JP2003232791A

JP2003232791A - プローブ固相化反応アレイ

Info

Publication number: JP2003232791A
Application number: JP2002034197A
Authority: JP
Inventors: Etsuo Shinohara; 悦夫篠原; Takeo Takahashi; 威夫高橋; Nobuhiko Morimoto; 伸彦森本
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2002-02-12
Publication date: 2003-08-22
Also published as: US20030152957A1

Abstract

(57)【要約】【課題】反応効率および再現性に優れたプローブ固定
化反応アレイを提供する。【解決手段】支持体と、前記支持体内部にそれぞれ独
立して形成された内腔よりなる第１から第ｎまでの反応
部と（ここでｎは２以上の整数である）、前記第１から
第ｎまでのそれぞれの反応部から、前記支持体の第１の
面に開口する２つの開口部と、前記第１の反応部の壁面
に固相化された第１のプローブ群から、第ｎの反応部の
壁面に固相化された第ｎのプローブ群までのプローブ群
と（ここでｎは２以上の整数である）を具備するプロー
ブ固相化反応アレイであって、前記第１から第ｎまでの
各プローブ群には複数種類のプローブが含まれ、且つ各
プローブ群のそれぞれに含まれるプローブは、プローブ
群毎に至適反応条件が揃っていることを特徴とするプロ
ーブ固相化反応アレイ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸や蛋白質の解
析に関連する解析に使用される反応アレイに関する。よ
り具体的には、特異的結合性を利用した核酸や蛋白質を
解析する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡマイクロアレイの基本原理は以下
のようなものである。即ち、多数の異なったＤＮＡプロ
ーブをガラスなどの固相支持体上に高密度に固定する。
それに対して試料を添加し、試料に含まれる標識したタ
ーゲットＤＮＡをハイブリダイズする。その後、ハイブ
リダイズした標識化ターゲットＤＮＡの各々から生じる
シグナルを自動検出器で検出し、得られたデータをコン
ピュータで大量に解析する。

【０００３】このようなＤＮＡマイクロアレイは、大量
解析、検出感度の向上、マイクロ化によるサンプルの節
約、データ取得の自動化、およびデータ処理による簡便
化など点で期待されている。

【０００４】現在、ＤＮＡマイクロアレイは、その製造
方法の違いから２種類に大別されている。１つはＤＮＡ
をガラス表面上で合成していくタイプであり、一般的に
は、ＤＮＡとも称される（Proc Natl Acad Sci USA(199
4)91:5022-5026）。もう１つは、予め調製しておいたＤ
ＮＡを機械的に並べていくタイプであり、一般的にはＤ
ＮＡアレイとも称される（Science(1995)270:467-47
0）。

【０００５】スライドガラスにＤＮＡを張り付けていく
タイプのＤＮＡマイクロアレイは、大がかりな半導体製
造器を必要とせず、後述するＤＮＡアレイ機および検出
器があれば製造することができる。また、張り付けるＤ
ＮＡを任意に選択できるのも利点である。しかしなが
ら、その一方で、ＤＮＡのコレクションを調製する必要
があるのが煩雑である。また、ＤＮＡアレイへのＤＮＡ
の張り付けは、ピン先による物理的なスポットにより行
うので、ＤＮＡの高密度化は光リソグラフ方式よりは劣
る。しかしながら、それであっても、例えば、直径１０
０μｍのスポットを１００μｍ間隔でスポットしていく
と、計算上、１ｃｍ^２当たりの面積に２５００スポット
を配置することが可能である。従って、有効面積約４ｃ
ｍ^２であるとして、通常のスライドガラス１枚当たりに
約１万のＤＮＡを乗せることが可能である。

【０００６】ＤＮＡアレイ機は、基本的に、高性能サー
ボモータを組み合わせ、コンピュータ制御下でピン先或
いはスライドホルダーをＸＹＺ軸方向に作動し、マイク
ロタイタープレートからスライドガラス表面上にＤＮＡ
サンプルを運ぶ装置である。ピン先の形状には多くの工
夫がなされており、この技術の命であるとも言える。最
も一般的なペン先はカラス口のように割れた形状のペン
先である。そこにＤＮＡ溶液を溜めて、複数のスライド
に対してスポットする。１つのＤＮＡサンプルのスポッ
トが終了すると、洗浄および／または乾燥のサイクルを
挟んで、次のＤＮＡサンプルを乗せる工程に移行する。
このような工程を繰り返す。理想的なＤＮＡアレイ機に
求められる機能は、スポットのサイズや形状が均一で、
しかも高速で再現性がよいということである。従来のピ
ン先は、ロットの違いなどにより均一性やスピードに下
界が生じるので、より高性能なスポット手段を求めて、
インクジェット方式やキャピラリ方式などの新しい技術
の開発も進められている。

【０００７】ガラスはメンブレンと比較して有効固定面
積が小さく、電荷のチャージも少ない。そのため、ＤＮ
Ａ固定法に関しては次のような種々のコーティングが試
みられている。一般的にはポリＬリジンやシラン化など
がコーティングに用いられている。また、ＤＮＡ末端を
アミノ化して、シラン化ガラスにクロスリンクする方法
も使用されている。

【０００８】上述のようなＤＮＡマイクロアレイを使用
して、現在行われている遺伝子発現解析の主流は、二蛍
光標識法を用いるディファレンシャルな遺伝子発現を見
る系である。その原理は２つの検体における発現の差を
検出するものである。即ち、２つの検体から得たｍＲＮ
Ａ含有試料中に含まれるｍＲＮＡに対して異なる蛍光物
質を標識し、それらをＤＮＡマイクロアレイ上で競合的
にハイブリダイズし、その後、そのＤＮＡマイクロアレ
イ上に得られる両方の蛍光を測定し、比較する方法であ
る。

【０００９】一般的に上述のようなＤＮＡマイクロアレ
イにより解析されるべき検体ＤＮＡは、組織または細胞
より抽出したｍＲＮＡまたは全ＲＮＡなどのＲＮＡであ
る。従って、上述のような蛍光は、ＲＮＡからｃＤＮＡ
が合成される際に、Ｃｙ３−ｄＵＴＰやＣｙ５−ｄＵＴ
Ｐなどの標識物質によって標識するものである。また、
オリゴｄＴプライマーまたはランダムプライマーと逆転
写酵素とを用いて、第１鎖ｃＤＮＡを合成する際にラベ
リングが行われる場合も多い。

【００１０】このようなＤＮＡマイクロアレイを用いて
核酸の解析を行う場合には、以下のような問題点があ
る。即ち、同一支持体上に固定されるＤＮＡプローブ
は、互いに塩基配列の異なる多種類の配列を有している
のが一般的であり、各々のＤＮＡプローブについての反
応条件は一定ではない。従って、従来のＤＮＡマイクロ
アレイの場合、固相化されている全てのプローブを効率
よく利用し、所望する全ての標的を効率よく検出するこ
とは不可能である。また、そのため検出結果の再現性も
低いものである。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】上述のような状況にお
いて、本発明の目的は、反応効率および再現性に優れた
プローブ固定化反応アレイを提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究の
結果、下記の手段により上記課題を解決し、目的を達成
することを見い出した。即ち、支持体と、前記支持体内
部にそれぞれ独立して形成された内腔よりなる第１から
第ｎまでの反応部と（ここでｎは２以上の整数であ
る）、前記第１から第ｎまでのそれぞれの反応部から、
前記支持体の第１の面に開口する２つの開口部と、前記
第１の反応部の壁面に固相化された第１のプローブ群か
ら、第ｎの反応部の壁面に固相化された第ｎのプローブ
群までのプローブ群と（ここでｎは２以上の整数であ
る）、を具備するプローブ固相化反応アレイであって、
前記第１から第ｎまでの各プローブ群には複数種類のプ
ローブが含まれ、且つ各プローブ群のそれぞれに含まれ
るプローブは、プローブ群毎に至適反応条件が揃ってい
ることを特徴とするプローブ固相化反応アレイである。

