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1. Gebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Polynukleotid-Mikroarray, welches
Polynukleotide einschließt, die
entsprechend einer Schmelztemperatur (Tm) immobilisiert sind, sowie
ein Verfahren zum Nachweis von Ziel-Poiynukleotiden unter Verwendung
von selbigem.
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2. Beschreibung des Standes
der Technik
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Ein
Mikroarray ist im gängigen
Stand der Technik gut bekannt Beispiele eines Mikroarrays werden
offenbart in US-Patent Nr. 5,445,934 und 5,744,305. Ein Verfahren
zum Erzeugen eines Mikroarrays unter Verwendung von Fotolithografie
ist um Allgemeinen bekannt. Entsprechend einem Verfahren zum Herstellen
eines Polynukleotid-Mikroarrays unter Verwendung von Fotolithografie
werden vorbestimmte Regionen eines Substrats, gecoatet mit einem
Monomer, welches eine entfernbare Schutzgruppe aufweist, irgendeiner
Energiequelle ausgesetzt, um die Schutzgruppe zu entfernen. Anschließend wird
das entschützte
Monomer mit einem Monomer gekoppelt, welches eine entfernbare Schutzgruppe
aufweist. Wiederholung der oben dargelegten Prozesse erzeugt ein
Polynukleotid-Mikroarray. In diesem Fall können Polynukleotide, welche
auf dem Polynukleotid-Mikroarray immobilisiert werden sollen, hergestellt
werden durch fortschreitende Verlängerung von Polynukleotid-Monomeren.
Alternativ können
zuvor synthetisierte Polynukleotide immobilisiert werden auf vorbestimmten
Regionen auf dem Polynukleotid-Mikroarray (auch als so genannte "Spotting-Technik" bezeichnet). Solche
Fabrikations-Verfahren für
Polynukleotid-Mikroarrays werden illustriert in US-Patent Nr. 5,744,305,
5,143,854 und 5,424,186. Die oben dargelegte Patentdokumente, betreffend
Polynukleotid-Mikroarrays und Fabrikations-Verfahren davon, sind
hier in ihrer Gesamtheit mit Verweis eingeschlossen.
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Jedoch
werden Sonden-Polynukleotide zufällig
auf diesen konventionellen Polynukleotid-Mikroarrays immobilisiert.
Des Weiteren ist ein einzelnes Mikroarray mit einer Hülle bedeckt,
ausgebildet mit einem Einlass und einem Auslass für eine einzelne
Hybridisierungslösung,
und folglich wird nur eine einzelne Hybridisierungsreaktion erlaubt.
Daher machen konventionelle Mikroarray-Techniken keine Angaben betreffend
die Immobilisie rung von Sonden-Polynukleotiden entsprechend dem
Tm bzw. Polynukleotid-Mikroarrays,
welche eine Vielzahl von Blöcken
einschließen.
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JP 2002 303626 A ist
gerichtet auf eine Vorrichtung, in welcher Stellen (spots) von DNA-Sonden als "ein Kanal" oder eine Rille
in abnehmender Reihenfolge von Schmelztemperaturen angeordnet sind.
Die Probe wird elektrophoretisch bewegt durch den Kanal und die
Temperatur innerhalb des Kanals wird reguliert nach der Schmelztemperatur,
bei welcher die Elektrophorese-Probe an einer spezifischen Zeit
anlangt. Es gibt jedoch keine Gruppierung von Stellen von ähnlichen
Schmelztemperaturen.
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WO
01/79458 A lehrt ein Verfahren zum Konzipieren einer Vielzahl von
einfangenden Polynukleotid-Sonden zur Verwendung auf einer Unterlage,
an welche komplementäre
Polynukleotid-Sonden hybridisieren mit wenig Mismatches, wobei die
Vielzahl von Polynukleotid-Sonden eine Schmelztemperatur aufweist
innerhalb eines engen Bereiches. Keine Diskriminierung erfolgt mit
Blick auf ihren Tm-Bereich, so dass er innerhalb eines vorbestimmten
Bereichs sein soll, zur entsprechenden Gruppierung der eingefangenen
Polynukleotid-Sonden.
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Verschiedene
Verfahren zum Nachweis von Target-Polynukleotiden sind bekannt.
