CN117751196A - 固相介质上的环介导等温扩增(lamp) - Google Patents

Abstract

本公开涉及环介导等温扩增(LAMP)反应组件，其包括与固相反应介质组合的基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物。本公开还包括用于色度LAMP分析的系统，所述系统包括基本上非反应性固相反应介质，和非干扰试剂混合物。本公开还包括固相LAMP反应介质，其包括基板、设置在所述基板上的粘合剂层、设置在所述粘合剂层上的反应层和设置在所述反应层上的展开层。本公开还包括测试目标核苷酸序列的存在的方法，所述方法包括提供生物样品，并将所述样品分配到具有与LAMP试剂混合物和pH敏感染料组合的固相反应介质的测试环境中。

Description

固相介质上的环介导等温扩增(LAMP)

相关申请

本申请要求2021年1月15日提交的美国临时专利申请序列号63/138,316和63/138,318的权益，其每一个都通过引用并入本文。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)是一种分子生物学技术，其允许核苷酸扩增以用于各种分析目的。定量PCR(qPCR)是PCR的一种改进，其允许监测靶标核苷酸的扩增。诊断qPCR已应用于检测指示感染性疾病、癌症和遗传异常的核苷酸。逆转录PCR(RT-PCR)是qPCR的一种改进，其允许检测目标RNA核苷酸。由于这种能力，RT-PCR非常适合检测病毒病原体。然而，RT-PCR使用的大型设备在某些即时医疗(point of care)环境中可能无法使用。此外，RT-PCR使用经过培训的人员、大量的样品制备以及执行和获得结果的时间。

相比之下，环介导等温扩增(LAMP)是一种更简单的目标核苷酸诊断鉴定方法。具体地，LAMP是用于倍增具体核苷酸序列的单操作核酸扩增方法。除了使用等温加热过程之外，LAMP还可使用简单的视觉输出测试指示(如颜色变化)而非PCR使用的更复杂的荧光指示。逆转录LAMP(RT-LAMP)可以像RT-PCR一样使用以从RNA中鉴定目标核苷酸，并因此能够以诊断能力来使用以鉴定病毒病原体的存在或不存在。由于LAMP更加简单，因此其可使用更少的设备和样品制备来执行，并因此更容易在诊所、急诊室等即时医疗环境中使用，甚至可以在移动基础(mobile basis)上使用。

发明内容

本公开涉及用于在固相介质上使用环介导等温扩增(LAMP)检测目标核苷酸的技术(例如，方法、系统和组件)。在一些方面中，可知晓目标核苷酸存在于感兴趣的病原体中。在病原体是病毒的情况下，LAMP分析可以是逆转录(RT)RT-LAMP分析。

在一些公开实施方式中，LAMP反应组件可包括与固相反应介质组合的基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物。一方面，固相介质可以是亲水的、吸收性的和多孔的。

一方面，固相介质可基本上不含镁干扰剂。另一方面，镁干扰剂可包括含镁化合物和干扰镁的螯合剂。

另一方面，固相介质可以是纤维素基介质。一方面，纤维素基介质可具有在约30和约600之间的表面积与厚度比。另一方面，纤维素基介质可具有大于约1微米且小于约100微米的孔径。一方面，固相介质可包括纸。另一方面，固相介质可包括玻璃纤维。又另一方面，固相介质可包括尼龙、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素或亲水聚四氟乙烯(PTFE)，或其组合。

另一方面，LAMP反应组件还可包括基本上不含镁干扰剂和吸湿剂的粘合剂。另一方面，LAMP反应组件还可包括比固相反应介质亲水性低的展开层(spreading layer)。

在另一个公开实施方式中，制造如前文叙述的LAMP反应组件的方法可包括将基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物与固相反应介质组合使得试剂混合物保持与固相反应介质接触。

一方面，方法可包括使用不变色添加剂控制变色。另一方面，不变色添加剂可包括糖、缓冲剂、阻断剂或其组合。另一方面，不变色添加剂可包括糖，糖包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖或其组合中的一种或多种。另一方面，不变色添加剂可包括阻断剂，阻断剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其组合。

在另一个公开实施方式中，执行LAMP分析的方法可包括提供如前文叙述的LAMP反应组件，将生物样品施加到反应组件，将组件加热到足以引发LAMP反应的温度，和维持温度足以完成LAMP反应的时间。一方面，生物样品可以是唾液、粘液、血液、尿液、粪便、汗液、呼出气冷凝物或其组合中的一种或多种。另一方面，生物样品可以是唾液。一方面，方法还可包括检测病毒病原体。另一方面，LAMP分析可以是逆转录LAMP(RT-LAMP)。

在另一个公开实施方式中，用于色度LAMP分析的系统可包括基本上非反应性固相反应介质，和非干扰试剂混合物。一方面，基本上非反应性固相反应介质可以是亲水的、吸收性的和多孔的。另一方面，基本上非反应性固相反应介质可基本上不含氧化剂、pH干扰剂或其组合。

一方面，基本上非反应性固相反应介质可具有约0.01mM至约5mM的缓冲能力。另一方面，基本上非反应性固相反应介质在与pH敏感染料组合时在测试范围内具有最大吸收波长(λ_max)。另一方面，基本上非反应性固相反应介质可包括纤维素或玻璃纤维。另一方面，系统还可包括粘合剂、展开层、间隔件、塑料载体或其组合。一方面，粘合剂、展开层、间隔件或塑料载体中的每一个可基本上不含氧化剂和pH干扰剂。另一方面，非干扰试剂混合物还可包括一种或多种目标引物、DNA聚合酶或再增溶剂(re-solubilization agent)。

在另一个公开实施方式中，最大化固相pH依赖性LAMP分析中色度输出信号的准确度的方法可包括提供最小化非LAMP反应产生的变色的固相反应介质，和在固相反应介质上执行LAMP分析。一方面，方法可包括控制非LAMP反应产生的质子引起的非LAMP反应产生的变色。另一方面，方法可包括使用不变色添加剂控制非LAMP反应产生的变色。一方面，不变色添加剂可包括糖、缓冲剂、阻断剂或其组合。另一方面，不变色添加剂可包括糖，糖包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖或其组合中的一种或多种。另一方面，不变色添加剂可包括阻断剂，阻断剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其组合。

在又一个公开实施方式中，最大化LAMP分析中的检测水平(LOD)的方法可包括提供最小化非LAMP反应产物的反应环境和试剂。

在又一个公开实施方式中，用于色度LAMP分析的系统可包括固相反应介质和LAMP试剂的组合，当在选定温度(例如，约25℃的室温)下储存时，所述组合维持固相反应介质的色彩，所述色彩具有在固相介质的初始色调的10％以内的色调。一方面，当储存超过30天、90天、365天、2年或5年中的一个或多个时，所述组合可维持色彩。另一方面，当在约40％和90％之间的相对湿度下储存时，所述组合可维持色彩。另一方面，选定温度可以是范围在约-20℃和约37℃之间的任意温度。

在又一个公开实施方式中，用于制造如前文叙述的色度LAMP系统的方法可包括将非干扰试剂混合物与基本上非反应性固相反应介质组合使得非干扰试剂混合物保持与基本上非反应性固相反应介质接触。一方面，方法可包括制备含有非干扰试剂混合物的溶液，和将试剂混合物涂布到基本上非反应性固相反应介质上。另一方面，涂布可包括将溶液滴落、喷涂、浸渍、浸泡或喷雾到基本上非反应性固相反应介质上。另一方面，可使用卷对卷(reel-to-reel,R2R)方法将非干扰试剂混合物与基本上非反应性固相反应介质组合。

在又一公开实施方式中，固相LAMP反应介质可包括基板、设置在基板上的粘合剂层、设置在粘合剂层上的反应层或设置在反应层上的展开层。一方面，基板可以是光学透明材料。另一方面，粘合剂层可基本上不含挥发性剂。另一方面，其中粘合剂层可不连续地设置在基板上。另一方面，基板可以是光学透明的塑料载体。

一方面，固相LAMP反应介质还可包括测试区域。一方面，测试区域可由至少两段不连续的粘合剂层限定。另一方面，测试区域可由至少三段不连续的粘合剂层限定。另一方面，测试区域可由至少四段不连续的粘合剂层限定。

一方面，固相LAMP反应介质还可包括至少一个基本上不含试剂的段。另一方面，反应层可包括试剂，试剂包括一种或多种目标引物、DNA聚合酶或再增溶剂。另一方面，试剂可形成足以进行LAMP反应的组合物。一方面，反应层可以是不连续的。

另一方面，固相LAMP反应介质还可包括展开层，展开层包括玻璃纤维、尼龙、纤维素、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、聚酯、亲水聚四氟乙烯(PTFE)或其组合中的一种或多种。一方面，展开层可以是光学透明的。

另一方面，固相LAMP反应介质可包括间隔件材料。一方面，间隔件材料可包括玻璃纤维、尼龙、纤维素、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、聚苯乙烯、聚酯、亲水聚四氟乙烯(PTFE)或其组合中的一种或多种。另一方面，间隔件材料可与反应层在同一平面中定向并且在反应层的段之间定向。另一方面，反应层可具有约30至约600的表面积与厚度比。另一方面，反应层可具有约0.05mm至约2mm的厚度。另一方面，反应层可具有约4mm至约12mm的宽度和约4mm至约25mm的长度。另一方面，反应层的段之间的最小间距可在约1.8mm和约2.2mm之间。

在另一个公开实施方式中，用于测试病毒病原体的存在的方法可包括提供来自对象的唾液样品，和将样品分配到具有与LAMP试剂混合物和pH敏感染料组合的固相反应介质的测试环境中。一方面，方法可包括最小化能够使固相介质变色的挥发性剂、吸湿剂和非pH敏感剂的量。另一方面，方法可包括提供足以促进LAMP反应的量的一种或多种目标引物、DNA聚合酶或再增溶剂。另一方面，方法可包括提供足以促进逆转录LAMP(RT-LAMP)反应的量的逆转录酶。另一方面，方法可包括提供足以检测病毒病原体的量的一种或多种目标引物。另一方面，方法可包括在将样品分配到测试环境中后不到一小时生成测试结果。

在又一个公开实施方式中，确认唾液样品对于用固相LAMP反应测试的适用性的方法可包括提供具有至少一个测试位点或测试点和阴性对照位点的固相反应介质。一方面，所述至少一个测试位点或测试点可包括LAMP试剂和pH敏感染料的组合。另一方面，阴性对照位点可包括pH敏感染料并且可不包括LAMP试剂。另一方面，方法可包括将唾液样品施加到固相反应介质。另一方面，方法可包括确认阴性对照位点上pH敏感染料的活化。

一方面，pH敏感染料可以是酚红、酚酞、石蕊精、溴百里酚蓝、萘酚酞(naphtholphthalein)、甲酚红中的至少一种，或其组合。另一方面，LAMP试剂可基本上不含挥发性试剂、影响pH的试剂、含镁试剂或其组合。另一方面，LAMP试剂可包括不干扰LAMP的试剂，包括DNA聚合酶、逆转录酶、目标区用引物或其组合。

另一方面，方法还可包括提供由至少两段不连续的粘合剂层限定的测试位点或测试点。另一方面，方法可包括提供由至少三段不连续的粘合剂层限定的测试位点或测试点。

在又一个公开实施方式中，最大化来自固相LAMP反应的阳性测试结果的准确度的方法可包括提供具有至少三个测试位点或测试点的固相反应介质，每个测试位点或测试点包括共同的pH敏感染料和LAMP试剂的组合，其中每个位点包括来自目标病原体的不同引物序列。一方面，方法可包括引发LAMP反应。另一方面，方法可包括当测试位点或测试点中的至少两个活化pH敏感染料并且经历从第一颜色向第二颜色的变化时，确认阳性测试结果。另一方面，方法还可包括提供足以促进逆转录LAMP反应的量的逆转录酶。

一方面，pH敏感染料可以是酚红、酚酞、石蕊精、溴百里酚蓝、萘酚酞、甲酚红中的至少一种，或其组合。另一方面，LAMP试剂可基本上不含挥发性试剂、影响pH的试剂、含镁试剂或其组合。

另一方面，目标病原体可包括病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或原生动物病原体。一方面，目标病原体可包括病毒病原体。一方面，病毒病原体可包括dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、正链ssRNA病毒、负链ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒或ds-DNA-RT病毒。一方面，每个引物序列可与来自病毒目标的序列匹配，病毒目标包括H1N1、H2N2、H3N2、H1N1pdm09或SARS-CoV-2。

在一个公开实施方式中，测试目标核苷酸序列的存在的方法可包括提供生物样品，将样品分配到具有与环介导等温扩增(LAMP)试剂混合物和pH敏感染料组合的固相反应介质的测试环境中。

另一方面，测试环境可基本上不含挥发性试剂、影响pH的试剂、干燥剂或其组合。一方面，方法可包括以约0.1℃/秒的速率升高测试环境温度。另一方面，方法可包括在测试环境中提供变率小于1℃的加热均匀性。另一方面，方法可包括提供包括纤维素或玻璃纤维的固相反应介质。一方面，方法可包括提供足以促进逆转录LAMP(RT-LAMP)反应的量的逆转录酶。

一方面，生物样品可以是唾液、粘液、血液、尿液或粪便、汗液、呼出气冷凝物中的至少一种，或其组合。一方面，方法可包括使用唾液采集装置、鼻拭子、血液采集装置、尿液采集装置、汗液采集装置、呼出气冷凝物采集装置或粪便采集装置中的一种或多种来采集生物样品。

另一方面，目标核苷酸序列可来自病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或原生动物病原体中的至少一种。一方面，目标核苷酸序列可来自病毒病原体。一方面，病毒病原体可选自冠状病毒科(Coronoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)和细小病毒科(Parvoviridae)。另一方面，病毒病原体可选自：严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征(MERS)、流感和H1N1。一方面，目标核苷酸序列可来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)病原体。

在又一个公开实施方式中，生物样品测试设备可包括基板，基板接合与脱水的环介导等温扩增(LAMP)试剂混合物和脱水的pH敏感染料组合的固相反应介质，其中当在室温下储存6个月后，设备提供至少约95％的测试准确度。一方面，当在室温下储存12个月后，设备可提供至少约95％的测试准确度。另一方面，当在室温下储存2年后，设备可提供至少约95％的测试准确度。

在又一个公开实施方式中，生物样品测试系统可包括基板，基板接合与脱水的环介导等温扩增(LAMP)试剂混合物和脱水的pH敏感染料组合的固相反应介质，所述壳体可操作以接收生物样品。一方面，生物样品测试系统可包括加热器，加热器被配置以将容器等温加热到足以引发和维持LAMP试剂混合物之间的LAMP反应的内部温度。另一方面，生物样品测试系统可包括生物样品达到用于通过pH敏感染料生成测试结果的时间。

一方面，基板可包括光学透明材料。另一方面，基板可通过粘合剂接合固相反应介质。另一方面，粘合剂可以是基本上光学透明的。另一方面，基板可包括壳体的一部分。

另一方面，生物样品测试系统可包括设置在基板上的粘合剂层、设置在粘合剂层上的反应层和设置在反应层上的展开层。一方面，生物样品测试系统还可包括与反应层在同一平面中定向的间隔件层。另一方面，壳体可抵靠基板设置。另一方面，壳体还可抵靠展开层设置。另一方面，壳体可基本上包围基板、粘合剂层、反应层和展开层。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本公开的特征和优点将变得明显，附图以示例的方式一起示出了本公开的特征；并且，其中：