【００１３】かかる構造によれば、プローブ群毎に１つ
の至適反応条件を適用して、各プローブ群が何れも最良
の反応結果を示す。従って、プローブ固相化アレイの反
応効率のみならず再現性が格段に向上する。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下に例を用いて本発明の態様を
説明する。

【００１５】実施の態様１図１に本発明の第１の実施の形態を示す。図１（Ａ）は
本態様であるプローブ固相化反応アレイ１を上面から見
た平面図である。プローブ固相化反応アレイ１は、透明
なガラス製の基板２２とシリコン基板２３を用いて製造
されたプローブ固相化反応アレイの例であり、従って、
上面から見た場合、ガラス基板２２を通して、シリコン
基板２３上に形成された各キャピラリおよび核酸プロー
ブを観察することが可能である。また、図１（Ｂ）は、
ヒータ２４上に配置された状態のプローブ固相化反応ア
レイ１の図１（Ａ）の線Ａ−Ａに沿った断面図である。

【００１６】プローブ固相化反応アレイ１の基板の内部
には複数のキャピラリ２、３、４、５および６が形成さ
れている。それぞれのキャピラリは互いに独立して形成
されるので、他のキャピラリに含まれる流体と互いに混
じり合うことはない。また、それぞれのキャピラリの両
端には、開口部が形成されている。具体的には、キャピ
ラリ２、３、４、５および６には、それぞれ試料注入口
１２、１３、１４、１５および１６と、試料排出口１
７、１８、１９、２０および２１が形成されている。キ
ャピラリ２、３、４、５および６の内部には、それぞれ
Ｔｍの違いによりグループ分けされた核酸プローブ群７
(ａ〜ｌ;計１２スポット、以下同じ)、８(ａ〜ｌ)、９
(ａ〜ｌ)、１０(ａ〜ｌ)および１１(ａ〜ｌ)が固定され
ている。

【００１７】キャピラリ２には、核酸プローブ７(ａ)か
ら核酸プローブ７(ｌ)の１２種類の異なる塩基配列を有
する核酸プローブ固定されている。核酸プローブ７(ａ)
から核酸プローブ７(ｌ)のそれぞれには、複数の同じ塩
基配列を有する核酸プローブが固定されている。キャピ
ラリ２に固定化された核酸プローブ群のＴｍをＴｍ１と
する。

【００１８】キャピラリ３には、核酸プローブ８(ａ)か
ら核酸プローブ８(ｌ)の１２種類の異なる塩基配列を有
する核酸プローブ固定されている。核酸プローブ８(ａ)
から核酸プローブ８(ｌ)のそれぞれには、複数の同じ塩
基配列を有する核酸プローブが固定されている。キャピ
ラリ３に固定化された核酸プローブ群のＴｍをＴｍ２と
する。

【００１９】キャピラリ４には、核酸プローブ９(ａ)か
ら核酸プローブ９(ｌ)の１２種類の異なる塩基配列を有
する核酸プローブ固定されている。核酸プローブ９(ａ)
から核酸プローブ９(ｌ)のそれぞれには、複数の同じ塩
基配列を有する核酸プローブが固定されている。キャピ
ラリ４に固定化された核酸プローブ群のＴｍをＴｍ３と
する。

【００２０】キャピラリ５には、核酸プローブ１０(ａ)
から核酸プローブ１０(ｌ)の１２種類の異なる塩基配列
を有する核酸プローブ固定されている。核酸プローブ１
０(ａ)から核酸プローブ１０(ｌ)のそれぞれには、複数
の同じ塩基配列を有する核酸プローブが固定されてい
る。キャピラリ５に固定化された核酸プローブ群のＴｍ
をＴｍ４とする。

【００２１】キャピラリ６には、核酸プローブ１１(ａ)
から核酸プローブ１１(ｌ)の１２種類の異なる塩基配列
を有する核酸プローブ固定されている。核酸プローブ１
１(ａ)から核酸プローブ１１(ｌ)のそれぞれには、複数
の同じ塩基配列を有する核酸プローブが固定されてい
る。キャピラリ６に固定化された核酸プローブ群のＴｍ
をＴｍ５とする。

【００２２】各核酸プローブ群内に含まれる複数種類の
核酸プローブ間のＴｍの相違の範囲は約±２℃であれば
よく、約±１℃が好ましい。

【００２３】また、核酸プローブ群間、即ち、Ｔｍ１と
Ｔｍ２、Ｔｍ２とＴｍ３、Ｔｍ３とＴｍ４、Ｔｍ４とＴ
ｍ５、の間のＴｍの相違は、約２℃以上、３０℃以下が
好ましい。

【００２４】ここにおいて使用される「核酸」の語は天
然に存在する種々のＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチ
ド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸
およびＳ-オリゴ核酸などの人工的に合成された核酸類
似体などを指す。

【００２５】ここにおいて使用される「標的核酸」の語
は、核酸プローブにより検出されるべき核酸をいう。一
般的に、核酸プローブは標的核酸に相補的な塩基配列を
有するように設計される。被検試料に含まれる被検核酸
が標的配列が有する塩基配列を有している場合には、核
酸プローブと標的配列の間にハイブリダイゼーションが
生じる。従って、このハイブリダイゼーションを検出す
ることにより被検試料に含まれる核酸を解析することが
可能である。ハイブリダイゼーションの検出はそれ自身
公知の手段により行ってよい。標的核酸の標的になる塩
基配列を「標的配列」と称す。

【００２６】ここで使用される「個体」の語は、ヒト、
イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及びサルを含
む任意の哺乳動物、並びに植物および昆虫など哺乳動物
以外の生物を示す。

【００２７】ここで使用される「被検試料」の語は、生
物個体から採取した細胞、組織、臓器、血液、血清、リ
ンパ液、組織、毛髪および耳垢などの生物試料を所望に
応じて調製した試料や、人工的に合成または製造した物
質を含む試験に供したい試料をいう。また、「被検試
料」は必要に応じて、生物試料をホモジネートおよび抽
出などの必要な任意の前処理を行って得た試料であって
もよい。このような前処理は、対象となる生物試料に応
じて当業者によって選択され得るであろう。

【００２８】上記のプローブ固相化反応アレイ１は、例
えば、次のように製造することが可能である。同じ大き
さのガラス基板とシリコン基板を用意し、それぞれ基板
２２と基板２３とする。基板２３にエッチングにより溝
を形成する。Ｔｍの違いにより分けられたグループ毎
に、所望の核酸プローブを前記溝の底部に対してスポッ
ティングにより固定する。基板２３の前記溝の両端に対
応する部分に貫通穴を形成する。次に基板２２と基板２
３を接合する。更に、それぞれの開口部に所望の長さの
ガラス管を接着することにより連結部２５ａおよび２５
ｂを形成する。

