CN102667477B - 流通池装置 - Google Patents

Abstract

公开了微阵列系统。所述微阵列系统包括形成于平面基底上的微阵列和形成于微阵列周围的孵育室。所述孵育室具有多个内表面，包括在其上形成微阵列的下表面和面向下表面并通常平行于下表面的上表面。多个内表面中的至少一个是亲水性表面。

Description

流通池装置

相关申请

本申请是2008年5月9日提交的美国专利申请号12/149,865的部分继续申请，并要求2009年7月24日提交的美国临时申请号61/213,887的权益，通过引用将两个专利申请全文并入本文。

技术领域

技术领域涉及生物分子的检测，并且具体而言，涉及流通池装置，其具有含有靶标捕获表面的反应室、废物室以及将反应室与废物室连接的宽度可变的通道。

发明背景

微阵列通过同时进行多个检测反应为进行样品的综合分析提供了巨大潜能。通常，在平面基底如玻璃显微镜载片上形成多点反应物分子的微阵列，其通常是二维网格模式。然后将液体样品和试剂施加到载片上，以同时接触多个斑点。可以用微阵列中的结合分子进行各反应步骤，包括将结合的反应物分子暴露于液体样品和试剂以及洗涤步骤。为了表征固定于载片上的材料或液体样品中的材料，可以监测微阵列每个斑点处反应的进程或结果。

微阵列分析通常需要数分钟至数小时的孵育期。孵育期的持续是测定依赖性的，并由多种因素决定，如反应物类型、混合程度、样品体积、靶标拷贝数和阵列的密度。在孵育期，液体样品中的靶分子必须与微阵列探针充分接触。孵育通常在孵育室中进行。孵育室通常通过在微阵列周围形成衬垫(gasket)而形成。衬垫盖由盖片(cover slip)覆盖，从而形成封闭的室。盖片可以由透明材料如玻璃制成，从而允许孵育之后光查询微阵列。

如果盖片没有入口和排放口(vent)，则需要在将盖片放置在衬垫的顶部之前向孵育室添加液体样品和其它试剂。如果反应混合物被充满至衬垫的边缘，那么反应混合物可能从衬垫的侧面溢出，会损坏衬垫/盖密封并增加污染环境的风险。具有填充孔和排放孔的盖片避免了这两个问题。然而，通过盖片上的孔填充孵育室通常会有将气泡或气穴(air pocket)引入孵育室的风险。而且，液体样品或反应混合物的表面张力还可能阻止液体样品或反应混合物完全充满孵育室。如果气穴覆盖在阵列斑点上，并阻止阵列斑点与液体样品或反应混合物之间的接触，那么部分充满的室可能会导致假阴性。

发明概述

公开了用于检测靶分子的流通池装置(flow cell device)。所述流通池装置包括反应室(reaction chamber)、废物室(waste chamber)、进入口(inletport)、将反应室与进入口连接的第一通道以及将反应室与废物室连接的第二通道。所述反应室具有入口、出口、微阵列以及位于反应室顶部或底部中至少一个之上的亲水性区域。所述废物室具有吸收剂吸收剂，从而允许液体通过毛细管作用前进通过反应室，用于洗涤。

还公开了用于检测靶分子的装置。所述装置包括：反应室，所述反应室具有入口、出口、与靶分子特异性结合的靶标捕获表面以及位于反应室顶部或底部中至少一个之上的亲水性区域；废物室，所述废物室具有吸收剂，从而允许液体通过毛细管作用前进通过所述反应室，用于洗涤；以及将反应室与废物室连接的宽度可变的通道。

附图说明

详细描述将涉及以下附图，其中相似的数字表示相似的元件，并且其中：

图1是微阵列系统孵育室的一个实施方案的示意图。

图2是具有刺穿移液管吸头的支持壳体中的圆顶阀的示意图。

图3是具有废物室的微阵列系统的一个实施方案的示意图。

图4是具有废物室的微阵列系统的另一个实施方案的示意图。

图5是集成微阵列系统的一个实施方案。

图6是集成微阵列系统的另一个实施方案的示意图。

图7是展示集成微阵列组件的元件的示意图。

图8是展示图7组件的隔离胶带(spacer tape)的示意图。

图9是展示图7组件的顶部薄膜的示意图，其与图8中的隔离胶带的粘合剂连结。

图10是展示了考虑到厚吸收剂的隔离胶带的示意图。

图11是与图9和10的隔板中的穴(pocket)匹配的吸收剂。

图12是展示具有排放孔(vent hole)的废物室的盖子的示意图。

图13是展示在PCR-微阵列系统中进行样品分析的方法的流程图。

图14是展示在蛋白-微阵列系统中进行样品分析的方法的流程图。

图15A和15B展示了“条纹蛋白质阵列”以及适于容纳“条纹蛋白质阵列”的蛋白-微阵列系统的实施方案。

图16A是展示用于评价液体吸入废物室的四个微阵列孵育室组件的图。

图16B是展示利用图16A的微阵列孵育室组件产生的杂交结果的图。

图17A是展示集成微阵列系统的一个实施方案。

图17B是展示来自图17A的微阵列系统的杂交结果的图。

图18A是微阵列系统的一个实施方案的示意图。

图18B是展示来自图18A的微阵列系统的杂交结果的图。

图18C是图18A的微阵列系统的阵列图。

图19是展示芯片图、蛋白阵列系统以及实施例6的代表性阵列图像的综合图。

图20展示了纯化的300pg MRSA靶标的结果，所述靶标在具有玻璃基底的微阵列系统上扩增并随后进行洗涤和干燥步骤。

图21A是微阵列系统的反应室中所含的用于获得图20、22和23的结果的微阵列的MRSA芯片图，所述芯片图具有4个重复，以增加试验的可信度并评价象限的不均一性。

图21B展示了与芯片图相关的一列探针。同一靶标的探针在长度或序列上不同。探针序列9和29来自赋予新青霉素抗性的mecA基因。探针14和42来自所有葡萄球菌菌株中均存在的tufA基因。探针18、19、31和43来自tufA基因，但仅是金黄色葡萄球菌(S.aureus)特有的。探针35、36和37靶向于金黄色葡萄球菌与mecA盒的连接区。

图22展示了纯化的1ng MRSA靶标的结果，所述靶标在具有玻璃基底的微阵列系统上扩增并随后在液体中读取。

图23展示了在塑料基底上的纯化的300pg MRSA靶标而没有干燥步骤的结果。

图24是用化脓性链球菌(S.pyogenes)的10⁴个基因组拷贝激发的阵列在下述条件下倒置图像的综合图：图(a)，在管中扩增，在生物芯片上杂交，用移液管洗涤以及芯片上的干燥程序；图(b)在生物芯片上的PCR扩增，用移液管洗涤以及芯片上的干燥程序；图(c)在管中扩增，在FrameSeal的阵列上杂交，取下Frame Seal，在浴器中洗涤并风干。图(d)是与图像对应的阵列图。注意，杂交标志物仅在图(a)和(c)的图像上可见，因为图(b)的芯片上的amp在master mix中没有杂交标志物。

图25是在以下每种条件下比较信噪比的柱状图：1)管扩增和生物芯片上杂交，随后为吸取洗涤和芯片上的干燥方案，2)生物芯片扩增，随后吸取洗涤方案，以及3)管扩增，随后为Frame-Seal杂交，浴器中洗涤和风干。在每种情况下，扩增出化脓性链球菌的10⁴基因组拷贝。整体斑点强度减去两个靶标斑点和dN20无义斑点的局部背景用来计算所示的比值。利用Aurora PortArray 5000，获取曝光时间高达斑点刚好低于浸润时的持续时间的图像。

图26在以下每种条件下比较平均噪音(dN20)信号的柱状图：1)生物芯片扩增，随后通过移液管用75μL 1X SSPE和25μL水洗涤；2)生物芯片扩增，随后通过移液管用175μL 1X SSPE和25μL水洗涤；以及3)管中扩增，Frame-Seals中杂交并在微阵列浴器中洗涤阵列。对于生物芯片和Frame Seals，输入的样品是化脓性链球菌的10⁴个基因组拷贝。用Aurora Port阵列5000对生物芯片成像0.2秒。用Spotfinder鉴定dN20(无义探针)斑点，并将4个dN20斑点中每一个斑点的累积荧光强度减去局部背景的结果求平均值，并沿着误差棒进行绘制，所述误差棒代表最小值和最大值。dN20信号与洗涤效率成反比，因为dN20无义探针由于与标记靶标(如来自扩增反应的产物)的非特异结合而发荧光。

