EP3256253A1 - Dispositif en papier pour le diagnostic génétique - Google Patents

Dispositif en papier pour le diagnostic génétique

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EP3256253A1
EP3256253A1 EP16705099.6A EP16705099A EP3256253A1 EP 3256253 A1 EP3256253 A1 EP 3256253A1 EP 16705099 A EP16705099 A EP 16705099A EP 3256253 A1 EP3256253 A1 EP 3256253A1
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EP
European Patent Office
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zone
porous substrate
primers
sample
seq
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16705099.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Laura MAGRO
Pierre Lafaye
Fabrice Monti
Patrick Tabeling
Jean-Claude Manuguerra
Jessica VANHOMWEGEN
Béatrice JACQUELIN
Anavaj SAKUNTHABHAI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Pasteur de Lille
Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris
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Filing date
Publication date
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Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut Pasteur de Lille, Ecole Superieure de Physique et Chimie Industrielles de Ville Paris filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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    • B01L2400/0406—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces capillary forces

Definitions

  • the invention relates to diagnostic devices by amplification of DNA. It applies, in particular, to the diagnosis of microorganisms, from a biological sample such as drops of blood, urine, saliva and sweat.
  • immunoassay which includes "enzyme immunoassay” and abbreviated enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), translated as "bound enzyme immunoadsorption assay"
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • bound enzyme immunoadsorption assay have been for the purpose of detecting the presence of an antibody or an antigen in a sample.
  • the formation and spatial localization of the antibody-antigen complex is detectable by several techniques: grafting of colored or fluorescent species, nanoparticles and enzymes, for example.
  • the signal characterizing the presence of the desired species can be detected in the eye or by spectroscopy.
  • This family includes dipstick, dipstick or lateral flow test (translated as "lateral flow test”) tests.
  • Point-of-Care tests are very suitable for field situations with little material available. But the diagnosis by immunological tests is limited to detect species involved in antibody-antigen complexes. For example, in the case of a microorganism, the detection is indirect: the immunological tests make it possible to detect the presence or absence of characteristic proteins or antibodies produced by the immunocompetent cells of the host infected with the microorganism (s). .
  • DNA amplification tests make it possible to recognize and multiply a specific DNA or RNA sequence.
  • the DNA amplification test is more direct: we recognize the genetic material of the desired species. But these tests require expensive equipment and know-how to be implemented. These tests do not allow for bedside tests, particularly in remote geographical areas. For all these reasons, these DNA amplification tests do not make it possible to quickly and inexpensively carry out diagnostics outside the laboratories.
  • the subject of the present invention is a diagnosis device by amplification of DNA, characterized in that it comprises:
  • a porous substrate comprising at least:
  • a sample deposition zone said sample comprising at least one target compound
  • a plurality of channels positioned in the thickness of said porous substrate
  • diagnostic zone comprising at least one reactive compound adapted to react with a said target compound
  • the reactive compounds of said device comprise at least primers, recombinases, polymerases and proteins fixing and maintaining the single-stranded DNA, said reactive compounds being arranged in the pores of said zones of said porous substrate.
  • said primers of the device are adapted to detect the presence of a pathogen by RT-RPA.
  • said pathogen is the Ebola virus.
  • at least one said reactive compound is arranged in or on said porous substrate in freeze-dried form.
  • said porous substrate of the device comprises a stack of at least two primary porous substrates, each said primary porous substrate comprising at least one element chosen from a channel, a channel part and a zone.
  • said stack of said primary porous substrates of the device is obtained by folding.
  • the device comprises at least one additional zone comprising at least one reactive compound of the diagnostic zone connected to the deposition zone of a vector fluid by a succession of at least one element chosen from a channel and a different zone of a sample deposit area.
  • a said compound of the device chosen from a reactive compound and a target compound is arranged in or on said porous substrate in freeze-dried form.
  • the device comprises at least one additional zone comprising at least one said reactive compound, and at least one target compound, connected to the deposition zone of a vector fluid by a succession of at least one element chosen from a channel and a different zone from a sample deposit area.
  • the device comprises means for locally conditioning the temperature of the sample deposition zone.
  • said porous substrate of the device comprises at least one sheet of paper.
  • said local temperature conditioning means of the device comprises a conductive electrical circuit facing said porous substrate.
  • the device comprises:
  • the impervious layer being positioned in an intermediate manner between the porous substrate and the support layer.
  • said conductive electrical circuit of the device is supported by a sheet of paper distinct from said porous substrate.
  • At least one channel of the device is delimited by regions of said porous substrate impregnated with solid wax.
  • At least one channel of the device is formed by a hydrophilic-hydrophobic contrast in the thickness of said porous substrate.
  • said local temperature conditioning means of the device is configured to set the temperature of at least one zone between 20 ° C and 120 ° C and preferably between 30 ° C and 40 ° C.
  • At least one said reactive compound of the device is adapted to change color in contact with a said target compound.
  • At least one said reactive compound of the device is adapted to emit a fluorescence signal in contact with a said target compound.
  • said reactive compounds of the device comprise at least one pair of said primers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-2; SEQ ID NO: 4-5; and SEQ ID NO: 7-8.
  • said reactive compounds of the device comprise at least one nucleotide probe selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13, 14 and 15.
  • said reactive compounds of the device comprise at least one oligonucleotide composition comprising a pair of primers and a probe, selected from the group consisting of a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 1-2 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 3; a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 4-5 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 6; and a pair of sequence primers of SEQ ID NO: 7-8 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 9.
  • Another object of the invention is an RNA detection method comprising at least the steps of:
  • the third step of the method comprises an amplification of nucleotide sequence by RT-RPA (reverse transcription and amplification by polymerase assisted recombinases).
  • RT-RPA reverse transcription and amplification by polymerase assisted recombinases.
  • Another object of the invention is a primer pair selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-2; SEQ ID NO: 4-5; and SEQ ID NO: 7-8.
  • Another object of the invention is a nucleotide probe selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13, 14 and 15.
  • Another subject of the invention is an oligonucleotide composition comprising a pair of primers and a probe, selected from the group consisting of a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 1-2 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 3; a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 4-5 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 6; and a pair of sequence primers of SEQ ID NO: 7-8 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 9.
  • Another object of the invention is a method of manufacturing a device comprising at least the steps of at :
  • FIG. 1 schematically illustrates and illustrates perspective an embodiment of the device according to the invention
  • FIG. 2 illustrates a particular embodiment of the local temperature conditioning means and the support layer according to the invention
  • FIG. 3 illustrates a device according to the invention assembled to perform a diagnosis
  • FIG. 4 illustrates a logic diagram of steps of the method which is the subject of the invention
  • FIG. 5 illustrates an embodiment of the device according to the invention
  • FIG. 6 illustrates a particular embodiment of the device according to the invention
  • FIG. 7 illustrates a particular embodiment of the device 60 according to the invention.
  • FIG. 8 illustrates a particular embodiment of the device 50 according to the invention.
  • FIG. 9 illustrates several embodiments of the device according to the invention.
  • FIG. 10 illustrates an embodiment of the device according to the invention
  • Figure 11 illustrates a general method of amplifying DNA on a paper substrate
  • FIG. 12 illustrates a paper device adapted to perform an RT-RPA type amplification reaction according to one embodiment of the invention
  • FIG. 13 illustrates a different paper device of the invention and local temperature conditioning means according to one embodiment of the invention
  • FIG. 14 illustrates the dependence of the material of the zones or channels in contact with the reactive compounds of the RT-RPA on the result of an amplification reaction
  • Figure 15 illustrates the influence of a paper substrate on fluorescence signal kinetics emitted during RT-RPA
  • FIG. 16 illustrates the influence of wax or PDMS barriers, serum and lyophilization of the RNA target compound on the fluorescence signal kinetics emitted during RT-RPA on paper;
  • Figure 17 illustrates the preservation of a RT-RPA amplification device on paper
  • Figure 18 illustrates the dependence between the amount of reactive compounds deposited on the paper substrate and the geometry of the substrates considered
  • FIG. 19 illustrates the flows in a device according to the invention
  • FIG. 20 illustrates the flows in a device according to the invention
  • Figure 21 illustrates an RNA detection of an Ebola virus
  • FIG. 22 illustrates the dependence of the conditioning of the reactive compounds and the target compounds 920 on the fluorescence emission kinetics of an RT-RPA;
  • FIG. 23 illustrates the dependence of the conditioning of the reactive compounds and the target compounds 920 on the fluorescence emission kinetics of an RT-RPA
  • FIG. 24 illustrates tests leading to the choice of primers
  • FIG. 25 illustrates tests leading to the choice of the primers
  • Figure 26 illustrates the effect of lyophilization of target compounds 920 and an RNAse inhibitor on a RT-RPA reaction on paper.
  • FIG. 1 illustrates schematically and in perspective an embodiment of the device 10 object of the present invention.
  • This diagnostic amplification device 10 comprises:
  • a porous substrate 105 comprising:
  • Zone 1 comprising at least one reactive compound 1 reacting with a target compound 120 of a sample, called the "diagnostic zone";
  • the sample deposition zone 130 positioned between the vector fluid deposition zone 125 and the diagnostic zone 1, which comprises a compound 145 for preparing the sample by chemical lysis of the cells;
  • an additional zone 155 comprising at least one reactive compound of the diagnostic zone 1 connected via a channel 160 to the deposition zone 125 of a vector fluid
  • an additional zone 165 comprising at least one reactive compound 1 of the diagnostic zone 1, and at least one target compound 120 connected via a channel 170 to the zone 125 for depositing a vector fluid;
  • means 205 for local conditioning of the temperature of the diagnostic zone 1 10 and additional zones 155 and 165 of additional control;
  • means 150 for locally conditioning the temperature of the sample deposit zone 130
  • the sealed layer 215 being positioned between the porous substrate 105 and the support layer 210.
  • FIG. 1 shows the porous substrate 105 implemented by the device 10.
  • This porous substrate 105 is, for example, a sheet of paper made from cellulose fibers, nitrocellulose membranes or filter paper. constituting a porous medium capable of allowing the passage of a vector fluid.
  • a droplet for example of water, blood or buffer solution
  • a set of zones and channels is defined in the porous substrate 105. These zones and channels are delimited by barriers passing through the porous substrate 105 in thickness. These barriers are formed, for example: by depositing molten wax penetrating into the thickness of the porous substrate and then solidified (the solid wax impregnating portions of a porous substrate 105 may delimit one or more channels);
  • a “zone” is a closed volume of the porous substrate 105 having at least one opening and “channel” a conduit connecting at least two zone openings.
  • a zone called diagnostic zone 1 10
  • a mixture of reactive compounds 1 15 is formed of an enzyme, a mixture of the four deoxyribonucleotides and a selection of primers allowing the realization of a DNA amplification technique among:
  • RPA Relatively stable protein kinase kinase
  • the reagent compounds 1 used allow at least one amplification technique described in Yan, L. et al., “Isothermal amplified detection of DNA and RNA", Molecular BioSystems, 70 (5), 970-1003, 2014.
  • At least one reactive compound is present in freeze-dried form in the diagnostic zone 1 10: it can be arranged on the surface of the porous substrate 105, and / or in the pores of the porous substrate 105 (that is to say in the porous substrate 105).
  • At least one reactive compound is present in dried form and / or in the form of a hydrogel. In other embodiments, at least one reactive compound is present in a wet form. In these variants, the diagnostic zone 1 10 is isolated from the external environment by plastic sheets, for example.
  • each said reactive compound is rehydrated by the vector fluid deposited in the vector fluid deposition zone 125.
  • the primers hybridize to the DNA strand that is complementary to them, the enzyme can then attach to the primers and replicate the DNA strand (use available deoxyribonucleotides to create the complement of the DNA strand).
  • a colorimetric or fluorescent intercalator is generally integrated and is at the origin of the detection signal.
  • At least one reactive compound 1 changes color in contact with the target compound 120, which makes it possible to detect the presence of the target compound. If a target compound is detected, a user of the device 10 can deduce the presence or absence of a microorganism and deduce the infection of an individual by said microorganism whose DNA is the target compound 120 of the reagent compounds 1 15 of the device 10.
  • At least one reactive compound 1 emits a fluorescence signal in contact with the target compound 120.
  • This diagnostic zone 1 10 is connected to the sample deposition zone 130 by a preferably rectilinear channel 135.
  • the sample deposition zone 130 may comprise a sample preparation compound 145 by lysis of the cells present in dried or lyophilized form in the thickness of the porous substrate 105.
  • this compound 145 is, for example, a detergent agent destroying the plasma membrane of the cells present in the sample, which makes it possible to extract the genetic material from the cells.
  • the sample deposition zone 130 is connected to the deposition zone of a vector fluid 125 by a channel 140.
  • the deposition zone of a vector fluid 125 is configured to receive a vector fluid, for example.
  • This vector fluid deposition zone 125 is connected by a channel 160, different from the channel 140, to an additional zone 155 comprising at least one reactive compound 1 (for example of the same composition as the reactive compounds 1 15 of zone 1). diagnosis).
  • This zone 155 called “additional verification zone 155" has the function of verifying that the vector fluid deposited in the vector fluid deposition zone 125 does not have the target compound 120, which would lead to an erroneous diagnosis with respect to the sample deposited in the sample deposit area 130.
  • a verification of the absence of a target compound in the vector fluid may be performed in a device in which an area 125 and a zone 155 are connected indirectly: these two zones can for example be connected by combinations of zone (s) and / or channel (aux), so that the flow of vector fluid 125 does not pass through a zone 130 , 410, 910 sample deposit to join an additional 155 area.
  • This combination may be a succession of at least one element selected from a channel and a different zone from a sample deposition zone 130, 410, 910.
  • the deposition zone of a vector fluid 125 is also connected, by a channel 170 different from the channel 140 and the channel 160, to an additional zone 165 comprising the reactive compound 1 and at least one target compound 120 in freeze-dried form.
  • an additional area 165 comprising a reactive compound 1 and a target compound may be connected to the zone 125 for depositing a vector fluid indirectly, for example by a succession of at least one element chosen from a channel and a zone different from an area 130, 410, 910 sample deposit.
  • This zone 165 called "additional verification area 165" has the function of verifying the operation of the device 10.
  • the deposition zone of a vector fluid 125 has an area substantially greater than the areas of the other zones of the device 10.
  • a vector fluid in the deposition zone of a vector fluid 125 causes, by a capillary pump mechanism, a displacement of the water in the additional and supplementary checking zones 155 and in the deposition zone of A sample 130.
  • the vector fluid thus transports the sample into the sample deposition zone 130 and the diagnostic zone 1 10.
  • the zones and channels of the porous substrate 105 act as a microfluidic system.
  • the porous substrate 105 is, for example, wrapped in a plastic sheet covering all the surfaces of the porous substrate 105 with the exception of the deposition zones 125 and 130. In this way, the porous substrate 105 is protected and each Reactant 1 is isolated to prevent contamination.
  • FIG. 2 illustrates a particular embodiment of the means 205 for locally conditioning the temperature and the support layer 210.
  • the support layer 210 is, for example, a sheet of paper or cellulose fibers similar to the material used to make the porous substrate 105. This support layer 210 has dimensions that are preferentially identical to those of the porous substrate 105.
  • a thermal conditioning means 205 may comprise a conductive electrical circuit 205 positioned on this support layer 210 so that, when a current flows through the circuit, this circuit locally heats the porous substrate 105 by Joule effect.
  • the positioning of the conductive electrical circuit 205 is carried out so that, when the support layer 210 and the porous substrate 105 are brought into contact, the local temperature conditioning means 205 is placed opposite the diagnostic zones 10. and additional check zones 155 and additional 165.
  • the local temperature conditioning means 205 is configured to heat the diagnostic zone 1 10 and the additional and additional control zones 155 to a temperature of between 20 ° C and 120 ° C. Preferably, this temperature is between 35 ° C and 70 ° C and preferably between 45 ° C and 65 ° C.
  • Other means of thermal conditioning can be used alternatively or in addition such as a Peltier effect device.
  • a secondary electrical conductor circuit 150 is positioned so as to face the sample deposition zone 130 of the porous substrate 105 in order to act as a means 150 for local conditioning of the sample preparation temperature by thermal denaturation of the sample. the sample.
  • a conductive electrical circuit 150 may be positioned so as to face the other zones of the device 10, 40, 50, 90.
  • These electrical circuits, 205 and 150 are powered by a battery 220 for example.
  • This battery 220 has, for example, a voltage of 9 volts, which allows the substrate system 105, layer 205 and battery 220 to be portable.
  • the local temperature conditioning means 205 is configured to perform a set of thermal cycles in order to perform a PCR reaction.
  • an electrical circuit 150 may consist of an electrically conductive ink traced, deposited or printed on a sheet of paper. This sheet of paper is in this case a sheet distinct from the porous substrate 105.
  • FIG. 3 shows the device 10 assembled to perform a diagnosis.
  • a sealed layer 215 is positioned between the porous substrate 105 and the support layer 210.
  • the local temperature conditioning means 205 is positioned under the additional diagnostic zones 10 and zones 155 and 165 while the local temperature conditioning means 150 is positioned below the sample deposition zone 130. In this manner, the sample transported into the sample deposition zone 130 and diagnostic zone 1 is heated, allowing the enzymes to function and the isothermal amplification function of DNA to take place. .
  • local isothermal warming of the additional zone 165 makes it possible to check the operation of each reactive compound 1 15.
  • the thermal preparation means 150 makes it possible to purify and inactivate the sample deposited in the sample deposition zone 130.
  • FIG. 4 illustrates a logic diagram of steps of the method that is the subject of the present invention. This process comprises:
  • a detection step 330 of the presence of a target compound in the sample is a detection step 330 of the presence of a target compound in the sample.
  • the sampling step 305 is performed, for example, by a syringe or a needle pricking an individual at the end of the finger to extract a drop of blood.
  • a drop of urine, saliva or any other biological fluid is removed.
  • a drop of blood drawn from a blood test is used.
  • a drop of blood taken at the fingertip of the individual is often used.
  • the deposition step 310 is carried out, for example, by contacting the sample with the sample deposition zone of the device as described with reference to FIGS. 1 to 3.
  • the preparation step 315 is carried out by lysis of the cells of the sample and / or by thermal denaturation of the sample.
  • the chemical lysis is carried out by a detergent agent, for example, while the thermal denaturation is carried out by local isothermal heating of the sample deposition zone by a conductive electrical circuit positioned opposite said zone.
  • This preparation step 315 aims to extract the DNA or RNA material from the cells of the sample and to decontaminate the sample by deactivating the microorganism (s), for example.
  • the transport step 320 is carried out, for example, by deposition of a standardized amount of sterile vector fluid on the deposition zone of a vector fluid of the device 10. This vector fluid, by a pump mechanism capillary, transports the sample to the sample deposition zone and the diagnostic zone of the device 10.
  • the volume of deposited vector fluid is, for example, thirty times greater and preferably one hundred times greater than the deposited volume of aqueous solution in which the sample is diluted.
  • the isothermal amplification step 325 may be carried out by conditioning the temperature of the reagent medium, comprising the prepared sample and each reactive compound, in the diagnostic zone. This heating allows the enzymes, initially present in dried form and then rehydrated, to amplify the DNA of the target compound.
  • the isothermal amplification 325 is less restrictive than the PCR methods and the thermal cycles associated with these methods.
  • the local temperature conditioning means 205 is supported by a layer which, associated with the porous substrate of the device 10 forms a chip with three thicknesses:
  • porous substrate layer comprising the microfluidic system of channels and zones;
  • the detection step 330 is performed, for example, by detecting the color or fluorescence of the porous substrate at the diagnostic zone. This spectrometry is performed directly by the user or, for example, by a communicating portable terminal, such as a mobile phone having an image sensor for example. An image processing software embedded in said terminal or in a remote computer server determines the color of the porous substrate and derives diagnostic information therefrom.
  • the method comprises a step of verifying the purity of the vector fluid by detecting the color in an area of the substrate porous in connection with the deposition zone of a vector fluid. If this zone, provided only with each reactive compound, has a color or a fluorescence characteristic of the presence of the target compound in said zone, the vector fluid used is infectious and the diagnosis established by the device 10 can not be exact.
  • the method comprises a step of verifying the operation of the device 10 by detecting the color or the fluorescence in an area of the substrate comprising, in freeze-dried forms, each reactive compound and the target compound.
  • the deposited vector fluid hydrates this zone, the compounds are brought into contact and the color of said zone becomes representative of the detection of the target compound. If this zone does not take this color, then the diagnosis made can not be considered correct.
  • the device can be burned to avoid generating infectious waste.
  • the local temperature conditioning means 205 may be extracted for reuse in connection with another porous substrate.
  • FIG. 5 illustrates a particular embodiment of the device 40 object of the present invention. This device 40 differs from the device 10 as described with reference to FIG. 1 in that:
  • sample deposition zone 410 and the diagnostic zone 455 are combined and in that
  • the two channels are merged into a single channel 430.
  • this device 40 comprises a porous substrate 405 similar to the porous substrate 105 described with reference to FIG. 1, a set of channels 430, 440 and 450, and zones 410, 425, 435, 445 and 455 being delimited. on and in this porous substrate 405.
  • Zone 410 corresponds to a sample deposit area.
  • This sample deposition zone 410 is connected to a deposition zone 425 of vector fluid similar to the deposition zone 125 of vector fluid described with reference to FIG.
  • the vector fluid is used primarily to hydrate the area sample deposition 410 and diagnostic 455 to prevent drying of the compounds before a diagnosis is made.
  • sample and diagnostic 455 deposition zones 410 comprise a sample preparation compound similar to the sample preparation compound 165 described with respect to FIG.
  • FIG. 6 illustrates a particular embodiment of the device 50 object of the present invention.