【００２９】上記の例では、支持体の材料として蓋とし
て用いる基板にはガラス製基板を使用し、溝を形成する
基板にはシリコン基板を使用したが、これに限定される
ものではなく、蓋として用いる基板にシリコン基板を使
用し、溝を形成する基板にガラス製基板を使用してもよ
い。また、使用される２枚の基板を同じ材質としてもよ
い。また、観察の方向に透過性部材が配置されるよう
に、使用する部材を決定してもよい。或いは、プラスチ
ック樹脂やゴムなどで形成された支持体を使用してもよ
い。また、これらの材質、ガラス、シリコン、プラスチ
ック樹脂およびゴムなどの材質で形成された支持体を組
み合わせて使用してもよい。

【００３０】また、上記の例では支持体として板状の基
板を使用しているが、これに限定されるものではない。

【００３１】ガラスやシリコンウエハ様の基板では、例
えば、フォトリソ−エッチングなどにより溝および貫通
穴の形成を行うことが可能である。また、プラスチック
樹脂やゴムなどの場合には機械加工やモールド加工など
により溝および貫通穴の形成を行うことが可能である。
核酸プローブの固定手段は、それ自身公知の何れかの手
段、例えば、スポッティング法および光固相化法などを
使用してよい。上記の例では、基板２３の溝の底部に核
酸プローブを固定したが、基板２２に固定してもよく、
また、各キャピラリ側面に固定してもよい。

【００３２】また、上記の例では、キャピラリを５本具
備するプローブ固相化反応アレイ１を例として示した
が、具備されるキャピラリの数はこれに限定されるもの
ではなく、これ以下でも以上であってもよい。また、核
酸プローブはＴｍの違いにより分けられたグループ毎
に、異なるキャピラリに固相化されてもよく、或いは幾
つかのキャピラリに対して同じＴｍのグループに含まれ
る核酸プローブを分割して固定してもよい。また、１キ
ャピラリに具備される複数のスポットに含まれるプロー
ブの種類は必ずしも互いに異なる必要はない。その一部
が同じであってもよい。

【００３３】また、１キャピラリに固相化される核酸プ
ローブのスポット数も図１に示すような１２スポットに
限定されることなく、至適反応条件が同等であるような
核酸プローブについて任意の個数であり得、キャピラリ
毎に異なるスポット数であってもよい。また、プローブ
固相化反応アレイ上の全てのキャピラリが複数種類のプ
ローブを含んでいる必要はなく、また、何も固相化して
いないキャピラリを具備していてもよい。

【００３４】また、２枚の基板の接合は、それ自身公知
の手段によって、核酸プローブの固定の前または固定後
に達成される。例えば、シリコン−石英ガラスの場合に
は、接着剤をスクリーン印刷機により印刷して接着すれ
ばよい。例えば、シリコン−パイレックス（登録商標）
ガラスの場合には、半導体プロセスで使用される陽極接
合法により、高温および高電圧の下で接合を行えばよ
い。

【００３５】このように形成したプローブ固相化反応ア
レイ１は、それぞれのＴｍに適した温度でハイブリダイ
ゼーションを行う。例えば、それぞれのキャピラリ毎に
温度管理をしても、全てのキャピラリを一定の温度に維
持し、イオン濃度および塩濃度により至適反応条件を得
てもよい。

【００３６】例えば、ヒータ２４で全てのキャピラリの
温度を一定に維持する場合には、ハイブリダイゼーショ
ン時に使用する反応液に含まれる塩濃度を調節すればよ
い。

【００３７】例えば、Ｔｍ１の至適反応温度が約４５
℃、Ｔｍ２が５０℃、Ｔｍ３が５５℃、Ｔｍ４が６０
℃、Ｔｍ５が６５℃であった場合でも、プローブ固相化
反応アレイ１の全てのキャピラリ反応部の温度を４５℃
に保持しながら、核酸プローブと、核酸プローブにより
検出すべき標的核酸との反応を行うことが可能である。
即ち、Ｔｍ２〜Ｔｍ５の至適濃度は、例えば、標的核酸
を含む被検試料の溶液として使用する緩衝液等の塩濃度
を調節することによって達成することが可能である。

【００３８】例えば、塩濃度１ＭでＴｍが８０℃のＤＮ
Ａプローブを用いる場合、８０℃を維持しながら塩濃度
を０．２Ｍとすれば、その反応部の温度は約１０℃低下
する。従って、ヒータ２４で４５℃の一定温度に加温し
た場合、反応はＴｍより約２０℃低い温度で行うことが
多いので、Ｔｍが６５℃になるように緩衝液中の塩濃度
を調整すればよい。また、実際のハイブリダイゼーショ
ン反応において用いられる溶液の成分にＤＮＡの変性剤
などが含まれる場合には、適宜、更に塩濃度を調整する
必要がある。

【００３９】また、ハイブリダイゼーション反応後の処
理としての洗浄も、精密な反応を実現するためには大切
である。ＤＮＡのハイブリダイゼーション反応ではミス
マッチをできるだけ少なくし、なおかつできるだけ標的
核酸とのハイブリダイゼーション効率を高める必要があ
る。そのためには正常にハイブリダイゼーション反応が
生じた標的核酸を除去しないように、ミスマッチにより
核酸プローブと結合している被検核酸だけを取り除く必
要がある。ミスマッチした核酸の場合、核酸プローブと
問題の被検核酸とにより形成される２本鎖における水素
結合の数はマッチした場合に比較して少ない。従って、
ミスマッチの場合のＴｍはより低くなる。従って、温度
または洗浄液の塩濃度を制御することにより、ミスマッ
チした被検核酸を特異的に取り除くことが期待される。
ミスマッチした被検核酸は、ミスマッチの箇所や数によ
りＴｍが変わるので、そのＴｍをどのような場合につい
ても一括してここに定義することは難しいが、このよう
な条件は、各グループ分けされたキャピラリ毎に実験を
行えば、所望の解析における最適条件を設定することが
可能である。このようなミスマッチを防止する方法も本
発明の範囲内に含まれる。

【００４０】本発明の態様に従い、プローブ固相化反応
アレイ１を利用することにより、ハイブリダイゼーショ
ン反応時の条件設定や洗浄の条件設定を、各キャピラリ
毎に個別にまたは複数のキャピラリからなる単位毎に行
うことが可能である。従って、再現性に優れ且つ高精度
の測定が可能となる。また更に、ハイブリダイゼーショ
ンにおけるミスマッチを防止することも可能である。

【００４１】本実施の形態では、プローブ固相化反応ア
レイ１に含まれる反応部の形態をキャピラリとしたが、
この形状に限定されるものではない。即ち、物理的に互
いに隔離された反応部が形成され、その反応部のそれぞ
れに試料注入口および／または試料排出口として使用で
きる１以上の開口部が形成されたデバイス構造であれ
ば、種々の構造が考えられる。上記の例では、プローブ
固相化反応アレイ１に含まれる反応部を５つとしたが、
この数に限定されるものではなく、２以上の反応部を具
備すればよい。