图1描绘了根据示例实施方式的执行LAMP分析的方法；

图2描绘了根据示例实施方式的最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法；

图3a示出了根据示例实施方式的具有三个测试区段的固相LAMP反应介质；

图3b示出了根据示例实施方式的具有两个测试区段的固相LAMP反应介质；

图3c示出了根据示例实施方式的具有四个测试区段的固相LAMP反应介质；

图3d示出了根据示例实施方式的具有三个测试区段并且没有展开层的固相LAMP反应介质；

图3e示出了根据示例实施方式的具有两个测试区段并且没有展开层的固相LAMP反应介质；

图3f示出了根据示例实施方式的具有四个测试区段并且没有展开层的固相LAMP反应介质；

图4描绘了根据示例实施方式的测试病毒病原体的存在的方法；

图5描绘了根据示例实施方式的确认唾液样品对于用固相LAMP反应测试的适用性的方法；

图6描绘了根据示例实施方式的最大化来自固相LAMP反应的阳性测试结果的准确度的方法；

图7描绘了根据示例实施方式的测试目标核苷酸序列的存在的方法；

图8a描绘了根据示例实施方式的生物测试试剂盒的操作；

图8b示出了根据示例实施方式的生物测试试剂盒的色表；

图9示出了根据示例实施方式的纸基LAMP组件；

图10示出了根据示例实施方式的1级和222级色谱纸的材料筛选；

图11显示了根据示例实施方式的在液体中使用掺入水中的热灭活SARS-CoV-2的反应；

图12示出了根据示例实施方式的纸条形式；

图13示出了根据示例实施方式的固相LAMP反应介质；

图14示出了根据示例实施方式的固相LAMP反应介质；

图15A示出了根据示例实施方式的1级色谱纸和222级色谱纸之间的比较；

图15B示出了根据示例实施方式的在RT-LAMP反应混合物的不同起始pH下并入干燥时的RT-LAMP；

图16示出了根据示例实施方式的测试条形式；

图17示出了根据示例实施方式的测试条组装过程；和

图18A示出了根据示例实施方式的生物测试系统的操作。

图18B示出了根据示例实施方式的生物测试系统的操作；

图19A-19F示出了根据示例实施方式的纸基装置的示意图和比色表征；

图20A-20C示出了根据示例实施方式的纸上比色响应的数字分析；

图21A示出了根据示例实施方式的在各种热灭活SARS-CoV-2浓度下对装置的验证；

图21B示出了根据示例实施方式的在各种pH值下的酚红颜色校准；

图21C示出了根据示例实施方式的在变化的模板浓度下RT-LAMP比色响应的绿色通道颜色强度；

图21D示出了根据示例实施方式的在色谱纸上使用EBT作为比色报告剂(reporter)的LAMP；

图21E示出了根据示例实施方式的在各种纸上使用EBT作为指示剂的LAMP的比色响应；

图21F示出了根据示例实施方式的在biodyne A两性纸上使用EBT作为比色指示剂的LAMP检测；

图21G示出了根据示例实施方式的在干燥之后单一反应物的消除对纸的初始颜色的影响；

图21H示出了根据示例实施方式的海藻糖和吐温20对RT-LAMP比色响应的影响；

图21I示出了根据示例实施方式的唾液处理对比色响应的影响；

图22A示出了根据示例实施方式的板对RT-LAMP比色响应的影响；

图22B示出了根据示例实施方式的盖对RT-LAMP比色响应的影响；

图22C示出了根据示例实施方式的加热方法对RT-LAMP比色响应的影响；

图22D示出了根据示例实施方式的升温速率(ramp rate)对RT-LAMP比色响应的影响；和

图23A和23B示出了根据示例实施方式的比色感知调查。

现在将参考所示的示例性实施方式，并且本文将使用具体的语言来对其描述。然而应当理解，并不由此意在限制技术范围。

实施方式的描述

在描述发明实施方式之前，应当理解，本公开不限于本文公开的特定结构、方法步骤或材料，而是扩展到相关领域普通技术人员将认识到的其等同物。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定示例或实施方式的目的，而不意在是限制性的。不同附图中相同的参考编号代表相同的元件。流程图和过程中提供的数字是为清楚地示出步骤和操作而提供的，而不一定指示特定的顺序或序列。

此外，所描述的特征、结构或特性可在一个或多个实施方式中以任意合适的方式组合。在以下描述中，提供了许多具体细节，如组合物、剂型、治疗等的示例，为的是提供对各种发明实施方式的透彻理解。然而，相关领域技术人员将认识到这样的详细实施方式并不限制本文阐述的总体发明构思，而仅仅是对其的代表。

定义

应当注意，如本文所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。因此，例如，对“赋形剂”的提及包括对此类赋形剂中的一种或多种的提及，以及对“载体”的提及包括对此类载体中的一种或多种的提及。

如本文所用，术语“制剂”和“组合物”可互换使用，并且是指两种或更多种化合物、元素或分子的混合物。在一些方面中，术语“制剂”和“组合物”可用于指一种或多种活性剂与载体或其它赋形剂的混合物。

如本文所用，术语“可溶的”是物质或剂关于其溶解在给定溶剂中的能力的量度或特性。物质或剂在组合物的特定组分中的溶解度是指物质或剂在指定温度如约25℃或约37℃下溶解形成视觉上澄清的溶液的量。

如本文所用，术语“亲脂性”是指不易溶于水的化合物。相反，术语“亲水性”是指可溶于水的化合物。

如本文所用，“对象”是指动物。一方面，动物可以是哺乳动物。另一方面，哺乳动物可以是人。

如本文所用，“非液体”当用于指代本文公开的组合物的状态时，是指该组合物的物理状态为半固体或固体。

如本文所用，“固体”和“半固体”是指组合物在标准温度和压力下支撑其自身重量并且具有足够的粘度或结构而不自由流动的物理状态。半固体材料在施加的压力下可共形于容器的形状。

如本文所用，“固相介质”是指非液体介质。在一个示例中，非液体介质可以是具有多孔表面的材料。在另一个示例中，非液体介质可以是具有纤维表面的材料。在另一个示例中，非液体介质可以是纸。

如本文所用，“固相介质”、“固相基底”、“固相基板”、“固相测试基板”、“固相检验基板”、“固相反应介质”等在本文中可互换使用并且是指非液体介质、装置、系统或环境。在一些方面中，非液体介质可基本上不含液体或完全不含液体。在一个示例中，非液体介质可包括或是多孔材料或具有多孔表面的材料。在另一示例中，非液体介质可包括或是纤维材料或具有纤维表面的材料。在又一示例中，非液体介质可以是纸。

如本文所用，“不变色添加剂”是指最小化或防止固相介质的颜色出于除了其上或其中发生的LAMP反应造成的核苷酸扩增的原因外，从原始颜色或起始颜色向不同颜色发生颜色变化的添加剂。例如，在一个实施方式中，这种颜色变化与不变色添加剂不存在时将发生的颜色变化相比，能够被最小化或减少。

如本文所用，“非LAMP反应产生的变色”是指固相介质并非因LAMP反应造成的核苷酸扩增所致的任何变色(例如，颜色从原始颜色变为另一种颜色)。在一些示例中，非LAMP反应产生的变色可指由以下中的一种或多种引起的固相介质的变色：挥发性剂、镁干扰剂、氧化剂、除LAMP反应造成的扩增外的原因所致的pH变化、干燥或其组合。

如本文所用，“挥发性剂”是指包括具有高蒸气压或低沸点的组合物的剂。在一个示例中，硫酸铵可以是挥发性剂，因为铵离子能够挥发并留下硫酸根。在一个示例中，当组合物在高于约30℃的温度下处于气相时，组合物可具有高蒸气压。在一个示例中，当组合物在低于约80℃的温度下处于气相时，组合物可具有低沸点。

如本文所用，“干燥剂”是指当与对不含该剂的固相介质干燥相比时增强固相介质的干燥的剂。

如本文所用，“pH干扰试剂”是出于除LAMP反应造成的扩增外的原因而能够影响反应、系统或环境的pH的试剂。在一个示例中，铵离子可从硫酸铵中挥发，而硫酸根离子可反应形成硫酸并在不存在LAMP反应造成的扩增的情况下影响反应的pH。

如本文所用，“非pH敏感剂”是基本上不受pH变化影响的试剂。

在本公开中，“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”和“具有”等可具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可意为“包括(includes)”、“包括(including)”等，并且一般理解成开放式术语。术语“由……组成(consisting of)”或“由……组成(consists of)”是封闭术语，并且仅包括连同此类术语具体列出的部件、结构、步骤等，以及符合美国专利法的部件、结构、步骤等。“主要由……组成(consisting essentiallyof)”或“主要由……组成(consists essentially of)”具有美国专利法一般赋予它们的含义。具体地，除了允许包括对连同其使用的项目(一个或多个)的基本和新颖特征或功能不产生实质影响的其它项目、材料、部件、步骤或元件，此类术语一般是封闭术语。例如，即使未在此类术语后面的项目列表中明确叙述，存在于组合物中但不影响组合物本性或特性的微量元素如果在“主要由……组成”的语言下存在，也将是允许的。当在书面描述中使用开放式术语如“包含”或“包括”时，应理解“主要由……组成”这一语言以及“由……组成”这一语言也应当给予直接的支持，就好像明确阐述一样，反之亦然。

说明书和权利要求中的术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等(如果有的话)用于区分相似的元件，而不一定用于描述特定的次序上或时间上的顺序。应当理解，如此使用的任何术语在适当的情况下都是可互换的，使得本文描述的实施方式能够例如以除本文示出或以其它方式描述的序列之外的序列操作。类似地，如果本文将方法描述为包括一系列步骤，则本文所呈现的此类步骤的顺序不一定是可执行此类步骤的唯一顺序，并且可以省略所述步骤中的某些和/或可以将本文未描述的某些其它步骤添加到该方法中。

如本文所用，比较术语如“增加的”、“减少的”、“更好的”、“更差的”、“更高的”、“更低的”、“增强的”、“最大化的”、“最小化的”等是指装置、组分、组合物或活性的特性与周围或邻近区域中的、位置类似的、单个装置或组合物或多个相当的装置或组合物中的、一组或一类的、多个组或多个类的其它装置、组分、组合物或活性相比，或与已知技术状态相比是可测量地有所不同的。

如本文所用的术语“耦接”被定义为以化学、机械、电的或非电的方式直接或间接地连接。本文中描述为彼此“邻近”的对象可彼此物理接触、彼此紧密靠近或彼此在同一个一般性的区或区域中，视该短语所使用的语境而定。“直接耦接”的物体、结构、元件或特征彼此接触，并且可以是附接的。此外，如在本书面描述中所用，应当理解当使用术语“耦接”时，也给予了“直接耦接”的支持，反之亦然。

如本文所用，术语“基本上”是指动作、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完全或近乎完全的程度或度。例如，“基本上”包围的物体将意味着该物体是完全包围的或是近乎完全包围的。在一些情况下，偏离绝对完全的确切的可允许度可能取决于具体环境。然而，一般来说，近乎完全将具有与获得绝对和全部完全相同的总体结果。当“基本上”用于否定含义时，它的使用同等适用于指代完全或近乎完全缺少动作、特性、性质、状态、结构、项目或结果。例如，“基本上不含”颗粒的组合物完全缺少颗粒，或近乎完全缺少颗粒，而效果将与其完全缺少颗粒近乎相同。换句话说，“基本上不含”某成分或元素的组合物可能实际上仍然含有此类项目，只要不存在其可测量的效果即可。

如本文所用，术语“约”用于通过规定给定值可以“略高于”或“略低于”端点来为数值范围端点提供灵活性。除非另有说明，否则根据具体数字或数值范围对术语“约”的使用也应理解为对此类不含术语“约”的数值术语或范围提供支持。例如，为方便和简洁起见，“约50埃至约80埃”的数值范围也应理解为对“50埃至80埃”的范围提供支持。此外，应当理解，在本说明书中即使当术语“约”与其一起使用时，也提供了对实际数值的支持。例如，“约”30的叙述应解释为不仅对略高于和略低于30的值提供支持，还对实际数值30提供支持。

如本文所用，为方便起见，多个项目、结构元素、组成元素和/或材料可呈现在共同列表中。然而，这些列表应解释为好像列表中的每个成员被独立地标识为单独且唯一的构件一样。因此，在无相反指示的情况下，此类列表的任何单个成员都不应仅基于其在共同群组中的呈现而被解释为是同一列表的任何其它成员的事实上的等同物。

浓度、量、水平和其它数值数据可在本文中以范围格式表示或呈现。应当理解，这样的范围格式仅仅是为方便和简洁而使用的，因此应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围界限的数值，还包括涵盖在该范围内的所有单个数值或子范围或小数单位，就好像每个数值和子范围都被明确叙述一样。作为说明，“约1至约5”的数值范围应解释为不仅包括明确叙述的约1至约5的值，还包括所指示范围内的单个值和子范围。因此，包括在此数值范围内的是诸如2、3和4的单个值和诸如1-3、2-4和3-5的子范围等，以及单独的1、2、3、4和5。这一同样的原理适用于仅叙述一个数值作为最小值或最大值的范围。此外，不管所描述的范围或特征的广度如何，这种解释都适用。

在本说明书全文中对“示例”的引用意味着有关该示例描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一个实施方式中。因此，在本说明书全文的多个位置出现的短语“在一个示例中”不一定都指同一实施方式。

具体实施方式

很多对病原体(例如，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，即导致COVID-19的病毒)的分子检测可能局限于实验室并因此具有显著的滞后时间(>24小时)才能提供结果，从而妨碍它们在即时医疗环境中的采用。尽管数次尝试开发针对SARS-CoV-2的即时医疗检测，但仍然存在一些局限性：i)可扩展性(scalability)(测试需求约为每周数百万次，但制造这种规模的新测试是有困难的)，ii)样品处理(很多测试在使用唾液时仍采用提取操作)，和iii)可读出性(分子测试经常使用荧光，因此需要荧光读出器来报告结果)。

可通过利用纸基装置和逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)，采用即时医疗测试来克服目前的测试方法，纸基装置和逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)使用稀释的唾液(例如，在水中为5％v/v)作为样品，在60分钟内报告病原体(例如，SARS-CoV-2)存在时的颜色变化。RT-LAMP是在恒温下进行的核酸扩增技术，具有足够的诊断性能，特别是在感染的急性期。由于RT-LAMP可在恒温下进行，因此并不使用昂贵的热循环设备。此外，现有LAMP产物比色报告剂不使用荧光读出器。因此，此测试适合在即时医疗环境中使用并且顺应于(amenable to)快速开展和扩大规模，使其适合在公共卫生紧急情况下使用。

RT-LAMP可在微流纸基分析装置(microfluidic paper-based analyticaldevices,μPAD)上实施以检测各种病原体(例如，SARS-CoV-2)，其中可使用便携式电子装置进行图像分析以区分阳性应答和阴性应答。在一个示例中，纸上的高对比度RT-LAMP反应可提供肉眼可见的颜色变化。此外，代替使用蜡印(wax-printing)——其将会要求精确的印刷区域对准和试剂分配，聚苯乙烯间隔件就可用于防止样品之间的串扰(crosstalk)。聚苯乙烯间隔件顺应于卷对卷(roll-to-roll)制造，以供扩大生产规模。

基于核酸的COVID-19诊断方法采用预处理来提供结果。如本文公开的，SARS-CoV-2的纸上比色检测可用最少的预处理来进行。装置可具有无需预扩增即可在纸上检测SARS-CoV-2的灵敏度和特异性。在溶液中进行的其它测定在制造过程中可能不如纸基测定那样具有可扩展性。另外，本文公开的测定采用可在数秒内完成的稀释操作，而其它测定则采用各种操作如用蛋白酶处理、热灭活和/或RNA提取来检测SARS-CoV-2(操作在至少10分钟内才能完成并且还使用其它设备)。

固相介质上LAMP反应用材料组件

由于涉及性能要求，在固相介质上进行LAMP反应可能会比较困难。例如，为了最大化检测准确度，固相介质应当支持LAMP反应而不干扰其或LAMP反应指示剂。在高水平下，用生物样品水合固相介质以使LAMP反应进行，此后读出结果。然而，各种试剂可能会干扰LAMP反应或随后对结果的读出。为了最小化误差，可小心谨慎地最小化或避免因以下方面可能造成的挑战：提供生物样品、将固相介质与样品水合、将LAMP试剂整合到固相介质中、进行LAMP分析以及获得能够毫无困难地判读的清楚的测试输出信号。

鉴于上述背景，在一个公开实施方式中，环介导等温扩增(LAMP)反应组件可包括基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物与固相反应介质组合。当基本上不含吸湿剂时，LAMP试剂混合物可最小化或避免固相反应介质干燥过程中出现的难题。当使用吸湿剂时，它们或固相反应介质可能不会完全干燥，或在储存后可能会再水合达到一定程度，并且可能会干扰固相反应介质的原始颜色，这样会扭曲LAMP过程的测试结果。

在一个示例中，吸湿剂可以是当在25℃下、在约40％与约90％相对湿度(RH)之间时吸收超过约10wt％的剂。一方面，吸湿剂可包括但不限于甘油、乙醇、甲醇、氯化钙、氯化钾、硫酸钙等或其组合中的一种或多种。在一些示例中，含有吸湿剂如甘油的LAMP反应可能会导致固相介质中试剂不稳定，因为吸湿剂会吸引水。因此，应避免在固相反应介质中使用过量的吸湿剂。

此外，另一方面，基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物可包含DNA聚合酶、逆转录酶、目标引物或其组合中的一种或多种。当LAMP反应是LAMP反应或逆转录LAMP(RT-LAMP)反应时，可包括DNA聚合酶。此外，当LAMP反应是RT-LAMP反应时，基本上不含吸湿剂的LAMP试剂还可包括用于将RNA逆转录成cDNA的逆转录酶。

一方面，固相反应介质可基本上不含镁干扰剂。镁可通过几种方式干扰LAMP反应。首先，镁可以是DNA聚合酶的辅因子，并且应严密地监测其处于目标浓度范围内以使DNA聚合酶促进LAMP反应。其次，当将镁敏感指示剂用于LAMP反应时，镁干扰剂则可能会使LAMP反应的结果无效或使结果分析错综复杂。

