CN1117161C - 高密度基因芯片的制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种高密度基因芯片的制作方法，更准确地说，是一种高密度寡核苷酸探针微阵列的制作方法。首先提出一种基因芯片上寡核苷酸探针的选择方法，即变长变覆盖探针优化选择方法，该方法保证所有探针的杂交解链温度最大程度地一致，可以较大程度地降低基因芯片杂交控制的复杂性，提高基因芯片检测结果的可靠性。此外，在本发明中还提出直接检测目标序列、检测特定位点突变及检测非特定位点突变的具体探针选择方法和探针布局方案。

Description

高密度基因芯片的制作方法

本发明是一种高密度基因芯片的制作方法，更准确地说，是一种高密度寡核苷酸探针的微阵列的制作方法。

基因芯片技术以其可同时、快速、准确地分析大量基因组信息的特点在诸多领域得到应用。在生命科学领域中，基因芯片为分子生物学、生物医学等研究提供了强有力的手段。利用基因芯片技术，可研究生命体系中不同部位、不同生长发育阶段的基因表达，比较不同个体或物种之间的基因表达，比较正常和疾病状态下基因及其表达的差异。基因芯片技术也有助于研究不同层次的多基因协同作用的生命过程，寻找和发现新的基因，研究生物体在进化、发育、遗传过程中的规律。基因芯片技术的发展将大力推进包括人类基因组计划和人类后基因组计划在内的各类基因组研究，它使生命科学的研究从单个基因、孤立地研究发展到多基因、基因组整体研究的崭新阶段。

对于分子生物学、生物医学的研究来说，一个基本的前提是DNA序列的测定和分析。传统DNA测序所采用的方法包括化学反应、凝胶电泳等一系列繁杂的步骤，这些方法操作繁杂、费时，不能满足大规模快速测序和便携化的要求。在对传统DNA测序方法进行改进的过程中，以基因芯片为代表的生物芯片技术应运而生。基因芯片技术将生命科学研究中所涉及的许多不连续的分析过程，如样品制备、化学反应和分析检测等，通过采用微电子、微机械等工艺集成到芯片中，使之连续化、集成化和微型化。这一技术的成熟和应用将在下个世纪给疾病诊断和治疗、药物制作和环境保护等生命科学相关领域带来一场革命，为生物信息的获取及分析提供强有力的手段。

基因芯片将为现代医学特别是医学诊断学提供高效而便捷的手段，为在分子层次上进行基因诊断和基因治疗提供可靠的依据。利用基因芯片可以分析基因与疾病(如癌症、传染病和遗传病)的相关性，使得我们可以深入地认识疾病产生的根源。基因芯片在医学诊断中最直接的应用就是检测与疾病相关的基因。生物医学研究表明，人类大多数疾病的发病机制从根本上来说都和基因有关。因此，基因芯片在医学应用上有着重要的意义，它可快速检测与疾病相关的基因及突变。基因芯片不仅可以提高疾病诊断的科学性，而且对于治疗疾病也有着指导意义，我们可以根据与疾病相关基因的检测结果，制定有针对性的治疗方案。

基因芯片的探针选择和探针布局是基因芯片技术中关键的一步，它影响基因芯片的制作和基因检测，最重要的是影响检测特定基因或目标核苷酸序列的可靠性。

基因芯片制作的关键是要解决芯片对目标序列检测的可靠性问题，包括提高由杂交后荧光检测结果标识每个序列小片段的可靠性以及由各小片段组成完整目标序列的可靠性。而影响检测可靠性的一个关键因素就是待测序列与探针的碱基杂交错配，而碱基杂交错配又是由于各探针具有不同的杂交解链温度所引起的。如果各探针的杂交解链温度不一致，则容易造成在某一给定条件下探针与待测序列杂交出现碱基错配，从而显示错误的杂交信号，导致基因芯片检测的困难和误判断。

目前探针选择方法主要是等长移位法。该方法按照目标序列从头到尾的顺序依次取一定长度的互补核苷酸序列作为探针，相邻探针序列之间覆盖的核苷酸数目恒定。这种方法的缺陷就是在同一芯片上的探针杂交解链温度不一致，难以保证检测结果的可靠性。本发明人通过分析现有基因芯片探针选择方法的不足，经过深入仔细地探索研究，认为必须在探针选择过程中解决探针杂交解链温度不一致的问题，由此提出变长变覆盖探针的选择方法，以提高基因芯片检测的可靠性。

