JP2011523698A - マイクロアレイシステム - Google Patents

Abstract

マイクロアレイシステムが開示される。マイクロアレイシステムは、平面基板上に形成されたマイクロアレイおよびマイクロアレイの周囲に形成されたインキュベーションチャンバーを含む。インキュベーションチャンバーは、その上にマイクロアレイが形成される底面、および底面と対面し且つ底面と概して平行である上面を含む複数の内面を有する。複数の内面のうち少なくとも１つは親水性の表面である。
【選択図】
図５

Description

本技術分野はマイクロアレイシステムおよび、特に、一方向バルブおよび／または廃液チャンバーと接続されたインキュベーションチャンバーを有するマイクロアレイシステムである。

マイクロアレイは、複数の検出反応を同時に遂行することによりサンプルの複雑な分析を実施する大きな可能性を提供する。典型的には、反応物分子の複数のスポットのマイクロアレイが、通常は二次元グリッドパターンにある顕微鏡スライドガラスなどの平面基板上に形成される。次に、液状サンプルおよび試薬をスライドに適用し、同時に複数のスポットと接触させる。マイクロアレイにおいて結合した分子によって、結合した反応物分子の液状サンプルおよび試薬への曝露および洗浄段階を含む多様な反応段階を実施することもある。スライド上に固定された物質または液状サンプル中の物質のいずれかを特性付けるために、マイクロアレイの各スポットにおいて反応の進捗および結果をモニタリングすることもある。

マイクロアレイ分析は、通常数分から数時間の範囲に及ぶインキュベーション時間を要する。インキュベーション時間の長さは分析によって異なり、反応物の種類、混合の程度、サンプルの容積、目標コピー数、およびアレイの密度などの多様な因子によって決定される。インキュベーション時間中、液状サンプル中の目標分子はマイクロアレイプローブと密接（密に接触）しなければならない。インキュベーションは、通常はインキュベーションチャンバー内で実施される。インキュベーションチャンバーは、典型的にはマイクロアレイの周囲にガスケットを形成することによって形成される。ガスケットはカバースリップによって被覆され、密閉されたチャンバーを形成する。カバースリップは、インキュベーション後のマイクロアレイの光学的検査（インタロゲーション）を可能とするために、ガラスなどの透明な材料で製作することもできる。

カバースリップが入口およびベントを有していない場合、カバースリップをガスケットの上部に載置する前にインキュベーションチャンバーに液状サンプルおよび他の試薬を付加する必要がある。反応混合物をガスケットの縁まで充填する場合、混合物がガスケットの側部より漏出し、ガスケット／カバーシールを毀損し、さらに環境を汚染するリスクを高めることがある。充填のための穴およびベンティングを有するカバースリップはこれら２つの問題を回避する。しかし、カバースリップ上の穴からインキュベーションチャンバーに充填することには、しばしばインキュベーションチャンバー内へ気泡またはエアポケットを導入する危険を伴う。さらに、液状サンプルまたは反応混合物の表面張力も、液状サンプルまたは反応混合物がインキュベーションチャンバーを完全に充填することを妨害することがある。エアポケットがアレイスポットを被覆し、且つアレイスポットと液状サンプルまたは反応混合物との接触を妨害した場合、部分的に充填されたチャンバーが擬陽性の結果を示すことがある。

マイクロアレイシステムが開示される。マイクロアレイシステムは、平面基板上に形成されたマイクロアレイ、およびマイクロアレイの周囲に形成されたインキュベーションチャンバーを含む。インキュベーションチャンバーは、その上にマイクロアレイが形成される底面、および底面と対面し且つ底面と概して平行である上面を含む複数の内面を有する。複数の内面のうち少なくとも１つは親水性の表面である。

平面基板上に形成されたマイクロアレイ、マイクロアレイの周囲に形成されたインキュベーションチャンバー、液状サンプルをインキュベーションチャンバー内に装填するドームバルブ、および一方向バルブをインキュベーションチャンバーに接続する導管を有するマイクロアレイシステムも開示される。

発明を実施するための形態は、同様の数字が同様の要素を示す以下の図面に言及するであろう。

マイクロアレイシステムのインキュベーションチャンバーの１つの実施形態の模式図である。 貫通するピペットチップを有するサポートハウジング内のドームバルブの模式図である。 廃液チャンバーを有するマイクロアレイシステムの１つの実施形態の模式図である。 廃液チャンバーを有するマイクロアレイシステムの他の実施形態の模式図である。 統合マイクロアレイシステムの１つの実施形態の模式図である。 マイクロアレイシステムの１つの実施形態の寸法を示す模式図である。 廃液チャンバーへの液状物の吸上を評価するために用いられる４つのマイクロアレイインキュベーションチャンバーのアセンブリ（パネルＡ）およびハイブリダイゼーションの結果（パネルＢ）を示す図の組合せである。 統合マイクロアレイシステムの実施形態（パネルＡ）およびマイクロアレイシステムからのハイブリダイゼーションの結果（パネルＢ）を示す図の組合わせである。 マイクロアレイシステムの実施形態の模式図（パネルＡ）、アレイマップ（パネルＢ）、およびハイブリダイゼーションの結果（パネルＣ）を示す図の組み合わせである。 ハイブリダイゼーションの結果（パネルＣ）を示す図の組み合わせである。

この説明は、本発明の記述された説明全体の一部と見なすべきである、付属の図面と関連付けて読まれることを意図している。図面は正しい縮尺で描出される必要はなく、且つ明解性および簡潔性を図って発明のある特徴を縮尺において誇張したり、または幾分模式的な形態で示したりしてもよい。記述においては、「前」、「後」、「上へ」、「下へ」、「上部」および「底部」などの相対的な用語、ならびにその派生語は、その時に論じられる図の描出において記載されるかまたは示される方向を指すと解釈すべきである。これらの相対的な用語は記載の簡便さを目的としており、通常は特定の方向を必要とすることを意図していない。「連結された」および「着接された」などの着接、接続などに関する用語は、説明的に記載されない限り、構造が直接的または介入構造を経て間接的に相互に固定または着接された関係、ならびに可動性のまたは剛直な着接または関係を指す。