因此，另一方面，镁干扰剂可包括含镁化合物和干扰镁的螯合剂。一方面，镁干扰剂可基本上不含镁，镁包括但不限于：Mg²⁺、Mg¹⁺、碳酸镁、氯化镁、柠檬酸镁、氢氧化镁、氧化镁、硫酸镁、七水合硫酸镁等，或其组合。由于某些固相反应介质可能具有一定缓冲能力、残留离子或可能会干扰镁的螯合剂，因此镁——BST酶(例如，DNA聚合酶)的辅因子——的浓度可能会受到影响并干扰LAMP反应。因此，镁的浓度应控制在镁的目标范围内以促进LAMP反应。一方面，组合物可含有少于1.0wt％、0.5wt％、0.1wt％或0.01wt％的镁中的一种或多种。

固相反应介质可具有数种特性以促进LAMP反应。一方面，固相反应介质可以是亲水的、吸收性的、多孔的和惰性的。当液滴的表面与边缘之间的接触角小于约90度时，固相反应介质可以是亲水的。正如通过纸所能摄取液体量的程度测量的，固相反应介质可以是吸收性的。当固相反应介质的孔径大于至少1微米且小于或等于约100微米、约75微米、约50微米、约25微米、约10微米、约5微米或约1微米中的一种或多种时，固相反应介质可以是多孔的。当固相反应介质不干扰LAMP反应时，该介质可以是惰性的。当固相反应介质不干扰LAMP反应产生的指示时，该介质也可以是惰性的。

有多种材料是固相反应介质可包含或包括的。一方面，固相反应介质可包含尼龙、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、亲水聚四氟乙烯(PTFE)等或其组合中的一种或多种。另一方面，固相反应介质可以是纤维素基介质，如1级色谱纸、222级色谱纸等，或其组合。

除了固相反应介质的材料类型外，固相反应介质还可具有数种物理性质——其能够适应或增强LAMP反应和避免干扰由LAMP反应产生的指示或信号输出。一方面，固相反应介质可具有约30和约600之间的表面积与厚度比。另一方面，固相反应介质可具有约60和约400之间的表面积与厚度比。一方面，固相反应介质可具有约100和约200之间的表面积与厚度比。另一方面，固相反应介质可以是纤维素基介质，其可具有约30和约600之间的表面积与厚度比。一方面，纤维素基介质可具有大于至少1微米且小于或等于约100微米、约75微米、约50微米、约25微米、约10微米、约5微米或约1微米中的一个或多个的孔径。

固相反应介质的厚度可促成LAMP反应的总反应时间、通过固相反应介质的流速、使用比色指示剂时的颜色对比度、比色结果的均一性、固相反应介质中试剂的浓度等。

一方面，固相反应介质可包括222级色谱纸，其提供的均匀性相对于1级色谱纸的均匀性是增加的，因为222级色谱纸厚于1级色谱纸。因此，与1级色谱纸相比，222级色谱纸可将试剂集中(concentrate)在更小的表面积内。一方面，色谱纸可以是222级，其表面积为约5mm乘约5mm以提供所需的表面积与厚度比。在一个示例中，1级色谱纸可具有长度为20mm、宽度为5mm、厚度为0.18mm的横截面尺寸以提供约555的表面积与厚度比。在另一个示例中，222级色谱纸可具有长度为5mm、宽度为5mm、厚度为0.83mm的横截面尺寸以提供约30的表面积与厚度比。因此，此示例示出与约555的表面积与厚度比(例如，对于1级色谱纸)相比，约30的表面积与厚度比(例如，对于222级色谱纸)可提供增加的均匀性。

除了本文公开的材料外，固相反应介质还可包括纸或玻璃纤维中的一种或多种。在一个示例中，纸可包含α纤维素、β纤维素、γ纤维素等或其组合中的一种或多种。在另一个实施方式中，玻璃纤维可包括A-玻璃、E-玻璃、S-玻璃、R-玻璃、C-玻璃、T-玻璃、D-玻璃、M-玻璃、ECR玻璃等或其组合中的一种或多种。

在一些示例中，反应组件可包括粘合剂。例如，粘合剂可用于将固相反应介质的各个段彼此粘合。在一个示例中，反应组件还可包括基本上不含镁干扰剂、吸湿剂或其组合的粘合剂。粘合剂可基本上不含镁干扰剂以避免镁与DNA聚合酶之间的干扰以及避免在使用镁基指示剂时读出LAMP结果时的错综复杂。

在一些示例中，反应组件还可包括展开层。展开层可促进生物样品在固相反应介质的整个不同区段中的均匀展开。在另一个示例中，展开层的亲水性可小于固相反应介质。亲水性小于固相反应介质的展开层可促进生物样品的均匀展开，因为生物样品将从亲水性小的展开层向亲水性大的固相反应介质扩散。

试剂混合物相对于固相反应介质的配置可影响LAMP反应。在一个实施方式中，制造如本文叙述的LAMP反应组件的方法可包括将基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物与固相反应介质组合使得试剂混合物保持与固相反应介质接触。在一个示例中，试剂混合物可保持与固相反应介质直接接触。在另一个示例中，试剂混合物可保持与固相反应介质间接接触。当试剂混合物保持与固相反应介质间接接触时，中间材料(例如，抗氧化剂)可增强LAMP反应。

在某些情况下，固相反应介质的颜色可能会受到并非由LAMP反应产生的剂的影响。例如，硫酸铵等挥发性剂可形成硫酸根离子，硫酸根离子可反应形成硫酸。当使用基于pH的指示剂读出LAMP反应的结果时，这些非LAMP反应会妨碍结果的正确读出或使对结果的判读更加复杂。

一方面，方法可包括使用不变色添加剂控制变色。不变色添加剂可包括糖、缓冲剂、阻断剂等，或其组合。在一个示例中，糖可包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖等或其组合中的一种或多种。在另一个示例中，阻断剂可包括牛血清白蛋白、酪蛋白等，或其组合。

糖可防止非LAMP试剂pH变化的影响。缓冲剂可通过防止除LAMP反应以外的因素引起的pH变化的影响，来防止对LAMP反应或LAMP反应的结果的干扰。阻断剂可通过阻断各种酶(如RNase或DNase)对待分析核酸(例如，来自病毒的RNA或来自病原体的DNA)的作用来防止除LAMP反应外的因素的影响。

在另一个实施方式中，如图1所示，执行LAMP分析的方法100可包括提供如本公开叙述的LAMP反应组件，如框110所示。方法还可包括将生物样品施加到反应组件，如框120所示。方法还可包括将组件加热到足以引发LAMP反应的温度，如框130所示。方法还可包括维持温度达足以完成LAMP反应的时间，如框140所示。

一方面，生物样品可以是唾液、粘液、血液、尿液、粪便、汗液、呼出气冷凝物或其组合中的一种或多种。另一方面，生物样品可以是唾液。另一方面，方法还可包括检测病毒病原体。另一方面，LAMP分析可以是逆转录LAMP(RT-LAMP)。

另一方面，足以引发LAMP反应的温度可在约50℃至约60℃的温度范围内。另一方面，足以引发LAMP反应的温度可在约60℃至约70℃的温度范围内。在另一个示例中，等温温度可以是相差小于5℃的范围内的温度。另一方面，可将温度维持在足以完成LAMP反应的温度达长于以下中的一个或多个：15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟或120分钟。另一方面，可将温度维持在足以完成LAMP反应的温度达短于以下中的一个或多个：15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟或120分钟。

可将LAMP反应组件制造成增强其均匀性、其保质期或储存期以及其测试有效性。一方面，可使用以下中的一种或多种来制造LAMP反应组件：切割(slitting)(将卷分割成更薄的卷)、单片化(singulation)(通过切断器(guillotine)、旋转模具(rotary die)或激光切割成单个件)、试剂涂布(试剂浸渍、喷雾或分配并干燥)、卡片层压(card lamination)(将塑料背衬添加到卷轴)等，或其组合。在一个示例中，可使用以下中的一种或多种来制造LAMP反应组件：将卷分割成更薄的卷；通过切断器或旋转模具切割成单个件；使用试剂浸渍来涂布试剂、使用添加到卷轴的塑料背衬进行卡片层压等，或其组合。

固相介质上基于pH的LAMP分析用材料

当存在吸湿剂和镁干扰剂时，在固相反应介质上进行LAMP反应可能比较困难。然而，还有其它因素会干扰LAMP反应结果的输出和判读。当涉及基于pH的指示剂时，那么试剂混合物应基本上不含干扰试剂。在一些示例中，干扰试剂可包括氧化剂和pH干扰剂。

在一个实施方式中，用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统可包括基本上非反应性固相反应介质，和非干扰试剂混合物。一方面，基本上非反应性固相反应介质可基本上不含氧化剂和pH干扰剂。一方面，非干扰试剂混合物可包含一种或多种目标引物、DNA聚合酶、再增溶剂或其组合。

氧化剂可干扰LAMP反应。因此，氧化剂不应包含在基本上非反应性固相反应介质中。一方面，氧化剂可包括但不限于以下中的一种或多种：O₂、O₃、H₂O₂、F₂、Cl₂、卤素、HNO₃、硝酸盐、H₂SO₄、H₂S₂O₈、H₂SO₅、次氯酸盐、亚氯酸盐、氯酸盐、高氯酸盐、铬化合物、高锰酸盐、过硼酸钠、一氧化二氮、NO₂、N₂O₄、KNO₃、NaBiO₃、铈化合物、二氧化铅等，或其组合。

在某些情况下，仅仅避免使用氧化剂可能不足以促进LAMP反应。在这种情况下，可添加其它试剂以防止不希望的氧化。一方面，非反应性固相反应介质可包括以下中的一种或多种：氧吸收剂、干燥剂等，或其组合，以防止非反应性固相反应介质的氧化。另一方面，为了防止包含纤维素的非反应性固相反应介质的氧化，可通过热循环纤维素以使氧化位点饱和来预处理纤维素。在另一个示例中，可添加抗氧化剂来防止氧化。另一方面，染料指示剂(例如，酚红)可具有抗氧化作用。一方面，基本上非反应性固相反应介质可包含少于1.0wt％、0.5wt％、0.1wt％或0.01wt％的氧化剂中的一个或多个。

除了氧化剂之外，pH干扰剂还会妨碍对LAMP反应结果的正确判读，或使LAMP反应的信号输出进一步复杂化。一方面，pH干扰剂可包括但不限于以下中的一种或多种：挥发性试剂、影响pH的试剂、含镁试剂或其组合。

当包含影响pH的试剂时，那么由此产生的pH变化可能会使对LAMP反应基于pH的结果的分析复杂化。在某些情况下，可对影响pH的试剂的包含进行补偿，并且可调整分析以实现充分的测试判读。然而，在其它情况下，影响pH的试剂可能会将不明确性引入基于pH的结果的判读中。

在一个示例中，基本上非反应性固相反应介质可基本上不含影响pH的试剂。一方面，影响pH的试剂可包括酸、碱或其组合，它们可干扰pH敏感信号。一方面，基本上非反应性固相反应介质可包含少于1.0wt％、0.5wt％、0.1wt％或0.01wt％的影响pH的试剂中的一种或多种。

当非反应性固相反应介质上包含挥发性试剂时，挥发性组分会挥发并留下可能会干扰pH敏感输出信号的组分，或留下可能会进一步反应以干扰pH敏感输出信号的组分。在一个示例中，碳酸铵可形成挥发的铵离子和反应形成碳酸的碳酸根离子。碳酸可通过在LAMP反应无阳性结果(例如，存在目标病原体和LAMP引发的扩增)的情况下降低pH来干扰pH敏感输出信号。因此，在一个示例中，非反应性固相介质可基本上不含本文所定义的挥发性剂。

当含镁试剂包含在非反应性固相反应介质上时，如若未严密监测，含镁试剂可能会干扰DNA聚合酶的操作。因此，在一个示例中，基本上非反应性固相反应介质可基本上不含如本文另外公开的镁试剂。

基本上非反应性固相介质可由各种材料组成。一方面，基本上非反应性固相反应介质可包括玻璃纤维、尼龙、纤维素、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、亲水PTFE等，或其组合。另一方面，如本文所公开的，基本上非反应性固相反应介质可以是亲水的、吸收性的、惰性的和多孔的。

非反应性固相介质的缓冲能力可影响LAMP反应。例如，强缓冲剂可防止待从LAMP反应中检测到的pH变化。然而，即使没有LAMP引发的扩增，弱缓冲剂也可能导致pH大幅波动。一方面，基本上非反应性固相反应介质可具有约0.01mM至约5mM的缓冲能力。在一个示例中，热灭活病毒可以约500个拷贝/25μl样品体积的检测极限掺入生物储库唾液(bio-banked saliva)中。然而，生物储库唾液的缓冲能力和pH可能与新鲜采集的唾液不同。因此，可根据生物储库唾液与新鲜采集的唾液之间的缓冲能力差异和pH差异调整新鲜采集的唾液的检测极限(LOD)。

在一些示例中，来自非反应性固相反应介质的pH敏感输出信号可由技术人员在没有专用仪器的情况下进行判读。然而，比色读出器可提供另外水平的精确度和准确度。例如，在一个示例中，当与pH敏感染料组合时，基本上非反应性固相反应介质可具有测试范围内的最大吸收波长(λ_max)。在一个示例中，当pH敏感染料是酚红时，λ_max可在约443nm至约570nm的测试范围内。因此，当pH敏感染料是酚红且最大吸光度波长在测试范围内时，技术人员可使用比色读出器检测阳性或阴性结果。

在一些方面中，系统还可包括其它除非反应性固相反应介质外的组分。一方面，系统还可包括粘合剂、展开层、间隔件、塑料载体或其组合。一方面，粘合剂、展开层、间隔件和塑料载体中的每一个可基本上不含如本文公开的氧化剂和pH干扰剂。

在另一个实施方式中，如图2所示，最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法200可包括：提供最小化非LAMP反应产生的变色的固相反应介质，如框210所示，和在固相反应介质上执行LAMP分析，如框220所示。

一方面，方法还可包括控制非LAMP反应产生的质子引起的非LAMP反应产生的变色。另一方面，方法还可包括使用不变色添加剂控制非LAMP反应产生的变色。

不变色添加剂可防止非LAMP扩增导致比色响应出现不希望的变化。一方面，不变色添加剂可包括糖、缓冲剂、阻断剂等，或其组合。

在一个示例中，糖可包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖等或其组合中的一种或多种。一方面，当用于固相介质上时，糖的浓度可为约0.01mM至约1M。在另一个示例中，当用于固相介质上时，糖的浓度可为约10mM至约500mM。在又一个实施方式中，当用于固相介质上时，糖的浓度可为约200mM至约400mM。

在另一个示例中，缓冲剂可包括以下中的一种或多种：磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Dulbecco氏PBS、Alsever氏溶液、Tris缓冲盐水(TBS)、水、HEPES、BICINE、平衡盐溶液(BSS)(如Hank氏BSS、Earle氏BSS、Grey氏BSS、Puck氏BSS、Simm氏BSS、Tyrode氏BSS、BSS Plus)、Ringer氏乳酸盐溶液、生理盐水(即0.9％盐水)、1/2生理盐水等，或其组合。一方面，当用于固相介质上时，缓冲剂的浓度可为约10μM至约20mM。在另一个示例中，当用于固相介质上时，缓冲剂的浓度可为约100μM至约10mM。在又一个示例中，当用于固相介质上时，缓冲剂的浓度可为约100μM至约500μM。

在另一个示例中，阻断剂可包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其组合中的一种或多种。一方面，当用于固相介质上时，阻断剂的浓度可为约0.01wt％至约5wt％。在另一个示例中，当用于固相介质上时，阻断剂的浓度可为约0.01wt％至约1wt％。在又一个示例中，当用于固相介质上时，阻断剂的浓度可为约0.02wt％至约0.06wt％。

在另一个实施方式中，最大化环介导等温扩增(LAMP)分析中的检测水平(LOD)的方法可包括提供最小化非LAMP反应产物的反应环境和试剂。在一些示例中，反应环境可基本上不含氧化剂、pH干扰剂、吸湿剂、镁干扰试剂等或其组合中的一种或多种。

在另一个实施方式中，用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统可包括固相反应介质和LAMP试剂的组合，当在25℃下储存时，该组合可维持固相反应介质的色彩在固相介质的初始色调的10％以内。一方面，当储存超过30天、90天、365天、2年、3年或5年中的一个或多个时，固相介质和LAMP试剂的组合可维持色彩。另一方面，当在约40％和90％之间的相对湿度下储存时，固相介质和LAMP试剂的组合可维持色彩。

