TR2023008289T2

TR2023008289T2 - Loop-mediated isothermal amplification (lamp) on a solid-phase medium

Info

Publication number: TR2023008289T2
Application number: TR2023/008289
Authority: TR
Inventors: Gavin Mike; Seville Jordan; Mcchesney Darby; Verma Mohit; Wang Jiangshan; Kannan Maruthamuthu Murali; Dextre Andres; M Laduca Frank
Original assignee: Purdue Research Foundation; Raytheon Bbn Technologies Corp
Filing date: 2022-01-15
Publication date: 2023-09-21

Abstract

The present disclosure is drawn to loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction assemblies including a substantially hygroscopic agent free LAMP reagent mixture in combination with a solid-phase reaction medium. The present disclosure also includes systems for a chromatic LAMP analysis including a substantially non-reactive solid phase reaction medium, and a non-interfering reagent mixture. The present disclosure also includes solid phase LAMP reaction mediums comprising a substrate, an adhesive layer disposed on the substrate, a reaction layer disposed on the adhesive layer, and a spreading layer disposed on the reaction layer. The present disclosure also includes methods of testing for a presence of a target nucleotide sequence including providing a biological sample, and dispensing the sample into a test environment having a solid phase reaction medium in combination with a LAMP reagent mixture and a pH sensitive dye.

Description

TARIFNAME BIR KATI FAZ ORTAM ÜZERINDE DÖNGÜ ARACILI IZOTERMAL AMPLIFIKASYON Ilgili Basvurular Bu basvuru, her biri buraya referans olarak dahil edilmis olan 15 Ocak 2021 tarihinde dosyalanmis Amerika Birlesik Devletleri Geçici Patent Basvurusu Seri No. 63/138,316 ve 63/138,318 sayili belgelere rüçhan hakki talep etmektedir. Teknigin Bilinen Durumu Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), çesitli analitik amaçlar için nükIeotidIerin amplifikasyonuna imkân veren bir moleküler biyoloji teknigidir. Kantitatif PCR (qPCR), hedeflenen bir nükIeotidin amplifikasyonunun izlenmesine izin veren bir PCR uyarlamasidir. Tanisal qPCR, bulasici hastaliklarin, kanserin ve genetik anormalliklerin göstergesi olan nükIeotidIeri tespit etmek için uygulanmaktadir. Ters transkripsiyon PCR (RT-PCR), bir hedef RNA nükIeotidIerinin tespitine izin veren bir qPCR uyarlamasidir. Bu yetenek nedeni ile RT-PCR, virüs patojenlerini tespit etmek için çok uygundur. Bununla birlikte, RT-PCR, beIirIi hasta basi ortamlarinda bulunamayabilecek olan büyük ekipman kullanir. Ek olarak, RT-PCR, uygulamayi gerçeklestirmek ve sonuçlari elde etmek için egitim" personel, önemIi numune hazirligi ve zaman gerektirmektedir. Buna karsilik, Döngü Aracili Izotermal Amplifikasyon (LAMP), hedef nükIeotidIerin tanisal tanimlanmasina yönelik daha basit bir yaklasimdir. Özellikle de LAMP, spesifik nükIeotit sekanslarini çogaltmak için tek isIemIi bir nükleik asit amplifikasyon metodudur. Bir izotermal isitma isleminin kullanilmasina ek olarak, LAMP, örnegin PCR tarafindan kullanilan daha karmasik bir roresan göstergeden ziyade bir renk degisikligi gibi basit bir görsel çikti test göstergesi kullanabilir. RNA'dan hedef nükIeotitIeri tanimlamak amaci ile RT-PCR gibi ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) kullanilabilir ve bu nedenle viral patojenlerin varligini ya da yoklugunu tanimlamak için tanisal bir kapasitede kullanilabilir. LAMP daha basit oldugundan dolayi, daha az ekipman ve numune hazirlama iIe gerçekIestiriIebiIir ve bu nedenle de örnegin kIinikIer, acil servisler gibi hasta basi ortamlarinda ve hatta mobiI olarak kullanim için daha erisilebilir olmaktadir. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, bir kati faz ortami üzerinde Döngü Aracili Izotermal Amplifikasyon (LAMP) kullanilarak bir hedef nükleotidin tespit edilmesinde kullanim için teknolojilere (örnegin, metotlar, sistemler ve birIesimIer) yöneliktir. Bazi yönlerde, hedef nükleotidin iIgiIeniIen bir patojenin içinde bulundugu biIinebiIir. Patojenin bir virüs oldugu durumlarda LAMP analizi bir ters transkripsiyon (RT) RT-LAMP analizi olabilir. Bulusun bazi yapilanmalari, LAMP reaksiyon düzenekleri, bir kati faz reaksiyon ortami iIe kombinasyon halinde büyük ölçüde higroskopik ajan içermeyen bir LAMP reaktif karisimi ihtiva edebilir. Bir yönde, kati faz ortami hidrofiIik, emici ve gözenekli olabilir. Bir yönden, kati faz ortami büyük ölçüde magnezyum ile etkilesen ajanlardan ari (arindirilmis) oIabiIir. Baska bir yönde, magnezyum ile etkilesen ajanlar, magnezyum içeren bilesikleri ve magnezyum iIe etkilesime giren selatlastirici ajanlari ihtiva edebilir. Baska bir yönden, kati faz ortami seIüIoz bazIi bir ortam olabilir. Bir yönden, seIüIoz bazIi ortam, yaklasik olarak 30 ila yaklasik olarak 600 arasinda bir yüzey alani - kaIinIik oranina sahip olabilir. Baska bir yönde, seIüIoz bazli ortam, yaklasik olarak 1 mikrondan büyük ve yaklasik olarak 100 mikrondan daha küçük bir gözenek boyutuna sahip olabilir. Bir yönde, kati faz ortami kagit ihtiva edebilir. Baska bir yönde, kati faz ortami cam elyafi ihtiva edebilir. Yine bir baska yönde, kati faz ortami naylon, polisüIfon, polietersülfon, seIüIoz asetat, nitroseIüIoz ya da hidrofiIik politetrafloroetilen (PTFE) ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, LAMP reaksiyon birlesimi bundan baska olarak magnezyum iIe etkilesime giren ajanlar ve higroskopik ajanlardan büyük ölçüde ari (arindirilmis) olan bir yapistirici ihtiva edebilir. Baska bir yönde, LAMP reaksiyon birlesimi bundan baska olarak, kati faz reaksiyon ortamindan daha az hidrofiIik olan bir yayma katmani ihtiva edebiIir. Bqusun baska bir yapilanmasinda, daha önceki kisimlarda belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon birlesiminin üretimine yöneIik metotlar, higroskopik ajandan büyük ölçüde ari olan LAMP reaktif karisiminin, böylece reaktif karisiminin kati faz reaksiyon ortami ile temas halinde tutulacagi bir sekilde kati faz reaksiyon ortami iIe birIestiriImesini ihtiva edebilir. Bir yönde, metot, renk degistirmeyen bir katki maddesi kullanilarak renk degisikliginin kontroI edilmesini ihtiva edebilir. Diger bir yönde, renk degistirmeyen katki maddesi bir seker, bir tampon, bir bloke edici madde ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Diger bir yönde renk degistirmeyen katki maddesi, trehaIoz, glikoz, sükroz, dekstran ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva eden bir seker ihtiva edebilir. Baska bir yönde renk degistirmeyen katki maddesi, sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva eden bir bloke etme maddesi ihtiva edebilir. Bulusun baska bir yapilanmasinda, bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik metotlar, daha önceki kisimlarda belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon birlesiminin saglanmasini, reaksiyon birlesimine bir biyolojik numunenin uygulanmasini, birlesimin LAMP reaksiyonunu baslatmak üzere yeterli olan bir sicakliga isitilmasini ve LAMP reaksiyonunu tamamlamak üzere yeterli olan bir süre boyunca sicakligin korunmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da daha fazlasi olabilir. Diger bir yönde, biyolojik örnek tükürük olabilir. Bir yönde metot bundan baska olarak, bir viral patojenin tespit edilmesini ihtiva edebilir. Diger bir yönde, LAMP analizi ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) olabilir. Bulusun baska bir yapilanmasinda, bir kromatik LAMP analizine yönelik bir sistem, büyük ölçüde reaktif olmayan bir kati faz reaksiyon ortami ve etkilesimde bulunmayan bir reaktif karisimi ihtiva edebilir. Bir yönde, reaktif olmayan kati faz ortami büyük ölçüde hidrofilik, emici ve gözenekli olabilir. Baska bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, oksitleyici ajanlar, pH ile etkilesime giren ajanlar ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olabilir. Bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 5 mM arasinda bir tamponlama kapasitesine sahip olabilir. Baska bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, pH'a duyarli bir boya ile birlestirildigi zaman bir test araligi içinde bir maksimum absorbans dalga boyuna (Amaks) sahiptir. Baska bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami selüloz ya da cam elyafi ihtiva edebilir. Baska bir yönde, sistem bundan baska olarak bir yapistirici, bir yayma katmani, bir ara parça, bir plastik tasiyici ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir yönde, yapistirici, yayma katmani, ara parça ya da plastik tasiyicinin her biri büyük ölçüde oksitleyici maddeler ve pH ile etkilesime giren maddelerden ari olabilir. Baska bir yönde, etkilesime girmeyen reaktif karisim bunlardan baska olarak, hedef primerler, DNA polimeraz ya da bir yeniden çözündürme ajanindan birinin ya da daha fazlasini ihtiva edebilir. Bulusun diger bir yapilanmasinda, bir kati faz pH'a bagli LAMP analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik metotlar, LAMP disi reaksiyonla üretilen renk bozulmasini en aza indiren bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasini ve kati faz reaksiyon ortami üzerinde LAMP reaksiyonunun gerçeklestirilmesini ihtiva edebilir. Bir yönde, metot, LAMP disi bir reaksiyonla üretilen protonlardan LAMP disi bir reaksiyonla üretilen renk degisikliginin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, renk degistirmeyen bir katki maddesi kullanilarak LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikliginin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Bir yönde, renk degistirmeyen katki maddesi bir seker, bir tampon, bir bloke edici madde ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Diger bir yönde renk degistirmeyen katki maddesi, trehaloz, glikoz, sükroz, dekstran ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva eden bir seker ihtiva edebilir. Baska bir yönde renk degistirmeyen katki maddesi, sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva eden bir bloke etme maddesi ihtiva edebilir. Yine bulusun bir diger yapilanmasinda, bir LAMP analizinde bir tespit seviyesini (LOD) en üst düzeye çikarmaya yönelik metotlar, bir reaksiyon ortaminin ve LAMP disi reaksiyon ürünlerini en aza indiren reaktiflerin saglanmasini ihtiva edebilir. Yine bulusun bir diger yapilanmasinda, bir kromatik LAMP analizine yönelik sistemler, bir kati faz reaksiyon ortaminin ve LAMP reaktiflerinin bir kombinasyonunu ihtiva edebilmekte olup, bu da, seçilen bir sicaklikta (örnegin, yaklasik olarak 25 CC'de oda sicakligi) depolandigi zaman, kati faz reaksiyon ortaminin, kati faz ortaminin bir baslangiç tonunun kombinasyon 30 gün, 90 gün, 365 gün, 2 yil ya da 5 yildan biri ya da birkaçindan daha uzun bir süre boyunca depolandigi zaman renklenmeyi koruyabilir. Baska bir yönde, kombinasyon, yaklasik olarak %40 ila %90 arasinda bir bagil nemde depolandigi zaman renklenmeyi muhafaza edebilir. Baska bir yönde, seçilen sicaklik, yaklasik olarak - 20 (C ile yaklasik olarak 37 CC arasindaki bir aralik içindeki herh angi bir sicaklik olabilir. Yine bulusun bir diger yapilanmasinda, daha önceki kisimlarda belirtildigi gibi bir kromatik LAMP sisteminin üretimine yönelik metotlar, etkilesime girmeyen reaktif karisiminin, böylece etkilesime girmeyen reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile temas halinde tutulacagi bir sekilde büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile birlestirilmesini ihtiva edebilir. Bir yönde, metot, etkilesime girmeyen reaktif karisimini ihtiva eden bir çözeltinin hazirlanmasini ve reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami üzerine kaplanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, kaplama, çözeltinin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami üzerine damlatilmasini, püskürtülmesini, daldirilmasini, islatilmasini ya da bugulanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, etkilesime girmeyen reaktif karisimi, bir makaradan makaraya (RZR) islemi kullanilarak büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile birlestirilebilir. Yine bulusun bir diger yapilanmasi, bir kati faz LAMP reaksiyon ortami, bir substrat, substrat üzerine yerlestirilmis bir yapiskan katman, yapiskan katman üzerine yerlestirilmis bir reaksiyon katmani ya da reaksiyon katmani üzerine yerlestirilmis bir yayma katmani ihtiva edebilir. Bir yönde, substrat optik olarak seffaf bir malzeme olabilmektedir. Baska bir yönde, yapiskan katman büyük ölçüde uçucu maddelerden ari olabilir. Baska bir yönde, burada yapiskan katman, substrat üzerine süreksiz bir sekilde yerlestirilebilmektedir. Baska bir yönde, substrat optik olarak seffaf bir plastik tasiyici olabilir. Bir yönde, kati faz LAMP reaksiyon ortami ayrica bir test alani ihtiva edebilir. Bir yönde, test alani, süreksiz yapiskan katmanlarin en az iki bölümü ile tanimlanabilmektedir. Baska bir yönde, test alani, süreksiz yapiskan katmanlarin en az üç bölümü ile tanimlanabilmektedir. Diger bir yönde, test alani, süreksiz yapiskan katmanlarin en az dört bölümü ile tanimlanabilmektedir. Bir yönde, kati faz LAMP reaksiyon ortami bundan baska olarak, reaktiflerden büyük ölçüde ari olan en az bir bölüm ihtiva edebilir. Baska bir yönde, reaksiyon katmani, hedef primerler, DNA polimeraz ya da bir yeniden çözündürme ajanindan birini ya da daha fazlasini ihtiva eden reaktifleri ihtiva edebilir. Baska bir yönde, reaktifler bir LAMP reaksiyonu gerçeklestirmek için yeterli olan bir bilesim olusturabilir. Bir yönde, reaksiyon katmani süreksiz oIabiImektedir. Baska bir yönde, kati faz LAMP reaksiyon ortami bundan baska olarak, cam elyafi, naylon, seIüIoz, poIisüIfon, poIietersüIfon, seIüIoz asetat, nitroseIüIoz, polyester, hidrofiIik politetrafloroetilen (PTFE) ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden fazlasini ihtiva eden bir yayma katmani içerebilir. Bir yönde, yayma katmani optik olarak seffaf olabilir. Baska bir yönde, kati faz LAMP reaksiyon ortami bir ara parça malzemesi ihtiva edebilir. Bir yönde, ara parça malzemesi cam elyafi, naylon, seIüIoz, poIisüIfon, poIietersüIfon, seIüIoz asetat, nitroseIüIoz, poIistiren, polyester, hidrofiIik politetrafloroetilen (PTFE) ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, ara parça malzemesi, reaksiyon katmani ile ayni düzlemde yönlendirilebilmektedir ve reaksiyon katmaninin bölümleri arasinda yönlendirilebilmektedir. Baska bir yönde, reaksiyon katmani yaklasik olarak 30 ila yaklasik olarak 600 arasinda bir yüzey alani - kalinlik oranina sahip oIabiImektedir. Baska bir yönde, reaksiyon katmani yaklasik olarak 0,05 mm ila yaklasik olarak 2 mm arasinda bir kalinliga sahip oIabiImektedir. Baska bir yönde, reaksiyon katmani yaklasik olarak 4 mm ila yaklasik olarak 12 mm arasinda bir genislige ve yaklasik olarak 4 mm ila yaklasik olarak 25 mm arasinda bir uzunluga sahip olabilir. Baska bir yönde, reaksiyon katmaninin bölümleri arasindaki bir minimum bosluk yaklasik olarak 1,8 mm ile yaklasik olarak 2,2 mm arasinda oIabiImektedir. Bulusun bir diger yapilanmasinda, bir viral patojenin varligina yönelik test metotlari, bir denekten bir tükürük numunesinin saglanmasini ve numunenin, bir LAMP reaktif karisimi ve pH'a duyarli bir boya ile kombinasyon halinde bir kati faz reaksiyon ortamina sahip olan bir test ortami içine dagitilmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, metot, kati faz ortaminin rengini degistirebilen nitelikteki uçucu ajanlarin, higroskopik ajanlarin ve pH'a duyarli olmayan ajanlarin miktarinin en aza indirilmesini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan miktarda hedef primerler, DNA polimeraz ya da bir yeniden çözündürme ajaninin (re-solubilization agent) bir ya da birkaçinin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, bir ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir miktarda ters transkriptazin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, viral patojeni tespit etmek için yeterli olan bir miktarda bir ya da daha fazla hedef primerin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, numunenin test ortami içine dagitilmasindan sonra bir saatten daha kisa bir süre içinde bir test sonucunun üretilmesini ihtiva edebilir. Yine bulusun bir diger yapilanmasinda, bir tükürük numunesinin bir kati faz LAMP reaksiyonu ile test edilmeye uygunlugunu dogrulamaya yönelik metotlar, en az bir test alani ya da test noktasi ve bir negatif kontrol alanina sahip olan bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, en az bir test alani ya da test noktasi, LAMP reaktiflerinin ve pH'a duyarli bir boyanin bir kombinasyonunu ihtiva edebilir. Baska bir yönde, negatif kontrol bölgesi pH'a duyarli bir boya ihtiva edebilir ve LAMP reaktiflerini disarda birakabilir. Baska bir yönde metot, tükürük numunesinin kati faz reaksiyon ortamina uygulanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, negatif kontrol bölgesinde pH'a duyarli boyanin aktivasyonunun dogrulanmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, pH'a duyarli boya, fenol kirmizisi, fenolftalein, azolitmin, bromtimol mavisi, naftolftalein, kresol kirmizisi ya da bunlarin kombinasyonlarindan en az bir tanesi olabilir. Baska bir yönde, LAMP reaktifleri, uçucu reaktifler, pH'i etkileyen reaktifler, magnezyum içeren reaktifleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olabilir. Diger bir yönde, LAMP reaktifleri, DNA polimeraz, ters transkriptaz, bir hedef bölge için primerler ya da bunlarin kombinasyonlari dahil olmak üzere etkilesime girmeyen LAMP reaktiflerini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot bundan baska olarak, süreksiz yapiskan katmanlarin en az iki bölümü tarafindan tanimlanan test bölgesinin ya da test noktasinin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, süreksiz yapiskan katmanlarin en az üç bölümü tarafindan tanimlanan test bölgesinin ya da noktasinin saglanmasini ihtiva edebilir. Yine bulusun bir diger yapilanmasinda, bir kati faz LAMP reaksiyonundan elde edilen pozitif bir test sonucunun dogrulugunu maksimize etmeye yönelik metotlar, her biri ortak bir pH'a duyarli boya ve LAMP reaktiflerinin bir kombinasyonunu ihtiva eden en az üç test bölgesi ya da noktasina sahip olan bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasini ihtiva edebilmekte olup, burada her bir bölge bir hedef patojenden farkli bir primer sekansi ihtiva etmektedir. Bir yönde, metot bir LAMP reaksiyonunun baslatilmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, test bölgesinden ya da noktalarindan en az iki tanesi pH'a duyarli boyayi aktive ettigi zaman ve bir birinci renkten ikinci bir renge bir degisiklik yasadigi zaman pozitif bir test sonucunun dogrulanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot bundan baska olarak, bir ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir miktarda ters transkriptazin saglanmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, pH'a duyarli boya, fenol kirmizisi, fenolftalein, azolitmin, bromtimol mavisi, naftolftalein, kresol kirmizisi ya da bunlarin kombinasyonlarindan en az bir tanesi olabilir. Baska bir yönde, LAMP reaktifleri, uçucu reaktifler, pH'i etkileyen reaktifler, magnezyum içeren reaktifleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olabilir. Diger bir yönde, hedef patojen bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojeni ihtiva edebilir. Bir yönde, hedef patojen bir viral patojen ihtiva edebilir. Bir yönde, viral patojen bir dsDNA virüsü, bir ssDNA virüsü, bir dsRNA virüsü, bir pozitif zincirli ssRNA virüsü, bir negatif zincirli ssRNA virüsü, bir ssRNA-RT virüsü ya da bir ds-DNA-RT virüsü ihtiva edebilir. Bir yönde, her bir primer sekansi, H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 ya da SARS-CoV-Z'yi ihtiva eden bir viral hedeften bir sekans ile eslesebilir. Bulusun bir yapilanmasinda, bir hedef nükleotit sekansnin varligina yönelik test metotlari, bir biyolojik numunenin saglanmasini ve numunenin, bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaktif karisimi ve pH'a duyarli bir boya ile kombinasyon halinde bir kati faz reaksiyon ortamina sahip olan bir test ortami içine dagitilmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, test ortami uçucu reaktifler, pH'i etkileyen reaktifler, kurutma ajanlari ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde arinmis olabilir. Bir yönde metot, bir test ortami sicakliginin saniyede yaklasik olarak 0,1 CC bir hizda yükseltilmesini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, test ortaminda 1 (C'den daha az bir degiskenlige sahip olan bir isitma es dagilimliligi saglamayi ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, selüloz ya da cam elyafi ihtiva eden bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasini ihtiva edebilir. Bir yönde metot, bir ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir miktarda ters transkriptazin saglanmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar ya da diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da bunlarin bir kombinasyonundan en az bir tanesi olabilir. Bir yönde metot, bir tükürük toplama cihazi, bir burun sürüntü çubugu, bir kan toplama cihazi, bir idrar toplama cihazi, bir ter toplama cihazi, bir soluk verilen nefes kondensati toplama cihazi ya da bir diski toplama cihazindan birini ya da birkaçini kullanarak biyolojik numunenin toplanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde hedef nükleotit sekansi, bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojenden en az bir tanesinden olabilir. Bir yönde, hedef nükleotit sekansi bir viral patojenden olabilir. Bir yönde, viral patojen asagidakilerden olusan grup arasindan seçilebilir: Coronoviridae, Orfhomyxoviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Adenoviridae ve Parvoviridae. Diger bir yönde, viral patojen, siddetli akut solunum sendromu koronavirüsü (SARS- CoV-1), siddetli akut solunum sendromu koronavirüsü 2 (SARS-CoV-Z), Orta Dogu solunum sendromu (MERS), grip ve H1N1'den olusan grup içinden seçilebilir. Bir yönde, hedef nükleotit sekansi bir siddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-Z) patojeninden olabilir. Yine bulusun bir diger yapilanmasinda, bir biyolojik numune test aparati, bir susuzlastirilmis döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaktif karisimi ve bir susuzlastirilmis pH'a duyarli boya ile kombinasyon halinde bir kati faz reaksiyon ortamina baglanan bir substrat ihtiva edebilmekte olup, burada aparat, oda sicakliginda depolandigi zaman 6 ay boyunca depolandiktan sonra en az yaklasik olarak %95'lik bir test dogrulugu derecesi saglar. Bir yönde, aparat, oda sicakliginda depolandigi zaman 12 ay boyunca depolandiktan sonra en az yaklasik olarak %95'lik bir test dogrulugu derecesi saglayabilir. Baska bir yönde, aparat, oda sicakliginda depolandigi zaman 2 yil boyunca depolandiktan sonra en az yaklasik olarak %95'lik bir test dogrulugu derecesi saglayabilir. Yine bulusun bir diger yapilanmasinda, bir biyolojik numune test sistemi, bir susuzlastirilmis döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaktif karisimi ve bir susuzlastirilmis pH'a duyarli boya ile kombinasyon halinde bir kati faz reaksiyon ortamina baglanan bir substrat ihtiva edebilmekte olup, söz konusu muhafaza bir biyolojik numuneyi almak üzere çalistirilabilir niteliktedir. Bir yönde, biyolojik numune test sistemi, LAMP reaktifi karisimi arasinda bir LAMP reaksiyonunu baslatmak ve sürdürmek üzere yeterli olan bir iç sicakliga kabi izotermal olarak isitmak üzere yapilandirilan bir isitici ihtiva edebilir. Baska bir yönde biyolojik numune test sistemi, pH'a duyarli boya araciligi ile bir test sonucu üretmek üzere kullanilan bir süre için bir biyolojik numune ihtiva edebilir. Bir yönde substrat, optik olarak seffaf bir malzeme ihtiva edebilir. Baska bir yönde substrat, bir yapistirici araciligi ile kati faz reaksiyon ortamina kenetlenebilmektedir. Baska bir yönde yapistirici, büyük ölçüde optik olarak seffaf olabilir. Baska bir yönde substrat, bir muhafazanin bir kismini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, biyolojik numune test sistemi, substrat üzerine yerlestirilmis bir yapiskan katman, yapiskan katman üzerine yerlestirilmis bir reaksiyon katmani ve reaksiyon katmani üzerine yerlestirilmis bir yayma katmani ihtiva edebilir. Bir yönde, biyolojik numune test sistemi bundan baska olarak, reaksiyon katmani ile ayni düzlemde yönlendirilen bir ara parça katmani ihtiva edebilir. Baska