JP2005172819A - ポリヌクレオチドアレイ及びそれを利用した標的ポリヌクレオチドの検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｔｍによって基板上に固定化されたプローブポリヌクレオチド群を２以上含むポリヌクレオチドアレイ及びそれを利用する標的ポリヌクレオチド検出方法を提供する。
【解決手段】標的ポリヌクレオチドとのＴｍが設定された範囲に属するプローブポリヌクレオチドが固定されたスポット群を２以上含むポリヌクレオチドアレイ及びそれを利用した標的ポリヌクレオチドの検出方法である。
【選択図】図１

Description

本発明は、特定のＴｍ（溶融温度：Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有するプローブヌクレオチドを固定化したポリヌクレオチドアレイ、及びこれを利用した標的ポリヌクレオチドの検出方法に関する。

従来、マイクロアレイは当業界に公知であり、例えば特許文献１及び特許文献２に開示されている。また、前記マイクロアレイの製造方法には一般的に、フォトリソグラフィを利用する方法が知られている。

フォトリソグラフィを利用する場合、除去可能な保護基を有するヌクレオチド単量体で被覆された基板表面上の一定領域にエネルギーを露出させて該保護基を除去し、次いで該単量体と除去可能な保護基を有する他のヌクレオチド単量体とをカップリングさせ、これを反復することにより、ポリヌクレオチドのアレイを製造することができる。この場合、ポリヌクレオチドアレイ上に固定化されるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド単量体を一つずつ延長させる方式で合成する方法のほか、すでに合成されたポリヌクレオチドを一定の位置に固定化させる方法（スポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）法ともいう）によっても製造することができる。このようなポリヌクレオチドアレイの製造方法は、例えば特許文献２、特許文献３、特許文献４及びに開示されている。ポリヌクレオチドアレイ及びその製造方法についての前記文献は、本明細書において製造方法として援用できる。

このような従来のポリヌクレオチドアレイには、プローブポリヌクレオチドがランダムに固定化されている。また、１つのマイクロアレイには、１つのハイブリダイゼーション反応溶液注入口及び排出口が形成された覆いで覆われており、単一のハイブリダイゼーションだけがなされうるように区画されている。従って、従来は、標的ポリヌクレオチドとのＴｍによってプローブポリヌクレオチドが固定化され、複数のスポットを含むポリヌクレオチドアレイは知られていない。

従来、標的ポリヌクレオチドを検出する方法には、多様な方法が知られている。一般的には、標的ポリヌクレオチドを検出可能な標識でラベルし、ポリヌクレオチドアレイ上のプローブポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせた後、ハイブリダイゼーション結果を分析する過程からなる。例えば、特許文献５には、標的ポリヌクレオチドに標識をラベルする段階と、前記ラベルされた標的ポリヌクレオチドを基板に固定されているポリヌクレオチドプローブの集合体とハイブリダイゼーション条件下で接触させる段階と、前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションする前記プローブポリヌクレオチドの配列を決定する段階とを含み、前記プローブ集合体は、単位面積（ｃｍ^２）あたり１００以上のプローブを含むことを特徴とする。

しかし、従来の標的ポリヌクレオチド検出方法は、ポリヌクレオチドプローブがアレイ上に固定化されている集合体を使用するものであるが、標的ポリヌクレオチドとのＴｍによって区分して固定化されているポリヌクレオチドプローブのスポット群を利用する方法は開示されたことはなかった。
米国特許第５，４４５，９３４号明細書 米国特許第５，７４４，３０５号明細書 米国特許第５，１４３，８５４号明細書 米国特許第５，４２４，１８６号明細書 米国特許第５，８７１，９２８号明細書

従って、本発明は、標的ポリヌクレオチドとのＴｍが設定された範囲に属するプローブポリヌクレオチドが固定されたスポット群を２以上含むポリヌクレオチドアレイを提供することを解決課題とする。

本発明はまた、前記ポリヌクレオチドアレイを利用し、各プローブポリヌクレオチドスポット群によってハイブリダイゼーション溶液を異ならせてハイブリダイゼーションさせる標的ポリヌクレオチド検出方法を提供することを解決課題とする。

