MXPA06004103A - Microarreglo de oligonucleotido. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a microarreglos de oligonucleotido que comprenden oligonucleotidos de ARN quimicamente modificados y los usos de dichos microarreglos en aplicaciones genomicas. Mas especificamente, la invencion proporciona un arreglo de oligonucleotido que comprende una superficie y una pluralidad de oligonucleotido, en donde por lo menos un oligonucleotido tiene al menos una porcion de azucar modificada en la posicion 2'OH. Los microarreglos de la invencion son especificamente mas utiles para detectar ARNs pequenos.

Description

MICROARREGLO DE OLIGONUCLEOTIDO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a microarreglos de oligonucleótido que comprenden oligonucleótidos de ARN químicamente modificados cortos y a los usos de dichos microarreglos en aplicaciones genómicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los microarreglos de biopolímeros se han convertido en valiosas herramientas en la investigación biomédica. La tecnología de los microarreglos ha avanzado a tal punto que los microarreglos son de costo efectivo y pueden ser provistos a los investigadores con la flexibilidad deseada y seguridad de calidad (Barrett J. Cari; Kawasaki Emest S Microarrays: el uso de oligonucleótidos y ADNc para el análisis de expresión de gen. Drug Discovery Today, 2003, 8, 134-41). Existen muchas plataformas para microarreglos con varios tipos de arreglos de biopolímero disponibles, tales como, por ejemplo, arreglos de proteína o de péptido incluyendo arreglos de anticuerpos o enzimas. Otras plataformas de microarreglos disponibles utilizan arreglos de ADN, de los cuales existen varios tipos que difieren en la forma de las sondas de oligonucleótido de superficie unida: los ejemplos incluyen arreglos de ADNc utilizando polinucleótidos largos, los cuales usualmente son colocados sobre una superficie de soporte sólido, arreglos de oligonucleótido de ADN compuestos de oligonucleótidos largos (por ejemplo, 40-80 nucleótidos) ya sea colocados sobre superficies de arreglos o unidos a través de enlaces terminales, y oligonucleótidos cortos (por ejemplo, 25 nucleótidos (nt)) sintetizados in situ (por ejemplo, Affymetrix). La energía de los microarreglos de ADN como herramientas experimentales se basa en el reconocimiento molecular específico a través de la paridad de base complementaria, lo que los hace altamente útiles para análisis simultáneos de expresión de gen en una alta producción. En la era post-genómica, los microarreglos se han convertido en una herramienta importante para el desarrollo de muchos ensayos a base de hibridación, tales como perfilado de expresión, detección de polimorfismo de nucleótido individual (SNP), secuenciación de ADN y análisis de genotipo a gran escala. Recientemente, se ha descubierto que las células eucariótlcas · contienen un gran número de ARNs cortos de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleótidos. Dichos ARNs cortos actúan, por ejemplo, como efectores de interferencia de ARN (ARNi) o como reguladores de la expresión de gen a nivel post-transcripcional. El ARNi es un proceso evolucionalmente conservado que se basa en convertir ARN de estructura de cadena doble largo (ds) a ARNsds de interferencia cortos de 20 a 23 nucleótidos (ARNsis), los cuales silencian genes a través de la degradación del ARNm objetivo. Otros ARNs cortos incluyen micro ARNs (ARNsmi) y ARNs temporales pequeños (ARNsst), un subgrupo de un grupo más grande de ARNmis, los cuales son procesados a partir de precursores de orquilla endógenamente codificados (70 a 100 nucleótidos más largos) como ARNs de 18 a 25 nucleótidos de estructura de cadena individual y parece que funcionan a través de la represión de traducción mediante la paridad de base para los 3'-UTRs de los ARNsm objetivo (Lau N C; Lim L P; Weinstein E G; Bartel D P; Science (2001 ), 294, 858-62). Aunque aproximadamente 200 diferentes ARNmis han sido identificados en plantas, C. elegans, Drosophila y mamíferos, solamente los ARNsts lin-4 y let-7 han sido bien documentados para regular el control de tiempo de la expresión de gen a nivel de traducción durante el desarrollo de larvas en C. elegans. En vertebrados, la expresión de muchos ARNmis tiene importantes patrones de desarrollo o de tejido específico pero en la actualidad la función de sólo muy pocos está establecida. El número en incremento y la diversidad de ARNmis (Lim, Lee P.¡ Glasner, Margaret E.; Yerta, Soraya; Burge, Christopher B.; Bartel, David P. Vertébrate microRNA genes. Science 2003, 299, 1540) argumenta que los ARNmis juegan un papel importante en una variedad de trayectorias distintas al control de tiempo de desarrollo. Esto está soportado por los hallazgos de los ARNmis de Drosophila están involucrados en la regulación de muerte y proliferación de célula, y son requeridos para el metabolismo normal de la grasa (Xu y otros, 2003; ver Current Biol. 13, 790-795 (2003). Además, parece ser que los ARNmis están asociados con enfermedades humanas. Estudios recientes realizados en Drosophila han enlazado la trayectoria de ARNi/ARNmi con la proteína dFMR1, un homólogo de la proteína humana FMR1 ajustada en el síndrome X frágil, la forma hereditaria más común de retraso mental (Caudy, Amy A.; Myers, ike; Hannon, Gregory J.; Hammond, Scott M. Fraguke X-related protein and ViG associate with the ARN interferente machinery. Genes & Development 2002, 16, 2491-2496). Además, dos ARNmis localizados en el cromosoma 13q14 se ha encontrado que pueden ser eliminados o sub-regulados en la mayoría de las leucemias linfocíticas crónicas de célula B (B-CLL) (Calin George Adrián y otros; PNAS 2002, 99, 15524-9). Con el fin de descifrar el papel de los ARNs cortos en procesos biológicos y, en particular, sus implicaciones en enfermedades, se necesita para una herramienta para la detección de ARNs cortos. Dicha herramienta idealmente debe permitir el análisis simultáneo de una variedad de ARNs cortos en una célula eucariótica. Sin embargo, debido a la longitud corta y a la baja abundancia, el análisis de dichos ARNs es difícil y consumidor de tiempo con las herramientas actualmente disponibles. La presente invención ahora proporciona una nueva herramienta que es capaz de detectar ARNs cortos y de esta manera es particularmente útil para la aclaración de los papeles y funciones de ARNs cortos. Será evidente para algún experto en la técnica a través de esta descripción, las aplicaciones de esta herramienta, sin embargo, no están limitadas a la detección y análisis de ARNs cortos, pero se pueden aplicar a la detección o análisis de ácidos nucleicos en general.

