) * | 2005-07-13 | 2010-09-07 | Avi Biopharma Inc. | Antisense antibacterial method and compound |
US8067571B2 (en) | 2005-07-13 | 2011-11-29 | Avi Biopharma, Inc. | Antibacterial antisense oligonucleotide and method |
WO2007009094A2 (en) * | 2005-07-13 | 2007-01-18 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antibacterial method and compound |
US8524676B2 (en) * | 2005-09-08 | 2013-09-03 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Method for treating enterovirus or rhinovirus infection using antisense antiviral compounds |
WO2007030576A2 (en) * | 2005-09-08 | 2007-03-15 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection |
WO2007031098A1 (en) * | 2005-09-12 | 2007-03-22 | Xigen S.A. | Cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway |
US8080517B2 (en) * | 2005-09-12 | 2011-12-20 | Xigen Sa | Cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway |
US8501704B2 (en) | 2005-11-08 | 2013-08-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Immunosuppression compound and treatment method |
US8785407B2 (en) * | 2006-05-10 | 2014-07-22 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection |
US20070265215A1 (en) * | 2006-05-11 | 2007-11-15 | Iversen Patrick L | Antisense restenosis composition and method |
CN101583274A (zh) * | 2006-12-29 | 2009-11-18 | 雷文斯治疗公司 | 使用反向序列hiv-tat多肽的运输分子 |
CA2675665C (en) * | 2007-01-19 | 2018-02-13 | Kai Pharmaceuticals, Inc. | Modifications of peptide compositions to increase stability and delivery efficiency |
WO2009005793A2 (en) * | 2007-06-29 | 2009-01-08 | Avi Biopharma, Inc. | Tissue specific peptide conjugates and methods |
US20100016215A1 (en) | 2007-06-29 | 2010-01-21 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
WO2009086469A2 (en) * | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Avi Biopharma, Inc. | Immunomodulatory agents and methods of use |
EP2119783A1 (en) * | 2008-05-14 | 2009-11-18 | Prosensa Technologies B.V. | Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means |
WO2009143864A1 (en) * | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Xigen S.A. | Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory digestive diseases |
WO2009143865A1 (en) * | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Xigen S.A. | Use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases |
PL3133160T3 (pl) | 2008-10-24 | 2019-06-28 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Kompozycje do pomijania eksonów w DMD |
US8592386B2 (en) * | 2008-12-17 | 2013-11-26 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis |
WO2010072228A1 (en) | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Xigen S.A. | Novel transporter constructs and transporter cargo conjugate molecules |
US8603966B2 (en) * | 2009-02-27 | 2013-12-10 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Amino acid-based compounds, their methods of use, and methods of screening |
US20120156138A1 (en) * | 2009-04-14 | 2012-06-21 | Smith Larry J | Methods and Compositions for the Treatment of Medical Conditions Involving Cellular Reprogramming |
US9296785B2 (en) | 2009-04-17 | 2016-03-29 | Wake Forest University Health Sciences | IL-13 receptor binding peptides |
US20110269665A1 (en) | 2009-06-26 | 2011-11-03 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
WO2011026139A1 (en) * | 2009-08-31 | 2011-03-03 | Gen-Probe Incorporated | Dengue virus assay |
KR102239374B1 (ko) | 2009-11-12 | 2021-04-14 | 더 유니버시티 오브 웨스턴 오스트레일리아 | 안티센스 분자 및 이를 이용한 질환 치료방법 |
AU2010319314C1 (en) | 2009-11-13 | 2016-09-01 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection |
US20120309684A1 (en) * | 2009-11-30 | 2012-12-06 | Isis Innovation Limited | Conjugates for delivery of biologically active compounds |
JP5457813B2 (ja) * | 2009-12-16 | 2014-04-02 | ルネサスエレクトロニクス株式会社 | Adpll回路、半導体装置及び携帯情報機器 |
WO2011084694A1 (en) | 2009-12-17 | 2011-07-14 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Stabilized stat3 decoy oligonucleotides and uses therefor |