本明細書で用いられるところの用語「マイクロアレイ」は、目的のリガンドと結合するために提供されたスポットの配列されたアレイを指す。マイクロアレイは少なくとも２つのスポットからなる。目的とするリガンドは核酸、タンパク質、ペプチド、多糖類、抗体、抗原、ウイルス、および細菌を含むがこれに限定されない。

本明細書で用いるところの用語「親水性の表面」は、そのような表面上で静止する純水の水滴と６０°またはそれ以下の接触角を形成するような表面を指す。本明細書で用いるところの用語「疎水性の表面」は、そのような表面上で静止する純水の水滴と６０°を超える接触角を形成するような表面を指す。接触角は接触角度計を用いて測定することができる。

本明細書で用いるところの用語「インキュベーションチャンバー」は、マイクロアレイの周囲の密封された空間を指す。インキュベーションチャンバーは、液状サンプルで満たされた場合、液状サンプル中の目標分子がマイクロアレイプローブとの密な接触を維持できるよう、マイクロアレイが液状サンプルに浸漬されることを可能とする。

本明細書においては、親水性表面を伴うインキュベーションチャンバーを有するマイクロアレイシステムが開示される。液状物がチャンバーに進入するにつれてこれに接触する親水性表面を用いることによって、インキュベーションチャンバーの完全な充填が可能となる。

上述のように、液状サンプルまたは反応混合物の表面張力は、液状サンプルまたは反応混合物が、マイクロアレイシステムのインキュベーションチャンバーなどの小さな空間を完全に充填することをしばしば妨害する。表面張力は、多様な分子間力による液状物分子間の引力の結果である。液状物の大部分において、各分子は隣接する液状物分子により全方向に同等に牽引されるため、全体の力はゼロとなる。液状物の表面においては、分子は液状物内部のより深いところにある他の分子によって内向きに牽引され、且つ（真空、空気または他の液状物であれば）隣接する媒体中の分子によっては同様に強く牽引されない。したがって表面にある全ての分子は、圧縮に対する液状物の抵抗によってのみ均衡することのできる分子間引力の内向きの力を被る。この内向きへの牽引は表面積を減少させる傾向にあり、且つこの点で液状物表面は伸展する弾性の膜に類似している。したがって、液状物はその部分で可能な限り最も小さな表面積を有するまで自身を緊密に圧搾する。最終的な結果は、液状物が小さな空間の内部においてほぼ球状の形状を維持することがあり、かつ隅、特に小さな区間の正方形の隅を充填しないことである。カバーとマイクロアレイの表面を隔離する典型的な小さなギャップは、しばしば液状物を円柱状の形状に圧縮する。

マイクロアレイシステムの場合、インキュベーションチャンバーを満たす液状物は、ハイブリダイゼーションバッファーまたは洗浄バッファーなどの水性液状物である可能性が高い。水性液状物の表面張力は、インキュベーションチャンバーの内面の少なくとも一部を親水性物質で被覆することによって克服されることがある。

図１はインキュベーションチャンバーの１つの実施形態を示す。この実施形態においては、平面基板３０の上面３２にプリントまたは形成された多数のマイクロアレイスポット２２よりなるマイクロアレイ２０の周囲にインキュベーションチャンバー１０が形成される。表面３２はインキュベーションチャンバー１０の底面も形成する。チャンバー１０の上部はカバースリップ４０によって被覆される。インキュベーションチャンバー１０は、典型的にはガラスまたはプラスチックスライドである、平面基板３０の寸法と適合するあらゆるサイズまたは形状とすることができる。

この実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０は平面基板３０の上部にガスケット３４を載置し、且つガスケット３４をカバースリップ４０で被覆することによって形成される。他の実施形態において、インキュベーションチャンバー１０は平面基板３０にポケットまたは陥凹領域を（たとえば成形またはエッチングなどによって）作成し、ポケットまたは陥凹領域の底部にマイクロアレイ２０をプリントし、さらにポケットまたは陥凹領域をカバースリップ４０で被覆することによって形成される。さらに他の実施形態においては、カバースリップ４０上にポケットまたは陥凹領域を形成し、その後これを平面基板３０の上面に直接載置する。

インキュベーションチャンバー１０は、インキュベーションチャンバー１０におけるハイブリダイゼーションまたは他の何らかの反応に必要とされる液状物の容積を減少させるよう、通常はマイクロアレイ２０の周囲に形成される。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバーは約０．１〜１０ｃｍ^２，好ましくは約０．５〜５ｃｍ^２の底面積および約０．０５〜５ｍｍ、好ましくは約０．１〜１ｍｍの高さを有する。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバーの総容積は１〜２５０μＬの範囲内である。

インキュベーションチャンバー１０は、その形状に応じて、その上にマイクロアレイ２０が形成される底面、下向きに底面に対面し且つ概して底面と平行である上面、および１つまたはそれ以上の側面を含むいくつかの内面を有する。インキュベーションチャンバー１０の均一な充填を確保する目的のために、全ての内面が親水性である必要はない。１つの実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面のみが親水性である。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の底面のみが親水性である。他の実施形態においては、上面および底面が共に親水性である。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバーの全ての内面が親水性である。