COMPENDIO DE LA INVENCION En un primer aspecto, la presente invención proporciona un arreglo de oligonucleótido que comprende una superficie y una pluralidad de oligonucleótidos, en donde por lo menos un oligonucleótido tiene al menos una porción de azúcar modificada. En una modalidad, el grupo 2'-OH de la porción de azúcar de dicho oligonucleótido está sustituido. Preferiblemente, dicha porción de azúcar comprende, en la posición 2' F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; o O-alquilo-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de 1 a 10 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono sustituido o no sustituido y alquinilo, alcoxialquilo, alquilo inferior de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo inferior de 1 a 10 átomos de carbono sustituido, aralquilo, alcarilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02, CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino. En una modalidad preferida, dicha porción de azúcar comprende 2'-MOE, 2'-D AOE, 2'~metoxi o 2'-aminopropoxi . En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la detección de ARNs cortos que comprende los pasos de, (a) proporcionar una muestra biológica, en donde dicha muestra comprende ARNs cortos; (b) poner en contacto dicha muestra con un arreglo de. oligonucleótido de la presente invención, (c) realizar una reacción de hibridación entre los ARNs endógenos cortos y los oligonucleótidos en el arreglo. En un aspecto más, la presente invención proporciona un método para correlacionar una muestra biológica con una condición biológica, que comprende (a) proporcionar una muestra biológica, en donde dicha muestra comprende ARNs cortos; (b) poner en contacto dicha muestra con un arreglo de oligonucleótido de la presente invención, en donde dicha muestra comprende un grupo de secuencias predefinidas adecuadas para la detección de ARNs cortos; (c) comparar el patrón de hibridación estándar. En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la prognosis o diagnóstico de una enfermedad, que comprende (a) proporcionar una muestra biológica, (b) poner en contacto un arreglo de oligonucleótido de la presente invención que corresponde a un grupo de secuencias definidas útiles para la detección de ARNs cortos, (c) obtener un patrón "de hibridación, (d) comparar dicho patrón de hibridación estándar, en donde la presencia o ausencia de cierto patrón es indicativa de una probabilidad de desarrollar un enfermedad o de la frecuencia de una enfermedad.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra valores de intensidad que representan la hibridación de 7 muestras de ARN para sondas de captura 1 MM y 2 MM que fueron normalizadas a intensidades obtenidas de las secuencias de coincidencia individuales. La intensidad es definida como densidad (media) - antecedentes (medio). Se obtuvo la discriminación de desigualdad mejorada con las sondas MOE hibridizadas con ARN marcado con Cy5 incrementando la temperatura de hibridación de 32 a 42°C. Bajo las mismas condiciones, las sondas de ADN estándar con la misma longitud no revelaron ninguna intensidad de señal.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Todas las solicitudes, patentes y literatura citadas aquí se incorporan aquí por referencia en su totalidad. La presente invención proporciona micro arreglos de oligonucieotido con alta sensibilidad y selectividad, los cuales son particularmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico cortas. Más bien, la detección y análisis de ácidos nucleicos cortos, tales como ARNs cortos, ha probado ser difícil debido a la corta longitud y la baja abundancia de dichos ácidos nucleicos. Los microarreglos de nucleótido, los cuales están actualmente disponibles, no son una herramienta adecuada, ya que su sensibilidad y/o selectividad es demasiado baja para la detección de ARNs cortos. En contraste, la presente invención proporciona microarreglos de oligonucleótido, ios cuales son particularmente adecuados para la detección de oligonucleótidos cortos y, en particular, de ARNs cortos. Como se utiliza aquí, los términos "oligonucleótido" y "oligorribonucleótido" se usan intercambiablemente y significan un polímero compuesto de residuos de ribonucleótido o de residuos de desoxirribonucleótido. También, un polímero compuesto de residuos tanto de ribonucleótido como de desoxirribonucleótido, cae dentro del significado de "oligonucleótido" y "oligorribonucleótido" de acuerdo con la presente invención. Los términos "arreglo de oligonucleótido" o "arreglo" o "microarreglo", los cuales se utilizan intercambiablemente de aquí en adelante, se refieren a un sustrato, preferiblemente un sustrato sólido, con al menos una superficie que tiene una pluralidad de oligonucleótidos a una superficie rígidas en diferentes ubicaciones conocidas. Los arreglos de oligonucleótido típicamente tienen una densidad de por lo menos 100 oligonucleótidos por cm2. En ciertas modalidades, los arreglos pueden tener una densidad de aproximadamente 500, al menos 1000, al menos 10,000, al menos 105, por lo menos 106 y por lo menos 107 oligonucleótidos por cm2. En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un arreglo de oligonucleótido que comprende una superficie y una pluralidad de oligonucleótidos, en donde dicho arreglo de oligonucleótido comprende por lo menos un oligonucleótido que tiene al menos una porción de azúcar modificada, de aquí en adelante denominados como oligonucleótidos modificados. De preferencia, los oligorribonucleótidos comprenden por lo menos 2, muy preferiblemente al menos 5 o por lo menos 10 porciones de azúcar modificada. En una modalidad específica, todas las porciones de azúcar de los oligonucleótidos están modificadas, o, en otra modalidad, preferida más, todas pero 1, 2, 3 o 4 porciones de azúcar de los oligonucleótidos están modificadas. El arreglo de oligonucleótido comprende por lo menos 10%, muy preferiblemente al menos 25%, por lo menos 33%, por lo menos 50%, por lo menos 66%, por lo menos 75%, por lo menos 90%, o por lo menos 95% de los oligonucleótidos que comprenden porciones de azúcar modificada. En una modalidad particularmente preferida, el arreglo de oligonucleótido comprende 100% de oligonucleótidos modificados. Los microarreglos de oligonucleótido de la presente invención comprenden oligonucleótidos con una o más porciones de azúcar modificada. En una modalidad preferida, la porción de azúcar está modificada en el grupo 2'-OH de la porción de azúcar. Una variedad de sustituciones 2'-OH es conocida en la técnica (ver modificaciones en Uhlmann, Eugen. Recent advances in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides. Current Opinión in Drug Díscovery & Development (2000), 3(2), 2003-213 y Uhlmann, Eugen; Peyman, Anusch, Antisense oligonucleotides; a new therapeutic principie. Chemical Reviews (Washington, DC, United Estates) (1990), 90(4), 543-84). En otra modalidad preferida, el 4'-C de la porción de azúcar no está modificado, en una modalidad muy preferida, los oligonucleótidos no comprenden ácidos nucleicos trabados (LNA, ver, por ejemplo, (Rajwanshi, Vivek K y otros; The eight stereoisomers of LNA (Iocked nucleic acid): a remarkable family of strong RNA binding molecules. Angewandle Chemie, International Edition (2000), 39(9), 1656-1659). Las porciones de azúcar modificadas preferidas, de acuerdo con la presente invención, comprenden uno de los siguientes en la posición 2': F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; O-, S-, o N-arilo; u O-alquilo-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de 1 a 10 átomos de carbono sustituido o no sustituido o alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono y alquinilo. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno o más de los siguientes en la posición 2' de sus porciones de azúcar: alquilo inferior, alquilo inferior de 1 a 10 átomos de carbono sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo o O-aralquilo, SH, SCH3, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02 CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterociclo alcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino. En otra modalidad preferida, las porciones de azúcar modificadas no comprenden un enlace de 2'-0, 4'-C-etileno. Particularmente preferidas son las porciones de azúcar sustituidas con 0[(CH2)nO]m CH3, 0(CH2)n OCH3, 0(CH2)n NH2, 0(CH2)n NR2, 0(CH2)n CH3, 0(CH2)n ONH2 ONH2, y/o 0(CH2)n ON[(CH2)n CH3)]2, en donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otra modificación preferida incluye un grupo alcoxialcoxi, en particular 2'-metoxietoxi (2'-0-CH2 CH2 OCH3, también conocido como 2'-0-(2-metoxietiIo) o 2'-MOE) (Martin y otros, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504). Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo 0(CH2)2 ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, 2'-metoxi (2'-0-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2 H2). Un experto en la técnica puede utilizar métodos convencionales para crear dichas estructuras de azúcar modificada. Las patentes de E. U. A. representativas que enseñan la preparación de dichas estructuras azúcar modificada incluyen, pero no se limitan a patentes de E. U. A. Nos. 4,981,957; 5,118,800; 5,700,920 y 5,969,116, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad. No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado estén uniformemente modificadas, y, en realidad, más de una de ias modificaciones antes mencionadas puede ser incorporara en un solo compuesto, o aún en sólo nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente invención también incluye oligonucleótidos quiméricos. Los oligonucleótidos "quiméricos" en el contexto de esta invención, son oligonucleótidos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una hecha de por lo menos una unidad de monómero. Dichos oligonucleótidos quiméricos, por ejemplo, pueden comprenden una región de nucleótidos con una o más porciones de azúcar modificada como se describió anteriormente y una región de desoxirribonucleótidos (Lima, Walt.; Crooke, Stanley T; Biochemistry (1997), 36(2), 390-398). Los oligonucleótidos de la presente invención pueden, además de las modificaciones en la posición 2' de la porción de azúcar, además comprende otras modificaciones. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden tener modificaciones en la estructura de base. Varias modificaciones de estructura de base son conocidas en la técnica, y dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforamidato y similares (ver modificaciones en U lmann, Eugen. Recent Advances in the medicinal chemistry of antisense oligonucleotides. Current Opinión in Drug Discovery & Development (2000), 3(2), 203-213 y Uhlmann, Eugen; Peyman, Anusch. Antisense oligonucleótidos; a new therapeutic principie. Chemical Reviews (Washington, DC, United States) (1990), 90(4), 543-84). Los oligonucleótidos del arreglo de oligonucleótido de acuerdo con la presente invención, típicamente tienen una longitud de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos. De preferencia, la longitud es de aproximadamente 12 a 50 nucleótidos, muy preferiblemente de 15 a 30 nucleótidos. En una modalidad particularmente preferida, la longitud de oligonucleótido es de 18 a 25 nucleótidos. Ya que no es necesario que los oligonucleótidos del arreglo de oligonucleótido tengan la misma longitud, el arreglo de oligonucleótido de acuerdo con la presente invención típicamente comprende una pluralidad de oligonucleótidos que son de longitud similar o igual. Los arreglos de oligonucleótido, comúnmente conocidos como "circuitos de gen", han sido descritos en la técnica. Los arreglos de oligonucleótidos usualmente comprenden un sustrato sólido con al menos una superficie, sobre la cual los oligonucleótidos pueden estar unidos. El sustrato puede formarse a partir de materiales inorgánicos tales como vidrio, Si02, cuarzo, Si. Alternativamente, el sustrato puede ser formado de materiales orgánicos tales como polímeros, preferiblemente policarbonato (PC), poli(metilmetacrilato) (PMMA), polümida (Pl), poliestireno (PS), polietileno (PE), tereftalato de polietileno (PET) o poliuretano (PU). En un ejemplo, el sustrato se forma a partir de vidrio. La superficie puede estar compuesta del mismo material o de un material diferente al sustrato, el sustrato y su superficie también pueden ser seleccionados para proporcionar características de absorción de luz apropiadas. En una modalidad preferida, el sustrato y/o la superficie son ópticamente transparentes. En otra modalidad preferida, el sustrato comprende una capa ópticamente transparente. La capa ópticamente transparente puede formarse de un material inorgánico. Alternativamente, se puede formar de un material orgánico. En un ejemplo, la capa ópticamente transparente es un óxido de metal tal como Ta205, Ti02, Nb205, Zr02, ZnO o Hf02. La capa ópticamente transparente es no metálica. En una modalidad particularmente preferida, el arreglo de oligonucleótido se coloca sobre una plataforma de sensor de onda evanescente como se describe en WO 01/02839. De esta manera, la plataforma de sensor para utilizarse en el análisis de muestra, por ejemplo, puede comprender un sustrato ópticamente transparente que tiene un índice de refracción (n-,) una capa ópticamente transparente, delgada, formada sobre una superficie del sustrato, dicha capa teniendo un índice de refracción (n2) que es mayor que (ni), dicha plataforma incorporando en la misma una o más estructuras corrugadas que comprenden ranuras periódicas que definen una o múltiples áreas o regiones de percepción, cada una para uno o múltiples elementos de captura, dichas ranuras siendo así perfiladas, dimensionadas y orientadas que (a) la luz coherente incidente sobre dicha plataforma es difundida en rayos individuales u órdenes de difracción que interfieren dando como resultado ia reducción del rayo transmitido y una alta reflexión anormal de la luz incidente, generando así un campo evanescente mejorado en la superficie de una o múltiples áreas de percepción; o (b) luz incidente coherente y linealmente polarizada sobre dicha plataforma es difundida hacia rayos individuales u órdenes de difracción que interfieren dando como resultado una extinción casi total del rayo transmitido y una alta reflexión anormal de la luz incidente, generando así un campo evanescente mejorado en la superficie de una o múltiples áreas de percepción. Los arreglos de oligonucleótido pueden formarse a través de síntesis de oligonucleótido química ¡n situ. En este método, los oligonucleótidos son sintetizados directamente sobre la superficie del sustrato, utilizando, por ejemplo, métodos de síntesis mecánica o métodos de síntesis de luz dirigida, los cuales pueden incorporar una combinación de métodos fotolitográficos y métodos de síntesis de oligonucleótido de fase sólida tales como aquellos descritos en, por ejemplo, WO 90/033382 o WO 92/10092 o síntesis de polímero inmovilizado a gran escala (VLSIPS) tal como se describe en WO 98/27430. Alternativamente, los oligonucleótidos de origen natural o sintético pueden ser colocados sobre el circuito utilizando varias técnicas, por ejemplo, incluyendo impresoras de inyección de tinta que tienen accionadores piezoeléctricos, accionadores electromagnéticos, accionadores de presión/válvula solenoide u otros transductores de fuerza, impresoras de chorro de burbuja, las cuales hacen uso de accionadores termoeléctricos, accionadores láser, impresoras de anillo-pasador, o marcadores de herramienta de pasador (Heller MJ (2002) Annu Rev Biomed Eng; 4:129-53). Los oligonucleótidos pueden ser covalentemente unidos a la superficie de sustrato. Dicha unión covalente típicamente requiere de la activación de la superficie y/o modificación de la molécula de ácido nucleico con un grupo funcional/reactivo. La inmovilización también puede lograrse a través de un enlazador químico o fotoquímico (WO 98/27430 y WO 91/16425). Dichas técnicas son bien conocidas y serán evidentes para algún experto en el campo. Los grupos reactivos o foto-reactivos pueden ser unidos a la superficie de la plataforma, que pueden servir como grupos de anclaje para otros pasos de reacción. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden ser unidos a la superficie a través de unión no covalente, tal como, por ejemplo, a través de adsorción electrostática sobre una película de superficie positivamente cargada. En una modalidad preferida de la presente invención, los oligonucleótidos están unidos no covalentemente a la superficie. Se pueden utilizar moléculas orgánicas funcionarizadas que proporcionan cadenas de hidrocarburo para que la plataforma sea más hidrofóbica, se pueden utilizar grupos polares para hacer que la plataforma sea más hidrofílica, o se pueden utilizar grupos iónicos, o grupos potencialmente iónicos para introducir cargas. Por ejemplo, se puede utilizar glicol polietilénico (PEG) o sus derivados para hacer que la plataforma sea hidrofílica, lo cual evita la adsorción no específica de proteínas en la plataforma/superficie. Con el fin de obtener una señal detectable, Jos ácidos nucleicos de la muestra pueden ser marcados. Cualquier marca o etiqueta adecuada para la detección de oligonucleótidos puede ser utilizada. Por ejemplo, se pueden utilizar radioisótopos, marcas o etiquetas quicio-luminiscentes, marcas o etiquetas bio-luminiscentes o calorimétricas. En una modalidad preferida, se utilizan etiquetas o marcas luminiscentes. Las cintas luminiscentes, que se pueden utilizar, incluyen, pero no se limitan a, complejos de lantánido (Kricka LJ (2002) Stains, labels and detection strategies for nucleic acids assays. Ann Clin Biochem; 39(Pt 2): 114-29) y pueden ser química o físicamente unidos al oligonucleótido. En una modalidad muy preferida, el marcador es una etiqueta o marca fluorescente. Se conocen muchos fluoróforos adecuados, tales como fluoresceíona, lisamina, ficoeritrina, rodamina, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX. Se apreciará que se pueden utilizar diferentes fluoróforos con diferentes espectros, con el fin de distinguir diferentes sondas. Alternativamente, los oligonucleótidos del arreglo de oligonucleotido pueden ser marcados con etiques o marcas adecuadas, tales como las etiquetas o marcas descritas anteriormente. Los ácidos nucleicos de la muestra ("sondas") y los oligonucleótidos adecuados del arreglo de oligonucleotido hibridizarán; es decir, ocurrirán la unión no covaleríte de secuencias complementarias o condiciones adecuadas. Preferiblemente, las secuencias son perfectamente complementarias, pero dependiendo de las condiciones de hibridación, las secuencias con 1, 2, 3, 4 o 5 desigualdades pueden seguir hibridizando. Dichas condiciones de hibridación son conocidas en la técnica o pueden ser determinadas empíricamente. Los parámetros que son bien conocidos por afectar el carácter específico y la cinética de la reacción incluyen condiciones de sal, composición iónica del solvente, temperatura de hibridación, longitud de las secuencias coincidentes del oligonucleotido, contenido de guanina y citosina (GC), presencia de aceleradores de hibridación, pH, bases específicas encontradas en las secuencias coincidentes, condiciones del solvente, y la adición de solventes orgánicos. Por ejemplo, para condiciones de alta seguridad, con el fin de que los ácidos nucleicos con sólo pocas o ninguna desigualdad se hibridizan, la concentración de sal típicamente podría ser más baja. Las condiciones de alta seguridad ordinarias pueden utilizar una concentración de sal menos que aproximadamente 1 molar, con más frecuencia menos de aproximadamente 750 milimolares, usualmente menos de aproximadamente 500 milimolares, y puede tan baja como aproximadamente 250 o 150 o 15 milimolares. La sal típica utilizada es cloruro de sodio (NaCI); sin embargo, se pueden utilizar otras sales iónicas, por ejemplo, KCI o sales de tetraetilamonio. Para condiciones de severidad más bajas, dependiendo de la hibridación de severidad deseada, la concentración de sal puede ser menos que aproximadamente 3 milimolares, de preferencia menos de 2.5 milimolares, menos de 2 milimolares, o muy preferiblemente menos de aproximadamente 1.5 milimolares. La cinética de la hibridación y la severidad de hibridación también dependen de la temperatura a la cual se realiza la hibridación. Las temperaturas para una hibridación de baja severidad típicamente podrían ser temperaturas más bajas, por ejemplo, temperaturas de aproximadamente 15 o 20°C a aproximadamente 25 a 30°C. Cuando se necesita una hibridación de alta severidad, las temperaturas a las cuales se realizan la hibridación típicamente podrían ser altas. Por ejemplo, se puede utiliza una temperatura de por lo menos 37°C, al menos 42CC, a! menos 48°C, o al menos 56°C. Se pueden utilizar altas temperaturas, por ejemplo de 80°C o más, para la separación, es decir, la interrupción de la unión de las secuencias complementarias. La reacción de hibridación también ser seguida por un paso de lavado, en donde los ácidos nucleicos que no están unidos a los oligonucleótidos se lavan. Sin embargo, dicho paso también puede ser omitido, por ejemplo, cuando se detecta luminiscencia inducida por un campo evanescente (WO 01/02839). En una modalidad preferida de la presente invención, las condiciones de hibridación son optimizadas para la hibridación de oligonucleótidos modificados, en particular de oligonucleótidos modificados con MOE, con ARNs cortos. Dicha optimización puede hacerse empíricamente y no posee ninguna dificultad para alguna persona experta en la técnica. La temperatura, por ejemplo, puede ser de aproximadamente 30°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 37°C a aproximadamente 60°C, o de aproximadamente 42°C a aproximadamente 56°C. Los métodos de detección utilizados para determinar si la hibridación se ha presentado dependerán de la marca o etiqueta seleccionada. La luminiscencia puede ser inducida por una fuente láser adecuado. Los detectores apropiados para la luminiscencia incluyen, por ejemplo, cámaras CCD, tubos fotomultiplicadores, fotodiodos de avalancha, fotomultiplicadores híbridos. Cuando se utilizan sondas marcadas en forma fluorescente, la detección de preferencia es a través de microscopía láser con focal. Las señales son registradas y, en una modalidad preferida, analizadas por una computadora, por ejemplo, utilizando un tablero analógico a digital de 12 bits. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para la detección de ARNs corto. Como se utiliza aquí, el término "ARNs cortos" se refiere a ARNs corto de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, de preferencia de aproximadamente 18 a aproximadamente 25 nucleótidos. Los ARNs cortos incluyen, pero no se limitan a, ARNsmi ARNsts, ARNsis o ARNs de orquilla cortos (ARNshs), o precursores de todos los anteriores. Los ARNs pueden ser formados endógenamente en las células, pero también pueden ser ARNs que fueron transfectados a las células, tales como, por ejemplo, ARNsis. Los inventores de la presente invención ahora han encontrado que, de acuerdo con la presente invención, los ARNs cortos y, en particular, los ARNs endógenos cortos, pueden ser detectados a través de los arreglos de oligonucleótido de la presente invención como una sensibilidad y carácter específico mucho más altos que los métodos y herramientas actualmente conocidos. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para la detección de ARNs cortos, que comprende poner en contacto una muestra biológica con un arreglo del oligonucleótido de la presente invención. Las muestras biológicas pueden ser derivadas de células, tejidos, órganos, fluidos del cuerpo, tales como, por ejemplo, suero, plasma, fluidos seminal, orina, fluido sinovial, y fluido cerebro espinal. Las células o tejidos también se pueden seleccionar mediante características particulares, por ejemplo, se pueden seleccionar células o tejidos cancerosos o células o tejidos en varias etapas de desarrollo o en una condición patológica. En una modalidad preferida, la muestra biológica se deriva de un mamífero, muy preferiblemente de un roedor, tal como, por ejemplo, de ratón o rata, o muy preferiblemente, de un ser humano. Los ácidos nucleicos de las muestras biológicas pueden ser enriquecidos a través de un paso de purificación, tal como, por ejemplo, extracción de fenol/cloroformo, precipitación de etanol o purificación de gel. En una modalidad preferida, la muestra es enriquecida para ARNs cortos que, por ejemplo, puede ser lograda a través de purificación de gel o fraccionamiento de tamaño. Las muestras pueden ser utilizadas ya sea en forma no diluida o con solventes agregados. Los solventes adecuados incluyen agua, soluciones de regulador de pH acuosas o solventes orgánicos. Los solventes orgánicos adecuados incluyen alcoholes cetonas, ésteres, hidrocarburos alifáticos, aldehidos, acetonitrilo o nitrilos. Un método adecuado para la detección de ARNs cortos comprende los pasos de, (a) proporcionar una muestra biológica, en donde dicha muestra comprende ARNs endógenos cortos; (b) poner en contacto dicha muestra con un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con la presente invención; c) realizar una reacción de hibridación entre los ARNs endógenos cortos y los oligonucleótidos en el arreglo, y, opcionalmente; d) detectar una hibridación entre ARN corto de la muestra y un oligonucleótido del arreglo. En una modalidad preferida, los ARNs cortos de la muestra biológica son marcados, preferiblemente con un colorante fluorescente. En otra modalidad, los métodos de la invención se utilizan para perfilar ARNs cortos. Por ejemplo, los arreglos de oligonucleótido que corresponde a un grupo de secuencias definidas útiles para la detección de ARNs cortos pueden ponerse en contacto con muestras de célula o tejido de células o tejidos normales y enfermos. El patrón de oligonucleótidos hibridizados en el arreglo será indicativo de la presencia o ausencia de un ARN corto en una muestra de tejido. Los patrones de ARNs cortos presentes en células o tejidos normales y enfermos de esta manera pueden ser comparados, permitiendo así correlacionar muestras con un estado de enfermedad. De esta manera, la presente invención proporciona un método para correlacionar una muestra biológica o niveles de expresión de ARN corto particular con un estado de salud, que comprende (a) proporcionar una muestra biológica, en donde dicha muestra comprende ARNs cortos; (b) poner en contacto dicha muestra con un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con la presente invención, en donde dicha muestra comprende un grupo de secuencias predefinidas adecuadas para la detección de ARNs cortos; (c) comparar el patrón de hibridación obtenido con un patrón de hibridación estándar. El patrón estándar, · por ejemplo, puede ser obtenido de una muestra derivada de células o tejido enfermo. Un patrón, similar de esta manera puede ser indicativo de una muestra de células o tejido con cierto estado de enfermedad. En una modalidad preferida, la célula o tejido es infectado por un patógeno, tal como a través de infecciones del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), infecciones de influenza, malaria, hepatitis, plasmodio, citomegalovirus, virus simple de herpes, o virus de enfermedad de pies y boca. En una modalidad preferida, la célula o tejido es infectado por un patógeno viral o bacterial. En otra modalidad preferida, la enfermedad es un cáncer (ver, por ejemplo, McManus, Michael T. MicroRNAs y cáncer. Seminars in Cáncer Biology (2003), 14(4), 253-258), y en una modalidad muy preferida, un tumor sólido o una malignidad sanguínea. En otra modalidad preferida, la enfermedad es una enfermedad neurodegenerativa, tal como Parkinson, Alzheimer, o Esclerosis Múltiple. En una modalidad particularmente preferida, la enfermedad es retraso metal relacionado con X frágil (ver, por ejemplo, Caudy AA y otros, (2002) Genes Dev; 16:2491-6 and Dostie, Josee y otros RNA (2003), 9(2), 180-186). En otra modaiidad preferida, el arreglo de oligonucleótido es compresivo para la detección de ARNs pequeños de un órgano, tejido o célula dada de un organismo, es decir, el arreglo comprende oligonucleótidos para una parte grande o todos los ARNs pequeños formados en un organismo particular o en un órgano, tejido, o célula de dicho organismo. Una parte grande dentro de este contexto significa por lo menos 60%, de preferencia al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, o muy preferiblemente por lo menos 95% de los ARNs pequeños. El arreglo también puede comprender un grupo comprensivo de secuencias predefinidas de marcadores de una etapa o condición particular de células, por ejemplo, marcadores conocidos o combinación de marcadores para tumores particulares o para un tipo particular de célula. En otra modalidad preferida, el arreglo de oligonucleótido es adecuado para detectar un subgrupo específico de ARNs pequeños de un organismo dado, u órgano, tejido o célula de dicho organismo, preferiblemente ARNsi, muy preferiblemente ARNmis o ARNsts. Como será evidente para algún experto en la técnica, los métodos anteriores pueden ser utilizados para perfilar cualquier condición biológica, la cual tiene diferencias en la cantidad y/o composición de ARNs cortos y, en particular, de ARNmis en células o tejidos. Por ejemplo, una muestra biológica puede ser correlacionada con diferentes situaciones de tensión, tales como, por ejemplo, hipoxia o tensión mecánica, a través de dicho método utilizando muestras biológicas adecuadas y patrones estándares apropiados, con los cuales los patrones obtenidos que utilizan las muestras biológicas pueden ser comparados. Alternativamente, las muestras biológicas pueden ser correlacionadas con diferentes etapas de desarrollo. Otra modalidad de la presente invención proporciona un método para explorar ARN corto, y, en particular, dinámica de ARNmi durante diferenciación. Por ejemplo, un arreglo de oligonucleótido con un grupo de secuencias definidas útiles para la detección de ARN cortos y, en particular, ARNmi se pueden poner en contacto con muestras biológicas derivadas de, por ejemplo, células del tallo embrionicas que experimentan diferenciación en diferentes linajes, tales como diferenciación de células hematopoyéticas in Vitro, diferenciación de mioblastos, o diferenciación de células PC12 a neuronas. Otro aspecto de la presente invención proporciona métodos para pronosticar o diagnosticar enfermedades y, en particular, enfermedades de seres humanos. Dichos métodos incluyen: (a) proporcionar una muestra biológica, la cual puede ser aislada de un tejido u órgano o fluido del cuerpo de interés y que puede ser, opcionalmente, previamente tratada, (b) poner en contacto un arreglo de oligonucleótido que corresponde a un grupo de secuencias definidas útiles para la detección ARNs cortos, en particular de ARNmis con dicha muestra, (c) obtener un patrón de hibridación, (d) comparar dicho patrón de hibridación con un patrón de hibridación estándar, en donde la presencia o ausencia de cierto patrón es indicativa de una probabilidad de desarrollo de una enfermedad o la presencia de una enfermedad. Por ejemplo, una condición cancerosa puede ser indicada a través de una combinación de ciertos ARNs cortos. Dicha combinación dará surgimiento a un patrón específico cuando dichos ARNs cortos son hibridizados a un arreglo de oligonucleótido con oligonucleótidos adecuados. De esta manera, la presencia o ausencia de cierto patrón de hibridación de dicho arreglo de oligonucleótido con una muestra biológica será indicativa de la presencia o ausencia de una condición cancerosa. El patrón también puede ser comparado con un patrón estándar obtenidos con células, tejidos u órganos saludables, etc., y diferencias en el patrón obtenido de la muestra biológica según comparada con el patrón estándar serán indicativas de anomalías o estados de enfermedad en la muestra biológica analizada. La invención además se describe, para propósitos de ilustración solamente, en los siguientes ejemplos. Los métodos de genética molecular, proteína y bioquímica de péptido e inmunología referidos pero no explícitamente descritos en esta descripción y ejemplos, se reportan en la literatura específica y son bien conocidos por aquellos expertos en el campo.