Im Allgemeinen werden entsprechend dieser Verfahren Ziel-Polynukleotide
mit einem nachweisbaren Marker gelabelt und anschließend mit
Sonden-Polynukleotiden hybridisiert auf einem Polynukleotid-Mikroarray.
Nachdem die Hybridisierung vollständig ist, wird das Ergebnis
der Hybridisierung analysiert. Beispielsweise offenbart das US-Patent
Nr. 5,871,928 ein Verfahren zum Nachweis der Hybridisierung zwischen
Target-Polynukleotiden und Sonden-Polynukleotiden, welches Folgendes
umfasst: (a) Anbinden von Labeln an Ziel-Polynukleotide, (b) Inkontaktbringen
unter Hybridisierungsbedingungen der gelabelten Ziel-Polynukleotide
mit einer Sammlung von Sonden-Polynukleotiden, immobilisiert auf
bekannten Regionen eines Substrates; und (c) Bestimmen der Sequenzen
der Sonden-Polynukleotide, welche mit den Ziel-Polynukleotiden hybridisieren,
wobei die Sammlung zumindest 100 Sonden/cm2 umfasst.
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Entsprechend
dem oben genannten Verfahren wird die Sammlung der Sonden-Polynukleotide,
immobilisiert auf dem Mikroarray eingesetzt. Jedoch wird kein Verfahren
erwähnt
des Verwendens von Blöcken
von immobilisierten Sonden-Polynukleotiden, welche entsprechend
dem Tm zwischen den Sonden-Polynukleotiden und den Ziel-Polynukleotiden
angeordnet sind.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Polynukleotid-Mikroarray zur Verfügung, welches
Sonden-Polynukleotide einschließt,
die auf einem Substrat immobilisiert sind, in welchem die Sonden-Polynukleotide
entsprechend einer Schmelztemperatur (Tm) zwischen den Sonden-Polynukleotiden
und den Ziel-(Target)-Polynukleotiden angeordnet sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verfügung zum
Nachweis von Ziel-Polynukleotiden unter Verwendung des Polynukleotid-Arrays,
in welchem Hybridisierung durchgeführt wird unter Verwendung einer
unterschiedlichen Hybridisierungs-Lösung
entsprechend einem Block von Sonden-Polynukleotiden.
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Entsprechend
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polynukleotid-Mikroarray
zur Verfügung
gestellt, welches zwei oder mehr Gruppen an Stellen umfasst, auf
welchen Sonden-Polynukleotide immobilisiert sind, wobei die Sonden-Polynukleotide
einer jeden Gruppe Tms aufweisen innerhalb eines vorbestimmten Bereichs
von Tm zwischen den Sonden-Polynukleotiden und den Ziel-Polynukleotiden.
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Entsprechend
einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren
bereitgestellt zum Nachweis von Ziel-Polynukleotiden, welches das
Abscheiden (Spotting) von Proben, welche Ziel-Polynukleotide enthalten,
an Stellen einschließt,
auf den Sonden-Polynukleotiden, immobilisiert auf den Gruppen von
den Stellen des Polynukleotid-Mikroarrays, gefolgt von Hybridisieren,
wobei zumindest eine Gruppe der Stellen (Spots) behandelt wird mit
einer Hybridisierungslösung,
welche ein denaturierendes Agens, ein stabilisierendes Agens oder
eine Mischung davon enthält,
sodass die Abweichung von den Tms zwischen den Sonden-Polynukleotiden,
immobilisiert auf den Gruppen der Stellen, und den Ziel-Polynukleotiden
innerhalb eines vorbestimmten Bereiches liegt.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die
oben genannten sowie weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden
Erfindung werden offensichtlicher werden durch Beschreiben der detaillierten
exemplarischen Ausführungsformen
davon unter Verweis auf die beigefügten Zeichnungen, in welchen:
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1 ein
Beispiel eines Polynukleotid-Mikroarrays illustriert, welches zwei
Blöcke
entsprechend der vorliegenden Erfindung einschließt.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Polynukleotid-Mikroarray zur Verfügung, welches
zwei oder mehrere Gruppen (im Folgenden hier als "Blöcke" bezeichnet) von
Stellen einschließt,
auf welchen Sonden-Polynukleotide immobilisiert sind, wobei die
Sonden-Polynukleotide
einer jeden Gruppe Schmelztemperaturen (Tms) aufweisen, innerhalb
eines vorbestimmten Bereichs von einem Tm zwischen den Sonden-Polynukleotiden
und Ziel-Polynukleotiden.