在另一个示例中，用于制造色度LAMP系统的方法可包括将非干扰试剂混合物与基本上非反应性固相反应介质组合使得非干扰试剂混合物保持与基本上非反应性固相反应介质接触。

在一个示例中，非干扰试剂混合物可保持与固相反应介质直接接触。在另一个示例中，非干扰试剂混合物可保持与固相反应介质间接接触。当非干扰试剂混合物保持与固相反应介质间接接触时，中间材料(例如，抗氧化剂)可增强LAMP反应。

一方面，方法可包括：制备含有非干扰试剂混合物的溶液，和将试剂混合物涂布到基本上非反应性固相反应介质上。另一方面，涂布可包括将溶液滴落、喷涂、浸渍、浸泡或喷雾到基本上非反应性固相反应介质上。

在某些情况下，制造方法可能会影响用于LAMP分析的系统的保质期稳定性或均匀性。在一个示例中，可使用卷对卷(R2R)法将非干扰试剂混合物与基本上非反应性固相反应介质组合。

利用固相介质上LAMP多重检测(Multiplexing)选定靶标以测试病原体

当利用在固相介质上LAMP检测病原体时，有多种多重检测LAMP的方式。首先，通过在同一固相介质上包括多个对照，可对过程进行多重检测。例如，可使用阳性对照来验证测试有效性。例如，LAMP反应可测试唾液样品的唾液DNA或RNA生物标志物，以验证LAMP反应是否如预期那样发挥作用。在另一个示例中，可使用阴性对照来验证测试有效性。例如，LAMP反应可测试不含病原体的唾液样品。

多重检测LAMP的第二种方式可以是将靶向多种不同病原体的引物包含在同一固相介质上。例如，可通过在同一固相介质上测试病毒病原体和细菌病原体以进一步表征生物样品来验证测试有效性。

多重检测LAMP的第三种方式可以是使用不同的目标引物对同一病原体进行测试。在一个示例中，固相介质的第一区段可使用针对病毒病原体的第一蛋白的引物组进行测试，固相介质的第二区段可使用针对病毒病原体的第二蛋白的第二引物组进行测试，以及固相介质的第三区段可使用针对病毒病原体的第三蛋白的第三引物组进行测试。这些引物中的每一个都可靶向病毒病原体基因组的不同区域以消除假阴性和假阳性。

通过在固相LAMP反应介质中包含各种组分，可对LAMP进行多重检测。在一个实施方式中，如图3a所示，用于进行LAMP分析的固相反应介质300a可包括基板302、设置在基板302上的粘合剂层304、设置在粘合剂层304上的包括测试点或反应位置或反应段305a、305b、305c的反应层306和间隔件307a、307b、307c以及设置在反应层306上的展开层308。一方面，测试点305a、305b和305c可包括或以其它方式保持试剂，包括一种或多种目标引物、DNA聚合酶、再增溶剂等。一方面，试剂可形成足以进行LAMP反应的组合物。

空间不连续的反应层306可允许多个对照或多个病原体的多重检测。例如，测试点305a可以是阳性对照(例如，测试已知的唾液DNA或RNA生物标志物)，测试点305b可以是阴性对照(例如，测试比色结果而不包括用于LAMP反应的所有试剂)，以及测试点或反应段305c可测试目标病原体。

空间不连续的测试点或反应位置305a、305b和305c还可允许多路检测多种病原体。例如，测试点305a可测试流感，测试点305b可测试细菌感染，以及测试点305c可测试真菌感染。

反应位置或反应段305a-305c的尺寸可能会影响多重检测的潜能。一方面，反应段305a-305c可具有约0.05mm至约2mm的厚度。另一方面，反应段305a-305c可具有约4mm至约12mm的宽度和约4mm至约25mm的长度。在一个示例中，反应位置305a-305c可在空间上不连续。在另一个示例中，反应段305a-305c可具有约30至约600的表面积与厚度比。

在一个示例中，固相反应介质300a可被配置以接收生物流体，生物流体可横向流过展开层308并且可竖直向下迁移到反应层306的测试点305a-305c中。测试点305a-305c可含有用于发生RT-LAMP或LAMP反应的所有组分。在一个示例中，测试点305a-305c可含有再增溶剂(例如，表面活性剂)、酶(例如，DNA聚合酶、逆转录酶、DNase抑制剂或RNase抑制剂)、稳定剂(例如，诸如BSA或酪蛋白的阻断剂)、比色指示剂(例如，镁比色指示剂、pH比色指示剂或DNA插入比色指示剂)和缓冲剂(例如，20mM Tris)。

固相反应介质300a可被配置以接收可加速反应、增加灵敏度或其组合的剂。在一个示例中，BSA可加速反应并增加灵敏度。然而，BSA的包含也会引起pH变化，pH变化可能会干扰结果的可读出性。因此，在一些示例中，稳定剂可以是酪蛋白、聚山梨酯20等，或其组合。

反应段或反应点(例如，测试点)305a-305c可包括本文公开的任意合适的材料。在一个示例中，反应段305a-305c可包括玻璃纤维、尼龙、纤维素、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、亲水PTFE等或其组合中的一种或多种。一方面，反应段或反应点305a-305c的孔径可为约1至约100微米。反应段或反应点305a-305c在外观上可以是光学洁净和光滑的。

另一方面，反应段305a-305c可在读出区提供均匀的最终颜色(end-color)，用于准确和精确的信号输出或检测。在一个示例中，生物样品可缓慢地竖直向下迁移到反应段305a-305c中。反应段305a-305c的最终颜色强度可由用户通过光学观察和与色表或色标进行比较或通过手持LED计测量为百分比反射单位并使用对照实验室参考仪器校准的曲线组转换成每次反应的RNA或DNA拷贝来测量，或测量为获得RGB值或像素计数(其可对照实验室参考仪器校准)的光学图像。RNA或DNA的浓度可通过选定时间点处的最终颜色强度或通过动力学速率测定来测定。

另一方面，固相LAMP反应介质300a还可包括反应段305a-c。在一个示例中，至少一个区段可基本上不含试剂(例如，305a可基本上不含试剂)。另一方面，反应段305a-c可由至少三个区段的不连续的粘合剂层304限定。这三个反应段305a、305b和305c可包括用于同一病原体测试、用多个对照测试一种病原体或者用或不用特定阳性或阴性对照测试多种不同病原体的指定(designations)。简而言之，反应段305a-c可被指定和配置用于以几乎任意的阵列进行测试以便提供任意所需的参数或方案——其以高准确置信度产生针对特定结果的特定测试。此外，反应层306可以各种数量和位置布置配置有测试点305a-c。例如，反应层中可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或任意其它合理数量的测试点。此外，这样的测试点或反应段可线性地、并排地或以反应层306内几乎任意其它所需的空间布置来布置。

一方面，如图3b所示，固相LAMP反应介质300b可包括耦接在粘合剂层304和展开层或分布层308之间的反应段305a和305b。一方面，至少一个反应段(例如，305a或305b)可以是基本上不含试剂的对照区段或对照点。另一方面，反应段(例如，305a或305b)中的至少一个可被配置以测试目标病原体(例如，将包含或以其它方式支持用于所选LAMP反应的试剂)。

在又一方面中，如图3c所示，固相LAMP反应介质300c可包括反应层306，其中反应段或反应点305a、305b、305c、305d耦接在粘合剂层304和展开层308之间。每个反应段可由间隔件(例如，307a、307b、307c、307d、307e)与相邻反应段或反应点隔开。

在又一方面中，如图3d所示，固相LAMP反应介质300d可包括基板302、粘合剂304、具有反应段或反应点305a、305b和305c的反应层306，而不包括展开层。在此示例中，样品可分别或同时沉积在反应层305a、305b、305c的每个区段上。此外，在此实施方式中，相邻反应段之间不存在间隔件。然而，在一些实施方式中，可包括间隔件而不存在展开层308。

在又一方面中，如图3e所示，固相LAMP反应介质300e可包括基板302、粘合剂304和具有反应段或测试点305a和305b的反应层306，而不包括展开层或任意间隔件。同样，在另一个实施方式中仍然可包括间隔件，而也不包括展开层308。在此示例中，样品可分别和/或共同沉积在反应层305a和305b的每个区段上。

在又一方面中，如图3f所示，可用于LAMP分析的固相反应介质300f可包括基板302、粘合剂304、具有反应段305a、305b、305c和305d的反应层306，而不包括展开层并且不具有任何间隔件。同样，应理解，如果需要，可在相邻反应段之间包括间隔件，而不包括展开层。在此示例中，样品可分别和/或共同沉积在反应层305a、305b、305c、305d的每个区段上。

还应理解，在其它实施方式(未显示)中，展开层308的存在可伴有测试点或反应段耦接在展开层和粘合剂304之间，而不包括任何间隔件。简而言之，根据待执行的具体测试，可选择固相反应介质的组分以适应测试的需要，从而提供最准确的结果或者从而适应任何制造需求或获得某些其它益处。

另一方面，基板302可以是光学透明材料。另一方面，基板302可以是光学透明的塑料载体。另一方面，粘合剂层304可基本上不含挥发性剂。另一方面，粘合剂层304可基本上不含可干扰LAMP反应的剂。另一方面，粘合剂层304可连续或不连续地设置在基板上。

粘合剂层可包括各种材料。在一个示例中，反应层306可包括玻璃纤维、尼龙、纤维素、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、亲水PTFE等或其组合中的一种或多种。在一个示例中，粘合剂层304可包括不影响反应层中反应段或测试点的颜色变化的惰性粘合剂。在一个示例中，反应层306可基本上不含螯合剂、镁、过量的缓冲能力、影响pH的试剂或其组合。在另一个示例中，粘合剂的量可被最小化以防止粘合剂层304和反应段305a-c之间的干扰。

展开层可被配置以增强生物样品在反应段305a-305c上的分布和均匀性。另一方面，展开层308可将唾液样品遍及反应层306的表面来分布或计量。展开层308可将均匀或基本上均匀浓度的唾液样品提供在展开层308和反应层306的界面之间。展开层308可以是网状材料、自始至终具有相同孔隙率的各向同性多孔材料或具有孔隙率梯度的各向异性层等或其组合中的一种或多种。一方面，各向异性层可具有在约1至约100微米范围内的孔径。一方面，展开层308的亲水性可达到足以吸收和展开样品的程度。另一方面，展开层308的亲水性可低于下面的反应层306，以允许样品从展开层308吸出并进入反应层306中。

当提供均质生物样品时，展开层308的精确的渗透性可用于遍及反应层305a-c的表面均等且均匀地分布生物样品。一方面，展开层308的表面可与反应层305a-c直接接触，以通过生物样品的横向迁移来均匀地竖直转移生物样品。另一方面，展开层308可包括玻璃纤维、尼龙、纤维素、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、聚酯、亲水聚四氟乙烯(PTFE)等或其组合中的一种或多种。在一个示例中，展开层308可以是光学透明的。一方面，材料可被化学处理以增强遍及多个反应段305a-305c来分布生物样品。

反应段或测试点305a-305c之间充足的间距可最小化或消除每个反应段之间交叉污染的可能性。例如，当两个区段之间的间距允许试剂从305a流入305b时，反应段305a可能会污染邻接段如305b。另一方面，固相LAMP反应介质300a还可包括间隔件307a、307b、307c和307d，其可在反应段305a-c之间形成约1.0mm mm至约3.0mm(例如，2.5mm)的最小空间。

在一些实施方式中，间隔件307a-307d可具有大于或等于反应段或测试点305a-305d的高度，以在其间创建物理屏障(例如，当将样品分别施用到每个测试点时)。在一个示例中，可将间隔件高度确定为基板302与间隔件(一个或多个)的顶面之间的距离的量度。同样地，可将反应段高度确定为基板302与反应段的顶面之间的距离的量度。在一些方面中，间隔件可具有比反应段的高度多0至50％的高度。

在其它实施方式中，间隔件307a-307d可具有小于或等于反应段或测试点305a-305d的高度，以在其间创建物理屏障(例如，当将样品分别施用到每个测试点时)。同样地，可将反应段高度确定为基板302与反应段的顶面之间的距离的量度。在一些方面中，间隔件可具有比反应段的高度少0至50％的高度。

在一个示例中，间隔件307a-d可包括但不限于聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、聚苯乙烯、聚酯、亲水聚四氟乙烯(PTFE)等或其组合中的一种或多种。在另一示例中，间隔件307a-d可包括但不限于玻璃纤维、尼龙、纤维素等，或其组合。在另一示例中，间隔件307a-d可包括疏水材料(例如，聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、聚苯乙烯、聚酯、亲水聚四氟乙烯(PTFE)等)，但不包括亲水材料(玻璃纤维、尼龙、纤维素等)。一方面，间隔件307a-d可与反应段305a-c在同一平面中定向，并且可在其间定向。

在另一示例中，如图3a所示，固相LAMP反应介质可包括通过粘合剂层304联结的展开层308和反应层306。在一个示例中，间隔件307a-307d的材料类型可增强或以其它方式积极地影响展开程度。例如，聚苯乙烯间隔件相比于其它材料类型可产生更多的展开。无展开层308的固相反应介质可以用户简易性为代价来简化制造。在这种情况下，用户可将唾液样品分别施加到测试点305a-c中的每一个。然而，由排斥或最低限度吸收样品的材料如聚苯乙烯制成的间隔件可辅助展开层提供均匀的展开结果。此外，当不使用展开层308时，此类材料的此类间隔件还可辅助展开样品。

参考图4，显示了测试病毒病原体的存在的方法400并且可包括提供来自对象的唾液样品，如框410所示，和将样品分配到具有与LAMP试剂混合物和pH敏感染料组合的固相反应介质的测试环境中，如框420所示。

一方面，方法可包括最小化能够使固相介质变色的挥发性剂、吸湿剂和非pH敏感剂的量。另一方面，方法可包括提供足以促进LAMP反应的量的一种或多种目标引物、DNA聚合酶和再增溶剂。另一方面，方法可包括提供足以促进RT-LAMP反应的量的逆转录酶。另一方面，方法可包括提供足以检测病毒病原体的量的一种或多种目标引物。在另一示例中，方法可包括在将样品分配到测试环境中后不到一小时内生成测试结果。

在又一个实施方式中，如图5所示，确认唾液样品对于用固相LAMP反应测试的适用性的方法500可包括提供具有至少一个测试位点或测试点的固相反应介质，所述至少一个测试位点或测试点包括LAMP试剂和pH敏感染料的组合。另一方面，方法还可包括提供具有至少一个阴性对照位点的固相反应介质，所述阴性对照位点包括pH敏感染料，并且不包括LAMP试剂，如框510所示。另一方面，方法还可包括将唾液样品施加到固相反应介质，如框520所示。另一方面，方法还可包括确认阴性对照位点上pH敏感染料的活化，如框530所示。

在一个示例中，pH敏感染料可以是酚红、酚酞、石蕊精、溴百里酚蓝、萘酚酞、甲酚红中的至少一种，或其组合。在另一示例中，LAMP试剂可基本上不含挥发性试剂、影响pH的试剂、含镁试剂或其组合。另一方面，LAMP试剂可包括不干扰LAMP的试剂，包括DNA聚合酶、逆转录酶、目标区用引物或其组合。

另一方面，方法还可包括提供由至少两个区段的不连续的粘合剂层限定的测试位点或测试点。在另一个示例中，方法还可包括提供由至少三个区段的不连续的粘合剂层限定的测试位点或测试点。

在又一实施方式中，如图6中所示，最大化来自固相LAMP反应的阳性测试结果的准确度的方法600可包括提供具有至少三个测试位点或测试点的固相反应介质，每个测试位点或测试点包括共同的pH敏感染料和LAMP试剂的组合，如框610所示。一方面，每个位点可包括来自目标病原体的不同引物序列。另一方面，方法可包括引发LAMP反应，如框620所示。另一方面，方法可包括当测试位点或测试点中的至少两个活化pH敏感染料并且经历从第一颜色向第二颜色的变化时，确认阳性测试结果，如框630所示。另一方面，方法还可包括提供足以促进RT-LAMP反应的量的逆转录酶。

在一个示例中，pH敏感染料可以是酚红、酚酞、石蕊精、溴百里酚蓝、萘酚酞、甲酚红中的至少一种，或其组合。另一方面，LAMP试剂可基本上不含挥发性试剂、影响pH的试剂、含镁试剂或其组合。

另一方面，目标病原体可包括病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或原生动物病原体。一方面，目标病原体可包括病毒病原体。另一方面，病毒病原体可包括dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、正链ssRNA病毒、负链ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒或ds-DNA-RT病毒。另一方面，每个引物序列可与来自病毒目标的序列匹配，病毒目标包括H1N1、H2N2、H3N2、H1N1pdm09或SARS-CoV-2。