  • This device 50 comprises:
  • An additional zone 540 comprising no reactive compound 515 or target compound 520, making it possible to verify that the vector fluid has no target compound 520 and
  • An additional zone 550 comprising the target compound 520 to check the operating capacity of the device 50.
  • FIG. 7 illustrates a particular embodiment of the device 60 object of the present invention.
  • the reactive compounds described above comprise:
  • primers that is, small strands of DNA that specifically recognize a desired DNA or RNA sequence in a sample, this sequence being nicknamed "target compound” in the figures above;
  • deoxyribonucleic bases ie the elementary bricks which form the DNA
  • This device 60 comprises a porous substrate 605 comprising a zone
  • vector fluid deposition connected to three channels, 615, 620 and 625, for conveying the vector fluid by capillarity.
  • this vector fluid is transported to a zone 685 comprising a pair of primers 665, deoxyribonucleic bases and 645 enzymes, in freeze-dried form, for example, to verify that the vector fluid does not contain the target compound 630. If target compound 630 is present, primers 665 and enzymes 645 react with target compound 630 and indicate to a user, for example, through a fluorescent probe, that target compound 630 is present in the vector fluid.
  • the carrier fluid is transported to an area 680 having a pair of primers 665, deoxyribonucleic bases, 645 enzymes, target compound 630 in lyophilized form, for example.
  • the primers 665, the enzymes 645 and the target compound 630 react, indicating to a user, by means of a fluorescent probe, for example, that the device 60 functions properly in the presence of the target compound 630.
  • the channel 620 the vector fluid is transported to a sample deposition zone 625, this sample here comprising the target compound 630.
  • This sample deposition zone 625 is connected via a channel 635 to a storage area 640 of 645 enzymes in freeze-dried form.
  • the vector fluid transports the stored sample and enzymes 645 into three distinct zones, 650, 660 and 670, each connected to the storage zone 640 by a separate channel.
  • Connected elements are understood to mean that there is an arrangement of zone (s) and / or channel (s) capable of transporting a vector fluid from one element to another or to the other elements, by capillarity and / or by another mode of fluid flow in / on a porous substrate 105 between said elements.
  • a pair of primers, 655, 665 and 675 different is placed in each zone, 650, 660 and 670.
  • Each primer pair, 655, 665, and 675 corresponds to a different diagnosis, with each pair of primers, 655, 665, and 675, reacting with a different target compound 630 or with a different part of a target compound 630.
  • FIG. 8 illustrates a particular embodiment of the device 70 object of the present invention.
  • the reactive compounds described above there are three components of the reactive compounds described above. These reactive compounds are formed:
  • primers ie small strands of DNA, called “oligonucleotides”, which specifically recognize a desired sequence in a sample, this sequence being named “target compound” in the figures above.
  • oligonucleotides which specifically recognize a desired sequence in a sample, this sequence being named “target compound” in the figures above.
  • These primers can be adapted to detect the presence of a pathogen, for example by RT-RPA;
  • dNTPs deoxyribonucleotides
  • enzymes capable of assembling the deoxyribonucleotides to form the complementary DNA strand of the target compound may be polymerases, the operation of which requires, among other things, that the primer finds a complementary sequence.
  • Other enzymes may be necessary, in particular when carrying out an isothermal amplification reaction with RT-RPA in the device 10, 40, 90.
  • the enzymes may be single-stranded binding protein (or SSB) and / or recombinases whose function is to hybridize primers with homologous DNA sequences.
  • Reverse transcriptases are used to detect a pathogen from RNA, particularly an RNA genome pathogen.
  • This device 70 comprises a porous substrate 705 comprising a vector fluid deposition zone 710 connected to a channel 720 for conveying the vector fluid by capillarity. Via channel 720, the carrier fluid is transported to an enzyme storage area 725 745 in dried form. This storage area 725 is connected to three channels, 715, 725 and 735.
  • the vector fluid comprising enzymes 745 is transported to a zone 785 comprising a pair of primers 765 and deoxyribonucleotides (dNTPs), in freeze-dried form for example, to verify that the vector fluid does not contain the target compound 730. If target compound 730 is present, primers 765 and enzymes 745 react and indicate to a user, through fluorescence for example, that target compound 730 is present in the vector fluid.
  • the enzyme-containing vector fluid 745 is transported to an area 780 having a pair of primers 765, deoxyribonucleotide bases and target compound 730 in lyophilized form, for example. In contact with the carrier fluid, primers 765 and enzymes 745 react and fluoresce to indicate to a user that device 70 is functioning properly in the presence of target compound 730.
  • the enzyme-containing vector fluid 745 is transported to a sample deposition zone 740, which sample here comprises target compound 730.
  • the carrier fluid transports the stored sample and enzymes 745 into three distinct areas, 750, 760 and 770, each connected to the storage area 740 by a separate channel.
  • a pair of primers, 755, 765 and 775 different is placed in each zone, 750, 760 and 770.
  • Each primer pair, 755, 765 and 775 corresponds to a different diagnosis, with each pair of primers, 755, 765 and 775, reacting with a different target compound 730 or with a different part of a target compound 730.
  • Figure 9 illustrates several embodiments of the device according to the invention.
  • Panel A of FIG. 9 illustrates a top view geometry of patterns used for producing a device according to the invention.
  • the porous substrate comprises a stack 3 of four primary porous substrates 906, each said primary porous substrate 906 comprising at least one element chosen from a channel and a zone. More generally, the porous substrate comprises a stack 3 of at least two primary porous substrates 906, each primary porous substrate 906 comprising a channel and / or a channel portion and / or a zone.
  • This exemplary embodiment is suitable for carrying out the test of a sample comprising a negative control, that is to say a control making it possible to verify that the vector fluid does not comprise a target compound 920 and a positive control, that is to say, a control to verify the operation of the device 90 and the DNA amplification reaction.
  • the porous substrate 905 used in this embodiment is made from Whatman (Trade Mark) grade 1 paper for chromatography. Wax patterns (108R0090 / 108R0091 / 108R0092 / 108R0093, Xerox, registered trademark) are printed (Xerox 8570 ColorQube printer) on the paper and then for example heated for one minute at 150 ° C on a hot plate (Ika, registered trademark, RCT basic). The wax can thus penetrate the pores of the porous substrate 905.
  • This manufacturing step advantageously allows the inactivation of enzymes such as RNAses possibly present in the paper.
  • the device is made by aligning the patterns followed by folding the paper.
  • the folding of the paper allows the stack 3 of several primary porous substrates 906 whose patterns are made by printing.
  • the stack 3 or part of the stack 3 of primary porous substrates 906 of a device according to one embodiment of the invention can be obtained by folding an initial porous substrate.
  • Each primary porous substrate 906 can be joined to another with good contact by applying a piece of double-sided adhesive roll (Tesa, registered trademark) around the flow patterns.
  • Plastic sheets RT2RR, Sigma, registered trademark
  • Holes are pierced using a punch having a diameter of 5 mm in the plastic coating to allow access to the inputs and outputs of the device 90, for example for the deposition of vector fluid.
  • a reservoir can be made for depositing vector fluid by coating the stack 3 with several layers of plastic film and then piercing them at an inlet or an outlet. Subsequently, the reservoir or tanks made may be covered with a layer of plastic film, for example to prevent evaporation of a vector fluid deposited on the device.
  • materials other than wax can be used to make the barriers of the channels or zones.
  • materials other than wax can be used to make the barriers of the channels or zones.
  • biocompatible materials such as PDMS (polydimethylsiloxane) for example.
  • Obtaining barriers in PDMS is less simple than printing wax and can lead to lower spatial resolution. It will sometimes be used in the following examples implemented to check the compatibility of different materials with the biological reactions performed in the device.
  • the dashed lines of the panel A of FIG. 9 indicate the fold directions during the implementation of the device as described previously.
  • the four primary porous substrates 906 are aligned during folding to allow vertical openings related to the areas defined by the patterns.
  • the components of the various fluid flows in the device can thus be directed in the main plane of a primary porous substrate 906 as well as in the plane normal to the main plane of a said primary porous substrate 906.
  • the geometry of the vector fluid deposition zone is adapted to be soaked in said vector fluid.
  • the device 90 comprises:
  • a zone 925 of vector fluid deposition adapted to be in contact, after stacking 3 of the primary substrate of said zone 925, to
  • an area 915 comprising at least one reactive compound; three channels 935, 945 and 955 adapted to transport a vector fluid and reactive compounds from zone 915 to:
  • a sample deposition zone 910 A sample deposition zone 910;
  • An additional zone 940 comprising no compound before carrying out a test, making it possible to verify that the vector fluid does not comprise a target compound 920 (so-called negative control zone);
  • An additional zone 950 comprising target compounds 920 (for example a short fragment of RNA comprising an Ebola virus RNA sequence) adapted to verify the operation of the device 90 and the DNA amplification reaction (so-called positive control area).
  • target compounds 920 for example a short fragment of RNA comprising an Ebola virus RNA sequence
  • Panel B of FIG. 9 schematically illustrates the arrangement of the different primary porous substrates 906 of a device according to the invention, after folding of the pattern described in panel A of FIG. 9.
  • the various primary porous substrates 906 are separated in the diagram for the understanding of the flows, differently from their arrangement in the device.
  • the gray arrows illustrate the flow in a primary porous substrate 906 and the white arrows illustrate the flow from one primary porous substrate to another.
  • the two zones 910 and 940 are in contact by the stack 3 of the primary porous substrates 906.
  • a vector fluid brought into contact with the vector fluid deposition zone 925 follows a flow through of all the primary porous substrates 906 from bottom to top.
  • each of the zones of a device according to the invention is connected to the other zones by at least one element selected from a channel and a zone: this characteristic allows a vector fluid deposited on a vector fluid deposition zone 125,525,925 to be transported in each of the zones of the device from a single localized deposit.
  • zones 910, 940 and 950 for testing on the same device makes it possible to carry out several experiments in parallel under identical conditions of temperature, hygrometry, etc., and thus to make a significant comparison of the detection results.
  • At least one said compound (for example a reactive compound and / or a target compound 920) is present in at least one of said zones in freeze-dried form.
  • the lyophilization of the various compounds can be carried out for example for 2 hours at -80 ° C. in a lyophilizer.
  • the stack 3 can be made by folding, and the device can be covered with an impermeable sheet, for example plastic.
  • the device thus packaged can be stored at room temperature, protected from moisture and light for several days or weeks.
  • the experiment consists in depositing the sample in the sample deposition zone 910, closing the openings with an impermeable sheet and plunging the vector fluid deposition zone into said vector fluid (ie, more generally, contacting a vector fluid with the vector fluid deposition area 125, 425, 925), for example a buffer solution.
  • the experimenter or the user may examine diagnostic areas 110, 410 to determine the presence or absence of a said target compound 120, 420, 920 in the sample. In some cases, direct visualization by the user may be impossible due to device configuration. The visualization of the result can then be indirect, by displaying colored or fluorescent markers on other areas of the device, coming from a diagnostic zone.
  • a vector fluid having markers has been used to visualize the flow in the device.
  • This method makes it possible to check the flow of the reactive compounds to the test zones, the absence of mixing between the sample test flow lines, the positive and negative controls as well as the trajectories of the different compounds.
  • Fluorescein RAL reagents, registered trademark
  • Brilliant Blue G Sigma Aldrich
  • Allura Red AC Sigma Aldrich
  • Panel A of FIG. 10 illustrates a top view geometry of patterns used for producing a device according to the invention.
  • the porous substrate comprises a stack 3 of five primary porous substrates 906, each said primary porous substrate 906 comprising at least one element chosen from a channel and a zone.
  • This exemplary embodiment is suitable for carrying out multiplexed tests of a sample, each of the tests comprising a negative control and a positive control.
  • the dotted lines of the panel A of FIG. 9 indicate the directions of folding during the production of the device.
  • the crosses indicate pierced areas (absence of substrate) before the folding of the primary porous substrate 906.
  • the device comprises:
  • an area 915 comprising at least one reactive compound
  • Three zones 916 comprising primers specific for the detection of a first DNA sequence
  • Three zones 917 comprising primers specific to the detection of a second DNA sequence
  • Three zones 918 comprising primers specific for the detection of a third DNA sequence.
  • a pair of primers may for example be adapted to detect the Ebola virus
  • Panel B of FIG. 10 schematically illustrates the arrangement of the various primary porous substrates 906 of a device according to the invention, after a folding of the primary porous substrate 906 described in panel A of FIG.
  • Primary porous substrates 906 are separated in the scheme for the understanding of flows, differently from their arrangement in the device.
  • the solid arrows schematically represent different flows when using the device.
  • the dotted arrow indicates the area where the sample is deposited during the test.
  • a carrier fluid is pumped through the vector fluid deposition area 925.
  • a control line it routes and dispenses the reactive compounds present in area 915 in a control line and in a sample line.
  • line is meant a series of at least one channel and / or a zone. These two lines distribute the flow to three test zones, three positive control zones and three negative control zones.
  • the sample line contains a sample deposition area 910 and three areas 916, 917 and 918 with different primers. In this way, the test of a sample can be multiplexed.
  • the negative and positive control lines each comprise three zones 916, 917 and 918.
  • Panel C of FIG. 10 illustrates two photographs of the device according to embodiments of the invention described in panels A and B of FIG. 10.
  • the photograph on the left is a top view of the device. Different visible areas allow the observation, for example in fluorescence, of different sample tests, positive controls and negative controls.
  • the photograph on the right is a bottom view of the device. It illustrates some of the positive and negative control lines.
  • Figure 11 illustrates a general method of amplifying DNA on a paper substrate.
  • Panel A illustrates the deposition of reactive compounds on circular areas of the paper substrate. The device can then be lyophilized.
  • Panel B illustrates the preservation of the device. Said device may for example be kept at room temperature for several weeks.
  • Panel C illustrates the initiation of the test step.
  • a vector fluid for example water or a buffer solution, can be deposited in the presence or in the absence of target compounds 920 of RNA (respectively positive or negative control), or in the presence of an unknown sample.
  • Panel D of FIG. 11 illustrates the fluorescence detection of the amplification reactions on paper.
  • a temperature conditioning means for example a Peltier element conditions the temperature of the substrate between 20 ° C and 120 ° C, preferably between 25 ° C and 65 ° C, and most preferably between 30 and 40 ° C.
  • the result of a test of the sample, a positive or negative control can be advantageously detected by fluorescence.
  • a quantitative measurement of the fluorescence of the visible areas is carried out and described in the results illustrated in the following figures using an external light source for the excitation in fluorescence (Leica EL 6000), a macroscope (Leica Z16 APO, 0.57X magnification) and a GFP filter (Leica).
  • the filter comprises an excitation filter centered on a wavelength of 470 nm +/- 20 nm, a dichroic mirror centered on a wavelength of 500 nm and a suppression filter centered on a wavelength of 525 nm +/- 25 nm.
  • This optical arrangement is suitable for the detection of FAM type optical probes (495 nm wavelength and 520 nm emission wavelength).
  • the images are detected by an EM-CCD camera (Hamamatsu C900-13), recorded at the rate of one image every ten seconds for 30 minutes and 75 ms exposure.
  • a synchronization between the shutter opening and the camera acquisition (EG R & D Vision Delays generator) prevents bleaching of the probes in interaction with the sample.
  • the data is normalized by subtracting the first image at each sequence.
  • the signal as a function of time corresponds to the measurement of an average of the signal on the surface of a test zone, for each image.
  • the amplification can be detected by colorimetry, electrical measurement, capacitive or by measurement of the pH.
  • FIG. 12 illustrates a paper device adapted to perform an RT-RPA type amplification reaction according to one embodiment of the invention.
  • the device comprises the reagent compounds 1 to perform an amplification reaction by RT-RPA adapted to test the sample.
  • a Example of amplification of RNA by RT-RPA is described in the literature in Piepenburg, O., Williams, CH, Stemple, D. L, & Armes, NA, DNA detection using recombination proteins. PLoS biology, 4 (7), 2006.
  • the RT-RPA amplification technique can be adapted for the detection of a microorganism in a sample by performing a reverse transcription of a region of a specific RNA of said microorganism in order to obtain a cDNA (complementary DNA).
  • a diagnostic zone 105, 405 of the device may be conditioned at a stationary or constant temperature so as to initiate a reverse transcription of RNA.
  • the cDNA obtained is then amplified by RPA (isothermally).
  • the detection of amplified cDNA sequences can be performed by measuring the fluorescence associated with the hybridization of a fluorescent nucleotide probe specific for the amplified region.
  • the inventors of the present application have developed primers and nucleotide probes to specifically detect an Ebola virus.
  • the inventors have based on the genomic sequences of 145 Ebola Zaire viruses (EBOV) available in the sequence databases (Gire, SK et al., Scheiffelin, JS (2014).) Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak, Science, 345 (6202), 1369-1372). Based on the alignment of these sequences, they determined which regions were conserved within these sequences. From the consensus sequences, they then designed six pairs of primers targeting conserved regions. For each pair of primers, different fluorescent probes were created.
  • EBOV Ebola Zaire viruses
  • the primers for amplifying a target region of an Ebola virus whose sequence is bounded by positions 8661 and 8820 may include:
  • a pair of primers specifically amplifying the target region and whose sequence of each primer is at least 95% identical (more particularly at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100%) to the sequence of each primer of sequence SEQ ID NO: 1 and 2, or
  • a pair of primers specifically amplifying the target region and whose sequence of each primer is at least 95% identical (more particularly at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100%) to the sequence of each primer of SEQ ID NO: 4 and 5 sequence.
  • the primers for amplifying a target region of Ebola virus whose sequence is bounded by positions 17158 and 17274 may include:
  • a pair of primers specifically amplifying the target region and whose sequence of each primer is at least 95% identical (more particularly at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% or 100%) to the sequence of each primer of SEQ ID NO: 7 and 8.
  • the primers are selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1-2, 4-5 and 7-8.
  • the target regions amplified by the primer pairs are detected, simultaneously or sequentially, by nucleotide probes.
  • a nucleotide probe for detecting a target region of an Ebola virus whose sequence is bounded by positions 8661 and 8820 may include:
  • a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 3 or A nucleotide probe whose sequence is complementary to the sequence SEQ ID NO: 13, or
  • a nucleotide probe for detecting a target region of an Ebola virus whose sequence is bounded by positions 17158 and 17274 may include:
  • a nucleotide probe whose sequence is complementary to the sequence SEQ ID NO: 15.
  • the nucleotide probes are labeled with at least one fluorochrome.
  • a composition comprising a pair of primers and a nucleotide probe is selected from the group consisting of: a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 1-2 and a nucleotide probe of SEQ sequence ID NO: 3; a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 1-2 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 13, a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 4-5 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 6; a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 4-5 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 14; a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 7-8 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 9; a pair of primers of sequence SEQ ID NO: 7-8 and a nucleotide probe of sequence SEQ ID NO: 15.
  • the nucleotide probes refer to the sequences described by their SEQ ID NO: 3; a pair of
  • RNA fragments of an Ebola virus are synthesized in vitro.
  • the inventors have synthesized a DNA corresponding to each of the target regions of the genome of an amplified Ebola virus. by the primer pairs described above.
  • Each of these DNA sequences was cloned into a pRSET vector downstream of a T7 promoter (GeneArt, Life Technologies) to enable in vitro transcription of the cloned sequence (MEGAscript kit, Ambion technologies).
  • T7 promoter GeneArt, Life Technologies
  • RT-RPA The amplification by RT-RPA is carried out using the reagents of the kit TwistAmp RT-Exo kit, TwistDX, registered trademark).
  • reactive compounds are mixed in aqueous solution, deposited on paper at -20 ° C and lyophilized at -20 ° C for 1 hour and 30 minutes.
  • the aqueous solution comprising a mixture of the various reactive compounds and / or target compounds, is conditioned at the temperature of 4 ° C. before being deposited on the porous substrate before lyophilization.
  • An object of the invention is a method comprising a step of forming the channels and zones in a porous substrate 105, as described above, followed by a step of depositing on an area of said porous substrate 105, 405, 905 at least a member selected from reactive compounds 1, 15, 415 and target compounds 120, 420, 920 diluted in an aqueous solution conditioned at a temperature between 0 ° C and 10 ° C, and then freeze-dried.
  • a final step may be to seal said porous substrate in a plastic sheet, to prevent entry of any compound likely to degrade freeze-dried biological species during storage of the device.
  • the reactive compounds comprise inhibitors of
  • the reactive compounds comprise cryoprotectants.
  • cryoprotectants can help to maintain normal activity of the different enzymes of the reactive compounds after rehydration.
  • the inventors have also tested the influence of blood serum on the efficiency of RT-RPA amplification in the device.
  • the inventors also describe the use of human sera in the various tests, comprising dilutions of 920 RNA target compounds.
  • the different sera are heated at 95 ° C for 5 minutes and cooled on ice for two minutes.
  • the heating step and the deionized water in which it is diluted are intended to destroy the viral envelope to make accessible the genomic material.
  • the inventors have also found that the temperature must be at least 95 ° C if the heating time is 5 min. If the temperature is lower than 95 ° C then the heating time must be extended to achieve the same result.
  • the inventors have also validated a device and method for detecting an Ebola virus according to embodiments of the invention by analyzing samples of viral RNA from an Ebola virus from patients' plasma. Samples are collected during the 2014 outbreak in Macenta, Guinea, and field tested. The 120 samples collected were tested in parallel with the device of the present application and with a known RT-PCR method (RealStar® Ebolavirus RT-PCR Kit 1 .0, Altona Diagnostics) in order to be able to compare the results obtained with the device. diagnosis to those of a reference method.
  • Panel A of Figure 12 illustrates a device for testing RT-RPA reactions on paper.
  • This device comprises three rectangular test zones (each zone having dimensions of 3 mm by 5 mm) and two circular openings for fixing the device for fluorescence detection.
  • Panel B of FIG. 12 illustrates a fluorescence measurement of a test area during RT-RPA adapted for amplification of a target compound 920 RNA from an Ebola virus.