bir yönde, muhafaza substrata karsi yerlestirilebilmektedir. Baska bir yönde, muhafaza bundan baska olarak, yayma katmanina karsi yerlestirilebilmektedir. Baska bir yönde, muhafaza, substrati, yapiskan katmani, reaksiyon katmanini ve yayma katmanini büyük ölçüde çevreleyebilmektedir. Sekillerin Kisa Açiklamasi Bulusun diger özellikleri ve avantajlari, örnekleme yolu ile bulusa ait özellikleri birlikte gösteren, ekte yer alan sekiller ile birlikte ele alindigi zaman asagidaki ayrintili açiklama ile asikâr hale gelecektir. Sekil 1, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir LAMP analizinin gerçeklestirilmesine yönelik bir metodu tasvir etmektedir; Sekil 2, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kati faz pH bagimli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmak için bir metodu tasvir etmektedir; Sekil 3a, bir örnek yapilanmaya uygun olarak üç test bölümüne sahip olan bir kati faz LAMP reaksiyon ortamini göstermektedir; Sekil 3b, bir örnek yapilanmaya uygun olarak iki test bölümüne sahip olan bir kati faz LAMP reaksiyon ortamini göstermektedir; Sekil 30, bir örnek yapilanmaya uygun olarak dört test bölümüne sahip olan bir kati faz LAMP reaksiyon ortamini göstermektedir; Sekil 3d, bir örnek yapilanmaya uygun olarak üç test bölümüne sahip olan ve bir yayma katmaninin olmadigi bir kati faz LAMP reaksiyon ortamini göstermektedir; Sekil 3e, bir örnek yapilanmaya uygun olarak iki test bölümüne sahip olan ve bir yayma katmaninin olmadigi bir kati faz LAMP reaksiyon ortamini göstermektedir; Sekil 3f, bir örnek yapilanmaya uygun olarak dört test bölümüne sahip olan ve bir yayma katmaninin olmadigi bir kati faz LAMP reaksiyon ortamini göstermektedir; Sekil 4, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir viral patojenin varligina yönelik bir test metodunu tasvir etmektedir; Sekil 5, bir tükürük numunesinin bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kati faz LAMP reaksiyonu ile test edilmek üzere uygunlugunu dogrulamak için bir metodu tasvir etmektedir; Sekil 6, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kati faz LAMP reaksiyonundan gelen bir pozitif test sonucunun dogrulugunu en üst düzeye çikarmak için bir metodu tasvir etmektedir; Sekil 7, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir hedef nükleotitin varligina yönelik bir test metodunu tasvir etmektedir; Sekil 8a, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir biyolojik test kitine yönelik islemleri tasvir etmektedir; Sekil 8b, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir biyolojik test kitine yönelik bir renk semasini göstermektedir; Sekil 9, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kagit bazli LAMP düzenegi göstermektedir; Sekil 10, bir örnek yapilanmaya uygun olarak 1. derece ve 222. derece kromatografi kagidinin malzeme taramasini göstermektedir; Sekil 11, bir örnek yapilanmaya uygun olarak su içine eklenen isi ile inaktive edilmis SARS- CoV-2 kullanilarak sivi içinde bir reaksiyonu göstermektedir; Sekil 12, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kagit serit formatini göstermektedir; Sekil 13, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kati faz LAMP reaksiyon ortamini göstermektedir; Sekil 14, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kati faz LAMP reaksiyon ortamini göstermektedir; Sekil 15A, bir örnek yapilanmaya uygun olarak 1. derece kromatografi kagidi ile 222. derece kromatografi kagidinin arasindaki bir karsilastirmayi göstermektedir; Sekil 158, bir örnek yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP reaksiyon karisiminin farkli baslangiç pH'inda kurutma dahil edildigi zaman RT-LAMP'i göstermektedir; Sekil 16, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir test seridi formatini göstermektedir; Sekil 17, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir test seridi birlestirme islemini göstermektedir; ve Sekil 18A, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir biyolojik test sistemine yönelik çalismalari göstermektedir; Sekil 188, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir biyolojik test sistemine yönelik çalismalari göstermektedir; Sekil 19A - 19F, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kagit bazli cihazin semalarini ve kolorimetrik karakterizasyonunu göstermektedir; Sekil 20A - 20C, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kagit üzerindeki kolorimetrik tepkilerin dijital analizini göstermektedir; Sekil 21A, bir örnek yapilanmaya uygun olarak isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-Z'nin çesitli konsantrasyonlarinda bir cihazin dogrulanmasini göstermektedir; Sekil 218, bir örnek yapilanmaya uygun olarak çesitli pH degerlerinde fenoI kirmizisi renk kalibrasyonunu göstermektedir; Sekil 21C, bir örnek yapilanmaya uygun olarak degisen sablon konsantrasyonlarinda RT- LAMP kolorimetrik tepkisinin yesil kanal renk yogunlugunu göstermektedir; Sekil 21D, bir örnek yapilanmaya göre bir kolorimetrik raportör olarak EBT'yi kullanarak kromatografi kagidi üzerinde LAMP'i göstermektedir; Sekil 21E, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir gösterge olarak EBT kullanarak çesitli kagitlar üzerinde LAMP'in kolorimetrik yanitini göstermektedir; Sekil 21F, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kolorimetrik gösterge olarak EBT kullanarak biodyne A amfoterik kagit üzerinde LAMP tespitini göstermektedir; Sekil 21G, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kurutulduktan sonra kagidin baslangiç rengi üzerindeki tek reaktantin ortadan kaldirilmasinin etkisini göstermektedir; ve Sekil 21H, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde trehaloz ve Tween 20'nin etkisini göstermektedir; Sekil 21 I, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kolorimetrik yanit üzerinde tükürük islemenin etkisini göstermektedir; Sekil 22A, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde plakanin etkisini göstermektedir; Sekil 228, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde kapaklarin etkisini göstermektedir; Sekil 22C, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde isitma metodunun etkisini göstermektedir; Sekil 22D, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde devreye girme hizinin etkisini göstermektedir; Sekil 23A ve 238, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kolorimetrik algi anketlerini göstermektedir. Simdi gösterilen örnek niteligindeki yapilanmalara atifta bulunulacak ve burada bunu açiklamak üzere belirli bir dil kullanilacaktir. Bununla birlikte, bu sekilde teknolojinin kapsaminin sinirlandirilmasinin amaçlanmadigi anlasilacaktir. Bulusun Detayli Açiklamasi Bulus yapilandirmalari tarif edilmeden önce, bu açiklamanin burada açiklanan beIirIi yapilar, islem adimlari ya da malzemeler ile sinirli olmadigi, ancak ilgili tekniklerde siradan uzmanliga sahip olan kisiler tarafindan anlasilacagi gibi bunlarin esdegerlerine genisletildigi anIasiImaIidir. Ayni zamanda, burada kuIIaniIan terminolojinin, yalnizca beIirIi örnekleri ya da yapilanmalari açiklamak amaci ile kullanildigi ve sinirlayici olmasinin amaçlanmadigi da anIasiImaIidir. Farkli çizimlerdeki ayni referans numaralari ayni elemani temsil etmektedir. Akis semalarinda ve islemlerde saglanan sayilar, adimlarin ve islemlerin gösterilmesinde açiklik saglamak için verilmistir ve mutlaka belirli bir sirayi ya da diziyi belirtmemektedir. Bundan baska olarak, tarif edilen özellikler, yapilar ya da karakteristikler, bir ya da daha fazla yapilanmada herhangi bir uygun sekilde birlestirilebilirler. Asagida yer alan açiklamada, çesitli bulus yapiIanmaIarinin tam olarak anlasilmasini saglamak için, örnegin bilesim örnekleri, dozaj formlari, islemler vb. gibi çok sayida spesifik detay saglanmaktadir. Bununla birlikte, iIgiIi teknikte uzmanliga sahip olan bir kisi, bu tür ayrintili yapiIanmaIarin burada ifade edilen geneI bqus kavramlarini sinirIamadigini, ancak sadece bunlari temsil ettigini kabul edecektir. Tanimlar Burada kullanildigi sekli ile "bir" ve benzeri tekiIIik ifade eden gramer formlarinin, baglam açikça aksini gerektirmedigi sürece çogul atiflari da kapsadigina dikkat edilmelidir. Dolayisi ile de örnek olarak, "bir yardimci maddeye" yapilan atif, bu tür yardimci maddelerden biri ya da daha fazlasina yapilan atiflari ihtiva etmektedir ve "tasiyiciya" yapilan atif, bu tür tasiyiciIardan biri ya da daha fazlasina yapilan atiflari ihtiva etmektedir. Burada kullanildigi sekli ile "formülasyon" ve "bilesim" terimleri birbirinin yerine geçecek bir sekilde kullanilir ve iki ya da daha fazla bilesigin, elementin ya da moIeküIün bir karisimini ifade eder. Bazi yönlerde, "formülasyon" ve "bilesim" terimleri, bir ya da daha fazla aktif maddenin bir tasiyici ya da baska yardimci maddeler ile karisimini ifade etmek için kullanilabilir. Burada kuIIaniIdigi sekli ile, "çözünür" terimi, belirli bir çözücü içinde bu maddenin çözünme kabiliyeti ile ilgili olarak bir maddenin ya da ajanin bir ölçüsü ya da özeIIigidir. BiIesimin belirli bir biIesenindeki bir maddenin ya da ajanin çözünürlügü, örnegin yaklasik olarak 25 CC ya da yaklasik olarak 37 (C gibi belirli bir sicaklikta gözle g örünür sekilde berrak bir çözelti olusturmak üzere çözünen madde ya da ajanin miktarini ifade eder. Burada kullanildigi sekli ile, "IipofiIik" terimi, suda serbestçe çözünmeyen bilesikleri ifade eder. Bunun aksine olarak, "hidrofiIik" terimi, suda çözünebilen bilesikleri ifade eder. Burada kullanildigi sekli ile bir "denek" bir hayvani ifade eder. Bir yönde hayvan bir memeli olabilir. Baska bir yönde, memeli bir insan olabilir. Burada kullanildigi sekli ile, burada açiklanan bir bilesimin durumuna atifta bulunmak için kullanildigi zaman "sivi olmayan", bilesimin bir yari kati ya da kati olduguna iliskin fiziksel durumu ifade eder. Burada kullanildigi sekli ile, "kati" ve "yari kati", standart sicaklik ve basinçta kendi agirligini destekleyen ve serbest bir biçimde akmamak için yeterli viskoziteye ya da yapiya sahip olan bir bilesimin fiziksel durumunu ifade eder. Yari kati malzemeler, uygulanan basinç altinda bir kabin sekline uyabilir. Burada kullanildigi sekli ile bir "kati faz ortami", sivi olmayan bir ortami ifade eder. Bir örnekte, sivi olmayan ortam, gözenekli bir yüzeye sahip olan bir malzeme olabilir. Baska bir örnekte, sivi olmayan ortam, lifli bir yüzeye sahip olan bir malzeme olabilir. Yine baska bir örnekte, sivi olmayan ortam kagit olabilir. Burada kullanildigi sekli ile bir "kati faz ortami", "kati faz baz", "kati faz substrat", "kati faz test substrati", "kati faz test etme substrati", "kati faz reaksiyon ortami" ve benzerleri burada birbirinin yerine geçecek bir sekilde kullanilabilir ve sivi olmayan bir ortami, cihazi, sistemi ya da çevreyi ifade eder. Bazi yönlerde, sivi olmayan ortam büyük ölçüde sividan ari olabilir ya da tamamen sividan ari olabilir. Bir örnekte, sivi olmayan ortam, gözenekli bir malzeme ya da gözenekli bir yüzeye sahip olan bir malzeme olabilir ya da ihtiva edebilir. Baska bir örnekte, sivi olmayan ortam, lifli bir malzeme ya da lifli bir yüzeye sahip olan bir malzeme ihtiva edebilir ya da olabilir. Yine baska bir örnekte, sivi olmayan ortam bir kagit olabilir. Burada kullanildigi sekli ile bir "renk degistirmeyen katki maddesi", üzerinde ya da içinde meydana gelen bir LAMP reaksiyonundan nükleotid amplifikasyonu disindaki nedenler ile kati faz ortaminin renginde, orijinal ya da baslangiç renginden farkli olan bir renge bir renk degisikligini en aza indiren ya da önleyen bir katki maddesini ifade eder. Örnek olarak, bir yapilandirmada, bu tür bir renk degisikligi, renk degistirmeyen katki maddesi mevcut olmadan meydana gelecek bir renk degisikligine kiyasla en aza indirgenebilir ya da azaltilabilir. Burada kullanildigi sekli ile "LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikligi", bir LAMP reaksiyonundan bir nükleotid amplifikasyonunun sonucu olmayan kati faz ortaminin herhangi bir renk degisikligini (örnegin, orijinal renkten baska bir renge renk degisikligi) ifade eder. Bazi örneklerde, LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikligi, asagidakilerden biri ya da birkaçindan kaynaklanan kati faz ortaminin renk degisikligini ifade edebilir: bir uçucu ajan, bir magnezyum engelleyici ajan, bir oksitleyici ajan, bir LAMP reaksiyonundan kaynaklanan amplifikasyon disindaki nedenlerden kaynaklanan bir pH degisikligi, kurutma ya da bunlarin kombinasyonlari. Burada kullanildigi sekli ile bir "uçucu madde", yüksek bir buhar basincina ya da düsük bir kaynama noktasina sahip olan bir bilesimi ihtiva eden bir maddeyi ifade eder. Bir örnekte, amonyum sülfat uçucu bir ajan olabilir, çünkü amonyum iyonu uçucu hale gelebilir ve geride bir sülfat birakabilir. Bir örnekte bir bilesim, bilesim yaklasik olarak 30 CC'den daha yüksek bir sicaklikta bir gaz fazinda oldugu zaman yüksek bir buhar basincina sahip olabilir. Bir örnekte bir bilesim, bilesim yaklasik olarak 80 CC'den daha düsük bir sicaklikta bir gaz fazinda olustugu zaman düsük bir kaynama noktasina sahip olabilir. Burada kullanildigi sekli ile bir "kurutma maddesi", madde olmadan kati faz ortaminin kurutulmasi ile karsilastirildiginda kati faz ortaminin kurutulmasini artiran bir maddeyi ifade Burada kullanildigi sekli ile, bir "lela etkilesen reaktif ", bir LAMP reaksiyonundan amplifikasyon disindaki nedenler ile bir reaksiyonun, sistemin ya da ortamin pH'ini etkileyebilen bir reaktiftir. Bir örnekte, amonyum iyonu, amonyum süIfattan uçabilir ve sülfat iyonu sülfürik asit olusturmak üzere reaksiyona girebilir ve LAMP reaksiyonundan amplifikasyonun yoklugunda reaksiyonun pH'ini etkileyebilir. Burada kullanildigi sekli ile "pH'a duyarli olmayan bir madde", pH'daki degisikliklerden büyük ölçüde etkilenmeyen bir reaktiftir. 1 :5- , ". Bu açiklamada, "içerir", ihtiva etmektedir,, ihtiva eden" ve "sahip olan" ve benzerleri, ABD Patent yasasinda kendilerine atfedilen anlama sahip olabilir ve "ihtiva eder", "dahil olmak üzere" ve benzerleri anlamina gelebilir ve genel olarak açik uçlu terimler olarak yorumlanir. olarak listelenen bilesenleri, yapilari, adimlari ya da benzerlerini ve yani sira ABD Patent yasasina uygun olanlari ihtiva etmektedir. "Esas itibari ile -den olusan" ya da "esas itibari ile -den olusur", genel olarak ABD Patent yasasi tarafindan kendilerine atfedilen anlama sahiptir. Özellikle de bu tür terimler, bunlar ile baglantili olarak kullanilan madde(ler)in temel ve yeni özelliklerini ya da islevini önemli ölçüde etkilemeyen ek maddelerin, malzemelerin, bilesenlerin, adimlarin ya da unsurlarin dahil edilmesine izin vermek disinda, genel olarak kapali terimlerdir. Örnek olarak, bir bilesimde mevcut olan, ancak bilesimin dogasini ya da özelliklerini etkilemeyen eser elementlere, bu tür terminolojiyi takip eden bir maddeler listesinde açik bir biçimde belirtilmese bile, "esas itibari ile -den olusan" dili kapsaminda mevcut bulunuyor ise izin verilebilir. Yazili açiklamada "ihtiva eden" ya "dahil olmak üzere" gibi açik uçlu bir terim kullanildigi zaman, dogrudan destegin ayrica, "esas itibari ile -den olusan" dilinin yani sira açik bir sekilde belirtilmis gibi "-den olusan" dile de verilmesi gerektigi anlasilmaktadir. Açiklamadaki ve istemlerdeki "birinci , ikinci , uçüncü", "dördüncü" ve benzeri terimler, eger varsa, mutlaka belirli bir sirali ya da kronolojik sirayi tarif etmek için degil, benzer ögeler arasinda ayirt etmeyi saglamak için kullanilir. Bu sekilde kullanilan herhangi bir terimin, burada tarif edilen yapilanmalarin, örnek olarak, burada gösterilenler ya da baska bir sekilde tarif edilenler disindaki dizilerde çalisabilir nitelikte olabilecegi sekilde uygun kosullar altinda birbiri ile degistirilebilir oldugu anlasilmalidir. Benzer bir sekilde, eger bir metot burada, bir dizi adim ihtiva edecek bir sekilde tarif edilecek olursa, burada sunulan bu tür adimlarin sirasi mutlaka bu tür adimlarin gerçeklestirilebilecegi tek sira degildir ve belirtilen adimlardan bazilari muhtemelen atlanabilir ve/veya burada tarif edilmeyen bazi diger adimlar muhtemelen metoda ilave edilebilir. Burada kullanildigi sekli ile örnegin "artirilmis , azaltilmis , daha iyi", "daha kötü", "daha yüksek", "daha düsük", "gelistirilmis", "maksimize edilmis", "minimize edilmis" ve benzerleri gibi karsilastirmali terimler, çevreleyen ya da bitisik bir alanda bulunan, benzer bir sekilde konumlandirilmis, tek bir cihaz ya da bilesimde bulunan ya da birden fazla karsilastirilabilir cihaz ya da bilesimde bulunan, bir grup ya da sinifta bulunan, birden fazla grup ya da sinifta bulunan ya da teknigin bilinen durumuna kiyaslandiginda diger cihazlar, bilesenler, bilesimler ya da aktivitelerden ölçülebilir bir sekilde farkli olan bir cihazin, bilesenin, bilesimin ya da aktivitenin bir özelligini ifade eder. Burada kullanildigi sekli ile "birlestirilmis" terimi, kimyasal, mekanik, elektriksel ya da elektriksel olmayan bir sekilde dogrudan ya da dolayli olarak baglanmis olarak tanimlanir. Burada birbirine "bitisik" olarak tarif edilen nesneler, ifadenin kullanilmis oldugu baglama uygun olarak, birbirleri ile fiziksel temas halinde, birbirine yakin mesafede ya da birbirleri ile ayni genel bölge ya da alanda olabilir. "Dogrudan bagli" nesneler, yapilar, elemanlar ya da özellikler birbirleri ile temas halindedir ve baglanabilir. Bundan baska olarak, bu yazili açiklamada kullanildigi gibi, "bagli" terimi kullanildigi zaman, ayni zamanda "dogrudan bagli" ve bunun tersi için de destek saglandigi anlasilmalidir. Burada kullanildigi sekli ile "büyük ölçüde" terimi, bir eylemin, karakteristigin, özelligin, durumun, yapinin, ögenin ya da sonucun tam ya da nerede ise tam kapsamini ya da derecesini ifade eder. Örnek olarak, "büyük ölçüde" kapali olan bir nesne, nesnenin ya tamamen kapali oldugu ya da nerede ise tamamen kapali oldugu anlamina gelir. Mutlak bütünlükten tam olarak izin verilen sapma derecesi bazi durumlarda spesifik baglama bagli olabilir. Bununla birlikte, genel olarak belirtilecek olursa, tamamlamanin yakinligi, mutlak ve toplam tamamlama elde edilmis gibi ayni genel sonuca sahip olacak bir sekilde olacaktir. ya da sonucun tamamen ya da nerede ise tamamen eksikligine atifta bulunmak için olumsuz bir çagrisimda kullanildigi zaman esit derecede geçerlidir. Örnek olarak, partiküllerden ise sanki partiküllerden tamamen yoksunmus gibi ayni etkinin olacagi sekilde, partiküllerden nerede ise tamamen yoksun olacaktir. Baska bir ifade ile bir bilesen ya da elementten hala fiilen bu tür bir maddeyi ihtiva edebilir. Burada kullanildigi sekli ile "yaklasik olarak" terimi, belirli bir degerin son noktanin "biraz üstünde" ya da "biraz altinda" olmasini saglamak sureti ile bir sayisal aralik son noktasina esneklik saglamak için kullanilir. Aksi belirtilmedigi sürece, "yaklasik olarak" teriminin belirli bir sayiya ya da sayisal araliga uygun olarak kullanilmasinin ayni zamanda, "yaklasik olarak" terimi olmadan bu tür sayisal terimler ya da araliklar için destek sagladigi da anlasilmalidir. Örnek olarak, kolaylik ve kisalik saglamak adina, "yaklasik olarak 50 angstrom ila yaklasik olarak 80 angstrom" sayisal araliginin ayni zamanda "50 angstrom ila 80 angstrom" araligi için de destek sagladigi anlasilmalidir. Bundan baska olarak, bu tarifnamede "yaklasik olarak" terimi bununla birlikte kullanildigi zaman bile gerçek sayisal degerlere yönelik destegin saglandigi anlasilmalidir. Örnek olarak, "yaklasik olarak" 30 ifadesi sadece 30'un biraz üstünde ve biraz altinda degerler için destek saglamakla kalmayip, ayni zamanda 30'un gerçek sayisal degeri için de destek sagladigi seklinde yorumlanmalidir. Burada kullanildigi sekli ile kolaylik saglamak için çok sayida öge, yapisal eleman, bilesim elemani ve/veya malzeme ortak bir listede sunulabilir. Bununla birlikte, bu listeler, listenin her bir üyesi ayri ve benzersiz bir üye olarak ayri ayri tanimlanmis gibi yorumlanmalidir. Dolayisi ile de bu tür bir listenin hiçbir üyesi, aksine bir gösterge olmaksizin, yalnizca bunlarin ortak bir gruptaki sunulmus olmalarina dayali olarak, ayni listenin baska bir üyesinin fiili bir esdegeri olarak yorumlanmamalidir. Konsantrasyonlar, miktarlar, seviyeler ve diger sayisal veriler burada bir aralik formatinda ifade edilebilir ya da sunulabilir. Bu tür bir aralik formatinin sadece kolaylik ve kisalik saglamak için kullanildigi ve bu nedenle de sadece araligin sinirlari olarak açikça belirtilen sayisal degerleri degil, ayni zamanda sanki her bir sayisal deger ve alt aralik açikça belirtilmis gibi bu aralik içinde kapsanan tüm ayri ayri sayisal degerleri ya da alt araliklari ya da ondalik birimleri ihtiva edecek sekilde esnek bir biçimde yorumlanmasi gerektigi anlasilmalidir. Bir örnek olarak, "yaklasik olarak 1 ila yaklasik olarak 5" seklindeki bir sayisal aralik, sadece açikça belirtilen yaklasik olarak 1 ila yaklasik olarak 5 degerlerini ihtiva edecek bir sekilde degil, ayni zamanda belirtilen aralik içindeki ayri ayri degerleri ve alt araliklari da ihtiva edecek bir sekilde yorumlanmalidir. Dolayisi ile de bu sayisal araliga örnegin 2, 3 ve 4 gibi ayri ayri degerler ve örnegin 1 - 3, 2 - 4 ve 3 - 5 gibi alt araliklar ve yani sira ayri ayri olarak 1, 2, 3, 4 ve 5 dahildir. Ayni ilke, bir minimum ya da bir maksimum olarak yalnizca bir sayisal deger belirten araliklar için de geçerlidir. Bundan baska olarak, bu tür bir yorum, araligin genisligine ya da tarif edilen özelliklere bakilmaksizin uygulanmalidir. Bu tarifname boyunca "bir örnek" e yapilan atif, örnek ile baglantili olarak tarif edilen belirli bir özellik, yapi ya da karakteristigin en az bir yapilanmada yer aldigi anlamina gelmektedir. Dolayisi ile de bu tarifname boyunca çesitli yerlerde "bir örnekte" ifadelerinin bulunmasi, mutlaka hepsinin ayni yapilanmaya atif yapmasini gerektirmemektedir. Yagilanmalar Patojenler için pek çok moleküler test (örnegin, COVID-19'dan sorumlu virüs olan siddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)) laboratuvar ile sinirli olabilir ve dolayisi ile de bunlarin hasta basi ortamlarinda benimsenmelerini önleyerek sonuç elde etmek için önemli gecikme sürelerine (24 saat) sahip olabilir. SARS-CoV -2 için bir hasta basi testi gelistirmeye yönelik çesitli girisimlere ragmen, bazi sinirlamalar devam etmektedir: i) ölçeklenebilirlik (test talebi haftada milyonlar mertebesindedir, ancak bu ölçekte yeni testler üretmek zor olmaktadir), ii) numune isleme (pek çok test hala, tükürük kullanirken bir ekstraksiyon islemi kullanmaktadir) ve iii) okunabilirlik (moleküler testler genellikle floresan kullanir ve dolayisi ile de sonuçlari rapor etmek için bir floresan okuyucu kullanir). Mevcut test metotlari, kagit tabanli cihazlar ve numune olarak seyreltilmis tükürük (örnegin, suda %5 h/h) kullanilarak 60 dakika içinde bir patojenin (örnegin, SARS-CoV-Z) varliginda bir renk degisikligini bildiren ters transkripsiyon döngü aracili izotermal amplifikasyon (RT- LAMP) kullanilarak bir hasta basi testi kullanilmak sureti ile asilabilir. RT-LAMP, özellikle de enfeksiyonun akut fazinda yeterli tanisal performans ile sabit bir sicaklikta yapilan bir nükleik asit amplifikasyon teknigidir. RT-LAMP sabit bir sicaklikta yapilabildiginden dolayi, pahali termal döngü ekipmani kullanilmamaktadir. Ek olarak, LAMP ürünleri için mevcut kolorimetrik raportörler floresan okuyucular kullanmamaktadir. Sonuç olarak bu test, bakim noktasi ortamlarinda kullanim için uygundur ve onu halk sagligi acil durumlarinda kullanim için uygun hale getirerek hizli gelisim ve ölçek büyütmeye uygundur. RT-LAMP, çesitli patojenleri (örnegin SARS-CoV-Z) tespit etmek için, pozitif ve negatif tepkileri ayirt etmek için tasinabilir bir elektronik cihaz kullanilarak görüntü analizinin yapilabilecegi mikro akiskan kagit tabanli analitik cihazlar (uPAD'Ier) üzerinde uygulanabilir. Bir örnekte, kagit üzerinde yüksek kontrastli bir RT-LAMP reaksiyonu, çiplak göz ile görülebilen nitelikte bir renk degisikligi saglayabilir. Ek olarak, - basili alanlarin hassas bir sekilde hizalanmasina ve reaktiflerin dagitilmasina sahip olan - mum baski kullanmak yerine, numuneler arasinda çapraz karismayi önlemek için polistiren ara parçalar kullanilabilir. Polistiren ara parçalar, üretimin ölçeklendirilmesi için rulodan ruloya üretim için uygun olabilir. Nükleik asit bazli COVID-19 tani metotlari, sonuç elde etmek için ön