EP2545173A2 (en) * | 2010-03-12 | 2013-01-16 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense modulation of nuclear hormone receptors |
ES2816898T3 (es) | 2010-05-13 | 2021-04-06 | Sarepta Therapeutics Inc | Compuestos que modulan la actividad de señalización de las interleucinas 17 y 23 |
US9050373B2 (en) | 2010-05-13 | 2015-06-09 | The Charlotte-Mecklenburg Hospital Authority | Pharmaceutical compositions comprising antisense oligonucleotides and methods of using same |
JP2013530154A (ja) | 2010-05-28 | 2013-07-25 | サレプタ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 修飾されたサブユニット間結合および/または末端基を有するオリゴヌクレオチドアナログ |
WO2011160653A1 (en) | 2010-06-21 | 2011-12-29 | Xigen S.A. | Novel jnk inhibitor molecules |
US8198429B2 (en) | 2010-08-09 | 2012-06-12 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection |
US10017763B2 (en) | 2010-09-03 | 2018-07-10 | Sarepta Therapeutics, Inc. | dsRNA molecules comprising oligonucleotide analogs having modified intersubunit linkages and/or terminal groups |
US9150618B2 (en) | 2010-10-14 | 2015-10-06 | Xigen Inflammation Ltd. | Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of chronic or non-chronic inflammatory eye diseases |
KR102339196B1 (ko) | 2011-05-05 | 2021-12-15 | 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 | 펩타이드 올리고뉴클레오타이드 접합체 |
US9161948B2 (en) | 2011-05-05 | 2015-10-20 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Peptide oligonucleotide conjugates |
WO2013033407A2 (en) | 2011-08-30 | 2013-03-07 | The Regents Of The University Of California | Identification of small molecules that enhance therapeutic exon skipping |
US20130085139A1 (en) | 2011-10-04 | 2013-04-04 | Royal Holloway And Bedford New College | Oligomers |
JP2015500204A (ja) | 2011-11-18 | 2015-01-05 | サレプタ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 機能的に修飾されたオリゴヌクレオチドおよびそのサブユニット |
WO2013091670A1 (en) | 2011-12-21 | 2013-06-27 | Xigen S.A. | Novel jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases |
NZ700399A (en) | 2012-03-20 | 2016-07-29 | Sarepta Therapeutics Inc | Boronic acid conjugates of oligonucleotide analogues |
WO2014011177A1 (en) * | 2012-07-12 | 2014-01-16 | Smith Holdings, Llc | Antisense p53 phosphorodiamidate morpholino composititons, methods and indications |
JP6449231B2 (ja) | 2013-03-14 | 2019-01-09 | サレプタ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 筋ジストロフィを処置するためのエキソンスキッピング組成物 |
KR20200139271A (ko) | 2013-03-15 | 2020-12-11 | 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 근육 이영양증의 치료를 위한 개선된 조성물 |
EP3560502A1 (en) | 2013-04-12 | 2019-10-30 | The Curators of the University of Missouri | Smn2 element 1 antisense compositions and methods and uses thereof |
US10624948B2 (en) | 2013-06-26 | 2020-04-21 | Xigen Inflammation Ltd. | Use of cell-permeable peptide inhibitors of the JNK signal transduction pathway for the treatment of various diseases |
WO2014206427A1 (en) | 2013-06-26 | 2014-12-31 | Xigen Inflammation Ltd. | New use of cell-permeable peptide inhibitors of the jnk signal transduction pathway for the treatment of various diseases |
WO2015197097A1 (en) | 2014-06-26 | 2015-12-30 | Xigen Inflammation Ltd. | New use for jnk inhibitor molecules for treatment of various diseases |
CA2948373A1 (en) | 2014-05-16 | 2015-11-19 | Oregon State University | Antisense antibacterial compounds and methods |
WO2015179249A1 (en) | 2014-05-19 | 2015-11-26 | Geller Bruce L | Antisense antibacterial compounds and methods |
RU2020142530A (ru) | 2014-05-23 | 2021-04-26 | Джензим Корпорейшн | Множественные олигонуклеотидные фрагменты на пептидном носителе |
EP3240794A4 (en) | 2014-12-31 | 2018-10-31 | Oregon State University | Antisense antibacterial compounds and methods |
MA41795A (fr) | 2015-03-18 | 2018-01-23 | Sarepta Therapeutics Inc | Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine |
US11020417B2 (en) | 2015-06-04 | 2021-06-01 | Sarepta Therapeutics, Inc | Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions |
EP3359668A4 (en) * | 2015-10-09 | 2019-06-05 | Sarepta Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF |
AU2016379399B2 (en) | 2015-12-23 | 2022-12-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antisense antibacterial compounds and methods |
EP3394262B1 (en) | 2015-12-23 | 2024-08-28 | Oregon State University | Antisense antibacterial compounds and methods |
KR102522059B1 (ko) | 2016-04-18 | 2023-04-14 | 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 | 안티센스 올리고머, 및 산성 알파-글루코시다제 유전자와 연관된 질환을 치료하기 위한 이의 사용 방법 |
WO2017190041A1 (en) | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Oligonucleotide analogues targeting human lmna |
IL297528A (en) | 2016-12-19 | 2022-12-01 | Sarepta Therapeutics Inc | Exon-skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy |
PT3554553T (pt) | 2016-12-19 | 2022-08-04 | Sarepta Therapeutics Inc | Conjugados oligoméricos de salto de exão para a distrofia muscular |
CN206351680U (zh) * | 2017-01-04 | 2017-07-25 | 上海蔚来汽车有限公司 | 自适应调整位置的加解锁夹具 |
TW201919682A (zh) | 2017-08-08 | 2019-06-01 | 西班牙商阿爾米雷爾有限公司 | 活化Nrf2路徑的新穎化合物 |
WO2019060522A2 (en) * | 2017-09-22 | 2019-03-28 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | OLIGONUCLEOTIDES THIOMORPHOLINO FOR THE TREATMENT OF MUSCLE DYSTROPHY |
WO2019067981A1 (en) | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY |
US20200248178A1 (en) | 2017-09-28 | 2020-08-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Combination therapies for treating muscular dystrophy |
JP2020536057A (ja) | 2017-09-28 | 2020-12-10 | サレプタ セラピューティクス, インコーポレイテッド | 筋ジストロフィーを処置するための併用療法 |
EP3790890A4 (en) | 2018-05-09 | 2022-03-02 | Ohio State Innovation Foundation | CYCLIC PEPTIDES OF CELL PENETRATION WITH ONE OR MORE HYDROPHOBIC RESIDUES |
EP3806868A4 (en) | 2018-06-13 | 2022-06-22 | Sarepta Therapeutics, Inc. | EXON-SKIPPING OLIGOMERS FOR MUSCULAR DYSTROPHY |
TW202020153A (zh) | 2018-07-27 | 2020-06-01 | 美商薩羅塔治療公司 | 用於肌肉萎縮症之外顯子跳躍寡聚物 |
CA3122200A1 (en) * | 2018-12-07 | 2020-06-11 | Oxford University Innovation Limited | Linkers |
BR112021011018A2 (pt) | 2018-12-13 | 2021-08-31 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Conjugados de oligômero para exon skipping para distrofia muscular |
WO2020214763A1 (en) | 2019-04-18 | 2020-10-22 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions for treating muscular dystrophy |
WO2021042039A1 (en) * | 2019-08-29 | 2021-03-04 | Ajk Pharmaceutical Llc | Synthetic antimicrobial peptides |
US20230020092A1 (en) * | 2019-12-19 | 2023-01-19 | Entrada Therapeutics, Inc. | Compositions for delivery of antisense compounds |
US11987795B2 (en) | 2020-11-24 | 2024-05-21 | The Broad Institute, Inc. | Methods of modulating SLC7A11 pre-mRNA transcripts for diseases and conditions associated with expression of SLC7A11 |
EP4267191A1 (en) | 2020-12-23 | 2023-11-01 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Compositions comprising exon skipping oligonucleotide conjugates for treating muscular dystrophy |
CA3216839A1 (en) | 2021-04-30 | 2022-11-03 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Treatment methods for muscular dystrophy |
WO2023034515A2 (en) | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Delivery of anitsense oligomers by mirror image peptides |
IL311568A (en) | 2021-09-30 | 2024-05-01 | Sarepta Therapeutics Inc | Antisense oligonucleotides having one or more basic units |
EP4419680A1 (en) | 2021-10-22 | 2024-08-28 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Morpholino oligomers for treatment of peripheral myelin protein 22 related diseases |
WO2023178230A1 (en) | 2022-03-17 | 2023-09-21 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Phosphorodiamidate morpholino oligomer conjugates |