EJEMPLOS Materiales y Métodos Diseño y síntesis de oligonucleótidos MOE Se diseñaron sondas de captura de MOE para 31 ARNmis humanos Identificados por Lagos-Quintana M, y otros; Science 2001, 294, 853-8, Lagos-Quintana M, y otros; Current Biology, 2002, 12, 735-9, Lagos-Quintana M; RNA 2003, 9, 175-9, Mourelatos Zissimos y otros; Genes and Development 2002, 16, 720-8. La longitud de estos ARNmis varía de 20 a 24 nucleótidos. También la abundancia de estos ARNmis difiere basándose en la frecuencia de clonación de ARNmis individuales. Ya que la clonación y procedimientos de secuenciación empleados para identificar ARNmis no puede con frecuencia precisamente definir las extremidades 5' y 3' del ARNml, las sondas de captura MOE fueron diseñadas como complementarias a 19 nucleótidos que corresponden a la porción central ARNmi. Para ARNmis de longitud de 20 nucieótidos, la sonda de captura es complementaria a 19 nucieótidos 5'-próximos del ARNmi para ARNmis de longitud de 21 nucieótidos y más largos, las sondas de captura son complementarias a los nucieótidos 2-20 del ARNmi. El mantenimiento de la misma longitud (19 nucieótidos) de sondas de captura debe reducir al mínimo las diferencias en temperaturas de fusión de los dúplex'de sbnda-ARNmi individual. Se diseñaron oligos de control de desigualdad de 1 bp y 1 bp de acuerdo con las siguientes reglas de permutación: A - C; C -> A; T -> G; G -> T. Las desigualdades fueron introducidas utilizando un algoritmo que asegura un carácter específico máximo a través de todas las especies de ARNmi (J. Lange, LSI). El ADN sintético y oligonucleótidos modificados 2'- OE descritos en esta invención se preparan utilizando química de fosforamidita estándar en sintetizadores ABI394 or Exped ite/Moss Synthesizers (Applied Biosystems). Las fosforamiditas se disuelven en acetonitrilo a una concentración de 0.05 M. El acoplamiento se hace a través de activación de fosforamiditas a través de una solución de 0.2 M de triflato de benzimidazoüo en acetonitrilo. Los tiempos de acoplamiento usualmente comprenden de entre 3 a 6 minutos. Se hizo un primer bloque utilizando reactivos de bloqueo estándares. La oxidación se hizo a través de una solución de 0.5 M de hidroperóxido de t-butilo en d iclorometano durante 2 minutos. Se realizó un segundo bloqueo después de la oxidación o sulforización. Las cadenas de crecimiento de oligonucleótido se destriti laron para el siguiente acoplamiento por ácido tricloroacético al 2% en diclorometano. Después del término de las secuencias, los compuestos de soporte unido se separaron y se desprotegieron como "Trityl-on" a través de amoniaco acuoso al 32% a 80°C durante 2 horas. Las soluciones crudas obtenidas de purificaron directamente a través de RP-HPLC. Los compuestos destritilados purificados se analizaron a través de espectrometría de masas de electroaspersion y electroforesis de gel capilar y se cuantificaron a través de UV de acuerdo con su coeficiente de extinción a 260 nM. Los oligonucleótidos MOE complementarios a las secuencias ARNmi (COINCIDENCIA = PM perfecta) y controles de desigualdad de pares de base 1 (1 MM) y 2 (2MM) se muestran en el Cuadro 1.