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Wie
hier verwendet, zeigt der Begriff "Polynukleotid-Mikroarray" ein Analysesystem,
in welchem Polynukleotid-Gruppen in einer hohen Dichte auf einem
Substrat immobilisiert sind. Wie hier verwendet, bezeichnet der
Begriff "Stellen" (Spots) Regionen
auf dem Mikroarray, wo die gleichen Polynukleotide auf einem Substrat immobilisiert
sind.
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In
dem Polynukleotid-Mikroarray der vorliegenden Erfindung werden beispielsweise
zuerst Ziel-Polynukleotide ausgewählt. Tms zwischen den Ziel-Polynukleotiden
und den Sonden-Polynukleotiden zu ihrem Nachweis werden berechnet.
Basierend auf den Tm-Werten,
die so erhalten werden, werden die Sonden-Polynukleotide gruppiert
Beispielsweise, wenn der Tm zwischen spezifischen Ziel-Polynukleotiden
und Sonden-Polynukleotiden im Bereich von 30 bis 60°C liegen,
können
die Sonden-Polynukleotide unterteilt werden in drei Gruppen entsprechend
dem Tm, d. h. 30–40°C, 40–50°C und 50–60°C. Sonden-Polynukleotide
einer jeden Gruppe werden immobilisiert auf der gleichen Region
entsprechend den oben genannten konventionellen Verfahren zur Synthese
von Polynukleotiden auf einem festen Substrat. Die Sonden-Polynukleotide
einer jeden Gruppe, immobilisiert auf der gleichen Region, sind
bedeckt mit einer Abdeckung, welche einen Einlass und einen Auslass
aufweist für
eine korrespondierende Hybridisierungslösung, um unabhängig jede
Gruppe von Sonden-Polynukleotide der korrespondierenden Hybridisierungslösung auszusetzen.
Als ein Ergebnis bildet die Region, auf welcher eine jede Gruppe
der Sonden-Polynukleotide immobilisiert ist, ein Kompartiment aus,
welches unabhängig
der korrespondierenden Hybridisierungs-Lösung ausgesetzt werden kann.
In der vorliegenden Erfindung ist der Unterschied im Tm zwischen
Sonden-Polynukleotid-Gruppen
immobilisiert auf dem gleichen Block, nicht speziell limitiert,
ist jedoch vorzugsweise 10°C
oder weniger und mehr bevorzugt 5°C
oder weniger.
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Wie
hier verwendet, bezieht sich der Begriff "Schmelztemperatur (Tm)" auf die Temperatur,
bei welcher 50% der doppelsträngigen
Polynukleotide in einzelne Stränge
getrennt sind, unter Denaturierungs-Bedingungen oder 50% der einzelsträngigen Polynukleotide hybridisiert
sind oder unter Hybridisierungsbedingungen. Der Tm kann entsprechend
einer verwendeten Lösung
variieren, entsprechend der Basen-Zusammensetzung und entsprechend
der Länge
einer Polynukleotidsequenz sowie der Konzentration des denaturierenden
Agens und eines stabilisierenden Agens. Der Tm kann bestimmt werden
auf experimentellem Wege oder berechnet werden unter Verwendung
einer Korrelations-Gleichung,
welche von den Parametern abhängt,
die den Tm beeinflussen. Beispielsweise kann der Tm berechnet werden
durch die folgende Gleichung: Tm = 81,5 + 16,6 × log10 M + 0,41(%GC) – 0,61(%Formamid) – 500/Länge(bp),wobei
M eine molare Konzentration (mM) von Na+ ist
und % Formamid gleich % (v/v) an Formamid ist (siehe Meinkoth, J.
und Wahl, G.: (1984) Anal. Biochem. 138, 269).
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Gleichungen
für Tm,
wie die oben dargestellte Gleichung, können selektiv verwendet werden
entsprechend einem denaturierenden oder stabilisierenden Agens,
enthalten in einer Reaktionslösung.
Diese Gleichungen für
Tm sind leicht verfügbar
für den
gewöhnlichen
Durchschnittsfachmann.