WO2024064237A2 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Dmd antisense oligonucleotide-mediated exon skipping efficiency |
US20240218365A1 (en) | 2022-11-02 | 2024-07-04 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Formulation of an antisense oligomer conjugate |
Family Cites Families (113)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5506337A (en) | 1985-03-15 | 1996-04-09 | Antivirals Inc. | Morpholino-subunit combinatorial library and method |
US5217866A (en) | 1985-03-15 | 1993-06-08 | Anti-Gene Development Group | Polynucleotide assay reagent and method |
US5521063A (en) | 1985-03-15 | 1996-05-28 | Antivirals Inc. | Polynucleotide reagent containing chiral subunits and methods of use |
AU5661386A (en) | 1985-03-15 | 1986-10-13 | Stirchak, E. | Stereoregular polynucleotide-binding polymers |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5525465A (en) * | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
US5087617A (en) * | 1989-02-15 | 1992-02-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides |
US5378841A (en) | 1989-12-20 | 1995-01-03 | Antivirals Inc. | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5670617A (en) * | 1989-12-21 | 1997-09-23 | Biogen Inc | Nucleic acid conjugates of tat-derived transport polypeptides |
DE69215722T3 (de) | 1991-03-22 | 2001-03-08 | Katsuro Tachibana | Verstärker zur Ultraschalltherapie von Erkrankungen sowie diesen enthaltende flüssige Arzneimittelzusammensetzungen |
GB9209032D0 (en) * | 1992-04-25 | 1992-06-10 | Ciba Geigy Ag | New peptide derivatives |
DE656950T1 (de) | 1992-08-21 | 1996-03-14 | Biogen Inc | Tat-derivate transport polypeptide. |
ES2167358T3 (es) | 1993-01-07 | 2002-05-16 | Univ Jefferson | Inhibicion antisentido de c-myc para modular la proliferacion de celulas de musculo liso. |
GB9318288D0 (en) | 1993-09-03 | 1993-10-20 | Nycomed Imaging As | Improvements in or relating to contrast agents |
WO1995007072A2 (de) | 1993-09-09 | 1995-03-16 | Schering Aktiengesellschaft | Wirkstoffe und gas enthaltende mikropartikel |
GB9402867D0 (en) | 1994-02-15 | 1994-04-06 | Nycomed Imaging As | Improvements in or relating to contrast agents |
GB9417941D0 (en) | 1994-09-06 | 1994-10-26 | Nycomed Imaging As | Improvements in or relating to contrast agents |
US5648098A (en) | 1995-10-17 | 1997-07-15 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Thrombolytic agents and methods of treatment for thrombosis |
US6245747B1 (en) | 1996-03-12 | 2001-06-12 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Targeted site specific antisense oligodeoxynucleotide delivery method |
US5849727A (en) * | 1996-06-28 | 1998-12-15 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Compositions and methods for altering the biodistribution of biological agents |
US6261537B1 (en) | 1996-10-28 | 2001-07-17 | Nycomed Imaging As | Diagnostic/therapeutic agents having microbubbles coupled to one or more vectors |
US6143276A (en) | 1997-03-21 | 2000-11-07 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods for delivering bioactive agents to regions of elevated temperatures |
GB2341390B (en) | 1997-05-21 | 2000-11-08 | Univ Leland Stanford Junior | Composition and method for enhancing transport across biological membranes |
WO1999005302A1 (en) | 1997-07-24 | 1999-02-04 | The Perkin-Elmer Corporation | Conjugates of transporter peptides and nucleic acid analogs, and their use |
WO2000002588A1 (en) | 1998-07-13 | 2000-01-20 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Targeted site specific drug delivery compositions and method of use |
AU5583799A (en) * | 1998-08-25 | 2000-03-14 | Human Genome Sciences, Inc. | 49 human secreted proteins |
WO2000045167A2 (en) | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Avi Biopharma, Inc. | Non-invasive method for detecting target rna |
EP1173614A4 (en) | 1999-04-08 | 2003-10-29 | Oasis Biosciences Inc | ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDS CONTAINING UNIVERSAL AND / OR DEGENERATED BASES |