另一方面，待检测的特定目标核苷酸序列可以是对应于人生物标志物的目标核苷酸。可检测具有与疾病的人生物标志物相对应的目标核苷酸的任何疾病。可检测各种类型的疾病，包括以下中的一种或多种：乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌、胃肠癌、宫颈癌、肺癌、膀胱癌、多种类型的癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、淋巴瘤、白血病、黑素瘤、前列腺癌、甲状腺癌、胃癌等，或其组合。例如，各种类型的疾病的生物标志物可通过检测对应于以下中的一种或多种的目标核苷酸来检测：甲胎蛋白、CA15-3和CA27-29、CA19-9、C！-125、降钙素、钙视网膜蛋白、癌胚抗原、CD34、CD99MIC 2、CD117、嗜铬粒蛋白、第3、7、17和9p21号染色体、细胞角蛋白、cesmin、上皮膜抗原、VIII因子、CD31 FL1、胶质细胞原纤维酸性蛋白、巨囊性病液体蛋白(gross cystic disease fluid protein)、hPG80、HMB-45、人绒毛膜促性腺激素、免疫球蛋白、抑制素、角蛋白、淋巴细胞标志物、MART-1、Myo D1、肌特异性肌动蛋白、神经丝、神经元特异性烯醇化酶、胎盘碱性磷酸酶、前列腺特异性抗原、PTPRC、S100蛋白、平滑肌作用、突触泡蛋白、胸苷激酶、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、肿瘤M2-PK、波形蛋白等，或其组合。

在一个示例中，阳性对照可包括合成DNA目标作为测试区段之一，以确认DNA模板是稳定的。另一方面，阴性对照可包括：(a)不含引物的酶试剂，或(b)含靶向不同病毒的引物的酶试剂。

在另一个示例中，3个测试区段可用于取得不同病毒株(例如，SARS-CoV-2)的增强的覆盖率(coverage)。可针对每种引物选择检测时间和检测极限。在一个示例中，使用第一引物，可取得病毒(例如，SARS-CoV-2)的97％覆盖率。在另一个示例中，包括另外2个与第一引物相比更慢且更不敏感的引物可能不会增强病毒的覆盖率。在另一示例中，多个测试区段可用于取得不同病毒病原体(例如，SARS-CoV-2、H1N1、H2N2、H3N2、H1N1pdm09等)的覆盖率。

固相介质LAMP测试过程和方法

可通过数种方式增强固相介质上的LAMP测试。首先，可监测测试环境以防止可能影响测试过程的变动(variations)。其次，生物样品测试设备的储存条件可能会影响生物样品测试设备的有效性。当密切监测这些条件时，与液体基LAMP测试相比，生物样品测试设备可具有增强的可操作性。

可使用与测试环境相关的各种方法。在一个实施方式中，如图7所示，测试目标核苷酸序列的存在的方法可包括：提供生物样品，如框710所示，和将样品分配到具有与环介导等温扩增(LAMP)试剂混合物和pH敏感染料组合的固相反应介质的测试环境中，如框720所示。一方面，方法可包括提供足以促进RT-LAMP反应的量的逆转录酶。

生物样品的类型可能会影响测试环境。例如，唾液样品可具有缓冲能力，缓冲能力可能会降低测试输出的对比度。在一个示例中，生物样品可以是唾液、粘液、血液、尿液、汗液、呼出气冷凝物或粪便中的至少一种。在另一示例中，方法还可包括使用唾液采集装置、鼻拭子、血液采集装置、尿液采集装置、汗液采集装置、呼出气冷凝物采集装置或粪便采集装置中的一种或多种来采集生物样品。

可控制测试环境以提供一致的测试输出。一方面，测试环境可基本上不含挥发性试剂、影响pH的试剂、干燥剂或其组合。这些试剂中的每一种都可能通过引入可能通过额外分析进行补偿的变量来降低检测结果的一致性。

可监测的另一个测试环境变量是当生物测试设备用于加热生物样品时温度升高的速率。一方面，方法可包括以约0.1℃/秒的速率升高测试环境温度。在一个示例中，测试环境温度可以约0.1℃/秒至约0.2℃/秒的速率升高。在一个示例中，逆转录酶可在约55℃下被活化，而DNA聚合酶可在约65℃下被活化。因此，高于约0.2℃/秒的升温速率可能会干扰LAMP反应中逆转录酶和DNA聚合酶的协同作用。在一个示例中，升温速率可一直升高到测试环境温度处于约60℃至约67℃的范围为止。在一些示例中，当测试环境升高至约55℃(即逆转录酶可被活化的温度)时，在从55℃至约65℃、约0.1℃的升温速率下，生物样品测试设备可能会提供无效结果。因此，不仅仅应在约55℃至约65℃的测试环境温度范围内，而且应在将生物样品加热至约55℃时监测升温速率。

测试环境的变率也会影响生物样品测试设备的结果。一方面，方法可包括在测试环境中提供变率小于1℃的加热均匀性。测试盒(testing cartridge)周围温度的空间变率不应大于约0.5℃，以避免干扰LAMP反应。

另一方面，方法可包括唾液样品约15分钟至约30分钟的测试时间。另一方面，方法可包括唾液样品约30分钟至约45分钟的测试时间。另一方面，方法可包括唾液样品约45分钟至约60分钟的测试时间。另一方面，方法可包括唾液样品约60分钟至约90分钟的测试时间。另一方面，方法可包括鼻咽样品约20分钟至约30分钟的测试时间。另一方面，方法可包括鼻咽样品约30分钟至约40分钟的测试时间。

另一方面，方法还可包括提供固相反应介质，固相反应介质包括玻璃纤维、尼龙、纤维素、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素、亲水PTFE等，或其组合。另一方面，固相反应介质可包括本文另外公开的材料。

一方面，目标核苷酸序列可来自病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或原生动物病原体中的至少一种。一方面，目标核苷酸序列可来自病毒病原体。另一方面，病毒病原体可选自：冠状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、小核糖核酸病毒科、腺病毒科和细小病毒科。另一方面，病毒病原体可选自：严重急性呼吸综合征冠状病毒1(SARS-CoV-1)、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、中东呼吸综合征(MERS)、流感和H1N1。一方面，目标核苷酸序列可来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)病原体。

生物样品测试设备的测试准确度可受测试前的储存时间以及储存条件(例如，储存温度、湿度等)的影响。在一个实施方式中，生物样品测试设备可包括基板，基板接合与脱水的环介导等温扩增(LAMP)试剂混合物和脱水的pH敏感染料组合的固相反应介质。一方面，当在选定温度(例如，约25℃的室温)下储存6个月后，设备可提供至少约95％、96％、97％、98％或99％的测试准确度。一方面，当在选定温度下储存12个月后，设备可提供至少约95％、96％、97％、98％或99％的测试准确度。另一方面，当在选定温度下储存2年后，设备可提供至少约95％、96％、97％、98％或99％的测试准确度。另一方面，当在选定温度下储存3年后，设备可提供至少约95％、96％、97％、98％或99％的测试准确度。另一方面，选定温度可以是在约-20℃至约37℃的范围内的任意温度。

生物样品测试系统可包括壳体。在又一个实施方式中，生物样品测试系统可包括：基板，基板接合与脱水的环介导等温扩增(LAMP)试剂混合物和脱水的pH敏感染料组合的固相反应介质，所述壳体可操作以接收生物样品。一方面，生物样品测试系统还可包括加热器，加热器被配置以将容器等温加热到足以引发和维持LAMP试剂混合物与生物样品之间的LAMP反应的内部温度达到用于通过pH敏感染料生成测试结果的时间。

一方面，基板可包括光学透明材料。另一方面，基板可通过粘合剂接合固相反应介质。另一方面，粘合剂可以是基本上光学透明的。另一方面，基板可包括壳体的一部分。另一方面，生物样品测试系统还可包括设置在基板上的粘合剂层、设置在粘合剂层上的反应层和设置在反应层上的展开层。另一方面，生物样品测试系统还可包括与反应层在同一平面内定向的间隔件层。另一方面，生物样品测试系统还可包括抵靠基板设置的壳体。在一个示例中，壳体还可抵靠展开层设置。在另一个示例中，壳体可基本上包围基板、粘合剂层、反应层和展开层。

在一个示例中，生物测试系统的操作，如图8所示，可包括：(a)使用海绵采集唾液，(b)将海绵插入采集管中，(c)用水稀释采集管以将唾液样品稀释至5％以稳定唾液pH并降低唾液的缓冲能力，(d)使用移液器，通过将唾液样品施加至单个位置，将唾液样品转移到盒中的测试条使得毛细管和网状层可将唾液样品展开到反应层的离散段；(e)将罩放到盒上并将罩锁定就位；(f)通过检查反应层的段来验证唾液样品的pH处于测试范围内；(g)将盒插入加热器中，和(h)验证盒在加热器内的正确定位；(i)启动加热器；(j)约30分钟后——这时测试已完成——读出结果；(k)确定结果是否有效，以及(l)确定结果是阳性还是阴性。

操作(a)可通过海绵采集装置或被动流涎装置(passive drool device)采集唾液来执行。当使用海绵采集装置时，可将海绵插入采集管中以将唾液释放到采集管中(操作(b))。可用水稀释采集管以降低唾液的缓冲能力，降低唾液的粘度，并允许样品的均匀性增加(操作(c))。当唾液样品被转移到测试条上时，可将其单独施加到测试条的每个区段，或者可将其施加到测试条的中心，其中展开层将样品展开在测试条的整个测试区中(操作(d))。可将测试条覆盖以避免被测试环境污染(操作(e))。可通过比色装置、荧光读出器等多种手段，或者通过与所用pH指示剂的pH色表进行简单比较，来测试唾液样品的pH(操作(f))。可将盒放入加热器中并活化(操作(g)、(h)和(i))，同时记录时间以测量总反应时间和达到阳性或阴性结果的时间。30分钟后即可读出结果(操作(j))，或者在结果一显示阳性就可读出结果。阳性结果出现的速度可与病原体的浓度相关。可基于阳性对照、阴性对照、其它病原体结果或其组合来确定结果有效(操作(k))。当使用基于pH的指示剂时，可通过将结果的颜色与基于pH的指示剂的比色表进行比较来确定结果是阳性还是阴性。还可通过测量所吸收的颜色的波长来确定结果是阳性还是阴性。

在另一个公开实施方式中，生物测试试剂盒可包括唾液采集装置、采集管、盒、移液器、加热器、色表中的一个或多个，或其组合，如图8a和8b所示。唾液采集装置可以是海绵采集装置或被动流涎装置。

在一个示例中，如图8a的操作1所示，用户可采用一个或多个操作来采集唾液，操作包括：(a)从生物测试试剂盒的袋中取出Pure-Sal^TM，(b)放置Pure-Sal^TM的海绵采集唾液，直到指示剂改变颜色或提供显示唾液采集过程结束的某种其它指示为止，(c)将采集管固定到压缩管中，(d)将海绵采样器插入压缩管中，(e)压缩海绵以将采集的唾液(不含某些降解唾液的酶)挤压到压缩管中，(f)闭合管，和(g)通过颠倒多次(例如，1至10次)来混合管。

在将唾液采集在管中并充分混合后，用户可准备盒，如图8a的操作2所示。用户可(i)从箔袋中取出测试件，(ii)将护套(sheath)从盒移除，和(c)将盒放在水平表面上。用户还可通过将稀释的唾液(例如，用水稀释的)装填到移液器的黑色线，并转移到样品孔中来转移样品，如图8a的操作3所示。用户也可通过将护套放置在盒上使得夹具对准并卡合在一起来密封盒，如图8a的操作4所示。如图8a的操作5所示，用户还可通过将盒放入附属加热器中、闭合盖子并启动附属加热器来加热盒，其可通过LED指示何时完成了反应。

在反应完成后，如图8a的操作6所示，用户可从加热器取出盒并且将盒与色表比较，同时还确保色表与盒之间的定向是正确的。如图8b进一步示出的，色表，如参考病毒病原体SARS-CoV-2示出的，可包括6个正方形，2行3列。第一列可(-ve)可指示阴性结果，第二列(+ve)可指示阳性结果，以及第三列(无效测试)可指示无效结果。

例如，第一列可指示阴性结果，因为上行正方形和下行正方形均近似为红橙色，在任一正方形中都未发生LAMP反应核苷酸扩增时会发生这种情况。第二列可指示阳性结果，因为上行正方形近似为红橙色(在未发生LAMP反应核苷酸扩增时可发生这种情况)，但下面的正方形近似为橙黄色(在发生LAMP反应核苷酸扩增时可发生这种情况)，并指示存在病毒病原体。第三列可指示无效结果，因为上行正方形近似为橙黄色(在发生LAMP反应核苷酸扩增时可发生这种情况)，但下面的正方形近似为橙黄色(在发生LAMP反应核苷酸扩增时可发生这种情况)。但是对于第三列，颜色从红橙色变为橙黄色的原因可能是无定论的，因为阴性对照(例如，上行)也改变了颜色。

因此，用户可将色表与盒中的测试进行比较以确定测试结果。图8b所示的色表是一个示例。色表可包括另外的行或列以适应针对另外的对照、另外的病原体或涉及同一病原体的不同引物的任意数量的测试。此外，测试可由对象自施，或者可由受过训练的技术人员、护理助理、护士、医师助理、医生或任何其它有资格施用测试并判读结果的人施用。

实施例

提供以下实施例促进对本发明的某些实施方式的更加清楚的理解，而决不意为是对其的限制。

纸基LAMP反应用材料组件

实施例1-纸基LAMP组件

对于纸基LAMP组件，筛选几种材料设计出一种便携、紧凑的组件。为了筛选展开层，将两张纸条(一张含引物，一张不含引物)放在一起并加载50μL浓度为0.2ng/μL的RNA以使两张条饱和。材料可能对纸的pH不产生实质影响的原因有以下几个：(a)纸在温育前太过酸性而无法变色，或(b)纸太过碱性而防止反应所致的任何颜色变化。还用其它装置部件测试了防止两张纸条之间串扰的材料。

纸基LAMP组件的尺寸约为24x 54mm。纸基LAMP组件包括：(i)读出层，(ii)2个反应条，(iii)展开层。读出层包括3毫米的透明背衬(backer)用作支撑。/>背衬附接至这2个反应条，每个反应条由5mm x 20mm色谱纸(例如，/>1级色谱纸)和双面粘合剂(/>90178)接触而成。这两个测试条用2.5x 20mm的10毫米聚苯乙烯间隔件隔开以防止这两个测试条之间的串扰。展开层包括聚酯砜网(/>PES105/52)。将样品加载到展开层上。图9显示了组件的实施例。

实施例2-材料筛选

基于以下五个标准选择纸基材料：(a)当在基板上干燥时调配物(formulation)的稳定性，(b)当被样品再水合时颜色变化的强度，(c)样品在整个纸基基板上均匀芯吸(wick)的能力，(d)材料在整个反应过程中保持惰性的能力，和(e)纸基材料在扩增后显示颜色变化的能力。1级色谱纸被测试并用于优化。在将两张测试条组装在一起时，观察到流体分布不均匀，因为LAMP反应使用大面积的1级色谱。选择比1级色谱纸更厚的色谱纸(例如，Ahlstron 222级色谱纸)允许测试条的表面积约为5mm x 6mm，同时还携带与1级色谱纸相同量的样品和试剂，这实现了再水合过程中更均匀的展开。

实施例3-材料筛选-1级和222级色谱纸

在一个实施例中，如图10所示，图像示出了可生成的颜色对比度的实施例。在一个实施例中，使用1级色谱纸。在另一个实施例中，使用222级色谱纸。在这两种情况下，RT-LAMP试剂均经干燥并使用25μL的5％唾液和95％水进行再水合。阳性样品含有热灭活的SARS-CoV-2，每个反应掺入10k拷贝，而阴性样品为5％唾液(无病毒)和95％水。在65℃下温育90分钟的时间点处捕获图像。

如图10所示，1级纸的阴性结果和1级纸的阳性结果之间的颜色对比度不如222级纸的阴性结果和222级纸的阳性结果之间的颜色对比度明显。因此，较厚的纸产生增强的颜色对比度。

实施例4-纸组装方案

纸组装方案可包括：(1)将聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)切成尺寸为80mm x7mm的矩形，以产生每装置2个；(2)将色谱纸切成尺寸为33mm x 5mm的矩形，以产生每装置1个；(3)切掉一大张双面胶带并将PET矩形粘贴在其上使得每个PET矩形之间有2cm；(4)切掉所有的矩形使得所有的边上都有多余的胶带；(5)剥离其上有PET的胶带并将色谱纸粘贴在PET的相对侧，在胶带之外留出约1cm；(6)用靠近装置里侧的单个点将25ul样品添加到色谱纸上；(7)粘贴另一张PET条以覆盖样品(即胶带一侧应接触样品，而PET应在外侧)；(8)将任何伸出的胶带折叠到PET胶带上以进一步密封；(9)向15ml管的底部添加1ml溶剂；(10)将组装后的纸装置放入管中使得伸出的色谱纸处于溶剂中；(11)闭合管；和(12)在65℃下温育1小时。