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Wenn
das so hergestellte Polynukleotid-Mikroarray in einem Verfahren
zum Nachweis von Ziel-Polynukleotiden verwendet wird, können die
Sensitivität
und Schnelligkeit des Verfahrens verstärkt werden. Beispielsweise
kann beim Nachweis von Ziel-Polynukleotiden, wenn die denaturierende
Agenzien unterschiedlicher Konzentrationen in den Hybridisierungslösungen für Gruppen
von Sonden-Polynukleotiden enthalten sind, die auf dem Polynukleotid-Mikroarray
der vorliegenden Erfindung immobilisiert sind, der Tm einer Gruppe von
Sonden-Polynukleotiden mit hohem Tm so eingestellt werden, dass
er in der Nähe
des Tms einer Gruppe von Sonden-Polynukleotiden mit dem niedrigsten
Tm liegt. Folglich können
mehr Sonden-Polynukleotide, welche in der Lage sind, bei der gleichen
Temperatur zu hybridisieren, auf einem einzigen Mikroarray immobilisiert werden.
Als ein Ergebnis können
mehr Ziel-Polynukleotide nachgewiesen werden auf einem einzigen
Mikroarray. Des Weiteren erhöht
die Verwendung eines einzelnen Mikroarrays die Nachweis-Rate.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Verfügung zum
Nachweis von Ziel-Polynukleotiden, welches das Abscheiden von Proben,
welche die Ziel-Polynukleotide
enthalten, auf Stellen auf den Sonden-Polynukleotiden einschließt, immobilisiert
auf den Gruppen der Stellen des Polynukleotid-Mikroarrays der vorliegenden
Erfindung, gefolgt von Hybridisierung, wobei zumindest eine Gruppe
der Stellen behan delt ist, mit einer Hybridisierungslösung, welche
ein denaturierendes Agens, ein stabilisierendes Agens oder eine Mischung
davon enthält,
so dass die Abweichung von Tms zwischen den Sonden-Polynukleotiden,
immobilisiert auf den Gruppen der Spots in den Ziel-Polynukleotiden,
innerhalb eines vorbestimmten Bereiches liegt.
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Vorzugsweise
liegt die Abweichung in einem Bereich von 0 bis 5°C und mehr
bevorzugt von 0 bis 3°C.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann des Weiteren den Nachweis
des Ergebnisses der Hybridisierung unter Verwendung von fluoreszentem
Licht einschließen.
In diesem Fall können
die Ziel-Polynukleotide mit verschiedenen nachweisbaren Markern
gelabelt sein. Beispielsweise können
die Marker ein radioaktives Material sein, ein fluoreszierendes
Material, ein Enzym oder ein Ligand. Vorzugsweise werden die Ziel-Polynukleotide
mit einem fluoreszenten Material gelabelt.
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Das
denaturierende Agens, wie hier verwendet, ist ein Material, welches
doppelsträngige
Polynukleotide labil macht und ist nicht besonders eingeschränkt. Vorzugsweise
ist das denaturierende Agens eine Verbindung, welche freie Elektronen
aufweist, welche Wasserstoffbindungen zwischen Polynukleotid-Basen
inaktivieren können.
Beispielsweise ist das denaturierende Agens ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Formamid, Harnstoff, Guanidinchlorid, Dimethylformamid
(DMF) bzw. einer Mischung davon. Das stabilisierende Agens, wie
hier verwendet, ist eine Verbindung, welche doppelsträngige Polynukleotide
stabilisiert, und ist nicht besonders eingeschränkt. Da Polynukleotide im Allgemeinen
negativ geladen sind, ist es bekannt, dass eine positiv geladene
Verbindung doppelsträngige
Polynukleotide stabilisiert. Vorzugsweise ist das stabilisierende
Agens ein Metallsatz, welches Kationen einschließt, wie z. B. Na+,
K+, Ca2+ und Mg2+.
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In
der vorliegenden Erfindung können
die Konzentration des denaturierenden Agens und des stabilisierenden
Agens empirisch bestimmt werden durch Experimente oder können alternativ
berechnet werden aus der obigen Gleichung für Tm.
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In
der vorliegenden Erfindung kann die Hybridisierungstemperatur variieren
entsprechend der gewünschten
Spezifität
und Sensitivität.