  • Curve (a) corresponds to the amplification of a sample
  • curve (b) corresponds to the amplification of a target compound 920 of RNA previously lyophilized with all the other reactive compounds (positive control)
  • the curve (c) corresponds to a negative control (absence of RNA target compound 920).
  • Panel C and panel D illustrate the fluorescence emission during RT-RPA, corresponding to a series of primers, probes and RNA target compounds 920 of an Ebola virus according to the invention.
  • the amplifications are carried out on a device described in panel A of FIG. 12. Three signals are measured, after 30 minutes, for different sets of four elements consisting of a target compound 920 of RNA corresponding to a target region.
  • RNA of an Ebola virus a first primer, a second primer and a probe.
  • all of the reactive compounds are lyophilized beforehand on or in the paper.
  • the fluorescence emission of the positive control zone and the test zone is greater than that of the negative control zone (arranged between the two other zones in the device described in panel A of FIG. 12).
  • the negative control makes it possible to verify that the buffer solution used is not contaminated with a target compound 920 of RNA and to verify the absence of leakage between the different zones.
  • a comparison between five target compounds 920 of an Ebola virus RNA is performed on a series of devices such as those described in panel A of FIG. 12.
  • a target compound 920 For each of the sequences of a target compound 920, several combinations of the primers and probes are tested. In the test zone (ST) and in the positive control zone (PC) respectively, dilutions of target compounds 920 at 10- copy concentrations are deposited. mL “1 and 10 8 copies, mL " 1 . These tests make it possible to compare several reactive compounds involved in RT-RPA. The results were compared to the results obtained using primers used in the literature.
  • FIG. 13 illustrates a different paper device of the invention and means 205 for local temperature conditioning according to one embodiment of the invention.
  • Panel A of FIG. 13 is a photograph of the local temperature conditioning means 205 according to the invention.
  • a different device of the invention 206 is placed in contact with the means 205.
  • the means 205 of local temperature conditioning is compact is integrated in the device according to the invention.
  • 207 is a conductive material line, in this nickel embodiment, drawn on paper and connected to a 9 volt battery 208.
  • said local temperature conditioning means 205 is a circuit electrical conductor placed opposite a porous substrate of the device. The conductive material line is brought into electrical contact with connectors 209.
  • Panel B of Figure 13 illustrates experimental results of temperature conditioning.
  • the temperature measured on three lines 207 of conductive material, and measured according to the applied voltage.
  • Each line of conductive material is characterized by a different electrical resistance: the triangles correspond to an electrical resistance of 30 ⁇ , the discs correspond to an electrical resistance of 80 ⁇ and the diamonds correspond to an electrical resistance of 2500 ⁇ .
  • the local temperature conditioning means 205 is configured to set the temperature of said deposition regions 130 and diagnostic zones 1 to between 20 ° C and 120 ° C, preferably 25 ° C to 65 ° C, and most preferably 30 ° C to 65 ° C. ° C and 40 ° C.
  • Experimental measurements are in agreement with the theoretical behaviors (black lines).
  • Panel C of Figure 13 illustrates experimental results of temperature conditioning.
  • the temperature of the conductive material lines is measured as a function of the electrical resistance of said constant voltage lines. The measurements are in agreement with the theoretical behavior (black line).
  • Panel D of Figure 13 illustrates experimental results of temperature conditioning.
  • the kinetics of the temperature of a conductive material line is measured by imposing a voltage transition from 0 V to 4.4 V (triangles) and from 0 V to 2.7 V (round).
  • Panel E of Figure 13 illustrates experimental results of temperature conditioning.
  • the kinetics of the temperature of a conductive material line is measured by imposing a voltage transition of 4.4 V at 0 V (triangles) and 2.7 V at 0 V (round).
  • the device 10 is heated to 40 ° C.
  • This conditioning of the temperature can be performed by a Peltier element (MJ Research PTC 200) for 30 minutes.
  • MJ Research PTC 200 MJ Research PTC 200
  • local temperature conditioning means 205 integrated in the device, such as the means described above.
  • the resistance of the conductive material line is determined by its geometry (thickness, length, width, etc.) and the conductivity of the nickel. The major characteristics are verified experimentally. For example, the thermal Ohm law can be given by the formula (1):
  • T T amb + ⁇ U 2 (1)
  • T the temperature in Kelvin
  • T amb the ambient temperature in Kelvin
  • R th the thermal resistance in Kelvin.Watt "1
  • R e i ec the electrical resistance in Ohm: For a line of conductive material given the thermal Ohm's law becomes: (7 - T amb ) oc U 2 . (2)
  • FIG. 14 illustrates the dependence of the material of the zones or channels in contact with the reactive compounds of RT-RPA on the result of an amplification reaction. Indeed, the influence of the interfaces and materials constituting the interfaces of a container can have dramatic consequences on the progress of a DNA amplification reaction.
  • Panel A of FIG. 14 illustrates the kinetics of a fluorescence signal emitted during RT-RPA in tubes for a positive (h) and negative (i) control.
  • the panel B of FIG. 14 illustrates the kinetics of a fluorescence signal emitted during an RT-RPA for a positive control in the presence of paper (k), plastic (j) and wax (I).
  • the panel C of FIG. 14 illustrates the kinetics of a fluorescence signal emitted during an RT-RPA for a negative control in the presence of paper, plastic and wax.
  • FIG. 14 does not make it possible to determine the influence of paper or wax on the transcription of RNA and amplification of the DNA. The presence of wax seems to slightly decrease the detection signal of the amplification. The inhibition illustrated by the curve (I) is small compared to the amplitude of the signal.
  • the kinetics of panel C of FIG. 14 illustrate the absence of modification of the background signal in the case of negative controls.
  • Figure 15 illustrates the influence of a paper substrate on the fluorescence signal kinetics emitted during RT-RPA.
  • RT-RPAs are made on paper in the kinetics illustrated in FIG. 15, without lyophilization of the reactive compounds.
  • the different reactions are carried out on a square paper substrate comprising four circular zones making it possible to carry out several simultaneous reactions.
  • a mixture of all the reactive compounds is deposited on the paper substrate.
  • the reactive compounds comprise a target compound 920 of RNA at a concentration of 10 copies. ml "1.
  • Paper substrates are heated to 40 ° C.
  • a fluorescence detection used to monitor the amplification of the DNA transcript and discriminate positive and negative samples.
  • the curve (m) illustrates the fluorescence signal emitted during RT-RPA in the presence of a target compound RNA (positive control) on paper
  • the curve (n) illustrates the fluorescence signal emitted during RT-RPA in the presence of a target compound 920 of RNA (positive control) on a tube
  • the curve (o) illustrates the fluorescence signal emitted during RT-RPA in the absence of a compound Target 920 of RNA (negative control) on paper
  • the curve (p) illustrates the fluorescence signal emitted during RT-RPA in the absence of a target compound 920 of RNA (negative control) in tube.
  • curves (m) and (n) have similar profiles and show the good compatibility of the RT-RPA on a paper substrate.
  • Figure 16 illustrates the influence of wax or PDMS barriers, serum and lyophilization of RNA target compound 920 on the fluorescence signal kinetics emitted during paper RT-RPA.
  • the experiments illustrated in FIG. 16 are carried out on a square paper substrate comprising four circular or rectangular zones making it possible to carry out several simultaneous reactions.
  • the reactive compounds are lyophilized on the paper substrate, according to the protocol described above. They can be kept for several days, at room temperature, protected from light and moisture.
  • the sample is then deposited, diluted in a buffer or in an aqueous solution on the substrate which allows to rehydrate the substrate.
  • the substrate is then heated to 40 ° C.
  • the fluorescence emission is then recorded.
  • Panel A of Figure 16 illustrates the effect of varying concentration of RNA reactive compound on RT-RPA on paper when using wax for barrier construction.
  • the curve (neg) illustrates the fluorescence emission for the negative control (no target compound copy 920 RNA), the curve (C 0 ) illustrates the fluorescence emission for a concentration of 10 8 copies.
  • mL "1 target RNA compound 920 the curve (C) shows the fluorescence emission to a concentration of 10 10 copies.
  • the curve (C 2) illustrates the fluorescence emission for a concentration of 10 12 copies.
  • Panel B of FIG. 16 illustrates the effect of varying concentration of RNA reactive compound on paper RT-RPA when using PDMS for barrier construction.
  • the curve (neg) illustrates the fluorescence emission for the negative control (no target compound copy 920 RNA), the curve (C 0 ) illustrates the fluorescence emission for a concentration of 10 8 copies.
  • mL "1 target RNA compound the curve (C) shows the fluorescence emission to a concentration of 10 10 copies.
  • the curve (C 2) shows the emission in fluorescence for a concentration of 10 12 copies.
  • Panel C of Figure 16 illustrates the inhibition by human serum of fluorescence emission on paper RT-RPA.
  • Curve (q) illustrates a positive control without serum and curve (v) illustrates a negative control without serum.
  • Curve (u) illustrates a negative control in the presence of serum diluted 5 times in deionized water.
  • Curve (t) illustrates a positive control in the presence of serum diluted 5 times.
  • Curve (r) illustrates a positive control in the presence of serum diluted 10 times.
  • the curve (s) illustrates a positive control in the presence of serum diluted 20 times.
  • Panel D of FIG. 16 illustrates the influence of lyophilization of RNA target compound 920 on the fluorescent emission of RT-RPA on paper.
  • the curve (IRNA) illustrates a positive control in the case of the use of freeze-dried RNA target compound 920 and the (fRNA) curve illustrates a positive control in the case of the use of fresh RNA target compound 920.
  • the black curve shows a negative control.
  • RNA target compounds 920 in serum makes it possible to measure the importance of a possible inhibition in the case of a more realistic sample. For the most diluted cases (curves (r) and (s)) a slight inhibition is present: the signal in fluorescence is weaker than in the case without serum. Curve (t) illustrates that lower dilution of serum implies stronger inhibition.
  • a device comprises a positive control line and a negative control line.
  • the positive control and the negative control make it possible to solve problems of the prior art such as the problem of controlling the good quality of the reagent compounds of the device after storage, and the control of external contamination, of the vector fluid, for example.
  • the RNA target compound 920 of the device can be lyophilized to allow transport and preservation of the device.
  • Panel D of FIG. 16 illustrates that the same results can be obtained using a fresh or freeze-dried RNA target compound 920.
  • the device according to the invention thus makes it possible to carry out a positive and negative control.
  • Figure 17 illustrates the preservation of a RT-RPA amplification device on paper. Positive controls are performed using a target compound 920 RNA of an Ebola virus at a concentration of 10 copies. mL "1 . Panel A of Figure 17 illustrates several amplifications after different device and room temperature storage times.
  • the curve (x) illustrates a positive control after two days of storage of the device
  • the curve (w) illustrates a positive control after 6 days of storage of the device
  • the curve (y) illustrates a positive control after 30 days of storage of the device .
  • the black curves illustrate the different negative controls.
  • the panel B of FIG. 17 illustrates several amplifications carried out after two days storage, at different temperatures, of devices comprising lyophilized reactive compounds.
  • the curve (z) and (ac) respectively illustrate a positive control and a negative control for a prior conservation of the device at ambient temperature
  • curve (ab) and (ae) respectively illustrate a positive control and a negative control for a prior storage of the device at 4 ° C
  • the curve (aa) and (ad) respectively illustrate a positive control and a negative control for a prior storage of the -20 ° C device.
  • Panel C of FIG. 17 illustrates the influence of lyophilization of all of the reactive compounds and the carrier fluid on the amplification.
  • Curve (af) illustrates a positive control for a device comprising lyophilized reactive compounds and whose amplification is carried out using a fresh buffer solution as a carrier fluid and the curve (ag) illustrates a positive control for a device comprising reactive compounds. lyophilized and whose amplification is carried out using a buffer solution which has been lyophilized as a vector fluid.
  • the curve (ah) is a negative control.
  • the storage of the reactive compounds is tested by carrying out three devices at the same time. Each device is kept either two days, a week, or a month before performing amplification by RT-RPA.
  • the results of panel A illustrate the possibility of keeping the devices at least for a week without observing degradation of the amplification results. They also illustrate the possibility of performing the detection of a target compound 920 (RNA of an Ebola virus at a concentration of 10.sup.- 10 ml -1 ) after one month of storage of the device, despite a slight alteration of the amplification signal.
  • the results of panel B of Fig. 17 illustrate the possibility of keeping the devices independently at -20 ° C, 4 ° C and at room temperature to detect a target compound 920. The variation of the positive signal is, in this example, stronger in the case of storage at -20 ° C.
  • Panel C of FIG. 17 illustrates that the use of a fresh buffer solution has no positive effect on the detection of a target compound 920.
  • Figure 18 illustrates the dependence between the amount of reactive compounds deposited on the paper substrate and the geometry of the substrates considered.
  • Panel A of FIG. 18 illustrates kinetics of fluorescence emission on paper RT-RPA for different amounts of reactive compounds deposited on the paper substrate.
  • the curve (ai) corresponds to a condition of deposit before the reaction of a volume equivalent to half the standard volume (a standard volume can be between 40 ⁇ ⁇ - and 50 ⁇ )
  • the curve (aj) corresponds to at a pre-reaction condition of a volume equivalent to a quarter of the standard volume
  • the curve (ak) corresponds to a pre-reaction deposition condition of a volume equivalent to one eighth of the standard volume.
  • the black curves correspond to the negative controls for the different conditions of volumes deposited.
  • the panel B of FIG. 18 illustrates the amplitude of the signal at the end of the reaction as a function of the volume of solution used for the rehydration of the reactive compounds.
  • the experimental points marked by triangles correspond to a target compound concentration 920 of 10 8 copies.
  • ml "1 the data points marked by squares correspond to a concentration of target compound 920 10 10 copies.
  • ml" 1 and the experimental points marked by triangles correspond to a concentration of target compound 920 10 12 screens.
  • the black line corresponds to the average signal of the negative controls and the lines dashed to its standard error.
  • the amount of reactive compounds of the device is adapted to the geometry of the device.
  • the deposited volume comprising the reactive compounds as well as the concentration of the solution comprising the reactive compounds have an effect on the detection.
  • a low concentration of reagent tends to increase the value of the detection threshold and to decrease the sensitivity.
  • a high concentration of reactive compounds tends to inhibit the RT-RPA amplification reaction.
  • the reactions corresponding to FIG. 18 are performed on paper devices whose barriers are made of PDMS.
  • the experiments described in panel A of FIG. 18 correspond to a device comprising an RNA target compound 920 of an Ebola virus deposited at a concentration of 12 copies. ml "1.
  • volume of carrier fluid used for the rehydration of reactive compounds also alters the concentration of reactants during a RT-PCR amplification reaction A different optimal volume is observed for each target compound concentration 920.
  • the volume condition V 7.5 ⁇ ⁇ - allows the substrate geometry to obtain good conditions. for detection of 10 8 copies, 1 mL, 10 copies. mL "1 and 12 copies, mL " 1 .
  • Figure 19 illustrates the flows in a device according to the invention.
  • Panel A of the figure illustrates the flow in the different zones and channels of the device.
  • the photograph at the top of panel A of Figure 20 illustrates a primary porous substrate unfolded during the manufacture of a device.
  • a device described in Figure 20 allows for a sample test that may contain RNA sequences of an Ebola virus, a negative control and a positive control. Prior to this test, some of the reactive compounds are lyophilized and reactive compounds of said device are arranged in pores of a primary porous substrate 906 protected by two primary porous substrates 906 located at the ends of the stack 3 necessary to produce the porous substrate as described in Figure 9.
  • markers make it possible to visualize the flows and to check the functions of a device. For example, 5 ⁇ l of fluorescein are deposited and dried in zone 915 of said device.
  • the photographs of the bottom of the panel A of FIG. 20 illustrate a view from above of the device before and after the deposition of a vector fluid and a flow of said fluid in all the zones and channels.
  • the photograph at the bottom right of Panel A of Figure 20 confirms that the deposited markers are well deposited in the three areas of interest.
  • Panel B of Fig. 20 illustrates a similar experiment, with the difference that the markers are deposited before flow in a channel connecting area 915 and area 950 (gray portion of the top photograph of panel B of Fig. 20).
  • the photograph at the bottom right of panel B of Figure 20 confirms the transport of the markers in area 950 without mixing after the flow.
  • Figure 20 illustrates the flows in a device according to the invention.
  • a device described in FIG. 20 makes it possible to carry out three test samples capable of containing RNA sequences of an Ebola virus, three negative controls and three positive controls.
  • a part of the reactive compounds Prior to this test, a part of the reactive compounds are lyophilized and reactive compounds of said device are arranged in pores of a primary porous substrate 906 and protected by two primary porous substrates 906 located at the ends of the stack 3 necessary to produce the porous substrate, as described in FIG. 9.
  • Panel A of FIG. 20 comprises two photographs.
  • the left-hand photograph illustrates a fluorescent marker deposit on the 915 area.
  • the right-hand photograph illustrates the transport of the fluorescent markers in all of the reading areas 919.
  • Panel B of Figure 20 includes two photographs.
  • the photograph on the left illustrates several deposits of fluorescent markers of different colors (Allura Red AC and Brillant Blue G) on areas belonging to two different lines.
  • the right-hand photograph illustrates the transport of the fluorescent markers in all the reading areas 919. No mixing is observed and the markers are well transported in their line to the reading areas 919.
  • Panel C of FIG. 20 includes two photographs.
  • the left-hand photograph depicts a fluorescent marker deposit on the sample deposition area 915.
  • the right-hand photograph illustrates the transport of the fluorescent markers across all the reading areas 919. Fluorescent markers are well transported only to the reading areas 919 included in the test lines of the sample.
  • Figure 21 illustrates an RNA detection of an Ebola virus.
  • Panel A of Figure 21 illustrates the fluorescence emissions of the reading areas 919 of a device according to the invention, described for example in Figure 9.
  • Several RT-RPA are made in each of the lines of the device.
  • the curve (a1) corresponds to the fluorescence of the reading zone 919 of the test line of the sample
  • the curve (am) corresponds to the fluorescence of the reading zone of the positive control line
  • the curve ( ) corresponds to the fluorescence of the reading zone of the negative control line.
  • the sample tested corresponds to a sample collected during the 2014 Ebola outbreak in Macenta.
  • the primers used correspond to the pair of primers of sequence SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6. This result shows the possibility of discriminating a sample comprising RNA from an Ebola virus with a device comprising the primers of the virus. 'invention.
  • the panel B of FIG. 21 illustrates the fluorescence emissions of the reading zones 919 of a device according to the invention, described for example in FIG. 9.
  • Several RT-RPAs are produced in each of the lines of the device.
  • the curve (a1) corresponds to the fluorescence of the reading zone 919 of the test line of the sample
  • the curve (am) corresponds to the fluorescence of the positive control line reading zone
  • the curve (an) corresponds to the fluorescence of the negative control line reading zone.
  • the sample tested corresponds to a sample collected during the 2014 Ebola outbreak in Macenta.
  • the primers used correspond to the pair of primers of sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. This result shows the possibility of discriminating a sample comprising RNA from an Ebola virus with a device comprising the primers of the virus. 'invention.
  • Figure 22 illustrates the dependence of conditioning reactive compounds and target compounds 920 on the fluorescence emission kinetics of RT-RPA.
  • Reactive compounds of RT-RPA are dried (not lyophilized) on a device such as that described in FIG. 11, for 1 h at 4 ° C., and then stored for two days at -20 ° C.
  • the reagents contain the primers adapted for a target compound 920 of Ebola virus RNA (black symbols at a concentration of 10 copies / ml).
  • the crosses represent the negative controls for which the reaction medium on paper is rehydrated with water.
  • the circles represent the fluorescence monitoring when the target compound 920 is supplied to the reaction medium.
  • Figure 23 illustrates the dependence of the conditioning of the reactive compounds and target compounds 920 on the fluorescence emission kinetics of an RT-RPA.
  • the experimental conditions corresponding to the curves of FIG. 23 are the same as those described in FIG. 22, with the difference that panel A corresponds to a preservation of the dried compounds overnight at -20 ° C., panel B corresponds to a storage of the dried compounds overnight at -4 ° C and panel C corresponds to a storage of the dried compounds overnight at 25 ° C.
  • panel A corresponds to a preservation of the dried compounds overnight at -20 ° C.
  • panel B corresponds to a storage of the dried compounds overnight at -4 ° C
  • panel C corresponds to a storage of the dried compounds overnight at 25 ° C.
  • the distinction between positive and negative is possible when the device is stored at -20 ° C.
  • Figure 24 illustrates tests leading to the choice of primers. Paper devices such as that described in panel A of Figure 12 are prepared for four different primer sets (identified Ref / 5.2 / 4.3 / 4.4 in Table 1 at the end of the description). The curves below show a fluorescence measurement over time, from each zone (the sample test corresponds to the gray circles, the negative control corresponds to the black dashes and the positive control to the black crosses in all the panels A, B, C and D in Fig. 24) for each batch of primers, in response to the same test sample.
  • Primer lots 4.4 and Ref are not chosen for the rest of the experiments because they correspond to a nonspecific signal from 10-15 minutes in the zone of negative control.
  • An additional experiment on another sample makes it possible to choose between the primers 4.3 and 5.2.
  • Figure 25 illustrates tests leading to the choice of primers.
  • the primer set 4.3 appears to be more effective for the detection of the test and in the operation of the positive controls. We choose this batch of primers for the next experiments.
  • Figure 26 illustrates the effect of lyophilization of target compounds 920 and an RNAse inhibitor on a paper RT-RPA reaction.
  • the reactive compounds of RT-RPA are lyophilized. Fluorescence measurements make it possible to follow the reaction when the paper is rehydrated and heated.
  • square symbols show positive controls, dashes illustrate negative controls.
  • the positive control curve of panel A of FIG. 26 illustrates a fluorescence measurement when the reagents are rehydrated with a solution containing RNA target compounds 920.