親水性の表面は水を誘引する表面である。親水性の表面は、典型的には電荷分極しており且つ水素結合の能力を有する分子を含む。１つの実施形態においては、平面基板３０またはカバースリップ４０は親水性材料より製作されるため、それぞれ親水性底面または親水性上面を提供する。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面または底面が不溶性親水性材料によって被覆される。親水性物質の例は、ポリ（Ｎ−ビニルラクタム）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（プロピレンオキシド）、ポリアクリルアミド、セルロース誘導体、メチルセルロース、ポリ酸無水物、ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルエステル、アルキルフェノールエトキシレート、ポリオールモノエステル複合体、ポリオキシエチレンオレイン酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンオレイン酸エステル、および脂肪酸ソルビタンエステル等の親水性ポリマー；無機オキシド、金、ゼオライト、およびダイヤモンド様炭素等の無機親水性物質；およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−ｌ００、Ｔｗｅｅｎ、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸アンモニウム、アルキル硫酸塩、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、アルキルベンゼンスルホン酸、石けん、脂肪酸塩、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）別名臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、アルキルトリメチルアンモニウム塩、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、ポリエトキシル化牛脂アミン（ＰＯＥＡ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、ドデシルベタイン、ドデシルジメチルアミンオキシド、コカミドプロピルベタイン、ココアンフォグリシネートアルキルポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリプロピレンオキシドのコポリマー（商品名ＰｏｌｏｘａｍｅｒｓまたはＰｏｌｏｘａｍｉｎｅｓ）、アルキルポリグルコシド、脂肪アルコール、コカミドＭＢＡ、コカミドＤＥＡ、コカミドＴＥＡ等の界面活性剤を含むがこれに限定されない。界面活性剤は、ポリウレタンやエポキシなどの反応ポリマーと混合して親水性コーティングとして用いることができる。他の実施形態においては、インキュベーションチャンバー１０の上面または底面が雰囲気プラズマ処理によって親水性とされる。

代替的に、インキュベーションチャンバーの上面または底面を市販の親水性テープまたはフィルムで被覆してもよい。親水性テープの例はＡｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＲ）テープ９０１２８、ＡＲテープ９０４６９、ＡＲテープ９０３６８、ＡＲテープ９０１１９、ＡＲテープ９２２７６、およびＡＲテープ９０７４１（Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、ペンシルバニア州グレンロック）を含むがこれに限定されない。親水性フィルムの例は、（Ｆｉｌｍ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ社、ニュージャージー州ヒルズバラ）製のＶｉｓｔｅｘ（登録商標）およびＶｉｓｇｕａｒｄ（登録商標）フィルムおよびＬｅｘａｎ ＨＰＦＡＦ（ＧＥ Ｐｌａｓｔｉｃｓ社、マサチューセッツ州ピッツフィールド）を含むが、これに限定されない。他の親水性表面は、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ社（ミネソタ州イーデンプレーリー）、Ｂｉｏｃｏａｔ社（ペンシルバニア州ホーシャム）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（マサチューセッツ州ビルリカ）およびＨｙｄｒｏｍｅｒ社（ニュージャージー州ブランチバーグ）より入手することができる。

１つの実施形態においては、親水性テープまたはフィルムはインキュベーションチャンバーの上部からのマイクロアレイの光学的インタロゲーションを可能とするために十分な透明性を有する。他の実施形態においては、親水性表面はインキュベーションチャンバーの上面を親水性コーティングで被覆することにより作成される。他の実施形態においては、親水性表面は単純にカバースリップ４０を親水性テープまたは親水性フィルムに置換することによって作成される。

さらに他の実施形態においては、親水性表面はタンパク質を変性させながら細胞膜を溶解し、且つ核酸を捕捉する化学物質が浸漬された親水性基剤である。親水性基剤は、サンプルの精製およびインキュベーションチャンバー内へのサンプルの均一な吸上という２つの機能を実施するであろう。１つの実施形態においては、親水性基剤はＦＴＡ紙（登録商標）（Ｗｈａｔｍａｎ社、ニュージャージー州フロハムパーク）である。生物学的サンプルをＦＴＡ（登録商標）紙に適用し、サンプルに含有される細胞を紙の上で溶解させる。紙を洗浄してあらゆる非ＤＮＡ材料を除去する（ＤＮＡは紙に絡着して残る）。次に、その後のマイクロアレイ分析のためにＤＮＡを溶離する。代替的に、溶離段階を伴わずに結合したＤＮＡをマイクロアレイ検出のために原位置で増幅してもよい。

ＦＴＡ紙（登録商標）をアレイの対側面（すなわちインキュベーションチャンバーの上面）として用いることができる。代替的に、マイクロアレイをＦＴＡ紙（登録商標）にプリントしてもよく、インキュベーションチャンバー上部の透明なカバースライドによってマイクロアレイの目視が可能となるであろう。他の実施形態においては、ＦＴＡ紙（登録商標）上で核酸サンプルを増幅するためにＰＣＲ試薬をインキュベーションチャンバーに導入してもよい。この実施形態においては、増幅はインキュベーションチャンバー１０の内部で実施される。

マイクロアレイ２０は、核酸マイクロアレイまたはタンパク質マイクアレイを含むがこれに限定されないあらゆる種類のマイクロアレイとすることができる。１つの実施形態においては、マイクロアレイ２０は、たとえば全て参照文献として全文が本明細書に援用される米国特許第５，７４１，７００号、第５，７７０，７２１号、第５，９８１，７３４号、第６，６５６，７２５号および米国特許出願番号第１０／０６８，４７４号、第１１／４２５，６６７号および第６０／７９３，１７６号に記載されたプリントゲルスポット法を用いて形成される。