Die Hybridisierung kann durchgeführt
werden bei einer Temperatur, welche 20–25°C niedriger ist als der Tm,
ist jedoch nicht darauf limitiert.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung genauer beschrieben durch
die Beispiele. Jedoch werden die folgenden Beispiele nur aus Grund
der Illustration zur Verfügung
gestellt und die vorliegende Erfindung ist folglich nicht auf sie
limitiert.
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Beispiele
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Beispiel 1: Herstellung
von Polynukleotid-Mikroarrays mit Stellen, welche entsprechend dem
Tm gruppiert sind
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In
diesem Beispiel wurden als Ziel-Polynukleotide ein Promotor und
die Exons 1–10
eines Wildtyp HNF-1α (Hepatocytet-Nuclear
Factor-1α)-Gens,
assoziiert mit Maturity-Onset
Ddiabetes of the Young (MODY3) verwendet. Multiple PCR für die 10
Ziel-Polynukleotide
wurde durchgeführt
unter Verwendung von 10 Paaren an Primern (SEQ ID NR.: 1–20) (10
pmol für
jeden Primer) und gDNA (0,2 μg),
erhalten von menschlichem Blut als ein Templat (siehe Tabelle 1).
Die multiple PCR wurde durchgeführt
mit folgenden Bedingungen: ursprüngliche
Denaturierung bei 95°C
für 5 Minuten;
30 Zyklen der Denaturierung bei 95°C für 30 Sekunden, Annealen bei
64°C für 10 Sekunden
und Extension bei 72°C
für 30
Sekunden; und letztendliche Extension bei 72°C für 3 Minuten. Während der
PCR wurde Cy3-dUTP (Amersham Biosciences, Uppsala, Schweden) hinzugegeben,
um die Ziel-Polynukleotide, gelabelt mit einem Fluoreszenzfarbstoff,
herzustellen.
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Tabelle
1: Primer, verwendet bei der Amplifikation von Ziel-Polynukleotiden,
abgeleitet vom HNF-1α-Gen
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Sonden-Polynukleotide,
welche perfekt mit den Ziel-Polynukleotiden zusammenpassten oder
ein Mismatch ausbildeten, wurden konzipiert. Charakteristika dieser
Sonden-Polynukleotide sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Wie in
Tabelle 2 dargestellt, wurden diese Sonden-Polynukleotide in zwei
Gruppen gruppiert, d. h. eine Gruppe von Sonden-Polynukleotiden mit Tm von 52,8–56,9°C und eine
Gruppe von Sonden-Polynukleotiden mit einem Tm von 69,4–77,8°C und die
beiden Gruppen wurden entsprechend immobilisiert auf Blöcken 1 und
2 (siehe 1).
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Tabelle
2: Sequenzen und Charakteristika von Sonden-Polynukleotiden
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Die
Tm-Werte, wie in Tabelle 2 präsentiert,
wurden berechnet durch ein Programm (Samsung, Korea), implementiert
in die PERL-Sprache unter Verwendung von Santa Lucia 98-Parametern.
Diese Parameter sind leicht verfügbar
durch die gewöhnlichen
Fachleute auf dem Gebiet.
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Ein
Polynukleotid-Mikroarray, entsprechend der vorliegenden Erfindung,
wurde erzeugt durch die Abscheidungs-Technik (Spotting-Technik)
unter Verwendung eines radialen Polyethylenglycol-Derivats (Hydrogel).
Ein illustratives Herstellungs-Verfahren für das Polynukleotid-Mikroarray
war wie folgt.
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1. Synthese
von radialem Polyethylenglycol-Derivat mit Epoxygruppe
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Epichlorhydrin
(7,5 ml) und Tetrabutylammoniumbromid (0,32 g) wurden zu einer wässrigen
Lösung von
NaOH (50 Gew.-%, 2 ml) hinzugegeben und gerührt. Anschließend wurde
Pentaerythritolethoxylat (1 g) graduell hinzugefügt und bei Raumtemperatur 18
Stunden gerührt.
Das Reaktionsende wurde identifiziert durch Dünnschichtchromatografie (TLC).
Wenn die Reaktion nicht vollständig
abgelaufen war, wurde die Reaktionslösung weiter gerührt bei
60°C für 1 Stunde.