本发明的目的是提供一种使所有寡核苷酸探针的杂交解链温度最大程度地保持一致的变长变覆盖的基因芯片制作方法。

本发明的基因芯片制作方法是根据一个给定的目标核苷酸序列，采用变长变覆盖的方法选择一个覆盖给定目标核苷酸序列的探针集合，通过调节两个探针参数即探针长度和相邻探针之间的覆盖长度，动态调节探针的杂交解链温度T_m，使得探针集合中各探针满足杂交解链温度最大程度地相近或一致，从而形成基因芯片上的优化探针集合。而对于多个目标序列，首先根据前面的方法得到检测第一个目标序列的探针集合，然后顺序处理其它目标序列，依此得到其它对应的探针集合，使得所有探针满足杂交解链温度最大程度地相近或一致，最后将探针排列在芯片上。对于检测特定突变位点的基因芯片，首先在目标序列上取以该位点为中心的序列片段，对片段中心进行核苷酸替换，形成四个序列片段，将这四个片段作为新的目标序列，最后生成杂交解链温度一致的四组探针，分别检测不同的突变。而对于检测非特定位点突变的基因芯片，首先针对目标序列进行优化探针选择，得到检测目标序列的探针集合，然后从目标序列的第一个核苷酸开始，逐步取四种核苷酸变换，针对不同变换分别设计检测对应突变的探针，并且使各探针的T_m值与检测目标序列的探针的T_m的平均值一致。一种探针布局方法是将所形成的探针在芯片上连续地排列，而另一种方法(即非连续排列)是将目标序列的每一个核苷酸顺序地与芯片中一个阵列单元相对应，并将各探针放在与该探针互补的目标序列片段中心所对应的阵列单元上。

本发明的优点是首先提出一种基因芯片上寡核苷酸探针选择的新方法，即变长变覆盖探针制作方法，该方法能够保证芯片上所有探针的杂交解链温度最大程度地一致，可以较大程度地降低基因芯片杂交控制的复杂性，提高基因芯片检测结果的可靠性。此外，在本发明中还提出直接检测目标序列、检测特定位点突变及检测非特定位点突变的具体探针选择方法和探针布局方案。

图1是根据目标序列形成侯选探针的示意表。设目标序列为P’₁P’₂ P’₃......P’_nP’_n+1...P’_mP’_m+1...，P’_i代表对应核苷酸取其互补，例如，若P_i＝C，则P’_i＝G；若P_i＝A，则P’_i＝T(U)。其中P’₁代表目标序列的第一个核苷酸。假设探针长度的取值范围是从n到m，那么探针最短长度为n，而探针最大长度为m。该图说明了如何从序列的各位开始依/次取不同长度的互补探针，从而产生一系列的候选探针。

图2是变长变覆盖探针示意图。对于给定的目标序列，首先取其互补序列，然后针对互补序列，利用变长、变覆盖的优化探针选择方法得到的一系列杂交解链温度相近的探针。

图3是连续探针排列示意图，其中阴影部分表示在对应位置有探针。

图4是非连续探针排列示意图。根据图2中的结果，将各探针排布于芯片的阵列中。如图所示，目标序列的每一个核苷酸顺序与一个阵列单元对应，将每一个探针放置在与该探针互补的目标序列片段中心所对应的单元。

图5是非连续排列探针杂交模式图。这是利用图4所示芯片检测目标序列，经过杂交以后所得到的荧光标记检测图像模式。

图6是检测多目标序列基因芯片探针选择和布局的流程图。

图7是根据突变位点形成四个目标序列示意图。

图8是检测特定位点突变的芯片杂交模式图。将针对特定位点突变所选择的四组探针顺序地放在芯片阵列的A行、G行、C行和T行。本图为正常目标序列与探针杂交以后荧光信号检测结果示意。

图9也是检测特定位点突变的芯片杂交模式图。设突变点由A突变为C，则杂交荧光信号检测结果如图所示。

图10是检测目标序列上特定位点突变的基因芯片探针选择和布局的流程图。

图11是检测非特定位点突变的探针形成示意图。本图说明在制作检测非特定位点突变的探针时，如何在目标序列上从对应位点出发，向两端延伸，由此得到优化探针。

图12是检测非特定位点突变的探针排列示意图。第一行为Target行，在此行放置检测目标序列的探针。A行、G行、C行和T行分别放置检测对应突变的探针。

图13是检测非特定位点突变的芯片杂交模式图。检测非特定位点突变的基因芯片经杂交后荧光检测图像模式示意。除检测T→G突变的探针外，突变位置附近的其它探针所对应的荧光强度相对较弱，这是由于目标序列的一个突变所造成的。

图14是检测目标序列及所有位点突变的基因芯片探针选择和布局的流程图。

图15是检测已型肝炎病毒特征序列的探针集合排列表。

图16是检测甲型肝炎病毒特定位点突变的探针集合排列表。

本发明的具体实施方案如下：(1)变长变覆盖探针的优化选择方法

本发明的基本思想是对于一个给定的目标核苷酸序列，选择一个覆盖目标序列的最优探针集合，使集合中各探针的杂交解链温度最大程度地一致，并且各探针的长度及探针之间的覆盖长度满足一定的约束条件。