前記課題を解決するために本発明は、標的ポリヌクレオチドとのＴｍが設定された範囲に属するプローブポリヌクレオチドが固定されているスポット群を２以上含むポリヌクレオチドアレイを提供する。

本発明のポリヌクレオチドアレイには、標的ポリヌクレオチドとのＴｍが設定された範囲にあるプローブポリヌクレオチドが固定化されるスポット群が２以上存在することにより、１つのアレイを利用して検出できる標的ポリヌクレオチドの数を増加させて早く検出でき、それにより検出費用が節減される。

また、本発明のポリヌクレオチドアレイによれば、標的ポリヌクレオチドの検出において、感度と速度とを改善できる。

さらに、本発明の標的ポリヌクレオチド検出方法によれば、標的ポリヌクレオチドを高い感度で早く検出できる。

本発明において、「ポリヌクレオチドアレイ」とは、基板上にポリヌクレオチドが高密度に固定化されているスポットを有する分析システムであり、本願発明において、「スポット」とは、基板上に 同じポリヌクレオチドが固定化されている一定領域をいう。また、Ｔｍとは、ハイブリダイゼーション条件または変性条件下で、溶液中で、標的ポリヌクレオチドとプローブポリヌクレオチドとからなる二重ストランドポリヌクレオチドのうち、半分が２種の単一ストランドに変成される温度、または２種の単一ストランドポリヌクレオチドの半分がハイブリダイゼーションされる温度を意味いう。

本発明のポリヌクレオチドアレイは、例えばまず標的ポリヌクレオチドを選定し、それをプローブするためのプローブポリヌクレオチドとのＴｍを算出または測定する。得られたＴｍ分布を基に一定範囲に属するポリヌクレオチドの群に分ける。例えば、複数のプローブポリヌクレオチドにおいて、特定の標的ポリヌクレオチドと各プローブポリヌクレオチドとのＴｍが３０℃ないし６０℃の範囲で存在する場合、例えばＴｍ３０℃ないし４０℃、４０℃ないし５０℃、及び５０℃ないし６０℃の３群に分けることができる。次に、上記の通りに分類された各群のプローブポリヌクレオチドを一般的な固体基板上のポリヌクレオチド合成方法により、同じスポット群内に固定化する。

次に、同じスポット群内に固定化されたプローブポリヌクレオチドは、他のスポット群とは別にハイブリダイゼーション溶液と接触できるように、ハイブリダイゼーション溶液注入口及び排出口を有する覆いによって閉鎖される。その結果、各プローブポリヌクレオチドが固定化されたスポット群は、他のスポット群とは独立してハイブリダイゼーション溶液に露出される。本発明において、同じスポット群に固定化されるプローブポリヌクレオチドのＴｍの差は、すなわち同じスポット群に固定化されたプローブポリヌクレオチドのＴｍの最高値と最低値との差は、特別に限定されるものではないが、望ましくは１０℃以下であり、さらに望ましくは５℃以下である。

上記したように“Ｔｍ”とは、ハイブリダイゼーション条件または変性条件下で計算され、または測定される温度であるから、いずれかのポリヌクレオチド配列の塩基組成、長さによって同じＴｍが異なり、更に同じプローブポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとを使用しても、ハイブリダイゼーションの際に使われる溶液、変性剤及び安定化剤の濃度などによってＴｍが変わりうる。このようなＴｍは、実験的に決定されうるだけではなく、前記Ｔｍに及ぼす因子を反映する関係式によって計算できる。例えば、ホルムアミドを変性剤として使用し、Ｎａ^＋を安定化剤として使用する場合のＧＣ濃度０．４１モル％の５００ｂｐのポリヌクレオチドの前記Ｔｍは、下記のような関係式によって計算されうる。

式中、Ｍは、ｍＭで表示されたＮａ^＋のモル濃度であり、％ホルムアミドは、％（ｖ／ｖ）である（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ，Ｊ．；Ｗａｈｌ，Ｇ．；Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｐ１３８，ｐ２６９，１９８４参照）。