【００４２】本発明に従うプローブ固相化反応アレイに
具備される反応部は、その領域において、化学反応また
は生化学反応等の使用者が意図する反応および処理を行
う領域をいう。従って、上述の態様では、反応部がキャ
ピラリ形状である例を示したが、反応部の形状はこれに
限定されるものではない。該反応部は、互いに独立して
おればよく、例えば、凹部または凸部により仕切られた
領域に開口部を有する蓋または底部を配置し、有効容積
のある反応部を形成すればよい。本発明の反応アレイの
各々の反応部の容量は０．０１μＬから１ｍＬでよい。

【００４３】また、本発明の態様に従うと、上述に記載
したような基板内部に内腔よりなる反応部を形成した閉
鎖系の反応アレイばかりではなく、互いに独立していれ
ば、単に凹部または凸部により仕切られた容器に対して
も、または平面からなる特に仕切のない領域であって
も、充分に離間しているか、或いは多数の垂直孔によっ
て液の拡散が妨げられていることで、互いに独立してい
れば本発明の態様に使用することが可能である。このよ
うな装置および反応方法も本発明の範囲に含まれる。

【００４４】また、反応部の形状は、底面が角型、円ま
たは楕円であるようなウェル形状であってもよい。ま
た、反応部の底面と天井面の面積が等しくても異なって
いてもよい。ここで使用される「ウェル形状」とは、例
えば、キャピラリ形状のように反応部の底面および天井
面が特定の方向へのみに広がりを示すのではなく、その
面を構成する二次元の何れの方向に対してもある程度同
じような広がりを示すような形状を指す。

【００４５】本発明に従う「プローブ固相化反応アレ
イ」とは、プローブを固相化した上記のような複数の反
応部を同一支持体上に所望に応じたパターンで配置した
装置である。このようなプローブ固相化アレイは、そこ
において、プローブとそのプローブに特異的な高親和性
を有する標的物質とを反応させることが可能である。ま
た、前記反応により生じた結合は、前記支持体に含まれ
たままで観察され得る。

【００４６】厳密には、ＤＮＡのハイブリダイゼーショ
ン反応条件は、反応時に形成される２本鎖ＤＮＡの塩基
配列と液に含まれる塩濃度に影響を受けるものである。
２本鎖ＤＮＡが１本鎖に開裂する温度はＴｍ（melting
temperature）と言われ、大凡、水素結合の数と周囲の
イオン濃度によって決まる。ＤＮＡの構成塩基に関して
は、ＧＣ結合には水素結合が３箇所あり、ＡＴ結合には
水素結合が２箇所あるので、同じ長さのＤＮＡであって
も、ＧＣの含有量によってＴｍは変化する。また、溶液
中の塩基濃度を上げてもＴｍは上昇する。例えば、塩濃
度を１０倍変化させるとＴｍは１０数℃変化してしま
う。

【００４７】本発明の態様に従うと、このようなハイブ
リダイゼーションにおける従来における問題点が解決さ
れる。そればかりか従来問題になっていたこのような特
徴を利用するというユニークな逆転の発想によって、反
応効率に優れ、且つ再現性に優れたプローブ固相化反応
アレイと、これを用いた反応方法を提供される。

【００４８】また、本実施の形態では核酸プローブを支
持体に固定した核酸プローブ固相化反応アレイの例を示
したが、プローブとしての核酸に変えて、蛋白質または
ペプチド、抗原または抗体、或いはその組み合わせをプ
ローブとして使用してもよい。その場合、検出すべき標
的物質に特異的に結合する物質をプローブとして支持体
に固定すればよい。

【００４９】また、本実施の形態では、至適反応条件と
してＴｍ値や塩濃度を挙げたが、至適反応条件は、反応
が終了するまでの反応時間であってもよく、これら複数
種類の至適反応条件を組み合わせたものでもよい。

【００５０】また、本実施の形態では、ヒータが本発明
に従う反応アレイと別体である１例を示したが、ヒータ
およびセンサ並びに必要な配線等が反応アレイ中に組み
込まれていてもよい。

【００５１】近年、そのような複数の蛋白質やペプチド
を支持体に固定したプロテインチップが幾つか開示され
ている。例えば、ＳｃｉｅｎｃｅではＤＮＡマイクロア
レイ用のスポッターを用いて１万を越える蛋白質を固定
したチップを開示している(Science(2000)Sep 8;289(54
85):1673)。また、サイファージェン社では、プロテイ
ンチップと質量分析機を組み合わせた蛋白質の構造解
析、および相互作用解析システムを提案している。本発
明の態様は、このようなそれ自身公知の従来のプロテイ
ンチップにも応用することが可能である。

【００５２】また更に、上述した本発明の更なる側面に
従うと、本態様に従うプローブ固相化アレイを用いて、
個体における標的物質に関する情報の得る方法も提供さ
れる。そのような方法は、例えば、以下のように行うこ
とが可能である。まず、それ自身公知の手段により個体
から被検試料を得る。次に、本発明に従う前記プローブ
固相化反応アレイに具備される反応部の所望する数の反
応部、または所望する数の複数のプローブ固相化反応ア
レイに対して前記被検試料を添加する。前記被検試料を
添加した反応部における反応条件を、各反応部に具備さ
れる前記プローブ群の各々の至適反応条件となるように
反応条件の制御を行いながら前記プローブと標的物質と
を反応させる。続いて、前記プローブと標的物質の結合
を検出することによって、被検試料中に標的物質が存在
することを検出する。この検出は、使用する標識物質に
応じたそれ自身公知の手段により行うことが可能であ
る。次に、前記検出によって得られた結果から、個体に
おける標的物質に関する情報を得ることによって個体に
おける標的物質に関する情報の得る。

【００５３】ここで、このような方法により得られる情
報は、問題の個体における遺伝子発現に関する情報、ゲ
ノムに関する情報、蛋白質発現に関する情報、抗原抗体
などに関する免疫情報、並びに感染や疾病に関する情報
などであるが、これに限定されるものではない。所望す
る情報を得るためのプローブは、予め設計または選択し
ておけばよい。

【００５４】実施の態様２図２は、本発明のプローブ固相化反応アレイの１例とし
て実施の態様１に示したプローブ固相化反応アレイ１を
使用した処理システムの概略図を示す。本発明に従う
と、グループ分けした核酸プローブをそのグループ毎に
反応条件を整える必要がある。その結果、操作が煩雑に
なる可能性がある。本実施の態様に示す処理システムを
使用することにより、効率的に処理を行うことが可能に
なる。

【００５５】以下、図２に従い、本発明の処理システム
の１例を説明する。プローブ固相化反応アレイ１のキャ
ピラリ２には、排出用チューブ２５が接続されている。
排出用チューブはそれぞれのキャピラリに独立に接続さ
れる。図には示さないが、各チューブは、更に吸引ポン
プに接続され、廃液タンクに使用済みの試料や試薬が排
出される。ノズル２６は、プローブ固相化反応アレイ１
のそれぞれの反応部に対して、それぞれの開口部から流
体を流入するためのノズルである。図には示さないが、
ノズル２６は、分注ユニットおよびＸ−Ｙ−Ｚ軸の駆動
ユニットに接続されている。それにより、所望に応じた
分注と、この処理システムにおける座標間のの移動が可
能になる。リザーバ２７は複数具備され、それぞれに種
々の塩濃度の洗浄用緩衝液を収容する。更に、所望に応
じた試薬などを収容するための更なるリザーバを具備し
ていてもよい。マイクロタイタープレート２８は、被検
試料を各ウェルに収容する。図には示さないが、プロー
ブ固相化反応アレイ１の下部にはヒータが設置され、該
ヒータの温度はセンサーを含む温度調節ユニットにより
調節される。