首先根据目标序列从头到尾依次取满足一定长度条件的核苷酸序列片段，对于各序列片段，其互补序列为候选探针，如图1所示。为了得到覆盖目标序列的最优探针集合，理应分析所有候选探针各种可能的组合。但是由于满足约束条件的探针集合非常多，从计算量来看，无法分析每种可能的组合，必须采用优化搜索策略。

我们的策略是在进行候选探针的优化组合时，通过调节两个探针参数，即探针长度和相邻探针之间的覆盖长度，动态调节探针的杂交解链温度(即T_m值，探针的T_m值与探针长度和GC含量密切相关)，并利用动态规划算法，优化组合候选探针，形成基因芯片上探针集合，使集合中各探针的杂交解链温度最大程度地一致。具体优化方法如下：以各探针相近的杂交解链温度作为优化目标，优化组合各候选探针，在优化组合时要求各探针的长度和相邻探针之间的交叠长度满足给定的约束条件。经过优化组合以后得到一组覆盖目标序列的探针。这里为探针集合定义一个代价函数f(S)，其中S表示一个探针集合，f(S)的值就是探针集合内所有探针T_m值的均方差。优化的目标就是搜索一个探针集合S，使S的代价函数值f(S)最小。

假设预先给定以下关于探针的约束条件：探针长度的范围(13-20)、相邻探针之间的交叠长度范围(12-19)。优化探针选择方法从目标序列前端开始逐步求到达各位点的局部最优探针集合，该过程推进到序列末端时即得到全局最优探针集合。假设当前到达目标序列的某一位点，其前面各位点所对应的局部最优探针集合已知，则产生若干个满足约束条件的探针集合，这些探针集合是由前面若干个局部最优探针集合加上一个以当前点为末端的新探针而得到。而到达当前点的局部最优探针集合就是这些集合中代价函数值最小的一个。因而按照递推方式可根据前面阶段各部分的局部最优探针集合计算出当前位点对应的局部最优探针集合。本算法中，计算各位点局部最优解是在一定的初始条件下进行的正向计算的过程，而求解最优探针集合则是一个反向求解的过程。

上述是变长变覆盖探针优化选择的基本方法，根据该方法，可以得到检测一条目标核苷酸序列的基因芯片探针集合。对于高密度基因芯片，往往需要同时检测多个目标序列。为使整个芯片上各探针的T_m值相近，下面提出检测多个目标序列的一般探针优化方法。

首先根据前面介绍的基本方法得到检测第一个目标序列的探针集合S₁，然后顺序处理其它目标序列，依此得到对应的探针集合S_i。在处理第i+1(i＝1，2，...，n，n是目标序列个数)个目标序列时，已经得到S₁、S₂、...、S_i，计算S₁、S₂、...和S_i中所有探针T_m的平均值T_avg。这样对第i+1个目标序列进行探针优化选择时，以各探针的T_m值与T_avg的均方差替代原来的代价函数f(S)，经过优化选择以后得到探针集合S_i+1。该过程一直进行到求出S_n为止。最后，S₁、S₂、...、S_n就是所要的探针集合，将各集合中的探针分区排布在基因芯片上。(2)制作直接检测目标序列的基因芯片

运用本发明提出的优化探针选择方法，按照目标序列进行探针选择，从而得到一个探针集合，如图2所示。然后在芯片上排布各探针。一种方法是将各探针在芯片上连续地排列，如图3所示。另一种方法是将目标序列的每一个核苷酸顺序地与芯片中一个阵列单元相对应，并将探针放置在与该探针互补的目标序列片段中心所对应的单元，如图4所示。图5为芯片杂交以后荧光标记检测图像模式。

对于直接检测多个目标序列的基因芯片，其探针选择和布局的流程见图6。(3)制作检测特定位点突变的基因芯片

在有些情况下，需要检测目标序列上特定位点是否有突变。制作检测特定位点突变的基因芯片的目标是根据杂交解链温度一致性条件，制作检测特定位点突变的四组探针集合，并将四个集合中各探针按一定规律排布在微阵列芯片上。

设已知序列中一个突变位置k，以k为中心，在目标序列中取一定长度(25-39)的片段。对于这个片段，将其中心的核苷酸分别替换为A、G、C、T，由此得到四个不同的序列片段，其中一个片段就是原来的片段，而其它片段则对应于三种突变，如图7所示。将这四个片段看成是四个目标序列，利用本发明所提出的优化探针选择方法，得到四组探针，所有各组探针的杂交解链温度相近。

将针对特定位点突变的四组探针顺序地放在芯片阵列的四行，分别为A行、G行、C行和T行。在每一行中，从左到右顺序地放置同组内各探针。上述四行探针分别检测对应位点的四种突变。图8对应于正常目标序列的杂交模式，图9对应于A到C突变的杂交模式。