前記のようなＴｍ関係式は、溶液に含まれる変性剤または安定化剤によって選択して使用でき、このようなＴｍ関係式は当業者ならば容易に理解できる。

このように製造されたポリヌクレオチドアレイは、標的ポリヌクレオチドの検出方法において、感度及び速度が改善される。例えば、標的ポリヌクレオチドを検出する過程で、本発明のポリヌクレオチドアレイ上の各プローブポリヌクレオチドに対して使用されるハイブリダイゼーション溶液中に、相異なる濃度の変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ）を含ませることにより、高いＴｍを有するプローブポリヌクレオチドのＴｍを低くして、該プローブポリヌクレオチドのＴｍをより低温に調節することができる。これにより、１つのアレイ上で同じ温度でハイブリダイゼーションされるプローブポリヌクレオチドをさらに多く固定化することができる。その結果、１つのアレイを使用して検出できる標的ポリヌクレオチドの数が増加するため、速い速度で分析できる。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドアレイのうち、前記スポット群に固定化されているプローブポリヌクレオチドに試料を添加してハイブリダイゼーションする段階を含み、１以上の前記スポット群に変性剤、安定化剤及びその組み合わせから構成される化合物を含むハイブリダイゼーション溶液を添加し、各スポット群に固定化されているプローブポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのＴｍの差が設定された範囲内となるように調整することを特徴とする標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。望ましくは、前記Ｔｍの差は、０〜５℃であり、さらに望ましくは０〜３℃である。

本発明の方法において、前記ハイブリダイゼーションの結果を蛍光を測定することによって分析する段階をさらに含むことができる。この場合、前記標的ポリヌクレオチドは、多様な検出可能な基で標識されうる。前記標識には、例えば放射能物質、蛍光、酵素及びリーガンドが含まれる。望ましくは、前記標的ポリヌクレオチドは蛍光標示されたものである。

本発明で使われる前記変性剤は、二重ストランドポリヌクレオチドを不安定にする物質であり、特別に制限されるものではない。望ましくは、前記変性剤は、ポリヌクレオチド塩基との水素結合を不活性化させられる自由電子を有する部分を含む化合物である。前記変性剤は、例えばホルムアミド、尿素、グアニジンクロライド、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものでありうる。

また、本発明で使われる前記安定化剤は、二重ストランドポリヌクレオチドを安定化させる化合物であり、特別に制限されるものではない。一般的に、ポリヌクレオチドは、陰イオンを帯びているので、正電荷を帯びる化合物が二重ストランドポリヌクレオチドを安定化させると知られている。前記安定化剤は、望ましくは、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋のような陽イオンを含む金属塩である。

本発明において、添加される変性剤または安定化剤の濃度は、各スポット群に固定化されてなるプローブポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのＴｍの差が設定された範囲内のＴｍを有するように実験を介して経験的に決定するか、または前記のＴｍ関係式から計算によって計算することもできる。

本発明において、ハイブリダイゼーションの温度は、所望する特異性と感度とによって変わりうる。前記ハイブリダイゼーションは、Ｔｍより２０℃ないし２５℃さらに低温度で行われうるが、これに限定されるものではない。

以下、実施形態を介して本発明をさらに詳細に説明する。しかし、それら実施形態は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施形態によって限定されるものではない。

実施例１：Ｔｍにより分離されたスポットを有するポリヌクレオチドアレイの製造
本実施形態では、青年期発病糖尿病３（ＭＯＤＹ ３）と関連したＨＮＦ−１α（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−１ａ）、正常型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）遺伝子のプロモータとエクソン（Ｅｘｏｎ）１〜１０領域を標的ポリヌクレオチドとして使用した。前記１０個の標的ポリヌクレオチドは、１０対のプライマ対（配列番号１ないし２０）をプライマ（それぞれ１０ｐｍｏｌ）（表１参照）とし、人間の血液から分離したｇＤＮＡを鋳型（０．２μｍ）としたＰＣＲを行って得た。ＰＣＲは、初期変性；９５℃で５分；変性９５℃で３０秒、アニーリング６４℃で１０秒、及び延長７２℃で３０秒を３０回反復し、最終延長７２℃で３分反応して行った。前記標的ポリヌクレオチドのＰＣＲ過程で、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）を添加することにより、蛍光染料が標識された標的ポリヌクレオチドを調製した。