详细描述

意图结合附图来阅读本描述，附图应视为本发明完整书面描述的一部分。附图没有必要按比例绘制，并且本发明的某些部件可以以增大的比例或为了清楚和简要以略微示意的形式显示。在本描述中，相对术语如“前”、“后”、“上”、“下”、“顶”和“底”以及以上的派生词应被解释为指接下来所描述的或在所讨论的附图中所示的方向。这些相对术语是为了便于描述，并且通常并非意图要求具体的方向。涉及附着、连接等的术语如“连接的”和“附着的”是指其中结构直接或通过中间结构而间接固定于或附着于另一结构的联系，以及二者是活动或刚性附着或联系，除非文中明确描述并非如此。

本文所用的术语“靶标捕获表面”指与靶分子特异性结合的表面。靶标捕获表面可以是用诸如寡核苷酸探针、抗原或抗体的靶标捕获材料包被的表面。靶标捕获表面也可以是表现出对靶分子的特异亲和力的非包被的表面，如与核苷酸特异性结合的烧结的玻璃料表面。在某些实施方案中，靶标捕获表面含有微阵列。

本文所用的术语“微阵列”指所提供的用于结合目的配体的规则斑点阵列。微阵列由至少两个斑点构成。目的配体包括但不限于，核酸(例如，分子信标、适配体、锁核酸、肽核酸)、蛋白、肽、多糖、抗体、抗原、病毒和细菌。

本文所用的术语“亲水性表面”指将会与停留在该表面上的纯水滴形成60°或更小接触角的表面。本文所用的术语“疏水性表面”指将会与停留在该表面上的纯水滴形成大于60°的接触角的表面。可以用接触角测角仪测量接触角。

本文所用的术语“孵育室”指靶标捕获表面或微阵列周围的闭合空间。当用液体样品充满时，孵育室允许靶标捕获表面或微阵列淹没在液体样品中，以便液体样品中的靶分子能够保持与靶标捕获表面或微阵列探针的充分接触。

芯片上扩增在本文被定义为靶分子在含有微阵列的孵育室的溶液中发生对称或非对称式扩增的过程。

其它扩增方案在微阵列系统形式中是可能的，例如其中将一种引物或以相同或不同浓度比的多种引物固定于微阵列上，并在该阵列上进行完全或部分扩增。可以将与阵列上所固定的引物具有相同或不同序列的其它引物添加至溶液室中。可以在等温条件或利用DNA或RNA酶利用温度循环进行这些扩增方案。实例包括：引物延伸芯片法(APEX)、多元微阵列增强的PCR法(MME-PCR)、桥式扩增法、单核苷酸掺入法、滚环扩增法(RCA)、链置换扩增法(SDA)、环介导扩增法(LAMP)、转录介导的扩增法(TMA)、解链酶依赖性扩增法(HDA)、切口酶扩增反应(NEAR)、基于核酸序列的扩增法(NASBA)、扩增阻碍突变系统(ARMS)以及侵染技术。

可用于微阵列系统中的其它核酸反应包括连接、用核酸外切酶或核酸内切酶的限制酶消化、切口酶切割、杂交保护测定(HPA)或翻译。

如上文所指出的，液体样品或反应混合物的表面张力通常会阻止液体样品或反应混合物完全充满一个小空间，如微阵列系统的孵育室。表面张力是液体分子通过多种分子间作用力吸引的结果。在大量液体中，每个分子在各方向上被邻近的液体分子均等地牵引，导致净力为零。在液体的表面，分子被液体内较深的其它分子向内牵引，并且没有被邻近介质(可以是真空、空气或另一种液体)中的分子强烈吸引。因此，表面的所有分子都遭受向内的分子吸引力，其仅通过液体抵御压缩来平衡。这种向内的牵引趋向于缩小表面积，并且鉴于此，液体表面类似于拉伸的弹性膜。因此，液体将其本身积压在一起，直到其具有可能的最小表面积。最终结果就是液体可以在小空间内维持近球形的形状，并且不会充满角落，尤其是小空间的方角。将盖与微阵列表面隔离的典型的小间隙通常将液体压成圆柱形。

就流通池装置而言，充满孵育室的液体最可能是基于水的液体，如杂交缓冲液或洗涤缓冲液。基于水的液体的表面张力可以通过用亲水性材料包被孵育室内表面的至少一部分来克服。

本文所描述的是具有孵育室的流通池系统，所述孵育室含有靶标捕获表面和与进入室内的液体接触的亲水性表面。与进入室内的液体接触的亲水性表面的用途是允许完全充满孵育室。在某些实施方案中，亲水性表面形成孵育室的完整的上表面。在其它实施方案中，靶标捕获表面含有微阵列。

图1展示了孵育室的一个实施方案。在本实施方案中，孵育室10形成于微阵列20周围，微阵列20由印迹或形成于平面基底30的上表面32上的多个阵列斑点22组成。表面32也形成了孵育室10的下表面。孵育室10的顶部用盖片40覆盖。孵育室10可以为与平面基底30的维度匹配的任何大小或形状，平面基底30通常为玻璃或塑料载片。在某些实施方案中，平面基底30是可以卷起用于卷到卷生产的塑料薄膜。在一实施方案中，塑料薄膜是聚酯纤维。

在该实施方案中，孵育室10通过将衬垫34放置于平面基底30的顶部并用盖片40覆盖衬垫34来形成。在另一实施方案中，孵育室10通过在平面基底30中产生穴或凹陷区域(例如通过模制或蚀刻)，将微阵列20印迹在穴或凹陷区域的底部，并用盖片40覆盖穴或凹陷区域来形成。在另一实施方案中，穴或凹陷区域在盖片40上形成，然后将盖片40直接放置在平面基底30的顶部。

孵育室10形成于微阵列20周围，以便减小孵育室10中杂交或任何其它反应所需的液体体积。在一实施方案中，孵育室的足印为约0.1-10cm²，优选约0.25-2.5cm²，高度为约0.05-5mm，优选约0.1-1mm。在一实施方案中，孵育室总体积的范围为1-250μl。

取决于其形状，孵育室10可以具有数个内表面，包括在其上形成微阵列20的下表面，向下面向下表面并通常平行于下表面的上表面和一个或多个侧表面。为了确保均匀填充孵育室10，并非所有内表面都必须是亲水性的。在一实施方案中，只有孵育室10的上表面是亲水性的。在另一实施方案中，只有孵育室10的下表面是亲水性的。在另一实施方案中，上表面和下表面两者都是亲水性的。在另一实施方案中，孵育室的所有内表面都是亲水性的。

亲水性表面是吸引水的表面。亲水性表面通常含有带极性电荷且能够形成氢键的分子。在一实施方案中，平面基底30或盖片40由亲水性材料制成，并因此分别提供亲水性下表面或亲水性上表面。在另一实施方案中，孵育室10的上表面或下表面用不溶性亲水性材料包被。亲水性材料的实例包括但不限于，亲水性聚合物，如聚乙二醇、聚甲基丙烯酸羟乙酯、Bionite、聚(N-乙烯内酰胺)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(环氧乙烷)、聚(环氧丙烷)、聚丙烯酰胺、纤维素、甲基纤维素、聚酸酐、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯醚、烷基酚聚氧乙烯醚、复合多羟基单酯、油酸的聚氧乙烯酯、油酸的聚氧乙烯山梨醇酯和脂肪酸的山梨醇酯；无机亲水性材料，如无机氧化物、金、沸石和钻石样碳；以及表面活性剂，如TritonX-100、Tween、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵、烷基硫酸盐、十二烷基醚硫酸酯钠(SLES)、烷基苯磺酸钠、肥皂、脂肪酸盐、溴代十六烷基三甲胺(CTAB)a.k.a.十六烷基三甲基溴化铵、溴化烷基三甲铵盐、氯化十六烷基吡啶(CPC)、聚氧化乙烯牛脂胺(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)、十二烷基甜菜碱、十二烷基二甲基氧化胺、椰油酰胺丙基甜菜碱、coco ampho glycinate烷基聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(商业上称为Poloxamers或Poloxamines)、烷基聚葡糖苷、脂肪醇、椰油酰胺MEA、椰油酰胺TEA。表面活性剂可以与诸如聚亚安酯和环氧树脂的反应聚合物混合充当亲水性涂层。在另一实施方案中，孵育室10的上表面或下表面通过常压等离子体处理制成亲水性的。