islemeyi kullanir. Burada açiklandigi gibi SARS-CoV-Z'nin kagit üzerinde kolorimetrik tespiti, minimum ön isleme ile gerçeklestirilebilir. Cihaz, ön amplifikasyon olmadan kagit üzerinde SARS-CoV- 2'yi tespit edebilen bir hassasiyete ve özgüllüge sahip olabilir. Çözeltide yapilan diger miktar tayinleri, üretim sirasinda kagit bazli miktar tayinleri kadar ölçeklenebilir olmayabilir. Ek olarak, burada açiklanan tahlil, saniyeler içinde tamamlanabilen bir seyreltme islemi kullanirken, diger tahliller SARS-CoV-Z'yi tespit etmek için örnegin proteaz ile muamele, isi inaktivasyonu ve/veya RNA ekstraksiyonu gibi çesitli islemler kullanir (islemler en az 10 dakika içinde tamamlanir ve ek ekipman kullanilir). Bir Kati Faz Ortami Üzerinde LAMP Reaksivonu için Malzeme Düzenegi Bir kati faz bir ortami üzerinde LAMP reaksiyonu yürütülmesi, ilgili performans talepleri nedeni ile zor olabilir. Örnegin, test dogrulugunu en üst düzeye çikarmak için, kati faz ortami, onunla ya da LAMP reaksiyon göstergesi ile etkilesime girmeden LAMP reaksiyonunu desteklemelidir. Yüksek bir seviyede, kati faz ortami, LAMP reaksiyonunun devam etmesini saglamak için biyolojik bir numune ile sulandirilir ve daha sonra sonuçlar okunur. Bununla birlikte, çesitli reaktifler LAMP reaksiyonu ya da sonuçlarin daha sonraki okunmasina müdahale edebilir. Hatayi en aza indirmek için, biyolojik bir numune saglamak, kati faz ortamini bir numune ile sulandirmak, LAMP reaktiflerini kati faz ortami içine entegre etmek, LAMP analizini gerçeklestirmek ve zorluk çekmeden yorumlanabilen net bir test çikti sinyali elde etmek açisindan ortaya çikabilecek olasi zorluklari en aza indirmek ya da önlemek için özen gösterilebilir. Yukarida açiklananlar göz önünde bulundurularak, bir bulus yapilanmasinda, bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon birlesimi, bir kati faz reaksiyon ortami ile kombinasyon halinde higroskopik bir ajandan büyük ölçüde ari olan bir LAMP reaktif karisimi ihtiva edebilir. LAMP reaktif karisimi, higroskopik ajanlardan büyük ölçüde ari oldugu zaman, kati faz reaksiyon ortaminin kurutulmasi sirasinda meydana gelen zorluklari en aza indirebilir ya da önleyebilir. Higroskopik ajanlar kullanildigi zaman, bunlar ya da kati faz reaksiyon ortami tamamen kurumayabilir ya da depolandiktan sonra bir dereceye kadar yeniden su içerir hale gelebilir ve LAMP isleminden elde edilen test sonuçlarini çarpitabilen sekilde kati faz reaksiyon ortaminin orijinal rengine müdahale edebilir. Bir örnekte, bir higroskopik madde, 25 CC'de yaklasik olarak %40 ila yaklasik olarak %90 bagil nem (RH) arasinda oldugu zaman agirlikça yaklasik olarak %10'dan daha fazlasini emebilen bir madde olabilir. Bir yönde, bir higroskopik madde, bunun ile sinirli olmamak üzere, inseroI, etanol, metanol, kalsiyum klorür, potasyum klorür, kalsiyum sülfat, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birkaçini ihtiva edebilir. Bazi örneklerde, örnegin inseroI gibi bir higroskopik madde ihtiva eden bir LAMP reaksiyonu, kati baz ortamindaki reaktiflerin kararsizligina katkida bulunabilir, çünkü higroskopik madde suyu çekebilir. Bu nedenle de kati faz reaksiyon ortaminda asiri bir miktarda higroskopik ajandan kaçinilmalidir. Bundan baska olarak, baska bir yönde, higroskopik ajandan büyük ölçüde ari olan LAMP reaktif karisimi, DNA polimeraz, ters transkriptaz, hedef primerler ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. LAMP reaksiyonu ya bir LAMP reaksiyonu ya da bir ters transkripsiyon LAMPI (RT-LAMP) reaksiyonu oldugu zaman DNA polimerazi dahil ediIebiIir. Bundan baska olarak, LAMP reaksiyonu bir RT-LAMP reaksiyonu oldugu zaman, higroskopik ajandan büyük ölçüde ari olan LAMP reaktifi ayrica RNA'yi cDNA'ya ters kopyalamak için kullanilan ters transkriptazi ihtiva edebilir. Bir yönde, kati faz reaksiyon ortami büyük ölçüde magnezyum iIe etkilesen ajanlardan ari olabilir. Magnezyum LAMP reaksiyonunu birkaç sekilde etkileyebiIir. Ilk olarak, magnezyum DNA polimeraz için bir kofaktör olabilir ve DNA polimerazin LAMP reaksiyonunu kolaylastirmasina izin vermek için bir hedef konsantrasyon araligi içinde siki bir sekilde izlenmelidir. Ikinci olarak, LAMP reaksiyonu için magnezyuma duyarli bir gösterge kullanildigi zaman, magnezyum etkilesim ajanlari LAMP reaksiyonunun sonuçlarini geçersiz kilabilir ya da sonuçlarin analizini karmasiklastirabilir. Bu sebeple baska bir yönde, magnezyum etkilesim ajanlari, magnezyum içeren bilesikleri ve magnezyum iIe etkilesime giren seIatIastirici ajanlari ihtiva edebilir. Bir yönde, magnezyum etkilesim ajanlari asagidakiler dahil olmak ancak bunlar ile sinirli olmamak üzere magnezyumdan büyük ölçüde ari olabilir: Mg", Mg", magnezyum karbonat, magnezyum klorür, magnezyum sitrat, magnezyum hidroksit, magnezyum oksit, magnezyum sülfat, magnezyum sülfat heptahidrat, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari. Bazi kati faz reaksiyon ortamlari, magnezyum iIe etkilesime girebiIecek olan bazi tampon kapasitesine, artik iyonlara ya da selatlama ajanlarina sahip olabileceginden dolayi, - BST enzimleri (örnegin, DNA polimeraz) için bir kofaktör olan - magnezyum konsantrasyonu etkilenebiIir ve LAMP reaksiyonu ile etkilesimde bulunabilir. Sonuç olarak, magnezyum konsantrasyonu, LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için bir hedef magnezyum araligi içinde kontrol edilmelidir. Bir yönde, bilesim, agirlikça %1,0, agirlikça %0,5, agirlikça %0,1 ya da agirlikça Kati faz reaksiyon ortami, LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için çesitli özelliklere sahip olabilir. Bir yönde, kati reaksiyon faz ortami hidrofilik, emici, gözenekli ve inert olabilir. Kati faz reaksiyon ortami, bir damlacigin yüzeyi ve kenari arasindaki temas açisi yaklasik olarak 90 dereceden daha az oldugu zaman hidrofilik olabilmektedir. Kati faz reaksiyon ortami, kagidin bir miktar sivi alabilecegi bir derece ile ölçüldügü gibi emici olabilir. Kati faz reaksiyon ortami, en az 1 mikrondan daha büyük ve yaklasik olarak 100 mikron, yaklasik olarak 75 mikron, yaklasik olarak 50 mikron, yaklasik olarak 25 mikron, yaklasik olarak 10 mikron, yaklasik olarak 5 mikron ya da yaklasik olarak 1 mikrondan birine ya da birkaçina esit ya da daha küçük bir gözenek boyutuna sahip oldugu zaman gözenekli olabilir. Kati faz reaksiyon ortami, ortam LAMP reaksiyonu ile etkilesime girmedigi zaman inert olabilir. Kati faz reaksiyon ortami ayrica, ortam LAMP reaksiyonundan kaynaklanan gösterge ile etkilesime girmedigi zaman da inert olabilir. Kati faz reaksiyon ortaminin ihtiva edebilecegi ya da içerebilecegi çesitli malzemeler vardir. Bir yönde, kati faz reaksiyon ortami; naylon, polisülfon, polietersülfon, selüloz asetat, nitroselüloz, hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE), benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, kati faz reaksiyon ortami, örnegin 1. Derece kromatografi kagidi, 222. Derece kromatografi kagidi, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari gibi selüloz bazli bir ortam olabilir. Kati faz reaksiyon ortami için malzeme tipine ek olarak, kati faz reaksiyon ortami, LAMP reaksiyonunu barindirabilen ya da gelistirebilen ve LAMP reaksiyonundan kaynaklanan gösterge ya da sinyal çikisi ile etkilesimi önleyebilen çesitli fiziksel özelliklere sahip olabilmektedir. Bir yönde, kati faz reaksiyon ortami, yaklasik olarak 30 ila yaklasik olarak 600 arasinda bir yüzey alani - kalinlik oranina sahip olabilir. Baska bir açidan, kati faz reaksiyon ortami, yaklasik olarak 60 ila yaklasik olarak 400 arasinda bir yüzey alani - kalinlik oranina sahip olabilir. Bir açidan, kati faz reaksiyon ortami, yaklasik olarak 100 ila yaklasik olarak 200 arasinda bir yüzey alani - kalinlik oranina sahip olabilir. Baska bir açidan, kati faz reaksiyon ortami, yaklasik olarak 30 ila yaklasik olarak 600 arasinda bir yüzey alani - kalinlik oranina sahip olabilen bir selüloz bazli ortam olabilir. Bir açidan, selüloz bazli ortam, en az 1 mikrondan daha büyük ve yaklasik olarak 100 mikron, yaklasik olarak 75 mikron, yaklasik olarak 50 mikron, yaklasik olarak 25 mikron, yaklasik olarak 10 mikron, yaklasik olarak 5 mikron ya da yaklasik olarak 1 mikrondan birine ya da birkaçina esit ya da daha küçük bir gözenek boyutuna sahip olabilir. Kati faz reaksiyon ortaminin kalinligi, LAMP reaksiyonuna yönelik toplam reaksiyon süresine, kati faz reaksiyon ortami boyunca akis hizina, bir kolorimetrik gösterge kullanildigi zaman renk kontrastina, kolorimetrik sonuçlarin es dagilimli olmasina, reaktiflerin kati faz reaksiyon ortamindaki konsantrasyonuna ve benzerlerine katkida bulunabilir. Bir yönde, kati faz reaksiyon ortami, 222. derece kromatografi kagidi 1. derece kromatografi kagidindan daha kalin oldugundan dolayi, 1. derece kromatografi kagidinin es dagilimliligina göre daha fazla es dagilim saglayan 222. derece kromatografi kagidi ihtiva edebilir. Sonuç olarak, 222. derece kromatografi kagidi, reaktifleri 1. derece kromatografi kagidina kiyasla daha küçük bir yüzey alaninda yogunlastirabilir. Bir yönde, kromatografi kagidi, arzu edilen yüzey alani - kalinlik oranini saglamak üzere yaklasik olarak 5 mm x yaklasik olarak 5 mm'lik bir yüzey alanina sahip olan 222. derece olabilir. Bir örnekte, 1. derece kromatografi kagidi, yaklasik olarak 555'lik bir yüzey alani - kalinlik orani saglamak üzere, 0,18 mm bir kalinliga sahip olan 20 mm uzunlugunda ve 5 mm genisliginde enine kesit boyutlarina sahip olabilir. Baska bir örnekte, 222. derece kromatografi kagidi, yaklasik olarak 30'luk bir yüzey alani - kalinlik orani saglamak üzere 0,83 mm kalinliginda 5 mm uzunlugunda ve 5 mm genisliginde enine kesit boyutlarina sahip olabilir. Bu nedenle, bu örnek, yaklasik olarak 30'luk bir yüzey alani - kalinlik oraninin (örnegin, 222. derece kromatografi kagidi için), yaklasik olarak 555'lik bir yüzey alani - kalinlik oranina (örnegin, 1. derece kromatografi kagidi için) kiyasla daha fazla es dagilim saglayabilecegini göstermektedir. Burada açiklanan malzemelerin yani sira, kati faz reaksiyon ortami kagit ya da cam elyaftan birini ya da birkaçini ihtiva edebiIir. Bir örnekte, kagit aIfa seIüIoz, beta seIüIoz, gama seIüIoz, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebiIir. Baska bir örnekte, cam elyafi, A-cam, E-cam, S-cam, R-cam, C-cam, T-cam, D-cam, M-cam, ECR cam, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebiIir. Bazi örneklerde, reaksiyon birlesimi bir yapistirici ihtiva edebiIir. Örnek olarak, yapistirici, kati faz reaksiyon ortaminin çesitli bölümlerini birbirine yapistirmak için kullanilabilir. Bir örnekte, reaksiyon birlesimi bundan baska oIarak magnezyum etkilesim ajanlari, higroskopik ajanlar ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olan bir yapistirici ihtiva edebiIir. Yapistirici, magnezyum ve DNA poIimeraz arasindaki etkilesimi önlemek ve magnezyum bazli göstergeler kullanildigi zaman LAMP sonuçlarinin okunmasindaki komplikasyonlari önlemek için magnezyum iIe etkiIesen ajanlardan büyük ölçüde ari olabilir. Bazi örneklerde, reaksiyon birlesimi ayrica bir yayma katmani da ihtiva edebiImektedir. Yayma katmani, bir biyolojik numunenin kati faz reaksiyon ortaminin farkli bölümleri boyunca düzgün bir sekilde yayilmasini kolaylastirabilir. Baska bir örnekte, yayma katmani, kati faz reaksiyon ortamindan daha az hidrofilik olabilmektedir. Kati faz reaksiyon ortamindan daha az hidrofilik olan bir yayma katmanina sahip olmak, biyolojik numunenin es dagilimli sekilde yayilmasini kolaylastirabilir, çünkü biyolojik numune, daha az hidrofilik yayma katmanindan daha hidrofilik kati fazli reaksiyon ortamina dogru yayilacaktir. Reaktif karisiminin kati faz reaksiyon ortamina göre konfigürasyonu, LAMP reaksiyonunu etkileyebilir. Bir yapilanmada, burada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon birlesiminin üretimine yönelik bir metot, higroskopik ajandan büyük ölçüde ari olan LAMP reaktif karisiminin, böylece reaktif karisiminin kati faz reaksiyon ortami ile temas halinde tutulacagi bir sekilde kati faz reaksiyon ortami ile birIestiriImesini ihtiva edebilir. Bir örnekte, reaktif karisimi, kati faz reaksiyon ortami ile dogrudan temas halinde tutulabilir. Baska bir örnekte, reaktif karisimi, kati faz reaksiyon ortami ile dolayli temas halinde tutulabilir. Reaktif karisimi, kati faz reaksiyon ortami ile dolayli temas halinde tutuldugu zaman, araya giren bir malzeme (örnegin, bir antioksidan) LAMP reaksiyonunu artirabilir. Bazi durumlarda, kati faz reaksiyon ortaminin rengi, LAMP reaksiyonundan kaynaklanmayan ajanlardan etkilenebilir. Örnek olarak, amonyum sülfat gibi uçucu maddeler, sülfürik asit olusturmak üzere reaksiyona girebilen bir sülfat iyonu olusturabilir. LAMP reaksiyonunun sonuçlarini okumak için pH tabanli bir gösterge kullanildigi zaman, bu LAMP disi reaksiyonlar sonuçlarin dogru bir sekilde okunmasini önleyebilir ya da sonuçlarin yorumlanmasini daha da karmasiklastirabilir. Bir yönde, metot, renk degistirmeyen bir katki maddesi kullanilarak renk degisikliginin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Renk degistirmeyen katki maddesi bir seker, bir tampon, bir bloke edici madde, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir örnekte seker: trehaloz, glikoz, sükroz, dekstran, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Baska bir örnekte, bloke etme maddesi sigir serum albümini, kazein, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Seker, LAMP disi reaktif pH degisikliklerinin etkisini önleyebilir. Tampon, LAMP reaksiyonu disindaki faktörlerden kaynaklanan pH degisikliklerinin etkisini önlemek sureti ile LAMP reaksiyonu ile etkilesimi ya da LAMP reaksiyonunun sonuçlari ile etkilesimi önleyebilir. BIoke edici madde, örnegin analiz edilecek olan nükIeik asitler (ör. bir virüsten RNA ya da bir patojenden DNA) üzerindeki RNaz ya da DNaz gibi çesitli enzimlerin etkilerini bloke etmek sureti ile LAMP reaksiyonu disindaki faktörlerin etkisinin önüne geçebilir. Baska bir yapilanmada, Sekil 1'de de tasvir edildigi gibi, bir LAMP analizini gerçeklestirmeye yönelik bir metot (100), blokta (110) gösterildigi gibi, bu açiklamada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon birlesiminin (düzeneginin) saglanmasini (110) ihtiva edebilir. Metot bundan baska olarak, blokta (120) da gösterildigi gibi, bir biyolojik numunenin reaksiyon birlesimine uygulanmasini (120) ihtiva edebilir. Metot bundan baska olarak, blokta (130) da gösterildigi gibi, birlesimin LAMP reaksiyonunu baslatmak için yeterli bir sicakliga isitilmasini (130) ihtiva edebilir. Metot bundan baska olarak, blokta (140) da gösterildigi gibi, sicakligin LAMP reaksiyonunu tamamlamaya yeterli olacak bir süre boyunca korunmasini (140) ihtiva edebilir. Bir yönde, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da daha fazlasi olabilir. Diger bir yönde, biyolojik örnek tükürük olabilir. Baska bir yönde, metot bundan baska olarak, bir viral patojenin tespit edilmesini ihtiva edebilir. Diger bir yönde, LAMP analizi ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) olabilir. Baska bir yönde, bir LAMP reaksiyonunu baslatmak için yeterli olan sicaklik, yaklasik olarak 50 CC ila yaklasik olarak 60 CC arasi bir sicaklik araliginda olabilir. Baska bir yönde, bir LAMP reaksiyonunu baslatmak için yeterli olan sicaklik, yaklasik olarak 60 CC ila yaklasik olarak 70 (C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Baska bir örnekte, izotermal sicaklik, 5 (C'den daha az farklilik gösteren bir aralik içinde bir sicaklik olabilmektedir. Baska dakika, 90 dakika, 105 dakika ya da 120 dakikadan biri ya da birkaçi kadar bir süre boyunca tamamlamak üzere yeterli olan sicaklikta tutulabilir. Baska bir yönde, sicaklik, LAMP ya da 120 dakikadan biri ya da birkaçi kadar bir süre boyunca tamamlamak için yeterli olan sicaklikta tutulabilir. LAMP reaksiyon birlesimi, homojenligini, raf ömrünü ya da depolama ömrünü ve test geçerliligini artirmak için üretilebilir. Bir yönde, LAMP reaksiyon birlesimi sunlardan biri ya da daha fazlasi kullanilarak üretilebilir: dilme (rulolarin daha ince rulolar halinde ayrilmasi), tekillestirme (giyotin, döner kalip ya da lazer ile kesilen ayri ayri parçalar), reaktif kaplama (daldirilan, püskürtülen ya da dagitilan ve kurutulan reaktifler), kart Iaminasyonu (makaralara eklenen plastik destek), benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari. Bir örnekte, LAMP reaksiyon düzenegi sunlardan biri ya da daha fazlasi kullanilarak üretilebilir: rulolarin daha ince rulolar haline ayrilmasi; giyotin ya da döner kalip ile kesilen ayri ayri parçalar; reaktif daldirma kullanilarak reaktif kaplama, makaralara eklenen plastik destek kullanilarak kart Bir Kati Faz Ortaminda pH Tabanli LAMP Analizi için Malzemeler Higroskopik ajanlar ve magnezyum ile etkilesen ajanlar mevcut oldugu zaman, bir kati faz reaksiyon ortami üzerinde bir LAMP reaksiyonu yürütmek zor olabilir. Bununla birlikte, LAMP reaksiyonunun çiktisina ve sonuçlarinin yorumlanmasina müdahale edebilecek baska faktörler de vardir. pH tabanli bir gösterge söz konusu oldugu zaman, reaktif karisimi etkilesen reaktiflerden büyük ölçüde arindirilmis olmalidir. Bazi örneklerde, etkilesimde bulunan reaktifler, oksitleyici ajanlari ve pH ile etkilesen ajanlari ihtiva edebilir. Bir yapilanmada, bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sistem, büyük ölçüde reaktif olmayan bir kati faz reaksiyon ortami ve etkilesimde bulunmayan bir reaktif karisimi ihtiva edebilir. Bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, oksitleyici ajanlar ve pH ile etkilesime giren ajanlardan büyük ölçüde ari olabilir. Bir yönde, etkilesime girmeyen reaktif karisimi, hedef primerler, DNA polimeraz ya da bir yeniden çözündürme ajani ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Oksitleyici maddeler LAMP reaksiyonunu ile etkilesime girebilir. Bu nedenle de oksitleyici ajanlar büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortamina dahil edilmemelidir. Bir yönde, bir oksitleyici ajan, bunlar ile sinirli olmamak üzere, asagidakilerden birini ya da stzog, H2805, hipoklorit, klorit, klorat, perklorat, krom bilesikleri, permanganat, sodyum perborat, Nitröz oksit (nitrous oxide), N02, N204, KNOs, NaBiOs, seryum bilesikleri, kursun dioksit, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari. Bazi durumlarda, sadece oksidasyon ajanlarindan kaçinmak LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olmayabilir. Bu gibi durumlarda, istenmeyen oksidasyonu önlemek için ek ajanlar dahil edilebilir. Bir yönde, reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortaminin oksidasyonunu önlemek için oksijen emiciler, kurutucu maddeler, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden fazlasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, selüloz ihtiva eden reaktif olmayan bir kati faz reaksiyon ortaminin oksidasyonunu önlemek için, selüloz, oksidasyon bölgelerini doyurmak üzere selülozun isi döngüsüne tabi tutulmasiyla ile ön isleme tabi tutulabilir. Baska bir örnekte, oksidasyonu önlemek için bir antioksidan ilave edilebilir. Baska bir yönde, bir boya göstergesi (ör. fenol kirmizisi) antioksidan etkilere sahip olabilir. Bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, oksitleyici ajanlarin agirlikça %1,0'inden, agirlikça %0,5'inden, agirlikça Oksidasyon ajanlarinin yani sira, pH ile etkilesime giren ajanlar, LAMP reaksiyonunun sonuçlarinin uygun bir sekilde yorumlanmasini önleyebilir ya da LAMP reaksiyonunun sinyal çikisini daha da karmasiklastirabilir. Bir yönde, bir pH ile etkilesime giren ajan, bunlar ile sinirli olmamak üzere, uçucu reaktifler, pH'i etkileyen reaktifler, magnezyum içeren reaktifler ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden fazlasini ihtiva edebilir. pH'i etkileyen reaktifler dahil edildigi zaman, pH'ta ortaya çikan degisiklik, LAMP reaksiyonundan elde edilen pH bazli sonuçlarin analizini karmasiklastirabilir. Bazi durumlarda, pH'i etkileyen reaktiflerin dahil edilmesi telafi edilebilir ve analiz, yeterli test yorumuna izin verecek bir sekilde ayarlanabilir. Bununla birlikte, diger durumlarda, pH'i etkileyen reaktifler, pH bazli sonuçlarin yorumlanmasina belirsizlik getirebilir. Bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, pH'i etkileyen reaktiflerden büyük ölçüde ari (arindirilmis) olabilir. Bir yönde, pH'i etkileyen reaktifler, pH'a duyarli bir sinyal ile etkilesime girebilen asitler, bazlar ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, pH'i etkileyen reaktiflerin agirlikça %1,0'inden, agirlikça %0,5'inden, agirlikça %0,1'inden ya da agirlikça %0,01'inin biri ya da birkaçindan daha azini ihtiva edebilir. Reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortamina uçucu reaktifler dahil edildigi zaman, uçucu bilesen uçucu hale gelebilir ve pH'a duyarli çikis sinyali ile etkilesime girebilen bir bileseni geride birakabilir ya da pH'a duyarli çikis sinyali ile etkilesime girmek üzere daha fazla reaksiyona girebilecek bir bileseni geride birakabilir. Bir örnekte, amonyum karbonat, uçucu hale gelen bir amonyum iyonu ve karbonik asit olusturmak üzere reaksiyona giren bir karbonat iyonu olusturabilir. Karbonik asit, LAMP reaksiyonundan pozitif bir sonucun (örnegin, bir hedef patojenin ve LAMP kaynakli amplifikasyonun varligi) yoklugunda pH'i düsürmek sureti ile pH'a duyarli çikis sinyali ile etkilesime girebilir. Bu nedenle, bir örnekte, reaktif olmayan kati faz ortami, burada tanimlandigi gibi uçucu maddelerden büyük ölçüde ari olabilir. Reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortamina magnezyum içeren reaktifler dahil edildigi zaman, magnezyum içeren reaktifler, siki bir sekilde izlenmedigi zaman, DNA polimerazin çalismasina müdahale edebilir. Bu nedenle de bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, aksi taktirde burada açiklandigi gibi magnezyum reaktiflerinden büyük ölçüde ari olabilir. Büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz ortami çesitli malzemelerden olusabilir. Bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami cam elyaf, naylon, selüloz, polisülfon, polietersülfon, selüloz asetat, nitroselüloz, hidrofilik PTFE, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Diger bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz ortami burada açiklandigi gibi hidrofilik, emici (absorbent) , inert ve gözenekli olabilir. Reaktif olmayan kati faz ortaminin tamponlama kapasitesi LAMP reaksiyonunu etkileyebilir. Örnek olarak, güçlü bir tampon, LAMP reaksiyonundan tespit edilecek olan pH degisikliklerini önleyebilir. Bununla birlikte, zayif bir tampon, LAMP kaynakli amplifikasyonun yoklugunda bile pH'ta büyük dalgalanmalara yol açabilir. Bir yönde, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 5 mM arasinda bir tamponlama kapasitesine sahip olabilir. Bir örnekte, isi ile inaktive edilmis bir virüs, 25 ul numune hacmi basina yaklasik olarak 500 kopya mertebesinde bir tespit sinirinda biyo kümelenmis tükürüge eklenebilir. Bununla birlikte, biyo kümelenmis tükürügün tamponlama kapasitesi ve pH'i yeni toplanan tükürükten farkli olabilir. Bu nedenle de yeni toplanan tükürügün tespit siniri (LOD), biyo kümelenmis tükürük ve yeni toplanan tükürük arasindaki tamponlama kapasitesi farkliliklarina ve pH farkliliklarina bagli olarak ayarlanabilir. Bazi örneklerde, reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortamindan gelen pH'a duyarli çikis sinyali, özel enstrümantasyon olmadan bir teknisyen tarafindan yorumlanabilmektedir. Bununla birlikte, bir kolorimetrik okuyucu ek bir hassasiyet ve dogruluk seviyesi saglayabilir. Örnek olarak, bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, pH'a duyarli bir boya ile birlestirildigi zaman bir test araligi içinde bir maksimum absorbans dalga boyuna (Amaks) sahip olabilir. Bir örnekte, pH'a duyarli boya fenol kirmizisi oldugu zaman, Amaks yaklasik olarak 443 nm ila yaklasik olarak 570 nm'lik bir test araligi içinde olabilir. Bu nedenle de pH'a duyarli boya fenol kirmizisi oldugu ve maksimum absorbans dalga boyu bir test araligi içinde oldugu zaman, bir teknisyen pozitif ya da negatif bir sonucu tespit etmek için bir kolorimetrik okuyucu kullanabilir. Bazi yönlerde, sistem bundan baska olarak, reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortamina ek olarak bilesenler ihtiva edebilir. Bir yönde, sistem bundan baska olarak