TR2023008291T2 - Patojeni̇k hedefler i̇çi̇n döngü aracili i̇zotermal ampli̇fi̇kasyon (lamp) anali̇zi̇ - Google Patents

Abstract

The present disclosure is drawn to compositions and methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP) analysis utilizing a pH-dependent output signal. The composition can comprise a pH sensitive dye, and a plurality of non-interfering LAMP reagents. The method can comprise providing an assembly of a solid phase medium and a composition, depositing a biological sample onto the solid phase medium, and heating the assembly to an isothermal temperature sufficient to facilitate a LAMP reaction.

Description

TARIFNAME PATOJENIK HEDEFLER içiN DÖNGÜ ARACILI IZOTERMAL AMPLIFIKASYON (LAMP) Ilgili Basvurular Bu basvuru, buraya referans olarak dahil edilmis olan 15 Ocak 2021 tarihli Amerika Birlesik Devletleri Geçici Patent Basvurusu Seri No. (SS/138,314 sayili belgeye rüçhan hakki talep etmektedir. Teknigin Bilinen Durumu Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), çesitli analitik amaçlar için nükleotidlerin amplifikasyonuna imkan veren bir moleküler biyoloji teknigidir. Kantitatif PCR (qPCR), hedeflenen bir nükleotidin amplifikasyonunun izlenmesine izin veren bir PCR uyarlamasidir. Tanisal qPCR, bulasici hastaliklarin, kanserin ve genetik anormalliklerin göstergesi olan nükleotidleri tespit etmek için uygulanmaktadir. Ters transkripsiyon PCR (RT-PCR), bir hedef RNA nükleotidlerinin tespitine izin veren bir qPCR uyarlamasidir. Bu özelligi nedeni ile RT-PCR, virüs patojenlerini tespit etmek için çok uygundur. Bununla birlikte, RT-PCR, belirli hasta basi ortamlarinda bulunamayabilecek olan büyük ekipman kullanir. Ek olarak, RT-PCR, uygulamayi gerçeklestirmek ve sonuçlari elde etmek için egitimli personel, önemli numune hazirligi ve sonuçlarin elde edilmesi için zaman gerektirir. Buna karsilik, Döngü Aracili Izotermal Amplifikasyon (LAMP), hedef nükleotidlerin tanisal tanimlanmasina yönelik daha basit bir yaklasimdir. Özellikle de LAMP, spesifik nükleotit sekanslarini çogaltmak için tek islemli bir nükleik asit amplifikasyon metodudur. Bir izotermal isitma isleminin kullanilmasina ek olarak, LAMP, örnegin PCR tarafindan kullanilan daha karmasik bir floresan göstergeden ziyade bir renk degisikligi gibi basit bir görsel çikti test göstergesi kullanabilir. RNA'dan hedef nükleotitleri tanimlamak amaci ile RT-PCR gibi ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) kullanilabilir ve bu nedenle viral patojenlerin varligini ya da yoklugunu tanimlamak için tanisal bir kapasitede kullanilabilir. LAMP daha basit oldugundan dolayi, daha az ekipman ve numune hazirlama ile gerçeklestirilebilir ve bu nedenle de örnegin klinikler, acil servisler gibi bakim noktasi ortamlarinda ve hatta mobil olarak kullanim için daha erisilebilir olmaktadir. Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, bir LAMP analizi kullanilarak bir hedef nükleotidin tespit edilmesinde kullanilmak üzere teknolojiye (örnegin, bilesimler, metotlar, sistemler ve düzenekler) yöneliktir. Bazi yönlerde, hedef nükleotidin ilgilenilen bir patojenin içinde bulundugu bilinebilir. Patojenin virüs oldugu durumlarda LAMP analizi bir RT-LAMP analizi olabilir. Bazi açiklanan yapilanmalarinda, bir patojen hedefinin döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) tespiti için tükürük numuneleri hazirlama metotlari saglanmaktadir. Bir yönde, bu tür metot, bir test deneginden bir miktartükürük saglanmasini ve tükürügün, patojen hedefinin tespit edilmesine izin vermek üzere yeterli olacak bir konsantrasyonu korurken, tükürügün tamponlama kapasitesini azaltan bir dereceye kadar seyreltilmesini ihtiva edebilmektedir. Bir yönden metot, orijinal bir viskoziteye