C UAD RO 1 No. ARNmi Desigualdad 1 nt (1 MM) 13249.1 1 MM_mir-1 d acá tac ttc gtt acá tic C 13250.1 1 MM_mir-21 aac ate agt atg ata age T 13251.1 1 MM_mir-22 agt tet tea ect ggc age T 13252.1 1 MM_mir- 6 cea ata ttt ccg tgc tgc T . 13253.1 1 MM_let7a cta tac aac ata cta cctC 13254.1 1 MM_let7b cea cae aac ata cta ect C 13255.1 1 MM_mir-19b gtt ttg cat tga ttt gca C 13256.1 1 MM_mir-23 gaa ate ect tgc aat gtg A 13257.1 1 MM_mir 20 ect gca cta gaa gca ctt T 13258.1 1 MM_m¡r-24 gtt ect get taa ctg age C 13259.1 1 MM_mir-96 aaa aat gtg ata gtg cea A 13260.1 1. MM_mir-122a aac ace aft ttc acá ctc C 13261.1 1 MM_mir-124a gca ttc acc teg tgc ctt A 13262.1 1 MM_mir-91 ect gca ctg gaa gca ctt T 13263.1 1 MM_mir-97 tec agt cga tga tgt tta C 13264.1 1 MM_m¡r-24 gtt ect get taa ctg age C 13265.1 1 MM_m¡r-102 ctg aft tea cat ggt get A 13266.1 1 M _mir- 04 get tat cag ect gat gtt G 3267.1 1 MM_m¡r-93 acc tgc acg cag age act T 13268.1 1 MM_m¡r-95 ctc aat aaa gac ccg ttg A 13269.1 1 MM_mir-98 caa tac aac gta cta ect C 13270.1 1 M_mir-99 caa gat cgg ctc tac ggg T 13271.1 1 MM_mir-100 caa gtt cgg ctc tac ggg T 13272.1 1 MM_mir-18 tet gca cta tat gca ect T 13273.1 1 MM_m¡r-92 agg ccg gga aaa gtg caa T 13274.1 1 MM_m¡r-94 tet gca ctg gca gca ctt T 13275.1 1 MM_mir-27 cgg aac tta tec act gtg A 13276.1 1 MM_mir-101 tea gtt ate cea gta cig T 13277.1 1 MM_mir-25 aga ccg aga aaa gtg caa T 13278.1 1 MM_m¡r-26a ect ate ctg tat tac ttg A 13279.1 1 MM_mir-28 caa tag act ttg age tec T 3 O No. ARNmi Desigualdad 2 nt (2 MM) 13280.1 2MM_mir-1 d acá tac tta gtt acá ttc C 13281.1 2MM_m¡r-21 aac ate agg atg ata age T 13282.1 2MM_mir-22 agt tet tec ect ggc age T 13283.1 2MM_m¡r-16 cea ata ttg ccg tgc tgc T 13284.1 2 M_let7a cta tac aaa ata cta ect C 13285.1 2MM_let7b cea cae aaa ata cta ect C 13286.1 2MM_mir-19b gtt ttg cag tga ttt gca C 13287.1 2MM_mir-23 gaa ate ccg tgc aat gtg A 13288.1 2M -mir-20 ect gca etc gaa gca ctt T 13289.1 2MM_mir-24 gtt ect gcg taa ctg age C 13290.1 2MM_mir-96 aaa aat gtt ata gtg cea A 13291.1 2MM_mir-122a aac acc atg ttc acá etc C 13292.1 2 M_mir- 24a gca ttc acá teg tgc ctt A 13293.1 2MM_mir-91 ectgea ctt gaa gca ctt T 13294.1 2MM_mir-97 tec agt cgc tga tgt tta C 13295.1 2MM_m¡r-24 gtt ect gcg taa ctg agcC 13296.1 2MM_m¡r-102 ctg att tec cat ggt get A 13297.1 2MM_mir-104 get tat cat ect gat gtt G 13298.1 2 M_mir-93 acc tgc act cag age act T 13299.1 2 M_mir-95 etc aat aac gac ccg ttg A 13300.1 2 M_mir-98 caa tac aaa gta cta ect C 13301.1 2 M_mir-99 caa gat cgt etc tac ggg T 13302.1 2MM_mir-100 caa gtt cgt etc tac ggg T 13303.1 2MM_mir-18 tet gca etc tat gca ect T 13304.1 2MM_mir-92 agg ccg ggc aaa gtg caa T 13305.1 2MM_mir-94 tet gca ctt gca gca ctt T 13306.1 2MM_m¡r-27 cgg aac ttc tec act gtg A 13307.1 2 M_mir- 01 tea gtt ata cea gta ctg T 13308.1 2 M_mir-25 aga ccg age aaa gtg caa T 13309.1 2 M_mir-26a ect ate ctt tat tac ttg A 13310.1 2MM_mir-28 caa tag acg ttg age tec T n(g,a,t)=2,-0-(2-metoxietil)-r¡bonucleósido, c=2'-0-(2-metoxiet¡l)-5-metil citidina. Las letras mayúsculas en el extremo 3' indican N(A, G, C, T) 2'-desoxinucleot¡dos (nts). Por razones prácticas, todas las secuencias fueron sintetizadas empleando soportes de ADN conduciendo a oligonucleótido MOE con 2'-desoxínucleótido en la posición 3'-terminal.