检测特定位点突变的基因芯片探针选择和布局流程见图10。

若要制作同时检测目标序列和特定位点突变的基因芯片，可将对突变位点替换得到的四个片段作为一般目标序列，然后利用(1)所提出的方法。(4)制作检测非特定位点突变的基因芯片

在有些情况下，需要检测非特定位点突变。所谓非特定位点突变是指突变可能发生在目标序列的任何一个位置上。对于这种情况，首先根据目标序列进行探针优化选择，得到一系列杂交解链温度相近的探针，这些探针用于检测正常的目标序列。将这些探针放在芯片的Target行。计算这组探针T_m的平均值，以T_avg表示，作为其它探针T_m的优化参照值。然后从序列前端开始，逐步处理各位点，并按下述方法制作检测每一个位点突变的探针：分别用A、G、C、T替换将当前位点的核苷酸，然后按照目标序列从该位点向两端延伸(见图11)，由此得到四个序列片段，其互补序列即为探针。在延伸的同时计算各探针的T_m值，当达到与T_avg最接近时停止延伸扩展。最后将得到的四个探针依次放在A行、G行、C行和T行的对应位置上，见图12。图13为基因芯片杂交后荧光检测图像模式示意。

检测非特定位点突变的基因芯片探针选择和布局流程见图14。实施例1：检测乙型肝炎病毒的基因芯片

乙型肝炎病毒HBV是迄今已知能对人感染的病毒中最小的基因组。根据序列数据，选择其S基因片段作为目标序列。之所以作这样的选择，主要有两个原因，一是S片段所编码的蛋白质构成HBV的表面抗原(HbsAg)，而HbsAg是临床诊断HVB感染的标志抗原。二是S片段上的基因突变决定HBV的亚型，选择其作为目标序列，有利于进行病毒的基因分型研究。

对于S区序列片段，将其作为目标序列，运用本发明所提出的优化选择方法，得到的探针见图15。实施例2：检测甲型肝炎病毒特定位点突变的基因芯片

甲肝病毒序列的第152位可能发生A-G替换，该位点突变位于5′非翻译区(5′non-translated region，5′-NTR)，这一区域位于基因前段，是HAV基因组中核苷酸序列最保守的部分。5′-NTR的核苷酸变异对HAV获得适应体外培养细胞增殖能力具有重要意义。该位点突变通常以A-G替换形式出现，突变后能促进HAV在体外培养细胞中的生长。其作用机理可能与该突变位点位于内部核糖体进入位点(internalribosome entry site，IRES)的5′端附近有关，而5′-NTR中的IRES与核糖体RNA结合是与病毒蛋白的表达程度密切相关的。

对于上述特定突变位点，运用本发明所提出的方法，得到四组分别检测不同核苷酸突变的探针集合，其中一组对应于检测该位点正常的核苷酸。探针集合见图16。

Claims (5)

1、一种高密度基因芯片的制作方法，其特征在于：该方法是根据一个给定的目标核苷酸序列，采用变长变覆盖的方法选择一个覆盖给定目标核苷酸序列的探针集合，通过调节两个探针参数即探针长度和相邻探针之间的覆盖长度，动态调节探针的杂交解链温度T_m，使得探针集合中各探针满足杂交解链温度最大程度地相近或一致，从而形成基因芯片上的优化探针集合；对于多个目标序列，首先根据前面的方法得到检测第一个目标序列的探针集合，然后顺序处理其它目标序列，依此得到其它对应的探针集合，使得所有探针满足杂交解链温度最大程度地相近或一致；最后将探针排列在芯片上。

2、根据权利要求1所述的高密度基因芯片的制作方法，其特征在于：对于检测特定突变位点的基因芯片，首先在目标序列上取以该位点为中心的序列片段，对片段中心进行核苷酸替换，形成四个序列片段，将这四个片段作为新的目标序列，最后生成杂交解链温度一致的四组探针，分别检测不同的突变。

3、根据权利要求1所述的高密度基因芯片的制作方法，其特征在于：对于检测非特定位点突变的基因芯片，首先针对目标序列进行优化探针选择，得到检测目标序列的探针集合，然后从目标序列的第一个核苷酸开始，逐步取四种核苷酸变换，针对不同变换分别设计检测对应突变的探针，并且使各探针的T_m值与检测目标序列的探针的T_m的平均值一致。

4、根据权利要求1或2或3所述的高密度基因芯片的制作方法，其特征在于：将所形成的探针在芯片上连续地排列。

5、根据权利要求1或2或3所述的高密度基因芯片的制作方法，其特征在于：将目标序列的每一个核苷酸顺序地与芯片中一个阵列单元相对应，并将各探针放在与该探针互补的目标序列片段中心所对应的阵列单元上。

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