Die resultierende Lösung
wurde verdünnt
mit Wasser (30 ml) und dreimal extrahiert mit Methylenchlorid (40
ml), um eine organische Schicht zu erhalten. Die organische Schicht
wurde dreimal gewaschen mit gesättigtem
NaHCO3 (40 ml) und wasserfreies MgSO4 wurde hinzugefügt, gefolgt von Trocknen und
Entfernen eines Lösungsmittels
bei niedrigem Druck. Anschließend
wurde Trocknen durchgeführt
im Vakuum für
zwei Tage, um einen Epichlorhydrinrückstand zu entfernen. Als ein
Ergebnis wurde ein radiales Polyethylenglycolderivat mit einer Epoxygruppe
erhalten und identifiziert durch H-NMR sowie Titration der Epoxygruppe
unter Verwendung von 0,1N HBr/Essigsäure (Eisessig).
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2. Synthese
von Diamin-Quervernetzungs-Agens
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Penta(ethylenglycol)di-tosylat
(5 g, 9,2 mmol) wurde aufgelöst
in Dimethylformamid (DMF) (40 ml). NaN3 (4,2
g, 64, 1 mmol) und Pyridin (0,5 ml) wurden nachfolgend hinzugefügt und bei
140°C für 18 Stunden gerührt. Ein
Lösungsmittel
wurde entfernt aus der Reaktionslösung bei niedrigem Druck und
Wasser (200 ml) wurde unter Rühren
hinzugegeben. Die Reaktionslösung
wurde extrahiert mit Methylenchlorid (100 ml), um eine organische
Schicht zu erhalten. Die organische Schicht wurde dreimal gewaschen
mit Salzlösung
(100 ml) und wasserfreies MgSO4 wurde hinzugefügt, gefolgt
von Trocknen, Entfernen eines Lösungsmittels
bei geringem Druck und Flash-Säulenchromatografie
(EA:nHex = 1:2), was zu einem Diazidintermediat führte. Das Diazidintermediat
wurde aufgelöst
in Methanol (30 ml), 10% Pd-C (0,1 Äquivalente) wurden hinzugefügt und eine
Reduktion wurde durchgeführt
in einer Sauerstoffatmosphäre
für 18
Stunden. Ein Katalysator wurde entfernt aus der resultierenden Lösung unter
Verwendung eines Celite-Tupfers
und der Celite-Tupfer wurde mit Ethanol gewaschen. Ein resultierendes
Filtrat sowie die Ethanolwaschlösung
wurde vermischt, gefolgt von der Entfernung eines Lösungsmittels
bei einem geringen Druck, um ein Diamin-quervernetztes Agens zu
ergeben.
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3. Herstellung
einer Gel-Matrix-Lösung
unter Verwendung eines Quervernetzungsagens
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Polyethylenglycol
(PEG) mit einem Molekulargewicht von 1500 wurde zu einer wässrigen
Lösung
von 2N NaOH hinzugegeben und in einem Eisbad gerührt, um eine PEG-Quervernetzungsagens-Lösung herzustellen.
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Als
Nächstes
wurde das radiale Polyethylenglycol-Derivat mit einer Epoxygruppe,
wie in Abschnitt 1 synthetisiert, in einem Carbonatpuffer (0,1 M,
pH 9,1) aufgelöst.
Die zuvor hergestellte PEG-Quervernetzungsagens-Lösung wurde
graduell hinzugefügt
und bei Raumtemperatur für
3 Stunden gerührt.
Wenn das Reaktionsende identifiziert wurde, wurde die resultierende
Lösung
extrahiert mit Methylenchlorid und bei 4°C nach Entfernung eines Lösungsmittels
bei einem geringen Druck gelagert.
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4. Herstellen
eines Polynukleotid-Mikroarrays durch Aufbringen der Gel-Matrix-DNA-Konjugat-Lösung auf Chips
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Zuvor
hergestellte Sonden-Polynukleotide wurden zur Gel-Matrix-Lösung, hergestellt
in Abschnitt 3, hinzugefügt,
so dass das radiale Polyethylenglycol mit einer Epoxygruppe, das
Diamin-Quervernetzungsagens und die Sonden-Polynukleotide in einem Äquivalentenverhältnis von
4:1:4 vorlagen, und inkubiert bei 37°C für 14 Stunden unter Rühren, um
eine Matrix-DNA-Konjugat-Lösung
zu erhalten. Die Matrix-DNA-Konjugat-Lösung wurde verwendet als eine
Aufbringungs-(Spotting)-Lösung.