可选地，孵育室的下表面或上表面可以用商购的亲水性胶带或薄膜覆盖。亲水性胶带的实例包括但不限于，Adhesives Research(AR)胶带90128、AR胶带90469、AR胶带90368、AR胶带90119、AR胶带92276和AR胶带90741(Adhesives Research，Inc.，Glen Rock，PA)。亲水性薄膜的实例包括但不限于，来自(Film Specialties Inc.，Hillsborough，NJ)的and薄膜和Lexan HPFAF(GE Plastics，Pittsfield，MA)。其它亲水性表面可从Surmodics，Inc.(Eden Prairie，MN)、Biocoat Inc.(Horsham，PA)、Advanced  Surface Technology(Billerica，MA)以及Hydromer，Inc.(Branchburg，NJ)获得。

在一实施方案中，亲水性胶带或薄膜具有足以允许光从孵育室顶部查询微阵列的透明度。在另一实施方案中，亲水性表面通过用亲水性涂层包被孵育室表面来产生。在另一实施方案中，亲水性表面通过用亲水性胶带或亲水性薄膜简单替代盖片40来产生。

在另一实施方案中，亲水性表面是浸渍有裂解细胞膜、使蛋白质变性和捕获核酸的化学品的亲水性基质。亲水性基质将行使两种功能，纯化样品和使样品均匀地吸入孵育室。在一实施方案中，亲水性基质是FTA纸(FTAWhatman，Florham Park，NJ)。将生物样品施加到纸上，并使样品中所含的细胞在纸上裂解。洗涤纸，从而去除任何非DNA材料(DNA保持缠于纸内)。然后洗脱DNA用于随后的微阵列分析。可选地，在没有洗脱步骤的情况下，可以原位扩增结合的DNA，用于微阵列检测。

FTA纸可以用作与阵列的相对面(即孵育室的上表面)。可选地，可以将微阵列印迹在FTA纸上，并且孵育室顶部的透明盖的载片将允许微阵列可视。在另一实施方案中，可以将PCR试剂引入孵育室，用于扩增FTA纸上的核酸样品。在该实施方案中，扩增将在孵育室10内进行。

微阵列20可以为任何类型的微阵列，包括但不限于寡核苷酸微阵列和蛋白质微阵列。在一实施方案中，微阵列20利用以下所述的印迹凝胶斑点法形成：例如，美国专利号5,741，700、5,770,721、5,981,734、6,656,725和美国专利申请号10/068,474、11/425,667和60/793，176，通过引用将上述所有专利全文并入本文。

在另一实施方案中，微阵列系统还含有用于将液体(例如，样品、具有靶标的PCR缓冲液、杂交缓冲液或洗涤缓冲液)引入孵育室10中的单向阀。通过单向阀将样品引入孵育室10中，从而防止环境污染，这在某些应用如生物战剂(biological warfare agent)的检测中是重大的事件。单向阀可以是放置在孵育室10进入口的止回阀或圆顶阀。各种大小的圆顶阀都是可以商购获得的(例如，从Minivalve International，Yellow Springs，OH)。在图2所示的一实施方案中，圆顶阀50含有两个组件：圆顶形的阀体52和背密封件(back seal)54。背密封件上有一个孔(未示出)，其允许导入件56刺穿背密封件54。导入件56可以是具有能刺穿背密封件54的尖末端的任何流体递送装置。在该实施方案中，导入件56是移液管吸头。在另一实施方案中，导入件56是注射器针头。

圆顶阀50便于与导入件56接近，并且当导入件56的末端通过背密封件54进入圆顶阀50时，与该末端相符。在导入件56收回后，背密封件54上的开口自发地关闭，从而防止样品从圆顶阀50溢出孵育室10。因此，圆顶阀50充当可刺破的隔膜和止回阀。可通过支持结构58将圆顶阀安装在微阵列组件。在一实施方案中，圆顶阀通过进入口11和入口通道14与孵育室10连接(图3)。

在另一实施方案中，微阵列系统还包括废物室。许多光读取器如Aurora Photonics PortArray 5000^TM微阵列读取器当读取干图像(dry image)时，能给出改善的信噪比。因此，在将微阵列置于微阵列读取器中之前，将废物室并入微阵列系统以从孵育室去除液体是有利的。现在参见图3，孵育室10与在同一微阵列载片上形成的废物室60连接。

废物室60可以为任何性状，并且其体积通常大于孵育室10的体积。在一实施方案中，废物室形成于衬垫胶带中，然后将衬垫胶带附着于在其上印迹微阵列20的基底30(参见图1)上。在另一实施方案中，基底30在其上表面具有剪切块(cut-out)。剪切块的大小和位置与衬垫34中的废物室60的大小和位置匹配，使得废物室60一旦在基底30和衬垫34之间形成，其所具有的深度就会比孵育室10的深度深。在另一实施方案中，基底30由塑性材料制成，使得易于在基底30上制作开孔。在另一实施方案中，孵育室10和废物室60均形成于基底30中，而没有使用衬垫34。然而，废物室60所具有的深度可以比孵育室10的深度深。

在一实施方案中，废物室60含有吸收剂62，吸收剂62一旦与孵育室10中的液体接触，就会从孵育室10芯吸走液体，因而允许微阵列20在干燥的状态下被读取。

62可以是能够保留相对大量的液体的任何材料。在一实施方案中，吸收剂62由纤维集料制成。在另一实施方案中，吸收剂62是在热风粘合法(through-air bonding process)中所产生的非织造布(nonwoven fabric)。非织造布的组成纤维可以是亲水性的合成纤维、纸浆的天然纤维素纤维等或再生的纤维素纤维。纤维可以用表面活性剂或亲水性油包被或浸透，从而提高液体吸收率。并非受限于热风粘合法，本文所用的非织造布可以在其它方法中产生，如纺粘法(spun-bonding process)、气流成网法(airlaying process)、水刺法(spun-lacing process)等。在一实施方案中，吸收剂62是来自Millipore(Billerica，MA)的纤维素纸(C048)。

再次参见图3，废物室60通过通道12与孵育室10连接。通道12具有双重目的。当充满液体时，通道12在孵育室10和废物室60之间提供流体通道。当充满空气时，通道12将孵育室10与废物室60隔离，并防止废物室60中的吸收剂62提前芯吸。

通过将孵育室10内的液体压入通道12并在通道12中的液体与废物室60中的吸收剂62之间建立接触来去除孵育室10内的液体。通过向孵育室10内的液体施加压力从而将液体推出通道12或通过在废物室60的排放口64处施加吸力从而将液体拉出通道12来建立接触。可以通过圆顶阀50施加压力来产生对孵育室10中液体的压力(例如，使用移液管或注射器)。如果孵育室10仅用亲水性胶带或亲水性薄膜覆盖，那么可以通过简单按压形成孵育室10上表面的亲水性胶带或薄膜来产生对孵育室10中液体的压力。可选地，可以通过向通道12推进吸收剂62直到吸收剂62接触通道12内的液体，来建立通道12中的液体与吸收剂62之间的接触。

一旦建立接触，孵育室10内的液体通过通道12被吸入废物室60中的吸收剂62。液体的流速由通道12的尺寸、液体的表面张力和粘度以及吸收剂62的芯吸速率决定。此外，流速随着吸收剂的饱和度增加而降低。还可以通过吸收剂62在废物室60的放置来控制流速。放置在通道12出口附近的吸收剂会比放置在更远处的吸收剂产生更高的流速。因此，切下吸收剂62的一角会导致流速减慢，这是因为通道12的出口与吸收剂62之间的距离增大了。

如果将气泡引入孵育室10，气泡可能停留在通道12中，并部分或完全堵塞通道12中的液体流动。如果气泡正好位于液体和吸收剂62的界面处，则气泡还可能阻止吸收剂62的芯吸作用。利用图4所示的通道设计可以克服这个问题。在该实施方案中，通道12包括三部分：入口部分15、漏斗形连接部分16和出口部分17。出口部分17的直径小于入口部分15的直径。较小的直径导致出口部分17的毛细管压力高于入口部分15的压力。压力差导致液体向出口部分17移动。在运行中，已经位于出口部分17处的液体被推出出口部分17，并在液体与吸收剂62截面处的气穴(air pocket)周围穿过。漏斗形连接部分16提供了溢出区，这防止了由于通道的毛细管作用而导致的提前芯吸。在另一实施方案中，出口部分17被进一步分成两个小部分，即直径较大的第一部分(对应于图4中部分17的水平部分)和直径较小的第二部分(对应于进入废物室60的部分17的竖直部分)。