他の実施形態においては、マイクロアレイシステムはインキュベーションチャンバー１０に液状物（例：サンプル、ハイブリダイゼーションバッファーまたは洗浄バッファー）を導入するための一方向バルブをさらに含む。サンプルは、生物兵器剤の検出などの一定の用途における重要な懸念である環境汚染を防止するために、一方向バルブを経てインキュベーションチャンバー１０に導入する。一方向バルブは、インキュベーションチャンバーの入口に載置された逆止弁またはドームバルブとすることができる。多様なサイズのドームバルブが市販されている（例：Ｍｉｎｉｖａｌｖｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社より、オハイオ州イエロースプリングス）。図２に示す実施形態においては、ドームバルブ５０は２つのコンポーネント：ドーム型バルブボディ５２およびバックシール５４を含む。バックシールは、イントロデューサー５６がバックシール５４を貫通することを可能とする１つの穴（示さず）を有する。イントロデューサー５６は、バックシール５４を貫通する鋭い先端を有するあらゆる液状物送達装置としてよい。この実施形態においては、イントロデューサー５６はピペットチップである。他の実施形態においては、イントロデューサー５６はシリンジの針である。

ドームバルブ５０は、イントロデューサー５６による容易な到達を可能とし、且つイントロデューサー５６の先端がバックシール５４を経てドームバルブ５０に進入するにつれて先端に適合する。イントロデューサー５６を抜去すると、バックシール５４の開口部はその後自然に閉鎖し、サンプルがドームバルブ５０よりインキュベーションチャンバー１０の外に漏出することを阻止する。したがって、ドームバルブ５０は刺入可能な隔壁としても逆止弁としても作動する。ドームバルブは、支持構造５８を経てマイクロアレイアセンブリに設置してもよい。１つの実施形態においては、ドームバルブは入口１１および入口導管１４を経てインキュベーションチャンバー１０と接続される（図３）。

さらに他の実施形態では、マイクロアレイシステムはさらに廃液チャンバーを含む。Ａｕｒｏｒａ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｐｏｒｔ Ａｒｒａｙ ５０００（TM）マイクロアレイリーダーなどの多くの光学リーダーは、乾燥画像を読む際に改善された信号雑音比をもたらす。したがって、廃液チャンバーをマイクロアレイシステムに組み入れ、マイクロアレイリーダー内にマイクロアレイを載置する前にインキュベーションチャンバーより液状物を除去することは有益である。次に図３を参照すると、インキュベーションチャンバー１０は同一のマイクロアレイスライド上に形成された廃液チャンバー６０に接続される。

廃液チャンバー６０はあらゆる形状とすることができ、且つ典型的にはインキュベーションチャンバー１０の容積を上回る容積を有する。１つの実施形態においては、廃液チャンバーはガスケットテープ内に形成された後、その上にマイクロアレイ２０がプリントされる基板３０（図１参照）に着接される。さらに他の実施形態では、基板３０はその上面に１つの打ち抜きを有する。打ち抜きは、廃液チャンバー６０が一旦基板３０とガスケット３４の間に形成されたならばインキュベーションチャンバー１０の深さを上回る深さを有するよう、ガスケット３４内の廃液チャンバー６０のサイズおよび位置と適合するサイズおよび位置を有する。他の実施形態においては、基板３０上で打ち抜きが容易に作製されるよう基板３０はプラスチック材料で製作される。さらに他の実施形態では、インキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０はいずれもガスケット３４を用いずに基板３０に形成される。しかし廃液チャンバー６０は、インキュベーションチャンバー１０の深さを上回る深さを有してもよい。

１つの実施形態においては、廃液チャンバー６０は、一旦インキュベーションチャンバー１０内で液状物と接触したならば、液状物をインキュベーションチャンバー１０より吸上するため、マイクロアレイ２０が乾燥状態で読み取られることを可能とする吸収剤６２を収容する。

吸収剤６２は、比較的大量の液状物を保持することのできるあらゆる物質とすることができる。１つの実施形態においては、吸収剤６２は繊維の凝集体より製作される。他の実施形態においては、吸収剤６２はスルーエアーボンディング（through-air bonding process）工程において製造される不織布である。不織布の構成繊維は親水性合成繊維、パルプなどの天然セルロース繊維、または再生セルロース繊維とすることができる。繊維は界面活性剤または親水性の油でコーティングまたは浸潤して液状物の吸収を向上させてもよい。本明細書における使用を目的とした不織布は、スルーエアーボンディング工程に限らず、スパンボンディング（spun-bonding process）工程、エアーレイング（air laying process）工程、スパンレーシング（spun-lacing process）工程などの他のあらゆる工程で製造されることがある。１つの実施形態においては、吸収剤６２はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社（マサチューセッツ州ビレリア）製のセルロース紙（Ｃ０４８）である。

再度図３を参照すると、廃液チャンバー６０は導管１２を経てインキュベーションチャンバー１０に接続される。導管１２は二重の目的を果たす。液状物で満たされると、導管１２はインキュベーションチャンバー１０と廃液チャンバー６０の間の液状物経路を提供する。空気で満たされると、導管１２はインキュベーションチャンバー１０を廃液チャンバー６０より分離し、廃液チャンバー６０内の吸収剤６２の早すぎる吸上を防止する。

インキュベーションチャンバー１０内の液状物は、インキュベーションチャンバー１０内の液状物を導管１２内に押出、および導管１２内の液状物と廃液チャンバー６０内の吸収剤６２の接触を確立することによって除去される。接触は、インキュベーションチャンバー１０内の液状物に圧力を印加して液状物を導管１２より押出するか、または廃液チャンバー６０のベント６４に吸引を適用して導管１２より液状物を引出して確立してもよい。インキュベーションチャンバー１０内の液状物に対する圧力は、ドームバルブ５０を経て圧力を印加することによって生成してもよい（例：ピペットまたはシリンジを使用）。インキュベーションチャンバー１０が親水性テープまたは親水性フィルのみで被覆される場合、インキュベーションチャンバー１０の内部の圧力はインキュベーションチャンバー１０の上面を形成する親水性テープまたはフィルムを単純に押圧することによって生成してもよい。代替的に、導管１２内の液状物と吸収剤６２の間の接触は、吸収剤６２が導管１２の内の液状物に接触するまで吸収剤６２を導管１２に進入させることによって確立してもよい。