CA2374499A1 (en) | 1999-05-24 | 2000-11-30 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense to c-myc for treatment of polycystic kidney disease |
US6303573B1 (en) | 1999-06-07 | 2001-10-16 | The Burnham Institute | Heart homing peptides and methods of using same |
US6593292B1 (en) * | 1999-08-24 | 2003-07-15 | Cellgate, Inc. | Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues |
US6669951B2 (en) * | 1999-08-24 | 2003-12-30 | Cellgate, Inc. | Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues |
US7229961B2 (en) * | 1999-08-24 | 2007-06-12 | Cellgate, Inc. | Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into ocular tissues |
US20030104622A1 (en) | 1999-09-01 | 2003-06-05 | Robbins Paul D. | Identification of peptides that facilitate uptake and cytoplasmic and/or nuclear transport of proteins, DNA and viruses |
AU785056B2 (en) | 1999-10-07 | 2006-09-14 | Avi Biopharma, Inc. | C-myc antisense-treated hematopoietic stem cell composition and method |
DE60038695T2 (de) | 1999-11-29 | 2009-05-28 | Avi Biopharma, Inc., Corvallis | Gegen bakterielle 16s und 23s rrnas gerichtete ungeladene antisense oligonukleotide und deren verwendungen |
JP2003518946A (ja) | 2000-01-04 | 2003-06-17 | エイブイアイ バイオファーマ, インコーポレイテッド | アンチセンス抗細菌性細胞分裂組成物、およびその方法 |
US20020009491A1 (en) * | 2000-02-14 | 2002-01-24 | Rothbard Jonathan B. | Compositions and methods for enhancing drug delivery across biological membranes and tissues |
US20040170955A1 (en) | 2000-09-08 | 2004-09-02 | Wadih Arap | Human and mouse targeting peptides identified by phage display |
US6559279B1 (en) * | 2000-09-08 | 2003-05-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds |
EP1191097A1 (en) | 2000-09-21 | 2002-03-27 | Leids Universitair Medisch Centrum | Induction of exon skipping in eukaryotic cells |
AU2002225714A1 (en) | 2000-11-10 | 2002-05-21 | The Regents Of The University Of California | Il-17 receptor-like protein, uses thereof, and modulation of catabolic activity of il-17 cytokines on bone and cartilage |
EP1364201A4 (en) | 2001-02-06 | 2005-01-05 | Univ Auburn | LIGAND SENSOR DEVICES AND USES THEREOF |
US20030031655A1 (en) * | 2001-02-08 | 2003-02-13 | Sequitur, Inc. | Methods of light activated release of ligands from endosomes |
US7585834B2 (en) | 2001-02-16 | 2009-09-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Transporters comprising spaced arginine moieties |
US7456146B2 (en) * | 2001-05-09 | 2008-11-25 | Ghc Research Development Corporation | Lytic peptide prodrugs |
AT413185B (de) | 2001-05-17 | 2005-12-15 | Blum Gmbh Julius | Möbelschublade |
CA2447052A1 (en) | 2001-05-17 | 2002-11-21 | Avi Biopharma, Inc. | Combined approach to treatment of cancer using a c-myc antisense oligomer |
JP3735292B2 (ja) | 2001-07-26 | 2006-01-18 | 三菱重工業株式会社 | ダイエット効果のある健康食品および製剤 |
US6645974B2 (en) | 2001-07-31 | 2003-11-11 | Merck & Co., Inc. | Androgen receptor modulators and methods for use thereof |
US20090075377A1 (en) | 2001-08-03 | 2009-03-19 | Arbor Vita Corporation | Molecular interactions in cells |
US20030224353A1 (en) | 2001-10-16 | 2003-12-04 | Stein David A. | Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection |
JP2005538035A (ja) * | 2001-12-11 | 2005-12-15 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | グアニジニウム輸送試薬および結合体 |
US7482016B2 (en) | 2003-03-19 | 2009-01-27 | The J. David Gladstone Institutes | Immunogenic compositions comprising HIV-1 acetylated Tat polypeptides |
DE602004028930D1 (de) | 2003-04-29 | 2010-10-14 | Avi Biopharma Inc | Zusammensetzungen zur verbesserung der antisense-wirksamkeit und des transports von nukleinsäureanalog in zellen |
SI2784084T2 (sl) | 2003-07-08 | 2024-02-29 | Novartis Pharma Ag | Antagonistična protitelesa proti IL-17 A/F heterolognim polipeptidom |
CN1910200A (zh) | 2003-08-07 | 2007-02-07 | 津莫吉尼蒂克斯公司 | Il-28和il-29的均一化制剂 |