bir yapistirici, bir yayma katmani, bir ara parça, bir plastik tasiyici ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir yönde, yapistirici, yayma katmani, ara parça ve plastik tasiyicinin her biri burada açiklandigi gibi büyük ölçüde oksitleyici maddeler ve pH ile etkilesime giren maddelerden ari olabilir. Diger bir yapilanmada, Sekil 2'de de tasvir edildigi gibi, bir kati faz pH'a bagli döngü araciligi izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot sunlari ihtiva edebilir: blokta (210) gösterildigi gibi, LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikligini en aza indiren bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasi (210) ve blokta (220) gösterildigi gibi, kati faz reaksiyon ortami üzerinde LAMP analizinin gerçeklestirilmesi (220). Bir yönde metot bundan baska olarak, LAMP disi bir reaksiyonla üretilen protonlardan LAMP disi bir reaksiyonla üretilen renk degisikliginin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot bundan baska olarak, renk degistirmeyen bir katki maddesi kullanilarak LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikliginin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Renk degistirmeyen bir katki maddesi, LAMP disi amplifikasyon nedeni ile kolorimetrik yanitta istenmeyen degisiklikleri önleyebilir. Bir yönde, renk degistirmeyen katki maddesi bir seker, bir tampon, bir bloke edici madde, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir örnekte seker: trehaloz, glikoz, sükroz, dekstran, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Bir yönde, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 1 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 10 mM ila yaklasik olarak 500 mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 200 mM ila yaklasik olarak 400 mM arasinda olabilir. Diger bir örnekte, bir tampon, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), Dulbecco PBS, Alsever çözeltisi, Tris tamponlu tuzlu su (TBS), su, HEPES, BICINE, su, örnegin Hank BSS, Earle BSS, Grey BSS, Puck BSS, Simm BSSi, Tyrode 888, 888 Plus gibi dengeli tuz çözeltileri (BSS), Ringer laktat çözeltisi, normal tuzlu su (diger bir deyis ile %0,9 tuzlu su), 1/2 normal tuzlu su, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden daha fazlasini ihtiva edebilir. Bir yönde, tamponun konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 10 uM ila yaklasik olarak 20 uM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, tamponun konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 100 uM ila yaklasik olarak 10 mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, tamponun konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 100 uM ila yaklasik olarak 500 uM arasinda olabilir. Diger bir örnekte, bir bloke edici ajan, sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden daha fazlasini ihtiva edebilir. Bir yönde bloke edici ajan konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman agirlikça yaklasik olarak %0,01 ila agirlikça yaklasik olarak %5 arasinda olabilir. Diger bir örnekte, bloke edici ajan konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman agirlikça yaklasik olarak %0,01 ila agirlikça yaklasik olarak %1 arasinda olabilir. Yine diger bir yönde, bloke edici ajan konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman agirlikça yaklasik olarak %0,02 ila agirlikça yaklasik olarak %0,06 arasinda olabilir. Diger bir yapilanmada, bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir tespit seviyesini (LOD) en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot, bir reaksiyon ortaminin ve LAMP disi reaksiyon ürünlerini en aza indiren reaktiflerin saglanmasini ihtiva edebilir. Bazi örneklerde, reaksiyon ortami oksitleyici ajan, pH ile etkilesime giren ajanlar, higroskopik reaktifler, magnezyum ile etkilesime giren reaktifler, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçindan büyük ölçüde ari (arindirlmis) olabilir. Diger bir yapilanmada, bir kromatik döngü araciligi izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sistem, bir kati faz reaksiyon ortaminin ve LAMP reaktiflerinin bir kombinasyonunu ihtiva edebilmekte olup, bu da, 25 °C'de depolandigi zaman, kati faz ortaminin bir baslangiç tonunun %10'u içinde olan bir kati faz reaksiyon ortami renklendirmesini muhafaza eder. Bir yönde, kati faz ortami ve LAMP reaktiflerinin daha uzun süre boyunca depolandigi zaman renklenmeyi koruyabilir. Baska bir yönde, kati faz ortami ve LAMP reaktiflerinin kombinasyonu, yaklasik olarak %40 ila %90 arasinda bir bagil nemde depolandigi zaman renklenmeyi muhafaza edebilir. Yine diger bir yapilanmada, bir kromatik LAMP sisteminin üretimine yönelik bir metot, etkilesime girmeyen reaktif karisiminin, böylece etkilesime girmeyen reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile temas halinde tutulacagi bir sekilde büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami iIe birlestirilmesini ihtiva edebilir. Bir örnekte, etkilesime girmeyen reaktif karisimi, kati faz reaksiyon ortami ile dogrudan temas halinde tutuIabiIir. Baska bir örnekte, etkilesime girmeyen reaktif karisimi, kati faz reaksiyon ortami iIe doIayIi temas halinde tutuIabiIir. Etkilesime girmeyen reaktif karisimi, kati faz reaksiyon ortami ile dolayli temas halinde tutuldugu zaman, araya giren bir malzeme (örnegin, bir antioksidan) LAMP reaksiyonunu artirabiIir. Bir yönde, metot, etkilesime girmeyen reaktif karisimini ihtiva eden bir çözeltinin hazirlanmasini ve reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami üzerine kaplanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, kaplama, çözeltinin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami üzerine damIatiImasini, püskürtüImesini, daldirilmasini, islatilmasini ya da bugulanmasini ihtiva edebilir. Bazi durumlarda, üretim süreci LAMP anaIizi için olan sistemin raf ömrü stabilitesini ya da homojenligini etkileyebiIir. Bir örnekte, etkilesime girmeyen reaktif karisimi, bir makaradan makaraya (R2R) islemi kullanilarak büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami iIe birlestirilebilir. Kati Faz Ortaminda LAMP Kullanarak Patoienleri Test Etmek Için Seçilen Hedeflerin çoklanmasi Bir kati faz ortamindaki LAMP kullanarak bir patojen tespit ederken, LAMP'i çokIamanin çesitli yollari vardir. Ilk olarak, proses ayni kati faz ortaminda birden fazla kontrolu dahil edilmesi sureti ile çokIanabiIir. Örnek olarak, test geçerliligi pozitif bir kontrol kullanilarak dogrulanabilir. Örnek olarak, LAMP reaksiyonu, LAMP reaksiyonunun beklendigi gibi çalistigini dogrulamak için bir tükürük DNA'si ya da RNA biyobelirteci için bir tükürük örnegini test edebilir. Diger bir örnekte, test geçerliligi negatif bir kontrol kullanilarak dogrulanabilir. Örnek olarak, LAMP reaksiyonu, patojeni ihtiva etmeyen bir tükürük örnegini test edebilir. LAMP'i çogullamanin ikinci bir yolu, ayni kati faz ortami üzerinde birden fazla, farkli patojeni hedef alan primerleri dahil etmek olabilir. Örnek olarak, test geçerliligi, biyolojik numuneyi daha fazla karakterize etmek için ayni kati faz ortami üzerinde bir viral patojen ve bir bakteriyel patojen için test edilerek dogrulanabilir. LAMP'i çogullamanin üçüncü bir yolu, farkli hedef primerler kullanarak ayni patojeni test etmek olabilir. Bir örnekte, kati faz ortaminin bir birinci bölümü, bir viral patojenin bir birinci proteini için bir primer seti kullanilarak test edebilir, kati faz ortaminin bir ikinci bölümü, viral patojenin bir ikinci proteini için bir ikinci primer seti kullanilarak test edebilir ve kati faz ortaminin bir üçüncü bölümü, viral patojenin bir üçüncü proteini için bir üçüncü primer seti kullanilarak test edebilir. Primerlerin her biri, yanlis negatifleri ve yanlis pozitifleri ortadan kaldirmak için viral patojenin genomunun farkli bölgelerini hedefleyebilir. LAMP, kati faz LAMP reaksiyon ortami üzerinde çesitli bilesenlerin dahil edilmesi sureti ile çoklanabilir. Bir yapilandirmada, Sekil 3a'da da gösterildigi gibi, bir LAMP analizini yürütmeye yönelik bir kati faz reaksiyon ortami (300a), bir substrat (302), substrat (302) üzerine yerlestirilmis olan bir yapiskan katman (304), test noktalarini ya da reaksiyon ve reaksiyon katmani (306) üzerine yerlestirilmis olan bir yayma katmani (308) ihtiva edebilir. çözündürme ajani vb.'nin birini ya da birkaçini ihtiva eden reaktifleri ihtiva edebilir ya da baska bir sekilde tutabilir. Bir yönde, reaktifler bir LAMP reaksiyonu gerçeklestirmek için yeterli olan bir bilesim olusturabilir. Uzamsal olarak süreksiz reaksiyon katmani (306), çoklu kontrollerin ya da çoklu patojenlerin çogullanmasina izin verebilmektedir. Örnek olarak, test noktasi (305a) pozitif bir kontrol olabilir (ör. bilinen bir tükürük DNA'si ya da RNA biyobelirteç testi), test noktasi (305b) negatif kontrol olabilir (ör. LAMP reaksiyonu için kullanilan tüm reaktiflerin olmadigi bir kolorimetrik sonuç için test) ve test noktasi ya da reaksiyon bölümü (3050) hedef patojeni test edebilir. ayrica, çoklu patojenlerin çoklanmis tespitine izin verebilir. Örnek olarak, test noktasi (305a) influenzayi test edebilir, test noktasi (305b) bakteriyel bir enfeksiyonu test edebilir ve test noktasi (3050) mantar enfeksiyonunu test edebilir. Reaksiyon konumlarinin ya da bölümlerinin (305a - 3050) boyutlari, çogullama potansiyelini yaklasik olarak 2 mm arasinda bir kalinliga sahip olabilmektedir. Baska bir yönde, reaksiyon genislige ve yaklasik olarak 4 mm ila yaklasik olarak 25 mm arasinda bir uzunluga sahip olabilir. Bir örnekte, reaksiyon konumlari (305a - 3050) uzamsal olarak süreksiz olabilir. Baska bir örnekte, reaksiyon bölümleri (305a - 3050) yaklasik olarak 30 ila yaklasik olarak 600 arasinda bir yüzey alani - kalinlik oranina sahip olabilmektedir. Bir örnekte, kati faz reaksiyon ortami (300a), yayma katmani (308) boyun0a enine biçimde dogru yer degistirebilen bir biyolojik siviyi alacak bir sekilde yapilandirilabilir. Test noktalari (305a - 3050), bir RT-LAMP ya da LAMP reaksiyonunun meydana gelmesi için kullanilan tüm bilesenleri ihtiva edebilir. Bir örnekte, test noktalari (305a - 3050), bir yeniden çözündürme ajani (örnegin, bir yüzey aktif madde), enzimler (örnegin, DNA polimeraz, ters transkriptaz, DNaz inhibitörleri ya da RNaz inhibitörleri), stabilizatörler (örnegin, BSA ya da kazein gibi bloke edi0i ajanlar), bir kolorimetrik gösterge (örnegin, bir magnezyum kolorimetrik göstergesi, bir pH kolorimetrik göstergesi ya da bir DNA ara katman kolorimetrik göstergesi) ve bir tampon (örnegin, 20 mM Tris) ihtiva edebilir. Kati faz reaksiyon ortami (300a), reaksiyonu hizlandirabilen, hassasiyeti artirabilen ya da bunlarin bir kombinasyonunu bir ajani alacak bir sekilde yapilandirilabilir. Bir örnekte, BSA reaksiyonu hizlandirabilir ve hassasiyeti artirabilir. Bununla birlikte, BSA'nin dahil edilmesi ayni zamanda, sonuçlarin okunabilirligi ile etkilesebile0ek pH varyasyonlarini da ortaya çikarabilir. Bu nedenle de bazi örneklerde, stabilizatör kazein, polisorbat 20, benzerleri ya da bunlarin bir kombinasyonu olabilir. Reaksiyon bölümleri ya da noktalari (örnegin test noktalari) (305a - 3050), burada açiklanan herhangi bir uygun malzemeyi ihtiva edebilir. Bir örnekte, reaksiyon bölümleri (305a - 3050) 0am elyaf, naylon, selüloz, polisülfon, polietersülfon, selüloz asetat, nitroselüloz, hidrofilik PTFE, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Bir yönde, reaksiyon bölümlerinin ya da noktalarinin (305a - 3050) gözenek boyutu yaklasik olarak 1 ila yaklasik olarak 100 mikron olabilir. Reaksiyon bölümleri ya da noktalari (305a - 3050) optik olarak temiz ve pürüzsüz görünümlü olabilir. Baska bir yönde, reaksiyon bölümleri (305a - 3050), dogru ve hassas bir sinyal çikisi ya da tespiti için bir okuma bölgesinde tek tip bir uç renk saglayabilir. Bir örnekte, bir biyolojik numune yavasça reaksiyon bölümleri (305a - 3050) içine dikey olarak asagi dogru yer degistirebilir. Reaksiyon bölümlerinin (305a - 3050) son renk yogunlugu, bir kullanici tarafindan optik gözlem ile ve bir renk semasi ya da ölçegi ile karsilastirilarak ya da bir elde tasinir LED metre ile yüzde yansima birimleri olarak ölçülebilir ve bir laboratuvar referans cihazina karsi kalibre edilmis olan bir egri (curve) seti kullanilarak reaksiyon basina RNA ya da DNA kopyalarina dönüstürülebilir ya da bir laboratuvar referans cihazina karsi kalibre edilebilen RGB degerleri ya da piksel sayisi elde eden bir optik görüntü olarak ölçülebilir. RNA ya da DNA konsantrasyonu, seçilen bir zamandaki son renk yogunlugu ile ya da kinetik Baska bir yönde, kati faz LAMP reaksiyon ortami (300a) bundan baska olarak, reaksiyon bölümlerini (305a - c) ihtiva edebilir. Bir örnekte, en az bir bölüm reaktiflerden büyük ölçüde arindirilmis (ari) olabilir (örnegin, (305a) reaktiflerden büyük ölçüde ari olabilir). Baska bir yönde, reaksiyon bölümleri (305a-c), süreksiz yapiskan katmanlarin (304) en az üç bölümü fazla kontrole ile bir patojenin ya da spesifik pozitif ya da negatif kontroller ilen ya da bunlar olmayan birden fazla farkli patojenin test edilmesine yönelik tanimlamalari ihtiva edebilir. Kisaca belirtilecek olursa, reaksiyon bölümleri (305a - c), yüksek bir derecede dogruluk güvenine sahip olan belirli bir sonuç için spesifik bir test veren herhangi bir arzu edilen parametre ya da protokolü saglamak üzere hemen hemen her dizide test edilmek üzere tasarlanabilmekte ve yapilandirilabilmektedir. Bundan baska olarak, reaksiyon katmani (306), çesitli sayilarda ve konum düzenlemelerinde test noktalari (305a - c) ile bir sayida test noktasi reaksiyon katmanina dahil edilebilmektedir. Buna ilave olarak, bu tür test noktalari ya da reaksiyon bölümleri, reaksiyon katmani (306) içinde dogrusal, yan yana ya da nerede ise arzu edilen herhangi bir uzamsal düzenleme halinde düzenlenebilir. Bir yönde, Sekil 3b'de de gösterildigi gibi, bir kati faz LAMP reaksiyon ortami (300b), yapiskan katman (304) ile yayma ya da dagitim katmani (308) arasinda birlestirilen reaksiyon bölümünü (305a ve 305b) ihtiva edebilir. Bir yönde, en az bir reaksiyon bölümü (örnegin, 305a ya da 305b), reaktiflerden büyük ölçüde ari olan bir kontrol bölümü ya da noktasi olabilir. Baska bir yönde, reaksiyon bölümlerinden en az bir tanesi (örnegin, (305a) ya da (305b)), bir hedef patojeni test etmek üzere yapilandirilabilir (örnegin, seçilen bir LAMP reaksiyonu için reaktifleri ihtiva edecek ya da bunun disinda onlari destekleyecektir). Yine bir baska yönden, Sekil 3c'de de gösterildigi gibi, bir kati faz LAMP reaksiyon ortami ihtiva edebilir. Her bir reaksiyon bölümü, bitisik bir reaksiyon bölümünden ya da noktasindan Yine bir baska yönde, Sekil 3d'de de gösterildigi gibi, bir kati faz LAMP reaksiyon ortami (300d); bir substrat (302), bir yapiskan katman (304), bir yayma katmani dahil olmadan bölümü üzerinde ayri ayri ya da eszamanli olarak biriktirilebilir. Ek olarak, bu yapilanmada, bitisik reaksiyon bölümleri arasinda hiçbir ara parça yoktur. Bununla birlikte, bazi yapilanmalarda, ara parçalar, yayma katmani (308) mevcut olmadan dahil edilebilir. Yine bir baska yönde, Sekil 3e'de de gösterildigi gibi, bir kati faz LAMP reaksiyon ortami (300e); bir substrat (302), bir yapiskan katman (304) ve bir yayma katmani ya herhangi bir ara parça dahil olmadan reaksiyon bölümlerine ya da noktalarina (305a ve 305b) sahip olan bir reaksiyon katmanini (306) ihtiva edebilir. Yine, ara parçalar, ayni zamanda yayma katmani (308) da olmadan baska bir yapilanmaya dahil edilebilir. Bu örnekte numune, biriktirilebilir. Yine bir baska yönde, Sekil 3f'de de gösterildigi gibi, bir LAMP analizi için kullanilabilecek olan bir kati faz reaksiyon ortami (300f); bir substrat (302), bir yapiskan (304) ve bir yayma katmani dahil edilmeden ve herhangi bir ara parçaya sahip olmadan reaksiyon bölümlerine (305a ve 305b) sahip olan bir reaksiyon katmanini (306) ihtiva edebilir. Yine, ara parçalarin, eger istene0ek olursa, bir yayma katmani dahil edilmeksizin bitisik reaksiyon bölümleri arasina dahil edilebile0egi anlasilmalidir. Bu örnekte numune, reaksiyon katmaninin (305a, Ayrica, diger yapilanmalarda (gösterilmemistir), bir yayma katmaninin (308), yayma katmani ile bir yapistiri0i (304) arasinda, an0ak herhangi bir ara parça dahil edilmeden birlestirilen test noktalari ya da reaksiyon bölümleri ile mevcut olabilecegi anlasilmalidir. Kisa0a belirtile0ek olursa, gerçeklestirilecek olan spesifik teste bagli olarak, kati faz reaksiyon ortaminin bilesenleri, en dogru sonu0u saglamak ya da herhangi bir üretim ihtiyacini karsilamak ya da diger bazi faydalari elde etmek amaci ile testin ihtiyaçlarini karsilamak üzere seçilebilir. Diger bir yönde, substrat (302) optik olarak seffaf bir malzeme olabilir. Baska bir yönde, substrat (302) optik olarak seffaf bir plastik tasiyi0i olabilir. Baska bir yönde, yapiskan katman (304) uçu0u maddelerden büyük ölçüde ari olabilir. Baska bir yönde, yapiskan katman (304), bir LAMP reaksiyonu ile etkilesime girebilen maddelerden büyük ölçüde ari olabilir. Baska bir yönde, burada yapiskan katman (304), substrat üzerine ya sürekli bir biçimde ya da süreksiz bir sekilde yerlestirilebilmektedir. Yapiskan katman çesitli malzemeler ihtiva edebilir. Bir örnekte, reaksiyon katmani (306) 0am elyaf, naylon, selüloz, polisülfon, polietersülfon, selüloz asetat, nitroselüloz, hidrofilik PTFE, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Bir örnekte, bir yapiskan katmani (304), reaksiyon katmanindaki reaksiyon bölümlerinin ya da test noktalarinin renk degisimini etkilemeyen bir inert yapistirici ihtiva edebilir. Bir örnekte, reaksiyon katmani (306), selatlama maddeleri, magnezyum, fazla tamponlama kapasitesi, pH'i etkileyen reaktifler ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olabilir. Baska bir örnekte, yapistirici katmani (304) ile reaksiyon bölümleri (305a - 0) arasindaki etkilesimi önlemek üzere yapistirici miktari en aza indirilebilir. dagilimini ve es dagilimini arttirmak üzere yapilandirilabilir. Baska bir yönde, yayma katmani (308), tükürük numunesini reaksiyon katmaninin (306) yüzeyi boyunca dagitabilir ya da ölçebilir. Yayma katmani (308), yayma katmaninin (308) ara yüzü ile reaksiyon katmani (306) arasinda es dagilimli ya da büyük ölçüde es dagilimli bir tükürük numunesi konsantrasyonu saglayabilmektedir. Yayma katmani (308), bir ag malzeme, boyunca ayni gözeneklilige sahip olan bir izotropik gözenekli malzeme ya da gözenekli olma bakimindan bir gradyana sahip olan bir anizotropik katman, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da daha fazlasi olabilir. Bir yönde, bir anizotropik katman yaklasik olarak 1 ila yaklasik olarak 100 mikron araliginda gözenek boyutlarina sahip olabilmektedir. Bir yönde, yayma katmani (308), numuneyi emmek ve yaymak için yeterli bir dereceye kadar hidrofilik olabilmektedir. Baska bir yönde, yayma katmani (308), numunenin yayma katmanindan (308) disari ve reaksiyon katmaninin (306) içine çekilmesine izin vermek üzere alttaki reaksiyon katmanindan (306) daha az hidrofilik olabilmektedir. Yayma katmaninin (308) tam olarak geçirgenligi, homojen bir biyolojik örnek saglandigi zaman biyolojik numunenin reaksiyon katmaninin (305a - c) yüzeyi boyunca esit ve düzgün bir sekilde es dagilimli olarak dagitilmasi için kullanilabilir. Bir yönde, yayma katmaninin (308) yüzeyi, biyolojik numunenin bir yanal yer degistirmesi yolu ile biyolojik numunenin es dagilimli dikey transferi için reaksiyon katmani (305a - c) ile dogrudan temas halinde olabilir. Baska bir yönde, yayma katmani (308), cam elyafi, naylon, selüloz, polisülfon, polietersülfon, selüloz asetat, nitroselüloz, polyester, hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE), benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden fazlasini ihtiva edebilir. Bir örnekte, yayma katmani (308) optik olarak seffaf olabilir. Bir yönde, malzeme, biyolojik numunenin, birden fazla reaksiyon bölümü (305a - 3050) arasindaki dagilimini arttirmak üzere kimyasal olarak islenebilir. Reaksiyon bölümleri ya da test noktalari (305a - 3050) arasindaki yeterli aralik, her bir reaksiyon bölümü arasinda çapraz kontaminasyon olasiligini en aza indirebilir ya da ortadan kaldirabilir. Örnek olarak, reaksiyon bölümü (305a), iki bölüm arasindaki bosluk (305a)'dan reaktiflerin (305b)'ye akmasina izin verdigi zaman, örnegin (305b) gibi bitisik bir bölümü kirletebilir. Baska bir yönde, kati faz LAMP reaksiyon ortami (300a) ayrica, reaksiyon ihtiva edebilir. Bazi yapilanmalarda, ara parçalar (307a - 307d), aralarinda fiziksel bir bariyer meydana getirmek üzere (örnegin, numune her bir test noktasina ayri ayri uygulandiginda) reaksiyon bölümlerinden ya da test noktalarindan (305a - 305d) daha büyük ya da esit bir yükseklige sahip olabilir. Bir örnekte, ara parça yüksekligi, substrat (302) ile ara parçanin (ara parçalarin) bir üst yüzeyi arasindaki mesafenin bir ölçüsü olarak belirlenebilmektedir. Benzer bir sekilde, reaksiyon bölümü yüksekligi, substrat (302) ile reaksiyon bölümünün bir üst yüzeyi arasindaki mesafenin bir ölçüsü olarak belirlenebilmektedir. Bazi yönlerde, ara parçalar, reaksiyon bölümlerinin yüksekliginden %0 ila %50 daha büyük bir yükseklige sahip oIabiImektedir. Diger yapilanmalarda, ara parçalar (307a - 307d), aralarinda fiziksel bir bariyer meydana getirmek üzere (örnegin, numune her bir test noktasina ayri ayri uygulandiginda) reaksiyon bölümlerinden ya da test noktalarindan (305a - 305d) daha az ya da esit bir yükseklige sahip olabilir. Benzer bir sekilde, reaksiyon bölümü yüksekligi, substrat (302) ile reaksiyon bölümünün bir üst yüzeyi arasindaki mesafenin bir ölçüsü olarak belirlenebilmektedir. Bazi yönlerde, ara parçalar, reaksiyon bölümlerinin yüksekliginden %0 ila %50 daha az bir yükseklige sahip oIabiImektedir. Bir örnekte, ara parçalar (307a - d), bunlar ile sinirli olmamak üzere, polisüIfon, polietersülfon, seIüIoz asetat, nitroseIüIoz, polistiren, polyester, hidrofiIik politetrafloroetilen (PTFE), benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da daha fazlasini ihtiva edebilir. Baska bir örnekte, ara parçalar (307a - d), bunlar ile sinirli olmamak üzere cam eIyafi, naylon, seIüIoz, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Baska bir örnekte, ara parçalar (307a - d), hidrofobik bir malzeme (örnegin, polisüIfon, polietersülfon, seIüIoz asetat, nitroseIüIoz, polistiren, polyester, hidrofiIik politetrafloroetilen (PTFE) ya da benzerleri) ihtiva edebilir, ancak hidrofiIik bir malzeme (cam eIyafi, naylon, seIüIoz ya da benzerleri) ihtiva etmez. Bir yönde, ara parçalar (307a - d), reaksiyon bölümleri (305a - c) ile ayni düzIemde yönlendirilebilir ve bunlarin arasina yönlendirilebilir. Baska bir örnekte, Sekil 3a'da da gösterildigi gibi, bir kati faz LAMP reaksiyon ortami, bir yayma katmani (308) ve yapiskan katman (304) ile birlestirilen bir reaksiyon katmani (306) ihtiva edebilir. Bir örnekte, ara parçalarin (307a - 307d) malzeme tipi, yayilma derecesini artirabilir ya da bunun disinda olumlu yönde etkileyebilir. Örnek olarak, polistiren ara parçalar diger malzeme türlerine göre daha fazla yayilmaya neden olabilir. Bir yayma katmani (308) içermeyen bir kati faz reaksiyon ortami, kullanici basitIigi pahasina üretimi basitlestirebilmektedir. Kullanici, tükürük örnegini bu durumda test noktalarinin (305a - 0) her birine ayri ayri uygulayabilir. Bununla birlikte, örnegin polistiren gibi numuneyi iten ya da minimum düzeyde emen bir malzemeden ara parçalar, yayma katmaninin es dagilimli yayma sonuçlari saglamasina yardimci olabilir. Buna ilave olarak, bu tür malzemelerden bu tür ara parçalar ayni zamanda, bir yayma katmani (308) kullanilmadigi zaman bir numunenin yayilmasina da yardimci olabilmektedir. Sekil 4'e atif yapilmak sureti ile, bir viral patojenin varliginin test edilmesine yönelik bir metot (400) gösterilmektedir ve blokta (410) gösterildigi gibi bir denekten bir tükürük numunesinin saglanmasini ve blokta (420) gösterildigi gibi, numunenin, bir LAMP reaktif karisimi ve pH'a duyarli bir boya ile kombinasyon halinde bir kati faz reaksiyon ortamina sahip olan bir test ortami içine dagitilmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, metot, kati faz ortaminin rengini degistirebilen nitelikteki uçucu ajanlarin, higroskopik ajanlarin ve pH'a duyarli olmayan ajanlarin miktarinin en aza