  • target compound 920 of RNA is freeze-dried together with reactive RT-RPA compounds. The addition of water makes it possible to rehydrate the reaction medium. The signal is slightly weaker than in the case where the target compound 920 is not lyophilized but brought into solution at the time of the experiment.
  • the curves of panel C of Fig. 24 illustrate a fluorescence measurement when the reactive compounds, the RNA target compounds 920 are lyophilized on the paper before the addition of water.

Abstract

La présente invention les dispositifs de diagnostic par amplification d'ADN et plus particulièrement un dispositif caractérisé en ce qu'il comporte : -un substrat poreux comportant au moins: •une zone de dépôt d'échantillon, ledit échantillon comportant au moins un composé cible; •une pluralité de canaux positionnés dans l'épaisseur dudit substrat poreux; •une zone, dite « zone de diagnostic », comportant au moins un composé réactif adapté à réagir avec un dit composé cible; •une zone de dépôt d'un fluide vecteur adapté à être transporté par capillarité dans l'ensemble desdites zones et desdits canaux : chacune des dites zones étant reliées aux autres par au moins un élément choisi parmi un canal et une zone, -un moyen de conditionnement local de la température de la zone de diagnostic.

Description

Dispositif en papier pour le diagnostic génétique
L'invention concerne les dispositifs de diagnostic par amplification d'ADN. Elle s'applique, notamment, au diagnostic de microorganismes, à partir d'un échantillon biologique tel que des gouttes de sang, d'urine, de salive et de sueur.
Dans le domaine du diagnostic médical, il existe, entre autres, deux familles de tests biologiques. D'une part, les tests immunologiques (immunoassay en anglais), dont font partie les tests « immuno-enzymatiques » et abréviés ELISA (pour « enzyme- linked immunosorbent assay », traduit par « dosage d'immunoadsorption par enzyme liée ») ont pour objectif de détecter la présence d'un anticorps ou d'un antigène dans un échantillon. La formation et la localisation spatiale du complexe anticorps-antigène est détectable par plusieurs techniques : greffage d'espèces colorées ou fluorescentes, nanoparticules et enzymes par exemple. Le signal caractérisant la présence de l'espèce recherchée peut être détecté à l'œil ou par spectroscopie. On compte, dans cette famille, les tests de type bandelette, dipstick (traduit par « jaugeur ») ou latéral flow test (traduit par « test par flux latéral »). Ces tests de type Point-of-Care (traduit par « au chevet du patient ») sont très adaptés à des situations de terrain avec peu de matériel à disposition. Mais le diagnostic par tests immunologiques se restreint à détecter des espèces impliquées dans des complexes anticorps-antigène. Par exemple, dans le cas d'un microorganisme, la détection est indirecte : les tests immunologiques permettent de détecter la présence ou l'absence de protéines caractéristiques ou d'anticorps produits par les cellules immunocompétentes de l'hôte infecté par le ou les microorganismes.
D'autre part, les tests par amplification d'ADN permettent de reconnaître et de multiplier une séquence spécifique d'ADN ou ARN. Dans le cas d'un microorganisme, le test par amplification d'ADN est plus direct : on reconnaît le matériel génétique de l'espèce recherchée. Mais ces tests nécessitent du matériel coûteux et un savoir faire particulier pour être mis en œuvre. Ces tests ne permettent pas de réaliser des essais au chevet du patient, et ce particulièrement dans les zones géographiques éloignées des laboratoires. Pour l'ensemble de ces raisons, ces tests par amplification d'ADN ne permettent pas de réaliser rapidement et à bas coût des diagnostics hors des laboratoires.
La présente invention a pour objet un dispositif de diagnostic par amplification d'ADN, caractérisé en ce qu'il comporte :
- un substrat poreux comportant au moins:
• une zone de dépôt d'échantillon, ledit échantillon comportant au moins un composé cible ;
• une pluralité de canaux positionnés dans l'épaisseur dudit substrat poreux ;
• une zone, dite « zone de diagnostic », comportant au moins un composé réactif adapté à réagir avec un dit composé cible ;
• une zone de dépôt d'un fluide vecteur adapté à être transporté par capillarité dans l'ensemble desdites zones et desdits canaux : chacune des dites zones étant reliée aux autres par au moins un élément choisi parmi un canal et une zone,
- un moyen de conditionnement local de la température de la zone de diagnostic.
Avantageusement, les composés réactifs dudit dispositif comportent au moins des amorces, des recombinases, des polymérases et des protéines fixant et maintenant l'ADN simple brin, lesdits composés réactifs étant agencés dans les pores desdites zones dudit substrat poreux.
Avantageusement, lesdites amorces du dispositif sont adaptées à détecter la présence d'un agent pathogène par RT-RPA.
Avantageusement, ledit agent pathogène est le virus Ebola. Avantageusement, au moins un dit composé réactif est agencé dans ou sur ledit substrat poreux sous forme lyophilisée.
Avantageusement, ledit substrat poreux du dispositif comporte un empilement d'au moins deux substrats poreux primaires, chaque dit substrat poreux primaire comportant au moins un élément choisi parmi un canal, une partie de canal et une zone.
Avantageusement, ledit empilement de dits substrats poreux primaires du dispositif est obtenu par pliage.
Avantageusement, le dispositif comporte au moins une zone supplémentaire comportant au moins un composé réactif de la zone de diagnostic reliée à la zone de dépôt d'un fluide vecteur par une succession d'au moins un élément choisi parmi un canal et une zone différente d'une zone de dépôt d'échantillon.
Avantageusement, un dit composé du dispositif choisi parmi un composé réactif et un composé cible est agencé dans ou sur ledit substrat poreux sous forme lyophilisée.
Avantageusement, le dispositif comporte au moins une zone supplémentaire comportant au moins un dit composé réactif, et au moins un composé cible, reliée à la zone de dépôt d'un fluide vecteur par une succession d'au moins un élément choisi parmi un canal et une zone différente d'une zone de dépôt d'échantillon.
Avantageusement, le dispositif comporte un moyen de conditionnement local de la température de la zone de dépôt d'échantillon.
Avantageusement, ledit substrat poreux du dispositif comporte au moins une feuille de papier. Avantageusement, ledit moyen de conditionnement local de la température du dispositif comporte un circuit électrique conducteur mis en regard dudit substrat poreux.
Avantageusement, le dispositif comporte:
- une couche de support du circuit électrique conducteur et
- une couche étanche, la couche étanche étant positionnée de manière intercalaire entre le substrat (105) poreux et la couche de support.
Avantageusement, ledit circuit électrique conducteur du dispositif est supporté par une feuille de papier distincte dudit substrat poreux.
Avantageusement, au moins un canal du dispositif est délimité par des régions dudit substrat poreux imprégnées de cire solide.
Avantageusement, au moins un canal du dispositif est formé par un contraste hydrophile-hydrophobe dans l'épaisseur dudit substrat poreux.
Avantageusement, ledit moyen de conditionnement local de la température du dispositif est configuré pour fixer la température d'au moins une zone entre 20°C et 120°C et préférentiellement entre 30°C et 40°C.
Avantageusement, au moins un dit composé réactif du dispositif est adapté à changer de couleur au contact d'un dit composé cible.
Avantageusement, au moins un dit composé réactif du dispositif est adapté à émettre un signal de fluorescence au contact d'un dit composé cible.
Avantageusement, lesdits composés réactifs du dispositif comprennent au moins une paire de dites amorces sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 1 -2 ; SEQ ID NO: 4-5 ; et SEQ ID NO: 7-8. Avantageusement, lesdits composés réactifs du dispositif comprennent au moins une sonde nucléotidique sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13, 14 et 15. Avantageusement, lesdits composés réactifs du dispositif comprennent au moins une composition d'oligonucléotides comprenant une paire d'amorces et une sonde, sélectionnée parmi le groupe consistant en une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 1 -2 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 3; une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 4-5 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 6 ; et une paire d'amorces de séquence de SEQ ID NO: 7-8 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 9.
Un autre objet de l'invention est un procédé de détection d'ARN comprenant au moins les étapes consistant à :
- déposer un dit échantillon sur au moins une dite zone de dépôt d'échantillon d'un dit dispositif ;
- mettre en contact un dit fluide vecteur avec ladite zone de dépôt de fluide vecteur dudit dispositif ;
- conditionner une température stationnaire d'au moins une dite zone de diagnostic de manière à initier une transcription inverse d'ARN et à amplifier une séquence de nucléotides sélectionnée au préalable, et de manière isotherme ;
- examiner lesdites zones de diagnostic pour déterminer la présence ou l'absence d'un dit composé cible.
Avantageusement, la troisième étape du procédé comprend une amplification de séquence de nucléotides par RT-RPA (transcription inverse et amplification par polymérase assistée de recombinases). Un autre objet de l'invention est une paire d'amorces sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 1 -2 ; SEQ ID NO: 4-5 ; et SEQ ID NO: 7-8.
Un autre objet de l'invention est une sonde nucléotidique sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13, 14 et 15. Un autre objet de l'invention est une composition d'oligonucléotides comprenant une paire d'amorces et une sonde, sélectionnée parmi le groupe consistant en une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 1 -2 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 3; une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 4-5 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 6 ; et une paire d'amorces de séquence de SEQ ID NO: 7-8 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 9. Un autre objet de l'invention est un procédé de fabrication d'un dispositif comprenant au moins les étapes consistant à :
- former des zones et des canaux dans un dit substrat poreux en chauffant ledit substrat poreux pendant au moins une minute à une température supérieure ou égale à 100°C et préférentiellement supérieure ou égale à 150°C ;
- déposer sur une zone dudit substrat poreux au moins un élément choisi parmi des composés réactifs et des composés cibles dilués dans une solution aqueuse conditionnée à une température comprise entre 0°C et 10°C, et les lyophiliser ;
- sceller ledit substrat poreux dans un feuillet en plastique.
L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages, détails et caractéristiques de celle-ci apparaîtront au cours de la description explicative qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 illustre schématiquement et en perspective un mode de réalisation du dispositif selon l'invention ;
la figure 2 illustre un mode de réalisation particulier du moyen de conditionnement local de température et de la couche de support selon l'invention ;
la figure 3 illustre un dispositif selon l'invention assemblé pour réaliser un diagnostic ; la figure 4 illustre un logigramme d'étapes du procédé objet de l'invention ;
la figure 5 illustre un mode de réalisation du dispositif selon l'invention ; la figure 6 illustre un mode de réalisation particulier du dispositif selon l'invention ;
la figure 7 illustre un mode de réalisation particulier du dispositif 60 selon l'invention ;
la figure 8 illustre un mode de réalisation particulier du dispositif 50 selon l'invention ;
la figure 9 illustre plusieurs modes de réalisation du dispositif selon l'invention ;
la figure 10 illustre un mode de réalisation du dispositif selon l'invention ; la figure 1 1 illustre un procédé général d'amplification de l'ADN sur un substrat en papier ;
la figure 12 illustre un dispositif en papier adapté à réaliser une réaction d'amplification de type RT-RPA selon un mode de réalisation de l'invention ;
la figure 13 illustre un dispositif papier différent de l'invention et un moyen de conditionnement local de température selon un mode de réalisation de l'invention ;
la figure 14 illustre la dépendance du matériau des zones ou des canaux en contact avec les composés réactifs de la RT-RPA sur le résultat d'une réaction d'amplification ;
la figure 15 illustre l'influence d'un substrat en papier sur les cinétiques de signal de fluorescence émis lors d'une RT-RPA ;
la figure 16 illustre l'influence de barrières en cire ou PDMS, du sérum et de la lyophilisation du composé cible d'ARN sur les cinétiques de signal de fluorescence émis lors d'une RT-RPA sur papier ;
la figure 17 illustre la conservation d'un dispositif d'amplification par RT- RPA sur papier ;
la figure 18 illustre la dépendance entre la quantité de composés réactif déposés sur le substrat en papier et la géométrie des substrats considérés ;
la figure 19 illustre les écoulements dans un dispositif selon l'invention ; la figure 20 illustre les écoulements dans un dispositif selon l'invention ; la figure 21 illustre une détection de l'ARN d'un virus Ebola ; la figure 22 illustre la dépendance du conditionnement des composés réactifs et des composés cibles 920 sur la cinétique d'émission en fluorescence d'une RT-RPA ;
la figure 23 illustre la dépendance du conditionnement des composés réactifs et des composés cibles 920 sur la cinétique d'émission en fluorescence d'une RT-RPA ;
la figure 24 illustre des tests conduisant au choix des amorces ; - la figure 25 illustre des tests conduisant au choix des amorces ;
la figure 26 illustre l'effet de la lyophilisation de composés cibles 920 et d'un inhibiteur de RNAse sur une réaction de RT-RPA sur papier.
La description suivante présente plusieurs exemples de réalisation du dispositif de l'invention : ces exemples sont non limitatifs de la portée de l'invention. Ces exemples de réalisation présentent à la fois les caractéristiques essentielles de l'invention ainsi que des caractéristiques additionnelles liées aux modes de réalisation considérés. Par souci de clarté, les mêmes éléments porteront les mêmes repères dans les différentes figures.
La figure 1 illustre schématiquement et en perspective un mode de réalisation du dispositif 10 objet de la présente invention. Ce dispositif 10 de diagnostic par amplification d'ADN comporte :
- un substrat 105 poreux comportant :
• une zone 1 10 comportant au moins un composé 1 15 réactif réagissant avec un composé 120 cible d'un échantillon, dite «zone de diagnostic» ;
· une zone 125 de dépôt de fluide vecteur transporté, par capillarité, dans une zone 130 de dépôt d'échantillon et dans la zone 1 10 de diagnostic ;
• la zone 130 de dépôt d'échantillon, positionnée entre la zone 125 de dépôt de fluide vecteur et la zone 1 10 de diagnostic, qui comporte un composé 145 de préparation de l'échantillon par lyse chimique des cellules ;
deux canaux, 135 et 140, positionnés dans l'épaisseur du substrat poreux, respectivement entre, d'une part, la zone 125 de dépôt de fluide vecteur et la zone 130 de dépôt d'échantillon, d'autre part, la zone 130 de dépôt d'échantillon et la zone 1 10 de diagnostic ;
une zone 155 supplémentaire comportant au moins un composé 1 15 réactif de la zone 1 10 de diagnostic reliée par un canal 160 à la zone de dépôt 125 d'un fluide vecteur, et
une zone 165 supplémentaire comportant au moins un composé 1 15 réactif de la zone 1 10 de diagnostic, et au moins un composé 120 cible, reliée par un canal 170 à la zone 125 de dépôt d'un fluide vecteur ;
- un moyen 205 de conditionnement local de la température de la zone de diagnostic 1 10 et des zones 155 supplémentaire et 165 supplémentaire de contrôle ;
- un moyen 150 de conditionnement local de la température de la zone 130 de dépôt d'échantillon ;
- une couche 210 de support du circuit électrique conducteur ; et
- une couche 215 étanche, la couche 215 étanche étant positionnée de manière intercalaire entre le substrat 105 poreux et la couche 210 de support.
En particulier, on observe, sur la figure 1 , le substrat poreux 105 mis en œuvre par le dispositif 10. Ce substrat poreux 105 est, par exemple, une feuille de papier, en fibres en cellulose, en membranes de nitrocellulose, en papier filtre constituant un milieu poreux susceptible de permettre le passage d'un fluide vecteur. Au contact du substrat poreux 105, une goutte (par exemple d'eau, de sang ou de solution tampon) diffuse en surface et dans l'épaisseur du substrat poreux 105 autour du point de contact entre la goutte et le substrat poreux 105. Afin de canaliser l'écoulement des gouttes dans ce substrat poreux 105, un ensemble de zones et de canaux est défini dans le substrat poreux 105. Ces zones et canaux sont délimités par des barrières traversant le substrat poreux 105 en épaisseur. Ces barrières sont formées, par exemple : - par dépôt de cire fondue pénétrant dans l'épaisseur du substrat poreux puis solidifiée (la cire solide imprégnant des parties d'un substrat poreux 105 peut délimiter un ou plusieurs canaux) ;
- par un contraste hydrophile-hydrophobe dans l'épaisseur du substrat poreux
105 ;
- par découpe au laser ;
- par réticulation de polymères et/ou
- par photolithographie dans l'épaisseur du substrat poreux 105.
On appelle « zone » un volume fermé du substrat poreux 105 comportant au moins une ouverture et « canal » un conduit reliant au moins deux ouvertures de zones.
Le dispositif 10 met en œuvre plusieurs zones dans le substrat poreux 105 : une zone, appelée zone de diagnostic 1 10, comporte au moins un composé réactif 1 15 réagissant avec un composé cible 120. Par exemple, un mélange de composés réactifs 1 15 est formé d'une enzyme, un mélange des quatre désoxyribonucléotides et une sélection d'amorces permettant la réalisation d'une technique d'amplification d'ADN parmi :
- PCR (« Polymerase Chain Reaction », traduit en français par « Amplification en Chaîne par Polymérase» ou ACP), RT-PCR (« Reverse Transcriptase - PCR », traduit en français par « PCR après transcription inverse ») et ses dérivés ;
- LAMP (« Loop-mediated isothermal amplification », traduit en français par « Amplification isotherme par des structures en boucle ») et RT-LAMP (« Reverse transcription - LAMP », traduit en français par « LAMP après transcription inverse ») ;
- RPA (« Recombinase polymerase amplification », traduit en français par « Amplification par polymérase, assistée de recombinases ») et RT-RPA (« Reverse transcription - RPA », traduit en français par « RPA après transcription inverse ») ; - SDA (« Strand displacement amplification », traduit en français par «amplification par déplacement de brin ») et RT-SDA (« Reverse transcription- SDA », traduit en français par « SDA après transcription inverse
») ;
- HDA (« Helicase dépendant amplification », traduit en français par « amplification assistée par hélicases ») et RT-HDA (« Reverse transcription - HDA », traduit en français par « HDA après transcription inverse ») et
- NEAR (« Nicking enzyme amplification reaction », traduit en français par «Réaction d'amplification par enzymes de coupure») et RT-NEAR («Reverse transcription - NEAR », traduit en français par « NEAR après transcription inverse»).
Un exemple de réalisation de RPA est décrit par Piepenburg et al., « DNA détection using recombination proteins », PLoS biology, 4(7), 2006. Dans d'autres modes de réalisation de l'invention, les composés réactif 1 15 utilisés permettent de réaliser au moins une technique d'amplification décrite dans Yan, L. et al., « Isothermal amplified détection of DNA and RNA », Molecular BioSystems, 70(5), 970-1003, 2014. Au moins un composé réactif est présent sous forme lyophilisée dans la zone de diagnostic 1 10 : il peut être agencé à la surface du substrat poreux 105, et/ou dans les pores du substrat poreux 105 (c'est-à-dire dans le substrat poreux 105). Dans des variantes, au moins un composé réactif est présent sous forme séchée et/ou sous forme d'un hydrogel. Dans d'autres variantes, au moins un composé réactif est présent sous format humide. Dans ces variantes, la zone de diagnostic 1 10 est isolée de l'environnement extérieur par des feuilles de plastique, par exemple.
Lorsqu'au moins un composé réactif est sous forme lyophilisée, chaque dit composé réactif est réhydraté par le fluide vecteur déposé dans la zone de dépôt de fluide vecteur 125.
Lorsqu'au moins un composé réactif entre en contact avec le composé cible 120, sous réserve des conditions thermiques adéquates, les amorces s'hybrident au brin d'ADN qui leur est complémentaire, l'enzyme peut alors se fixer aux amorces et répliquer le brin d'ADN (utiliser les désoxyribonucléotides disponibles pour créer le complémentaire du brin d'ADN). Lors de cette réplication, un intercalant colorimétrique ou fluorescent est généralement intégré et est à l'origine du signal de détection.
Dans le cas d'une détection colorimétrique, au moins un composé réactif 1 15 change de couleur au contact du composé cible 120, ce qui permet de détecter la présence du composé cible. Si un composé cible est détecté, un utilisateur du dispositif 10 peut en déduire la présence ou l'absence d'un microorganisme et déduire l'infection d'un individu par ledit microorganisme dont l'ADN est le composé cible 120 des composés réactifs 1 15 du dispositif 10.
Dans des variantes, au moins un composé réactif 1 15 émet un signal de fluorescence au contact du composé 120 cible.
Cette zone de diagnostic 1 10 est reliée à la zone de dépôt d'échantillon 130 par un canal 135 de préférence rectiligne. La zone de dépôt d'échantillon 130 peut comporter un composé 145 de préparation de l'échantillon par lyse des cellules présent sous forme séchée ou lyophilisée dans l'épaisseur du substrat poreux 105. Dans le cas d'une lyse chimique, ce composé 145 est, par exemple, un agent détergent détruisant la membrane plasmique des cellules présentes dans l'échantillon, ce qui permet d'extraire le matériel génétique des cellules. La zone de dépôt d'un échantillon 130 est reliée à la zone de dépôt d'un fluide vecteur 125 par un canal 140. La zone de dépôt d'un fluide vecteur 125 est configurée pour recevoir un fluide vecteur, par exemple. Cette zone de dépôt de fluide vecteur 125 est reliée par un canal 160, différent du canal 140, à une zone 155 supplémentaire comportant au moins un composé réactif 1 15 (par exemple de même composition que les composés réactifs 1 15 de la zone 1 10 de diagnostic). Cette zone 155 dite « zone de vérification 155 supplémentaire » a pour fonction de vérifier que le fluide vecteur déposé dans la zone de dépôt de fluide vecteur 125 ne présente pas le composé cible 120, ce qui induirait un diagnostic erroné par rapport à l'échantillon déposé dans la zone de dépôt d'échantillon 130. Dans d'autres configurations des canaux et des zones d'un dispositif selon un mode de réalisation de l'invention, une vérification de l'absence d'un composé cible dans le fluide vecteur peut être réalisée dans un dispositif dans lequel une zone 125 et une zone 155 sont reliées de manière indirecte : ces deux zones peuvent par exemple être reliées par des combinaisons de zone(s) et/ou de canal(aux), de manière à ce que l'écoulement de fluide vecteur 125 ne transite pas par une zone 130, 410, 910 de dépôt de l'échantillon pour rejoindre une zone 155 supplémentaire. Cette combinaison peut être une succession d'au moins un élément choisi parmi un canal et une zone différente d'une zone 130, 410, 910 de dépôt d'échantillon.