Impresión e hibridación de microarreglos de oligonucleótido Circuitos de resonancia Evanescentes NovaChips (D, Budach W, Wanke C, Chibout SD (2003): una plataforma universal con sensibilidad superior para micro arreglos a base de fluorescencia. Se prepararon Biosens Bioelectron; 18:489-97), se imprimieron y se hibridizaron esencialmente como se describió. Las mezclas de hibridación contubieron 3 microgramos de micro ARN marcado (Budach, Wolfgang; Neuschaefer, Dieter, Wanke, Christoph; Salah-Dine. La generación de transductores para microarreglos a base de fluorescencia con sensibilidad mejorada y su aplicación para perfilación de expresión de gen. Analitical Chemistry (2003), 75(11), 2571-2677).

Preparación de ARNmis a partir de células HeLa humanas y P19 de ratón Se desarrollaron células HeLa a 37°C en un medio de Eagle modificado con Dulbecco suplementado con FCS al 10% y 2 mM de L-glutamina. Aproximadamente 1.5 x 107 se lavaron con PBS y el ARN se extrajo con 1 mi de Trizol® (Life-Technologies T ) por 10 cm2 de superficie de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ADN presente en la fase acuosa fue digerido con 20 U DNase I por 500 µ? durante 1 hora a 37°C. Después de la extracción de fenol/cloroformo, el ARN total fue precipitado con etanol, se volvió a suspender en agua libre de RNase y se aplicaron 100 µg de ARN a una columna de minigiro (Qiagen) siguiendo el protocolo de limpieza de ARN del fabricante. Las especies de ARNs más pequeñas que aproximadamente 200 nts contenidas en el flujo fueron precipitadas con etanol, se volvieron a suspender el regulador de pH de carga de , gen de desnaturalización (70% de formamida, 30 mM de EDTA, 0.05% de Xylene Cianol, 0.05% de Azul de Bromofenol) y se separaron en un gel de 8 M urea-12.5% de poliacrilamida corriendo en un reguiador de pH de TBE. Los ARNs con un tamaño variable de 15 a 30 nts fueron separados del gel bajo sombreado de luz UV, se eluyeron durante 16 horas a 4°C con una solución conteniendo 500 mM de acetato de amonio, 1 mM de EDTA, y 20% de fenol/cloroformo, se precipitaron con etanol y se volvieron a suspender en agua libre de RNase. La cantidad de ARN recuperado se estimó midiendo la densidad óptica a 250 nm. Alternativamente, las muestras de ARN se aplicaron a una columna de minigiro RNeasy® (Qiagen) y sé utilizaron en experimentos de circuito omitiendo el paso de purificación de PAGE.

Marcación fluorescente de olígos de ARNmi de control sintético y ARNmi de tamaño seleccionados fraccionados de células HeLa y P19 Se compraron oligonucleótidos de ARN de 19-mer complementarios a 8 diferentes secuencias de ARNmi en Xeragon. Para la marcación de los ARNs, se oxidaron 9 pg de ARN en 9 µ? de agua en dialdehído agregando 1 µ? recientemente preparado de periodato de sodio acuoso de 100 mM seguido por una incubación de 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. El exceso de oxidante se removió agregando 1 µ? de una solución de 200 mM de sulfito de sodio y una incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de agregar 12 µ? de 50 mM de regulador de pH de acetato de sodio pH 4, se agregaron 5 µ? de 20 mM de clorhidrato de etileno diamina acuoso, pH 7.2, al ARN oxidado. La mezcla se reacción se incubó durante 1 hora a 37°C y el enlace de aldimina entre el ARN y el separador fue estabilizado a través de la reducción con 2 µ? de 200 mM de ciano borohidruro de sodio recientemente preparado en acetonitrilo. La incubación se presentó durante 30 minutos a temperatura ambiente y la precipitación se realizó con dos volúmenes con perclorato de litio al 2% en acetona durante 1 hora a 0°C. La muestra se hizo girar a 14,000 rpm durante 45 minutos (3-4°C) y después de remover el sobrenadante, la pella de ARN se lavó dos veces con acetona y se secó con aire. La conjugación se realizó volviendo a suspender el ARN modificado con amino en 5 µ? de agua tratada con DEPC y agregando 5 µ? de 30 mM de éster activo de Cy5 N-hidroxisuccinimidilo en regulador de pH de 1 M de fosfato de sodio (pH 7.8). Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad, el ARN se precipitó con 2.5 volúmenes de etanol enfriado con hielo al 100% durante 1 hora a -20°C. La mezcla se hizo girar a 14,000 rpm durante 30 minutos (3-4°C) y después de remover el sobrenadante, la pella de Cy5-ARN se lavó dos veces con etanol acuoso al 70% enfriado con hielo y se secó con aire. La calidad y cantidad del ARN marcado se analizó a través de electroforesis de gel capilar y se cuantificó mediante UV de acuerdo con el coeficiente de extinción a 260 nm. Las secuencias de ARN marcado con Cy5 están contenidas en el Cuadro 2.