indirilmesini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan miktarda hedef primerler, DNA polimeraz ve bir yeniden çözündürme ajaninin bir ya da bir kaçinin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, bir RT-LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir miktarda ters transkriptazin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot, viral patojeni tespit etmek için yeterli olan bir miktarda bir ya da daha fazla hedef primerin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir örnekte metot, numunenin test ortami içine dagitilmasindan sonra bir saatten daha kisa bir süre içinde bir test sonucunun üretilmesini ihtiva edebilir. Yine baska bir yapilanmada, Sekil 5'te de gösterildigi gibi, bir tükürük numunesinin bir kati faz LAMP reaksiyonu ile test edilmeye uygunlugunu dogrulamaya yönelik bir metot (500), LAMP reaktiflerinin ve pH'a duyarli bir boyanin bir kombinasyonunu ihtiva eden en az bir test bölgesi ya da noktasina sahip bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot bundan baska olarak, en az bir negatif kontrol bölgesine sahip olan bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasini ihtiva edebilmekte olup, söz konusu negatif kontrol bölgesi, blokta (510) gösterildigi gibi, pH'a duyarli bir boya ihtiva etmektedir ve LAMP reaktifleri disarda kalmaktadir. Baska bir yönde metot bundan baska olarak, blokta (520) gösterildigi gibi, tükürük numunesinin kati faz reaksiyon ortamina uygulanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot bundan baska olarak, blokta (530) gösterildigi gibi, negatif kontrol bölgesinde pH'a duyarli boyanin aktivasyonunun dogrulanmasini ihtiva edebilir. Bir örnekte, pH'a duyarli boya, fenol kirmizisi, fenolftalein, azolitmin, bromtimol mavisi, naftolftalein, kresol kirmizisi ya da bunlarin kombinasyonlarindan en az bir tanesi olabilir. Baska bir örnekte, LAMP reaktifleri, uçucu reaktifler, pH'i etkileyen reaktifler, magnezyum içeren reaktifleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olabilir. Diger bir yönde, LAMP reaktifleri, DNA polimeraz, ters transkriptaz, bir hedef bölge için primerler ya da bunlarin kombinasyonlari dahil olmak üzere etkilesime girmeyen LAMP reaktiflerini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot bundan baska olarak, süreksiz yapiskan katmanlarin en az iki bölümü tarafindan tanimlanan test bölgesinin ya da test noktasinin saglanmasini ihtiva edebilir. Baska bir örnekte metot, süreksiz yapiskan katmanlarin en az üç bölümü tarafindan tanimlanan test bölgesinin ya da noktasinin saglanmasini ihtiva edebilir. Yine bir baska açiklama yapilanmasinda, Sekil 6'da da gösterildigi gibi, bir kati faz LAMP reaksiyonundan elde edilen pozitif bir test sonucunun dogrulugunu maksimize etmeye yönelik bir metot (600), blokta (610) gösterildigi gibi, her biri ortak bir pH'a duyarli boya ve LAMP reaktiflerinin bir kombinasyonunu ihtiva eden en az üç test bölgesi ya da noktasina sahip olan bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, her bir bölge bir hedef patojenden farkli bir primer sekansi ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, blokta (620) gösterildigi gibi bir LAMP reaksiyonunun baslatilmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, blokta (630) gösterildigi gibi, test bölgesinden ya da noktalarindan en az iki tanesi pH'a duyarli boyayi aktive ettigi zaman ve bir birinci renkten ikinci bir renge bir degisiklik yasadigi zaman pozitif bir test sonucunun dogrulanmasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, metot bundan baska olarak, bir RT-LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir miktarda ters transkriptazin saglanmasini ihtiva edebilir. Bir örnekte, pH'a duyarli boya, fenol kirmizisi, fenolftalein, azolitmin, bromtimol mavisi, naftolftalein, kresol kirmizisi ya da bunlarin kombinasyonlarindan en az bir tanesi olabilir. Baska bir yönde, LAMP reaktifleri, uçucu reaktifler, pH'i etkileyen reaktifler, magnezyum içeren reaktifleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olabilir. Diger bir yönde, hedef patojen bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojeni ihtiva edebilir. Bir yönde, hedef patojen bir viral patojen ihtiva edebilir. Baska bir yönde, viral patojen bir dsDNA virüsü, bir ssDNA virüsü, bir dsRNA virüsü, bir pozitif zincirli ssRNA virüsü, bir negatif zincirli ssRNA virüsü, bir ssRNA-RT virüsü ya da bir ds-DNA-RT virüsü ihtiva edebilir. Baska bir yönde, her bir primer sekansi, H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 ya da SARS-CoV-2'yi ihtiva eden bir viral hedeften bir sekans ile eslesebilir. Baska bir yönde, tespit edilecek olan spesifik hedef nükleotit sekanslari, insan biyobelirteçlerine karsilik gelen hedef nükleotitler olabilir. Bir hastalik için bir insan biyobelirteçine karsilik gelen bir hedef nükleotite sahip olan herhangi bir hastalik tespit edilebilir. Meme kanseri, pankreas kanseri, kolorektal kanser, yumurtalik kanseri, gastrointestinal kanser, rahim agzi kanseri, akciger kanseri, mesane kanseri, pek çok karsinom türü, tükürük bezi kanseri, böbrek kanseri, karaciger kanseri, Ienfoma, lösemi, meIanom, prostat kanseri, tiroid kanseri, mide kanseri, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birden fazlasi dahil olmak üzere çesitli türdeki hastaliklar tespit edilebilir. Örnek olarak, çesitli hastalik türleri için biyobelirteçler,asagidakilerden biri ya da birden fazlasina karsilik gelen hedef nükleotitlerin tespit edilmesi sureti ile belirlenbilir: ve 9p21, sitokeratin, cesmin, epitelyal membran antijeni, faktör VIII, CD31 FL1, glial fibriler asidik protein, gross kistik hastalik sivi proteini, hPG80, HMB-45, insan koryonik gonadotropini, immünoglobulin, inhibin, keratin, Ienfosit belirteci, MART-1, Myo D1, kas spesifik aktin, nörofilament, nörona özgü enolaz, plasental alkalin fosfataz, prostat spesifik antijen, PTPRC, 8100 proteini, düz kas hareketi, sinaptofizin, timidin kinaz, tiroglobulin, tiroid transkripsiyon faktörü-1, tümör M2-PK, vimentin, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari. Bir örnekte pozitif kontrol, DNA sablonunun stabil oldugunu dogrulamak için test bölümlerinden biri olarak sentetik bir DNA hedefi ihtiva edebilir. Baska bir yönde, negatif kontrol sunlari içerebilir: (a) primer içermeyen enzim reaktifleri ya da (b) farkli bir virüsü hedefleyen primerlere sahip enzim reaktifleri. Baska bir örnekte, farkli viral suslarin (örnegin, SARS-CoV-Z) gelismis bir kapsamini elde etmek için 3 test bölümü kullanilabilir. Her bir primer için tespit zamanlamasi ve siniri seçilebilir. Bir örnekte, bir birinci primer ile, bir virüsün (örnegin, SARS-CoV-Z) %97 kapsama alani elde edilebilir. Baska bir örnekte, ilk primere kiyasla daha yavas ve daha az hassas olan 2 ek primerin dahil edilmesi, virüsün için kapsamayi artirmayabilir. Baska bir örnekte, çok sayida test bölümü, farkli viral patojenlerin (örnegin, SARS-CoV-Z, H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 ve benzerleri) kapsanmasini saglamak üzere kullanilabilir. Kati Faz Ortami LAMP Test Süreci ve Metodoloiisi Bir kati faz ortaminda LAMP testi çesitli sekillerde gelistirilebilir. Ilk olarak, test sürecini etkileyebilecek degisiklikleri önlemek için test ortami izlenebilir. Ikinci olarak, biyolojik numune test aparatinin depolama kosullari, biyolojik numune test aparatinin geçerliligini etkileyebilmektedir. Bu kosullar siki bir sekilde izlendigi zaman, biyolojik numune test aparati, sivi bazli LAMP testlerine kiyasla daha fazla çalisabilirlige sahip olabilir. Test ortami ile ilgili çesitli metotlar kullanilabilir. Bir yapilanmada, Sekil 7'de de tasvir edildigi gibi, bir hedef nükleotit sekansnin varligini test etmeye yönelik bir metot: blokta (710) gösterildigi gibi, bir biyolojik numunenin saglanmasini ve blokta (720) gösterildigi gibi numunenin, bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaktif karisimi ve pH'a duyarli bir boya ile kombinasyon halinde bir kati faz reaksiyon ortamina sahip olan bir test ortami içine dagitilmasini ihtiva edebilir. Bir yönde metot, bir RT-LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir miktarda ters transkriptazin saglanmasini ihtiva edebilir. Biyolojik numunenin türü test ortamini etkileyebilir. Örnek olarak, bir tükürük numunesi, test çiktisinin kontrastini azaltabilen bir tamponlama kapasitesine sahip olabilir. Bir örnekte, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da diskidan en az bir tanesi olabilir. Diger bir örnekte metot bundan baska olarak, bir tükürük toplama cihazi, bir burun sürüntü çubugu, bir kan toplama cihazi, bir idrar toplama cihazi, bir ter toplama cihazi, bir soluk verilen nefes kondensati toplama cihazi ya da bir diski toplama cihazindan birini ya da birkaçini kullanarak biyolojik numunenin toplanmasini ihtiva edebilir. Tutarli test çiktilari saglamak için test ortami kontrol edilebilir. Bir yönde, test ortami uçucu reaktifler, pH'i etkileyen reaktifler, kurutma ajanlari ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde arinmis olabilir. Bu reaktiflerin her biri, ek analiz ile telafi edilebilecek olan degiskenleri dahil etmek sureti ile test sonuçlarinin tutarliligini azaltabilir. izlenebilecek olan bir diger test ortami degiskeni, biyolojik numuneyi isitmak için biyolojik test aparati kullanildigi zaman sicakligin artma hizidir. Bir yönde metot, bir test ortami sicakliginin saniyede yaklasik olarak 0,1 (C bir hizda yükseltilmesini ihtiva edebilir. Bir örnekte, test ortami sicakligi saniyede yaklasik olarak 0,1 (C ila saniyede yakla sik olarak 0,2 (C arasinda yükseltilebilir. Bir örnekte, ters tra nskriptaz yaklasik olarak 55 "C'de aktive edilebilir ve DNA polimerazi yaklasik olarak 65 "C'de aktive edilebilir. Sonuç olarak, saniyede yaklasik olarak 0.2 (C'den daha yüksek bir devreye girme hizi, bir LAMP reaksiyonunda ters transkriptaz ve DNA polimerazin koordineli etkisine müdahale edebilir. Bir örnekte, devreye girme hizi, test ortami sicakligi yaklasik olarak 60 CC ila yaklasik olarak 67 CC arasi bir aralikta olana kadar yükseltilebilir. Bazi örneklerde, test ortami yaklasik olarak 55 "C'ye (diger bir deyis ile ters transkriptazin aktive edilebilecegi sicaklik) yükseltildigi zaman, 55 CC'den yaklasik olarak 65 CC'ye yaklasik olarak 0,1 CC'lik bir devreye girme hizi ile, biyolojik numune test aparati geçersiz sonuçlar saglayabilmektedir. Bu nedenle de devreye girme hizi sadece yaklasik olarak 55 CC ila yaklasik olarak 65 CC arasindaki test etme ortami sicaklik araligi içinde degil, ayni zamanda biyolojik numune yaklasik olarak 55 CC'ye isitilirken de izIenmeIidir. Test ortaminin degiskenligi ayni zamanda, biyolojik numune test aparatindan elde edilen sonuçlari da etkileyebilir. Bir yönde metot, test ortaminda 1 (C'den daha az bir de giskenlige sahip olan bir isitma es dagilimi saglamayi ihtiva edebilir. LAMP reaksiyonu ile etkilesime girilmesini önlemek için test kartusunun etrafindaki sicakligin mekansal degiskenligi yaklasik olarak 0,5 CC'den daha büyük olmamalidir. Baska bir yönde metot, bir tükürük numunesi için yaklasik olarak 15 dakika ila yaklasik olarak 30 dakika arasinda bir test etme süresi ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, bir tükürük numunesi için yaklasik olarak 30 dakika ila yaklasik olarak 45 dakika arasinda bir test etme süresi ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, bir tükürük numunesi için yaklasik olarak 45 dakika ila yaklasik olarak 60 dakika arasinda bir test etme süresi ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, bir tükürük numunesi için yaklasik olarak 60 dakika ila yaklasik olarak 90 dakika arasinda bir test etme süresi ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, bir nazofarinjeal numunesi için yaklasik olarak 20 dakika ila yaklasik olarak 30 dakika arasinda bir test etme süresi ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, bir nazofarinjeal numunesi için yaklasik olarak 30 dakika ila yaklasik olarak 40 dakika arasinda bir test etme süresi ihtiva edebilir. Diger bir yönde metot bundan baska olarak, cam elyaf, naylon, selüloz, polisülfon, polietersülfon, seIüIoz asetat, nitroselüloz, hidrofilik PTFE, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva eden bir kati faz reaksiyon ortami ihtiva edebilir. Baska bir yönde, kati faz reaksiyon ortami bunun disinda burada baska sekilde açiklanmis olan bir malzeme ihtiva edebilir. Bir yönde hedef nükIeotit sekansi, bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojenden en az bir tanesinden olabilir. Bir yönde, hedef nükIeotit sekansi bir viral patojenden olabilir. Diger bir yönde, viral patojen asagidakilerden olusan grup arasindan olabilir: Coronoviridae, Orfhomyxoviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Adenoviridae ve Parvoviridae. Diger bir yönde, viral patojen, siddetli akut solunum sendromu koronavirüsü (SARS- CoV-1), siddetli akut solunum sendromu koronavirüsü 2 (SARS-CoV-Z), Orta Dogu solunum sendromu (MERS), grip ve H1N1'den olusan grup içinden seçiIebiIir. Bir yönde, hedef nükIeotit sekansi bir siddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-Z) patojeninden olabilir. Biyolojik numune test aparatinin test dogrulugu, test etmeden önceki depolama uzunlugundan ve depolama kosullarindan (örnegin, depolama sicakligi, nem ve benzerleri) etkilenebilir. Bir yapilanmada, bir biyolojik numune test aparati, bir susuzlastirilmis döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaktif karisimi ve bir susuzlastirilmis pH'a duyarli boya ile kombinasyon halinde bir kati faz reaksiyon ortamina baglanan bir substrat ihtiva edebilir. Bir yönde aparat, seçilmis olan bir sicaklikta (ör. yaklasik olarak 25 (C oda sicakligi) depolandigi zaman 6 ay boyunca depolandiktan sonra en az yaklasik olarak %95, seçilmis olan bir sicaklikta depolandigi zaman 12 ay boyunca depolandiktan sonra en az Baska bir yönde, aparat, seçilmis olan bir sicaklikta depolandigi zaman 2 yil boyunca dogrulugu derecesi saglayabilir. Diger bir yönde aparat, seçilmis olan bir sicaklikta depolandigi zaman 3 yil boyunca depolandiktan sonra en az yaklasik olarak %95, %96, sicaklik, yaklasik olarak - 20 CC ile yakla sik olarak 37 CC arasi bir aralik içindeki herhangi bir sicaklik olabilir. Biyolojik numune test sistemi bir muhafaza ihtiva edebilir. Yine bir baska yapilanmada, bir biyolojik numune test sistemi, bir susuzlastirilmis döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaktif karisimi ve bir susuzlastirilmis pH'a duyarli boya ile kombinasyon halinde bir kati faz reaksiyon ortamina baglanan bir substrat ihtiva edebilmekte olup, söz konusu muhafaza bir biyolojik numuneyi almak üzere çalistirilabilir niteliktedir. Bir yönde biyolojik numune test sistemi bundan baska olarak, pH'a duyarli boya vasitasi ile bir test sonucu üretmek üzere kullanilan bir süre boyunca LAMP reaktif karisimi ile bir biyolojik numune arasinda bir LAMP reaksiyonunu baslatmak ve sürdürmek üzere yeterli olan bir iç sicakliga kabi izotermal olarak isitmak üzere yapilandirilan bir isitici ihtiva edebilir. Bir yönde substrat, optik olarak seffaf bir malzeme ihtiva edebilir. Baska bir yönde substrat, bir yapistirici araciligi ile kati faz reaksiyon ortamina kenetlenebilmektedir. Baska bir yönde yapistirici, büyük ölçüde optik olarak seffaf olabilir. Baska bir yönde substrat, bir muhafazanin bir kismini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, biyolojik numune test sistemi bundan baska olarak, substrat üzerine yerlestirilmis olan bir yapiskan katman, yapiskan katman üzerine yerlestirilmis olan bir reaksiyon katmani ve reaksiyon katmani üzerine yerlestirilmis olan bir yayma katmani ihtiva edebilir. Diger bir yönde, biyolojik numune test sistemi bundan baska olarak, reaksiyon katmani ile ayni düzlemde yönlendirilen bir ara parça katmani ihtiva edebilir. Baska bir yönde biyolojik numune test sistemi bundan baska olarak, substrata karsi yerlestirilmis olan bir muhafaza ihtiva edebilmektedir. Bir örnekte muhafaza bundan baska olarak, yayma katmanina karsi yerlestirilebilmektedir. Baska bir örnekte, muhafaza, substrati, yapiskan katmani, reaksiyon katmanini ve yayma katmanini büyük ölçüde çevreleyebilmektedir. Bir örnekte, Sekil 8'de de gösterildigi gibi, bir biyolojik test sistemi için bir islem sunlari ihtiva edebilir: (a) tükürük toplamak için süngerin kullanilmasi, (b) süngerin bir toplama tüpü içine daldirilmasi, (c) tükürük pH'ini stabilize etmek ve tükürügün tamponlama kapasitesini azaltmak için tükürük numunesini %5'e kadar seyreltmek için toplama tüpünün su ile seyreltilmesi, (d) tükürük numunesinin bir kapiler ve bir ag katmaninin tükürük örnegini reaksiyon katmaninin ayri bölümlerine yayabilecegi bir biçimde için tükürük örnegini tek bir konuma uygulamak sureti ile bir pipet kullanarak kartusta test seridine aktarilmasi (e) kapagin kartus üzerine yerlestirilmesi ve kapagin yerine kilitlenmesi; (f) reaksiyon katmaninin bölümlerinin incelenmesi sureti ile tükürük örneginin pH'inin bir test araliginda oldugunun dogrulanmasi; (g) kartusun isitici içine yerlestirilmesi ve (h) kartusun isitici içinde uygun sekilde konumlandirildiginin dogrulanmasi; (i) isiticinin etkinlestirilmesi; (j) test islemi tamamlandiktan yaklasik olarak 30 dakika sonra sonuçlarin okunmasi; (k) sonuçlarin geçerli olup olmadiginin belirlenmesi ve (I) sonucun pozitif mi yoksa negatif mi oldugunun belirlenmesi. (a) Islemi, bir sünger toplama cihazi ya da bir pasif salya alma cihazi vasitasi ile tükürük toplanmak sureti ile gerçeklestirilebilir. Bir sünger toplama cihazi kullanildigi zaman, tükürügü toplama tüpü içine salmak için sünger toplama tüpü içine batirilabilir (islem (b)). Toplama tüpü, tükürügün tamponlama kapasitesini azaltmak, tükürügün viskozitesini azaltmak ve numunede artan bir es dagilima izin vermek için su ile seyreltilebilir (islem (0)). Tükürük numunesi, test seridine aktarildigi zaman, test seridinin her bir bölümüne ayri ayri uygulanabilir ya da yayma katmanim numuneyi test seridinin test alani boyunca yaymasi ile test seridinin merkezine uygulanabilir (islem (d)). Test ortami ile kontaminasyonu önlemek için test seridi kapatilabilir (islem (e)). Tükürük numunesinin pH'i, örnegin bir kolorimetrik cihaz, bir floresan okuyucu gibi çesitli araçlar vasitasi ile ya da kullanimdaki pH göstergesine yönelik bir pH renk semasi ile basit bir karsilastirma yolu ile test edilebilir (islem (f)). Kartus, toplam reaksiyon süresini ve pozitif ya da negatif bir sonuca ulasma süresini ölçmek için kaydedilen süre ile isitici içine yerlestirilebilir ve etkinlestirilebilir (islemler (g), (h) ve (i)). Sonuçlar 30 dakika sonra okunabilir (islem (j)) ya da sonuçlar olumlu bir sonuç gösterir göstermez okunabilir. Pozitif bir sonucun ortaya çikma hizi, patojenin konsantrasyonu ile iliskilendirilebilir. Sonuçlar, pozitif kontrollere, negatif kontrollere, diger patojen sonuçlarina ya da bunlarin bir kombinasyonuna dayali olarak geçerli (islem (k)) olarak belirlenebilir. pH tabanli bir gösterge kullanildigi zaman, sonuçlarin rengini pH tabanli gösterge için bir renk karsilastirma grafigi ile karsilastirmak sureti ile sonuçlarin pozitif ya da negatif oldugu belirlenebilir. Ayni zamanda, emilen rengin dalga boyunun ölçülmesi sureti ile de sonuçlarin pozitif ya da negatif oldugu belirlenebilir. Baska bir açiklama yapilanmasinda, bir biyolojik test kiti, Sekil 8a ve 8b'de de gösterildigi gibi, bir tükürük toplama cihazi, bir toplama tüpü, bir kartus, bir pipet, bir isitici, bir renk semasi ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da daha fazlasini içerebilir. Tükürük toplama cihazi, bir sünger toplama cihazi ya da bir pasif salya alma cihazi olabilmektedir. Bir örnekte, Sekil 8a'daki islem 1'de gösterildigi gibi, bir kullanici asagidakileri ihtiva eden bir ya da daha fazla islem kullanarak tükürük toplayabilir: (a) bir biyolojik test kitinin bir torbasindan bir Pure-SaITM' in çikarilmasi, (b) gösterge renk degistirene ya da tükürük toplama isleminin bittigini gösteren baska bir gösterge saglanana kadar tükürük toplamak üzere Pure-SalTM süngerinin yerlestirilmesi, (c) toplama tüpünün bir sikistirma tüpü içine sabitlenmesi, (d) sünger örnekleyicinin sikistirma tüpü içine yerlestirilmesi, (e) toplanan tükürügü (bazi bozucu tükürük enzimleri olmadan) sikistirma tüpü içine sikmak üzere süngerin sikistirilmasi, (f) tüpün kapatilmasi ve (g) tüpün birkaç kez (örnegin 1 ila 10 kez) ters çevrilmek sureti ile karistirilmasi. Tükürük bir tüpte toplandiktan ve yeterince karistirildiktan sonra, kullanici Sekil 8a'daki islem 2'de gösterildigi gibi kartusu hazirlayabilir. Kullanici (i) testi folyo posetten çikarabilir, (ii) kilifi kartustan çikarabilir ve (c) kartusu düz bir yüzey üzerine yerlestirebilir. Kullanici ayrica, Sekil 8a'daki islem 3'te gösterildigi gibi, pipeti seyreltilmis tükürük (örnegin, su ile seyreltilmis) ile siyah çizgiye kadar doldurarak ve numune kuyucugu içine aktararak numuneyi aktarabilir. Kullanici ayrica, Sekil 8a'daki islem 4'te de gösterildigi gibi, klipsler hizalanacak ve birbirine geçecek bir sekilde kilifi kartusun üzerine yerlestirmek sureti ile kartusu sizdirmaz bir sekilde kapatabilir. Kullanici ayrica, Sekil 8a'daki islem 5'te de gösterildigi gibi, kartusu yardimci isitici içine yerlestirerek, kapagi kapatarak ve bir reaksiyon tamamlandigi zaman LED'ler araciligi ile gösterebilen yardimci isiticiyi baslatarak kartusu isitabilmektedir. Reaksiyon tamamlandiktan sonra, Sekil 8a'nin 6 numarali isleminde de gösterildigi gibi, bir kullanici kartusu isiticidan çikarabilir ve kartusu bir renk semasi ile karsilastirabilir iken, ayni zamanda renk semasi ile kartus arasindaki yönelimin dogru olmasini temin edebilir. Sekil 8b'de daha ayrintili olarak gösterildigi gibi, viral patojen SARS-CoV-Z'ye atifta bulunmak sureti ile gösterildigi gibi bir renk semasi, 2 sira ve 3 sütun halinde 6 kare ihtiva edebilir. Bir birinci sütun (-ve) negatif bir sonucu gösterebilir, ikinci bir sütun (+ve) pozitif bir sonucu gösterebilir ve üçüncü bir sütun (geçersiz test) geçersiz bir sonucu gösterebilir. Örnek olarak, birinci sütun negatif bir sonucu gösterebilir, çünkü hem üst sira karesi hem de alt sira karesi yaklasik olarak kirmizi - turuncu bir renktir, bu da bir LAMP reaksiyonu için nükleotit amplifikasyonu her iki karede de gerçeklesmedigi zaman ortaya çikabilir. Ikinci sütun pozitif bir sonuç gösterebilir, çünkü üst sira karesi yaklasik olarak kirmizi - turuncu bir renktir, bu da bir LAMP reaksiyonu için nükleotit amplifikasyonu meydana gelmedigi zaman ortaya çikabilir, ancak alt kare yaklasik olarak turuncu - sari bir renktir, bu da bir LAMP reaksiyonu için nükleotit amplifikasyonu meydana geldigi zaman ortaya çikabilir ve viral patojenin mevcut oldugunu gösterir. Üçüncü sütun geçersiz bir sonucu gösterebilir, çünkü üst sira karesi yaklasik olarak turuncu - sari bir renktir, bu da bir LAMP reaksiyonu için nükleotit amplifikasyonu meydana geldigi zaman ortaya çikabilir, ancak alt kare yaklasik olarak turuncu - sari bir renktir, bu da bir LAMP reaksiyonu için nükleotit amplifikasyonu meydana geldigi zaman ortaya çikabilir. Ancak üçüncü sütun için, kirmizi - turuncu renkten turuncu - sari renge renk degisiminin nedeni, ayrica negatif kontrol (örnegin, üst sira) de renk degistirdigi için sonuçsuz olabilir. Bu nedenle de bir kullanici bir test sonucunu belirlemek için kartustaki test ile renk semasini karsilastirabilir. Sekil 8b'de gösterilen renk semasi bir örnektir. Renk semasi, ek kontroller, ek patojenler ya da ayni patojenlere yönlendirilen farkli primerler için herhangi bir sayida testi barindirmak üzere ek satirlar ya da sütunlar ihtiva edebilir. Buna ilave olarak, test denek tarafindan kendi kendine uygulanabilir ya da egitimli bir teknisyen, bir hemsirelik asistani, bir hemsire, bir doktor asistani, bir tip doktoru ya da testi uygulamak ve sonuçlari yorumlamak için nitelikli olan herhangi bir kisi tarafindan uygulanabilir. ÖRNEKLER Asagida yer alan örnekler, mevcut bulusa ait belli bazi yapilanmalarin daha net bir sekilde anlasilmasini desteklemek üzere saglanmaktadir ve hiçbir sekilde bunun üzerinde bir sinirlama anlamina gelmemektedir. Kagit Baz/i LAMP Reaksiyonu Için Malzeme Tertibati ÖRNEK 1 - Kagit bazli LAMP Tertibati Kagit bazli LAMP düzenegi için, tasinabilir ve kompakt bir düzenek tasarlamak üzere çesitli malzemeler taranmistir. Yayma katmaninin taranmasi için, biri primerli ve biri primersiz olmak üzere iki kagit serit birlikte yerlestirildi ve her iki seridi doyurmak (sature etmek) için 0,2 ng/uL bir konsantrasyonda 50 uL RNA yüklendi. Malzemeler, birkaç nedenden dolayi kagidin pH'i üzerinde önemli bir etkiye sahip olmayabilir: (a) ya kagit, inkübasyondan önce renk degistirmek için çok asidikti ya da (b) kagit, reaksiyondan kaynaklanan herhangi bir renk degisikligini önleyecek kadar bazikti. Iki kagit serit arasinda çapraz karismayi önleyen malzemeler, diger cihaz bilesenleri ile daha fazla test edilmistir. Kagit bazli LAMP düzenegi yaklasik olarak 24 x 54 mm boyutlarinda idi. Kagit bazli LAMP düzenegi sunlari içermektedir: (i) bir okuma katmani, (ii) 2 reaksiyon seridi ve (iii) bir yayma katmani. Okuma katmani, destek için seffaf bir 3 milimetre Melinex® destekleyiciden olusuyordu. Melinex® destekleyici, her biri çift tarafli bir yapistirici (ArClean ® 90178) ile temas ettirilen 5 mm x 20 mm kromatografi kagidindan (örnegin, Whatman® 1. Derece kromatografi kagidi) olusan 2 reaksiyon seridine baglanmistir. Iki test seridi, iki test serit arasinda çapraz karismayi önlemek için 2,5 x 20 mm 10 milimetrelik polistiren ara parçalar ile ayrilmistir. Yayma katmani bir polyester sülfon agdan olusmustur (Saaticare® PES 105/52). Numune, yayma katmani üzerine yüklenmistir. Sekil 9, tertibatin bir örnegini göstermektedir. ÖRNEK 2 - Malzeme Taramasi Kagit bazli malzemeler bes kritere bagli olarak seçilmistir: (a) substrat üzerinde kurutuldugu zaman formülasyonun stabilitesi, (b) numune ile yeniden sulandirildigi zaman renk degisiminin yogunlugu, (c) numunenin kagit bazli substrat boyunca esit sekilde sivi çekme kabiliyeti, (d) malzemenin reaksiyon boyunca inert kalma kabiliyeti ve (e) kagit bazli malzemenin amplifikasyon sonrasi bir renk degisikligi gösterme kabiliyeti. Whatman® 1. Derece kromatografi kagidi test edilmis ve optimizasyon için kullanilmistir. Iki test seridini bir araya getirildigi zaman, LAMP reaksiyonu 1. Derece kromatografinin genis bir alanini kullandigindan dolayi sivi dagiliminin düzensiz oldugu gözlemlenmistir. 