一旦接触が確立されたならば、インキュベーションチャンバー１０内の液状物を、導管１２を経て廃液チャンバー６０内の吸収剤６２に吸引する。液状物の流量は導管１２のサイズ、液状物の表面張力および粘度、および吸収剤６２の吸上率によって決定される。さらに、吸収剤がより飽和するにつれて流量が低下する。廃液チャンバー６０内に吸収剤６２を載置することによっても流量を調節することができる。導管１２の出口の近くに載置された吸収剤は、さらに離れて載置された吸収剤よりも高い流量をもたらす。したがって、吸収剤６２の隅を切除することにより、導管１２の出口と吸収剤６２の距離が延長することよって流量が遅くなる。

気泡がインキュベーションチャンバー１０に導入された場合、気泡はインキュベーションチャンバーに滞留し、導管１２への液状物の流入を部分的または完全に遮断することがある。気泡がまさに液状物と吸収剤６２の接触部分に位置する場合、気泡が吸収剤の吸上作用を停止させることもある。この問題は図４に示す導管設計によって克服することができる。この実施形態において、導管１２は入口部分１５、漏斗型接続部分１６および出口部分１７を含む。出口部分１７は入口部分１５の口径よりも小さな口径を有する。より小さな口径は、出口部分１７において入口部分１５における毛細管圧よりも強い圧力をもたらす。圧力の差は出口部分１７に向かう液状物の移動に至る。実施中、すでに出口部分１７にある液状物は出口部分１７より押出され、さらに液状物と吸収剤６２の接触部分にあるエアポケットの周囲を通過する。漏斗型接続部分１６は、導管の毛細管作用による早すぎる吸上を防止するオーバーフロー領域を提供する。他の実施形態においては、出口部分１７は２つのサブセクション：より口径の大きな第１のセクション（図４のセクション１７の水平部分に対応）およびより小さな口径の第２のセクション（廃液チャンバー６０に入るセクション１７の垂直部分に対応）にさらに分割される。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における熱サイクルの変性段階などのように、インキュベーションチャンバー１０内のハイブリダイゼーションまたは増幅過程が加熱段階を含む場合、インキュベーションチャンバー１０内部の液状物は導管１２より押出され、さらにインキュベーションチャンバー１０内で上昇する圧力により吸収剤６２との早すぎる接触を形成する。これらの状況下において、意図的に導管１２内に空気を残し（インキュベーションチャンバー１０を充填する時）吸収剤６２による早すぎる吸上を防止することがある。代替的に、導管１２の内部に疎水性の栓を載置して吸収剤６２による早すぎる吸上を防止してもよい。１つの実施形態においては、疎水性の栓は疎水性の内面を有する導管セクションを含む。１つの実施形態においては、疎水性表面は未加工の導管表面をテフロン（登録商標）、シリコンまたはシランなどの疎水性物質で被覆または処理することによって形成される。他の実施形態においては、導管１２の内面は疎水性材料によって被覆され、且つ疎水性の栓は未加工の疎水性プラスチック材料を露出する非被覆面を有する導管１２のセクションを含む。

他の実施形態においては、吸上が適切な間隔で起こることを確保するためにインキュベーションチャンバー１０が複数の廃液チャンバー６２と接続される。

本明細書には、均一な充填を目的とした親水性インキュベーションチャンバー、サンプルの汚染を防止するための一方向バルブ、およびインキュベーションチャンバーより液状物を除去するための廃液チャンバーを有する統合マイクロアレイシステムも記載される。今度は図５を参照すると、統合マイクロアレイシステム１００の実施形態は基板３０上にプリントまたは形成されたマイクロアレイ２０、マイクロアレイ２０の周囲に形成された親水性インキュベーションチャンバー１０、導管（示さず）を経てインキュベーションチャンバー１０と流体的に連絡するドームバルブ５０、および導管１２を経てインキュベーションチャンバー１０と接続する廃液チャンバー６０を含む。吸収剤６２は、ベント６４を経て環境中に表出する廃液チャンバー６０に組み入れられる。透明な親水性カバー７０がインキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０の上面を形成する。１つの実施形態においては、ベント６４は単純に廃液チャンバー６０のカバーに穴を穿孔することによって形成される。

インキュベーションチャンバー１０および廃液チャンバー６０を親水性テープまたはフィルムで被覆することの利点の１つは、薄いフィルムまたはテープが圧力の下で変形できることである。したがって、インキュベーションチャンバー１０にわずかな変形を引き起こすことによりインキュベーションチャンバー内部の液状物に動きを引き起こすような、わずかな圧力を廃液チャンバーに印加することにより、インキュベーションチャンバー１０内の液状物を混合することが可能である。