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Die
Aufbringungs-Lösung
wurde auf einem Glas abgeschieden, welches oberflächenbehandelt
worden war, so dass es eine Aminogruppe trug und in einer feuchten
Kammer bei 37°C
für 4 Stunden
inkubiert. Anschließend
wurde zur Durchführung
einer Hintergrundkontrolle, d. h., um die Anbindung von Ziel-Polynukleotiden
an die Oberfläche
des Glases zu verhindern, das Glas oberflächenbehandelt, so dass Amino-Gruppen auf
der nicht abgeschiedenen Oberfläche
des Glases negativ geladen waren, und anschließend in einer Trocken-Maschine
inkubiert.
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Inzwischen
wurden Kontroll-Polynukleotid-Mikroarrays erzeugt. In den Kontroll-Polynukleotid-Mikroarrays
wurden Sonden-Polynukleotide immobilisiert auf einem Substrat, ohne
dass sie durch Tm gruppiert wurden, so dass eine Hybridisierung
durchgeführt
wurde unter dem gleichen Hybridisierungs-Bedingungen.
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Beispiel 2: Hybridisierung
und Nachweis von Ziel-Polynukleotiden
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Eine
Mischung der 10 Regionen-Sequenzen des Wildtyp HNF-1α-Gens von
Beispiel 1 wurde verwendet für
Ziel-Polynukleotide.
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Eine
Hybridisierungs-Lösung,
welche kein Formamid enthielt, wurde in dem Block 1 des Polynukleotid-Mikroarrays
verwendet, wobei die beiden Blöcke
wie in Beispiel 1 erzeugt worden waren. Auf der anderen Seite wurde
eine Hybridisierungslösung,
welche 7,5% Formamid enthielt, in dem Block 2 verwendet.
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Die
multiplen PCR-Produkte, erhalten in Beispiel 1, wurden identifiziert
durch Vergleich mit einem Molekulargewicht-Marker durch 1,8% Agarosegel-Elektrophorese.
Die multiple PCR führte
zu einer Amplifikation von allen der 10 Target-Gen-Stellen ((579,
459, 365, 308, 332, 241, 286, 230, 414 und 171 bp). Die PCR-Produkte
wurde aufgereinigt unter Verwendung eines PCR-Produkt-Aufreinigungs-Kits
(Qiagen). Die aufgereinigten DNAs wurden inkubiert mit 0,5 U DNase
I (Boehringer Mannheim, Deutschland) bei 37°C für 10 Minuten und eine Stopp-Mischung
wurde dann zur Reaktions-Beendigung hinzugefügt. Die geschnittenen DNA-Produkte
wurden so eingestellt, dass sie eine Konzentration aufwiesen von
150–187,5
nM, denaturiert bei 94°C für 5 Minuten
und inkubiert über
Eis für
2 Minuten. Die gekühlte
DNA-Lösung
wurde gemischt mit derselben Menge eines Hybridisierungs-Puffers
(6 × SSPE-0,1%
Triton X-100) und anschließend
zu einer Hybridisierungs-Kammer des Polynukleotid-Mikroarrays hinzugefügt. Das
Mikroarray wurde inkubiert bei 32°C
für 16 Stunden
und gewaschen mit Wasch-Puffer I(6 × SSPE-Triton X-100 0,05% bei
Raumtemperatur für
5 Minuten und anschließend
einem Waschpuffer II (3 × SSPE-Triton
X-100 0,005%) bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Das Mikroarray
wurde getrocknet bei Raumtemperatur für 15 Minuten und gescannt (Testgruppe).
Beim Scannen wurden Bilder erzeugt unter Verwendung eines GenePix
4000B-Modellsscanners (Axon Instruments, Amerika) und Bildanalyse
wurde durchgeführt
unter Verwendung von GenePix Pro-Software (Son Instruments, Amerika).
Fluoreszenzlicht wurde gemessen bei 532 nm.