kiyasla tükürügün viskozitesinin azaltilmasini ihtiva edebilmektedir. Baska bir yönden, viskozite, seyreltme, filtreleme ya da bunlarin kombinasyonlarindan bir ya da daha fazlasi ile azaltilabilir. Baska bir yönde, viskozite filtreleme kullanilarak azaltilabilir. Daha baska bir yönde, viskozite 10 mikronluk bir filtre kullanilarak azaltilabilir. Yine baska bir yönde, viskozite, orijinal bir viskoziteye kiyasla bir kati faz ortami boyunca akiciligi artiran bir dereceye kadar azaltilabilir. Yine baska bir yönde, viskozite yaklasik olarak 1,0 santipuaz (cP) ila yaklasik olarak 50 cP araligina düsürülebilir. Bir yönde, bu tür metot, tükürük numunesinin pH'ini bir test numunesi hedef araligina ayarlayan bir dereceye kadar filtrelenmesini ihtiva edebilmektedir. Baska bir yönde, test numunesi hedef araligi yaklasik olarak 7,2 ila yaklasik olarak 8,6 arasinda olabilmektedir. Baska bir yönde, su 6,0'dan daha büyük bir pH'a sahip olabilir ve büyük ölçüde kirleticilerden ari olabilir. Yine baska bir yönde, tükürük örnegi esas itibari ile tükürük ve sudan olusabilir. Yine daha baska bir yönde, tükürük sünger bazli toplama kullanilarak toplanabilir. Bir yönde, tükürük suda yaklasik olarak 121 ila yaklasik olarak 1:20 arasinda bir tükürük - su oranina seyreltilebilir. Baska bir yönde, tükürük, numuneye 600 nm'de (ODsoo) 0,2'den daha az bir optik yogunluk saglayan bir dereceye kadar suda seyreltilebilir. Daha baska bir yönde, tükürük yaklasik olarak 50 ul ila yaklasik olarak 100 pl arasinda bir hacme sahiptir. Yine baska bir yönde, tükürük numunesi yaklasik olarak 100 ul ila yaklasik olarak 1 ml arasinda degisen bir hacme sahiptir. Ek bir yönde, patojen hedefi bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojeni ihtiva edebilir. Bir yönde, patojen hedefi viral bir hedef olabilir. Baska bir yönde, viral hedef bir dsDNA virüsü, bir ssDNA virüsü, bir dsRNA virüsü, bir pozitif zincirli ssRNA virüsü, bir negatif zincirli ssRNA virüsü, bir ssRNA-RT virüsü ya da bir ds-DNA-RT virüsü ihtiva edebilir. Bazi yönlerde, LAMP tespiti ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) algilamasini ihtiva edebilir. Diger açiklama yapilanmalarinda, LAMP analizine yönelik test numunesi bilesimleri açiklanmaktadir ve sunlari içerebilmektedir: tükürügün tamponlama kapasitesini azaltan bir miktarda su ile kombinasyon halinde bir LAMP analizi vasitasi ile bir patojen hedefini tespit etmek için yeterli olan bir test deneginin tükürük miktari. Bir yönde, bilesim yaklasik olarak 1,0 cP ila yaklasik olarak 50 cP arasinda bir viskoziteye sahip olabilir. Baska bir yönde, bilesim yaklasik olarak 7,2 ila yaklasik olarak 8,6 arasinda bir pH degerine sahip olabilir. Baska bir yönde, bilesim yaklasik olarak 121 ila yaklasik olarak 1:20 arasinda bir tükürük - su oranina sahip olabilir. Yine baska bir yönde, bilesim, 600 nm'de (ODeoo) 0,2'den daha az bir optik yogunluga sahip olabilir. Baska bir yönde, su 6,0'dan daha büyük bir pH'a sahip olabilir ve büyük ölçüde kirleticilerden ari olabilir. Bir yönde, bilesim esas itibari ile tükürük ve sudan olusabilir. Yine baska bir yönde, tükürük yaklasik olarak 50 ,Lil ila yaklasik olarak 1 ,Lil arasinda degisen bir hacme sahip olabilir. Yine baska bir yönde, tükürük numunesi yaklasik olarak 100 Ml ila yaklasik olarak 1 ml arasinda degisen bir hacme sahip olabilir. Bir yönde, patojen hedefi bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojeni ihtiva edebilir. Diger bir yönde, patojen hedefi viral bir hedef olabilir. Baska bir yönde, viral hedef bir dsDNA virüsü, bir ssDNA virüsü, bir dsRNA virüsü, bir pozitif zincirli ssRNA virüsü, bir negatif zincirli ssRNA virüsü, bir ssRNA-RT virüsü ya da bir ds-DNA-RT virüsü ihtiva olabilir. Yine