このような標的ポリヌクレオチドに対して完全マッチ（ＷＰ）及び不完全マッチ（ＭＰ）されるプローブポリヌクレオチドを設計した。このようなプローブポリヌクレオチドの特性を表２に示した。表２に示されたように、それらプローブポリヌクレオチドは、Ｔｍが５２．８℃ないし５６．９℃の範囲に属するプローブポリヌクレオチド群と、６９．４℃ないし７７．８℃の範囲に属する群の２群に分類され、それらをそれぞれスポット群１と２とに固定化した（図１参照）。表２に示すＴｍから算出すと、プローブポリヌクレオチドのスポット群１におけるＴｍの最高値と最低値との差は、４．１℃であり、スポット群２におけるＴｍの差は８．４℃である。

表２で示すＴｍ値は、サンタルチア９８パラメータを利用してＰＥＲＬ言語を使用して作ったプログラム（自体製作）を使用して計算した。このようなパラメータは当業者ならば容易に理解可能である。

本発明で、放射形ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）誘導体（ヒドロゲル）を利用したスポッティング方法でポリヌクレオチドマイクロアレイを製作した。具体的なポリヌクレオチドマイクロアレイの製作過程を次に示す。

（１）エポキシ基を有する放射形ＰＥＧ誘導体の合成
ＮａＯＨ水溶液（５０ｗｔ％、２ｍＬ）にエピクロロヒドリン（７．５ｍＬ）とテトラブチルアンモニウムブロミド（０．３２ｇ）を添加して撹拌した後、ペンタエリスリトールエトキシレート（１ｇ）をゆっくり加えて常温で１８時間撹拌した。ＴＬＣで反応の終結を確認したが、反応が終結していない場合、６０℃で１時間さらに撹拌した。その後、水（３０ｍＬ）を加えて希釈した後、メチレンクロライド（４０ｍＬ）で三回抽出した。有機溶液層をさらに飽和ＮａＨＣＯ_３（４０ｍＬ）で三回洗浄して分離し、無水ＭｇＳＯ_４を添加して乾燥させた後で低圧で溶媒を除去した。次に、真空で二日間乾燥させることによりエピクロロヒドリンの残余物を除去した。このようにして合成されたエポキシ基を有する放射形ＰＥＧ誘導体は、Ｈ−ＮＭＲと、０．１Ｎ ＨＢｒ／氷酢酸を利用するエポキシ基の滴定とで確認した。

（２）ジアミン架橋剤の合成
ＤＭＦ（４０ｍＬ）溶液にペンタ（エチレングリコール）ジ−トシレート（５ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を溶解させ、ＮａＮ_３（４．２ｇ、６４．１ｍｍｏｌ）とピリジン（０．５ｍＬ）とを順次添加した後、１４０℃で１８時間撹拌した。低圧で溶媒を除去し、水（２００ｍＬ）を加えつつ撹拌した後、メチレンクロライド（１００ｍＬ）を加えて抽出し、有機溶媒層をブリン（１００ｍＬ）で３回洗浄した。無水ＭｇＳＯ_４を添加して乾燥させ、低圧で溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィ（ＥＡ：ｎＨｅｘ＝１：２）を行ってジアジド中間体を得た。この中間体をメタノール（３０ｍＬ）に溶解させ、１０％のＰｄ−Ｃ（０．１当量）を添加した後、水素ガスを利用して１８時間還元反応を進めた。セライトパッド（Ｃｅｌｉｔｅ ｐａｄ）を利用して触媒を除去し、パッドはエタノールで洗浄した。濾液とエタノール洗浄液とを混合して低圧で溶媒を除去し、ジアミン架橋剤を得た。

（３）架橋剤を利用したゲルマトリックス溶液の製造
分子量が１，５００であるＰＥＧを２Ｎ ＮａＯＨの入っている水溶液に入れ、アイスバスで撹拌してＰＥＧ架橋剤溶液を準備した。