【００５６】続いて、本実施の形態を用いた反応の手順
の例を示す。便宜上、プローブ固相化反応アレイ１に含
まれるキャピラリ２について説明する。プローブ固相化
反応アレイ１に含まれるその他のキャピラリについても
同様に処理を行うことが可能である。キャピラリ２は、
Ｔｍに従ってグループ分けされ固相化された核酸プロー
ブ群２９を具備する。キャピラリ２の反応条件に適した
塩濃度に調製された試料が、分注ノズル２６を介して試
料注入口１２から反応部に添加される。一定の反応時間
が経過した後、試薬リザーバ２７より洗浄用緩衝液が吸
引され、分注ノズル２６によりキャピラリへ添加され
る。この際、試薬リザーバからマイクロタイタープレー
トへの一定量の試薬の搬送および注入が可能であるよう
に、各部位は接続され制御されている。プローブ固相化
反応アレイ１に含まれる全てのキャピラリについてのこ
のような構成により、試薬および洗浄液をそれぞれの反
応条件に適した塩濃度に調製する手間が省ける。また、
洗浄は、通常、２種から３種の緩衝液を用いるので、洗
浄時の緩衝液の塩濃度や洗浄時間、回数などを機械的に
正確に制御することにより、精密で再現性のよい反応を
自動的に行うことが可能である。

【００５７】このようにプローブ固相化反応アレイ１を
使用する反応を行うためのシステム化を行うことによ
り、本発明の態様に従う装置の反応の精密化および良好
な再現性をより有効に利用することが可能である。

【００５８】実施の態様３反応部がウェル形状である本発明に従うプローブ固相化
反応アレイの例を図３および４に示す。

【００５９】図３（Ａ）は本態様であるプローブ固相化
反応アレイ３１を上面から見た平面図である。実施の態
様１と同様に、プローブ固相化反応アレイ１は、透明な
ガラス製の基板４９とシリコン基板５０を用いて製造さ
れたプローブ固相化反応アレイの例であり、従って、上
面から見た場合、ガラス基板４９を通して、シリコン基
板５０上に形成された各ウェルおよび核酸プローブを観
察することが可能である。また、図３（Ｂ）は、図３
（Ａ）の線Ａ−Ａに沿ったプローブ固相化反応アレイ１
の断面図である。

【００６０】プローブ固相化反応アレイ３１の基板の内
部には複数のウェル３２、３３、３４および３５が形成
されている。それぞれのウェルは互いに独立して形成さ
れるので、他のウェルに含まれる流体と互いに混じり合
うことはない。また、それぞれのウェルの両端には、開
口部が形成されている。具体的には、ウェル３２、３
３、３４および３５には、それぞれ試料注入口４１、４
２、４３および４４と、試料排出口４５、４６、４７お
よび４８が形成されている。ウェル３２、３３、３４お
よび３５の内部には、それぞれＴｍの違いによりグルー
プ分けされた核酸プローブ群３７(ａ〜ｐ;計１６スポッ
ト、以下同じ)、３８(ａ〜ｐ)、３９(ａ〜ｐ)および４
０(ａ〜ｐ)が固定されている。

【００６１】図４（Ａ）は本態様であるプローブ固相化
反応アレイ５１を上面から見た平面図である。実施の態
様１と同様に、プローブ固相化反応アレイ５１は、透明
なガラス製の基板５９とシリコン基板６０を用いて製造
されたプローブ固相化反応アレイの例であり、従って、
上面から見た場合、ガラス基板５９を通して、シリコン
基板６０上に形成された各ウェルおよび核酸プローブを
観察することが可能である。また、図４（Ｂ）は、図４
（Ａ）の線Ａ−Ａに沿ったプローブ固相化反応アレイ５
１の断面図である。

【００６２】プローブ固相化反応アレイ５１の基板の内
部には複数のウェル５２、５３、５４および５５が形成
されている。それぞれのウェルは互いに独立して形成さ
れるので、他のウェルに含まれる流体と互いに混じり合
うことはない。また、それぞれのウェルの両端には、開
口部が形成されている。具体的には、ウェル５２、５
３、５４および５５には、それぞれ試料注入口６０、６
１、６２および６３と、試料排出口６４、６５、６６お
よび６７が形成されている。ウェル５２、５３、５４お
よび５５の内部には、それぞれＴｍの違いによりグルー
プ分けされた核酸プローブ群５６(ａ〜ｐ;計１６スポッ
ト、以下同じ)、５７(ａ〜ｐ)、５８(ａ〜ｐ)および５
９(ａ〜ｐ)が固定されている。

【００６３】このような本発明に従うプローブ固相化反
応アレイは、実施の態様１および２に従い製造するこ
と、使用することおよび変更することが可能である。ま
た、並びに後述および態様に従って使用してもよい。

【００６４】また、ここでは、本発明の態様に従うウェ
ル形状の例として、底面および天井面が円である例を示
したが、ウェル形状の底面および天井面の形状はこれに
限定するものではなく、曲線および／または直線で囲ま
れた形状であればどのような形状であってもよい。

【００６５】実施の態様４続いて、実施の態様１に記載のプローブ固相化反応アレ
イ１に具備されるキャピラリ２、３、４、５および６の
反応温度をそれぞれに設定することにより、各キャピラ
リの至適反応条件を得る方法の例を示す。例えば、それ
ぞれのキャピラリに対して、市販のヒートブロックなど
を使用して温度管理してもよい。

【００６６】また、以下の加熱方法を利用してもよい。

【００６７】例えば、１２本のキャピラリを並列に配置
して具備するプローブ固相化反応アレイを使用する例を
以下に説明する。それぞれのキャピラリの下部にキャピ
ラリの形状に沿ったパターンで抵抗加熱体と測温抵抗体
を配置する。便宜上、順に１、２、３・・・１２と番号を
付す、そのうちの１、４、８、１２の抵抗加熱体と測温
抵抗体の系列を選択する。４つのキャピラリを夫々、９
０℃、８１．８℃、７０．９℃、６０℃の温度に制御し
て、各キャピラリの反応部内の溶液の温度を測定する。
その結果は図５のグラフ中の（ａ）に示される。また、
前記４キャピラリ全てを９０℃に制御し、各キャピラリ
の反応部内の溶液の温度を測定する。その結果を図５の
グラフ中の（ｂ）に示す。

【００６８】得られる結果を図５のグラフに示す。図５
のグラフは、横軸にキャピラリの番号を示し、縦軸には
各キャピラリに具備される全反応部に含まれる液体を示
す。グラフ中の矢印は、加温したキャピラリを示す。こ
のグラフから明らかであるように、１つのプローブ固相
化反応アレイに具備される１２のキャピラリに具備され
る反応部内部の温度は、その内の４つのキャピラリに対
する温度制御によって、全体が連続的に制御される。ま
た、この温度および温度勾配は、試験実施者の要求に応
じて任意に設定することが可能である。