（親水性テープでインキュベーションチャンバーを被覆することでチャンバーの完全な充填がもたらされた）
図６はマイクロアレイシステムの１つの実施形態の幾何学的配置を示す。円は充填入口１１であり、正方形はマイクロアレイインキュベーションチャンバー１０であり、且つ長い長方形は廃液チャンバーである。幅０．５ｍｍの導管１４が充填入口１１をマイクロアレイインキュベーションチャンバー１０に接続し、２．０ｍｍ導管１２がマイクロアレイインキュベーションチャンバー１０を廃液チャンバー６０に接続し、且つ１．０ｍｍ導管６４がベント（排出口）の役割を果たし廃液チャンバー６０を外部に接続する。マイクロアレイインキュベーションチャンバー１０は１０ｍｍ×１０ｍｍのサイズを有する。厚さ０．２５ｍｍを有する内側のガスケットテープ（３Ｍ社より入手可能、Ｐａｒｔ Ｎｏ．９０８７）はレーザー切断されて上述の幾何学配置を有するガスケットを形成した。ガスケットは、ゲルスポットプリント工程で用いられるスライドと同様の接触角で疎水性表面上に載置された。ガスケットの上面は親水性テープ（ＡＲ９０１２８）で密封されて親水性表面を提供した。３０μＬの水が気泡またはエアポケットを残すことなく均一にチャンバーに充填された。３０μＬのハイブリダイゼーションバッファー（３Ｍチオシアン酸グアニジン、１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、および１５ｍＭ ＥＤＴＡ）も気泡を伴わずにチャンバー内に均一に充填された。疎水性テープ（ＡＲ８１９２）を用いた同様の試験では、非均一的な充填によりマイクロアレイチャンバー内にエアポケットが残った。

この実験により、チャンバーの親水性表面によって液状物の表面張力が克服され、且つ正方形の隅を含むチャンバーの完全な充填が可能となることが証明された。典型的には正方形の隅は液状物がチャンバーを満たすにつれてエアポケットを捕捉するので、この結果は驚くべきものである。

（廃液チャンバーの吸上効率の評価）
図７Ａは４つの試験マイクロアレイスライドを示し、それぞれが吸収剤を収容する廃液チャンバーと接続する親水性インキュベーションチャンバーを有する。廃液チャンバーは環境中に表出していた。チャンバーはマイクロアレイ支持スライドの上部にガスケット（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂ社より提供された両面テープをレーザーカットする）を載置することにより形成された。インキュベーションチャンバー内の親水性表面は、インキュベーションチャンバーの空隙を親水性テープ（ＡＲ９０４６９）で被覆することによって生成された。吸収剤はミリポア社製であった（Ｃ０４８）。Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓに由来する増幅生成物、ハイブリダイゼーションマーカー、ＢＳＡおよびハイブリダイゼーションバッファーを含有するサンプル９５μＬを９５℃で５分間変性させた後、入口よりインキュベーションチャンバーに導入した。次に入口をテープ（ＡＲ９０６９７）で密封した。スライドタワーを着接したＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅサーマルサイクラー内で反応物を５０℃で１時間インキュベートした。マイクロアレイスライドをタワーより取出し、室温で水１５０μＬにより洗浄した。水が入口よりインキュベーションチャンバーに付加されるにつれて、インキュベーションチャンバー内の液状物はインキュベーションチャンバーと廃液チャンバーを接続する導管を経て廃液チャンバー内に押出された。一旦インキュベーションチャンバー内の液状物と廃液チャンバー内の吸収剤の間で接続が確立されると、吸収剤はインキュベーションチャンバーより液状物（洗浄容積を含む）を吸上することができた。次に、マイクロアレイスライドを９５℃で２０分間加熱し、インキュベーションチャンバーを完全に乾燥させた。マイクロアレイは、装置に一切操作を行わずにＡｕｒｏｒａ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｐｏｒｔ Ａｒｒａｙ ５０００（TM）上で撮影した。画像はインキュベーションチャンバーを被覆する親水性テープ越しに撮影した。

図７Ｂは、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥段階後のマイクロアレイの例の画像を示す。生成物スポットは暗黒色の点として示される。コントロールスポットはＣｙ３スポットおよびハイブリダイゼーションマーカーを含む。各アレイは４つのサブアレイの複製であるので、４組のＹｐ生成物スポットである。全ての試験スライドで均一なハイブリダイゼーションが達成された。

（ドームバルブ、親水性インキュベーションチャンバーおよび廃液チャンバーを含むマイクロアレイシステム）
図８Ａは、親水性テープで被覆されたインキュベーションチャンバー、吸収剤が組み込まれた廃液チャンバー、およびインキュベーションチャンバーと接続されたドームバルブを有する統合マイクロアレイシステムの１つの実施形態を示す。ハイブリダイゼーションマスター混合物およびＹｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ生成物からなるサンプル９５μＬを、９５℃で５分間変性させ、Ｒａｍｉｎｉｎ Ｐ２００μＬピペッターによりドームバルブを経てインキュベーションチャンバー内に導入した。サンプルは、気泡またはエアポケットを残すことなくマイクロアレイチャンバーに均一に流入した。インキュベーションチャンバーを、スライドタワーを着接したＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅサーモサイクラー上で、流動セル装置に一切変更を加えることなく、５０℃で６０分間加熱した。マイクロアレイスライドをスライドタワーより取出し、水１５０μＬで洗浄した。水がインキュベーションチャンバー内に導入されるにつれて、インキュベーションチャンバー内のハイブリダイゼーション混合物は廃液チャンバーに押出され、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃ０４８吸収剤がインキュベーションチャンバーより液状物の全容量を吸上した。次に、マイクロアレイスライドを９５℃で２０分間加熱し、インキュベーションチャンバーを完全に乾燥させた。マイクロアレイは、装置に一切操作を行わずにＡｕｒｏｒａ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｐｏｒｔ Ａｒｒａｙ ５０００（TM）上で撮影した。画像は、インキュベーションチャンバーを被覆する親水性テープ越しに撮影した。

図８Ｂは、ハイブリダイゼーション、洗浄および乾燥段階後の代表的なマイクロアレイの画像を示す。生成物スポットは暗黒色の点として示される。コントロールスポットはＣｙ３スポットおよびハイブリダイゼーションマーカーを含む。各アレイは４つのサブアレイの複製であるので、４組のＹｐ生成物スポットである。図８Ｂに示すように、全てのサブアレイにおいて均一なハイブリダイゼーションが達成された。