その後、前記（１）で合成したエポキシ基を有する放射形ＰＥＧ誘導体をカーボネート緩衝溶液（０．１Ｍ、ｐＨ９．１）に溶解させた後、前記（２）で調製したＰＥＧ架橋剤溶液をゆっくり注入し、３時間常温で撹拌した。反応が終結するのを確認した後、メチレンクロライドで抽出して低圧で溶媒を除去して４℃で保管した。

（４）チップ上にゲルマトリックス−ＤＮＡ接合体溶液のスポッティングを設けたポリヌクレオチドマイクロアレイの製造
エポキシ基を有する放射形ＰＥＧ、ジアミン架橋剤、そしてプローブポリヌクレオチドの当量比が４：１：４になるようにポリヌクレオチドプローブを前記（３）で製造したゲルマトリックス溶液に添加し、撹拌して３７℃で１４時間放置することによってマトリックス−ＤＮＡ接合体溶液を製造した後、これをスポッティング溶液とした。

前記スポッティング溶液をアミン基を有するように表面処理されたガラス表面上にスポッティングした後、４時間３７℃のウェットチャンバで放置した。

次に、背景ノイズの制御に必要な工程、すなわち標的ポリヌクレオチドをガラス表面に付着させないようにするために、スポッティングされていない箇所のガラス表面のアミン基が負電荷を帯びるように反応を実行して乾燥器に保管した。

比較例１
比較用ポリヌクレオディドマイクロアレイとして、単一のスポット群を有し、プローブポリヌクレオチドをＴｍによる調整を行なうことなしに前記スポット群に固定化した以外は実施例１と同様にしてマイクロアレイを調製した。比較例１における、スポット群内のプローブポリヌクレオチドのスポット群１におけるＴｍの最高値と最低値との差は、２５℃である。

実施例２：ハイブリダイゼーション及び標的ポリヌクレオチドの検出
標的ポリヌクレオチドは、実施例１でＰＣＲ増幅されたＨＮＦ−１αの正常型遺伝子のうち１０領域配列の混合物を使用した。

実施例１で製造した２つのスポット群を有するポリヌクレオチドアレイのうち、第１スポット群にはホルムアミドが添加されていないハイブリダイゼーション溶液を使用し、第２スポット群には７．５質量％のホルムアミドが添加されたハイブリダイゼーション溶液を使用してハイブリダイゼーションを行った。

実施例１で得られたＰＣＲ産物を１．８％のアガロースゲル電気泳動上で分子量マーカを基準として確認した。ＰＣＲを介して１０種の当該遺伝子部位（５７９，４５９，３６５，３０８，３３２，２４１，２８６，２３０，４１４及び１７１ｂｐ）がいずれも増幅されたことを確認した。前記ＰＣＲ産物をＰＣＲ産物精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を利用して精製した。精製されたＤＮＡを０．５Ｕ ＤＮａｓｅＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）で３７℃で１０分間反応させた後、反応停止液（ｓｔｏｐ ｍｉｘ）を添加して反応を停止させた。切断されたＤＮＡ産物を１５０ないし１８７．５ｎＭ濃度に調整し、９４℃で５分間変性させた後、氷上に２分間放置した。冷却されたＤＮＡ溶液を同量のハイブリダイゼーションバッファ（６ｘＳＳＰＥ−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と混合した後、プローブポリヌクレオチドマイクロアレイのハイブリダイゼーションチャンバに注入した。前記マイクロアレイを３２℃で１６時間培養した後、マイクロアレイを洗浄バッファＩ（６ｘＳＳＰＥ−ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．０５％）で５分間常温で洗浄した後、洗浄バッファＩＩ（３ｘＳＳＰＥ−ＴｒｉｔｏｎＸ−１００ ０．００５％）で５分間常温で洗浄した。１５分間常温で乾燥させた後、スキャニングした。この時、スキャニングは、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（米国）のＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂモデルスキャナを利用してイメージを生成し、ＧｅｎｅＰｉｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）を利用してイメージを分析した。蛍光測定は５３２ｎｍで行った。