【００６９】本実施の態様で示した方法は、４の温度制
御手段を用いて１２のキャピラリの反応部内部の温度を
制御した例を示したが、温度制御手段の数は４つ以下で
も以上でもよく、キャピラリの本数も所望に応じて増減
可能である。

【００７０】また、上述においてはプローブ群毎に揃え
る至適反応条件として温度を選択した例を示したが、そ
のような至適反応条件は、温度、塩濃度および反応時間
から任意に単独で選択してもよく、或いは任意の２以上
の組み合わせとして選択し、それぞれに制御されてもよ
い。

【００７１】実施の態様５本発明の更なる態様を図６を用いて説明する。本態様
は、本発明に従うプローブ固相化反応アレイの設計、製
造およびこれを使用した解析の設計、並びに前記解析の
実施および解析結果からの情報の収集、整理、並びに得
られたデータ更なる解析のための前記情報のデータベー
スへの保存を行う解析システムである。

【００７２】ここでは、プローブ固相化反応アレイの反
応部の形状がキャピラリ形状であり、且つプローブとし
てＤＮＡを前記キャピラリに固相化した装置（以下、Ｄ
ＮＡキャピラリアレイと記す）を用いる例を示すが、こ
れに限定されるものではない。本態様に示す解析システ
ムは、ＤＮＡキャピラリアレイと、各種デバイス、ツー
ルおよび装置を具備する。

【００７３】まず、本態様に使用されるデータベースに
は、それ自身公知の何れのデータベースも含まれる。実
施者（ユーザとも称す）がチップ台帳を参照して入力し
たデータを元に、必要なデータがＷｅｂやＣＤ−ＲＯＭ
等のそれ自身公知の手段を介して前記データベースから
チップ製造部に収集される。チップ製造部では、実施者
が実験計画のようなオーダー情報に基づいて入力したデ
ータを元に、前記データベースから収集したデータが、
整理され、整形される。その後、実施者は必要なデータ
を選択することが可能である。実施者は、チップ製造部
のインターフェースを介して、後述するプローブ設計手
法としてのタプル計算を演算部に行わせたり、その計算
結果をチップ製造装置に伝えさせたりできる。それによ
って所望の解析に適している複数のＤＮＡプローブがチ
ップ製造装置において指定され、前述した実施の態様で
示したような処理システムが機能せしめられることによ
り、各種指定されたＤＮＡプローブがグループ分けさ
れ、グループ分けされた複数のＤＮＡプローブは、複数
の独立したキャピラリまたはウェルにグループ毎に固相
化され、本発明に従うＤＮＡキャピラリアレイ（図６に
おいてはＤＮＡキャピラリと示す）が製造される。この
製造に関する情報は、チップ台帳と照合したり、台帳を
更新する際に用いられる。

【００７４】製造されたＤＮＡキャピラリアレイを用い
た反応、測定および各種評価は、チップ製造部と連絡し
た測定部によって行われる。この測定部は、例えば、複
数のＤＮＡキャピラリアレイについて、所望の順番で個
々のプローブ毎に測光用ビームを照射したり、蛍光シグ
ナルを受光する光学測定要素を備えるとともに、受光し
た各測定データを別々にまたは総合的に解析して、個体
（例えば、患者など）毎に解析データの出力（例えば、
ディスプレイへの表示または報告用紙への印刷など）を
行う構成を具備している。ここにおいて、測定部によっ
て実測された測定結果および解析用ソフトにより解析さ
れた解析結果の各データは、個体別の試薬台帳を反応条
件別の反応条件台帳を基に、データとしてそれ以降の種
々解析において利用されるためにデータベースに保存さ
れる。

【００７５】プローブとのハイブリダイゼーションによ
り、多数の標的核酸を正確に捉えるためには、上述のと
おり、各標的核酸を検出するためのプローブ毎にハイブ
リダイゼーション条件を最適化させればよい。即ち、各
プローブのＴｍおよび至適反応温度を考慮した上で、上
述のように空間的に異なる場所で、プローブと標的核酸
のハイブリダイゼーションを行えばよい。従来の方法で
は、標的配列の数が、数百、数千と、増えることになる
と空間的に異なる反応場を提供することは不可能であっ
た。これに対して、本発明の態様に従えば、支持体に形
成された溝毎にＴｍでグループ化された核酸プローブ群
を固定化した装置を用いることにより、好ましい条件の
下で標的核酸とのハイブリダイゼーションを行うことが
可能である。

【００７６】同一または異なるアレイ上で反応および測
定された複数種類の個体由来の試料から測定データは、
個体毎にまとめて解析および／または出力するのが好ま
しい。

【００７７】本実施の形態において使用され得るＤＮＡ
キャピラリアレイの１例を以下に記す。また、そのマス
クパターンのを図３に示す。前記ＤＮＡキャピラリは、
スライドガラスとほぼ同等のサイズ、即ち、２５ｍｍ×
７６ｍｍのサイズに、溝幅５００μｍ、深さ１００μｍ
で約４０ｍｍの長さのキャピラリを５ｍｍピッチで８本
形成している。

【００７８】また、このようなＤＮＡキャピラリアレイ
は、キャピラリ内でハイブリダイゼーションと蛍光検出
を行うために、次のような条件を満たす必要がある。

【００７９】（１）キャピラリ内壁は耐水性があり、キ
ャピラリ間でコンタミネーションが起きないこと；（２）水に接しながら室温から最大９４℃まで温度が変
化しても、キャピラリが変形して蛍光観察ができなくな
ったり、キャピラリ間でコンタミネーションが生じない
こと；（３）キャピラリの材料自身が励起光により検出用蛍光
体に近い波長の蛍光を発しないこと；（４）キャピラリ内壁からハイブリダイゼーションを阻
害したり、蛍光観察におけるノイズの元となる物質を溶
出しない；（５）キャピラリアレイに接触しているヒータから効率
よく熱伝導が起きる材料であること。

【００８０】以上の条件を満たし、更に入手および加工
が容易な材料を検討した結果、本態様では、溝部はシリ
コンウェハ、光透過部はパイレックスガラスまたは石英
ガラスを選択した。

【００８１】加工は、溝部と光透過部とに分けられる。
倒立型顕微鏡をベースとした装置で検出する場合は、溝
部に貫通穴を、正立顕微鏡をベースとした装置なら、光
透過部に貫通穴をあける。更に、溝部は沸硝酸・酢酸に
より等方性エッチングを行い溝を形成する。接合工程
は、シリコン−石英ガラスの場合には接着剤をスクリー
ン印刷機によって印刷し接着する。一方、シリコン−パ
イレックスガラスの場合は、半導体プロセスでよく用い
られている陽極接合法により高温および高電圧のもとで
接合を行えばよい。以上の代表的なプロセスを図８にま
とめた。

【００８２】［オリゴＤＮＡプローブ設計］次に、ＤＮ
Ａキャピラリアレイにおいて使用する核酸プローブ（例
えば、オリゴヌクレオチドプローブ等）の塩基配列を設
計する方法について説明する。