La zone de dépôt d'un fluide vecteur 125 est également reliée, par un canal 170 différent du canal 140 et du canal 160, à une zone 165 supplémentaire comportant le composé réactif 1 15 et au moins un composé cible 120 sous forme lyophilisée. Lorsque le fluide vecteur hydrate la zone 165 supplémentaire, le composé réactif 1 15 réagit avec le composé cible 120. De manière générale, dans des dispositifs selon des modes de réalisation de l'invention, une zone supplémentaire 165, comportant un composé 1 15 réactif et un composé cible, peut être reliée à la zone 125 de dépôt d'un fluide vecteur de manière indirecte, par exemple par une succession d'au moins un élément choisi parmi un canal et une zone différente d'une zone 130, 410, 910 de dépôt d'échantillon. Cette zone 165 dite « zone de vérification 165 supplémentaire » a pour fonction de vérifier le fonctionnement du dispositif 10.
Dans des variantes, la zone de dépôt d'un fluide vecteur 125 présente une aire sensiblement supérieure aux aires des autres zones du dispositif 10. Ainsi, le dépôt d'un échantillon dans la zone de dépôt d'un échantillon 130 puis le dépôt d'un fluide vecteur dans la zone de dépôt d'un fluide vecteur 125 entraine, par un mécanisme de pompe capillaire, un déplacement de l'eau dans les zones de vérification, 155 supplémentaire et 165 supplémentaire, et dans la zone de dépôt d'un échantillon 130. Le fluide vecteur transporte ainsi l'échantillon dans la zone de dépôt d'échantillon 130 et dans la zone de diagnostic 1 10. Les zones et canaux du substrat poreux 105 agissent comme système microfluidique. Le substrat poreux 105 est, par exemple, enveloppé dans un feuillet en plastique recouvrant l'intégralité des surfaces du substrat poreux 105 à l'exception des zones de dépôt, 125 et 130. De cette manière, le substrat poreux 105 est protégé et chaque composé réactif 1 15 est isolé afin d'éviter les contaminations.
La figure 2 illustre un mode de réalisation particulier du moyen 205 de conditionnement local de la température et de la couche 210 de support. La couche de support 210 est, par exemple, une feuille de papier ou de fibres de cellulose similaire au matériau utilisé pour réaliser le substrat poreux 105. Cette couche de support 210 présente des dimensions préférentiellement identiques à celles du substrat poreux 105.
Un moyen de conditionnement thermique 205 peut comprendre un circuit électrique conducteur 205 positionné sur cette couche de support 210 de manière à ce que, lorsqu'un courant traverse le circuit, ce circuit chauffe localement le substrat poreux 105 par effet Joule. Le positionnement du circuit électrique conducteur 205 est réalisé de manière à ce que, lorsque la couche de support 210 et le substrat poreux 105 sont mis en contact, le moyen 205 de conditionnement local de la température soit mis en regard des zones de diagnostic 1 10 et des zones de vérification 155 supplémentaire et 165 supplémentaire. Le moyen 205 de conditionnement local de la température est configuré pour échauffer la zone de diagnostic 1 10 et les zones de contrôle 155 supplémentaire et 165 supplémentaire à une température comprise entre 20°C et 120°C. Préférentiellement, cette température est comprise entre 35°C et 70°C et préférentiellement entre 45°C et 65°C. D'autres moyens de conditionnement thermique peuvent être utilisés, en variante ou en complément comme par exemple un dispositif à effet Peltier.
Un circuit électrique conducteur 150 secondaire est positionné de manière à être en regard de la zone de dépôt d'échantillon 130 du substrat poreux 105 afin d'agir comme moyen 150 de conditionnement local de la température de préparation de l'échantillon par dénaturation thermique de l'échantillon. De manière générale, un circuit électrique conducteur 150 peut être positionné de manière à être en regard des autres zones du dispositif 10, 40, 50, 90. Ces circuits électriques, 205 et 150, sont alimentés par une batterie 220 par exemple. Cette batterie 220 présente, par exemple, une tension de 9 volts, ce qui permet au système substrat 105, couche 205 et batterie 220 d'être portable. Dans des variantes, le moyen 205 de conditionnement local de la température est configuré pour réaliser un ensemble de cycles thermiques afin de réaliser une réaction de PCR. Dans ces variantes, au moins un composé réactif 1 15 est adapté à réaliser cette réaction. Dans des variantes, un circuit électrique 150 peut consister dans une encre électriquement conductrice tracée, déposée ou imprimée sur une feuille de papier. Cette feuille de papier est dans ce cas une feuille distincte du substrat poreux 105.
On observe, sur la figure 3, le dispositif 10 assemblé pour réaliser un diagnostic. Dans ce mode de réalisation, une couche 215 étanche est positionnée de manière intercalaire entre le substrat 105 poreux et la couche 210 de support. Le moyen 205 de conditionnement local de la température est positionné sous les zones de diagnostic 1 10 et les zones, 155 supplémentaire et 165 supplémentaire tandis que le moyen 150 de conditionnement local de la température est positionné sous la zone de dépôt d'échantillon 130. De cette manière, l'échantillon transporté dans la zone de dépôt d'échantillon 130 et dans la zone de diagnostic 1 10 est échauffé, ce qui permet aux enzymes de fonctionner et à la fonction d'amplification isotherme d'ADN d'avoir lieu. D'autre part, réchauffement isotherme local de la zone 165 supplémentaire permet de vérifier le fonctionnement de chaque composé réactif 1 15.
Le moyen de préparation 150 thermique permet de purifier et d'inactiver l'échantillon déposé dans la zone de dépôt d'échantillon 130.
Le dispositif 10, illustré par exemple dans les figures 1 à 3, peut être fabriqué de manière contrôlée, standardisée en laboratoire ou par des procédés industriels. Après fabrication, le dispositif 10 est stocké dans une pochette en plastique hermétique et peut être stocké à l'abri de la chaleur, de la lumière et de l'humidité pour permettre la conservation des dispositifs 10. La figure 4 illustre un logigramme d'étapes du procédé objet de la présente invention. Ce procédé comporte :
- une étape de prélèvement 305 d'un échantillon ;
- une étape de dépôt 310 de l'échantillon dans une zone de dépôt d'échantillon du dispositif 10 tel que décrit en regard des figures 1 à 3 ;
- une étape de préparation 315 de l'échantillon ;
- une étape de transport 320 de l'échantillon préparé ;
- une étape d'amplification isotherme 325 de l'échantillon et
- une étape de détection 330 de la présence d'un composé cible dans l'échantillon.
L'étape de prélèvement 305 est réalisée, par exemple, par une seringue ou par une aiguille piquant un individu au bout du doigt pour extraire une goutte de sang. Dans des variantes, une goutte d'urine, de salive ou tout autre fluide biologique est prélevée. Dans des variantes préférentielles, une goutte de sang tirée d'une prise de sang est utilisée. A des fins de simplicité d'utilisation, une goutte de sang prise au bout du doigt de l'individu est souvent utilisée. L'étape de dépôt 310 est réalisée, par exemple, par la mise en contact de l'échantillon avec la zone de dépôt d'échantillon du dispositif tel que décrit en regard des figures 1 à 3.
L'étape de préparation 315 est réalisée par lyse des cellules de l'échantillon et/ou par dénaturation thermique de l'échantillon. La lyse chimique est réalisée par un agent détergent, par exemple, tandis que la dénaturation thermique est réalisée par échauffement isotherme local de la zone de dépôt d'échantillon par un circuit électrique conducteur positionné en regard de ladite zone. Cette étape de préparation 315 a pour objectifs d'extraire le matériel ADN ou ARN des cellules de l'échantillon et de décontaminer l'échantillon en désactivant le ou les microorganismes par exemple. L'étape de transport 320 est réalisée, par exemple, par dépôt d'une quantité standardisée de fluide vecteur stérile sur la zone de dépôt d'un fluide vecteur du dispositif 10. Ce fluide vecteur, par un mécanisme de pompe capillaire, transporte l'échantillon dans la zone de dépôt d'échantillon et dans la zone de diagnostic du dispositif 10.
Le volume de fluide vecteur déposé est, par exemple, trente fois supérieur et préférentiellement cent fois supérieur au volume déposé de solution aqueuse dans laquelle est dilué l'échantillon.
L'étape d'amplification isotherme 325 peut être réalisée en conditionnant la température du milieu réactif, comportant l'échantillon préparé et chaque composé réactif, dans la zone de diagnostic. Cet échauffement permet aux enzymes, initialement présentes sous forme séchée puis réhydratée, d'amplifier l'ADN du composé cible.
L'amplification isotherme 325 est moins contraignante que les méthodes de PCR et les cycles thermiques associés à ces méthodes.
Le moyen 205 de conditionnement local de la température est supporté par une couche qui, associée au substrat poreux du dispositif 10 forme une puce à trois épaisseurs :
- une couche de substrat poreux comportant le système microfluidique de canaux et de zones ;
- une couche étanche adhésive fixée au substrat poreux et
- une couche supportant le circuit électrique d'échauffement. L'étape de détection 330 est réalisée, par exemple, par détection de la couleur ou de la fluorescence du substrat poreux au niveau de la zone de diagnostic. Cette spectrométrie est réalisée directement par l'utilisateur ou, par exemple, par un terminal portable communicant, tel un téléphone portable comportant un capteur d'image par exemple. Un logiciel de traitement d'image embarqué dans ledit terminal ou dans un serveur informatique distant détermine la couleur du substrat poreux et en déduit une information de diagnostic.
Dans des variantes, le procédé comporte une étape de vérification de la pureté du fluide vecteur par détection de la couleur dans une zone du substrat poreux en lien avec la zone de dépôt d'un fluide vecteur. Si cette zone, pourvue uniquement de chaque composé réactif, présente une couleur ou une fluorescence caractéristique de la présence du composé cible dans ladite zone, le fluide vecteur utilisé est infectieux et le diagnostic établi par le dispositif 10 ne peut être exact.
Dans des variantes, le procédé comporte une étape de vérification du fonctionnement du dispositif 10 par détection de la couleur ou de la fluorescence dans une zone du substrat comportant, sous formes lyophilisées, chaque composé réactif et le composé cible. Lorsque le fluide vecteur déposé hydrate cette zone, les composés sont mis en contact et la couleur de ladite zone devient représentative de la détection du composé cible. Si cette zone ne prend pas cette couleur, alors le diagnostic réalisé ne peut être considéré comme correct.
Une fois le diagnostic établi, le dispositif peut être brûlé pour éviter de générer des déchets infectieux. Le moyen 205 de conditionnement local de la température peut être extrait pour être réutilisé en liaison avec un autre substrat poreux.
La figure 5 illustre un mode de réalisation particulier du dispositif 40 objet de la présente invention. Ce dispositif 40 diffère du dispositif 10 tel que décrit en regard de la figure 1 en ce que :
- la zone 410 de dépôt d'échantillon et la zone 455 de diagnostic sont confondus et en ce que
- les deux canaux sont confondus en un seul canal 430.
Ainsi, ce dispositif 40 comporte un substrat poreux 405 similaire au substrat poreux 105 décrit en regard de la figure 1 , un ensemble de canaux, 430, 440 et 450, et de zones, 410, 425, 435, 445 et 455, étant délimités sur et dans ce substrat poreux 405.
La zone 410 correspond à une zone de dépôt d'échantillon. Cette zone de dépôt 410 d'échantillon est reliée à une zone de dépôt 425 de fluide vecteur similaire à la zone de dépôt 125 de fluide vecteur décrite en regard de la figure 1 . Dans ce mode de réalisation, le fluide vecteur sert principalement à hydrater la zone de dépôt d'échantillon 410 et de diagnostic 455 pour éviter un séchage des composés avant qu'un diagnostic ne soit réalisé.
Les zones supplémentaires, 435 et 445, correspondent respectivement aux zones, 155 et 165, décrites en regard de la figure 1 et assurent des fonctions similaires. Dans des variantes, les zones de dépôt 410 d'échantillon et de diagnostic 455 comportent un composé de préparation de l'échantillon similaire au composé 165 de préparation de l'échantillon décrit en regard de la figure 1 .
La figure 6 illustre un mode de réalisation particulier du dispositif 50 objet de la présente invention. Ce dispositif 50 comporte :
- un substrat poreux 505 ;
- une zone 525 de dépôt de fluide vecteur reliée à un canal 530 transportant le fluide vecteur par capillarité jusqu'à une zone 560 comportant au moins un composé réactif 515 ;
- trois canaux, 535, 545 et 555, pour transporter le fluide vecteur et chaque composé réactif 515 par capillarité respectivement depuis la zone 560 jusqu'à :
• une zone 510 de dépôt d'un échantillon agissant comme zone de diagnostic lors du contact entre l'échantillon et de chaque composé réactif 515 sous l'action d'un moyen 205 de conditionnement local de la température (non représenté) ;
• une zone 540 supplémentaire ne comportant ni composé réactif 515, ni composé cible 520, permettant de vérifier que le fluide vecteur ne comporte pas de composé cible 520 et
• une zone 550 supplémentaire comportant le composé cible 520 pour vérifier la capacité de fonctionnement du dispositif 50.
La figure 7 illustre un mode de réalisation particulier du dispositif 60 objet de la présente invention. Dans cette figure 7, on distingue trois composants des composés réactifs décrits ci-dessus. Ces composés réactifs comportent :
- des amorces, c'est à dire de petits brins d'ADN qui reconnaissent spécifiquement une séquence d'ADN ou d'ARN recherchée dans un échantillon, cette séquence étant surnommée « composé cible » dans les figures ci-dessus ;
- des bases désoxyribonucléiques, c'est à dire les briques élémentaires qui forment l'ADN et
- au moins un type d'enzyme capable d'assembler les bases désoxyribonucléiques pour former le brin d'ADN complémentaire de la cible recherché. L'enzyme ne fonctionne que si l'amorce a trouvé une séquence complémentaire. Ce dispositif 60 comporte un substrat poreux 605 comportant une zone
610 de dépôt de fluide vecteur relié à trois canaux, 615, 620 et 625, pour transporter le fluide vecteur par capillarité.
Par le canal 615, ce fluide vecteur est transporté vers une zone 685 comportant une paire d'amorces 665, des bases désoxyribonucléiques et des enzymes 645, sous forme lyophilisée par exemple, pour vérifier que le fluide vecteur ne comporte pas le composé cible 630. Si le composé cible 630 est présent, les amorces 665 et enzymes 645 réagissent avec le composé cible 630 et indiquent à un utilisateur, par le biais d'une sonde fluorescente par exemple, que le composé cible 630 est présent dans le fluide vecteur.
Par le canal 625, le fluide vecteur est transporté vers une zone 680 comportant une paire d'amorces 665, des bases désoxyribonucléiques, des enzymes 645, le composé cible 630 sous forme lyophilisée, par exemple. Au contact du fluide vecteur, les amorces 665, les enzymes 645 et le composé cible 630 réagissent, indiquant à un utilisateur, par le biais d'une sonde fluorescente par exemple, que le dispositif 60 fonctionne convenablement en présence du composé cible 630. Par le canal 620, le fluide vecteur est transporté vers une zone 625 de dépôt d'échantillon, cet échantillon comportant ici le composé cible 630. Cette zone 625 de dépôt d'échantillon est reliée, par un canal 635, à une zone 640 de stockage d'enzymes 645 sous forme lyophilisée. Le fluide vecteur transporte l'échantillon et les enzymes stockés 645 dans trois zones distinctes, 650, 660 et 670, reliées chacune à la zone 640 de stockage par un canal distinct. On entend par éléments « reliés » qu'il existe un agencement de zone(s) et/ou de canal(aux) apte(s) à transporter un fluide vecteur d'un élément à l'autre ou aux autres éléments, par capillarité et/ou par un autre mode d'écoulement fluide dans/sur un substrat poreux 105 entre lesdits éléments. Dans chaque zone, 650, 660 et 670, une paire d'amorces, 655, 665 et 675, différente est placée. Chaque paire d'amorces, 655, 665 et 675, correspond à un diagnostic différent, chaque paire d'amorces, 655, 665 et 675, réagissant avec un composé cible 630 différent ou avec une partie différente d'un composé cible 630.
La figure 8 illustre un mode de réalisation particulier du dispositif 70 objet de la présente invention. Dans cette figure 8, on distingue trois composants des composés réactifs décrits ci-dessus. Ces composés réactifs sont formés :
- d'amorces, c'est à dire de petits brins d'ADN, dits « oligonucléotides », qui reconnaissent spécifiquement une séquence recherchée dans un échantillon, cette séquence étant nommée « composé cible » dans les figures ci-dessus. Ces amorces peuvent être adaptées à détecter la présence d'un agent pathogène, par exemple par RT-RPA ;
- de désoxyribonucléotides (dNTP);
- d'enzymes capables d'assembler les désoxyribonucléotides pour former le brin d'ADN complémentaire du composé cible. Ces enzymes peuvent être des polymérases, dont le fonctionnement requiert, entre autres, que l'amorce trouve une séquence complémentaire. D'autres enzymes peuvent être nécessaires, en particulier lors de la réalisation d'une réaction d'amplification isotherme par RT-RPA dans le dispositif 10, 40, 90. Lors de la réalisation d'une RT-RPA, les enzymes peuvent être des protéines fixant l'ADN simple brin (ou Single-Stranded Binding Protein en anglais, dont l'acronyme est SSB) et/ou des recombinases ayant pour fonction d'hybrider des amorces avec des séquences homologues d'ADN. On utilise des rétrotranscriptases pour détecter un pathogène à partir d'ARN, en particulier un pathogène à génome ARN. Ce dispositif 70 comporte un substrat poreux 705 comportant une zone 710 de dépôt de fluide vecteur relié à un canal 720 pour transporter le fluide vecteur par capillarité. Par le canal 720, le fluide vecteur est transporté vers une zone 725 de stockage d'enzymes 745 sous forme séchée. Cette zone 725 de stockage est reliée à trois canaux, 715, 725 et 735.
Par le canal 715, le fluide vecteur comportant des enzymes 745 est transporté vers une zone 785 comportant une paire d'amorces 765 et des désoxyribonucléotides (dNTP), sous forme lyophilisée par exemple, pour vérifier que le fluide vecteur ne comporte pas le composé cible 730. Si le composé cible 730 est présent, les amorces 765 et enzymes 745 réagissent et indiquent à un utilisateur, par le biais d'une fluorescence par exemple, que le composé cible 730 est présent dans le fluide vecteur. Par le canal 725, le fluide vecteur comportant des enzymes 745 est transporté vers une zone 780 comportant une paire d'amorces 765, des bases désoxyribonucléotides et le composé cible 730 sous forme lyophilisée, par exemple. Au contact du fluide vecteur, les amorces 765 et enzymes 745 réagissent et provoquent une fluorescence indiquant à un utilisateur que le dispositif 70 fonctionne convenablement en présence du composé cible 730.
Par le canal 735, le fluide vecteur comportant des enzymes 745 est transporté vers une zone 740 de dépôt d'échantillon, cet échantillon comportant ici le composé cible 730.
Le fluide vecteur transporte l'échantillon et les enzymes stockés 745 dans trois zones distinctes, 750, 760 et 770, reliées chacune à la zone 740 de stockage par un canal distinct. Dans chaque zone, 750, 760 et 770, une paire d'amorces, 755, 765 et 775, différent est placé. Chaque paire d'amorces, 755, 765 et 775, correspond à un diagnostic différent, chaque paire d'amorces, 755, 765 et 775, réagissant avec un composé cible 730 différent ou avec une partie différente d'un composé cible 730. La figure 9 illustre plusieurs modes de réalisation du dispositif selon l'invention. Le panneau A de la figure 9 illustre une géométrie en vue de dessus de motifs utilisés pour la réalisation d'un dispositif selon l'invention. Dans cet exemple de réalisation, le substrat poreux comporte un empilement 3 de quatre substrats poreux primaires 906, chaque dit substrat poreux primaire 906 comportant au moins un élément choisi parmi un canal et une zone. Plus généralement, le substrat poreux comporte un empilement 3 d'au moins deux substrats poreux primaires 906, chaque substrat poreux primaire 906 comportant un canal et/ou une partie de canal et/ou une zone. Cet exemple de réalisation est adapté à la mise en œuvre du test d'un échantillon comportant un contrôle négatif, c'est-à-dire un contrôle permettant de vérifier que le fluide vecteur ne comporte pas de composé cible 920 et un contrôle positif, c'est-à-dire un contrôle permettant vérifier le fonctionnement du dispositif 90 et de la réaction d'amplification d'ADN. Le substrat poreux 905 utilisé dans cet exemple de réalisation est fabriqué à partir de papier Whatman (marque déposée) de grade 1 pour la chromatographie. Des motifs en cire (108R0090 / 108R0091 / 108R0092 / 108R0093, Xerox, marque déposée) sont imprimés (imprimante Xerox 8570 ColorQube) sur le papier puis par exemple chauffés pendant une minute à 150°C sur une plaque chauffante (Ika, marque déposée, RCT basic). La cire peut ainsi pénétrer les pores du substrat poreux 905. Cette étape de fabrication permet avantageusement l'inactivation d'enzymes telles que des RNAses éventuellement présentes dans le papier. Dans cet exemple de réalisation de l'invention, le dispositif est réalisé par un alignement des motifs suivi du pliage du papier. Le pliage du papier permet l'empilement 3 de plusieurs substrats poreux primaires 906 dont les motifs sont réalisés par une impression. De manière générale, l'empilement 3 ou une partie de l'empilement 3 de substrats poreux primaires 906 d'un dispositif selon un mode de réalisation de l'invention peut être obtenu par pliage d'un substrat poreux initial. Chaque substrat poreux primaire 906 peut être joint à un autre avec un bon contact en appliquant un morceau de rouleau adhésif double-face (Tesa, marque déposée) autours des motifs d'écoulements. Des feuilles de plastique (RT2RR, Sigma, marque déposée) permettent de fermer et d'isoler le dispositif. Des trous sont percés en utilisant un poinçon d'un diamètre de 5 mm dans le revêtement en plastique pour permettre un accès aux entrées et aux sorties du dispositif 90, par exemple pour le dépôt de fluide vecteur. On peut réaliser un réservoir pour le dépôt de fluide vecteur en enrobant l'empilement 3 de plusieurs couches de film plastique puis en les perçant au niveau d'une entrée ou d'une sortie. Ultérieurement, le ou les réservoirs réalisés peuvent être recouverts d'une couche de film plastique, par exemple pour éviter l'évaporation d'un fluide vecteur déposé sur le dispositif.