比較例２
比較例は、比較例１で調製したポリヌクレオチドアレイを使用し、ここにホルムアミドが添加されていないハイブリダイゼーション溶液を使用し、３２℃と４０℃とでハイブリダイゼーションした。その他の条件は実施例１と同一とした。

その結果を表３に示す。なお、表３においてスポット群についての事項は、実施例にのみ該当する。

表３に示すように、本発明の実施例マイクロアレイのスポット群１のハイブリダイゼーションの条件は、比較例において、温度３２℃でハイブリダイゼーションを行なったものと同じ条件であるため、両者間で蛍光強度やｌｎ（Ｗｐ／Ｍｐ）値はほとんど変化していない。一方、実施例マイクロアレイのスポット２の蛍光強度は、比較例において３２℃でハイブリダイゼーションを行なった場合に比べて若干減少するが、ｌｎ（Ｗｐ／Ｍｐ）値は顕著に増加した。また、比較例において４０℃でハイブリダイゼーションを行なったものと比して、蛍光強度やｌｎ（Ｗｐ／Ｍｐ）値がいずれも増加した。すなわち、基板上にＴｍによってプローブポリヌクレオチドを２つのスポット群に固定化したマイクロアレイを使用して同じ温度でハイブリダイゼーションすることにより、２つのマイクロアレイを使用して得られる検出結果を得ることができた。

Ｔｍの分布が広いプローブポリヌクレオチドを用いて１つの温度条件でハイブリダイゼーションを行った場合、Ｔｍが低いプローブ群またはＴｍが高いプローブ群のうちいずれか一方に条件を合わせ、または双方に最適化されたハイブリダイゼーション温度でハイブリダイズしなければならない。しかしながら、本実施例に示されたように、本発明のマイクロアレイを使用した場合、本発明の方法によれば、ハイブリダイゼーション液中に変性剤または安定剤を添加することにより、同じマイクロアレイで同じ温度でハイブリダイゼーションを行うことができる。

本発明のポリヌクレオチドアレイは、マイクロアレイを利用した多様な分析方法に有用であり、本発明の標的ポリヌクレオチド検出方法は、ポリヌクレオチドの分析を介した疾病の診断、治療及び予防に有用である。

２つのスポット群を有する本発明のポリヌクレオチドアレイの一形態を図式的に示した図面である。

Claims (9)

1. 標的ポリヌクレオチドとのＴｍが設定された範囲に属するプローブポリヌクレオチドが固定されたスポット群を２以上含むポリヌクレオチドアレイ。
2. 前記固定化されたプローブポリヌクレオチドのスポット群内のＴｍの差は、１０℃以下である請求項１に記載のポリヌクレオチドアレイ。
3. 前記固定化されたプローブポリヌクレオチドのスポット群内のＴｍの差は、５℃以下である請求項１に記載のポリヌクレオチドアレイ。
4. 請求項１に記載のポリヌクレオチドアレイの、前記スポット群に固定化されているプローブポリヌクレオチドに試料を添加してハイブリダイゼーションする段階を含み、１以上の前記スポット群に変性剤、安定化剤及びその組み合わせから構成される化合物を含むハイブリダイゼーション溶液を添加し、各スポット群に固定化されているプローブポリヌクレオチドと標的ポリヌクレオチドとのＴｍの差が設定された範囲内となるように調整することを特徴とする標的ポリヌクレオチドを検出する方法。
5. 前記標的ポリヌクレオチドは蛍光標示で標識されており、前記ハイブリダイゼーションの結果を蛍光を測定することによって分析する段階をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記変性剤は、ホルムアミド、尿素、グアニジンクロライド、ＤＭＦ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
7. 前記安定化剤は、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋及びＭｇ^２＋よりなる群から選択される１以上のイオンであることを特徴とする請求項４に記載の方法。
8. 前記Ｔｍの差は、０〜５℃であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
9. 前記Ｔｍの差は、０〜３℃であることを特徴とする請求項４に記載の方法。