如果孵育室10中的杂交或扩增过程涉及加热步骤，如聚合酶链式反应(PCR)中热循环的变性步骤，则孵育室10内的液体可被推出通道12，并由于孵育室10中的压力增加而提前与吸收剂62接触。在这些情况下，空气可能倾向于停留在通道12(当孵育室10被充满时)中，从而防止吸收剂62提前芯吸。可选地，可以将疏水性停止部件(stop)放置在通道12内，从而防止吸收剂62提前芯吸。在一实施方案中，疏水性停止部件包括具有疏水性内表面的通道部分。在一实施方案中，疏水性表面通过用诸如硅酮或硅烷的疏水性材料包被或处理天然通道表面来形成。在另一实施方案中，通道12的内表面用亲水性材料包被，并且疏水性停止部件包括一部分具有暴露天然疏水性塑性材料的非包被表面的通道12。

在另一实施方案中，孵育室10与多个废物室62连接，从而确保以适当的间隔发生芯吸。

本文还描述了集成微阵列系统，其具有用于均匀填充的亲水性孵育室、防止样品污染的单向阀以及用于从孵育室去除液体的废物室。现在参见图5，集成微阵列系统100的一个实施方案包括印迹或形成于基底30上的微阵列20、形成于微阵列20周围的亲水性孵育室10、与孵育室10通过通道(未示出)流体连通的圆顶阀50以及与孵育室10通过通道12连接的废物室60。吸收剂62被并入废物室60中，废物室60通过排放口64通向大气。透明的亲水性盖70形成孵育室10和废物室60的上表面。在一实施方案中，通过简单地在废物室60的盖中钻一个孔来产生排放口64。

用亲水性胶带或薄膜覆盖孵育室10和废物室60的一个优点在于薄膜或条带能够在压力下变形。因此，通过向废物室施加适度的压力就有可能混合孵育室10中的液体，所述适度的压力会导致孵育室10轻微变形，并因而导致孵育室10内的液体移动。

图6展示了微阵列系统100的另一实施方案，其含有反应室10、废物室60和洗涤缓冲液室80。所述室通过毛细管停止部件90彼此相通，毛细管停止部件90控制室间的液体流动。毛细管停止部件90可以含有一个或多个“阶梯”部分和/或一个或多个“Z字形”部分，从而控制液体流动。在该实施方案中，使用者首先通过入口91填充洗涤缓冲液室80并使其密封。接下来，使用者用样品通过入口92填充反应室10并使其密封。最后，使用者密封排放口93。然后将微阵列系统100放置于常规载片模块热循环仪(例如，Quanta Biotech，Thermofisher)上。热循环之后，取出微阵列系统100，并刺穿排放口93。刺穿排放口93之后，洗涤缓冲液前进通过反应室，并进入废物室，从而反应室以干燥状态结束，用于成像。废物室中的吸收剂62含有产物，并且当刺穿排放口93时防止了气雾化。在一实施方案中，可以使用多孔膜来确保没有气雾化存在。

在另一实施方案中，公开了用于检测靶分子的微阵列系统200。微阵列系统200包括反应室、废物室、进入口、将反应室与进入口连接的第一通道以及将反应室与废物室连接的第二通道。反应室有入口、出口、微阵列和亲水性区域，所述亲水性区域位于室的顶部和底部中的至少一处，从而允许液体样品被引入室内而不会有气泡。废物室具有吸收剂，从而允许液体通过毛细作用前进通过反应室，用于洗涤。

图7展示了微阵列系统200的一个实施方案。在该实施方案中，微阵列系统200含有层结构，所述层结构包括具有微阵列211的阵列基底210、反应室隔板220、亲水性盖230，以及废物室隔板240、吸收剂250和具有排放孔261的废物室盖260。在组装的微阵列系统中，反应室隔板220具有在阵列211周围形成反应室221的开口、连接通道222和223、进入孔(inlet hole)224以及废物室225。通道222将反应室221与进入孔224连接，通道223将反应室221与废物室225连接。

亲水性盖230覆盖在反应室221与连接通道222和223的顶部。亲水性盖230还含有与进入孔224和废物室225匹配的进入孔开口234和废物室开口235。废物室隔板240具有与亲水性盖230内的废物室开口235和隔板220内的废物室匹配的废物室开口245。吸收剂250的大小被定制成适合于废物室220中并用废物室盖260覆盖。进入孔开口224和234提供了通过进入口270进入反应室221的通道。

在一实施方案中，反应室221的侧壁是疏水性的，从而能够捕获反应期间的气泡。

在另一实施方案中，配置亲水性盖230，使得在反应室221出口227附近产生亲水性区域。在相关实施方案中，亲水性区域用亲水性凝胶成分产生。

在另一实施方案中，进入口270包括可刺穿的膜/胶带或圆顶阀，从而允许在不引起反应室221内的内容物从微阵列系统200释放出来的情况下发生洗涤。

在另一实施方案中，阵列基底是玻璃或塑料。在另一实施方案中，反应室隔板220是双面胶带。在一实施方案中，连接通道223具有“阶梯和Z字形”部分。如图8所示，通道223的“阶梯”部分具有多个在阵列室一侧增宽并且在废物室一侧逐渐变窄的子部分。这种“阶梯”设计防止提前芯吸。通道223的“Z字形”部分具有一系列通道宽度的突变和/或锐角。通道宽度的这些改变和锐角对于液体从反应室221向废物室225的前进再次提供了不利条件。在某些实施方案中，“锐角”指两条通道以小于135的角相交所形成的角。在其它实施方案中，通道223的“阶梯”部分的一个或多个子部分的壁用亲水性或疏水性涂层包被，以便导致两个邻近的子部分之间的亲水性的改变。在一实施方案中，通道223的邻近反应室221的“阶梯”部分的子部分用亲水性涂层或聚合物包被，而下一处子部分是非包被的或用疏水性涂层包被。这种亲水性改变会充当子部分之间的流体停止部件，从而防止提前芯吸。

本领域技术人员应当理解，微阵列系统200可以有多种变形。例如，反应室221或废物室225或两者都可以模制在塑料基底210中。

可以将样品纯化功能并入微阵列系统200。在一实施方案中，微阵列系统200的进入口270还包括样品纯化基质，从而从样品纯化或分离靶分子。可选地，微阵列系统200的反应室221还可以包括样品纯化基质，从而从样品纯化或分离靶分子。在一实施方案中，样品纯化基质是二氧化硅。

取决于靶分子，微阵列211可以是寡核苷酸阵列或蛋白质阵列。在一实施方案中，微阵列211是寡核苷酸阵列，并且所述微阵列系统200用于扩增和检测靶多核苷酸。

图8-12展示了微阵列系统200各组成部分的尺度。

图13是展示PCR阵列测试300的一个实施方案的流程图。简而言之，从样品分离总核酸(DNA和RNA)(模块(block)310)，将纯化的核酸与扩增混合物加载入微阵列系统200的阵列室，所述扩增混合物含有DNA聚合酶、dNTP和至少一对PCR引物(模块320)。在微阵列系统中进行PCR反应(模块330)。允许扩增产物与微阵列系统200内的微阵列杂交(模块340)，并在阵列读取器上读取杂交结果(350)。

样品可以是任何生物样品，如拭样、鼻咽抽出液或全血样品。可以利用本领域技术人员公知的技术分离总核酸。在一实施方案中，用可商购的核酸分离试剂或试剂盒如Qiagen试剂分离总核酸。在另一实施方案中，用Akonni Bio系统开发的样品制备装置分离总核酸。Akonni’s样品制备法的公认的一系列事件包括在裂解缓冲液中使样品变性；在样品制备装置上连续灌注裂解的样品；从样品制备装置洗涤和洗脱核酸。