1. Derece kromatografi kagidindan daha kalin olan bir kromatografi kagidinin seçilmesi (örnegin, Ahlstron 222. Derece kromatografi kagidi), test seritlerinin yüzey alaninda yaklasik 5 mm x 6 mm olmasina izin verirken, ayni zamanda 1. Derece kromatografi kagidi ile ayni miktarda numune ve reaktif tasimasina izin vermistir, bu da yeniden sulandirma sirasinda daha fazla yayilma es dagilimina izin vermistir. ÖRNEK 3 - Malzeme Tarama - 1. Sinif ve 222. Sinif Kromatografi Kagidi Bir örnekte, Sekil 10 'da gösterildigi gibi, görüntüler, üretilebilen renk kontrastinin örneklerini göstermektedir. Bir örnekte, 1. derece kromatografi kagidi kullanilmistir. Diger örnekte, 222. derece kromatografi kagidi kullanilmistir. Her iki durumda da RT-LAMP reaktifleri kurutulmus ve 25 uL %5 tükürük ve %95 su ile yeniden sulandirilmistir. Pozitif numunelerde, reaksiyon basina 10k kopyada eklenen isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 bulunuyordu ve negatif numuneler %5 tükürük (virüs olmadan) ve %95 su idi. Görüntüler 65 "C'de 90 dakikalik zaman noktasinda inkübasyonda yakalandi. Sekil 10'da da gösterildigi gibi, 1. derece kagit için negatif sonuç ile 1. derece kagit için pozitif sonuç arasindaki renk kontrasti, 222. derece kagit için negatif sonuç ile 222. derece kagit için pozitif sonuç arasindaki renk kontrastindan daha az belirgindir. Bu nedenle de daha kalin kagit gelismis renk kontrasti üretti. ÖRNEK 4 - Kagit Tertibat Protokolü Bir kagit tertibat protokolü sunlari ihtiva edebilir: (1) cihaz basina 2 tane olusturmak için polietilen tereftalat (PET) 80 mm x 7 mm boyutlarina sahip olan dikdörtgenler halinde kesin; (2) cihaz basina 1 tane olusturmak için kromatografi kagidini 33 mm x 5 mm boyutlarina sahip olan dikdörtgenler halinde kesin; (3) büyük bir çift tarafli bant tabakasi kesin ve PET dikdörtgenlerini her bir PET dikdörtgeni arasinda 2 cm olacak bir sekilde üzerine bantlayin; (4) tüm dikdörtgenleri kesin, böylece tüm tarafIar üzerinde ekstra bant olacaktir; (5) üzerinde PET olan bandi soyun ve PET'in karsi tarafindaki kromatografi kagidini bandin yaklasik olarak 1 cm disina birakarak bantlayin; (6) cihazin iç tarafina yakin olan tek bir nokta kullanmak sureti ile kromatografi kagidi üzerine 25 uL numune ilave edin; (7) numuneyi örtmek için diger PET seridini bantlayin (diger bir deyis iIe bandin oldugu taraf numuneye temas etmeli ve PET disarida olmalidir); (8) daha fazla kapatma için disarida duran herhangi bir bandi katIayin (9) 15 ml'lik bir tüpün tabanina 1 ml çözücü ilave edin; (10) bir araya getirilen kagit cihazini, disari çikan kromatografi kagidi çözücünün içinde olacak bir sekilde tüp içine yerlestirin; (11) tüpü kapatin; ve (12) 1 saat boyunca 65 "C'de inkübe edin. pH Baz/i Kagit Esas/i LAMP Analizi için Malzemeler ÖRNEK 5 - Tespit Limiti (LoD) Bir LoD çalismasi, 25 uL'Iik bir reaksiyon hacminde 2.5, 5, 10, 20 konsantrasyonlarinda ve kopya/uL'de SARS-CoV-2'nin çesitli bölgelerini ve isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2'nin 2 kat seri seyreItiIerini hedefleyen bir primer seti kuIIanmistir. Su içinde sivi bazIi bir kolorimetrik tahlil kullanilarak, tahmini LoD yaklasik olarak 20 kopya/uL idi ve 4/4 kopya kirmizidan sariya renk degisikligi gösterdi, bu nedenle de amplifikasyonun gerçeklestigini dogruladi. ÖRNEK 6 - Tespit Limiti (LoD) Sivi bazli bir LAMP reaksiyonu için LOD, numune hacminin uL'si basina yaklasik olarak 20 kopya virüsIük bir konsantrasyon olabilir. Bir kati faz reaksiyon ortami (örnegin, kromatografi kagidi) için, her bir reaksiyon alani yaklasik olarak 25 uL'lik bir numune hacmini tutabilir. LoD'nin tükürükte yaklasik olarak 20 kopya/uL oldugu belirlendikten sonra, iliskili konsantrasyonlara sahip olan asagidaki örnekIer olusturulmustur: (1) 20 kopya/uL (1x LoD - alikot). Sonuçlar ayni zamanda görüntü isleme kullanilarak dogrulandi. ÖRNEK 8 - LoD, Hassasiyet ve Özgüllük Su içinde isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2'nin çoklu seri seyreltmeleri yapilmistir (yaklasik olarak 100 kopya/reaksiyon araliginda - 105 kopya/reaksiyon). Bu seri seyreltmeler, potansiyel primer seti adaylari için bir temel LoD olusturmak üzere sivi reaksiyonlarda bir sablon olarak kullanilmistir. Reaksiyonlar, her bir viral konsantrasyon için beyaz bir qPCR plakasi (örnegin, Thermo Scientific® AB -0800W) üzerinde üç kez çalistirildi ve standart bir 75 L biyolojik inkübatörde (örnegin, Fisherbrand ® Isotemp Microbiological Indicator, 15-103- 0513) 60 dakika boyunca 65 CC'ye isitildi. Reaksiyon karisimlarinin farkli zaman noktalarindaki rengi, bir masa üstü tarayicida (Epson® Periection V800 Photo Color) plakanin taranmasi sureti ile kaydedilmistir. Bir primer seti için LoD, her üç kopyada da güçlü bir renk degisikligi ile sonuçlanan en düsük viral konsantrasyon ile belirlenmistir. 103 kopya/reaksiyon ya da daha düsük amplifikasyon saglayabilen herhangi bir aday daha sonra virüs seyreltmeleri ile ayni prosedüre tabi tutulmus (örnegin, 2x katlari ile seyreltilmis) ve matris etkilesimini kontrol etmek için havuzlanmis, saglikli tükürüge eklenmistir. Daha sonra bir kagit substrat üzerinde primer uyumlulugunu kontrol etmek için kagit bazli cihaz üzerinde tükürük LoD çalismalari yapilmistir. Sekil 11'de de gösterildigi gibi, sag taraftaki reaksiyonlar, 25 uL'lik bir reaksiyon hacmi kullanilarak bir floresan boya ile birlestirilmis bir kolorimetrik karisim ile su içine eklenen isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 kullanilarak sivi içinde gerçeklestirilmistir. Siyah çizgiler, absorbans orani (OD430/OD560) ile ölçülen bir renk degisikligini ve açik mavi çizgiler, 103 birim cinsinden floresan yogunlugu ile ölçülen bir floresan degisikligini göstermistir. Yerlesik bir renk/ floresan okuyucu ile kullanildigi zaman tespit süresi daha hizli olabilir. Yaklasik olarak 1000 kopya/reaksiyonluk bir virüs konsantrasyonu için, absorbans orani ve floresan aktivitesi yaklasik olarak 17 dakika sonra artar. Yaklasik olarak 500 kopya/reaksiyonluk bir virüs konsantrasyonu için, absorbans orani ve floresan aktivitesi yaklasik olarak 18 dakika sonra artar. Yaklasik olarak 250 kopya/reaksiyonluk bir virüs konsantrasyonu için, absorbans orani ve floresan aktivitesi yaklasik olarak 19 dakika sonra artar. Yaklasik olarak 125 kopya/reaksiyonluk bir virüs konsantrasyonu için, absorbans orani ve floresan aktivitesi yaklasik olarak 18 dakika sonra artar. Yaklasik olarak 62,5 kopya/reaksiyonluk bir virüs konsantrasyonu için, absorbans orani ve floresan aktivitesi yaklasik olarak 17 dakika sonra artar. Yaklasik olarak 31,25 kopya/reaksiyonluk bir virüs konsantrasyonu için, absorbans orani ve floresan aktivitesi yaklasik olarak 22 dakika sonra artar. Sablonsuz kontrol için, absorbans orani ve floresan aktivitesi asla beklendigi gibi yükselmez. Duyarlilik ve özgüllük, LoD'nin degisen katlarinda (sirasi ile 10, 10, 4, 3 ve 3 tekrarli 1x, 2x, 4x, 40x ve negatif tükürük numunesi kullanilarak belirlenmistir. Kolorimetrik yanit yogunlugu, her bir reaksiyon bölgesinin ortalama yesil kanal yogunlugunu çikarmak için ImageJ kullanilarak belirlendi. Pozitif ve negatif reaksiyonlar arasindaki esik esigi degistirilmesi ve her bir esik degerindeki duyarlilik ve özgüllügün hesaplanmasi sureti ile bir alici - çalisma karakteristigi (ROC) egrisi olusturulmustur. Duyarlilik, yanlis pozitifler de dahil olmak üzere gerçek pozitiflerin sayisinin toplam pozitiflere orani olarak hesaplandi. ÖzgüIIük, yanlis negatifler de dahil olmak üzere gerçek negatiflerin toplam negatiflere orani olarak hesaplandi. Kagit LAMP Kullanarak Viral Patoienleri Test Etmek Için Seçilen Hedef/erin Coklanmasi ÖRNEK 9 - Kagit Serit Formati Sekil 12, bir kagit serit formatini göstermektedir. Siyah çizgiler, 0,063 mm bir kalinliga ve 50 mm bir uzunluga sahip olan SAATICARE Hyphyl ® Polyester PES 105/52'yi göstermektedir. Kirmizi çizgiler, 0,0762 bir kalinliga ve 50 mm bir uzunluga sahip olan Tekra Clear MELINEX® 454 Polyester PET'i göstermektedir. Yesil çizgiler, 0,038 mm bir kalinliga ve 50 mm bir uzunluga sahip olan Adhesives Research ARcIean ® 90178'i (AS-144) göstermektedir. Turuncu blok, 0,508 mm bir kalinliga ve 2,5 mm bir uzunluga sahip olan Tekra Çift Beyaz Opak Yüksek Darbe Polistiren Litho Kalite'yi göstermektedir. Mavi blok, 0,83 mm bir kalinliga ve 5 mm bir uzunluga sahip olan Ahistrom- Munksjö Selüloz 222. Derece'yi göstermektedir. Bu örnekte, kagit serit, bir yayma katmani (siyah renkte), bir yapiskan katman (yesil renkte) ve bir substrat (kirmizi renkte) ile birlikte 5 ara parçaya (turuncu renkte) ve 4 reaksiyon katmani bölümüne (mavi renkte) sahiptir. ÖRNEK 10 - RT-LAMP Islemi Sekil 13'te de gösterildigi gibi, bir kati faz LAMP reaksiyon ortami sunlari ihtiva edebilir: reaktif malzemesi ihtiva eden bir reaksiyon katmani (pembe renkte 4 süreksiz reaksiyon katmani bölümü dahiI); 2,5 mm 20 mil polistiren ihtiva eden ara parçalar (5 süreksiz ara parça dahil), Saaticare® PES 105/52 hipil ihtiva eden bir yayma katmani ve 14 mm Melinex, Arclean ® 90178 ve BM 9962 ile olusturulan bir kapiIer ihtiva eden bir substrat. Sekil 14'te gösterildigi gibi, her bir reaksiyon bölümü ya da test alani arasinda yeterli bosluga sahip olarak reaksiyon bölgeleri arasinda çapraz karisma önIenebiIir. Bu örnekte, turuncu renkteki dört reaksiyon bölümü çapraz kontaminasyondan aridir, çünkü 5 ara parça renk degisikliklerinden aridir. ÖRNEK 11-A - Kagit Kontrasti Baska bir örnekte, Sekil 15'te gösterildigi gibi, 222. derece kromatografi kagidi, 1. derece kromatografi kagidindan daha fazla kontrast saglayabilir. 222. derece kagit için pozitif sonuçlar (sol tarafta), sol üstteki pozitif sonuçlar (sarimsi turuncu) ile sol alttaki negatif sonuçlar (koyu turuncu) arasinda, sag üstteki pozitif sonuçlara (turuncu) ve sag alttaki negatif sonuçlara (koyu turuncu) kiyasla daha büyük bir kontrast göstermektedir. Her bir kagit seridi, negatif test için 8,0 ila pozitif test için 7,5 arasinda degisen bir pH degerine sahip olan yaklasik olarak 500 ,uM tampon ile test edilmistir. ÖRNEK 11 - B - Fenol Kirmizisi Konsantrasyonunun Kagit Üzerinde Etkisi Reaksiyonun kendisini inhibe etmeden negatif sonuçlar ile pozitif sonuçlar arasindaki farklari ayirt etmek için fenol kirmizisi konsantrasyonu hem 1. Derece ve hem de 222. Derece kromatografi kagidi üzerinde test edilmistir. Her iki kromatografi kagidi türü için, reaksiyon basina 250 uM fenol kirmizisi tutarli bir sonuç göstermistir. Düsük boya konsantrasyonu, 60 dakikalik inkübasyondan sonra nispeten açik ve soluk renk gösterirken, pozitifleri negatiflerden ayirt etmek için daha yüksek konsantrasyonlu fenol kirmizi kagit pedler için daha uzun inkübasyon süresi kullanilmistir. ÖRNEK 11-C - Kolorimetrik RT-LAMP Yaniti Üzerinde Baslangiç pH ve Kurutmanin Fenol Kirmizisi Kullanilarak Kâgit Üzerindeki Etkisi Sekil 15B, RT-LAMP reaksiyon karisiminin farkli baslangiç pH'inda kurutma dahil edildigi zaman RT-LAMP'i göstermektedir. Bu örnekte, pH 7,6, RT-LAMP reaksiyon karisiminin ayarlanmamis pH'sidir. Islak kurulum, 20 uL LAMP reaksiyonu ana karisiminin ilave edilmesinden hemen sonra 5 uL sentetik RNA (N geni, 0,2 ng/uL, '+') ya da su ('-') ilave edildigini göstermektedir. Kurutulmus kurulum, kagit seritlerin 20 uL LAMP ana karisimi uygulandiktan sonra oda sicakliginda 30 dakika süre ile kurumaya birakildigini ve daha sonra 25 uL sentetik RNA ('+') ya da su ('-') ile yeniden sulandirildigini göstermektedir. LAMP reaksiyonlari, nükleaz içermeyen suda (1 mM) hazirlanan 5 uL fenol kirmizisi, 2,5 uL primer karisimi ve 12,5 uL NEB 2x kolorimetrik ana karisim ihtiva etmekte idi. Ortaya çikan karisimin pH'i KOH ile ayarlanmistir. 1. derece kromatografi kagidi kullanilmistir. Isitma, 65 CC'ye ayarlanmis bir inkübatörde 120 dakika boyunca gerçeklestirilmis ve reaksiyon sirasinda 45, 60, 90 ve 120 dakikalik zaman noktalarinda düz yatakli bir tarayici ile taranmistir. Sekil 16'da da gösterildigi gibi, bir test seridi formati bir örnek uygulama tarafina ve bir okuma tarafina (Seklin sag üst tarafi) sahiptir. Numune, yayma katmani mevcut oldugu zaman numune uygulama tarafina bir pozisyonda uygulanabilir. Diger örneklerde, bir yayma katmani olmadan, numune, reaksiyon katmaninin (turuncu) her bir bölümü üzerinden numune uygulama katmanina uygulanabilir. Okuma tarafi, özel aletler olmadan ya da bir kolorimetrik detektör ya da floresan dedektör ile okunabilir. Sekil 16'da daha ayrintili olarak gösterildigi gibi, test seridi formati ayrica, 4 test reaksiyon alanina, bir emici/yayma katmanina ve emici katmanin sekline uyacak ve ona temas edecek berrak tek tarafli yapistiriciya sahiptir. ÖRNEK 13 - Test Seridi Birlestirme Islemi Sekil 17, reaksiyon katmanlarinin daha genis enler halinde kaplandigi ve 5 mm'ye kadar kesildigi ve laminasyon için makaralar üzerine yerlestirildigi dilimlemeyi ihtiva eden bir test seridi birlestirme islemini göstermektedir. Proses ayrica, tek tarafli yapistiriciyi temizlemek üzere reaksiyon katmanlarinin bir birinci laminasyon islemini ihtiva etmektedir. Islem ayrica, birinci laminasyon isleminden hemen sonra hat üzerinde gerçeklestirilen ve yayma katmaninin reaksiyon katmanina ve yapiskan katmana lamine edildigi ikinci bir laminasyon prosesini de ihtiva etmektedir. Test seridi birlestirme islemi, pH reaktifi ile kaplanmis polisülfon malzemesi, tek tarafli bir yapistirici ve kromatografi 1 kagidi ihtiva eden malzemeleri içerebilir. ÖRNEK 14 - RT-LAMP Islemi Tükürükteki SARS-CoV-2 virüsünden elde edilen RNA, tükürük ve reaktif karisiminin 65 amplifiye edildi. LAMP için kullanilan dört primer seti sunlari ihtiva etmektedir: SARS-CoV-2 RdRp genini hedefleyen bir tane, SARS-CoV-2 zarf genini (E) hedefleyen bir tane, SARS- CoV-2 ORF1ab bölgesini hedefleyen bir tane ve son olarak bir yerlesik kontrol görevi gören insan RNaseP (RP) genini hedefleyen bir tane. Her bir primer seti, bir ters transkriptaz ve bir zincir - yer degistiren polimeraz kullanilarak izotermal inkübasyon sirasinda ters kopyalana ve amplifiye edilen viral ya da insan RNA'sinin belirli bölgelerini hedefleyen 6 ayri primerden olusuyordu. ÖRNEK 15 - Pozitif Kontrol Viral RNA için üç test seridi ile birlikte çalistirilan test bölgelerinden biri olarak test cihazinda yerlesik pozitif bir kontrol reaksiyonu bulunur. Pozitif kontrol es zamanli olarak pozitif bir sablon kontrolü ve ekstraksiyon kontrolü görevi görür. Eger test seridinin kontrol bölgesinde kirmizidan sariya bir renk degisikligi meydana gelir ise, bu, eger numunede mevcut ise viral RNA'nin virüsten basarili bir sekilde çikarildigini ve testteki reaktiflerin hepsinin bir amplifikasyon sinyali üretmek amaci ile beklendigi gibi performans gösterdigini gösterir. Eger renk degisikligi gerçeklesmez ise, bu durumda test geçersiz sayilmali ve tekrar edilmelidir. Pozitif kontrol, insan klinik örneklerinde her yerde bulunan bir belirteç ve pek çok RT-PCR kitinde standart bir kontrol olan insan RNase P'yi tespit eder. Bu belirtecin amplifikasyonu, insan hücrelerinin lizisinin, test kosullari altinda basarili bir sekilde gerçeklestigini ve ayrica viral lizisin de çikarilabilecegini göstermektedir. Kontrolün bilimsel dayanagi su sekildedir. RT-PCR'ye dayali olan tahlillerin aksine, bizim tahlilimiz viral RNA'nin kimyasal ekstraksiyonunu kullanmaz; daha ziyade isil islem yeterli olmaktadir. RT-PCR'deki polimerazlar biyolojik numune matrislerindeki reaksiyon inhibitörlerine duyarlidir. Dolayisi ile de bu testler genel olarakbir RNA ekstraksiyon ve saflastirma islemine sahiptir. Buna karsilik, LAMP analizlerinde kullanilan Bst 2.0 polimeraz enzimi biyolojik matrislerde son derece saglam olup, bu nedenle ekstraksiyon ve saflastirma kullanilmaz. Cihazda elde edilen 65 CC sicaklik, virüs partiküllerini Iizlemek, viral RNA'yi açiga çikarmak ve saglam amplifikasyonu desteklemek için yeterlidir. ÖRNEK 16 - Negatif Kontrol Bir tükürük örnegi yerine bos bir test çözeltisi ile test cihazi kullanilarak bir negatif, sablonsuz kontrol testi gerçeklestirilir. Bos test çözeltisi, herhangi bir RNA ya da DNA sablonu içermeyen steril, pH tamponlu bir çözeltidir. Eger bu testte bir renk degisikligi gözlenecek olursa, bu bir yanlis pozitif olma olasiligini düsündürür ve bu nedenle de son kontrol çalistirildigindan beri elde edilen pozitif sonuçlari geçersiz kilar. Bu nedenle de kullaniciya yönelik talimatlar, bu tür bir temsili test kiti kullanarak test kitlerini aldiktan sonra kullanici tarafinin bu negatif kontrolü gerçeklestirmesini saglayacaktir. Bu onay ayrica, tanimlanmis bir aralikta da tekrar edilebilir. Negatif bir kontrolde yanlis pozitiflerin en olasi nedeni, sirali testlerden amplifiye edilmis DNA ürününün tasinmasidir. Negatif kontrol testi, siki sizdirmazlik toleranslarina sahip olan kartuslarin imalat kontrolleri ve isitici aparatinin operatör tarafindan silinerek rutin dezenfekte edilerek temizlenmesi de dahil olmak üzere, tasima kontaminasyonu nedeni ile yanlis pozitifleri önlemek için bir dizi kontrol önleminin sonuncusudur. ÖRNEK 17 - iç Kontrol Test düzenegi, test substrati olarak tükürük kullanimi için tasarlanmis olan benzersiz bir kontrol kullanir. Her bir test seridi, tükürük numunesinin baslangiç pH'inin beklenen aralik içinde oldugunu dogrulayan bir iç kontrol olarak görev yapan pH gösterge boyasini ihtiva etmektedir. Numune uygulandigi zaman (isitmadan önce) dört test seridinin hepsinde de kirmizidan sariya bir renk degisikligi gözlenecek olursa, kullanici numunenin geçersiz oldugu sonucuna varmali ve teste devam etmemelidir. Örnekle yapmadan önce örnegin yeme, içme ya da agiz hijyeni ürünlerinin kullanimi gibi dis faktörler, numunenin baslangiç pH'ini çarpitabilir. Arizali bir pH göstergesinin varliginda, eger operatör bu faktörlerden bir tanesinin numuneyi etkiledigini belirleyecek olursa, bu durumda hastanin tükürük pH'inin kendi normal durumuna dönmesi için 5 dakika beklemesine izin verdikten sonra yeniden test yapilabilir. Ayrica örnegin bazi hastalik biçimleri gibi diger dis faktörler de tükürük pH'ini sistematik olarak etkileyebilir, bu durumda alternatif bir test aracinin kullanilmasi endike olmaktadir. ÖRNEK 18 - Sonuç Onayi Kagit LAMP testi kalitatif bir testtir. Test, yorumlayici bir renk semasi yardimi ile operatör tarafindan okunabilen renk tabanli bir görsel sonuçtur. Pozitif bir reaksiyon sonucu sari bir renk verir. Hasta sonuçlarinin yorumlanmasindan önce tüm test kontrolleri incelenmelidir. Eger kontroller geçerli degil ise test geçersizdir ve hasta sonuçlari yorumlanamaz. Bu bir izotermal RNA amplifikasyonu oldugundan dolayi, LoD deneyleri tarafindan tanimlanan seviyelerde hedef SARS CoV-2 RNA'sinin varligi, pozitif bir testin göstergesi olan sonuçlar üretecektir. Bazi durumlarda, pozitif bir test yorumu, Orf1ab, E Geni ya da RdRp Geni'nin 3 hedef gen primer bölgesinden 2 tanesinde pozitif bir sonuç ile dogrulanabilir. Test seridinin rengi, olumlu sonuçlari belirlemek için saglanan bir renk yorumlama çizelgesi ile karsilastirilabilir. Geçerli bir testi belirtmek için test seridinin RNaseP bölgesi sariya dönmelidir. Eger bu bölge sariya dönmezse test geçersizdir ve tekrar edilmelidir. Güvenilir ve mesru bir test seridinin birinci göstergesi, test seridinin isitilmasindan önce tükürügün uygulanmasi üzerine 4 test seridi bölgesinin sariya dönmediginin onaylanmasidir. Eger bu meydana gelecek olursa, tükürük pH'i muhtemelen son gida ya da sivi alimindan nedeni ile kabul edilebilir bir araligin disinda olmaktadir. Hasta agzini su ile çalkalamali, en az 5 dakika beklemeli ve tükürükten tekrar numune almalidir. Test reaksiyonu isitici aparatta tamamlandiktan sonra, yerlesik kontrol RNaseP bölgesinde pozitif bir sari renk degisikligi göstermelidir. Bu durum onaylandiktan sonra, her bir serit bölgesi, verilen renk yorumlama tablosuna karsi renk degisikligi açisindan incelenmelidir. Her bir serit bölgesi pozitif (örnegin, sari bir degisiklik) ya da negatif (örnegin, pembe renk) olarak siniflandirilir. Bir örnekte, test bölgelerinden 2 tanesi pozitif oldugu zaman SARS CoV-2'nin dogrulanmasi gösterilebilir. ÖRNEK 19 - Yanlis Pozitiflerin Kaynaklari Eger test prosedüründe bunlari ele almak için uygun özen gösterilmeyecek olursa, RT-LAMP testlerinde genellikle yanlis pozitifler ortaya çikabilir. Bu yanlis pozitiflerin kaynaklari, uzun bir süre boyunca çevrede kalan ve gelecekteki deneyleri kirleten daha önceki RT-LAMP reaksiyonlari tarafindan olusturulan DNA aerosollerinden kaynaklanabilir. Bu aerosoller, reaksiyon hazirligi sirasinda tek tek reaktifleri kontamine edebilir ya da bunlar reaksiyon karisimlarini tasindiklarinda, islendiklerinde, numuneler ile yüklendiklerinde ya da inkübe edildiklerinde kontamine edebilir. Aerosoller, RT-LAMP ile ilgili testlerin dogrulugunu azaltmanin yani sira, örnegin LoD çalismalari gibi belirli sablon konsantrasyonlarini kullanan deneylere gürültü ilave edebilir. Bu çesitli kontaminasyon noktalarini ele almak için, RT- LAMP ile ilgili tüm prosedürler, farkli yerlerde gerçeklestirilecek olan asamalar (diger bir deyis ile reaksiyon hazirlama, tasima, yükleme/sizdirmazlik, amplifikasyon için inkübasyon ve jel elektroforezi) halinde ayrilabilir. Protokoldeki islemleri uzamsal olarak ayirmak sureti ile reaksiyon sizdirmazligindan önce aerosollerin dahil olma olasiligi en aza indirilebilir ya da eger yanlis pozitifler meydana gelir ise sorun giderilebilir. ÖRNEK 20 - Plakalarin, Kapaklarin, Sizdirmazlik Elemanlarinin ve Tüplerin Taranmasi RT-LAMP'in kontaminasyona ve bu nedenle de yanlis pozitiflere egilimli oldugu göz önüne alindiginda, qPCR 96 kuyucuklu plakalar, sizdirmazlik metotlari ve PCR tüpleri üzerinde kapsamli tarama yapilmistir. Ilk olarak, hem Seffaf (ThermoScientific ® AB -0800) ve hem de Beyaz (AB -O8OOW) olmak üzere Thermo Scientific ® 96 kuyucuklu Tam Kenarli PCR Plakalarinin yani sira FrameStar ® 96 kuyucuklu kenarli optik alt plakalari (Brooks Life Sciences ® 4TI -0970) tarandi. Seffaf plakalar esas itibari ile kolorimetrik tahlillerin taranmasina yardimci olmak için kullanilmistir. Bu seffaf plakalar arasinda, beyaz tabanli Thermo Scientific® 96 kuyucuklu Tam Kenarli PCR plakalari, yanlis pozitiflerin ortalama sayisina dayali olarak en iyi performansa sahipti. Sekil 22A, orf1ab.ll'nin tespit siniri (LoD) için kolorimetrik RT-LAMP tarama görüntülerini göstermektedir. Tarama basliklari, kolorimetrik LoD'yi çalistirmak için kullanilan farkli plaka türlerine karsilik gelen katalog numaralaridir. Sari kuyucuklar basarili bir LAMP reaksiyonunun gerçeklestigini gösterirken, kirmizi/turuncu kuyucuklar sirasi ile eksik ya da düsük seviyeli amplifikasyonlari gösterir. 