【００８３】ＤＮＡキャピラリアレイで使用するＤＮＡ
プローブとしては、オリゴヌクレオチドからなるプロー
ブとｃＤＮＡのプローブがある。ｃＤＮＡプローブより
もオリゴヌクレオチドプローブの方が次の点で優れてい
る。（１）クロスハイブリダイゼーションによるエラー
が少ない；（２）プローブの調製に手間が掛からない；
（３）ハイブリダイゼーションの時間が短い；（４）選
択転写、選択スプライシングの区別が可能である。オリ
ゴヌクレオチドプローブの設計にはゲノムＤＮＡの塩基
配列が十分に決定されていることが必要とされるが、ゲ
ノムプロジェクトの急速な進展に伴い、多くの生物でこ
のような条件が整ってきた。

【００８４】従来のＤＮＡチップでは、２次元の平面的
広がりをもつ支持体表面上にプローブが集積される。こ
れらのプローブは同一のハイブリダイゼーションおよび
洗浄条件に曝されるので、全てのプローブのＴｍがそろ
っていないと偽陽性や偽陰性のエラーを生じる危険性が
高くなる。また、検出器のダイナミックレンジに制約さ
れるために、発現レベルが大きく異なるもの同士の正確
な検出は容易ではない。

【００８５】それに対してＤＮＡキャピラリアレイ型の
本発明の態様に従うＤＮＡチップでは、同一のチップ上
でもキャピラリ毎にハイブリダイゼーションおよび洗浄
条件、サンプル濃度を変えることが可能である。これら
の特徴を活かすために、Ｔｍや発現頻度で効率よくグル
ープ化されたプローブ配列を設計する方法であるタプル
法（N.uchikoga, A. Suyama, Genone Informatics, 9,
388-389(1998)）を利用することも可能である。そのよ
うな方法を具備する態様も本発明の範囲内に含まれる。

【００８６】タプル法は、タプルと呼ぶ数塩基程度の短
い塩基配列（ここでは例として７塩基の場合を示す）
が、全遺伝子の中で何回出現するかを数え上げる。この
数え上げは、始めに一度だけ行う。図９のように、候補
の塩基配列に含まれるタプルを調べ上げて、高頻度に出
現しているタプルがないかを調べる。その候補が善意電
子のうちで「ありふれた」配列でないか、特異性を評価
計算する。実際には、最初にタプル頻度を計算してか
ら、候補配列をタプルで評価して特異性の高い物を選択
し、途中、実験条件によって定まる制限を適用した後、
実験に適した熱特性をもつ候補だけを通すフィルターに
かけて候補を絞る。更に、ＤＮＡは相補的に結合する性
質があるので、１本鎖ＤＮＡだけでも十分に長ければ自
己分子内で結合してしまいハイブリダイゼーション反応
を起こしにくくなることがある。このような構造を取り
得るかどうかを計算で予想して排除している。以上の手
順を図１０に示す。

【００８７】これらの方法によって、出芽酵母の全ＯＲ
Ｆ（即ち、Open reading frame）領域を同定するための
３０塩基長ＤＮＡプローブ配列の設計を試みた。表１で
は、その極一部である３種類の遺伝子を検出するための
ＤＮＡプローブの候補がそれぞれ６〜１０種類示されて
いる。また、この場合のＴｍグループは、６４±２℃、
６０±２℃、５４±２℃、５２±２℃の４グループであ
った。

【００８８】

【表１】

【００８９】［液体処理装置］ＤＮＡキャピラリアレイ
への試料導入、反応制御、洗浄は必要とされる液体量が
微量であるため、専用のシステムを開発している。液体
処理装置は、ＤＮＡキャピラリアレイへの種々の液体を
供給するためのものである。特に、多数のキャピラリへ
の液体を確実に供給するためには各々のキャピラリ毎に
液体の流れを制御する必要があり、キャピラリへの液体
供給を精密に制御するためにはキャピラリの本数に相当
するバルブも必要となる。装置全体の小型化と高精度化
を図るには、マイクロ加工技術によるバルブアレイを登
載し、コネクター部分無効体積を極限まで少なくして高
精度の液体制御を行う方法が最も望ましい。しかしなが
ら、現状ではバルブアレイの開発は難度が高いことが予
想されるため、市販の小型のバルブを複数使って実現し
ている。

【００９０】本発明の態様に従って好ましく使用される
バイブアレイの例は、庄子のより提案されているものが
含まれる（庄子習一、日本機械学会ロボティクス・メカ
トロニクス講演会（１９９８））。

【００９１】上述した本態様の１例であるＤＮＡキャピ
ラリアレイはプロトタイプであるが、これに合わせて８
本のキャピラリを処理できる装置を開発した。この装置
はＤＮＡプローブが固相化されている領域のキャピラリ
部分のみの温度制御が可能で、キャピラリ１本当たり約
５μＬの試料溶液を導入したり洗浄できるように構成さ
れている。それらの処理は完全に自動化されているた
め、高い再現性が実現できる。

【００９２】［キャピラリの高密度化］本発明の態様に
従い使用されるプローブ固相化反応アレイは、図１１の
ようなパターンでキャピラリを具備してもよい。即ち、
本発明に従うキャピラリはその一部または全体が屈曲し
ていてもよい。

【００９３】

【発明の効果】本発明に従うと、反応効率および再現性
に優れたプローブ固定化反応アレイおよびそれを用いる
反応方法が提供される。

【００９４】より具体的には、本発明に従うと、支持体
に固定された複数のプローブとそのプローブによりそれ
ぞれ検出されるべき標的物質との反応がより好ましい条
件で行われるプローブ固相化反応アレイおよびそれを用
いた反応方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の態様に従うプローブ固相化反応アレイ
の１例を示す図。

【図２】本発明の態様に従うプローブ固相化反応アレイ
を具備する処理システムを示す模式図。

【図３】本発明の態様に従うプローブ固相化反応アレイ
の１例を示す図。

【図４】本発明の態様に従うプローブ固相化反応アレイ
の１例を示す図。

【図５】複数のキャピラリを具備する本発明の態様に従
うプローブ固相化反応アレイの温度制御の例を示すグラ
フ。

【図６】本発明の態様に従うプローブ固相化反応アレイ
を具備する解析システムを示す図。

【図７】本発明の態様に従うプローブ固相化反応アレイ
の１例のマスクパターンを示す図。

【図８】本発明の態様に従うプローブ固相化反応アレイ
の製造プロセスの例を示す図。

【図９】タプル法の概念を示す図。

【図１０】計算フィルターの例を示すフローチャート。

【図１１】本発明の態様に従うプローブ固相化反応アレ
イの１例を示す図。

【符号の説明】

１，３１，５１．プローブ固相化反応アレイ２，３，４，５，６．キャピラリ７，８，９，１０，１１，２９，３７，３８，３９，４
０，５６，５７，５８，５９．核酸プローブ群１２，１３，１４，１５，１６，４１，４２，４３，４
４．試料注入口１７，１８，１９，２０，２１，４５，４６，４７，４
８．試料排出口２２，２３，４９，５０，５９，６０．基板２４．ヒータ２５．排出および注入用チューブ２５ａ，２５ｂ．連結部２６．ノズル２７．リザーバ２８．マイクロタイタープレート２９．核酸プローブ３１．プローブ固相化反応アレイ３２，３３，３４，３５，５２，５３，５４，５５．ウ
ェル