基于pH的纸基LAMP分析用材料

实施例5-检测极限(LoD)

LoD研究使用靶向SARS-CoV-2各区域的引物组和25μL反应体积中浓度为2.5、5、10、20个拷贝/μL的热灭活SARS-CoV-2的2倍连续稀释夜(dilutions)。采用在水中基于液体的比色测定，估测LoD约为20个拷贝/μL，其中4个重复中的4个显示颜色从红色变为黄色，因此确认发生了扩增。

实施例6-检测极限(LoD)

基于液体的LAMP反应的LOD可以是每μL样品体积约20个拷贝病毒的浓度。对于固相反应介质(例如，色谱纸)，每个反应区都可容纳约25μL的样品体积。

实施例7-LoD的验证

在确定唾液中的LoD约为20个拷贝/μL后，制备以下具有相关浓度的样品：(1)20个拷贝/μL(1x LoD-10个样品)，(2)40个拷贝/μL(2x LoD-10个样品)，(3)100个拷贝/μL(2个样品)，(4)1000个拷贝/μL(2个样品)，(5)10,000个拷贝/μL(2个样品)，(6)100,000个拷贝/μL(2个样品)和(7)1,000,000个拷贝/μL(2个样品)。阴性样品是合并的(pooled)唾液的等分试样(30个等分试样)。利用图像处理也确认了结果。

实施例8-LoD、灵敏度和特异性

制备热灭活SARS-CoV-2在水中的多个连续稀释液(范围为约100拷贝/反应-10⁵个拷贝/反应)。这些连续稀释液用作液体反应中的模板以建立潜在候选引物组的基线LoD。在白色qPCR板(例如，ThermoAB-0800W)上针对各个病毒浓度进行反应，三次重复，并在标准75L生物培养箱(例如，/>等温微生物指示器(/>IsotempMicrobiological Indicator),15-103-0513)中加热至65℃达60分钟。通过在台式扫描仪(Perfection V800 Photo Color)上扫描板来记录不同时间点处反应混合物的颜色。引物组的LoD由所有三次重复中导致强烈颜色变化的最低病毒浓度确定。然后，对能够以10³个拷贝/反应或更低来提供扩增的任意候选物进行相同的病毒稀释程序(例如，稀释2倍)并掺入合并的健康唾液中以检查基质干扰。然后在纸基装置上进行唾液LoD研究以检查引物在纸基板上的相容性。

如图11所示，右侧的反应是在液体中进行的，使用的是掺入水中的热灭活SARS-CoV-2与组合了荧光染料的比色混合物，用的是25μL反应体积。黑色线指示通过吸光度比值(OD₄₃₀/OD₅₆₀)测量的颜色变化，而浅蓝色线指示通过以10³为单位的荧光强度测量的荧光变化。与内置颜色/荧光读出器联用时，检测时间会更快。

对于约1000个拷贝/反应的病毒浓度，吸光度比值和荧光活性在约17分钟后达到峰值。对于约500个拷贝/反应的病毒浓度，吸光度比值和荧光活性在约18分钟后达到峰值。对于约250个拷贝/反应的病毒浓度，吸光度比值和荧光活性在约19分钟后达到峰值。对于约125拷贝/反应的病毒浓度，吸光度比值和荧光活性在约18分钟后达到峰值。对于约62.5个拷贝/反应的病毒浓度，吸光度比值和荧光活性在约17分钟后达到峰值。对于约31.25个拷贝/反应的病毒浓度，吸光度比值和荧光活性在约22分钟后达到峰值。对于无模板对照，吸光度比值率和荧光活性如所预期的从未出现峰值。

使用变化的LoD倍数(分别为1x、2x、4x、40x和400x，重复10次、10次、4次、3次和3次)的30个设计的(人为的，contrived)阳性样品和30个非模板对照(NTC)阴性唾液样品测定灵敏度和特异性。使用ImageJ提取每个反应区的平均绿色通道强度，测定比色响应强度。通过改变阳性反应和阴性反应之间的阈值截止值(threshold cutoff)并计算各个阈值下的灵敏度和特异性，生成受试者工作特征(receiver-operating characteristic,ROC)曲线。灵敏度计算为真阳性与包括假阳性在内的总阳性数之比。特异性计算为真阴性与包括假阴性在内的总阴性之比。

使用纸LAMP多重检测选定目标以测试病毒病原体

实施例9-纸条形式

图12示出了纸条形式。黑色线指示厚度为0.063mm且长度为50mm的SAATICARE聚酯PES105/52。红色线指示厚度为0.0762且长度为50mm的Tekra Clear454聚酯PET。绿色线指示厚度为0.038mm且长度为50mm的Adhesives Research90178(AS-144)。橙色框指示厚度为0.508mm且长度为2.5mm的Tekra双白色不透明高冲击苯乙烯，石印级。蓝色框指示厚度为0.83mm且长度为5mm的Ahistrom-/>纤维素，222级。在本实施例中，纸条具有5个间隔件(橙色)和4个反应层区段(蓝色)，连同展开层(黑色)、粘合剂层(绿色)和基板(红色)。

实施例10-RT-LAMP过程

如图13所示，固相LAMP反应介质可包括：6mm x 50mm的透明3mm454，含90178；反应层，包括5mm Ahlstrom 222试剂材料(包括4个粉色的不连续的反应层区段)；间隔件，包括2.5mm的20密耳聚苯乙烯(包括5个不连续的间隔件)；展开层，包括PES 105/52hyphyl；基板，包括用14mm Melinex、/>90178和3M 9962制造的毛细管。

如图14所示，通过在各个反应区段或测试区之间具有足够的空间，可避免反应区之间的串扰。在本实施例中，橙色的四个反应区段保持无交叉污染，因为5个间隔件无颜色变化。

实施例11-A-纸对比度

在另一个实施例中，如图15所示，222级色谱纸可提供比1级色谱纸更高的对比度。222张纸的阳性结果(左)显示，与右上的阳性结果(橙色)和右下的阴性结果(深橙色)相比，左上的阳性结果(淡黄橙色)和左下的阴性结果(深橙色)之间的对比度更高。使用约500μM的缓冲剂对每张纸条进行测试，缓冲剂的pH范围从阴性测试的8.0到阳性测试的7.5。

实施例11-B-酚红浓度对纸的影响

为了在不抑制反应自身的情况下区分阴性结果和阳性结果之间的差异，在1级和222级色谱纸上测试了酚红浓度。对于这两种类型的色谱纸，每次反应250μM的酚红展示出一致的结果。60分钟温育后，低染料浓度显示出相对微弱暗淡的颜色，而对于高浓度酚红纸垫，则使用更长的温育时间来区分阳性和阴性。

实施例11-C-初始pH和干燥对使用酚红的纸上比色RT-LAMP响应的影响

图15B示出了当在RT-LAMP反应混合物的不同起始pH下结合干燥时的RT-LAMP。在本实施例中，pH 7.6是RT-LAMP反应混合物的未调节的pH。湿润设置(Wet setup)指示，在添加20μL LAMP反应主混合液后，立即添加5μL合成RNA(N基因,0.2ng/μL,‘+’)。干燥设置(Dried setup)指示，在施加20μL LAMP主混合液后，使纸条在室温下干燥30分钟，然后用25μL合成RNA(‘+’)或水(‘-’)再水合。LAMP反应含有12.5μL NEB 2x比色主混合液、2.5μL引物混合液和在无核酸酶水中制备的5μL酚红(1mM)。用KOH调节所得混合液的pH。使用1级色谱纸。在设定为65℃的培养箱中加热120分钟，并在反应过程中在45、60、90和120分钟的时间点处用平板扫描仪扫描。

实施例12-测试条形式

如图16所示，测试条形式具有样品施加侧和读出侧(图右上)。当存在展开层时，可在一个位置将样品施加到样品施加侧。在其它实施例中，在没有展开层的情况下，可将样品施加到反应层各区段上的样品施加层(橙色)。无需专用仪器或者使用比色检测器或荧光检测器即可将读出侧读出。

如图16进一步所示，测试条形式还具有4个测试反应区、吸收层/展开层以及将顺应形状并接触吸收层的透明单面粘合剂。

实施例13-测试条组装过程

图17示出了包括纵剪的测试条组装过程，其中反应层以较宽的宽度涂布并被纵剪成5mm并且放置在卷轴上以供层压。该过程还包括将反应层层压至透明单面粘合剂的第一层压过程。该过程还包括在第一层压过程之后直接在线(in line)执行的第二层压过程，并且其中展开层被层压到反应层和粘合剂层。测试条组装过程可包括材料，材料包括涂布pH试剂的聚砜材料、单面粘合剂和色谱1纸。

实施例14-RT-LAMP过程

通过在65℃下加热唾液和试剂混合物，在一锅混合物中提取、逆转录和扩增唾液中的SARS-CoV-2病毒中的RNA。LAMP使用的四引物组包括：靶向SARS-CoV-2RdRp基因的引物组，靶向SARS-CoV-2包膜基因(E)的引物组，靶向SARS-CoV-2ORF1ab区的引物组，以及最后是靶向人RNaseP(RP)基因的引物组——用作机上(on-board)对照。各引物组由6个独立引物组成，靶向病毒或人RNA的特定区域，在等温温育过程中使用逆转录酶和链置换聚合酶进行逆转录和扩增。

实施例15-阳性对照

阳性对照反应包括在测试装置机上，作为与三个病毒RNA测试条一起运行的检测区域之一。阳性对照同时充当阳性模板对照和提取对照。如果测试条的对照区域出现从红色到黄色的颜色变化，这表明已成功从病毒中提取出病毒RNA(如果其在样本中存在的话)，并且测试中的试剂均按预期执行以产生扩增信号。如果颜色未发生变化，则测试应被视为无效并重复进行。

阳性对照检测人RNase P，一种人类临床样本中普遍存在的标志物，也是许多RT-PCR试剂盒中的标准对照。此标志物的扩增表明在测试条件下已成功发生人细胞裂解，也可推断出病毒裂解。

该对照的科学依据如下。与基于RT-PCR的测定不同，我们的测定不采用病毒RNA的化学提取；而热处理是足够的。RT-PCR中的聚合酶对生物样品基质中的反应抑制剂敏感。因此，这些测试通常要进行RNA提取和纯化操作。相比之下，LAMP测定中使用的Bst 2.0聚合酶在生物基质中极其稳健，因此不采用提取和纯化。装置中达到的65℃温度足以裂解病毒颗粒，暴露病毒RNA，并支持稳健的扩增。

实施例16-阴性对照

通过使用测试装置，用空白测试溶液替代唾液样本进行阴性无模板对照测试。空白测试溶液是无菌pH缓冲溶液，不含任何RNA或DNA模板。如果在此测试中观察到颜色变化，这就表明可能有假阳性，因此自运行最后一个对照以来获得的任何阳性结果均无效。因此，在收到这些测试试剂盒后，用户说明书将会要求用户使用一个这样的代表性测试试剂盒现场执行此阴性对照。这种确认也可以预定的时间间隔进行重复。

阴性对照中假阳性最可能的原因是连续测试导致扩增后的DNA产物的夹带。阴性对照测试是一系列控制措施中的最后一项，旨在防止夹带污染导致的假阳性，包括以严格的密封容限对盒的制造控制和操作者对加热器设备的常规消毒擦拭清洁。

实施例17-内部对照

测试组件采用为使用唾液作为测试基板而设计的独特对照。每张测试条都包括pH指示剂染料，其可充当内部对照，验证唾液样本的初始pH是否在预期范围内。如果在施加样品时(加热前)在所有四张测试条上都观察到颜色从红色变为黄色，则用户应得出样本无效的结论，而不能继续测试。外部因素诸如进食、饮水或在取样前使用口腔卫生产品可能会扭曲样本的初始pH。在出现pH指示剂失效的情况下，如果操作者确定这些因素中的一个影响了样本，则可在5分钟后使患者唾液的pH恢复至其正常状态再测试。其它外部因素诸如某些疾病形式也可能对唾液pH产生全身性影响，在这种情况下，有必要采用替代测试手段。

实施例18-结果确认

纸LAMP测试是一种定性测试。该测试是一种基于颜色的视觉结果，操作者可在判读色表的帮助下读出结果。阳性反应结果会产生黄颜色。在判读患者结果之前，应检查所有测试对照。如果对照无效，则测试无效而无法判读患者结果。

由于这是一种等温RNA扩增，因此以LoD实验定义的水平存在的目标SARS CoV-2RNA将产生指示阳性测试的结果。在某些情况下，Orf1ab、E基因或RdRp基因的3个目标基因引物区域中有2个为阳性结果，则可确认阳性测试判读。可将测试条的颜色与所提供的颜色判读图进行比较以鉴定阳性结果。测试条的RNaseP区域应变为黄色，以指示测试有效。如果该区域未变为黄色，则测试无效而应进行重复。

可靠且合理的测试条的首要指标就是确认4个测试条区域在测试条加热之前施加唾液后不会变黄。如果出现这种情况，则很可能是由于最近摄入了食物或流体，唾液pH超出了可接受范围。患者应用水漱口，至少等待5分钟，然后重新对唾液采样。

一旦测试反应在加热器设备中完成，机上对照就应在RNaseP区域中显示出阳性的黄色变化。一旦确认，就应对照所提供的颜色判读图检查各个条区域的颜色变化。各个条区域被分类为阳性(例如，黄色变化)或阴性(例如，粉颜色)。在一个实施例中，当其中2个测试区域为阳性时，可指示出对SARS CoV-2的确认。

实施例19-假阳性的来源

如果在测定程序中未适当注意处理假阳性，则RT-LAMP测定中会经常出现假阳性。这些假阳性的来源可源自由先前RT-LAMP反应形成的DNA气溶胶，这些气溶胶会在环境中保留很长一段时间并污染将来的实验。这些气溶胶可能在反应准备过程中污染单个的试剂，也可能在反应混合物运输、处置、对样品加载或温育过程中将其污染。除了降低RT-LAMP相关测试的准确度外，气溶胶还会给使用具体模板浓度的实验如LoD研究增加噪声。为了解决这些各种各样的污染点，可将所有RT-LAMP相关程序分为待在不同地点进行的阶段(即反应准备、运输、加载/密封、温育扩增和凝胶电泳)。通过该方案中空间上分离的操作，可将反应密封前引入气溶胶的可能性降至最低，或在出现假阳性时进行故障排除。

实施例20-板、盖、密封件和管的筛选

考虑到RT-LAMP容易受到污染，因此会出现假阳性，故对qPCR 96孔板、密封方法和PCR管进行了广泛筛选。我们首先筛选了Thermo96孔全裙边PCR板(Thermo/>96-well Full Skirted PCR Plates)，透明款(Clear)(/>AB-0800)和白色款(White)(AB-0800W)两种，连同FrameStar/>96孔裙边光学底板(FrameStar96-well skirted optical bottom plates,Brooks Life Sciences/>4TI-0970)。透明板主要用于辅助对比色测定的扫描。在这些透明板当中，根据假阳性的平均数量，白色底的Thermo/>96孔全裙边PCR板的性能最好。

图22A显示orf1ab.II的检测极限(LoD)的比色RT-LAMP扫描图像。扫描标题是对应于用于运行比色LoD的不同板类型的目录号。黄色孔指示LAMP反应成功发生，而红色/橙色孔分别指示扩增不存在或扩增水平低。以标记浓度将5μL热灭活病毒稀释液掺入20μL反应混合物。反应主混合液由12.5μL NEB比色2x主混合液(NEB Colorimetric 2x mastermix)、2.5μL引物混合液和5μL水组成。在设定为65℃的培养箱中加热60分钟后拍摄终点图像。每个引物组针对各个病毒浓度重复3次。

对于密封方法，我们研究了以下产品：光学8盖条(/>Optical 8-cap strips,Thermo/>43-230-32)、Thermo Scientific VersiCap Mat盖条(Thermo Scientific VersiCap Mat Cap Strip,Thermo/>AB1820)、ThermoScientific粘合板密封件(Thermo Scientific Adhesive Plate Seals,Thermo/>AB-0558)和MicroAmp光学粘合密封件(MicroAmp Optical Adhesive Seal,Thermo/>43-119-71)。在这些盖当中，VersiCap Mat盖条在观察假阳性率时密封最好；然而，对于比色扫描来说，因为盖并不完全透明，所以盖使得很难获得反应进展的准确图像。因此，对粘合密封件进行了测试，并且两者相比之下表现均等。此外，当整个板上同时且均匀施加压力时，基于假阳性率，粘合密封件的表现优于VersiCap。