CUADRO 2 Secuencias de equivalentes de ARNmi sintético marcado con 3'-Cy5 utilizadas para la hibridación para los oligonucleótidos de "captura" complementarios inmovilizados. Los nucleótidos de pares de base están en negritas.

Nr RNAmi Compl Secuencia Capt Sec en circuito Origen Nr. Ac igual aacatcagtctgataagcT 3839 mir-21 1 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAC aacatcagtatgataagcT Humano AF480524 2 M aacatcaggatgataagcT 3840 mir-23 Igual AUCACAUUGCCAGGGAUUUCCA gaaatccctggcaatgtgA Humano AF480526 ¡MM gaaatcccttgcaatgtgA 2 MM gaaatcccgtgcaatgtgA igual gcattcaccgcgtgc cttA mlr- 3841 1 MM UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA gcattcacctcgtgccttA Ratón AJ459733 124a 2 MM gcattcacatcgtgccdA igual gttcctgctgaactgagcC 3842 mir-24 1 MM UGGCUCAGUUCAGCAG GAACAG gttcctgcttaactgagcC Humano AF480527 2 MM gtcxtgcgtaactgagcC igual caagatcggatctacgggT 3843 mir-99 1 MM AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG caagatcggctctacgggT Humano AF480537 2 MM caagatcgtctctacgggT igual caagttcggatctacgggT rnir- 3844 1 MM AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG caagttcggctctcgggT Humano AF480498 100 2 MM caagttcgtctctacgggT mir- igual tccagtcgaggatgtttaC 11657 30a-sl 1 MM GUAAACAUCCUCGACUGGA tccagtcgatgatgtttaC Humano m¡r-97 2 MM tccagtcgctgatgtttaC igual gcttatcagactgatgttG mir- 1 660 1 MM CAACAUCAGUCUGAUAAGC gcttatcagcctgatgttG Humano 104 2 MM gcttatcatcctgatgttG RESULTADOS La afinidad y el carácter específico de la sondas de captura de oligonucleótido se examinaron utilizando un circuito conteniendo un panel de oligonucleótido de MOE y ADN marcados junto con sus controles de desigualdad de nucleótido 1 y 2 correspondientes. Los oiigonucleótidos de ARN complementarios a 8 diferentes secuencias de ARNmi representados sobre el circuito se marcaron con Cy5 (Cuadro 2) y se hibridizaron con el circuito de diferentes condiciones. Un problema común para todos los microarreglos de oligonucleótido de ADN es la necesidad de un compromiso adecuado con respecto a la sensibilidad y carácter específico de la plataforma.

Como se ve en la Figura 1, las intensidades de fluorescencia obtenidas con los oiigonucleótidos de desigualdad de nucleótido 1 y 2 modificados con MOE muestran una reducción de intensidad importante con relación a los dúplex perfectamente coincidentes. El incremento de la temperatura de hibridación además debe mejorar la discriminación. En contraste, las sondas de captura de ADN estándares correspondientes no son capaces de formar dúplex estables bajo las condiciones de severidad de hibridación seleccionadas, dando comó resultado valores de intensidad no importantes de todas las zonas de captura de ADN. En 5 de 8 casos la discriminación de desigualdad con las sondas MOE pudo ser significativamente mejorada incrementando la temperatura de hibridación de 37 a 42°C (Figura 1), sin comprometer su sensibilidad de captura. En el caso del oligon ucleótido mir-99 y mir-100, que representa ARNmis que difieren sólo por un nucleótido individual, se observó un grado importante de reactividad cruzada.

Hibridación de ARNmi de extractos de célula humana y de ratón para NovaChips de OE En un siguiente paso, se extrajeron ARNmis de tamaño seleccionado de células de ratón HeLa/P19, marcadas con Cy5 e hibridizadas con sondas para un circuito de alta sensibilidad ( Novachip: Generation of transducers for f I uorescente-based microarrays with enhanced sensitivity and their aplication for gene expresión profiling, Budach, Wolfgang; Neuschaefer, Dieter; Wanke, Christoph; Chibout, Salah-Dine. Novartis Phama AG Suiza, Basel, Switz Analytical/Chemistry (2003), 75(11), 2571-2577) a temperaturas que varían de 30°C a 56°C. Las intensidades de fluorescencia medidas para 31 ARNmis marcados diferentes teniendo una sonda de captura MOE complementaria, a un control de 1 nt MM y de 2 nt MM en el circuito se muestran en el Cuadro 3. Aunque la hibridación específica de algunos ARNmis ya pudo ser observado a 30°C y 37°C (basándose en ia comparación de señales obtenidas con sondas 1 MM y 2 MM MOE de tipo silvestre), la discriminación entre las secuencias desiguales y totalmente complementarias presentes en NovaChip fue mejor a 42°C o temperaturas más altas. La realización de la hibridación a 48°C y 56°C permitió una detección específica de casi todos los ARNmis, con una reducción concomitante en intensidad a temperaturas más altas. En pocos casos, no se registró ninguna señal a 56°C. Al realizar la hibridación a 3 diferentes temperaturas (42, 48 y 56°C) fue posible registrar señales específicas para casi todos los ARNmis probados. En realidad, sólo para 6 ARNmis, la señal pareció ser ya sea ausente o no específica a cualquier temperatura probada. Esto puede deberse a la ausencia de un ARNmi específico en un aislado de célula o debido a la presencia de un ARN no relacionado de hibridación cruzada en muestras de ARN utilizadas para hibridación, respectivamente. Como se ilustra por algún caso, si una desigualdad individual no permitió una detección específica del ARNmi, dos desigualdades permitieron una discriminación mejor. Finalmente, los valores de intensidad de dos hibridaciones individuales conducidas a 42°C (datos no mostrados) revelaron valores de intensidad comparables indicando un alto nivel de capacidad de reproducción.

CUADRO 3 ARNmi de HeLa marcado con Cy5 fue hibridizado a diferentes temperaturas (T) bajo las condiciones descritas en el circuito. Una temperatura de hibridación de 48°C (marcada en negritas) parece ser el mejor compromiso entre la intensidad de señal y el carácter específico para la mayoría de las sondas en el circuito.