将分离的核酸加载入微阵列系统200，并利用本领域技术人员公知的方法在芯片上扩增。在芯片上扩增之后，将微阵列系统200以所需的温度孵育一段时间(例如，50-65℃下10-60分钟)，从而允许扩增子与微阵列杂交。杂交后，洗涤微阵列系统200(例如，用水)，并在微阵列读取器(例如Akonni的便携式微阵列读取器)上成像。在一实施方案中在成像之前是干燥微阵列系统。在另一实施方案中，将丙酮引入孵育室和/或加热孵育室来完成干燥步骤。在另一实施方案中，分离核酸的扩增和扩增产物的标记发生于非对称的PCR master mix中，所述PCR master mix含有荧光标记的“反向”引物和非标记的“正向”引物，“反向”引物远远超过(例如，超过5-20倍)非标记的“正向”引物。该策略主要产生了在其5’末端具有单个标记物的单链靶标。

阵列测试300可以以多种变形进行。在一实施方案中，杂交后所扩增的产物保留在反应室中，在微阵列成像之前不用洗涤。在另一实施方案中，所扩增的产物保留在反应室中，并在杂交过程中实时成像阵列斑点，以便展现Khodakov et al.(Khodakov et a1.，2008，BioTechniques，44：241-248)所描述的生长曲线。在另一实施方案中，反应室维持多步测定如ELISA的一系列孵育和洗涤步骤。

在另一实施方案中，微阵列211是蛋白质阵列，且微阵列系统200用于检测蛋白质靶标。图14是展示蛋白质阵列测试400的一个实施方案的流程图。简而言之，从样品提取蛋白质(模块410)，将所提取的蛋白质加载入阵列室，并与微阵列系统200中的微阵列一起孵育(模块420)，洗涤微阵列(模块430)，并利用本领域技术人员公知的方法检测与微阵列结合的蛋白质靶标(模块440)。

在一实施方案中，在周期或连续振动下进行孵育步骤420，从而提高阵列成分与靶蛋白之间的相互作用。

在另一实施方案中，将提取的蛋白连续灌注在蛋白质阵列上。在另一实施方案中，蛋白质阵列成分以多条纹形式(蛋白带阵列)排列在狭长的通道中(图15A)，使得所提取的蛋白在孵育步骤中通过通道流通，从而增强阵列成分与靶蛋白之间的相互作用。图15B展示了微阵列系统的一个实施方案，其含有通过通道与废物室连接的样品储存池。将蛋白质阵列或蛋白带阵列印迹于通道内。将从样品提取的蛋白加载入储存池，并以连续方式流过蛋白质阵列，进入废物室。

优选地，通道为窄通道，所具有的通道高度的范围为100-2000μm，更优选200-500μm。多孔凝胶行列形成于流动通道上，使得样品能够通过或穿过多孔凝胶行列连续灌注。极窄通道内的连续灌注将在一个维度上提供快速扩散动力学，扰乱扩散界限层，并增加对流转移，从而增强阵列成分与靶蛋白之间的相互作用。可以以受压力和/或吸收剂控制的流速灌注较大体积，从而提高灵敏度。凝胶成分的3D特征还比标准2D Ab附着提供了更为适合的扩散动力学，因为它们刺入流动通道。具有3D半球形凝胶滴的足够窄的通道还能被设计成能够促进快速扩散动力学，已证实这可以快至秒(Rossier et al，Langmuir 2000)。在一实施方案中，凝胶行列具有范围为0.5nm至0.5μm的多孔性。

在窄通道设计中，隔离胶带必须较薄，并具有较低的背景荧光，从而防止照入通道。通道上的盖必须是亲水性的，并具有足够的强度，以便其不会向通道弯曲并损坏蛋白质阵列的凝胶条纹。

实施例

实施例1.用亲水性胶带覆盖孵育室导致该室完全充满

构建了图3所示的微阵列载片。载片长度为2.95英寸，宽度为0.75英寸。宽度为0.5mm的通道14将填充进入口11与微阵列孵育室10连接，2.0mm的通道12将微阵列孵育室10与废物室60连接，以及从废物室60至外侧的1.0mm的通道64用作排放口。微阵列孵育室10的大小为10mm x 10mm。厚度为0.25mm的内部垫片(从3M，Part No.9087购得)用激光切割，以形成具有上述几何形状的衬垫。将衬垫放置在一疏水性表面上，所述疏水性表面与凝胶斑点印迹过程所用的载片具有相似的接触角。衬垫的顶部用亲水性胶带(AR 90128)密封，从而提供亲水性表面。用30微升水均匀地填充室，而没有留有气泡或气穴。同样用30微升杂交缓冲液(3M硫氰酸胍、150mM HEPES pH 7.5和15mM EDTA)均匀填充室而没有气泡。用疏水性胶带(AR 8192)进行的相似测试由于不均匀地填充而在微阵列室内留有气穴。

该实验证实，室的亲水性表面克服了液体的表面张力，并允许室完全充满，包括直角边缘。该结果是出人意料的，因为当液体充满室时，方角通常会捕获气穴。

实施例2.对废物室芯吸效率的评价

图16A展示了四个测试微阵列载片，每个载片都具有与含有吸收剂的废物室连接的亲水性孵育室。废物室通向大气。通过将衬垫(从GraceBiolab所提供的双面胶带激光切割得到)放置于支持微阵列的载片的顶部来形成室。孵育室内的亲水性表面通过用亲水性胶带(AR 90469)覆盖孵育室空间来产生。吸收剂来自Millipore(C048)。将含有来自鼠疫巴斯德氏菌(Yersinia pestis)的扩增产物、杂交标志物、BSA和杂交缓冲液的95微升样品在95℃下变性5分钟，并通过进入口引入孵育室。然后用胶带(AR90697)密封进入口。反应在配备有载片台的MJ Research PTC-200DNA Engine热循环仪中，于50℃下孵育1小时。从所述台上取下微阵列载片，并在室温下用150μL水洗涤。当水通过进入口被加入孵育室时，孵育室内的液体通过孵育室与废物室的连接通道被推入废物室。一旦在孵育室内的液体和废物室内的吸收剂之间建立接触，则吸收剂就能够从孵育室吸出液体(包括洗涤体积)。然后，将微阵列载片于95℃加热20分钟，以完全干燥孵育室。在没有对Aurora Photonics Port阵列5000^TM进行任何操作的情况下，在所述装置上对微阵列成像。通过覆盖孵育室的亲水性胶带采集图像。

图16B展示了在杂交、洗涤和干燥步骤之后，实例微阵列的图像。产物斑点显示为深黑色的点。对照斑点包括Cy3斑点和杂交标志物。每个阵列是四组亚阵列的重复，因而有四组Yp产物斑点。在所有测试载片中均获得了均匀的杂交。

实施例3.含有圆顶阀、亲水性孵育室和废物室的微阵列系统

图17A展示了集成微阵列系统的一个实施方案，其具有用亲水性胶带覆盖的孵育室、具有并入的吸收剂的废物室以及与孵育室连接的圆顶阀。将由杂交master mix和鼠疫巴斯德氏菌产物组成的95微升样品于95℃下变性5分钟，并利用Rainin P200uL移液管通过圆顶阀引入孵育室中。样品均匀地流入微阵列室，而没有留有气泡或气穴。在没有对流通池装置进行任何改变的情况下，将孵育室在配备有载片台的MJResearch PTC-200DNA Engine热循环仪中，于50℃下加热60分钟。从所述载片台上取下微阵列载片，并用150μL水洗涤。当将水引入孵育室中时，孵育室内的杂交缓冲液被推出废物室，并且Millipore C048吸收剂从孵育室吸出所有液体体积。然后，将微阵列载片于95℃加热20分钟，以完全干燥孵育室。在没有对Aurora Photonics Port阵列5000^TM进行任何操作的情况下，在所述装置上对微阵列成像。通过覆盖孵育室的亲水性胶带采集图像。

图17B展示了在杂交、洗涤和干燥步骤之后，示例性微阵列的图像。产物斑点显示为深黑色的点。对照斑点包括Cy3斑点和杂交标志物。每个阵列是四组亚阵列的重复，因而有四组Yp产物斑点。如图8B所示，在所有亚阵列中均获得了均匀的杂交。

实施例4.含有亲水性孵育室和废物室的微阵列系统

图18A展示了微阵列系统的另一实施方案，其具有亲水性室10和废物室60。两个室通过通道12连接，通道12具有入口部分15、漏斗形连接部分16、大直径的出口部分171和小直径的出口部分172。将液体样品通过进入口11和通道14加入孵育室10。