Dans d'autres modes de réalisation de l'invention, on peut utiliser des matériaux différents de la cire pour réaliser les barrières des canaux ou des zones. On peut par exemple utiliser des matériaux biocompatibles connus, tel que du PDMS (polydiméthylsiloxane) par exemple. La réalisation de barrières en PDMS est moins simple que l'impression de la cire et peut conduire à une résolution spatiale plus faible. Elle sera parfois utilisée dans les exemples suivants mis en œuvre pour vérifier la compatibilité des différents matériaux avec les réactions biologiques réalisées dans le dispositif.
Les lignes en pointillés du panneau A de la figure 9 indiquent les directions du pliage lors de la mise en œuvre du dispositif tel que décrit précédemment. Les quatre substrats poreux primaires 906 sont alignés lors du pliage pour permettre des ouvertures verticales liées aux zones définies par les motifs. Les composantes des différents écoulements fluides dans le dispositif peuvent ainsi être dirigées dans le plan principal d'un substrat poreux primaire 906 ainsi que dans le plan normal au plan principal d'un dit substrat poreux primaire 906.
Avantageusement, la géométrie de la zone de dépôt de fluide vecteur est adaptée à être trempée dans ledit fluide vecteur.
Le dispositif 90 comporte :
- une zone 925 de dépôt de fluide vecteur, adaptée à être en contact, après empilement 3 du substrat primaire de ladite zone 925, à
- une zone 915 comportant au moins un composé réactif ; - trois canaux 935, 945 et 955 adaptés à transporter un fluide vecteur et des composés réactifs depuis la zone 915 à :
• une zone 910 de dépôt d'échantillon ;
· une zone 940 supplémentaire ne comportant aucun composé avant la réalisation d'un test, permettant de vérifier que le fluide vecteur ne comporte pas de composé cible 920 (zone dite de contrôle négatif) ;
• une zone 950 supplémentaire comportant des composés cibles 920 (par exemple un fragment court d'ARN comportant une séquence de l'ARN du virus d'Ebola) adaptée à vérifier le fonctionnement du dispositif 90 et de la réaction d'amplification d'ADN (zone dite de contrôle positif).
Le panneau B de la figure 9, illustre de manière schématique l'agencement des différents substrats poreux primaires 906 d'un dispositif selon l'invention, après pliage du motif décrit dans le panneau A de la figure 9. Les différents substrats poreux primaires 906 sont séparés dans le schéma pour la compréhension des écoulements, différemment de leur agencement dans le dispositif. Les flèches grises illustrent l'écoulement dans un substrat poreux primaire 906 et les flèches blanches illustrent l'écoulement d'un substrat poreux primaire à un autre. Selon ce mode de réalisation de l'invention, les deux zones 910 et 940 sont en contact par l'empilement 3 des substrats poreux primaires 906. Un fluide vecteur mis en contact avec la zone de dépôt de fluide vecteur 925 suit un écoulement au travers de l'ensemble des substrats poreux primaires 906 de bas en haut. L'écoulement d'un fluide vecteur dans le dispositif peut distribuer les composés réactifs présents dans la zone 915 dans les trois canaux 935, 945 et 955 puis dans la zone 910 de dépôt d'échantillon, dans la zone 940 supplémentaire de contrôle négatif et dans la zone 950 supplémentaire de contrôle positif comportant des composés cibles 920. De manière générale, chacune des zones d'un dispositif selon l'invention est reliée aux autres zones par au moins un élément choisi parmi un canal et une zone : cette caractéristique permet à un fluide vecteur déposé sur une zone 125,525,925 de dépôt de fluide vecteur d'être transporté dans chacune des zones du dispositif à partir d'un seul dépôt localisé. Avantageusement, la présence de plusieurs zones (selon ce mode de réalisation, les zones 910, 940 et 950) de test sur le même dispositif permet de réaliser plusieurs expériences en parallèle dans des conditions identiques de température, d'hygrométrie, etc., et ainsi de réaliser une comparaison significative des résultats de détection.
Avantageusement, au moins un dit composé (par exemple un composé réactif et/ou un composé cible 920) est présent dans au moins une des dites zones sous forme lyophilisée. La lyophilisation des différents composés peut être réalisée par exemple pendant 2 heures à -80°C dans un lyophilisateur. Après le dépôt des composés réactifs et leur lyophilisation, l'empilement 3 peut être réalisé par pliage, et le dispositif peut être recouvert d'une feuille imperméable, par exemple en plastique. Le dispositif ainsi conditionné peut être conservé à température ambiante, à l'abri de l'humidité et de la lumière pendant plusieurs jours ou plusieurs semaines. Lors du test, l'expérience consiste à déposer l'échantillon dans la zone 910 de dépôt d'échantillon, fermer les ouvertures avec une feuille imperméable et à plonger la zone de dépôt de fluide vecteur dans ledit fluide vecteur (soit, de manière plus générale, mettre en contact un fluide vecteur avec la zone de dépôt de fluide vecteur 125, 425, 925), par exemple une solution tampon. Après réalisation des réactions biologiques, l'expérimentateur ou l'utilisateur peut examiner des zones de diagnostic 1 10, 410 pour déterminer la présence ou l'absence d'un dit composé cible 120, 420, 920 dans l'échantillon. Dans certains cas, la visualisation directe par l'utilisateur peut être impossible en raison de la configuration du dispositif. La visualisation du résultat peut alors être indirecte, en visualisant des marqueurs colorés ou fluorescents sur d'autres zones du dispositif, provenant d'une zone de diagnostic.
Dans cette réalisation de l'invention, un fluide vecteur comportant des marqueurs a été utilisé pour visualiser l'écoulement dans le dispositif. Cette méthode permet de vérifier l'écoulement des composés réactifs vers les zones de test, l'absence de mélange entre les lignes d'écoulement du test de l'échantillon, des contrôles positifs et négatifs ainsi que les trajectoires des différents composés. La fluorescéine (Réactifs RAL, marque déposée), le Brillant Blue G (Sigma Aldrich) et l'Allura Red AC (Sigma Aldrich) sont utilisés comme marqueurs à une concentration massique de 10~3 g.mL"1. Pour chaque marqueur, une goutte de 5 μΙ_ est déposée sur la surface à marquer, puis séchée. Un fluide vecteur, tel que l'eau, entraîne une désorption des marqueurs et permet leur transport. La figure 10 illustre un mode de réalisation du dispositif selon l'invention.
Le panneau A de la figure 10 illustre une géométrie en vue de dessus de motifs utilisés pour la réalisation d'un dispositif selon l'invention. Dans cet exemple de réalisation, le substrat poreux comporte un empilement 3 de cinq substrats poreux primaires 906, chaque dit substrat poreux primaire 906 comportant au moins un élément choisi parmi un canal et une zone. Cet exemple de réalisation est adapté à la réalisation de tests multiplexés d'un échantillon, chacun des tests comportant un contrôle négatif et un contrôle positif. Les lignes pointillées du panneau A de la figure 9 indiquent les directions du pliage lors de la réalisation du dispositif. Les croix indiquent des zones percées (absence de substrat) avant le pliage du substrat poreux primaire 906.
Dans ce mode de réalisation, le dispositif comporte :
- une zone 925 de dépôt de fluide vecteur ;
- une zone 915 comportant au moins un composé réactif ;
- neuf zones comportant :
• trois zones 916 comportant des amorces spécifiques à la détection d'une première séquence d'ADN,
• trois zones 917 comportant des amorces spécifiques à la détection d'une seconde séquence d'ADN, et
• trois zones 918 comportant des amorces spécifiques à la détection d'une troisième séquence d'ADN.
Une paire d'amorces peut par exemple être adaptée à détecter le virus Ebola ;
- une zone 910 de dépôt d'échantillon ;
- trois zones 950 supplémentaires comportant au moins un composé cible 920 (par exemple un fragment court d'ARN comportant une séquence de l'ARN d'un virus Ebola dans cette réalisation) adaptées à vérifier le fonctionnement du dispositif 90 (zone dite de contrôle positif). Le panneau B de la figure 10, illustre de manière schématique l'agencement des différents substrats poreux primaires 906 d'un dispositif selon l'invention, après un pliage du substrat poreux primaire 906 décrit dans le panneau A de la figure 10. Les différents substrats poreux primaires 906 sont séparés dans le schéma pour la compréhension des écoulements, différemment de leur agencement dans le dispositif. Les flèches pleines représentent schématiquement différents écoulements lors de l'utilisation du dispositif. La flèche en pointillés indique la zone où est déposé l'échantillon lors du test. Dans ce mode de réalisation, un fluide vecteur est pompé par la zone de dépôt de fluide vecteur 925. Il achemine et distribue les composés réactifs présents dans la zone 915 dans une ligne de contrôle et dans une ligne d'échantillon. On entend par ligne une série d'au moins un canal et/ou d'une zone. Ces deux lignes distribuent l'écoulement vers trois zones de tests, trois zones de contrôles positifs et trois zones de contrôles négatifs. La ligne d'échantillon contient une zone de dépôt de l'échantillon 910 et trois zones 916, 917 et 918 comportant des amorces différentes. De cette manière, le test d'un échantillon peut être multiplexé. De la même manière, les lignes de contrôles négatifs et positifs comportent chacune trois zones 916, 917 et 918.
Le panneau C de la figure 10 illustre deux photographies du dispositif selon des réalisations de l'invention décrites dans les panneaux A et B de la figure 10. La photographie de gauche est une vue de dessus du dispositif. Différentes zones visibles permettent l'observation, par exemple en fluorescence, des différents tests d'échantillon, contrôles positifs et contrôles négatifs. La photographie de droite est une vue de dessous du dispositif. Elle illustre une partie des lignes de contrôles positifs et négatifs.
La figure 1 1 illustre un procédé général d'amplification de l'ADN sur un substrat en papier. Le panneau A illustre le dépôt de composés réactifs sur des zones circulaires du substrat en papier. Le dispositif peut ensuite être lyophilisé. Le panneau B illustre la conservation du dispositif. Ledit dispositif peut être par exemple conservé à température ambiante pendant plusieurs semaines. Le panneau C illustre l'initiation de l'étape de test. Un fluide vecteur, par exemple de l'eau ou une solution tampon, peut être déposé en présence ou en l'absence de composés cibles 920 d'ARN (respectivement contrôle positif ou négatif), ou en présence d'un échantillon inconnu. Le panneau D de la figure 1 1 illustre la détection en fluorescence des réactions d'amplification sur papier. Un moyen de conditionnement de la température, par exemple un élément Peltier conditionne la température du substrat entre 20°C et 120°C, préférentiellement entre 25°C et 65°C, et tout préférentiellement entre 30 et 40°C. Le résultat d'un test de l'échantillon, d'un contrôle positif ou négatif peut être avantageusement détecté par fluorescence. Une mesure quantitative de la fluorescence des zones visibles (situées dans un substrat primaire 906 à l'extrémité de l'empilement 3) est réalisée et décrite dans les résultats illustrés dans les figures suivantes en utilisant une source de lumière externe pour l'excitation en fluorescence (Leica EL 6000), un macroscope (Leica Z16 APO, grossissement de 0.57X) et un filtre GFP (Leica). Le filtre comporte un filtre d'excitation centré sur une longueur d'onde de 470 nm +/- 20 nm, un miroir dichroïque centré sur une longueur d'onde de 500 nm et un filtre de suppression centré sur une longueur d'onde de 525 nm +/- 25 nm. Ce montage optique est adapté à la détection de sondes optiques de type FAM (de longueur d'onde d'absorption 495 nm et de longueur d'onde d'émission 520 nm). Les images sont détectées par une caméra EM-CCD (Hamamatsu C900-13), enregistrées à la fréquence d'une image toutes les dix secondes pendant 30 minutes et une exposition de 75 ms. Une synchronisation entre l'ouverture de l'obturateur et l'acquisition de la caméra (EG R&D Vision Delays generator) empêche le blanchiment (bleaching en anglais) des sondes en interaction avec l'échantillon. Les données sont normalisées en soustrayant la première image à chaque séquence. Le signal en fonction du temps correspond à la mesure d'une moyenne du signal sur la surface d'une zone de test, pour chaque image.
Dans d'autres réalisations de l'invention, on peut détecter l'amplification par colorimétrie, par mesure électrique, capacitive ou par mesure du pH.
La figure 12 illustre un dispositif en papier adapté à réaliser une réaction d'amplification de type RT-RPA selon une réalisation de l'invention. Dans des réalisations de l'invention, le dispositif comporte les composés réactifs 1 15 pour réaliser une réaction d'amplification par RT-RPA adaptée à tester l'échantillon. Un exemple d'amplification d'un ARN par RT-RPA est décrit dans la littérature dans Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L, & Armes, N. A., DNA détection using recombination proteins. PLoS biology, 4(7), 2006. La technique d'amplification par RT-RPA peut être adaptée pour la détection d'un microorganisme dans un échantillon en réalisant une transcription inverse d'une région d'un ARN spécifique dudit microorganisme afin d'obtenir un ADNc (ADN complémentaire). On peut par exemple conditionner une zone de diagnostic 105, 405 du dispositif, à une température stationnaire ou constante, de manière à initier une transcription inverse d'ARN. L'ADNc obtenu est ensuite amplifié par RPA (de manière isotherme). Par exemple, la détection des séquences d'ADNc amplifiées peut être réalisée en mesurant la fluorescence associée à l'hybridation d'une sonde nucléotidique fluorescente spécifique de la région amplifiée.
Afin d'illustrer un mode de réalisation de l'invention, les inventeurs de la présente demande ont développé des amorces et des sondes nucléotidiques pour détecter spécifiquement un virus Ebola. Pour cela, les inventeurs se sont basés sur les séquences génomiques de 145 virus Ebola Zaïre (EBOV) disponibles dans les bases de données de séquences (Gire, S. K. et al., Scheiffelin, J. S. (2014). Genomic surveillance élucidâtes Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science, 345(6202), 1369-1372). Sur la base de l'alignement de ces séquences, ils ont déterminé quelles étaient les régions conservées au sein de ces séquences. A partir des séquences consensus, ils ont ensuite conçu six paires d'amorces ciblant des régions conservées. Pour chaque paire d'amorces, différentes sondes fluorescentes ont été créées. Au total, les inventeurs ont testé vingt-quatre couples composés d'une paire d'amorces et d'une sonde fluorescente. Les inventeurs ont également testé un autre couple d'amorces-sonde connu dans la littérature pour permettre la détection du virus Ebola par RT-RPA à partir d'une faible quantité d'ARN (Euler, M et al. (2013). Development of a panel of recombinase polymerase amplification assays for détection of biothreat agents. J Clin Microbiol. 2013 Apr, 51(4):1 110-7) Trois ensembles d'amorces et de sondes qui leurs sont associées sont décrits ultérieurement dans le listage des séquences (ensembles constitués des amorces SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 et SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 8). Ces trois ensembles correspondent à deux régions ciblées de l'ARN d'un virus Ebola.
Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, les amorces pour amplifier une région cible d'un virus Ebola dont la séquence est bornée par les positions 8661 et 8820, peuvent comprendre :
• une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 1 et 2, ou · une paire d'amorces s'hybridant spécifiquement sur la région cible, et dont la position de chaque amorce diffère de ± 5 nucléotides (en particulier de ± 4 nucléotides, de ± 3 nucléotides, ± 2 nucléotides, de ± 1 nucléotide ou de 0 nucléotide) de la position des amorces de séquence SEQ ID NO: 1 et 2, ou
• une paire d'amorces amplifiant spécifiquement la région cible, et dont la taille de la région amplifiée par ces amorces diffère de ± 10 nucléotides (en particulier de ± 9 nucléotides, de ± 8 nucléotides, de ± 7 nucléotides, de ± 6 nucléotides, de ± 5 nucléotides, de ± 4 nucléotides, de ± 3 nucléotides, ± 2 nucléotides, de ± 1 nucléotide ou de 0 nucléotide) de la taille de la région cible, ou
• une paire d'amorces amplifiant spécifiquement la région cible, et dont la séquence de chaque amorce est identique à au moins 95% (plus particulièrement à au moins 96%, à au moins 97%, à au moins 98%, à au moins 99% ou à 100%) à la séquence de chaque amorce de séquence SEQ ID NO: 1 et 2, ou
• une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 4 et 5, ou
• une paire d'amorces s'hybridant spécifiquement sur la région cible, et dont la position de chaque amorce diffère de ± 5 nucléotides (en particulier de ± 4 nucléotides, de ± 3 nucléotides, ± 2 nucléotides, de ± 1 nucléotide ou de 0 nucléotide) de la position des amorces de séquence SEQ ID NO: 4 et 5, ou
• une paire d'amorces amplifiant spécifiquement la région cible, et dont la taille de la région amplifiée par ces amorces diffère de ± 10 nucléotides (en particulier de ± 9 nucléotides, de ± 8 nucléotides, de ± 7 nucléotides, de ± 6 nucléotides, de ± 5 nucléotides, de ± 4 nucléotides, de ± 3 nucléotides, ± 2 nucléotides, de ± 1 nucléotide ou de 0 nucléotide) de la taille de la région cible, ou
• une paire d'amorces amplifiant spécifiquement la région cible, et dont la séquence de chaque amorce est identique à au moins 95% (plus particulièrement à au moins 96%, à au moins 97%, à au moins 98%, à au moins 99% ou à 100%) à la séquence de chaque amorce de séquence SEQ ID NO: 4 et 5.
Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention, les amorces pour amplifier une région cible du virus Ebola dont la séquence est bornée par les positions 17158 et 17274, peuvent comprendre :
• une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 7 et 8, ou
• une paire d'amorces s'hybridant spécifiquement sur la région cible, et dont la position de chaque amorce diffère de ± 5 nucléotides (en particulier de ± 4 nucléotides, de ± 3 nucléotides, ± 2 nucléotides, de ± 1 nucléotide ou de 0 nucléotide) de la position des amorces de séquence SEQ ID NO: 7 et 8, ou
• une paire d'amorces amplifiant spécifiquement la région cible, et dont la taille de la région amplifiée par ces amorces diffère de ± 10 nucléotides (en particulier de ± 9 nucléotides, de ± 8 nucléotides, de ± 7 nucléotides, de ± 6 nucléotides, de ± 5 nucléotides, de ± 4 nucléotides, de ± 3 nucléotides, ± 2 nucléotides, de ± 1 nucléotide ou de 0 nucléotide) de la taille de la région cible, ou
• une paire d'amorces amplifiant spécifiquement la région cible, et dont la séquence de chaque amorce est identique à au moins 95% (plus particulièrement à au moins 96%, à au moins 97%, à au moins 98%, à au moins 99% ou à 100%) à la séquence de chaque amorce de séquence SEQ ID NO: 7 et 8.
Dans des modes de réalisation préférés de l'invention les amorces sont sélectionnées parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 1 -2, 4-5 et 7-8. Dans des modes particuliers de l'invention, les régions cibles amplifiées par les paires d'amorces sont détectées, simultanément ou séquentiellement, par des sondes nucléotidiques.
Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, une sonde nucléotidique pour détecter une région cible d'un virus Ebola dont la séquence est bornée par les positions 8661 et 8820, peut comprendre :
• une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 13, ou
• une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 3, ou • une sonde nucléotidique dont la séquence est complémentaire à la séquence SEQ ID NO: 13, ou
• une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 14, ou
• une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 6, ou · une sonde nucléotidique dont la séquence est complémentaire à la séquence SEQ ID NO: 14.
Dans des modes de réalisation préférés de l'invention, une sonde nucléotidique pour détecter une région cible d'un virus Ebola dont la séquence est bornée par les positions 17158 et 17274, peut comprendre :
• une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 15, ou
• une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 9, ou
• une sonde nucléotidique dont la séquence est complémentaire à la séquence SEQ ID NO: 15.
Préférentiellement, les sondes nucléotidiques sont étiquetées avec au moins un fluorochrome.
Dans des modes particuliers de l'invention, une composition comprenant une paire d'amorces et une sonde nucléotidique est sélectionnée parmi le groupe consistant en : une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 1 -2 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 3 ; une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 1 -2 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 13 , une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 4-5 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 6 ; une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 4-5 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 14 ; une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 7-8 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 9 ; une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 7-8 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 15. Selon l'invention les sondes nucléotidiques se réfèrent aux séquences décrites par leurs SEQ ID NO ainsi qu'à leurs brins complémentaires.