Temp. de hibridación 48°C Densidad Nombre de (media) Secuencia sonda - Anterior (media) Iet7a cta tac aac cta cta cct C 3306 1MM_let7a cta tac aac ata cta cct C -35 2M _let7a cta tac aaa ata cta cct C -46 iet7b cea cae aac cta cta cct C 2436 1MM_let7b cea cae aac ata cta cct C -7 2 M_let7b cea cae aaa ata cta cct C -81 mir-100 caá gtt cgg ate tac ggg T 2459 1MM_mir-100 caá gtt cgg etc tac ggg T 1056 2 M_mir-100 caá gtt cgt etc tac ggg T 24 mir-101 tea gtt ate acá gta ctg T 64 1MM_mir-101 tea gtt ate cea gta ctg T 0 2MM_mir-101 tea gtt ata cea gta ctg T -43 mir-102 ctg att tea aat ggt gct A 624 1MM_mir-102 ctg att tea cat ggt gct A 6 2MM_mir-102 ctg att tec cat ggt gct A 130 mir-104 get tat cag act gat gtt G -44 1 MM_mir-104 get tat cag cct gat gtt G 6 2MM_mir 104 get tat cat cct gat gtt G -17 mir-122a aac acc att gtc aca ctc C -4 1 MM_mir-122a aac acc aft ttc aca ctc C -54 2MM_mir-122a aac acc atg ttc aca ctc C -21 mir-124a gca ttc acc gcg tgc ctt A 554 1 MM_mir-124a gca ttc acc tcg tgc ctt A 541 2 M_mir-124a gca ttc aca tcg tgc ctt A -35 mir-16 cea ata ttt acg tgc tgc T 1031 1 MM_mir-16 cea ata ttt ceg tgc tgc T 86 2MM_mir-16 cea ata ttg ceg tgc tgc T 173 mir-18 tet gca cta gat gca cct T 1013 1 MM_mir-18 tet gca cta tat gca cct T 242 2MM_mir-18 tet gca ctc tat gca cct T 13 mir-19b gtt ttg cat gga ttt gca C 7243 1 _mir-19b gtt ttg cat tga ttt gca C 15 2M _mir-19b gtt ttg cag tga ttt gca C -12 mir-1 d aca tac ttc ttt aca ttc C -9 1 M _mir-1 d aca tac ttc gtt aca ttc C 96 2MM_mir-d aca tac tta gtt aca ttc C -79 mir-20 cct gca cta taa gca ctt T 2531 1 MM_mir-20 cct gca cta gaa gca ctt T 8 2MM_mir-20 cct gca ctc gaa gca ctt T 13 mir-21 aac ate agt ctg ata age T 2796 1 MM_mir-21 aac ate agt atg ata age T -9 2 M_mir-21 aac ate agg atg ata age T 37 mir-22 agt tet tea act ggc age T 820 1 MM_mir-22 agt tet tea ect ggc age T 1183 2MM_mir-22 agt tet tec ect ggc age T 2771 mir-23 gaa ate ect ggc aat gtg A 9291 1 MM_mir 3 gaa ate ect tgc aat gtg A 102 2MM_mir-23 gaa ate ccg tgc aat gtg A 16 Mir-24 gtt ect gct gaa ctg age C 5708 1 MM_mir- 24 gtt ect gct taa ctg age C 4022 2MM_mir-24 gtt ect gcg taa ctg age C 1305 mir-24 gtt ect gct gaa ctg age C 6171 1 MM_mir-24 gtt ect gct taa ctg age C 3858 2MM_mir-24 gtt ect gcg taa ctg age C 1282 mir-25 aga ccg aga caa gtg caa T 1186 1 MM_mir-25 aga ccg aga aaa gtg caa T -37 2M _mir-25 aga ccg age aaa gtg caa T -36 mir-26a ect ate ctg gat tac ttg A 1533 1 M _mir-2Ba ect ate ctg tat tac ttg A 97 2 M_mir-26a ect ate ctt tat tac ttg A -66 mir-27 cgg aac tta gee act gtg A 29330 1 MM_mir-27 cgg aac tta tec act gtg A 996 2M _mir-27 cgg aac ttc tec act gtg A 1064 mir28 caa tag act gtg age tec T 836 1 MM_mir-28 caa tag act ttg-age tec T -17 2MM_mir-28 caa tag acg ttg age tcc T -36 mir-91 cct gca ctg taa gca ctt T 4435 1 M_mir-91 cct gca ctg gaa gca ctt T 297 2MM_mir-91 cct gca ctt gaa gca ctt T -42 mir-92 agg ccg gga caa gtg caa T 5896 1 MM_mir-92 agg ccg gga aaa gtg caa T 3043 2MM_mir-92 agg ccg ggc aaa gtg caa T 7643 mir93 acc tgc acg aag age act T 319 1 MM_mir-93 acc tgc acg cag age act T 19 2M _mir-93 acc tgc act cag age act T 56 mir94 tct gca ctg tea gca ctt T 2340 1 MM_mir-94 tct gca ctg gca gca ctt T 197 2MM_mir-94 tct gca ctt gca gca ctt T 717 mir-95 ctc aat aaa tac ccg ttg A -42 1 MM_mir-95 ctc aat aaa gac ccg ttg A -40 2M _mir-95 ctc aat aac gac ccg fig A -7 mir-96 aaa aat gtg cta.gtg cea A 225 1 MM_mir-96 aaa aat gtg ata gtg cea A -46 2MM_mir-95 aaa aat gtt ata gtg cea A -63 mir 97 tcc agt cga gga tgt tta C 4811 1 MM_mir-97 tcc agt cga tga tgt üa C 39 2MM_mir-97 tcc agt cgc tga tgt tta C 12 mir98 caa tac aac tta cta cct C 82 1 MM_mir-98 caa tac-aac gta cta cct C -30 2MM_mir-98 caa tac aaa gta cta cct C -33 mir-99 caá gat cgg ate tac ggg T 2140 1 _mir-99 caá gat cgg ctc tac ggg T 1059 2 M_mir-99 caá gatcgt ctc tac ggg T 127

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES 1. - Un arreglo de oligonucleótido que comprende una superficie y una pluralidad de oligonucleótidos, en donde por lo menos un oligonucleótido tiene al menos una porción de azúcar modificada. 2. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el grupo 2'-OH de la porción de azúcar está sustituido. 3.- Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la porción de azúcar comprende en la posición 2': F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquilo-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de 1 a 10 átomos de carbono sustituido o no sustituido o alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono y alquinilo, alcoxialquilo, alquilo inferior de 1 a 10 átomos de carbono, alquilo inferior de 1 a 10 átomos de carbono sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, o O-aralquilo, SH, SCH3, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02 CH3, ON02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino. 4. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la porción de azúcar comprende un 2'-MOE, 2'-DMAOE, 2'-metox¡ o 2'~aminopropox¡. 5. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos oligonucleótidos tienen una longitud de aproximadamente 15 a 50 nucleótidos. 6. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos oligonucleótidos comprenden por lo menos 10 porciones de azúcar modificada. 7. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el arreglo de oligonucleótido comprende por lo menos 50% de oligonucleótidos con porciones de azúcar modificada. 8. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho arreglo de oligonucleótido comprende oligonucleótidos que específicamente hibridizan a ARNs de mamífero cortos. 9.- Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dichos oligonucleótidos específicamente hibridizan a ARNs humanos cortos. 10. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho arreglo de oligonucleótido es comprensivo para la detección de ARNs pequeños de un órgano, tejido o célula dada de un organismo. 11. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dichos oligonucleótidos están no covalentemente unidos a la superficie. 12.- Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el arreglo de oligonucleótido comprende oligonucleótidos con uno o más desoxirribonucleótidos. 13. - Un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el arreglo de oligonucleótidos se puede utilizar en una plataforma de sensor de onda evanescente. 14. - Un método para la detección de ARNs cortos que comprende los pasos de, (a) proporcionar una muestra biológica, en donde dicha muestra comprende ARNs cortos; (b) poner en contacto dicha muestra con un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13; (c) realizar una reacción de hibridación entre los ARNs endógenos cortos y los oligonucleótidos en el arreglo. 15.- Un método para correlacionar una muestra biológica para una condición biológica, que comprende (a) proporcionar una muestra biológica, en donde dicha muestra comprende ARNs cortos; (b) poner en contacto dicha muestra con un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho arreglo comprende un grupo de secuencias predefinidas adecuadas para la detección de ARNs cortos; (c) comparar el patrón de hibridación obtenido con un patrón de hibridación estándar. 16.- Un método de acuerdo con la reivindicación 14 o 15, en donde dichos ARNs cortos con micro ARNs (ARNmis). 17. - Un método de acuerdo con la reivindicación 15 o 16, en donde la muestra biológica está correlacionada con un estado de salud. 18. - Un método para la prognosis o diagnóstico de una enfermedad, que comprende (a) proporcionar una muestra biológica, (b) poner en contacto un arreglo de oligonucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 que corresponde a un grupo de secuencias definidas útiles para la detección de ARNs cortos, (c) obtener un patrón de hibridación, (d) comparar dicho patrón de hibridación con un patrón de hibridación estándar, en donde la presencia o ausencia de cierto patrón es indicativa de una probabilidad de desarrollar una enfermedad o la presencia de una enfermedad. 19. - Un método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la muestra biológica es de un ser humano. 20. - Un método de acuerdo con la reivindicación 18 o 19, en donde la enfermedad es cáncer, una enfermedad neurodegenerativa o una enfermedad infecciosa.