图22B显示orf1ab.II的检测极限(LoD)的比色RT-LAMP扫描图像。扫描标题是对应于用于运行比色LoD的不同盖类型的目录号。黄色孔指示LAMP反应成功发生，而红色/橙色孔分别指示扩增不存在或扩增水平低。将水中的5μL热灭活病毒稀释液掺入20μL反应混合物，得到最终的标记浓度(阳性反应)或无核酸酶水(阴性)。反应主混合液包括12.5μL NEB比色2x主混合液、2.5μL引物混合液和5μL水。在65℃下将板温育60分钟后拍摄终点图像。每个引物组针对各个病毒浓度重复3次。

作为成像过程中板的替代物，我们研究了以下PCR管产品：MicroAmp^TM光学8管条(附有光学盖)(MicroAmp^TMOptical 8-Tube Strip with Attached Optical Caps,ThermoFisherA30588)和使用与用于密封板的盖相同的盖的MicroAmp^TM光学8管条(MicroAmp^TMOptical 8-Tube Strip,Thermo/>4316567)。就假阳性率而言，附有光学盖的管表现最好。

完全组装好的4路复用测试条可包括展开网、粘合剂和透明的Melinex背衬。测试条还可包括水中的DNA模板，浓度为0.2ng/uL，对应于约10⁸个拷贝/uL。样品体积可以是100uL。N基因引物可与交替的引物和非引物条件联用。粘合剂可能会具有抑制颜色响应的缓冲作用，因此应对调配物进行补偿。

纸LAMP测试过程和方法

实施例21-A-纸LAMP测试过程

纸LAMP测试是为受过训练的医疗护理专业人员应用简单的即时医疗而设计的。整个测试过程如图18所示。患者在医疗护理专业人员的指导下采集唾液样本。将唾液样品采集到不含添加剂的专用采集容器中，因此患者在采集中使用是安全的。唾液的体积约为100μL，易于患者采集。含有如上文所述的特定的RNA检测区域的测试条完全容纳在塑料条托架中。采集唾液样品后，患者将采集容器交给操作者。然后，操作者将唾液样品施加到测试条于指示位置处并闭合盒壳体。然后，将具有含样品的条的盒放入加热器设备中，加热器设备设计成将盒牢固地保持就位以实现所需加热到65℃。纸LAMP测定在等温温度下于测试条上进行。在LAMP反应期间，在唾液样品中并且在65℃温度下鉴定核酸，核酸扩增产生的pH变化导致条上的颜色变化。

加热器设备设计成对整个测试条提供均匀加热。加热设备可具有(红-黄-绿)彩色LED灯以向用户显示加热在温育时间上的进展，并在测试得出结论时提醒操作者。当测试进展时，加热器设备可包含这样的特征，例如，磁性锁或机械锁，旨在确保测试不被中断。测试反应可在65℃等温温度下进行大约15至30分钟。测定结束时，可从加热器中取出测试条容纳其中的测试载体并在视觉上读出。

实施例21-B-纸LAMP测试过程

图18B示出了用于SARS-CoV-2的纸基比色分子测试的制造和使用。用于SARS-CoV-2的纸基比色分子测试的制造包括：(1a)制备主混合液，(1b)将混合液转移至垫，(1c)执行质量检查，和(1d)将测试装置空气干燥。用于SARS-CoV-2的纸基比色分子测试的使用包括：(2a)样品采集，(2b)重悬于水中，(2c)将样品添加至垫，(2d)在65℃下温育约60分钟，和(2e)判读结果。

实施例21-C-纸LAMP测试过程

图19A中示出了测定的工作流程：采集唾液，将样品转移至纸基装置，在65℃下温育，和读出结果；图19D显示出典型结果。图19C提供了我们的纸装置的结构的示意图。纸装置包括数个222级纤维素反应垫，由20密耳聚苯乙烯间隔件隔开以防止反应区之间的串扰。这些部件通过双面粘合剂附接至透明背衬以支撑结构。在制造期间，将进行RT-LAMP的试剂干燥至反应垫上。当用户将样品添加到反应区时，这些试剂被再水合。

图19示出了纸基装置的示意图和比色表征；图19A提供了装置使用的工作流程的示意图。对照区指示无引物对照。图19B提供了使用5％唾液中指定浓度下的热灭活严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)在纸上的比色LoD。阴性重复是使用无核酸酶水替代热灭活SARS-CoV-2的RT-LAMP反应。数据取自图21A。

图19C提供了纸装置的示意性布局。图19D提供了阴性和阳性运行的典型比色结果。对照为不包含LAMP引物的RT-LAMP反应。阳性反应具有：800个拷贝/μL掺入5％唾液中。图19E提供了从B图的比色结果得出的可能的结果的颜色梯度。图19F提供了用于基于调查响应计算纸装置的分析灵敏度和特异性的观察结果汇总表。

测定的每个操作(图19A)都旨在降低复杂性并减少即时护理环境下的用户失误。样品采集操作使用海绵基采集装置，这种装置允许患者自行采集，从采集的唾液中去除颗粒，并将患者与患者之间的结果变异降至最低。转移操作包括将25μL稀释的唾液放在装置上的两个反应区中的每一个上。对于温育操作，将加载样品的纸装置密封在可重新密封的塑料袋中，并置于设定为65℃的培养箱中60分钟。最后，对于读出操作，用户将对照区和反应区的颜色与图19C中的色条进行比较，以确定结果是否有效以及是否存在感兴趣的病原体。

该平台包括三个主要部件：赋予测定以特异性的引物组、含有两个反应区(一个对照区和一个反应区)的纸装置和用于将纸装置加热至反应温度的加热源。引物组决定测定所靶向的是何种病原体。因此，可通过重新设计引物组，同时保持装置和调配物的所有其它方面不变来重新配置该平台，从而靶向不同的病原体。此外，纸基装置可被配置以容纳允许同时检测多个目标的多个反应区。

通过可用肉眼读出的有区别的比色响应显示对唾液中SARS-CoV-2的直接检测(图19)。这种形式顺应于卷对卷制造，而预计成本约为10美元/次测试。测试的检测极限(LoD)为200个拷贝/μL唾液。当在视觉上估测时，使用设计样品(掺入热灭活SARS-CoV-2的新鲜采集唾液)测定的分析灵敏度(阳性预测值)为76％，特异性(阴性预测值)为100％，以及准确度大约为91％(图19F)。由于对对照垫颜色感知的主观性，应答者错误地将80个装置中的一共20个鉴定为无效，导致25％的假无效率。当使用图像处理量化颜色变化时，灵敏度提高到97％，准确度为98％(图19C)。

装置(图19C)的尺寸为6mm x 20mm并且包括：读出层、两个反应条和防止串扰的间隔件。读出区包括光学透明的3密耳MELINEX(Tekra454聚酯(PET))背衬。使用双面粘合剂(Adhesives Research无酸/>90178)将其附接至两个5mm x 6mm色谱纸反应条(Ahlstrom-/>222级)。用2.5x 6mm的20密耳聚苯乙烯间隔件(Tekra双白色不透明高冲击聚苯乙烯(HIPS)，石印级)(Tekra Double White Opaque High ImpactPolystyrene(HIPS)Litho Grade)将条隔开。当再水合时，添加25μL样品以使条饱和。

通过在一定的pH值范围内对222级色谱纸上的酚红的RGB值取平均值来创建色条。使用这些平均RGB值创建线性梯度，并将根据ROC曲线确定的最佳阈值标注在色条上(图19C)。

将样品加载到纸基装置上后，将装置放入1”x 1”可重复密封的塑料袋中以防止RT-LAMP反应过程中的污染。然后，将容纳纸装置的塑料袋放入65℃的培养箱中60分钟。取出袋，用平板扫描仪扫描(图19D)，并对照色表(图19E)——通过对来自222级垫上、6-9的已知pH值的缓冲剂中的酚红响应的RGB值取平均值创建的——进行比较(图21B)。色表中的阈值对应于通过ROC分析确定的阈值(图19B)。

在确定唾液中LoD为200个拷贝/μL(图19B)后，制备了1x、2x、4x、40x和400x LoD的设计样品。使用30个等分试样的新鲜采集的唾液作为阴性样品(图21A)。使用图像处理对结果进行量化(图19A和图21C)。使用双尾学生t检验得出阴性和阳性比色反应垫的绿色通道强度差异显著(p<0.001)。

采用图像分析的特异性为100％，灵敏度为97％，以及准确度为98％(图20C)。图20示出了对纸上比色响应的数字分析。图20A显示了纸上RT-LAMP的30个阳性和30个阴性结果的绿色通道强度的箱线图。图20B显示了纸上RT-LAMP的30个阳性和30个阴性结果的受试者-工作者(ROC)曲线。图20C显示了基于图像分析的观察结果汇总表。

色度感知调查(图23A和23B)是根据普渡大学(Purdue University)IRB方案#IRB-2021-375，从纳入本研究的参与者中收集的。向参与者提供标注阈值的色条(图19E)。参与者接受多次纸装置扫描并被要求将对照垫(左侧反应区)分类为有效或无效以及将SARS-CoV-2反应(右侧反应区)分类为阳性或阴性。通过测定性能分析丢弃分类为无效的观察结果，并将错误鉴定的无效测定的比例报告为假无效率。

要求四名参与者使用色条(图19)将图21A中呈现的10个阳性反应和10个阴性反应分类为有效或无效(根据左侧对照区)以及将SARS-CoV-2分类为阳性或阴性(根据右侧反应区)。将参与者视为无效的观察结果丢弃。在40个真阳性观察结果(采用图像分析均为有效)当中，参与者将19个错误地归类为无效。这与40个真阴性观察结果(其中的36个采用图像分析是有效的)——其中1个观察结果被错误地归类为无效——形成对比。因此，当解释比色判读时，我们的装置的经计算的特异性和灵敏度分别为100％和76％，同时准确度为91％(图19F)以及假无效率为25％。

实施例22-样品稳定性

从唾液采集到测试条应用的标准时间在2小时内。容许从样品采集起上至24小时测试的样品稳定性可基于在0-2小时、8-12小时和20-24小时重复对样品(例如，15个阳性和15个阴性)的重复测试。在采集中心或诊所环境中以快速方式从患者采集的样品届时可在数小时后进行测试。还可评估一个场地处的采集情况(例如，在门诊机构中的或在得来速(drive-thru)采集区，随后将唾液样本运输到第二个地点(如某地点))。

实施例23-制造

浸涂和升温干燥似乎对LAMP反应无负面影响。这对制造产量和可扩展性有着积极的影响。测试条被设计使得其能够在现有的转换设备上大规模制造，而不会产生大量的工具加工(tooling)成本。设计足够简单以满足从原型到全面生产的快速简单路径的目标，从而满足新兴市场的需求。

实施例24-纸基装置的设计

纸被广泛用于pH指示剂和尿液条，主要是因为其成本低廉、技术复杂性低且易于采用卷对卷制造来生产。对于本文公开的装置，评估了几种类型的纸和所选色谱纸的使用情况(图21D-21F)。由于与其它纸相比，色谱法纸的芯吸能力有所提高，因此可将其用于纸基生物传感器。很多纸基装置都使用1级色谱纸；然而，由于1级色谱纸的面积较大(5mm x20mm)，溶液在整张纸上分布不均匀。因此，选择一种不同类型的色谱纸，222级(0.83mm)，是1级(0.18mm)的约4.6倍厚。由于其厚度增加，可通过减小装置尺寸(5mm x 6mm)将相同体积的液体加载到小30％的反应区，从而实现均匀分布。

为了降低装置的复杂性，将RT-LAMP反应的组分(不含模板)在纸上干燥。干燥实现装置的稳定分布和简单操作，而不会损害诊断性能；用户只需添加样品即可使试剂再水合。在纸上使试剂干燥后，随着时间的推移，在不存在任何模板的情况下，纸颜色从红色变为黄色，指示纸的pH降低。通过一系列留一法(leave-one-out)实验，确定硫酸铵是造成此变化的原因(图21G)。此颜色变化可能是加热引起的纤维素氧化和硫酸铵的氧化性质所致，也可能是RT-LAMP混合物中的氨脱气引起试剂酸化所致。为防止无扩增时的颜色变化，用甜菜碱代替硫酸铵并提高酚红的浓度(其充当抗氧化剂)(图21H)。

甜菜碱在LAMP反应中的有效性是变化的；然而，甜菜碱可减少氧化损伤，因而被包括在内。海藻糖和BSA都被添加到纸上的调配物中(图21H)。

对于该装置而言，使用两个反应区；靶向SARS-CoV-2的反应区和提供无引物对照以测定我们的试剂在纸上的稳定性(其不应与任何样品反应)的反应区。图19C中显示了最终装置的示意图，而图19D中显示了来自具有和不具有以5％反应浓度掺入唾液中的热灭活SARS-CoV-2的装置的结果。如图19B所示，纸上该测定的LoD(250个拷贝/反应)与溶液中观察到的比色RT-LAMP调配物的LoD相当(图21I)

为了构建该装置，使用背衬来提供结构支撑。使用双面粘合剂，将两个反应垫附接到背衬而不改变其pH。反应区的数量可随意增加，以便在不改变装置设计的情况下进行多重检测。在反应垫之间添加20密耳的聚苯乙烯间隔件以提供物理屏障，抑制从一个反应区向相邻反应区的泄漏，从而消除试剂和样品这两者的添加期间的串扰。在某些情况下，反应区可被蜡印产生的疏水屏障隔开，从而防止样品穿过；然而，为了实现卷对卷制造，消除了蜡的使用，而使用间隔件。

实施例25-设计样品的验证

为了评估我们的纸上测定的分析灵敏度和特异性，用热灭活SARS-CoV-2、以orf7ab.I LoD的倍数生成设计样品，从而在纸上运行RT-LAMP测定。共使用了30个阳性样品和30个相应的阴性样品，这是美国紧急使用授权(emergency use authorization,EUA)的最低数量。为了确定区分阳性反应与阴性反应的比色阈值，通过计算变化的绿色通道强度阈值处的灵敏度和特异性构建了ROC曲线(图20)。在阈值处，测定具有以下分析量度：灵敏度97％，特异性100％，以及准确度98％(图20A和图20B)。阳性组与阴性组之间的差异存在显著差异(p<0.001)。纸条是手工切割的，纸的大小的微小差异都可能会导致比色响应的差异。因此，大规模制造和质量控制还可增强两组(阳性和阴性)之间的一致性。这种灵敏度与使用RNA提取物的测定(灵敏度约为95％)相当，且优于报告的粗样品灵敏度——灵敏度显著降低(至约80％)是常有的情况。

实施例26-纸基装置的比色判读

为了观察颜色感知对装置性能的影响，对四名参与者进行调查并要求他们判读装置的结果。向每名参与者提供色条和60分钟后对装置的扫描(图23A和23B)，并要求他们根据色条上标记的阈值将结果分类为有效或无效(使用对照垫)以及阳性或阴性。当将用户判读引入分析时，装置的灵敏度和准确度分别降至76％和91％(图19F)。这种低灵敏度源于应答者根据对照垫将许多阳性反应鉴定为无效，导致25％的假无效率，这可能是反应期间对照垫被扩增子污染所致。此外，用户对同时存在黄色和红色区域的垫的判读可能会引入模棱两可，导致假阳性率或假无效率升高。最近的发现表明，这种模棱两可是由于在比色测定中未得以充分解决的第三中间色簇(color cluster)(连同阳性/阴性簇)。由于通过进一步分析丢弃了无效结果，因此这种升高的假无效率可能会人为地影响装置的特异性和准确度量度。

实施例27-干燥后单一反应物的消除对纸初始颜色的影响

图21G显示了20μL的RT-LAMP主混合液——其含有KCl(50mM)、MgSO₄(8mM)、等摩尔dNTP混合物(每种dNTP 1.4mM)、WarmStart BST 2.0(0.32U/μL)、WarmStart RTx(0.3U/μL)、酚红(0.25mM)、dUTP(0.14mM)、Antarctic UDG(0.0004U/μL)、吐温20(1％v/v)、(NH₄)₂SO₄(10mM)和海藻糖(10％w/v)的基础调配物——连同5μL的无核酸酶水被添加到1级色谱纸并使其在PCR准备罩内干燥10分钟。如所示，将反应物从基础调配物中除去，以确定干燥后观察到的颜色变化的原因。RT-LAMP引物和模板不包括在本研究中。

实施例28-各种pH下的酚红颜色校准

图21B显示了在用20mM Tris缓冲的纸上于不同pH值下250μM酚红的校准。使用HCl或KOH调节pH值。将222级色谱仪纸(5mm x 6mm)的图像裁剪为矩形，使得能够轻易地跨多个条来对比颜色。