利用从双面胶带(Grace Biolabs)激光切割的衬垫在载玻片上构建图18A所示的微阵列系统。废物室60含有滤纸吸收剂(CF4，Millipore)并通向大气。所产生的微阵列组件用Lexan HPFAF(0.007”/175μm)抗雾胶带(GE Plastics)覆盖。将含有来自化脓性链球菌(Streptococcus pyogenese)的扩增产物、杂交标志物(阳性对照)、BSA和杂交缓冲液的20微升(20μ1)样品于95℃下变性5分钟，并利用Rainin P200uL移液管通过进入口11引入孵育室10中。进入口11用胶带密封，并允许整个载片在配备有载片台的MJ Research PTC-200DNA Engine热循环仪中，于55℃下孵育30分钟。从所述台上取下微阵列载片，并在室温下用150μL水洗涤。在Aurora Photonics Port阵列5000^TM微阵列读取器上对阵列成像(2秒的曝光时间)。图18B展示了杂交结果。图18C是展示阵列斑点排列的芯片图。如图18B所示，从杂交对照和链球菌特异性探针获得了强阳性的结果。

实施例5.一步蛋白质微阵列系统

一步、集成蛋白质微阵列系统如图5和图18A所示实施方案之一，利用含有捕获抗体的凝胶滴成分构建。捕获抗体是与一组生物战剂(BWAs)特异结合的抗体。每个凝胶斑点含有与特定BWA结合的抗体。将一组胶体金标记的二抗放置于邻近入口通道的位置。二抗识别相同的BWA组。当通过入口通道将液体样品载入孵育室中时，当样品进入孵育室时，胶体金标记的二抗与样品混合。孵育期间，目的BWA被阵列凝胶斑点内的抗体捕获，并且二抗与所捕获的BWA结合。孵育一段时间后，将未结合的抗体洗掉。二抗与凝胶斑点上所捕获的BWA结合，并在微阵列中产生阳性信号。

本文所用的术语“抗体”以最广泛的可能含义使用，并且可以包括但不限于，抗体、重组抗体、基因工程抗体、嵌合抗体、单特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、双体抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、异种抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、骆驼化抗体(camelizedantibody)、去免疫化抗体、抗独特型抗体和/或抗体片段。术语“抗体”还可以包括但不限于，诸如IgA、IgD、IgE、IgG和/或IgM的抗体类型，和/或IgG1/IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和/或IgA2亚型。术语“抗体”还可以包括但不限于，诸如完整抗体的至少一部分的抗体片段，例如抗原结合可变区。抗体片段的实例包括Fv、Fab、Fab′、F(ab′)、F(ab′)₂、Fv片段、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子、多特异性抗体和/或抗体的其它抗原结合序列。其它信息可以参阅美国专利号5,641,870、美国专利号4,816,567、WO 93/11161、Holliger et al.，Diabodies：small bivalent andbispecific antibody fragments(双体抗体：小的二价和双特异性的抗体片段)，PNAS，90：6444-6448(1993)/Zapata et al.，Engineering linear F(ab′)2fragments for efficient production in Escherichia coli and enhancedantiproliferative activity(用于在大肠杆菌中有效生产和增强抗增殖活性的工程化线性F(ab′)2片段)，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)，通过引用将上述并入本文。

实施例6.多步蛋白质微阵列系统

利用含有抗体的凝胶滴成分构建多步、集成蛋白质微阵列系统。阵列的芯片图如图19(左上图)所示。印迹有凝胶滴的载玻片用含有1％BSA的PBS在室温下封闭1小时。DI水漂洗载片，并允许在无灰尘的环境下风干。然后用封闭的载玻片、从Adchem激光切割的256M胶带、亲水性Lexan薄膜和圆顶阀组装微阵列系统。图19展示了本实验中所用的微阵列载片的图。将大约20μl SEB(1ug/mL于具有0.05％Tween-20和1％BSA的PBS中)通过圆顶阀吸入微阵列系统中，并在室温下孵育60分钟。通过吸入20μl DI水(x2)来漂洗微阵列系统，随后用移液管抽气干燥。将具有0.05％Tween-20的30μl PBS(PBST)吸入微阵列系统，随后用移液管抽气干燥。将稀释于具有1％BSA的PBST中的20μl抗-SEB单克隆抗体吸入微阵列系统，并允许在室温下孵育30分钟。将20μl DI水(x2)吸入微阵列系统，并用移液管抽气干燥。将30μl PBST吸入微阵列系统，并用移液管抽气干燥。将以2μg/ml溶解于具有1％BSA的PBST中的20μl Alexa 568标记的抗小鼠抗体吸入微阵列系统，并允许在室温下孵育30分钟。将微阵列系统进行避光保护。将20μl DI水(x2)吸入微阵列系统。将100％乙醇吸入微阵列系统的孵育室，残余的乙醇被吸入吸收剂。然后，将微阵列系统于55℃加热10分钟。用Aurora PortArray 5000上的605nm滤波器，利用绿色激光(532nm)对微阵列系统成像。蛋白阵列的代表性图像如图19(右下图)所示。

在本实施方案中，气泡留在将孵育室与废物室连接的通道中，从而将孵育室内的液体与废物隔离，并防止提前芯吸。

实施例7.PCR-微阵列系统

在Akonni样品制备装置上或用消费者优选的样品制备试剂盒(例如Qiagen试剂)从高达1ml拭样、鼻咽抽出液或全血样品中分离总核酸(DNA和RNA)。Akonni的样品制备法的公认的一系列事件包括，在裂解缓冲液中使样品变性；在样品制备装置上连续灌注裂解的样品；洗涤；以及将核酸洗脱入约100μl的终体积。将洗脱的样品载入具有图8-12所示尺度的微阵列系统中。靶标扩增和标记发生于非对称的PCR master mix中，所述PCR master mix含有荧光标记的“反向”引物和非标记的“正向”引物，“反向”引物超过“正向”引物10倍。该策略主要产生了在其5’末端具有单个标记物的单链靶标。芯片上扩增后，将扩增子在微阵列系统组件中，在50-65℃下孵育30分钟。孵育后，用水灌注微阵列系统(所有废物均保留在微阵列系统内)。

图8展示了微阵列系统组件的进入孔。隔离胶带的进入孔的范围为2.0至4.0mm，而盖薄膜的孔的直径范围为0.8至1.2mm。直径差异允许将试剂通过毛细管作用抽入室内。如果这些直径相同，那么隔离胶带的疏水性壁对抽入样品的毛细管作用产生不利条件。此外，入口通道的通道宽度随着其接近反应室而增加。这种增加允许液体进入室内，而不会在进入室内时产生急转弯。急转弯需要前沿的接触线具有间断，这会阻止液体进入废物室。连接通道内所用的方角防止液体离开反应室。

反应室的角呈圆形，以适应高流速的填充，其中相对表面驱动的流动，粘性流动占优势。在这种条件下，角落易受气穴影响。此外，当反应完成并洗涤反应室时，使洗涤缓冲液吸入反应室。向后退的前面通常会在室内沿边缘留有残余液体，并逐渐减少边缘。因此，圆角减少了从室内去除所有液体所需的时间。

连接通道由两部分组成，“阶梯”淹没部分和“Z字形”部分。“阶梯”部分的通道尺寸可改变，以2.0mm开始，降至0.6mm，从而产生范围为45至135度的角。更具体而言，这些角为90度。Z字形部分也具有一系列90度转折的逐渐减小的通道宽度。这些转折再次为液体进前提供了不利条件。直径的减小随液体接近废物室而产生更高的毛细管压力。随液体接近废物室而渐增的毛细管张力使得流体通道内的气泡的影响最小。如果连接通道出口处的气泡与液体向后退的接触线具有相同的曲率半径，那么液体将不会前进。然而，如果气泡的曲率半径小于液体向后退的接触线的曲率半径，那么液体会继续流入废物室。因此，小的0.3mm的通道与废物室连接。0.2mm或更小的通道产生了一种其中液体围绕边缘积累和合并的状态。如果液体从通道的两侧合并，则液体前进并开始耗尽反应室。废物室内的吸收剂挤压连接通道，使得吸收剂与连接通道直接流体连通。