Afin de valider le dispositif de diagnostic, des fragments d'ARN d'un virus Ebola sont synthétisés in vitro. Pour cela, les inventeurs ont synthétisé un ADN correspondant à chacune des régions cibles du génome d'un virus Ebola amplifiées par les paires d'amorces décrites ci-dessus. Chacune de ces séquences d'ADN a été clonée dans un vecteur pRSET en aval d'un promoteur T7 (GeneArt, Life technologies) pour permettre de réaliser une transcription in vitro de la séquence clonée (MEGAscript kit, Ambion technologies). Des quantités préalablement connues de chacun de ces ARN sont utilisées pour déterminer la sensibilité et/ou le seuil de détection du test.
L'amplification par RT-RPA est réalisée en utilisant les réactifs du kit TwistAmp RT-Exo kit, TwistDX, marque déposée). Dans une réalisation de la RT- RPA sur papier, des composés réactifs sont mélangés en solution aqueuse, déposés sur du papier à -20°C et lyophilisés à -20°C pendant 1 heure et 30 minutes.
Avantageusement, la solution aqueuse, comportant un mélange des différents composés réactifs et/ou des composés cibles, est conditionnée à la température de 4°C avant d'être déposée sur le substrat poreux avant la lyophilisation. Un objet de l'invention est un procédé comportant une étape de formation des canaux et des zones dans un substrat poreux 105, comme décrit précédemment, suivi d'une étape consistant à déposer sur une zone dudit substrat poreux 105, 405, 905 au moins un élément choisi parmi des composés réactifs 1 15, 415 et des composés cibles 120, 420, 920 dilués dans une solution aqueuse conditionnée à une température comprise entre 0°C et 10°C, puis de les lyophiliser. Les inventeurs ont découvert que ces deux dernières étapes sont particulièrement avantageuses pour réussir à stocker ou conserver des composés biologiques sur un substrat poreux, en vue d'une réaction adaptée à une détection d'ARN ou d'ADN. Une dernière étape peut consister à sceller ledit substrat poreux dans un feuillet en plastique, pour prévenir l'entrée de tout composé susceptible de dégrader des espèces biologiques lyophilisées pendant le stockage du dispositif. Avantageusement, les composés réactifs comportent des inhibiteurs de
RNAse.
Avantageusement, les composés réactifs comportent des cryoprotecteurs. L'utilisation de cryoprotecteurs peut permettre de conserver une activité normale des différentes enzymes des composés réactifs après réhydratation.
Les inventeurs ont également testé l'influence du sérum sanguin sur l'efficacité de l'amplification RT-RPA dans le dispositif. Dans les expériences des figures ultérieures, les inventeurs décrivent également l'utilisation de sérums humains dans les différents tests, comportant des dilutions de composés cibles 920 ARN. Les différents sérums sont chauffés à 95°C pendant 5 minutes et refroidis sur de la glace pendant deux minutes. L'étape de chauffage et l'eau désionisée dans lequel il est dilué ont pour but de détruire l'enveloppe virale pour permettre de rendre accessible le matériel génomique. Les inventeurs ont également constaté que la température doit au moins être de 95°C si le temps de chauffe est de 5 min. Si la température est plus basse que 95°C alors la durée du chauffage doit être allongée pour obtenir le même résultat.
Les inventeurs ont également validé un dispositif et une méthode de détection d'un virus Ebola selon des modes de réalisation de l'invention en analysant des échantillons d'ARN viral d'un virus Ebola provenant du plasma de patients. Les échantillons sont collectés pendant l'épidémie de 2014 à Macenta, en Guinée, et testés sur place. Les 120 échantillons collectés ont été testés en parallèle avec le dispositif de la présente demande et avec une méthode connue de RT-PCR (RealStar® Ebolavirus RT-PCR Kit 1 .0, Altona Diagnostics) afin de pouvoir comparer les résultats obtenus avec le dispositif de diagnostic à ceux d'une méthode de référence.
Le panneau A de la figure 12 illustre un dispositif de test des réactions de RT-RPA sur papier. Ce dispositif comporte trois zones de test rectangulaires (chacune des zones ayant pour dimensions 3 mm sur 5 mm) ainsi que deux ouvertures circulaires permettant la fixation du dispositif pour une détection en fluorescence.
Le panneau B de la figure 12 illustre une mesure en fluorescence d'une zone de test pendant une RT-RPA adaptée à l'amplification d'un composé cible 920 d'ARN d'un virus Ebola. La courbe (a) correspond à l'amplification d'un échantillon, la courbe (b) correspond à l'amplification d'un composé cible 920 d'ARN préalablement lyophilisé avec l'ensemble des autres composés réactifs (contrôle positif) et la courbe (c) correspond à un contrôle négatif (absence de composé cible 920 d'ARN). Ces mesures sont réalisées en utilisant le dispositif décrit dans le panneau A de la figure 12.
Le panneau C et le panneau D illustrent l'émission en fluorescence pendant une RT-RPA, correspondant à une série d'amorces, de sondes et de composés cibles 920 d'ARN d'un virus Ebola selon l'invention. Les amplifications sont réalisées sur un dispositif décrit dans le panneau A de la figure 12. Trois signaux sont mesurés, au bout de 30 minutes, pour différents ensembles de quatre éléments constitués d'un composé cible 920 d'ARN correspondant à une région cible d'ARN d'un virus Ebola, d'une première amorce, d'une seconde amorce et d'une sonde. Lors de ces réalisations de la RT-RPA sur papier, l'ensemble des composés réactifs sont lyophilisés au préalable sur ou dans le papier. L'émission en fluorescence de la zone de contrôle positif et de la zone de test est supérieure à celle de la zone de contrôle négatif (agencée entre les deux autres zones dans le dispositif décrit dans le panneau A de la figure 12). Le contrôle négatif permet de vérifier que la solution tampon utilisée n'est pas contaminée par un composé cible 920 d'ARN et de vérifier l'absence de fuite entre les différentes zones.
Une comparaison entre cinq composés cibles 920 d'ARN d'un virus Ebola est réalisée sur une série de dispositifs tels que ceux décrits dans le panneau A de la figure 12. Pour chacune des séquences d'un composé cible 920, plusieurs combinaisons des amorces et des sondes sont testées. On dépose dans la zone de test (ST) et dans la zone de contrôle positif (PC) respectivement des dilutions de composés cibles 920 aux concentrations de 1010 copies. mL"1 et de 108 copies. mL"1. Ces tests permettent de réaliser une comparaison de plusieurs composés réactifs impliqués dans la RT-RPA. Les résultats ont été comparés aux résultats obtenus en utilisant des amorces utilisées dans la littérature.
Les inventeurs ont mis en évidence que les couples d'amorces-sonde de RT-RPA qui fonctionnent en tube ne sont pas ceux qui fonctionnent sur papier. Par exemple, les couples d'amorces-sonde connus dans la littérature pour amplifier de faibles quantités d'ARN de virus ne sont pas adaptés à l'amplification sur papier. Le choix des amorces et des sondes n'est donc pas arbitraire. Avantageusement, le substrat poreux est réalisé à partir de papier de cellulose non traité tel que le papier Whatman. Les inventeurs ont mis en évidence que les papiers traités à l'acide et les papiers à base de coton peuvent être incompatibles avec des réactions d'amplification isothermes de l'ADN. La figure 13 illustre un dispositif papier différent de l'invention et un moyen 205 de conditionnement local de température selon une réalisation de l'invention. Le panneau A de la figure 13 est une photographie du moyen 205 de conditionnement local de température selon l'invention. Un dispositif différent de l'invention 206 est placé en contact avec le moyen 205. Avantageusement, le moyen 205 de conditionnement local de température est compact est intégré au dispositif selon l'invention. 207 est une ligne en matériau conducteur, dans cette réalisation en nickel, dessinée sur du papier et connecté à une pile de 9 volts 208. Dans ce mode de réalisation de l'invention, ledit moyen 205 de conditionnement local de la température est un circuit électrique conducteur mis en regard d'un substrat poreux du dispositif. La ligne en matériau conducteur est mise en contact électrique avec des connecteurs 209.
Le panneau B de la figure 13 illustre des résultats expérimentaux de conditionnement de la température. La température mesurée sur trois lignes 207 en matériau conducteur, et mesurée en fonction de la tension appliquée. Chaque ligne en matériau conducteur est caractérisée par une résistance électrique différente: les triangles correspondent à une résistance électrique de 30 Ω, les disques correspondent à une résistance électrique de 80 Ω et les losanges correspondent à une résistance électrique de 2500 Ω. Le moyen 205 de conditionnement local de la température est configuré pour fixer la température desdites zones de dépôt 130 et de diagnostic 1 10 entre 20°C et 120°C, de préférence entre 25°C et 65°C, et tout préférentiellement entre 30°C et 40°C. Les mesures expérimentales sont en accord avec les comportements théoriques (lignes noires). Le panneau C de la figure 13 illustre des résultats expérimentaux de conditionnement de la température. La température des lignes en matériau conducteur est mesurée en fonction de la résistance électrique desdites lignes à tension constante. Les mesures sont en accord avec le comportement théorique (ligne noire).
Le panneau D de la figure 13 illustre des résultats expérimentaux de conditionnement de la température. La cinétique de la température d'une ligne en matériau conducteur est mesurée en imposant une transition de tension de 0 V à 4,4 V (triangles) et de 0 V à 2,7 V (ronds).
Le panneau E de la figure 13 illustre des résultats expérimentaux de conditionnement de la température. La cinétique de la température d'une ligne en matériau conducteur est mesurée en imposant une transition de tension de 4,4 V à 0 V (triangles) et de 2,7 V à 0 V (ronds).
Dans un exemple de réalisation l'invention, le dispositif 10 est chauffé à 40°C. Ce conditionnement de la température peut être réalisé par un élément Peltier (MJ Research PTC 200) pendant 30 minutes. Dans un mode de réalisation de l'invention, on utilise un moyen 205 de conditionnement local de la température intégré au dispositif, tel que le moyen décrit précédemment. La résistance de la ligne de matériau conducteur est déterminée par sa géométrie (épaisseur, longueur, largeur, etc.) et par la conductivité du nickel. Les caractéristiques majeures sont vérifiées expérimentalement. Par exemple, la loi d'Ohm thermique peut être donnée par la formule (1 ) :
T = Tamb + ^ U2 (1 ) où T est la température en Kelvin, Tamb est la température ambiante en Kelvin, Rth est la résistance thermique en Kelvin.Watt"1 et Reiec est la résistance électrique en Ohm. Pour une ligne de matériau conducteur donnée la loi d'Ohm thermique devient : (7 - Tamb) oc U2 . (2)
Cette relation est illustrée dans le panneau B de la figure 13. Pour une tension donnée, la température augmente avec la conductance électrique, comme illustré dans le panneau C de la figure 13. Expérimentalement, un changement de conditionnement d'une température à une autre a lieu en un temps de l'ordre d'une minute comme illustré dans les panneaux D et E de la figure 13. La stabilité de la température dépend des conditions extérieures. La figure 14 illustre la dépendance du matériau des zones ou des canaux en contact avec les composés réactifs de la RT-RPA sur le résultat d'une réaction d'amplification. En effet, l'influence des interfaces et des matériaux constituant les interfaces d'un contenant peut avoir des conséquences dramatiques sur le déroulement d'une réaction d'amplification d'ADN. Le panneau A de la figure 14 illustre la cinétique d'un signal de fluorescence émis lors d'une RT-RPA en tubes pour un contrôle positif (h) et négatif (i). Le panneau B de la figure 14 illustre la cinétique d'un signal de fluorescence émis lors d'une RT-RPA pour un contrôle positif en présence de papier (k), de plastique (j) et de cire (I). Le panneau C de la figure 14 illustre la cinétique d'un signal de fluorescence émis lors d'une RT-RPA pour un contrôle négatif en présence de papier, de plastique et de cire.
L'influence de différents matériaux du dispositif selon l'invention tels que le papier, la cire et une feuille de plastique ont été testés en ajoutant chacun de ces matériaux en tube avec les composés réactifs de la RT-RPA. En présence d'un composé cible 920 d'ARN, ce test permet de détecter les effets inhibiteurs d'un matériau. En l'absence d'un composé cible 920 d'ARN d'un virus Ebola, ce test permet de vérifier qu'un matériau n'est pas responsable d'une augmentation indésirable du bruit en fluorescence. Les résultats présentés dans la figure 14 illustrent des amplifications d'ADN par RT-RPA dans lesquelles ont utilise un composé cible 920 d'ARN à une concentration de 1010 copies. mL"1. Les contrôles positifs (h) et négatifs (i) illustrés dans le panneau A de la figure 14 sont comparés aux expériences comportant un des matériaux parmi une feuille de plastique, du papier et de la cire. Les cinétiques du panneau B de la figure 14 ne permettent pas de déterminer une influence du papier ou de la cire sur la transcription de l'ARN et l'amplification de l'ADN. La présence de cire semble diminuer légèrement le signal de détection de l'amplification. L'inhibition illustrée par la courbe (I) est faible devant l'amplitude du signal. Les cinétiques du panneau C de la figure 14 illustre l'absence de modification du signal de fond dans le cas de contrôle négatifs.
La figure 15 illustre l'influence d'un substrat en papier sur les cinétiques de signal de fluorescence émis lors d'une RT-RPA. Des RT-RPA sont réalisées sur papier dans les cinétiques illustrées par la figure 15, sans lyophilisation des composés réactifs. Les différentes réactions sont réalisées sur un substrat carré en papier comportant quatre zones circulaires permettant de réaliser plusieurs réactions simultanées. Un mélange de l'ensemble des composés réactifs est déposé sur le substrat en papier. Dans une réaction de contrôle positif les composés réactifs comportent un composé cible 920 d'ARN à la concentration de 1010 copies. mL"1. Les substrats en papier sont chauffés à 40°C. Une détection en fluorescence permet de suivre l'amplification de l'ADN transcrit et de discriminer les échantillons positifs et négatifs. Les résultats des réactions sur papier sont comparés avec des réactions identiques en tube. La courbe (m) illustre le signal de fluorescence émis lors de la RT-RPA en présence d'un composé cible 920 d'ARN (contrôle positif) sur papier. La courbe (n) illustre le signal de fluorescence émis lors de la RT-RPA en présence d'un composé cible 920 d'ARN (contrôle positif) sur en tube. La courbe (o) illustre le signal de fluorescence émis lors de la RT-RPA en l'absence d'un composé cible 920 d'ARN (contrôle négatif) sur papier. La courbe (p) illustre le signal de fluorescence émis lors de la RT-RPA en l'absence d'un composé cible 920 d'ARN (contrôle négatif) en tube. Les courbes (m) et (n) présentent des profils similaires et montrent la bonne compatibilité de la réalisation d'une RT-RPA sur un substrat papier.
La figure 16 illustre l'influence de barrières en cire ou en PDMS, du sérum et de la lyophilisation du composé cible 920 d'ARN sur les cinétiques de signal de fluorescence émise lors d'une RT-RPA sur papier. Les expériences illustrées dans la figure 16 sont réalisées sur un substrat carré en papier comportant quatre zones circulaires ou rectangulaires permettant de réaliser plusieurs réactions simultanées. Les composés réactifs sont lyophilisés sur le substrat en papier, selon le protocole décrit précédemment. Ils peuvent être gardés plusieurs jours, à température ambiante, à l'abri de la lumière et de l'humidité. L'échantillon est ensuite déposé, dilué dans un tampon ou dans une solution aqueuse sur le substrat ce qui permet de réhydrater le substrat. Le substrat est ensuite chauffé à 40°C. L'émission en fluorescence est ensuite enregistrée.
Le panneau A de la figure 16 illustre l'effet d'une variation de concentration du composé réactif d'ARN sur la RT-RPA sur papier lors de l'utilisation de cire pour la réalisation des barrières. La courbe (neg) illustre l'émission en fluorescence pour le contrôle négatif (aucune copie de composé cible 920 d'ARN), la courbe (C0) illustre l'émission en fluorescence pour une concentration de 108 copies. mL"1 de composé cible 920 d'ARN, la courbe (Ci) illustre l'émission en fluorescence pour une concentration de 1010 copies. mL"1 de composé cible 920 d'ARN, la courbe (C2) illustre l'émission en fluorescence pour une concentration de 1012 copies. mL"1 de composé cible 920 d'ARN.
Le panneau B de la figure 16 illustre l'effet d'une variation de concentration du composé réactif d'ARN sur la RT-RPA sur papier lors de l'utilisation de PDMS pour la réalisation des barrières. La courbe (neg) illustre l'émission en fluorescence pour le contrôle négatif (aucune copie de composé cible 920 d'ARN), la courbe (C0) illustre l'émission en fluorescence pour une concentration de 108 copies. mL"1 de composé cible d'ARN, la courbe (Ci) illustre l'émission en fluorescence pour une concentration de 1010 copies. mL"1 de composé cible 920 d'ARN, la courbe (C2) illustre l'émission en fluorescence pour une concentration de 1012 copies. mL"1 de composé cible 920 d'ARN.
Le panneau C de la figure 16 illustre l'inhibition par du sérum humain de l'émission en fluorescence lors d'une RT-RPA sur papier. La courbe (q) illustre un contrôle positif sans sérum et la courbe (v) illustre un contrôle négatif sans sérum. La courbe (u) illustre un contrôle négatif en présence de sérum dilué 5 fois dans de l'eau déionisée. La courbe (t) illustre un contrôle positif en présence de sérum dilué 5 fois. La courbe (r) illustre un contrôle positif en présence de sérum dilué 10 fois. La courbe (s) illustre un contrôle positif en présence de sérum dilué 20 fois. Le panneau D de la figure 16 illustre l'influence de la lyophilisation du composé cible 920 d'ARN sur l'émission en fluorescence d'une RT-RPA sur papier. La courbe (IRNA) illustre un contrôle positif dans le cas de l'utilisation de composé cible 920 d'ARN lyophilisé et la courbe (fRNA) illustre un contrôle positif dans le cas de l'utilisation de composé cible 920 d'ARN frais. La courbe noire illustre un contrôle négatif.
Les résultats du panneau A de la figure 16 permettent de conclure à un seuil de détection en composé cible 920 d'au plus 108 copies. mL"1 (i.e. le seuil de détection est au moins inférieur ou égal) dans le cas d'un dispositif papier comportant des barrières en cire. L'étude illustrée par le panneau B de la figure 16 permet de conclure à un résultat similaire : le seuil de détection en composé cible 920 est d'au plus 108 copies. mL"1 (i.e. le seuil de détection est au moins inférieur ou égal) dans le cas d'un dispositif papier comportant des barrières en PDMS. L'expérience de dilution de composés cibles 920 d'ARN dans le sérum permet de mesurer l'importance d'une possible inhibition dans le cas d'échantillon plus réaliste. Pour les cas les plus dilués (courbes (r) et (s)) une légère inhibition est présente : le signal en fluorescence est plus faible que dans le cas sans sérum. La courbe (t) illustre qu'une dilution plus faible du sérum implique une plus forte inhibition.
Dans un mode de réalisation, un dispositif selon l'invention comporte une ligne de contrôle positif et une ligne de contrôle négatif. Le contrôle positif et le contrôle négatif permettent de résoudre des problèmes de l'art antérieur tels que le problème du contrôle de la bonne qualité des composés réactifs du dispositif après stockage, et le contrôle de contamination externe, du fluide vecteur par exemple. Pour réaliser un contrôle positif, le composé cible 920 d'ARN du dispositif peut être lyophilisé pour permettre le transport et la conservation du dispositif. Le panneau D de la figure 16 illustre que les mêmes résultats peuvent être obtenus en utilisant un composé cible 920 d'ARN frais ou lyophilisé. Le dispositif selon l'invention permet ainsi de réaliser un contrôle positif et négatif.
La figure 17 illustre la conservation d'un dispositif d'amplification par RT- RPA sur papier. Les contrôles positifs sont réalisés en utilisant un composé cible 920 d'ARN d'un virus Ebola à une concentration de 1010 copies. mL"1. Le panneau A de la figure 17 illustre plusieurs amplifications après des temps de conservation du dispositif différents et à température ambiante. La courbe (x) illustre un contrôle positif après deux jours de conservation du dispositif, la courbe (w) illustre un contrôle positif après 6 jours de conservation du dispositif, La courbe (y) illustre un contrôle positif après 30 jours de conservation du dispositif. Les courbes noires illustrent les différents contrôles négatifs.
Le panneau B de la figure 17 illustre plusieurs amplifications réalisées après deux jours conservation, à différentes températures, de dispositifs comportant des composés réactifs lyophilisés. La courbe (z) et (ac) illustrent respectivement un contrôle positif et un contrôle négatif pour une conservation préalable du dispositif à température ambiante, la courbe (ab) et (ae) illustrent respectivement un contrôle positif et un contrôle négatif pour une conservation préalable du dispositif à 4°C et la courbe (aa) et (ad) illustrent respectivement un contrôle positif et un contrôle négatif pour une conservation préalable du dispositif -20°C.
Le panneau C de la figure 17 illustre l'influence de la lyophilisation de l'ensemble des composés réactifs et du fluide vecteur sur l'amplification. La courbe (af) illustre un contrôle positif pour un dispositif comportant des composés réactif lyophilisés et dont l'amplification est réalisée en utilisant une solution tampon fraîche comme fluide vecteur et la courbe (ag) illustre un contrôle positif pour un dispositif comportant des composés réactif lyophilisés et dont l'amplification est réalisée en utilisant une solution tampon ayant été lyophilisée comme fluide vecteur. La courbe (ah) est un contrôle négatif.