实施例29-各种浓度的热灭活SARS-Cov-2下对最终装置的验证

图21A显示了采用orf7ab.I引物组和最终的比色RT-LAMP主混合液调配物的RT-LAMP。每个装置上的左侧反应区是无引物对照，其中所有orf7ab.I引物都用水代替且不包含在主混合液中。右侧反应区在阳性反应的情况下含有以指示浓度掺入处理过的唾液中的热灭活病毒，或在阴性反应的情况下含有处理过的唾液。所有处理过的唾液的最终反应浓度都为5％。主混合液由以下组成：KCl(50mM)、MgSO₄(8mM)、等摩尔dNTP混合物(每种dNTP1.4mM)、WarmStart BST 2.0(0.32U/μL)、WarmStart RTx(0.3U/μL)、酚红(0.25mM)、dUTP(0.14mM)、Antarctic UDG(0.0004U/μL)、吐温20(1％v/v)、甜菜碱(20mM)、BSA(40mg/mL)和海藻糖(10％w/v)。使用222级色谱纸。

实施例30-变化的模板浓度下RT-LAMP比色响应的绿色通道颜色强度

图21C显示了变化的浓度下纸垫的比色响应的散点图。用参考线121显示了绿色强度阈值。

实施例31-加热方法对RT-LAMP比色响应的影响

图22C显示了在65℃下温育60分钟后，不同加热装置上25uL反应的LAMP检测极限(LoD)的比色扫描。用于这些反应的引物组是orf1ab.II。20μL反应混合物掺有5μL的于水中的热灭活病毒稀释液，得到最终的标记浓度(阳性反应)或无核酸酶水(阴性)。反应主混合液包含12.5μL的NEB Colorimetric 2x主混合液、2.5μL的引物混合液和5μL的水。

实施例32-升温速率对RT-LAMP比色响应的影响

图22D显示了65℃下qTower(96孔板)和热循环仪(PCR管)上以变化的升温速率将25μL反应温育60分钟后的比色扫描。使用的引物组是orf1ab.II。20μL。反应混合物掺有5μL的于水中的热灭活病毒稀释液，得到最终的标记浓度(阳性反应)或无核酸酶水(阴性)。反应主混合液包含12.5μL的NEB Colorimetric 2x主混合液、2.5μL的引物混合液和5μL的水。

实施例33-海藻糖和吐温20对RT-LAMP比色响应的影响

图21H显示了包含给定浓度的海藻糖或吐温20的比色RT-LAMP结果。使用orf1ab.II引物组。将20μL的RT-LAMP主混合液——其含有KCl(50mM)、MgSO₄(8mM)、等摩尔dNTP混合物(每种dNTP 1.4mM)、WarmStart BST 2.0(0.32U/μL)、WarmStart RTx(0.3U/μL)、酚红(0.25mM)、dUTP(0.14mM)、Antarctic UDG(0.0004U/μL)、吐温20(1％v/v，如若指示)、甜菜碱(20mM)、BSA(40mg/mL)和海藻糖(10％w/v，如若指示)的基础调配物——添加到1级色谱纸并使其在PCR准备罩内干燥60分钟。将25μL的在25％的处理过的唾液中终浓度为1x10⁵个拷贝/反应的热灭活SARS-CoV-2(阳性反应)或无核酸酶水(阴性反应)添加到干燥的反应垫中。将垫在设定为65℃的培养箱中加热60分钟，然后使用平板扫描仪扫描。

当不存在模板时，硫酸铵的包含会导致RT-LAMP试剂干燥后颜色从红色变为黄色。通过增加酚红浓度并用甜菜碱代替硫酸铵来防止这种颜色变化(图21G)。此外，海藻糖和牛血清白蛋白(BSA)的添加提高反应速度并提高LoD(图21H)。

实施例34-总结

检测复杂样品中感兴趣的病原体的核酸的纸基装置可利用通过产生人眼可见的比色响应的环介导等温扩增(LAMP)。为了证明此装置在突发公共卫生事件中的实用性，在未进行预处理的情况下该装置检测人唾液中的SARS-CoV-2。所得装置能够在60分钟内检测病毒，并且利用图像分析，其分析灵敏度为97％且特异性为100％，同时检测极限为200个基因组拷贝/μL患者唾液。该装置包括数量可配置的反应区——由222级色谱纸构建，用20密耳聚苯乙烯间隔件隔开，间隔件通过双面粘合剂附接到/>背衬。所得装置通过改变LAMP引物组能够检测多种目标和各种病原体。

该平台具有以下特性：i)它使用唾液，ii)它具有最少的操作者培训，iii)它能够使用卷对卷方法制造以实现数百万次测试，iv)它在分析灵敏度和特异性方面的表现类似于RT-qPCR测定，v)它提供肉眼可见的比色响应，vi)它可顺应于即时医疗用途，vii)它在不到60分钟的时间内提供结果，和viii)它的成本估计为约10美元/测试。

由于此测试简单且可扩展，因此能够用于各种各样的环境，潜在包括居家(in-home)诊断。通过在溶液中筛选引物组，能够很容易地重新配置该平台以靶向不同的病原体。通过向该装置中添加另外的反应位点，能够实现多重检测。该平台的可重新配置性使其可用于在将来的公共卫生紧急情况下检测新兴病原体。

示例实施方式

在一个示例中，提供环介导等温扩增(LAMP)反应组件，其能够包括与固相反应介质组合的基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的一个示例中，所述固相介质能够基本上不含镁干扰剂。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述镁干扰剂能够包括含镁化合物和干扰镁的螯合剂。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述固相介质能够是亲水的、吸收性的和多孔的。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述固相介质能够是纤维素基介质。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述纤维素基介质能够具有在约30和约600之间的表面积与厚度比。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述纤维素基介质可具有小于约100微米的孔径。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述固相介质能够包括纸。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述固相介质能够包括玻璃纤维。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述固相介质能够包括尼龙、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素或亲水聚四氟乙烯(PTFE)，或其组合。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述LAMP反应组件还能够包括基本上不含镁干扰剂和吸湿剂的粘合剂。

在环介导等温扩增(LAMP)反应组件的另一个示例中，所述LAMP反应组件还能够包括比所述固相反应介质亲水性低的展开层。

在一个示例中，提供制造如本文叙述的LAMP反应组件的方法，所述方法能够包括将所述基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物与所述固相反应介质组合使得所述试剂混合物保持与所述固相反应介质接触。

在一个示例中，制造如本文叙述的LAMP反应组件的方法还能够包括使用不变色添加剂控制变色。

在制造如本文叙述的LAMP反应组件的方法的另一个示例中，所述不变色添加剂能够包括糖、缓冲剂、阻断剂或其组合。

在制造如本文叙述的LAMP反应组件的方法的另一个示例中，所述不变色添加剂能够包括糖，所述糖包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖或其组合中的一种或多种。

在制造如本文叙述的LAMP反应组件的方法的另一个示例中，所述不变色添加剂能够包括阻断剂，所述阻断剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其组合。

在另一个示例中，提供执行LAMP分析的方法，所述方法包括或包含提供如本文叙述的LAMP反应组件；将生物样品施加到所述反应组件；将所述组件加热到足以引发LAMP反应的温度；和维持所述温度足以完成所述LAMP反应的时间。

在执行LAMP分析的方法的一个示例中，所述生物样品能够是唾液、粘液、血液、尿液、粪便、汗液、呼出气冷凝物或其组合中的一种或多种。

在执行LAMP分析的方法的另一个示例中，所述生物样品能够是唾液。

在执行LAMP分析的方法的另一个示例中，所述方法还能够包括检测病毒病原体。

在执行LAMP分析的方法的另一个示例中，所述LAMP分析能够是逆转录LAMP(RT-LAMP)。

在一个示例中，提供用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统，所述系统包括或包含基本上非反应性固相反应介质；和非干扰试剂混合物。

在用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统的一个示例中，所述基本上非反应性固相反应介质能够具有约0.01mM至约5mM的缓冲能力。

在用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统的另一个示例中，所述基本上非反应性固相反应介质能够具有范围从约443nm至约570nm的λ_max。

在用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统的另一个示例中，所述基本上非反应性固相反应介质能够包括纤维素或玻璃纤维。

在用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统的另一个示例中，所述基本上非反应性固相反应介质能够是亲水的、吸收性的和多孔的。

在用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统的另一个示例中，所述基本上非反应性固相反应介质能够基本上不含氧化剂和pH干扰剂。

在用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统的另一个示例中，所述系统还能够包括粘合剂；展开层；间隔件；和塑料载体，其中所述粘合剂、展开层、间隔件和塑料载体中的每一个能够基本上不含氧化剂和pH干扰剂。

在用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统的另一个示例中，所述非干扰试剂混合物还能够包括一种或多种目标引物、DNA聚合酶或再增溶剂。

在另一个示例中，提供最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法，所述方法能够包括：提供最小化非LAMP反应产生的变色的固相反应介质；和在所述固相反应介质上执行所述LAMP分析。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的一个示例中，所述方法还能够包括控制非LAMP反应产生的质子引起的非LAMP反应产生的变色。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的另一个示例中，所述方法还能够包括使用不变色添加剂控制非LAMP反应产生的变色。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的另一个示例中，所述不变色添加剂能够包括糖、缓冲剂、阻断剂或其组合。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的另一个示例中，所述不变色添加剂能够包括糖，所述糖包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖或其组合中的一种或多种。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的另一个示例中，所述不变色添加剂能够包括阻断剂，所述阻断剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其组合。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的另一个示例中，最大化环介导等温扩增(LAMP)分析中的检测水平(LOD)的方法能够包括提供最小化非LAMP反应产物的反应环境和试剂。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的另一个示例中，用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统能够包括固相反应介质和LAMP试剂的组合，当在25℃下储存时，所述组合维持所述固相反应介质的色彩在所述固相介质的初始色调的10％以内。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的一个示例中，当储存超过30天、90天、365天、2年或5年中的一个或多个时，所述组合能够维持所述色彩。

在最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法的另一个示例中，当在25℃下于约40％和90％之间的相对湿度下储存时，所述组合能够维持所述色彩。

在另一个示例中，提供用于制造如本文叙述的色度LAMP系统的方法，所述方法能够包括将所述非干扰试剂混合物与基本上非反应性固相反应介质组合使得所述非干扰试剂混合物保持与所述基本上非反应性固相反应介质接触。

在用于制造如本文叙述的色度LAMP系统的方法的一个示例中，所述制造方法可包括：制备含有所述非干扰试剂混合物的溶液；和将所述试剂混合物涂布到所述基本上非反应性固相反应介质上。

在用于制造如本文叙述的色度LAMP系统的方法的另一个示例中，所述涂布能够包括将所述溶液滴落、喷涂、浸渍、浸泡或喷雾到所述基本上非反应性固相反应介质上。

在用于制造如本文叙述的色度LAMP系统的方法的另一个示例中，能够使用卷对卷(R2R)方法将所述非干扰试剂混合物与所述基本上非反应性固相反应介质组合。

应当理解，上述方法仅是本发明其中一些实施方式的说明。在不背离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可设计出多种修改和替代布置，并且所附权利要求旨在涵盖这样的修改和布置。因此，尽管上文已结合目前被认为是本发明最实用和优选的实施方式具体和详细地描述了本发明，但是对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，在不背离本文阐述的原理和构思的情况下，可进行包括在内的变型。

Claims (44)

1.环介导等温扩增(LAMP)反应组件，其包括：

与固相反应介质组合的基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物。

2.根据权利要求1所述的LAMP反应组件，其中所述固相介质基本上不含镁干扰剂。

3.根据权利要求2所述的LAMP反应组件，其中所述镁干扰剂包括含镁化合物和干扰镁的螯合剂。

4.根据权利要求1所述的LAMP反应组件，其中所述固相介质是亲水的、吸收性的和多孔的。

5.根据权利要求1所述的LAMP反应组件，其中所述固相介质是纤维素基介质。

6.根据权利要求5所述的LAMP反应组件，其中所述纤维素基介质具有在约30和约600之间的表面积与厚度比。

7.根据权利要求5所述的LAMP反应组件，其中所述纤维素基介质具有小于约100微米的孔径。

8.根据权利要求1所述的LAMP反应组件，其中所述固相介质包括纸。

9.根据权利要求1所述的LAMP反应组件，其中所述固相介质包括玻璃纤维。

10.根据权利要求1所述的LAMP反应组件，其中所述固相介质包括尼龙、聚砜、聚醚砜、醋酸纤维素、硝化纤维素或亲水聚四氟乙烯(PTFE)，或其组合。

11.根据权利要求1所述的LAMP反应组件，还包括基本上不含镁干扰剂和吸湿剂的粘合剂。

12.根据权利要求1所述的LAMP反应组件，还包括比所述固相反应介质亲水性低的展开层。

13.制造权利要求1所述的LAMP反应组件的方法，所述方法包括：

将所述基本上不含吸湿剂的LAMP试剂混合物与所述固相反应介质组合使得所述试剂混合物保持与所述固相反应介质接触。

14.根据权利要求13所述的方法，还包括：

使用不变色添加剂控制变色。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述不变色添加剂包括糖、缓冲剂、阻断剂或其组合。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述不变色添加剂包括糖，所述糖包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖或其组合中的一种或多种。

17.根据权利要求14所述的组合物，其中所述不变色添加剂包括阻断剂，所述阻断剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其组合。

18.执行LAMP分析的方法，所述方法包括：

提供权利要求1所述的LAMP反应组件；

将生物样品施加到所述反应组件；

将所述组件加热到足以引发LAMP反应的温度；和

维持所述温度足以完成所述LAMP反应的时间。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物样品是唾液、粘液、血液、尿液、粪便、汗液、呼出气冷凝物或其组合中的一种或多种。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述生物样品是唾液。

21.根据权利要求18所述的方法，还包括：

检测病毒病原体。

22.根据权利要求18所述的方法，其中所述LAMP分析是逆转录LAMP(RT-LAMP)。

23.用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统，所述系统包括：

基本上非反应性固相反应介质；和

非干扰试剂混合物。

24.根据权利要求23所述的系统，其中所述基本上非反应性固相反应介质具有约0.01mM至约5mM的缓冲能力。

25.根据权利要求23所述的系统，其中所述基本上非反应性固相反应介质具有范围从约443nm至约570nm的λ_max。

26.根据权利要求23所述的系统，其中所述基本上非反应性固相反应介质包括纤维素或玻璃纤维。

27.根据权利要求23所述的系统，其中所述基本上非反应性固相反应介质是亲水的、吸收性的和多孔的。

28.根据权利要求23所述的系统，其中所述基本上非反应性固相反应介质基本上不含氧化剂和pH干扰剂。

29.根据权利要求23所述的系统，还包括：

粘合剂；

展开层；

间隔件；和

塑料载体，

其中所述粘合剂、展开层、间隔件和塑料载体中的每一个基本上不含氧化剂和pH干扰剂。

30.根据权利要求23所述的系统，其中所述非干扰试剂混合物还包括：

一种或多种目标引物、DNA聚合酶或再增溶剂。

31.最大化固相pH依赖性环介导等温扩增(LAMP)分析中色度输出信号的准确度的方法，所述方法包括：

提供最小化非LAMP反应产生的变色的固相反应介质；和

在所述固相反应介质上执行所述LAMP分析。

32.根据权利要求31所述的方法，还包括：

控制非LAMP反应产生的质子引起的非LAMP反应产生的变色。

33.根据权利要求31所述的方法，还包括：

使用不变色添加剂控制非LAMP反应产生的变色。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述不变色添加剂包括糖、缓冲剂、阻断剂或其组合。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述不变色添加剂包括糖，所述糖包括海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖或其组合中的一种或多种。

36.根据权利要求33所述的组合物，其中所述不变色添加剂包括阻断剂，所述阻断剂包括牛血清白蛋白、酪蛋白或其组合。

37.最大化环介导等温扩增(LAMP)分析中的检测水平(LOD)的方法，所述方法包括：

提供最小化非LAMP反应产物的反应环境和试剂。

38.用于色度环介导等温扩增(LAMP)分析的系统，所述系统包括：

固相反应介质和LAMP试剂的组合，当在25℃下储存时，所述组合维持所述固相反应介质的色彩在所述固相介质的初始色调的10％以内。

39.根据权利要求38所述的系统，其中当储存超过30天、90天、365天、2年或5年中的一个或多个时，所述组合维持所述色彩。

40.根据权利要求38所述的系统，其中当在25℃下于约40％和90％之间的相对湿度下储存时，所述组合维持所述色彩。

41.用于制造权利要求1所述的色度LAMP系统的方法，所述方法包括：

将所述非干扰试剂混合物与基本上非反应性固相反应介质组合使得所述非干扰试剂混合物保持与所述基本上非反应性固相反应介质接触。

42.根据权利要求42所述的方法，其中所述制造方法包括：

制备含有所述非干扰试剂混合物的溶液；和

将所述试剂混合物涂布到所述基本上非反应性固相反应介质上。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述涂布包括将所述溶液滴落、喷涂、浸渍、浸泡或喷雾到所述基本上非反应性固相反应介质上。

44.根据权利要求42所述的方法，其中使用卷对卷(R2R)方法将所述非干扰试剂混合物与所述基本上非反应性固相反应介质组合。