进入口粗为0.75mm，且内径为0.9至1.1mm，外径为6.35mm。该直径与P20和P100移液管吸头相符，而不会使该吸头与阵列基底接触，进而堵塞流动。具有硅氧烷粘合剂的箔圈(foil circle)或箔片(foil tab)与进入口连结。硅氧烷与诸如丙酮的溶剂相容，用于使微阵列系统干燥。箔可用移液管吸头刺穿。在反应室充满样品和PCR master mix之后，再应用箔圈或箔片。扩增后，将箔刺穿，从而允许洗涤反应室。吸收剂防止液体在洗涤步骤之后漏出微阵列系统组件。废物室远端的排放孔保持开放，从而允许引入液体而无需其它步骤。排放孔的一半暴露于废物室，另一半由衬垫覆盖。箔圈可以位于模切孔(kiss-cut hole)上，所述模切孔从释放衬垫(release liner)散出，并应用于进入口，或箔片可以位于微阵列系统组件上，同时释放衬垫位于箔片的一部分之上。在制造过程中，将箔片应用在微阵列系统组件的位置上，使得当移除释放衬垫时，箔片覆盖进入口。

实施例8：在具有玻璃基底的PCR-微阵列系统上对MRSA靶标的检测以及对干燥的孵育室成像

本实验的目的是，在微阵列系统组件中进行多元反应。来自ErieScientific的具有敷形涂层的载玻片(25x 75x 1mm)用作阵列基底。在如Rubina et al.(参见例如，Rubina，et al.2003，BioTechniques 34：1008-1022，以及Rubina，et al.，.2004.Anal.Biochem.325：92-106)，通过引用将其并入本文)所述的一步、UV-诱导的共聚合反应中，将寡核苷酸探针共价交联于多聚物骨架，而不是固体基底。

新青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(S.aureus)(MRSA)获自ATCC的培养物形式，化脓性链球菌(S. pyog)的培养物形式获自合作者，然后用Akonni’s TruTip(Cat No.300-10206)进行纯化。TruTip方案花费大约4分钟，由利用电子移液器对每一下述步骤进行5次上下循环来组成：结合、洗涤、干燥和洗脱。用NanoDrop 3300荧光分光光度计(Wilmington，DE)测定DNA的量。

图20展示了在图7-12所示的微阵列系统设计中的MRSA Chip(v4.0)上进行的MRSA核酸扩增。利用mecA、tufA-3b、SCCmec和M13的引物组以多元反应扩增300pg MRSA DNA。用Aurora Port阵列5000获取图像。阵列的芯片图如图21A和21B所示。微阵列系统组件在废物室内含有激光切割的滤纸吸收剂(Whatman 31ET CHR Cellulose ChromatographyPaper，0.5mm)。亲水性盖薄膜的顶部(疏水侧)在组装后用IPA清洁。mastermix制备如下：利用QiagenDNA聚合酶试剂盒(Qiagen，cat#201205)，并添加10％甲酰胺，为每个反应制备14μl含有MRSA 4-组引物(mecA、tufA-3b、SCCmec、M13)和1.0μl新青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)核酸的master mix(以15μl反应体积扩增300pg总DNA)。将14μl制备好的反应混合物加入微阵列系统。样品进入口用具有粘合底布的箔胶带片覆盖，废物室排放口保持开放。将所有载片放置于配备有载片台的MJ Research PTC-200DNA Engine热循环仪上，并按下述扩增参数进行扩增：86.5℃2分钟；86.5℃45秒、50℃1分30秒，35个循环；以及最后的步骤为65℃5分钟、85℃2分钟和40℃45分钟。扩增后，从载片台取下载片，然后将覆盖样品进入口的箔胶带刺穿，并用35μl 1X SSPE将阵列洗涤一次。然后用25μl水洗涤载片，随后为75μl100％丙酮。然后，将载片在为ThermoFisher 2001FSQ数字控制干浴器所设计的顾客加热块(custom heat block)上，于50℃干燥15分钟，并在PortArray 5000读取器上干燥读取。

实施例9：在具有玻璃基底的PCR-微阵列系统上对MRSA靶标的检测以及以液体成像

本实验的目的是在微阵列系统组件中进行多元反应。来自ErieScientific的具有敷形涂层的载玻片(25x 75x 1mm)用作阵列基底。在如Rubina et al.(同上)所述的一步、UV-诱导的共聚合反应中，将寡核苷酸探针共价交联于多聚物骨架，而不是固体基底。图22展示了在图7-12所示的微阵列系统设计中的MRSA Chip(v4.0)上进行的新青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)核酸扩增。利用mecA引物以单一反应扩增1毫微克MR A DNA。用GenePix 4000B获取图像。阵列的芯片图如图21A和21B所示。流通池在废物室内含有激光切割的滤纸吸收剂(Whatman 31ETCHR Cellulose Chromatography Paper，0.5mm)。亲水性盖薄膜的顶部(疏水侧)在组装后用IPA清洁。Master Mix制备如下：利用Qiagen DNA聚合酶试剂盒(Qiagen，cat#201205，http://www1.qiagen.com)，并添加10％甲酰胺，为每个反应制备11.7μl含有mecA引物和3.3μl新青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)核酸的master mix(以15μl反应体积扩增1ng总DNA)。将14μl制备好的反应混合物加入微阵列系统。样品进入口用具有粘合底布的箔胶带片覆盖，并将废物室排放口保持开放。将所有载片放置于配备有载片台的MJ Research PTC-200DNA Engine热循环仪上，并按下述扩增参数进行扩增：86.5℃2分钟；86.5℃45秒、50℃1分30秒，35个循环；以及最后的步骤为65℃5分钟、85℃2分钟和40℃45分钟。扩增后，从载片台取下载片，并用GenePix 4000B对残留有液体的阵列室进行成像。注意，气泡附着于隔离胶带的疏水壁而不是阵列的中心。

实施例10：在没有干燥步骤的情况下在具有塑料载片的PCR-微阵列系统上对MRSA靶标的检测

本实验的目的是在Akonni and GenePix成像仪上评价塑料载片。以25.4mm x 76.2mm x 1mm的模子模制塑料载片。在实验前，将凝胶成分直接印迹在塑料上，并进行UV交联。图23展示了在图10和14-18的微阵列系统设计中的MRSA Chip(v4.0)上进行的新青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)核酸扩增。利用mecA和tufA-3b引物以多元反应扩增300pg MRSA DNA。利用Akonni开发的原型读取器获取图像。阵列的芯片图如图21A和21B所示。微阵列系统在废物室内含有激光切割的滤纸吸收剂(Whatman 31ET CHR Cellulose Chromatography Paper，0.5mm)。亲水性盖薄膜的顶部(疏水侧)在组装后用IPA清洁。Master Mix制备如下：利用QiagenDNA聚合酶试剂盒(Qiagen，cat#201205)，并添加10％甲酰胺，为每个反应制备14μl含有mecA和tufA-3b引物和1.0μl新青霉素抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)核酸的master mix(以15μl反应体积扩增300pg总DNA)。将14μl制备好的反应混合物加入微阵列系统。样品进入口用具有粘合底布的箔胶带片覆盖，并将废物室排放口保持开放。将所有载片放置于配备有载片台的MJ Research PTC-200DNA Engine热循环仪上，并按下述扩增参数进行扩增：86.5℃2分钟；86.5℃45秒、50℃1分30秒，35个循环；以及最后的步骤为65℃5分钟、85℃2分钟和40℃45分钟。扩增后，从载片台取下载片，然后将覆盖样品进入口的箔胶带刺穿，并用35μl1X SSPE将阵列洗涤一次。然后，在没有干燥步骤下，在Akonni读取器上读取载片。

实施例11：在不同杂交条件下对靶DNA的检测

生物芯片组件：

如图7所示，生物芯片组件由微阵列基底、隔离胶带、亲水性顶膜、具有吸收剂的废物室、进入口和排放孔。微阵列基底是玻璃的(ErieScientific，Portsmouth，NH)或塑料的。塑料载片被制成25.4mm x 76.2mmx 1mm的尺寸。用坐标将寡核苷酸探针印迹在空载片上，一旦应用隔离胶带，则所述坐标就决定阵列置在生物芯片的反应室内的位置。印迹方法与Vasiliskov et al.(Biotechniques 1999)和Rubina et al.(Biotechniques2003)所描述的方法类似，由共聚合和印迹在载片上并用UV交联的寡核苷酸探针混合物组成。凝胶成分直径为150μm，中心与中心相距300μm。通过激光切割双面胶带来构建生物芯片，所述双面胶带具有入口通道、反应室、连接通道和废物室的剪切块(cutout)。顶部薄膜分别覆盖阵列室废物室。顶部薄膜是亲水性的，从而允许通过毛细管作用充满整个反应室。吸收剂(Whatman chromatography Paper)位于废物室中。顶部薄膜具有1mm的孔用作入口，以及1mm的孔用排放口，所述排放口位于废物室的远端。Frame-Seals(BioRad，Hercules，CA)作为对照反应室。在使用前至少1小时制备生物芯片组件和Frame-Seals。