Dans les différents exemples de la figure 17, la conservation des composés réactifs est testée en réalisant trois dispositifs au même moment. Chaque dispositif est conservé soit deux jours, soit une semaine, soit un mois avant de réaliser une amplification par RT-RPA. Les résultats du panneau A illustrent la possibilité de conserver les dispositifs au moins pendant une semaine sans observer de dégradation des résultats d'amplification. Ils illustrent également la possibilité de réaliser la détection d'un composé cible 920 (ARN d'un virus Ebola à la concentration de 1010 copies. mL"1) après un mois de conservation du dispositif, malgré une légère altération du signal d'amplification. Les résultats du panneau B de la figure 17 illustrent la possibilité de conserver les dispositifs indépendamment à -20°C, 4°C et à température ambiante pour détecter un composé cible 920. La variation du signal positif est, dans cet exemple, plus forte dans le cas d'une conservation à -20°C. Le panneau C de la figure 17 illustre que l'utilisation d'une solution tampon fraîche n'a pas de conséquence positive sur la détection d'un composé cible 920.
La figure 18 illustre la dépendance entre la quantité de composés réactifs déposés sur le substrat en papier et la géométrie des substrats considérés. Le panneau A de la figure 18 illustre une cinétique de l'émission en fluorescence lors d'une RT-RPA sur papier pour différentes quantités de composés réactifs déposés sur le substrat en papier. La courbe (ai) correspond à une condition de dépôt préalable à la réaction d'un volume équivalent à la moitié du volume standard (un volume standard pouvant être compris entre à 40 μ\- et 50 μί), la courbe (aj) correspond à une condition de dépôt préalable à la réaction d'un volume équivalent un quart du volume standard et la courbe (ak) correspond à une condition de dépôt préalable à la réaction d'un volume équivalent à un huitième du volume standard. Les courbes noires correspondent aux contrôles négatifs pour les différentes conditions de volumes déposés.
Le panneau B de la figure 18 illustre l'amplitude du signal en fin de réaction en fonction du volume de solution utilisé pour la réhydratation des composés réactifs. Les points expérimentaux marqués par des triangles correspondent à une concentration de composé cible 920 de 108 copies. mL"1 , les points expérimentaux marqués par des carrés correspondent à une concentration de composé cible 920 de 1010 copies. mL"1 et les points expérimentaux marqués par des triangles correspondent à une concentration de composé cible 920 de 1012 copies. mL"1. La droite noire correspond au signal moyen des contrôles négatifs et les droites pointillées à son erreur type.
La quantité de composés réactifs du dispositif est adaptée à la géométrie du dispositif. Le volume déposé comportant les composés réactifs ainsi que la concentration de la solution comprenant les composés réactifs ont un effet sur la détection. Une faible concentration de réactif tend à augmenter la valeur du seuil de détection et à diminuer la sensibilité. Une forte concentration de composés réactifs tend à inhiber la réaction d'amplification RT-RPA. Les réactions correspondant à la figure 18 sont effectuées sur des dispositifs en papier dont les barrières sont fabriquées en PDMS. Les expériences décrites dans le panneau A de la figure 18 correspondent à un dispositif comprenant un composé cible 920 d'ARN d'un virus Ebola déposé à une concentration de 1012 copies. mL"1. Pour une géométrie de substrat correspondant à une zone en disque de 10 mm de diamètre, la moitié du volume standard correspond à un résultat optimum. Le volume de fluide vecteur utilisé pour la réhydratation des composés réactifs modifie aussi la concentration des réactifs pendant une réaction d'amplification RT-PCR. Un volume optimal différent est observé pour chaque concentration de composé cible 920. La condition de volume V=7,5 μ\- permet, pour la géométrie de substrat considérée d'obtenir de bonnes conditions de détection pour les 108 copies. mL"1 , 1010 copies. mL"1 et 1012 copies. mL"1.
La figure 19 illustre les écoulements dans un dispositif selon l'invention. Le panneau A de la figure illustre l'écoulement dans les différentes zones et canaux du dispositif. La photographie en haut du panneau A de la figure 20 illustre un substrat poreux primaire déplié pendant la fabrication d'un dispositif. Un dispositif décrit dans la figure 20 permet de réaliser un test d'échantillon susceptible de contenir des séquences d'ARN d'un virus Ebola, un contrôle négatif et un contrôle positif. Préalablement à ce test, certains des composés réactifs sont lyophilisés et des composés réactifs dudit dispositif sont agencés dans des porosités d'un substrat poreux primaire 906 protégés par deux substrats poreux primaires 906 située aux extrémités de l'empilement 3 nécessaire à réaliser le substrat poreux, tel que décrit dans la figure 9.
Des expériences impliquant des marqueurs permettent de visualiser les écoulements et de vérifier les fonctions d'un dispositif. Par exemple, 5 μ\- de fluorescéine sont déposés et séchés dans la zone 915 dudit dispositif. Les photographies du bas du panneau A de la figure 20 illustrent une vue de dessus du dispositif avant et après le dépôt d'un fluide vecteur et d'un écoulement dudit fluide dans l'ensemble des zones et des canaux. La photographie en bas à droite du panneau A de la figure 20 confirme que les marqueurs déposés sont bien déposés dans les trois zones d'intérêt. Le panneau B de la figure 20 illustre une expérience similaire, à la différence que les marqueurs sont déposés avant écoulement dans un canal reliant la zone 915 et la zone 950 (partie grisée de la photographie du haut du panneau B de la figure 20). La photographie en bas à droite du panneau B de la figure 20 confirme le transport des marqueurs dans la zone 950 sans mélange après l'écoulement.
La figure 20 illustre les écoulements dans un dispositif selon l'invention. Un dispositif décrit dans la figure 20 permet de réaliser trois tests d'échantillons susceptibles de contenir des séquences d'ARN d'un virus Ebola, trois contrôles négatifs et trois contrôles positifs. Préalablement à ce test, une partie des composés réactifs sont lyophilisés et des composés réactifs dudit dispositif sont agencés dans des porosités d'un substrat poreux primaire 906 et protégés par deux substrats poreux primaires 906 situés aux extrémités de l'empilement 3 nécessaire à réaliser le substrat poreux, tel que décrit dans la figure 9. Le panneau A de la figure 20 comprend deux photographies. La photographie de gauche illustre un dépôt de marqueurs fluorescents sur la zone 915. La photographie de droite illustre le transport des marqueurs fluorescents dans l'ensemble des zones de lecture 919. Le panneau B de la figure 20 comprend deux photographies. La photographie de gauche illustre plusieurs dépôts de marqueurs fluorescents de différentes couleurs (Allura Red AC et Brillant Blue G) sur des zones appartenant à deux lignes différentes. La photographie de droite illustre le transport des marqueurs fluorescents dans l'ensemble des zones de lecture 919. Aucun mélange n'est constaté et les marqueurs sont bien transportés dans leur ligne jusqu'aux zones de lecture 919. Le panneau C de la figure 20 comprend deux photographies. La photographie de gauche illustre un dépôt de marqueurs fluorescents sur la zone de dépôt d'échantillon 915. La photographie de droite illustre le transport des marqueurs fluorescents dans l'ensemble des zones de lecture 919. Les marqueurs fluorescents sont bien transportés uniquement jusqu'aux zones de lecture 919 comprises dans les lignes de test de l'échantillon.
La figure 21 illustre une détection de l'ARN d'un virus Ebola. Le panneau A de la figure 21 illustre les émissions en fluorescence des zones de lecture 919 d'un dispositif selon l'invention, décrit par exemple dans la figure 9. Plusieurs RT- RPA sont réalisées dans chacune des lignes du dispositif.
La courbe (al) correspond à la fluorescence de la zone de lecture 919 de la ligne de test de l'échantillon, la courbe (am) correspond à la fluorescence de la zone de lecture de la ligne de contrôle positif et la courbe (an) correspond à la fluorescence de la zone de lecture de la ligne de contrôle négatif. L'échantillon testé correspond à un échantillon collecté pendant l'épidémie d'Ebola de 2014 à Macenta. Les amorces utilisées correspondent au couple d'amorces de séquence SEQ ID NO: 5 et SEQ ID NO: 6. Ce résultat montre la possibilité de discriminer un échantillon comprenant de l'ARN d'un virus Ebola avec un dispositif comportant les amorces de l'invention.
Le panneau B de la figure 21 illustre les émissions en fluorescence des zones de lecture 919 d'un dispositif selon l'invention, décrit par exemple dans la figure 9. Plusieurs RT-RPA sont réalisées dans chacune des lignes du dispositif. La courbe (al) correspond à la fluorescence de la zone de lecture 919 de la ligne de test de l'échantillon, la courbe (am) correspond à la fluorescence de la zone de lecture de ligne de contrôle positif et la courbe (an) correspond à la fluorescence de la zone de lecture de ligne de contrôle négatif. L'échantillon testé correspond à un échantillon collecté pendant l'épidémie d'Ebola de 2014 à Macenta. Les amorces utilisées correspondent au couple d'amorces de séquence SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2. Ce résultat montre la possibilité de discriminer un échantillon comprenant de l'ARN d'un virus Ebola avec un dispositif comportant les amorces de l'invention.
La figure 22 illustre la dépendance du conditionnement des composés réactifs et des composés cibles 920 sur la cinétique d'émission en fluorescence d'une RT-RPA. Des composés réactifs de RT-RPA sont séchés (non lyophilisés) sur un dispositif tel que celui décrit en figure 1 1 , pendant 1 h à 4°C, puis conservés deux jours à -20°C. Les réactifs contiennent les amorces adaptées pour un composé cible 920 d'ARN d'un virus Ebola (symboles noirs à une concentration de 1010 copies/mL). Les croix représentent les témoins négatifs pour lesquels le milieu réactionnel sur papier est réhydraté avec de l'eau. Les cercles représentent le suivi en fluorescence lorsque le composé cible 920 est apporté au milieu réactionnel. La figure 23 illustre la dépendance du conditionnement des composés réactifs et des composés cibles 920 sur la cinétique d'émission en fluorescence d'une RT-RPA. Les conditions expérimentales correspondant aux courbes de la figures 23 sont les mêmes que celles décrites dans la figure 22, à la différence que le panneau A correspond à une conservation des composés séchés pendant une nuit à -20°C, le panneau B correspond à une conservation des composés séchés pendant une nuit à -4°C et le panneau C correspond à une conservation des composés séchés pendant une nuit à 25°C. La distinction entre positif et négatif est possible lorsque le dispositif est conservé à -20°C.
La figure 24 illustre des tests conduisant au choix des amorces. Des dispositifs en papier tels que celui décrit dans le panneau A de la figure 12 sont préparés pour quatre lots d'amorces différents (identifiés Ref / 5.2 / 4.3 / 4.4 dans le tableau 1 en fin de description). Les courbes ci-dessous illustrent une mesure de fluorescence au cours du temps, de chaque zone (le test de l'échantillon correspond aux cercles gris, le contrôle négatif correspond aux tirets noirs et le contrôle positif aux croix noires dans l'ensemble des panneaux A, B, C et D de la figure 24) pour chaque lot d'amorces, en réponse à un même échantillon de test.
Les lots d'amorces 4.4 et Ref (voir les séquences correspondantes dans le tableau 1 en fin de description) ne sont pas choisis pour la suite des expériences car ils correspondent à un signal non spécifique à partir de 10-15 minutes dans la zone de contrôle négatif. Une expérience supplémentaire sur un autre échantillon permet de choisir entre les amorces 4.3 et 5.2.
La figure 25 illustre des tests conduisant au choix des amorces. Le lot d'amorces 4.3 apparaît comme plus efficace pour la détection du test et dans le fonctionnement des contrôles positifs. On choisit ce lot d'amorces pour la suite des expériences.
La figure 26 illustre l'effet de la lyophilisation de composés cibles 920 et d'un inhibiteur de RNAse sur une réaction de RT-RPA sur papier. Sur un dispositif papier tel que décrit dans la figure 1 1 , les composés réactifs de RT-RPA sont lyophilisés. Des mesures de fluorescence permettent de suivre la réaction lorsque le papier est réhydraté et chauffé. Dans les panneaux A, B et C de la figure 26, les symboles carrés illustrent des contrôles positifs, les tirets illustrent des contrôles négatifs.
La courbe de contrôle positif du panneau A de la figure 26 illustre une mesure de fluorescence lorsque les réactifs sont réhydratés par une solution contenant des composés cibles 920 d'ARN. Dans le panneau B de la figure 26, le composé cible 920 d'ARN est lyophilisé en même temps que les composés réactifs de RT-RPA. L'ajout d'eau permet de réhydrater le milieu réactionnel. Le signal est légèrement plus faible que dans le cas où le composé cible 920 n'est pas lyophilisé mais apporté en solution au moment de l'expérience. Les courbes du panneau C de la figure 24 illustrent une mesure de fluorescence lorsque les composés réactifs, les composés cibles 920 d'ARN sont lyophilisés sur le papier avant l'ajout d'eau.
Taille du
Région SEQ ID
Nom segment Séquence
ciblée NO:
amplifié
Amorce 1
CTACTGTATTTCATAAGAAGAGAGTTGAACC
sens
Amorce
8661 - ATTAGTAGGAGTAATTCCCTATCAGTTAAA 2
4.3 160 anti-sens
8820
ATATGTCCGACCTTGAAAAAAGGATTTTTG[FAM-
Sonde dT][THF][BHQ,-dT]GACAGTAGTTTTTGC[3'- 3 phosphate]
Amorce
CTACTGTATTTCATAAGAAGAGAGTTGAACC 4 sens
Amorce
8661 - ATTAGTAGGAGTAATTCCCTATCAGTTAAA 5
4.4 160 anti-sens
8820
AATCCTTTTTTCAAGGTCGGACATATGTC[FAM-
Sonde dT][THF][BHQ,-dT]AGGTGCTGGAGGAAC[3'- 6 phosphate]
Amorce
CTACTGAGTCCAGTATAGAGTCAGAAATAGTA 7 sens
Amorce
17158- CTGAGTTGTTAAGAATAATCTCAATTTGGT 8
5.2 117 anti-sens
17274
AATGACTACTCCTAGGATGCTTCTACCTGT[FAM-
Sonde dT] [THF] [BHQrdT] GTCAAAATTCCATAA[3' - 9 phosphate]
Amorce
GACGACAATCCTGGCCATCAAGATGATGATCC 10 sens
Amorce
1775- 169 (Euler, M CGTCCTCGTCTAGATCGAATAGGACCAAGTC 11
Réf. anti-sens
1943 et al. (2013))
GATGATGGAAGCTACGGCGAATACCAGAG[FAM-
Sonde dTJTITHFlCIBHQ^dTlCGGAAAACGGCATGIS'- 12 phosphate]
Tableau 1 - correspondance des séquences

Claims

REVENDICATIONS
Dispositif (10, 40, 90) de diagnostic par amplification d'ADN, caractérisé ce qu'il comporte : un substrat poreux (105, 405, 905) comportant au moins:
• une zone de dépôt d'échantillon (130, 410, 910), ledit échantillon comportant au moins un composé cible (120, 420, 920) ;
· une pluralité de canaux (135, 140, 430, 935, 945, 955) positionnés dans l'épaisseur dudit substrat poreux ;
• une zone (1 10, 410, 915), dite « zone de diagnostic », comportant au moins un composé réactif (1 15, 415) adapté à réagir avec un dit composé cible ;
· une zone de dépôt d'un fluide vecteur (125, 425, 925) adapté à être transporté par capillarité dans l'ensemble desdites zones et desdits canaux : chacune desdites zones étant reliée aux autres par au moins un élément choisi parmi un canal et une zone,
- un moyen (205) de conditionnement local de la température de la zone de diagnostic.
2. Dispositif selon la revendication 1 dans lequel lesdits composés réactifs comportent au moins des amorces (655, 665, 675), des recombinases, des polymérases et des protéines fixant et maintenant l'ADN simple brin, lesdits composés réactifs étant agencés dans les pores desdites zones dudit substrat (105, 405, 905) poreux.
3. Dispositif selon la revendication 2 dans lequel lesdites amorces sont adaptées à détecter la présence d'un agent pathogène par RT-RPA.
4. Dispositif selon la revendication 3 dans laquelle ledit agent pathogène est le virus Ebola.
Dispositif selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel au moins un dit composé (1 15) réactif est agencé dans ou sur ledit substrat (105, 405, 905) poreux sous forme lyophilisée.
Dispositif selon la revendication 5 dans lequel ledit substrat poreux (105, 405, 905) comporte un empilement (3) d'au moins deux substrats poreux primaires (906), chaque dit substrat poreux primaire (906) comportant au moins un élément choisi parmi un canal, une partie de canal et une zone.
Dispositif selon la revendication 6 dans lequel ledit empilement (3) de dits substrats poreux primaires est obtenu par pliage
Dispositif selon l'une des revendications 1 à 7 comportant au moins une zone (155) supplémentaire comportant au moins un composé (1 15) réactif de la zone (1 10) de diagnostic reliée à la zone (125) de dépôt d'un fluide vecteur par une succession d'au moins un élément choisi parmi un canal et une zone différente d'une zone (130, 410, 910) de dépôt d'échantillon.
Dispositif selon la revendication 8 dans lequel au moins un dit composé choisi parmi un composé (1 15) réactif et un composé cible (120, 420, 920) est agencé dans ou sur ledit substrat (105, 405, 905) poreux sous forme lyophilisée.
10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 9 comportant au moins une zone (165) supplémentaire comportant au moins un dit composé (1 15) réactif, et au moins un composé cible (120, 420, 920), reliée à la zone (125) de dépôt d'un fluide vecteur par une succession d'au moins un élément choisi parmi un canal et une zone différente d'une zone (130, 410, 910) de dépôt d'échantillon.
1 1 . Dispositif selon l'une des revendications 1 à 10 comportant un moyen (150, 205) de conditionnement local de la température de la zone de dépôt d'échantillon.
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 1 1 , dans lequel ledit substrat poreux (105) comporte au moins une feuille de papier.
13. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 12, dans lequel ledit moyen (150, 205) de conditionnement local de la température comporte un circuit électrique conducteur mis en regard dudit substrat (105) poreux.
14. Dispositif selon la revendication 13 comportant:
- une couche (210) de support du circuit électrique conducteur et
- une couche (215) étanche, la couche étanche étant positionnée de manière intercalaire entre le substrat (105) poreux et la couche de support.
15. Dispositif selon l'une des revendications 13 à 14, dans lequel ledit circuit électrique conducteur est supporté par une feuille de papier distincte dudit substrat poreux (105, 405, 905).
16. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 15, dans lequel au moins un canal (135, 140) est délimité par des régions dudit substrat poreux (105, 405, 905) imprégnées de cire solide.
17. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, dans lequel au moins un canal (135, 140) est formé par un contraste hydrophile-hydrophobe dans l'épaisseur dudit substrat poreux (105).
18. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 17, dans lequel ledit moyen (205) de conditionnement local de la température est configuré pour fixer la température d'au moins une zone entre 20°C et 120°C et préférentiellement entre 30°C et 40°C.
19. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 18, dans lequel au moins un dit composé (1 15) réactif est adapté à changer de couleur au contact d'un dit composé cible (120, 420, 920).
20. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 19, dans lequel au moins un dit composé (1 15) réactif est adapté à émettre un signal de fluorescence au contact d'un dit composé cible (120, 420, 920).
21 . Dispositif selon l'une des revendications 1 à 20 dans lequel lesdits composés réactifs (1 15, 415) comprennent au moins une paire de dites amorces (655, 665, 675) sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 1 -2 ; SEQ ID NO: 4-5 ; et SEQ ID NO: 7-8.
22. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 21 dans lequel lesdits composés réactifs (1 15, 415) comprennent au moins une sonde nucléotidique sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13, 14 et 15.
23. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 22 dans lequel lesdits composés réactifs (1 15, 415) comprennent au moins une composition d'oligonucléotides comprenant une paire d'amorces et une sonde, sélectionnée parmi le groupe consistant en une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 1 -2 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 3; une paire d'amorce de séquence SEQ ID NO: 4-5 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 6 ; et une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 7-8 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 9.
24. Procédé de détection d'ARN comprenant au moins les étapes consistant à :
- déposer un dit échantillon sur au moins une dite zone de dépôt d'échantillon (130, 410, 910) d'un dit dispositif selon l'une des revendications 1 à 23; - mettre en contact un dit fluide vecteur avec ladite zone de dépôt de fluide vecteur (125, 425, 925) dudit dispositif ;
- conditionner une température stationnaire d'au moins une dite zone de diagnostic (105, 405) de manière à initier une transcription inverse d'ARN et à amplifier une séquence de nucléotides sélectionnée au préalable, et de manière isotherme ;
- examiner lesdites zones de diagnostic (1 10, 410) pour déterminer la présence ou l'absence d'un dit composé cible (120, 420, 920).
25. Procédé selon la revendication 24 dont la troisième étape comprend une amplification de séquences de nucléotides par RT-RPA (transcription inverse et amplification par polymérase assistée de recombinases).
26. Une paire d'amorces sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 1 -2 ; SEQ ID NO: 4-5 ; et SEQ ID NO: 7-8.
27. Une sonde sélectionnée parmi le groupe consistant en SEQ ID NO: 3, 6, 9, 13, 14 et 15.
28. Une composition d'oligonucléotides comprenant une paire d'amorce et une sonde, sélectionnée parmi le groupe consistant en une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 1 -2 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 3; une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 4-5 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 6 ; et une paire d'amorces de séquence SEQ ID NO: 7-8 et une sonde nucléotidique de séquence SEQ ID NO: 9.
29. Procédé de fabrication d'un dispositif selon l'une des revendications 1 à 23 comprenant au moins les étapes consistant à :
- former des zones et des canaux dans un dit substrat poreux (105, 405, 905) en chauffant ledit substrat poreux (105, 405, 905) pendant au moins une minute à une température supérieure ou égale à 100°C et préférentiellement supérieure ou égale à 150°C ; - déposer sur une zone dudit substrat poreux (105, 405, 905) au moins un élément choisi parmi des composés réactifs (1 15, 415) et des composés cibles (120, 420, 920) dilués dans une solution aqueuse conditionnée à une température comprise entre 0°C et 10°C, et les lyophiliser ;
- sceller ledit substrat poreux dans un feuillet en plastique.
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