20 uL reaksiyon karisimlarina, etiketli konsantrasyonlarda su içinde 5 uL isi ile inaktive edilmis virüs seyreItiIeri eklenmistir. Reaksiyon ana karisimlari 12,5 uL NEB Kolorimetrik 2xana karisim, 2,5 uL primer karisim, 5 uL sudan olusmustur. Son nokta görüntüleri, 65 CC'ye ayarlanmi s bir inkübatörde 60 dakika isitiIdiktan sonra alinmistir. Her bir viral konsantrasyon için primer seti basina üç kopya çalistirilmistir. Sizdirmazlik metotlari için asagida yer alan ürünleri inceledik: MicroAmp® Optik 8 kapakli seritler (Thermo Fisher® 43-230-32), Thermo Scientific VersiCap Mat Kapak Seridi (Thermo Fisher® AB1820), Thermo Scientific Yapiskanli Plaka Contalari (Thermo Fisher® AB-O558) ve MicroAmp Optik Yapiskanli Conta (Thermo Fisher ® 43-119-71). Kapaklar arasindan VersiCap Mat Kapak Seridi, yanlis pozitif orani gözlemlerken en iyi sekilde sizdirmaz kapama sagladi; bununla birlikte, bunlar tamamen seffaf olmadiklari için kolorimetrik taramalar için kapaklar reaksiyon iIerIemesinin dogru görüntülerini elde etmeyi zorlastirdi. Sonuç olarak, yapiskan contalar test edildi ve bunlarin her ikisi de birbirlerine kiyasla esit performans gösterdi. Ek olarak, plaka boyunca es zamanli olarak ve esit bir sekilde basinç uygulandigi zaman, yapiskan contalar yanlis pozitif oranlara dayali olarak VersiCaps'ten daha iyi performans göstermistir. Sekil 222B, orf1ab.ll'nin tespit siniri (LoD) için kolorimetrik RT-LAMP tarama görüntülerini göstermektedir. Tarama basliklari, kolorimetrik LoD'yi çalistirmak için kullanilan farkli kapak türlerine karsilik gelen katalog numaralaridir. Sari kuyucuklar basarili bir LAMP reaksiyonunun gerçeklestigini gösterirken, kirmizi/turuncu kuyucuklar sirasi ile eksik ya da düsük seviyeli amplifikasyonlari gösterir. 20 uL reaksiyon karisimlarina, nihai etiketli konsantrasyonlarda sonuçlanmak (pozitif reaksiyonlar) su içinde ya da nükleaz içermeyen su içinde (negatif) 5 uL isi ile inaktive edilmis virüs seyreItiIeri eklenmistir. Reaksiyon ana karisimlari 12,5 uL NEB Kolorimetrik 2xana karisim, 2,5 uL primer karisim, 5 uL sudan ihtiva etmekteydi. Son nokta görüntüleri, 65 "C'de 60 dakika süre ile plaka inkübe edildikten sonra alinmistir. Her bir viral konsantrasyon için primer seti basina üç kopya çalistirilmistir. Görüntüleme sirasinda pIakIara bir alternatif olarak asagida yer alan PCR tüpü ürünlerini arastirdik: Plakalari sizdirmaz halde kapatmak için kullanilanlar ile ayni kapaklari kullanan MicroAmpT'VI Baglantili Optik Kapakli Optik 8 Tüplü Serit (Thermo Fisher® A30588) ve MicroAmpTM Optik 8 Tüplü Serit (Thermo Fisher ® 4316567). TakiIi optik kapakli tüpler, yanlis pozitif oran açisindan en iyi performansi göstermistir. Tamamen monte edilmis, 4 sirali bir test seridi, yayilan bir ag, yapistirici ve içini gösteren Melinexbacker ihtiva edebilir. Test seridi ayrica yaklasik olarak 108 kopya/uL'ye karsilik gelen 0,2 ng/uL bir konsantrasyonda su içinde bir DNA sablonu ihtiva edebilir. Numune hacmi 100 uL olabilir. Bir N-gen primeri, primerIerin ve primer olmayanlarin dönüsümlü kosullari ile kullanilabilir. Yapistirici, renk tepkisini engelleyen bir tamponlama etkisine sahip olabilir, bu nedenle formülasyon telafi etmek için olmalidir. Kagit LAMP Test Islemi ve Mefodo/oiisi ÖRNEK 21 - A - Kagit LAMP Test Islemi Kagit LAMP testi, egitimli saglik hizmeti uzmanlari tarafindan basit bakim noktasi kullanimi için tasarlanmistir. Tüm test süreci Sekil 18'de açiklanmistir. Hasta, saglik hizmeti uzmaninin rehberligi altinda tükürük örnegi toplar. Tükürük numunesi, hiçbir katki maddesi ihtiva etmeyen ve bu nedenle de toplama islemi için hastanin kullanmasi bakimindan güvenli olan özel bir toplama kabi içine toplanir. Tükürük hacmi yaklasik olarak 100 uL'dir ve bu da hasta tarafindan kolay bir biçimde toplanir. Yukarida belirtildigi gibi spesifik RNA tespit bölgelerini ihtiva eden test seridi tamamen bir plastik serit tutucusunda bulunur. Tükürük numunesinin alinmasindan sonra hasta toplama kabini operatöre teslim eder. Operatör daha sonra tükürük numunesini belirtilen konumlardaki test seridine uyguIar ve kartus muhafazasini kapatir. Numuneyi ihtiva eden seritli kartus daha sonra, arzu edilen 65 "C'ye isitmayi elde etmek üzere kartusu güvenli bir sekilde yerinde tutmak üzere tasarlanmis olan isitici aparati içine yerlestirilir. Kagit LAMP tahlili, izotermal bir sicaklikta test seridinde ilerler. LAMP reaksiyonu sirasinda, nükleik asitler tükürük numunesinde tanimlanir ve 65 "C'Iik bir sicaklik altinda, nükleik asitlerin amplifikasyonundan kaynaklanan pH degisikligi serit üzerinde bir renk degisikligine neden olur. test sonucuna ulastigi zaman operatörü uyarmak için (kirmizi - sari - yesil) renkli LED isiklara sahip olabilir. Test ilerledigi sirada isitici aparati, testin kesintiye ugramamasini temin etmek için ör. bir manyetik ya da mekanik kilit gibi bir özellik ihtiva edebilir. Test reaksiyonu, izotermal 65 CC sicaklikta yaklasik olarak 15 ila 30 dakika devam edebilir. TahIiIin sonunda, içinde bulunan test seridi ile test tasiyicisi isiticidan çikarilabilir ve görsel olarak okunabilir. ÖRNEK 21 - B - Kagit LAMP Test Islemi Sekil 18B, SARS-CoV-2 için kagit bazli bir kolorimetrik moleküler testin üretimini ve kullanimini göstermektedir. SARS-CoV-2 için kagit bazli kolorimetrik moleküler testin imalati sunlari ihtiva etmektedir: (1a) Bir ana karisimin meydana getirilmesi, (1b) karisimin bir pede aktarilmasi, (10) bir kalite kontrolü yapilmasi ve (1d) test cihazinin hava ile kurutulmasi. SARS-CoV-2 için kagit bazli kolorimetrik moleküler testin kullanimi sunlari ihtiva etmektedir: (2a) numune toplama, (2b) suda yeniden süspanse etme, (2c) numunenin pede ilave edilmesi, (2d) 65 °C'de yaklasik olarak 60 dakika süre ile inkübasyon ve (2e) sonuçlarin yorumlanmasi. ÖRNEK 21 - C - Kagit LAMP Test Islemi Tahlilin is akisi Sekil 19A'da gösterilmektedir: tükürük toplayin, numuneyi kagit bazli cihaza aktarin, 65 "C'de inkübe edin ve sonucu okuyun; tipik bir sonuç Sekil 19D'de gösterilmektedir. Sekil 19C, kagit cihazimizin yapisinin bir semasini vermektedir. Kagit cihazi, reaksiyon bölgeleri arasinda çapraz karismayi önlemek için 20 mil polistiren ara parçalar ile ayrilmis olan muhtelif sayida 222. Derece seIüIoz reaksiyon pedini ihtiva etmekteydi. Bu bilesenler, çift tarafli bir yapistirici araciligi ile yapisal destek için seffaf bir destege baglanmistir. RT-LAMP'i yürütmek için olan reaktifler, üretim sirasinda reaksiyon pedi üzerinde kurutulmustur. Bu reaktifler, kullanici numuneyi reaksiyon bölgelerine ilave ettigi zaman yeniden sulandirilmistir. Sekil 19A, kagit bazli cihazin semalarini ve kolorimetrik karakterizasyonunu göstermektedir. Sekil 19A, cihaz kullanimina yönelik is akisinin sematik bir gösterimini saglamaktadir. Kontrol bölgesi, primer olmayan kontrolü gösterir. Sekil 198, %5 tükürükte belirtilen konsantrasyonda isi ile inaktive edilmis siddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) kullanarak kagit üzerinde kolorimetrik LoD saglar. Negatif kopyalar, isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 yerine nükleaz içermeyen su kullanan RT-LAMP reaksiyonlaridir. Veriler Sekil 21A'dan alinmistir. Sekil 19C, kagit cihazinin sematik bir düzenini saglamaktadir. Sekil 19D, negatif ve pozitif bir çalismanin tipik kolorimetrik sonuçlarini vermektedir. Kontroller, LAMP primerlerinin dahil olmadigi RT-LAMP reaksiyonlaridir. Pozitif reaksiyonlar %5 tükürük içine eklenmis 800 kopya/uL'ye sahiptir. Sekil 19E, panel B'nin kolorimetrik sonuçlarindan türetilen olasi sonuçlarin bir renk gradyanini saglar. Sekil 19F, anket yanitlarina dayali olarak kagit cihazin analitik duyarliligini ve özgüllügünü hesaplamak için kullanilan gözlemlerin bir özet tablosunu saglar. Testin bir her islemi (Sekil 19A), karmasikligi azaltmak ve bakim noktasi ayarlarindaki kullanici hatalarini azaltmak için tasarlanmistir. Numune toplama islemi, hasta tarafindan kendi kendine toplanma yapmaya izin veren, toplanan tükürükten partikülleri uzaklastiran ve hastadan hastaya sonuçlardaki degiskenligi en aza indiren sünger bazli bir toplama cihazi kullanir. Transfer islemi, cihazdaki iki reaksiyon bölgesinin her biri üzerine 25 uL seyreItiImis tükürük yerlestirilmesini ihtiva ediyordu. Inkübasyon islemi için, numune yüklü kagit cihaz yeniden kapatilabilir bir plastik torbaya kapatilir ve 60 dakika boyunca 65 CC'ye ayarlanmis bir inkübatör içine yerlestirilir. Son olarak, okuma islemi için kullanici, sonuçlarin geçerli olup olmadigini ve ilgili patojenin mevcut olup olmadigini belirlemek için kontrol ve reaksiyon bölgelerinin rengini Sekil 19C'deki renk çubugu ile karsilastirmistir. Platform üç ana bilesenden olusur: tahIiIe özgüllük kazandiran primer setleri, (bir kontrol ve bir reaksiyon olmak üzere) iki reaksiyon bölgesi ihtiva eden bir kagit cihaz ve kagit cihazi reaksiyon sicakliklarina isitmak için kullanilan bir isitma kaynagi. Primer setleri, tahIiIin hangi patojeni hedefledigini belirler. Bu nedenle de platform, cihazin diger tüm yönlerini ve formülasyonunu ayni tutarken primer setlerinin yeniden tasarlanmasi sureti ile farkli bir patojeni hedefleyecek bir sekilde yeniden yapilandirilabilir. Ek olarak, kagit bazli cihaz, es zamanli olarak birden fazla hedefin tespit edilmesine izin veren çok sayida reaksiyon bölgesini barindiracak bir sekilde yapilandiriIabiImektedir. SARS-CoV-2 inin tükürük içinde dogrudan tespiti, çiplak göz ile okunabilen farkli bir kolorimetrik yanit vasitasi ile gösterilir (Sekil 19). Bu format ruIodan ruona üretime uygundur ve test basina ~ 10 $'a mal olmasi beklenmektedir. Testin tespit siniri (LoD) 200 kopya/uL tükürüktür. Analitik duyarlilik (pozitif tahmine dayali deger) %76, özgüllük (negatif tahmine dayali deger) %100'dür ve dogruluk, görsel olarak degerlendirildigi zaman yapilandirilmis örnekler (isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 eklenmis yeni toplanan tükürük) kullanilarak belirlendigi gibi yaklasik %91'dir (Sekil 19F). Kontrol pedinin renk algisindaki öznellik nedeni ile katilimcilar sunulan 80 cihazdan toplam 20'sini yanlis bir biçimde geçersiz olarak tanimlamis ve bu da %25'lik yanlis geçersizlik oranina neden olmustur. Renk degisimi görüntü isleme kullanilarak ölçüldügü zaman duyarlilik %98'lik bir dogruluk ile %97'ye yükselmektedir (Sekil 19C). Cihaz (Sekil 19C) 6 mm x 20 mm boyutlarina sahipti ve sunlari ihtiva etmekteydi: bir okuma katmani, iki reaksiyon seridi ve çapraz karismayi önlemek için ara parçalar. Okuma alani, destek için optik olarak seffaf 3 mil MELINEX (Tekra MELINEX® destekleyiciyi ihtiva etmekteydi. Bu, çift tarafli bir yapistirici (Adhesives Research asit içermeyen ARclean ® 90178) kullanilarak 5 mm x 6 mm kromatografi kagidindan (Ahlstrom - Munksjö Derece 222) iki reaksiyon seridine baglanmistir. Seritler, 2,5 x 6 mm 20 mil polistiren ara parçalar (Tekra Çift Beyaz Opak Yüksek Darbe Polistiren (HIPS) Litho Sinifi) ile ayrilmistir. Yeniden sulandirma sirasinda seritleri doyurmak için 25 uL numune ilave edilmistir. 222. derece kromatografi kagidinda fenol kirmizisinin RGB degerlerinin bir dizi pH degeri üzerinden ortalamasi alinmak sureti ile bir renk çubugu meydana getirilmistir. Bu ortalama RGB degerleri kullanilarak dogrusal bir gradyan meydana getirildi ve ROC egrisinden belirlenen optimal esik degeri renk çubugu üzerine not edildi (Sekil 19 C). Numuneyi kagit bazli cihaz üzerine yükledikten sonra, RT-LAMP reaksiyonu sirasinda kontaminasyonu önlemek için cihaz 1" x 1" yeniden kapatilabilir bir plastik torba içine yerlestirildi. Kagit cihazin bulundugu plastik torba daha sonra 60 dakika boyunca 65 CC' de bir inkübatör içine yerlestirildi. Torba çikarildi, düz yatakli bir tarayici ile tarandi (Sekil 19D) ve 6 - 9 arasinda bilinen pH degerlerinde tamponlarda 222 derece pedler üzerinde fenol kirmizisi yanitindan RGB degerlerinin ortalamasi alinarak olusturulan bir renk semasi (Sekil 19E) ile karsilastirildi (Sekil 21B). Renk kartelasindaki esik degeri ROC analizinden (Sekil 19B) belirlenen esige karsilik gelmektedir. LoD'den olusan yapilandirilmis örnekler olusturuldu. Negatif örnekler olarak yeni toplanan tükürükten 30 alikot kullanildi (Sekil 21A). Sonuçlar görüntü isleme kullanilarak ölçülmüstür (Sekil 19A ve Sekil 21C). Negatif ve pozitif kolorimetrik reaksiyon pedlerinin yesil kanal yogunlugu arasindaki fark, iki kuyruklu ögrenci t-testi kullanilarak anlamli bulunmustur (p < Görüntü analizi kullanilarak yapilan özgüllük %100, duyarlilik %97 ve dogruluk %98 idi (Sekil 20C). Sekil 20, kagit üzerindeki kolorimetrik tepkilerin dijital analizini göstermektedir. Sekil 20A, kagit üzerinde RT-LAMP'nin 30 pozitif ve 30 negatif sonucunun yesil kanal yogunlugu için bir kutu grafigini göstermektedir. Sekil 20B, kagit üzerindeki RT-LAMP'in 30 pozitif ve 30 negatif sonucu için bir alici - operatör (ROC) egrisini göstermektedir. Sekil 20C, görüntü analizine dayali olarak gözlemler için bir özet tabloyu göstermektedir. Çalismaya alinan katilimcilardan Purdue Üniversitesi IRB Protokolü # IRB-2021-375'e uygun olarak kolorimetrik algi anketleri (Sekil 23A ve 23B) toplanmistir. Katilimcilara esik açiklamali bir renk çubugu verildi (Sekil 19E). Katilimcilara birden fazla kagit cihaz taramasi verildi ve kontrol pedini (sol reaksiyon bölgesi) geçerli ya da geçersiz ve SARS-CoV-2 reaksiyonunu (sag reaksiyon bölgesi) pozitif ya da negatif olarak siniflandirmalari istendi. Geçersiz olarak siniflandirilan gözlemler, tahlil performans analizinden çikarildi ve yanlis olarak tanimlanan geçersiz tahlillerin orani yanlis geçersiz oran olarak bildirildi. Dört katilimcidan bir renk çubugu kullanarak (Sekil 19) Sekil 21A'da sunulan 10 pozitif ve 10 negatif reaksiyonu geçerli ya da geçersiz (sol kontrol bölgesine göre) ve SARS-CoV-2 için pozitif ya da negatif (sag reaksiyon bölgesine göre) olarak siniflandirmalari istenmistir. Katilimcilar tarafindan geçersiz sayilan gözlemler çikarilmistir. 40 gerçek pozitif gözlemden (hepsi görüntü analizi kullanilarak geçerlidir), katilimcilar 19 taneyi yanlis bir sekilde geçersiz olarak siniflandirmistir. Bu durum, 1 gözlemin yanlis bir sekilde geçersiz olarak siniflandirildigi 40 gerçek negatif gözlem ile (36 tanesi görüntü analizi kullanilarak geçerliydi) çelismektedir. Dolayisi ile de kolorimetrik yorumlamayi açiklarken cihazimizin hesaplanan özgüllügü ve duyarliligi sirasi ile %100 ve %76 idi ve % 91'lik bir dogruluk (Sekil 19F) ve ÖRNEK 22 - Numune Stabilitesi Tükürük toplama isleminden test seridi uygulamasina kadar standart süre 2 saat içinde olmaktadir. Numune alimindan itibaren 24 saate kadar test için izin verilen numune 24 saatte tekrarli test edilmesine dayali olabilir. Hastalardan bir toplama merkezinde ya da klinik ortaminda hizli bir sekilde toplanan numuneler daha sonra saatler sonra test edilebilir. Bir bölgede toplanma (örnegin, bir ayakta tedavi tesisinde ya da daha sonra tükürük numunesinin örnegin bir yer gibi ikinci bir konuma tasinmasi ile birlikte bir arabaya servis toplama alaninda) da degerlendirilebilir. ÖRNEK 23 - Üretim Yüksek sicakliklarda daldirma kaplamanin ve kurutmanin LAMP reaksiyonunu olumsuz bir etkisi var gibi görülmemistir. Bunun üretim hacmi ve ölçeklenebilirlik üzerinde olumlu etkileri vardir. Test seridi, önemli alet edevat maliyetleri söz konusu olmadan mevcut dönüstürme ekipmaninda ölçekli olarak üretilebilecek bir sekilde tasarlanmistir. Tasarim, ortaya çikan pazar ihtiyaçlarini karsilamak için prototiplemeden tam ölçekli üretime kadar hizli ve basit bir yol hedefini karsilayacak kadar basittir. ÖRNEK 24 - Kagit Tabanli Cihaz Tasarimi Kagit, esas itibari ile ucuz maliyet, düsük teknik karmasiklik ve rulodan ruloya üretim kullanilarak üretim kolayligi nedeni ile pH göstergelerinde ve idrar seritlerinde yaygin olarak kullanilmaktadir. Burada açiklanan cihazlar için, çesitli kagit türlerinin ve seçilen kromatografi kagidinin kullanimi degerlendirilmistir (Sekil 21D - 21F). Kromatografi kagidi, diger kagitlara kiyasla gelismis sivi emme kabiliyeti nedeni ile kagit bazli biyosensörlerde kullanilabilir. Pek çok kagit bazli cihaz 1. Derece kromatografi kagidi kullanir; bununla birlikte, 1. Derece kromatografi kagidinin genis alani (5 mm x 20 mm) nedeni ile kagit boyunca çözelti dagilimi esit bir biçimde olmamaktadir. Dolayisi ile de 1. dereceden (0,18 mm) yaklasik olarak 4,6 kat daha kalin olan 222. dereceye (0,83 mm) farkli tipte bir kromatografi kagidi seçilmistir. Artan kalinligi nedeni ile ayni sivi hacmi, cihazin boyutunu (5 mm x 6 mm) azaltmak sureti ile esit dagilima izin verecek bir biçimde %70 daha küçük bir reaksiyon alani üzerine yüklenebilir. Cihazin karmasikligini azaltmak için RT-LAMP reaksiyonunun bilesenleri (sablon olmadan) kagit üzerinde kurutulmustur. Kurutma, teshis performansindan ödün vermeden cihazin istikrarli bir sekilde dagitilmasina ve kolay çalistirilmasina olanak saglar; kullanici sadece reaktifleri yeniden sulandirmak için numuneyi ilave eder. Reaktifleri kagit üzerinde kuruttuktan sonra, kagitlar herhangi bir sablon mevcut olmadan zaman içinde kirmizidan sariya renk degistirdi ve bu da kagidin pH'inda bir düsüs oldugunu gösterdi. Bir dizi disarida birakma deneyi ile bu degisimden amonyum sülfatin sorumlu oldugu beIirIenmistir (Sekil 216). Bu renk degisikligi, isitmanin neden oldugu selülozun oksidasyonundan ve amonyum sülfatin oksitleyici dogasindan ya da RT-LAMP karisimindan amonyagin gazdan arindirilmasi ile reaktiflerin asitlenmesinden kaynaklanabilir. Amplifikasyon yoklugunda renk degisikligini önlemek için amonyum sülfat betain ile degistirildi ve fenol kirmizisi konsantrasyonu arttirildi (bu ise bir antioksidan görevi görür) (Sekil 21 H). LAMP reaksiyonlarinda betainin etkinligi degisiklik göstermekte olup, bununla birlikte, betain oksidatif hasari azaltabilir ve dolayisi ile de dahil edilmistir. Hem trehaloz ve hem de BSA kagit üzerindeki formülasyona ilave edilmistir (Sekil 21 H). Cihaz için, biri SARS-CoV-2 iyi hedefleyen ve biri reaktiflerimizin kagit üzerindeki stabilitesini belirlemek için primersiz kontrol saglayan (herhangi bir numune ile reaksiyona girmemesi gereken) iki reaksiyon bölgesi kullanildi. Nihai cihazin bir semasi Sekil 19C'de gösterilmektedir ve %5 reaksiyon konsantrasyonunda tükürüge eklenen isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 içeren ve içermeyen cihazdan elde edilen sonuçlar Sekil 19D'de gösterilmektedir. Sekil 1QB'de de gösterildigi gibi, kagit üzerindeki analizin LoD'si (250 kopya/reaksiyon), koIorimetrik RT-LAMP formülasyonu için çözeltide gözlemlenen LoD ile karsilastirilabilir niteliktedir (Sekil 21 I). Cihazin yapimi için yapisal destek saglamak amaci ile Melinex® destek kullanilmistir. Çift tarafli bir yapistirici kullanilarak, pH'Iarini degistirmeden destege iki reaksiyon pedi baglanmistir. Reaksiyon bölgelerinin sayisi, cihazin tasarimini degistirmeden çoklanmis tespite izin vermek için istege bagli olarak artirilabilir. Bir reaksiyon bölgesinden bitisik bir reaksiyon bölgesine sizintiyi önleyen fiziksel bir bariyer saglamak için reaksiyon pedleri arasina 20 mil polistiren ara parça ilave edilmis olup, dolayisi ile de hem reaktif ve hem de numune ilave etme sirasinda çapraz karisma ortadan kaldirilmistir. Bazi durumlarda, reaksiyon bölgeleri, numunenin geçmesini önleyen balmumu baskisindan kaynaklanan hidrofobik bariyerler ile ayrilabilir; bununla birlikte, ruIodan ruona üretimi temin etmek için balmumu kullanimi ortadan kaldirilmis ve ara parçalar kullanilmistir. ÖRNEK 25 - Yapilandirilmis Numunelerin Dogrulanmasi Tahlilimizin kagit üzerindeki analitik duyarliligini ve özgüllügünü degerlendirmek için, RT- LAMP tahlilini kagit üzerinde çalistirmak üzere orf7ab.l için LoD'nin katlarinda isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 ile yapilandirilmis numuneler olusturulmustur. Amerika Birlesik Devletleri'nde acil kullanim izni (EUA) için minimum sayi olan toplam 30 pozitif numune ve karsilik gelen 30 negatif numune kullanilmistir. Pozitif reaksiyonlari negatif reaksiyonlardan ayirt etmek için kolorimetrik esigi belirlemek için, degisen yesil kanal yogunlugu esik degerlerinde duyarlilik ve özgüIIük hesaplamasi yapmak sureti ile bir ROC egrisi olusturulmustur (Sekil 20). Esikte, tahlil asagida yer alan analitik metriklere sahip idi: gruplar arasindaki fark anlamli olarak farkli bulunmustur (p < 0,001). Kagit seritler eIIe kesilmistir ve kagidin boyutundaki küçük farkliliklar kolorimetrik yanitta farkliliklara neden olabilir. Bu nedenle de büyük ölçekli imalat ve kalite kontrolü, iki grup (pozitif ve negatif) içindeki tutarliligi daha da artirabilir. Bu duyarlilik, RNA ekstraktlarini kullanan tahliller ile karsilastirilabilir niteliktedir (duyarlilik ~%95) ve duyarlilikta önemli düsüslerin (~%80'e kadar) yaygin oldugu ham numuneler için bildirilenden daha iyidir. ÖRNEK 26 - Kagit Bazli Cihazin Kolorimetrik Yorumu Renk algisinin cihazimizin performansi üzerindeki etkisini gözlemlemek için dört katilimciya anket uygulanmis ve cihazin sonuçlarini yorumlamalari istenmistir. Her bir katilimciya 60 dakika sonra bir renk çubugu ve cihazin taramalari verildi (Sekil 23A ve 238) ve renk çubugunda isaretlenen esige göre sonucu geçerli ya da geçersiz (kontrol pedi kullanilarak) ve pozitif ya da negatif olarak siniflandirmalari istendi. Kullanici yorumu analize dahil edildigi zaman cihazin duyarliligi ve dogrulugu sirasi ile %76 ve %91'e düsmüstür (Sekil 19F). Bu düsük hassasiyet, katilimcilarin kontrol pedine dayali olarak birçok olumlu reaksiyonu geçersiz olarak tanimlamalarindan kaynaklanmakta olup, bu da reaksiyon sirasinda kontrol pedinin amplikonlar ile kontaminasyonuna atfedilebilecek olan o/o25'lik yanlis bir geçersizlik oranina yol açmaktadir. Ek olarak, hem sari ve hem de kirmizi bölgelerin bulundugu pedlerin kullanici tarafindan yorumlanmasi belirsizlige neden olabilir ve bu da yanlis pozitif oranin ya da yanlis geçersiz oranin artmasina neden olabilir. Son bulgular, bu belirsizligin, kolorimetrik tahlillerde yeterince ele alinmayan üçüncü bir ara renk kümesinden (pozitif/negatif kümeler ile birlikte) kaynaklandigini ima etmektedir. Geçersiz sonuçlar daha fazla analizden çikarildigindan dolayi, bu yüksek yanlis geçersizlik orani cihazin özgüllük ve dogruluk ölçülerini yapay olarak etkileyebilir. ÖRNEK 27 - Tek Reaktantin Giderilmesinin Kurutma Sonrasi Kagidin Baslanqic Renqi Üzerindeki Etkisi Sekil , esmolar dNTP karisimi (, WarmStart RTX (0,3 U/uL), Fenol kirmizisi (, Tween 20 uL RT-LAMP ana karisimi, 1. derece kromatografi kagidina ilave edildigini ve 10 dakika boyunca bir PCR hazirlama basliginin içinde kurumaya birakildigini göstermektedir. Reaktantlar, kurutulduktan sonra gözlemlenen renk degisikliginin nedenini belirlemek için belirtildigi gibi baz formülasyonun disinda birakilmistir. RT-LAMP primerler ve sablonlari bu çalismaya dahil edilmemistir. ÖRNEK 28 - Çesitli pH Degerlerinde Fenol Kirmizisi Renk Kalibrasyonu Sekil 218, 20 mM Tris ile tamponlanmis kagit üzerinde farkli pH degerlerinde 250 uM fenol kirmizisinin kalibrasyonunu göstermektedir. pH degerleri HCI ya da KOH kullanilarak ayarlanmistir. 