（親水性インキュベーションチャンバーおよび廃液チャンバーを含むマイクロアレイシステム）
図９Ａは親水性チャンバー１０および廃液チャンバー６０を有するマイクロアレイシステムの他の実施形態を示す。２つのチャンバーは入口セクション１５を有する導管１２、漏斗型の接続セクション１６、大口径出口セクション１７_１および小口径出口セクション１７_２によって接続される。液状サンプルを、入口１１および導管１４を経てインキュベーションチャンバー１０に付加する。

図９Ａに示すマイクロアレイシステムは、両面テープよりレーザーカットされたガスケット（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いて、ガラススライド上に構築された。廃液チャンバー６０は濾紙吸収剤（ＣＦ４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を収容し、且つ環境中に表出した。生成したマイクロアレイアセンブリは、Ｌｅｘａｎ ＨＰＦＡＦ（０．００７’’／１７５μｍ）曇り止めテープ（ＧＥ Ｐｌａｓｔｉｃｓ社）によって被覆した。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎａｓｅに由来する増幅生成物、ハイブリダイゼーションマーカー（陽性対照）、ＢＳＡおよびハイブリダイゼーションバッファーを含有するサンプル２０μＬを９５℃で５分間変性させ、さらにＲａｉｎｉｎ Ｐ２００μＬピペッターにより入口を経てインキュベーションチャンバー１０に導入した。入口ポート１１をテープで密封し、スライドタワーを着接したＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ−２００ ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅサーマルサイクラー内でスライド全体を５５℃で３０分間インキュベートした。スライドをタワーより取出し、室温で水１５０μＬにより洗浄した。アレイはＡｕｒｏｒａ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｐｏｒｔ Ａｒｒａｙ ５０００（TM）マイクロアレイリーダー上で撮影した（露出時間２秒）。図９Ｂはハイブリダイゼーションの結果を示す。図９Ｃはアレイスポットの配置を示すチップマップである。図９Ｂに示すように、ハイブリダイゼーション対照およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ特異性プローブより強い陽性の結果が得られた。

（ワンステップタンパク質マイクロアレイシステム）
図５および図９に示された実施形態の１つのようなワンステップ統合タンパク質マイクロアレイシステムは、捕捉抗体を含有するゲルドロップ部材を用いて構築される。捕捉抗体は、生物兵器剤（ＢＷＡ）パネルと特異的に結合する抗体である。各ゲルスポットは特定の１種類のＢＷＡと結合する１種類の抗体を含有する。金コロイド標識された二次抗体群を入口導管付近に載置する。二次抗体は同一パネルのＢＷＡを認識する。液状サンプルを入口導管よりインキュベーションチャンバーに装填すると、サンプルがインキュベーションチャンバーに進入するにつれて金コロイド標識二次抗体がサンプルと混合する。目的のＢＷＡは、インキュベーション中にアレイゲルスポット中の抗体によって捕捉され、さらに二次抗体が捕捉されたＢＷＡと結合する。インキュベーション時間の後に未結合の二次抗体を洗流する。二次抗体はゲルスポットに捕捉されたＢＷＡと結合し、さらにマイクロアレイにおいて陽性シグナルを生成する。

本明細書で用いるところの用語「抗体」は可能な限り最も広い意味で用いられ、抗体、組換え抗体、遺伝子改変抗体、キメラ抗体、単一特異性抗体、二重特異性抗体、多重性抗体、二特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、異種抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ラクダ化抗体、脱免疫抗体、抗イディオタイプ抗体、および／または抗体フラグメントを含むことがあるが、これに限定されない。用語「抗体」は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ等の抗体の種類、および／またはサブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１および／またはＩｇＡ２を含むことがあるが、これに限定されない。用語「抗体」は、たとえば抗体結合可変領域などの無傷な抗体の少なくとも一部などのような抗体のフラグメントも含むことがあるが、これに限定されない。抗体フラグメントの例はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖフラグメント、二特異性抗体、線形抗体、短鎖抗体分子、多重特異性抗体、および／またはある抗体のその他の抗原結合配列を含む。追加的な情報は、参照文献として本明細書に組み入れられた米国特許第５，６４１，８７０号、米国特許第４，８１６，５６７号、国際公開第ＷＯ９３／１１１６１号、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ他Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ：ｓｍａｌｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，ＰＮＡＳ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）、Ｚａｐａｔａ他Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｌｉｎｅａｒ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）に認められることもある。

（ツーステップタンパク質マイクロアレイシステム）
図５および図９に示された実施形態の１つのようなツーステップ統合タンパク質マイクロアレイシステムは、抗体を含有するゲルドロップ部材を用いて構築される。各ゲルスポットは特定の目標物と結合する１種類の抗体を含有する。サンプルをインキュベーションチャンバーに導入し、固定された長さの時間チャンバー内でインキュベートする。洗浄バッファーを付加して未結合のサンプルを除去する。洗浄バッファーが廃液バッファーに吸上されるので、インキュベーションチャンバー内の液状物が全て除去される。次の段階では、１つまたは複数の二次抗体をインキュベーションチャンバーに付加し、さらに固定された長さの時間インキュベートする。インキュベーション時間の後に未結合の二次抗体を洗流する。ゲルスポットに捕捉された目標物と結合した二次抗体は、マイクロアレイにおいて陽性シグナルを生成する。

この実施形態においては、インキュベーションチャンバーを廃液チャンバーと接続する導管内に気泡が１個残り、インキュベーションチャンバー内の液状物を廃液と分離し、且つ早すぎる吸上を防止した。インキュベーションチャンバーに追加的な洗浄容積を付加すると、未結合の抗体はインキュベーションチャンバーより押出され、廃液チャンバーに吸上される。複数の廃液チャンバーにより、確実に適切な間隔で吸上が発生する。