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Für Kontrollexperimente,
wie oben beschrieben, wurden Polynukleotid-Mikroarrays mit immobilisierten Sonden-Polynukleotiden
darin, dergestalt, dass Hybridisierung unter den gleichen Bedingungen
stattfand, d. h. Polynukleotid-Mikroarrays, welche nicht in Blöcke durch
Tms unterteilt wurden, eingesetzt. Hybridisierung wurde durchgeführt unter
Verwendung einer Hybridisierungslösung, welche kein Formamid
enthielt, bei 32°C (Kontrol le
1) und bei 40°C
(Kontrolle 2). Andere Bedingungen der Kontrollen 1 und 2 waren die
gleichen.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Verweise auf Blöcke in Tabelle
3 gelten nur für
die Testgruppe. Tabelle
3: Hybridisierungsergebnisse
- Wp: Sonden-Polynukleotide, welche perfekt
mit Target-Polynukleotiden zusammenpassten
- Mp: Sonden-Polynukleotide, welche mit den Ziel-Polynukleotiden
Mismatches ausbildeten
- Verhältnis:
In(Wp/Mp)-Wert
- Testgruppe: Block 1; 0% Formamid, 32°C, Block2; 7,5% Formamid, 32°C
- Kontrolle 1: 0% Formamid, 32°C
- Kontrolle 2: 0% Formamid, 40°C
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Wie
in Tabelle 3 gezeigt, wiesen die Sonden-Polynukleotide, immobilisiert
auf dem Block 1 des Test-Mikroarrays, die gleichen Bedingungen auf
wie das Kontroll-Mikroarray 1. Folglich gab es geringe Unterschiede
in Fluoreszenzintensität
und dem In(Wp/Mp). Die Fluoreszenzintensitäts-Polynukleotide, immobilisiert auf
dem Block 2 des Test-Mikroarrays, war leicht erniedrigt, jedoch
war die In(Wp/Mp)-Werte signifikant erhöht im Vergleich zum Kontroll-Mikroarray
1. Die Sonden-Polynukleotide, immobilisiert auf dem Block 2 des
Test-Mikroarrays waren verstärkt
sowohl hinsichtlich den Fluoreszenzintensitäten als auch den In(Wp/Mp)-Werten
im Vergleich zum Kontroll-Mikroarray 2. Das heißt, Hybridisieren bei den gleichen
Temperatur-Bedingungen unter Verwendung eines Mikroarrays mit zwei
Blöcken
an Polynukleotiden, immobilisiert auf einem Substrat kann die gleichen
Ergebnisse liefern, als wenn zwei Mikroarrays verwendet werden.
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Wenn
eine Hybridisierung für
Sonden-Polynukleotide mit breiter Tm-Verteilung durchgeführt wird
bei einer einzelnen Temperatur, muss eine Hybridisierungstemperatur
optimiert für
eine oder beide einer Sonden-Gruppe mit niedrigem Tm und einer Sonden-Gruppe mit hohem
Tm, verwendet werden. Wie in diesem Beispiel beschrieben, ermöglicht entsprechend
der vorliegenden Erfindung die Zugabe eines denaturierenden Agens
oder eines stabilisierenden Agens zu einer Hybridisierungslösung die
Hybridisierung bei einer einzelnen Temperatur in einem einzelnen
Mikroarray.
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Wie
aus der oben dargestellten Beschreibung offensichtlich ist, schließt das Polynukleotid-Mikroarray der
vorliegenden Erfindung immobilisierte Sonden-Polynukleotide ein,
welche gruppiert sind in Blöcke
durch Tm. Folglich kann die Anzahl von Ziel-Polynukleotiden, welche
nachgewiesen werden können
unter Verwendung eines einzelnen Mikroarrays, sowie die Detektions-Raten
erhöht
werden, wodurch die Detektions-Kosten abnehmen.
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Des
Weiteren kann das Polynukleotid-Mikroarray der vorliegenden Erfindung
die Sensitivität
und Geschwindigkeit beim Nachweis von Ziel-Polynukleotiden erhöhen.
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Entsprechend
dem Verfahren zum Nachweis von Ziel-Polynukleotiden der vorliegenden
Erfindung können
die Ziel-Polynukleotide schnell bei hoher Sensitivität nachgewiesen
werden.
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