US20050203041A1 (en) | 2003-09-23 | 2005-09-15 | Mourich Dan V. | Antisense compound and method for selectively killing activated T cells |
US20050222068A1 (en) | 2003-10-23 | 2005-10-06 | Mourich Dan V | Method and antisense composition for selective inhibition of HIV infection in hematopoietic cells |
US7786151B2 (en) | 2004-01-09 | 2010-08-31 | Kinopharma, Inc. | Therapeutic composition of treating abnormal splicing caused by the excessive kinase induction |
WO2005072527A2 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-11 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense oligomers and methods for inducing immune tolerance and immunosuppression |
US20060078542A1 (en) | 2004-02-10 | 2006-04-13 | Mah Cathryn S | Gel-based delivery of recombinant adeno-associated virus vectors |
US7402574B2 (en) | 2004-03-12 | 2008-07-22 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense composition and method for treating cancer |
JP2007536253A (ja) | 2004-05-04 | 2007-12-13 | ナステック・ファーマシューティカル・カンパニー・インコーポレーテッド | 細胞内への核酸の送達を増強し、細胞中の標的遺伝子の発現を修飾するための組成物及び方法 |
US20050288246A1 (en) | 2004-05-24 | 2005-12-29 | Iversen Patrick L | Peptide conjugated, inosine-substituted antisense oligomer compound and method |
WO2005117928A1 (en) | 2004-05-30 | 2005-12-15 | Cemines, Inc. | Compositions and methods for the treatment of skin cancer |
ES2361325T3 (es) | 2004-06-28 | 2011-06-16 | The University Of Western Australia | Oligonucleótidos antisentido para inducir la omisión de exón y métodos de uso de los mismos. |
WO2006088490A2 (en) | 2004-06-30 | 2006-08-24 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage |
EP2382983B1 (en) | 2004-09-02 | 2014-02-12 | Cognosci, Inc. | Improved ApoE analogs and methods for their use |
US7429481B2 (en) | 2004-09-14 | 2008-09-30 | University Of Pittsburgh | Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein |
US8129352B2 (en) | 2004-09-16 | 2012-03-06 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating ssRNA viral infection |
US8357664B2 (en) | 2004-10-26 | 2013-01-22 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection |
US7524829B2 (en) | 2004-11-01 | 2009-04-28 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compounds and methods for treating a filovirus infection |
NZ538097A (en) | 2005-02-07 | 2006-07-28 | Ovita Ltd | Method and compositions for improving wound healing |
AU2006213686A1 (en) | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Avi Bio Pharma, Inc. | Antisense composition and method for treating muscle atrophy |
AR052289A1 (es) | 2005-02-14 | 2007-03-07 | Wyeth Corp | Anticuerpos para interleucina-17f y otros antagonistas de la senalizacion de il-17f y sus usos |
JP2008539209A (ja) | 2005-04-26 | 2008-11-13 | カリヨン−シーティーティー リミテッド | 診断及び治療剤 |
WO2008005002A1 (en) | 2006-06-30 | 2008-01-10 | Oligos Ets. Inc. | Compositions and methods for the treatment of muscle wasting |
US7790694B2 (en) | 2005-07-13 | 2010-09-07 | Avi Biopharma Inc. | Antisense antibacterial method and compound |
US8067571B2 (en) | 2005-07-13 | 2011-11-29 | Avi Biopharma, Inc. | Antibacterial antisense oligonucleotide and method |
WO2007009094A2 (en) | 2005-07-13 | 2007-01-18 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antibacterial method and compound |
US8524676B2 (en) | 2005-09-08 | 2013-09-03 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Method for treating enterovirus or rhinovirus infection using antisense antiviral compounds |
WO2007030576A2 (en) | 2005-09-08 | 2007-03-15 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating picornavirus infection |
EP1941275B1 (en) | 2005-09-29 | 2013-07-24 | Medimmune, Inc. | Method of identifying membrane lg specific antibodies and use thereof for targeting immunoglobulin-producing precursor cells |
CA2628093A1 (en) | 2005-11-08 | 2007-05-18 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense oligonucleotide analog compounds targeting proprocessed ctla-4 mrna |