样品制备和杂交：

利用实施例8中所描述的Akonni的TruTip制备MRSA DNA。对于在生物芯片中杂交：制备用于添加至生物芯片的由10μL杂交master mix(含有1.5M硫氰酸胍、75mM HEPES，pH 7.5、7.5mM EDTA、5mg/mLBSA和3.7fmol/uL杂交对照寡核苷酸)和5μL扩增产物组成的15μL反应体积。用激光切割成直径为6.35mm圆硅氧烷胶带覆盖样品进入口，并使废物室排放口保持开放。对于在Frame-Seals中的杂交：制备用于添加至Frame-Seal的由20μL杂交master mix和10μL MRSA扩增产物组成的30μL反应物。在这30μL中，将28μl添加至Frame-Seals，并用石蜡封口膜覆盖。将所有载片放置在配备有α单元载片台的MJ ResearchPTC-200DNA Engine热循环仪上，并于55℃下杂交3小时。如下述，在杂交方案之前，将生物芯片和Frame-Seal master mix溶液均于管中，在95℃下变性5分钟。这单独的变性步骤不是芯片上扩增方案的一部分，因为靶标可以在芯片上变性。如实施例8所述进行芯片上的PCR。

洗涤：

生物芯片：杂交或芯片上扩增之后，用体积范围为35至200μL的1X SSPE洗涤阵列。将生物芯片完全干燥，以与Aurora PortArray 5000兼容。发现材料与丙酮相容，这减少了加热干燥步骤的时间。因此，在一些情况下，洗涤步骤之后为向生物芯片吸入25μL水，然后吸入15μL或75μL丙酮。为了确保将丙酮从阵列室完全去除，将生物芯片倒置3分钟，从而允许残余的丙酮流入废物室。然后，将载片在为ThermoFisher2001FSQ数字控制加热器所设计的顾客加热块(custom heat block)上，于50℃干燥15分钟。干燥方法被称为“芯片上干燥方案”，因为芯片没有被拆卸，这与Frame-Seal方案相反，Frame-Seal方案需要在洗涤和通过空气流过暴露的阵列进行干燥之前取下Frame-Seal衬垫。

Frame-Seals：取下Frame-Seals，并在含有1X SSPE和0.01％TritonX-100的Telechem ArrayIt^TM Brand High Throughput Wash Station中将载片洗涤3分钟，用水漂洗，并用过滤的压缩空气干燥。

检测和分析：在Aurora PortArray 5000读取器、GenePix 4000B或Akonni’s内部读取器上读取阵列，GenePix 4000B或Akonni’s内部读取器利用倾斜角的激光发光技术和用于检测的CCD照相机。将来自每一读取器的Unbinned输出(12-比特、补偿＝0，增益＝1)存储成与TIFF，Revision 6.0标准相符的16-比特、灰度级、带标签的图像文件格式。利用来自TheInstitute for Genomic Research(Saeed et al.，Biotechniques，2003)的开放源码应用″Spotfinder″(Windows version 3.1.1，″Spotfinder3.1.1.exe″)分析.GIF图像。在Spotfinder内利用Otsu阈值算法(Liao et al.，Joumal ofInformationScience and Engineering，2001)进行图像分割，并将所有斑点的(中间)背景校正的累积强度与其它来源的统计资料、相关的质量指标(_relatd qualityindex)以及阵列位置指示(array location indicator)存储成标签限定的平面文件(.mev)格式。随后的数据分析用Microsoft Office Excel 2003ServicePack 3进行，其中将每个探针的重复斑点的平均累积强度与含有dN20无义寡核苷酸的斑点(用于由非特异杂交事件所引起的生物噪音的模型)的平均强度进行比较。

结果

图24-26比较了其中将凝胶成分寡阵列暴露于以下三种不同条件下的实验的结果：不严密地分为生物芯片中的杂交、液相扩增后生物芯片中的杂交以及Frame-Seal形式的杂交。没有提供Frame-Seal形式的芯片上PCR，因为这个方案需要在扩增后去除衬垫，这会引入污染风险，并且因而不能提供感兴趣的功效。按实验部分所描述的进行这个方案，对于芯片上扩增和生物芯片杂交，使用的洗涤缓冲液体积为175μL 1XSSPE、25μL水和15μL丙酮。扩增master mix不含杂交标志物，因而图24，B图中的杂交斑点不发荧光。

图25展示了每个条件重复三次的化脓性链球菌和葡萄球菌属(S.genus)的信噪比，误差棒代表最小和最大值。每个条件的起始基因组拷贝数为约10⁴。这个数据提示，生物芯片的芯片上扩增与管中扩增随后转移至生物芯片(如管中扩增随后转移至Frame-Seal)上的性能相当。本项研究中的误差棒较大，因为该方法要除以无义探针，无义探针由于洗涤方法的有效性而具有低信号。注意，洗涤方法应当能降低无义探针的信号强度，因为洗涤可从无义探针有效去除标记的引物或产物。因而，无义信号(分母)的较小改变会导致比值产生较大改变。如图26所示，比较了三种不同洗涤条件的无义信号的其它研究进一步证实强度的这种可变性。尽管所有三种条件都有可变性，但是有限的数据结果的确提示，在生物芯片上小体积的吸取洗涤方案与在浴器中的洗涤一样好，或比之更好。这些数据还提示，洗涤方案可以低至100μL，而不会丧失信噪比。实际上，其它的研究表明，体积可以低至35μL。这些低体积允许以实验室芯片(lab-on-a-chip)形式进行洗涤步骤，同时在芯片上含有所有试剂，并且因而如果不是消除也会降低污染风险。

本文所用的术语和描述仅是说明性的，并非意图限制。本领域技术人员应当意识到，很多改变都有可能落入以下权利要求书及其等同项所限定的本发明的实质和范围内，其中所有术语均应以最广泛可能的含义来理解，除非文中指出并非如此。

Claims (10)

1.用于检测靶分子的装置，包括：

反应室，所述反应室包括：

入口；

出口；

与所述靶分子特异性结合的靶标捕获表面；以及

位于所述反应室顶部和底部中至少一个之上的亲水性区域；

废物室，所述废物室具有吸收剂，从而允许液体通过毛细管作用前进通过所述反应室，用于洗涤；以及

将所述反应室与所述废物室连接的宽度可变的通道，其中所述通道包括两部分，在邻近所述反应室一端的第一部分和在邻近所述废物室一端的第二部分，其中所述第一部分的直径或横截面积大于所述第二部分的直径或横截面积。

2.如权利要求1所述的装置，其中所述靶标捕获表面含有微阵列。

3.如权利要求1所述的装置，其中所述第二部分还包括两个子部分：邻近所述第一部分的第一子部分和邻近所述废物室的第二子部分，其中所述第一子部分与所述第二子部分形成角度，且所述第一子部分的直径大于所述第二子部分的直径。

4.如权利要求1所述的装置，其中所述废物室包括排放口。

5.如权利要求1所述的装置，其中所述靶标捕获表面形成于所述反应室的底部，并且所述亲水性区域形成于所述反应室的顶部。

6.用于检测靶分子的流通池装置，包括：

反应室，所述反应室包括：

入口；

出口；

微阵列；以及

位于所述反应室顶部和底部中至少一个之上的亲水性区域；和出口通道，所述出口通道与所述反应室的所述出口流体连通，其中所述出口通道包括阶梯部分，所述阶梯部分所包括的子部分在所述反应室一侧较宽，并且远离所述反应室逐渐变窄。

7.如权利要求6所述的流通池装置，其中邻近所述反应室的子部分用亲水性涂层包被。

8.如权利要求6所述的流通池装置，其中所述出口通道包括Z字形部分，所述Z字形部分包括一个或多个锐角。

9.如权利要求6所述的流通池装置，还包括入口通道，所述入口通道包括多个直径可变的子部分。

10.如权利要求9所述的流通池装置，还包括通过所述入口通道与所述反应室流体连通的洗涤缓冲液室。