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (72)発明者森本伸彦東京都渋谷区幡ヶ谷２丁目43番２号オリンパス光学工業株式会社内Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 AA20 CA01 CA09 CA11 HA14 HA20 4B029 AA08 AA23 BB20 CC01 CC02 CC03 CC08 FA12 FA15 4B063 QA01 QA13 QA20 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR55 QR82 QS34 QS39 QX02 QX10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】支持体と、前記支持体のそれぞれに独立して形成された第１から第
ｎまでの反応部と（ここでｎは２以上の整数である）、前記第１から第ｎまでのそれぞれの反応部から、前記支
持体の第１の面に開口する２つの開口部と、前記第１の反応部の壁面に固相化された第１のプローブ
群から、第ｎの反応部の壁面に固相化された第ｎのプロ
ーブ群までのプローブ群と（ここでｎは２以上の整数で
ある）、を具備するプローブ固相化反応アレイであっ
て、前記第１から第ｎまでの各プローブ群には複数種類のプ
ローブが含まれ、且つ各プローブ群のそれぞれに含まれ
るプローブは、プローブ群毎に至適反応条件が揃ってい
ることを特徴とするプローブ固相化反応アレイ。
【請求項２】前記第１から第ｎまでのプローブ群の少
なくとも２群は、互いに至適反応条件が異なることを特
徴とする請求項１に記載のプローブ固相化反応アレイ
（ここでｎは２以上の整数である）。
【請求項３】前記反応部がキャピラリ形状の内腔より
なることを特徴とする請求項１または２の何れか１項に
記載のプローブ固相化反応アレイ。
【請求項４】前記開口部が前記キャピラリ形状の内腔
の長手方向の両端から前記支持体の第１の面に開口して
いることを特徴とする請求項３に記載のプローブ固相化
反応アレイ。
【請求項５】前記反応部がウェル形状の内腔よりなる
ことを特徴とする請求項１または２の何れか１項に記載
のプローブ固相化反応アレイ。
【請求項６】前記至適反応条件が揃っているというこ
とが、前記各プローブ群に含まれる複数種類のプローブ
と、前記複数種類のプローブがそれぞれに結合するべき
標的物質との反応のための至適反応条件が等しいという
ことであることを特徴とする請求項１から５の何れか１
項に記載のプローブ固相化反応アレイ。
【請求項７】前記プローブが核酸であることを特徴と
する請求項１から６の何れか１項に記載のプローブ固相
化反応アレイ。
【請求項８】前記至適反応条件が揃っているというこ
とが、Ｔｍが近いということであることを特徴とする請
求項７に記載のプローブ固相化反応アレイ。
【請求項９】前記反応部に具備される全てのプローブ
に関するＴｍの差が±２℃であることを特徴とする請求
項８に記載のプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１０】前記反応部に具備される全てのプロー
ブに関するＴｍの差が±１℃であることを特徴とする請
求項８に記載のプローブ固相化反応アレイ。
【請求項１１】前記プローブがペプチド、蛋白質、抗
原および抗体からなる群より選択されることを特徴とす
る請求項１から６の何れか１項に記載のプローブ固相化
反応アレイ。
【請求項１２】前記至適反応条件が揃っているという
ことが、上記ペプチド、蛋白質、抗原および抗体の活性
を維持するための至適ｐＨおよび塩濃度が近いというこ
とであることを特徴とする請求項１１に記載のプローブ
固相化反応アレイ。
【請求項１３】請求項１から１２の何れか１項に記載
のプローブ固相化反応アレイを使用して前記プローブと
前記標的物質を反応させる方法であって、前記第１から
第ｎまでの反応部における反応条件を、各反応部に具備
される前記プローブ群の各々の至適反応条件となるよう
に反応条件の制御を行いながら、前記プローブと標的物
質とを反応させることを具備する方法。
【請求項１４】請求項１から１２の何れか１項に記載
のプローブ固相化反応アレイを使用した反応方法であっ
て、（１）請求項１から１２の何れか１項に記載の前記プロ
ーブ固相化反応アレイに具備される前記第１から第ｎま
での反応部に対して被検試料を添加することと、（２）前記第１から第ｎまでの反応部における反応条件
を、各反応部に具備される前記プローブ群の各々の至適
反応条件となるように反応条件の制御を行いながら前記
プローブと標的物質とを反応させることと、を具備する
反応方法。
【請求項１５】前記反応条件の制御が、前記プローブ
群の各々の至適反応条件となるような組成を有した溶液
を用いて前記（２）に記載の反応を行うことを特徴とす
る請求項１３または１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】温度、塩濃度および反応時間、並びに
これらの組み合わせからなる群より少なくとも１選択さ
れる条件を、前記反応部のそれぞれに制御することによ
って、前記反応条件の制御がなされることを特徴とする
請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】前記（２）の反応の後に、更に、前記
プローブ群の各々の至適反応条件となるような組成を有
した溶液を用いて前記反応部を洗浄することを具備する
請求項１４または１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】請求項１から１２の何れか１項に記載
のプローブ固相化反応アレイを使用した標的物質の検出
方法であって、（１）請求項１から１２の何れか１項に記載の前記プロ
ーブ固相化反応アレイに具備される前記第１から第ｎま
での反応部に対して被検試料を添加することと、（２）前記第１から第ｎまでの反応部における反応条件
を、各反応部に具備される前記プローブ群の各々の至適
反応条件となるように反応条件の制御を行いながら前記
プローブと標的物質とを反応させることと、（３）前記プローブと標的物質の結合を検出することに
よって、被検試料中に標的物質が存在することを検出す
ることと、を具備する検出方法。
【請求項１９】前記（２）の反応の後に、更に、前記
プローブ群の各々の至適反応条件となるような組成を有
した溶液を用いて前記反応部を洗浄することを具備する
請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２０】請求項１から１２の何れか１項に記載
のプローブ固相化反応アレイを使用した、個体における
標的物質に関する情報の得る方法であって、（１）個体から被検試料を得ることと、（２）請求項１から１２の何れか１項に記載の前記プロ
ーブ固相化反応アレイに具備される前記第１から第ｎま
での反応部に対して被検試料を添加することと、（３）前記第１から第ｎまでの反応部における反応条件
を、各反応部に具備される前記プローブ群の各々の至適
反応条件となるように反応条件の制御を行いながら前記
プローブと標的物質とを反応させることと、（４）前記プローブと標的物質の結合を検出することに
よって、被検試料中に標的物質が存在することを検出す
ることと、（５）前記（４）に記載の検出することにより得られた
結果から、個体における標的物質に関する情報を得るこ
とと、を具備する個体における標的物質に関する情報の
得る方法。
【請求項２１】請求項２０に記載のプローブ固相化反
応アレイを使用した、個体における標的物質に関する情
報の得る方法であって、異なる複数の被検試料のそれぞ
れに対して、少なくとも１個の支持体上の複数の反応部
を割り当て、至適反応条件に応じた検出を行うと共に、
得られた検出結果を被検試料毎にまとめて解析および／
または出力する方法。