本明細書で用いた用語および記述は例示のみを目的として説明され、制限としては意図されていない。当業者は、特に示さない限り全ての用語がその可能な限り最も広い意味において理解されるべき以下の請求項、またはその相当記載で定義するように、本発明の趣旨および範囲内で多くの変法が可能であることを認識するであろう。

Claims (33)

1. マイクロアレイシステムであって：
   平面基板上に形成されたマイクロアレイ、および
   前記マイクロアレイの周囲に形成されたインキュベーションチャンバーを含み、
   前記インキュベーションチャンバーがその上に前記マイクロアレイが形成される底面および前記マイクロアレイと対面する上面を含む複数の内面を含み、且つ
   前記複数の内面のうち少なくとも１つが親水性の表面である、前記マイクロアレイシステム。
2. 前記親水性の表面が前記上面である、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
3. 前記親水性の表面が前記上面を親水性コーティングで被覆することにより形成される、請求項２に記載のマイクロアレイシステム。
4. 前記インキュベーションチャンバーが前記マイクロアレイの周囲にガスケットを載置し且つ前記ガスケットを親水性テープまたは親水性フィルムで被覆することによって形成される、請求項２に記載のマイクロアレイシステム。
5. 前記親水性のテープまたは親水性のフィルムが透明である、請求項４に記載のマイクロアレイシステム。
6. 請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記平面基板を被覆するカバースリップをさらに含み、前記マイクロアレイが前記平面基板上の陥凹領域に形成され且つ前記インキュベーションチャンバーが前記カバースリップと前記平面基板上の前記陥凹領域の間に形成される、前記マイクロアレイシステム。
7. 請求項１に記載のマイクロアレイシステムであって、前記平面基板を被覆するカバースリップをさらに含み、前記カバースリップが陥凹領域を有し、前記陥凹領域が前記マイクロアレイよりも大きく且つ前記マイクロアレイの上部に位置し、且つ前記インキュベーションチャンバーが前記マイクロアレイと前記カバースリップ上の前記陥凹領域の間に形成される、前記マイクロアレイシステム。
8. 前記親水性の表面が細胞膜を溶解する浸漬された化学物質を含む、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
9. 前記親水性の表面が溶解した細胞に由来する核酸を保持する親水性マトリクスを含む、請求項８に記載のマイクロアレイシステム。
10. 前記親水性の表面が前記上面である、請求項８に記載のマイクロアレイシステム。
11. 前記親水性の表面が前記底面である、請求項８に記載のマイクロアレイシステム。
12. 前記親水性の表面が前記底面である、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
13. 前記インキュベーションチャンバーに液状サンプルを装填するための一方向バルブをさらに含む、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
14. 前記一方向バルブが逆止弁である、請求項１３に記載のマイクロアレイシステム。
15. 前記一方向バルブがドームバルブである、請求項１３に記載のマイクロアレイシステム。
16. 前記一方向バルブが第１の導管を経て前記インキュベーションチャンバーに接続される、請求項１３に記載のマイクロアレイシステム。
17. 廃液チャンバーをさらに含む、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
18. 前記廃液チャンバーが前記インキュベーションチャンバーより液状物を吸上することのできる吸収剤を含む、請求項１７に記載のマイクロアレイシステム。
19. 前記吸収剤がセルロースを含む、請求項１８に記載のマイクロアレイシステム。
20. 前記廃液チャンバーが前記インキュベーションチャンバーの容積より大きな容積を有する、請求項１７に記載のマイクロアレイシステム。
21. 前記廃液チャンバーが第２の導管を経て前記インキュベーションチャンバーに接続される、請求項１７に記載のマイクロアレイシステム。
22. 前記廃液チャンバーが吸上率を調節することを目的として前記第２の導管から距離をおいて載置された吸収剤を含む、請求項２１に記載のマイクロアレイシステム。
23. 前記第２の導管が入口セクション、漏斗型接続セクション、および出口セクションを含み、前記入口セクションが前記出口セクションの口径よりも大きな口径を有する、請求項２１に記載のマイクロアレイシステム。
24. 前記廃液チャンバーがベンティング導管を経て環境中に表出する、請求項１７に記載のマイクロアレイシステム。
25. 前記基板がガラスである、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
26. 前記基板がプラスチックである、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
27. 前記マイクロアレイがオリゴヌクレオチドアレイである、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
28. 前記マイクロアレイがタンパク質アレイである、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
29. 前記タンパク質アレイが抗体アレイである、請求項２８に記載のマイクロアレイシステム。
30. 前記マイクロアレイがゲルスポットプリント法によって形成される、請求項１に記載のマイクロアレイシステム。
31. マイクロアレイシステムであって：
    平面基板上に形成されたマイクロアレイ；
    インキュベーションチャンバーが前記マイクロアレイを囲繞する、前記インキュベーションチャンバー；
    液状サンプルを前記インキュベーションチャンバーに装填するためのドームバルブ；および
    前記一方向バルブを前記インキュベーションチャンバーと接続する導管を含む、前記マイクロアレイシステム。
32. マイクロアレイシステムであって：
    平面基板上に形成されたマイクロアレイ、
    インキュベーションチャンバーが前記マイクロアレイを囲繞する、前記インキュベーションチャンバー；
    吸収剤を収容する廃液チャンバー；および
    前記廃液チャンバーを前記インキュベーションチャンバーと接続する導管を含む、前記マイクロアレイシステム。
33. 前記インキュベーションチャンバーが親水性の内面を含む、請求項３２に記載のマイクロアレイシステム。

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