US8501704B2 (en) | 2005-11-08 | 2013-08-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Immunosuppression compound and treatment method |
WO2007103529A2 (en) | 2006-03-07 | 2007-09-13 | Avi Biopharma, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating arenavirus infection |
US8785407B2 (en) | 2006-05-10 | 2014-07-22 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense antiviral agent and method for treating ssRNA viral infection |
HUE036995T2 (hu) | 2006-05-10 | 2018-08-28 | Sarepta Therapeutics Inc | Az alegységek között kationos kötéssel rendelkezõ oligonukleotid analógok |
PL2049664T3 (pl) | 2006-08-11 | 2012-02-29 | Biomarin Tech Bv | Jednoniciowe oligonukleotydy komplementarne do powtarzalnych elementów do leczenia chorób genetycznych związanych z niestabilnością powtórzeń DNA |
US20080199961A1 (en) | 2006-08-25 | 2008-08-21 | Avi Biopharma, Inc. | ANTISENSE COMPOSITION AND METHOD FOR INHIBITION OF miRNA BIOGENESIS |
US20080267978A1 (en) | 2006-08-28 | 2008-10-30 | Mary Zutter | Anti-angiogenic targets for cancer therapy |
CA2981308C (en) | 2006-09-21 | 2020-12-22 | University Of Rochester | Compositions and methods related to protein displacement therapy for myotonic dystrophy |
FR2908999B1 (fr) | 2006-11-29 | 2012-04-27 | Biomerieux Sa | Nouveau medicament destine a l'inhibition, la prevention ou le traitement de la polyarthrite rhumatoide. |
EP1938802A1 (en) | 2006-12-22 | 2008-07-02 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Interfering RNAs targeting pro-inflammatory cytokines |
US20100016215A1 (en) | 2007-06-29 | 2010-01-21 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
WO2009005793A2 (en) | 2007-06-29 | 2009-01-08 | Avi Biopharma, Inc. | Tissue specific peptide conjugates and methods |
US20110300154A1 (en) | 2007-08-21 | 2011-12-08 | Children's Medical Center Corporation | Treatment of airway hyperreactivity |
RU2010129761A (ru) | 2007-12-20 | 2012-01-27 | Ангиочем Инк. (Ca) | Конъюгаты полипептидов с нуклеиновыми кислотами и их применение |
WO2009086469A2 (en) | 2007-12-28 | 2009-07-09 | Avi Biopharma, Inc. | Immunomodulatory agents and methods of use |
WO2009144481A2 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Isis Innovation Limited | Conjugates for delivery of biologically active compounds |
PL3133160T3 (pl) | 2008-10-24 | 2019-06-28 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Kompozycje do pomijania eksonów w DMD |
KR20220047668A (ko) | 2008-12-09 | 2022-04-18 | 제넨테크, 인크. | 항-pd-l1 항체 및 t 세포 기능을 향상시키기 위한 그의 용도 |
US8592386B2 (en) | 2008-12-17 | 2013-11-26 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense compositions and methods for modulating contact hypersensitivity or contact dermatitis |
US8883995B2 (en) | 2009-03-06 | 2014-11-11 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Live attenuated influenza virus vaccines comprising microRNA response elements |
US20110269665A1 (en) | 2009-06-26 | 2011-11-03 | Avi Biopharma, Inc. | Compound and method for treating myotonic dystrophy |
WO2011049603A1 (en) | 2009-10-22 | 2011-04-28 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Biomarkers to identify hiv-specific t-cell subsets |
AU2010319314C1 (en) | 2009-11-13 | 2016-09-01 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense antiviral compound and method for treating influenza viral infection |
EP2545173A2 (en) | 2010-03-12 | 2013-01-16 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Antisense modulation of nuclear hormone receptors |
ES2816898T3 (es) | 2010-05-13 | 2021-04-06 | Sarepta Therapeutics Inc | Compuestos que modulan la actividad de señalización de las interleucinas 17 y 23 |
US9161948B2 (en) | 2011-05-05 | 2015-10-20 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Peptide oligonucleotide conjugates |
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