222. derece kromatograf kagidinin (5 mm x 6 mm) görüntüleri, renkler birden fazla serit boyunca kolayca karsilastirilabilecek bir sekilde bir dikdörtgen seklinde kirpilmistir. ÖRNEK 29 - Isi ile Inaktive Edilmis SARS-Cov-2'nin Çesitli Konsantrasvonlarinda Nihai Cihazin Dogrulugu Sekil 21A, orf7ab.l primer seti kullanilarak RT-LAMP'yi ve kolorimetrik RT-LAMP ana karisiminin nihai formülasyonunu göstermektedir. Her bir cihazdaki sol reaksiyon bölgesi, tüm orf7ab.l primerlerinin su ile degistirildigi ve ana karisima dahil edilmedigi primersiz kontroldür. Dogru reaksiyon bölgesi, ya pozitif reaksiyonlar durumunda belirtilen konsantrasyonlarda islenmis tükürük içine eklenmis isi ile inaktive edilmis virüs ya da negatif reaksiyonlar durumunda islenmis tükürük ihtiva etmektedir. Tüm islenmis tükürük, %5 ilik bir nihai reaksiyon konsantrasyonu ile sonuçlanmistir. Ana karisim, KCI (50 mM), MgSO4 (8 mM), esmolar dNTP karisimi (her biri , 222. derece kromatografi kagidi kullanilmistir. ÖRNEK 30 - Degisken Sablon Konsantrasvonlarinda RT-LAMP Kolorimetrik Yanitinin Yesil Kanal Renk Yogunlugu Sekil 21C, kagit pedlerin degisen konsantrasyonlarda kolorimetrik tepkisinin bir saçilim grafigini göstermektedir. Yesil renk yogunluk esigi referans hatti (121) ile gösterilmektedir. ÖRNEK 31 -Isitma Metodunun RT-LAMP Kolorimetrik Tepkisi Üzerindeki Etkisi Sekil 22C, 65 CC'de 60 dakikalik inkübasyondan sonra farkli isitma cihazlarinda 25 uL reaksiyonlari için LAMP'in tespit sinirina (LoD) yönelik kolorimetrik taramalari göstermektedir. Bu reaksiyonlar için kullanilan primer seti orf1ab.ll'dir. 20 uL reaksiyon karisimlarina, nihai etiketli konsantrasyonlar (pozitif reaksiyonlar) ya da nükleaz içermeyen su (negatif) ile sonuçlanmak üzere suda 5 uL isi ile inaktive edilmis virüs seyreltileri eklenmistir. Reaksiyon ana karisimlari 12,5 uL NEB Kolorimetrik 2xana karisim, 2,5 uL primer karisim, 5 uL sudan ihtiva etmekteydi. ÖRNEK 32 - RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerindeki etki ya da devreye qirme hizi Sekil 22D, degisen devreye girme hizi oranlarina sahip olan qTower (96 kuyucuklu plaka) ve termodöngüleyici (PCR tüpleri) üzerinde 25 uL reaksiyonlar için 65 C'de 60 dakikalik inkübasyondan sonra kolorimetrik taramalari göstermektedir. Kullanilan primer seti, orf1ab.ll. 20 uL idi. Reaksiyon karisimlarina, son etiketli konsantrasyonlar (pozitif reaksiyonlar) ya da nükleaz içermeyen su (negatif) ile sonuçlanmak üzere suda 5 uL isi ile inaktive edilmis virüs seyreltileri eklenmistir. Reaksiyon ana karisimlari 12,5 uL NEB Kolorimetrik 2x ana karisim, 2,5 uL primer karisim, 5 uL sudan ihtiva etmekteydi. ÖRNEK 33 - Trehaloz ve Tween 20'nin RT-LAMP Kolorimetrik Yaniti Üzerindeki Etkisi Sekil 21H, verilen konsantrasyonda Trehaloz ya da Tween 20'nin dahil edildigi kolorimetrik RT-LAMP sonuçlarini göstermektedir. orf1ab.ll primer seti kullanilmistir. KCI (50 mM), MgSO4 (8 mM), esmolar dNTP karisimi (, WarmStart BST 2.0 (0,32 U/uL), WarmStart RTX (, Antarktik mg/mL) ve Trehaloz'dan (%10 a/h, eger belirtilmis ise) olusan baz formülasyonu ihtiva eden uL RT-LAMP ana karisimi, Kalite 1 kromatografi kagidina (5 mm x 20 mm) ilave edilmistir ve 60 dakika boyunca bir PCR hazirlama basliginin içinde kurumaya birakilmistir. %25 islenmis tükürükte (pozitif reaksiyonlar) ya da nükleaz içermeyen suda (negatif reaksiyonlar) reaksiyon basina 1 x 105 kopya son konsantrasyonda 25 uL isi ile inaktive SARS-CoV-2 kuru reaksiyon pedlerine ilave edilmistir. Pedler, 65 "C'ye ayarlanmis olan bir inkübatörde 60 dakika boyunca isitilmis ve daha sonra bir düz yatakli tarayici kullanilarak taranmistir. Amonyum sülfatin dahil edilmesi, hiç sablon mevcut olmadigi zaman RT-LAMP reaktiflerinin kurutulmasi üzerine kirmizidan sariya bir renge neden olmustur. Bu renk degisikligi, fenoI kirmizisi konsantrasyonunun arttirilmasi ve amonyum sülfatin betain ile degistirilmesi ile önlenmistir (Sekil 21G). Bundan baska olarak, trehaloz ve sigir serum albümini (BSA) ilavesi reaksiyon hizini artirmis ve gelistirilmis LoD'yi arttirmistir (Sekil 21H). ÖRNEK 34 - Özet Karmasik numunelerde, iIgiIeniIen patojenlerin nükleik asitlerini tespit etmek için kagit bazli bir cihaz, insan gözü tarafindan görülebilen bir kolorimetrik yanit üreterek döngü aracili izotermal amplifikasyonu (LAMP) kullanabilir. Bu cihazin, ortaya çikan halk sagligi acil durumlarindaki faydasini göstermek için cihaz, ön isleme tabi tutulmadan insan tükürügünde SARS-CoV-2 tespit etmistir. Ortaya çikan cihaz, virüsü 60 dakika içinde tespit edebilir nitelikte ve görüntü analizi kullanarak 200 genomik kopya/uL hasta tükürügü tespit siniri ile yapistirici araciligi ile bir Melinex® destegine baglanan 20 mil polistiren ara parçalar ile ayrilmis 222. derece kromatografi kagidindan yapilmis yapilandirilabilir sayida reaksiyon bölgesi ihtiva etmekteydi. Elde edilen cihaz, LAMP primer setlerini degistirmek sureti ile birden fazla hedefi ve çesitli patojenleri tespit edebilir. Platform asagida yer alan özelliklere sahiptir: i) tükürük kullanir, ii) minimum operatör egitimine sahiptir, iii) milyonlarca test elde etmek için rulodan ruloya metotlar kullanilarak üretilebilir, iv) analitik duyarlilik ve özgüIIük açisindan bir RT-qPCR testine benzer bir performans gösterir, v) çiplak gözle görülebilen bir kolorimetrik yanit saglar, vi) bakim noktasi kullanimina uygundur, vii) 60 dakikadan daha kisa sürede sonuç verir ve viii) ~ 10 $/test maliyeti oldugu tahmin edilmektedir. Bu testin basitligi ve öIçekIenebiIirIigi nedeni ile potansiyel olarak ev içi teshis de dahil olmak üzere çok çesitli ortamlarda kullanilabilir. Platform, solüsyondaki primer setlerini taramak sureti ile farkli patojenleri hedeflemek üzere kolay bir biçimde yeniden yapilandirilabilir. Çogullama, cihaza ek reaksiyon bölgeleri ilave etmek sureti ile etkinlestirilir. Platformun yeniden yapilandirilabilir dogasi, gelecekteki halk sagligi acil durumlarinda ortaya çikan patojenlerin tespiti için kullanilmasina olanak tanir. Örnek Yapilanmalar Bir örnekte, bir kati faz reaksiyon ortami ile kombinasyon halinde higroskopik bir ajandan büyük ölçüde ari olan bir LAMP reaktif karisimi ihtiva edebilen bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzenegi saglanmaktadir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin bir örneginde, kati faz ortami magnezyum ile etkilesime giren maddelerden büyük ölçüde arindirilmis olabilir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, magnezyum ile etkilesen maddeler; magnezyum içeren bilesikleri ve magnezyum ile etkilesime giren selatlayici maddelerini ihtiva edebilir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, kati faz ortami; hidrofilik, emici ve gözenekli olabilir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, kati faz ortami; selüloz bazli bir ortam olabilir. Döngü aracili bir izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, selüloz bazli ortam, yaklasik olarak 30 ila yaklasik olarak 600 arasinda bir yüzey alani - kalinlik oranina sahip olabilmektedir. Döngü aracili bir izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, selüloz bazli ortam yaklasik olarak 100 mikrondan daha az bir gözenek boyutuna sahip olabilir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, kati faz ortami kagit ihtiva edebilir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, kati faz ortami cam elyaf ihtiva edebilir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, kati faz ortami; naylon, polisülfon, polietersülfon, selüloz asetat, nitroselüloz ya da hidrofilik Politetrafloroetilen (PTFE) ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, LAMP reaksiyon ortami bundan baska olarak, magnezyum ile etkilesime giren ajanlar ve higroskopik ajanlardan büyük ölçüde arindirilmis olan bir yapistirici ihtiva edebilir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzeneginin baska bir örneginde, LAMP reaksiyon ortami bundan baska olarak, kati faz reaksiyon ortamindan daha az hidrofilik olan bir yayma katmani ihtiva edebilir. Bir örnekte, higroskopik ajandan büyük ölçüde ari olan LAMP reaktif karisiminin, böylece reaktif karisiminin kati faz reaksiyon ortami ile temas halinde tutulacagi bir sekilde kati faz reaksiyon ortami ile birlestirilmesini ihtiva edebilen, burada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon düzeneginin üretimine yönelik bir metot saglanmaktadir. Bir örnekte, burada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon düzeneginin üretilmesine yönelik bir metot bundan baska olarak, bir renk degistirmeyen katki maddesi kullanilarak renk degisikliginin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Burada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon düzeneginin üretilmesine yönelik bir metoda ait baska bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesi bir seker, bir tampon, bir bloke edici madde ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Burada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon düzeneginin üretilmesine yönelik bir metoda ait baska bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesi, trehaloz, glikoz, sükroz, dekstran ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva eden bir seker ihtiva edebilir. Burada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon düzeneginin üretilmesine yönelik bir metoda ait baska bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesi, sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva eden bir bloke edici ajan/madde ihtiva edebilir. Baska bir örnekte, burada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon düzeneginin saglanmasini, reaksiyon düzenegine bir biyolojik numunenin uygulanmasini, düzenegin LAMP reaksiyonunu baslatmak üzere yeterli olan bir sicakliga isitilmasini ve LAMP reaksiyonunu tamamlamak üzere yeterli olan bir süre boyunca sicakligin korunmasini ihtiva edebilen, bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir metot saglanmaktadir. Bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir metoda ait bir örnekte, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birkaçi olabilir. Bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir metoda ait diger bir örnekte biyolojik numune tükürük olabilir. Bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir metoda ait diger bir örnekte, metot bundan baska olarak, bir viral patojenin tespit edilmesini ihtiva edebilir. Bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir metoda ait diger bir örnekte, LAMP analizi ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) olabilir. Bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan bir kati faz reaksiyon ortami ve etkilesimde bulunmayan bir reaktif karisimi ihtiva edebilen, bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sistem saglanmaktadir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sisteme ait bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 5 mM arasinda bir tamponlama kapasitesine sahip olabilir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sisteme ait baska bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, yaklasik olarak 443 nm ila yaklasik olarak 570 nm arasinda bir/'lmax araliga sahip olabilir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sisteme ait baska bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami selüloz ya da cam elyaf ihtiva edebilir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sisteme ait baska bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, hidrofilik, emici ve gözenekli olabilir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sisteme ait baska bir örnekte, büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami, oksitleyici ajanlar ve pH ile etkilesime giren ajanlardan büyük ölçüde arindirilmis olabilir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sisteme ait baska bir örnekte, sistem bundan baska olarak, bir yapistirici; bir yayma katmani; bir ara parça; ve bir plastik tasiyici ihtiva edebilmekte olup, burada yapistirici, yayma katmani, ara parça ve plastik tasiyicinin her biri oksitleyici ajanlar ve pH ile etkilesime giren ajanlardan büyük ölçüde arindirilmistir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sisteme ait baska bir örnekte, etkilesime girmeyen reaktif karisimi bundan baska olarak, hedef primerler, DNA polimeraz ve bir yeniden çözündürme ajanindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Diger bir örnekte, LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikligini en aza indiren bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasini ve kati faz reaksiyon ortami üzerinde LAMP reaksiyonunun gerçeklestirilmesini ihtiva edebilen, bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot saglanmaktadir. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, metot bundan baska olarak, LAMP disi reaksiyon ile üretilen protonlardan LAMP disi üretilen renk degisikliginin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, metot bundan baska olarak, bir renk degistirmeyen katki maddesi kullanilarak LAMP disi reaksiyon ile üretilen renk degisikliginin kontroI edilmesini ihtiva edebilir. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesi bir seker, bir tampon, bir bloke edici ajan ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesi, trehaloz, glikoz, sakaroz, dekstran ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini içeren bir seker ihtiva edebilir. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesi sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva eden bir bloke edici ajan ihtiva edebilir. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizindeki bir tespit seviyesini (LOD) en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot, bir reaksiyon ortami ve LAMP disi reaksiyon ürünlerini en aza indiren reaktifler saglanmasini ihtiva edebilir. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, bir kromatik döngü araciligi izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir sistem, bir kati faz reaksiyon ortaminin ve LAMP reaktiflerinin bir kombinasyonunu ihtiva edebilmekte olup, bu da, 25 CC'de depolandigi zaman, kati faz ortaminin bir baslangiç tonunun %10'u içinde olan bir kati faz reaksiyon ortami renklendirmesini muhafaza eder. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, kombinasyon, 30 gün, 90 gün, 365 gün, 2 yil ya da 5 yildan biri ya da birkaçindan daha uzun süre boyunca depolandigi zaman renklenmeyi koruyabilmektedir. Bir kati faz pH'a bagli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metoda ait bir örnekte, kombinasyon, 25 CC'de yaklasik olarak %40 ila %90 arasinda bir bagil nemde depolandigi zaman renklenmeyi koruyabilmektedir. Diger bir örnekte, etkilesime girmeyen reaktif karisiminin, böylece etkilesime girmeyen reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile temas halinde tutulacagi bir sekilde büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile birlestirilmesini ihtiva edebilen, burada belirtildigi gibi bir kromatik LAMP sisteminin üretimine yönelik bir metot saglanmaktadir. Burada belirtildigi gibi bir kromatik LAMP sisteminin üretilmesine yönelik bir metoda ait bir örnekte, üretim prosesi: etkilesime girmeyen reaktif karisimini ihtiva eden bir çözeltinin hazirlanmasi; ve reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami üzerine kaplanmasini ihtiva edebilir. Burada belirtildigi gibi bir kromatik LAMP sisteminin üretilmesine yönelik bir metoda ait diger bir örnekte, kaplama, çözeltinin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami üzerine damlatilmasini, püskürtülmesini, daldirilmasini, islatilmasini ya da bugulanmasini ihtiva edebilir. Burada belirtildigi gibi bir kromatik LAMP sisteminin üretilmesine yönelik bir metoda ait diger bir örnekte, etkilesime girmeyen reaktif karisimi, bir makaradan makaraya (RZR) islemi kullanilarak büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile birlestirilebilir. Yukarida tarif edilen metotlarin sadece, mevcut bulusa ait yapilanmalari açiklamaya yönelik oldugu anlasilmalidir. Mevcut bulusun özünden ve kapsamindan ayrilmaksizin teknikte uzmanliga sahip olan kisiler tarafindan çok sayida modifikasyon ve alternatif düzenleme tasarlanabilmektedir ve ekte yer alan istemlerin bu tür modifikasyonlari ve düzenlemeleri kapsamasi amaçlanmaktadir. Dolayisi ile de mevcut bulus, halihazirda bulusun en fazla pratik ve en çok tercih edilen yapilanmalari olarak kabul edilenler ile baglantili olarak yukarida özellikle ve ayrintili bir sekilde tarif edilmis olsa da, teknikte siradan uzmanliga sahip olan kisiler için, burada ortaya konulan ilke ve kavramlardan ayrilmaksizin dahil olmak üzere varyasyonlarin yapilabilecegi anlasilacaktir. TR TR TR

Claims

1.STEMLER Bir döngü aracili bir izotermal amplifikasyon (LAMP) reaksiyon düzenegi olup, özelligi: bir kati faz reaksiyon ortami ile kombinasyon halinde higroskopik maddeden büyük ölçüde arindirilmis olan bir LAMP reaktif karisimi içermesidir. Istem 1'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; kati faz ortaminin magnezyum ile etkilesime giren maddelerden büyük ölçüde arindirilmis olmasidir. Istem 2'ye göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; magnezyum ile etkilesen maddelerin, magnezyum içeren bilesikleri ve magnezyum ile etkilesime giren selatlayici maddeleri içermesidir. Istem 1'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; kati faz ortaminin hidrofilik, emici ve gözenekli olmasidir. Istem 1'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; kati faz ortaminin selüloz bazli bir ortam olmasidir. Istem 5'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; selüloz bazli ortamin yaklasik olarak 30 ila yaklasik olarak 600 arasinda bir yüzey alani - kalinlik oranina sahip olmasidir. Istem 5'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; selüloz bazli ortamin yaklasik olarak 100 mikrondan daha az bir gözenek boyutuna sahip olmasidir. Istem 1'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; kati faz ortaminin kagit içermesidir. Istem 1'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; kati faz ortaminin cam elyaf içermesidir. Istem 1'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; kati faz ortaminin naylon, polisülfon, polietersülfon, selüloz asetat, nitroselüloz, hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE) ya da bunlarin kombinasyonlarini içermesidir. Istem 1'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; ayrica magnezyum ile etkilesime giren maddeler ve higroskopik maddelerden büyük ölçüde arindirilmis olan bir yapistirici içermesidir. Istem 1'e göre LAMP reaksiyon düzenegi olup, özelligi; ayrica kati faz reaksiyon ortamindan daha az hidrofilik olan bir yayma katmani içermesidir. Istem 1'e uygun bir LAMP reaksiyon düzeneginin üretilmesine yönelik bir metot olup, özelligi: higroskopik maddeden büyük ölçüde arindirilmis olan LAMP reaktif karisiminin, reaktif karisimin kati faz reaksiyon ortami ile temas halinde tutulacagi bir sekilde kati faz reaksiyon ortami ile birlestirilmesini içermesidir. Istem 13'e göre metot olup, özelligi; ayrica: renk degistirmeyen bir katki maddesi kullanarak renk degisikliginin kontrol edilmesini içermesidir. Istem 14'e göre metot olup, özelligi; renk degistirmeyen katki maddesinin, bir seker, bir tampon, bir bloke edici madde ya da bunlarin kombinasyonlarini içermesidir. Istem 14'e göre metot olup, özelligi; renk degistirmeyen katki maddesinin, trehaloz, glikoz, sükroz, dekstran ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva eden bir seker içermesidir. Istem 14'e göre bilesim olup, özelligi; renk degistirmeyen katki maddesinin sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini içeren bir bloke edici madde içermesidir. Bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir metot olup, özelligi: istem 1'de belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyon düzeneginin saglanmasi; reaksiyon düzenegine biyolojik bir numunenin uygulanmasi; düzenegin LAMP reaksiyonunu baslatmak üzere yeterli olan bir sicakliga isitilmasi; LAMP reaksiyonunu tamamlamak için yeterli olan bir süre boyunca sicakligin muhafaza edilmesini içermesidir. Istem 18'e göre metot olup, özelligi; biyolojik numunenin tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birkaçi olmasidir. Istem 18'e göre metot olup, özelligi; biyolojik numunenin tükürük olmasidir. Istem 18'e göre metot olup, özelligi; ayrica: viral bir patojen tespit edilmesini içermesidir. Istem 18'e göre metot olup, özelligi; LAMP analizinin ters transkripsiyon LAMP (RT- LAMP) olmasidir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizi için bir sistem olup, özelligi: büyük ölçüde reaktif olmayan bir kati faz reaksiyon ortami; ve bir etkilesime girmeyen reaktif karisimi içermesidir. Istem 23'e göre sistem olup, özelligi; büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortaminin, yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 5 mM arasinda bir tamponlama kapasitesine sahip olmasidir. Istem 23'e göre sistem olup, özelligi; büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortaminin yaklasik olarak 443 nm ila yaklasik olarak 570 nm araliginda bir /lmax degere sahip olmasidir. Istem 23'e göre sistem olup, özelligi; büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortaminin selüloz ya da cam elyaf içermesidir. Istem 23'e göre sistem olup, özelligi; büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortaminin hidrofilik, emici ve gözenekli olmasidir. Istem 23'e göre sistem olup, özelligi; büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortaminin oksitleyici maddeler ve pH ile etkilesime giren maddelerden büyük ölçüde arindirilmis olmasidir. Istem 23'a ait sistem olup, ayrica: bir yapistirici; bir yayma katmani; bir ara parça; ve bir plastik tasiyici ihtiva etmekte olup, özelligi; burada yapistirici, yayma katmani, ara parça ve plastik tasiyicinin her birinin, oksitleyici maddelerden ve pH ile etkilesime giren maddelerden büyük ölçüde arindirilmis olmasidir. Istem 23'e ait sistem olup, özelligi; etkilesime girmeyen reaktif karisiminin ayrica: hedef primerler, DNA polimeraz ve bir yeniden çözündürme maddesinden birini ya da birkaçini içermesidir. Bir kati faz pH bagimli döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir kromatik çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot olup, özelligi: LAMP disi reaksiyon ile üretilen renk degisikligini en aza indiren bir kati faz reaksiyon ortaminin saglanmasi; ve kati faz reaksiyon ortami üzerinde LAMP analizinin gerçeklestirilmesini içermesidir. Istem 31'e ait metot olup, özelligi; ayrica: LAMP disi bir reaksiyon ile üretilen protonlardan LAMP disi reaksiyon ile üretilen renk degisikliginin kontrol edilmesini içermesidir. Istem 31'e ait metot olup, özelligi; ayrica: renk degistirmeyen bir katki maddesi kullanilarak LAMP disi reaksiyon ile üretilen renk degisikliginin kontrol edilmesini içermesidir. Istem 33'e ait metot olup, özelligi; renk degistirmeyen katki maddesinin, bir seker, bir tampon, bir bloke edici madde ya da bunlarin kombinasyonlarini içermesidir. Istem 33'e ait metot olup, özelligi; renk degistirmeyen katki maddesinin, trehaloz, glikoz, sükroz, dekstran ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva eden bir seker içermesidir. Istem 33'e ait bilesim olup, özelligi; renk degistirmeyen katki maddesinin sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini içeren bir bloke edici madde içermesidir. Bir döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizinde bir tespit seviyesini (LOD) en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot olup, özelligi; LAMP disi reaksiyon ürünlerini en aza indiren bir reaksiyon ortami ve reaktifler saglamayi içermesidir. Bir kromatik döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizi için bir sistem olup, özelligi: 25 CC'de depolandigi zaman, kati faz ortaminin bir baslangiç tonunun %10'u içinde olan bir kati faz reaksiyon ortami renklendirmesini koruyan bir kati faz reaksiyon ortaminin ve LAMP reaktiflerinin bir kombinasyonunu içermesidir. 5 yildan biri ya da birkaçindan daha uzun bir süre boyunca depolandigi zaman renklenmeyi korumasidir. Istem 38'e ait sistem olup, özelligi; kombinasyonun 25 CC'de yakla sik olarak %40 ila %90 arasinda bir bagil nemde depolandigi zaman renklenmeyi korumasidir. Istem 1'e uygun bir kromatik LAMP sisteminin üretilmesine yönelik bir metot olup, özelligi: etkilesime girmeyen reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile temas halinde tutulacagi bir sekilde, etkilesime girmeyen reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile birlestirilmesini içermesidir. Istem 41'ye göre metot olup, özelligi; burada üretim isleminin: etkilesime girmeyen reaktif karisimini ihtiva eden bir çözeltinin hazirlanmasini; ve reaktif karisiminin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami üzerine kaplanmasini içermesidir. 43. Istem 42'ye göre metot olup, özelligi; kaplamanin, çözeltinin büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami üzerine damlatilmasini, püskürtülmesini, daldirilmasini, islatilmasini ya da bugulanmasini içermesidir. 5 44. Istem 42'ye göre metot olup, özelligi; etkilesime girmeyen reaktif karisiminin, bir makaradan makaraya (RZR) islemi kullanilarak büyük ölçüde reaktif olmayan kati faz reaksiyon ortami ile birlestirilmesidir. TR TR TR