baska bir yönde, bilesimin tamponlama kapasitesi 5 mM'den daha az olabilir. Yine diger açiklama yapilanmalarinda, bir kati faz ortami üzerinde LAMP analizine yönelik bilesimler, bir ya da daha fazla hedef primer, bir DNA polimeraz ve bir yeniden çözündürme ajani ihtiva edebilir. Bazi yönlerde, bu tür bir bilesim, kati faz ortamini renksizlestirebilen nitelikteki pH'a duyarli olmayan ajanlardan büyük ölçüde arindirilmis (ari) olabilir. Bir yönde, bilesim bir antioksidan ihtiva edebilir. Baska bir yönde, bilesim büyük ölçüde uçucu maddelerden arindirilmis olabilir. Yine baska bir yönde, bilesim büyük ölçüde higroskopik maddelerden arindirilmis olabilir. Bir diger bir yönde, bilesim bundan baska olarak, ters transkriptaz ihtiva edebilir. Bir yönde, higroskopik maddeler, 25 °C'de yaklasik olarak %40 ila yaklasik olarak %90 bagil nem (RH) arasinda oldugu zaman agirlikça yaklasik olarak %10'dan daha fazlasini emebilir. Baska bir yönde, higroskopik maddeler gliserol, etanol, metanol, kalsiyum klorür, potasyum klorür, kalsiyum sülfat ve bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, yeniden çözündürme maddesi bir yüzey aktif madde olabilir. Baska bir yönde, yeniden çözündürme maddesi sigir serum albümini (BSA), kazein, polisorbat 20 ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir yönde, hedef primerler, bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojeni ihtiva edebilen bir patojeni hedefleyebilir. Bir yönde, patojen bir viral patojen olabilir. Baska bir yönde, viral patojen bir dsDNA virüsü, bir ssDNA virüsü, bir dsRNA virüsü, bir pozitif zincirli ssRNA virüsü, bir negatif zincirli ssRNA virüsü, bir ssRNA-RT virüsü ya da bir ds- DNA-RT virüsü ihtiva edebilir. Yine baska bir yönde, viral patojen H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 ya da SARS-CoV-Z ihtiva edebilir. Bir yönde, bilesim bundan baska olarak, renk degistirmeyen bir katki maddesi ihtiva edebilir. Renk degistirmeyen katki maddesi, bir seker, bir tampon ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da daha fazlasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, bilesim bundan baska olarak bir gösterge ihtiva edebilir. Diger açiklama yapilanmalarinda, bir kati faz ortami üzerinde LAMP analizine yönelik bir metot, burada belirtildigi gibi bir kati faz ortami ve bir bilesimin bir birlesiminin saglanmasini, bir biyolojik numunenin kati faz ortami üzerine birakilmasini ve birlesimin bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir izotermal sicakliga isitilmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da daha fazlasi olabilir. Baska bir yönde biyolojik örnek tükürüktür. Bir yönde, LAMP analizi ters transkriptaz LAMP (RT-LAMP) olabilir. Baska bir yönde, metot bundan baska olarak, bir viral patojenin tespit edilmesini ihtiva edebilir. Diger açiklama yapilanmalarinda, LAMP analizini gerçeklestirmeye yönelik bir sistem, burada belirtildigi gibi bir bilesim ve üzerine bilesimin çökeltildigi bir kati faz ortami ihtiva edebilir. Yine daha baska açiklama yapilanmalarinda, döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bilesimler, pH'a duyarli bir boya ve çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifini ihtiva edebilen pH'a bagli bir çikis sinyalini kullanabilir. Bir yönde, LAMP analizi RT- LAMP olabilir. Bir yönde, pH'a duyarli boya, fenol kirmizisi, fenolftalein, azolitmin, bromtimol mavisi, naftolftalein, kresol kirmizisi ya da bunlarin kombinasyonlarindan en az bir tanesi olabilir. Baska bir yönde, çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifi, uçucu reaktifler, pH etkilesim reaktifleri, magnezyum etkilesim reaktifleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde arindirilmis olabilir. Bir yönde, etkilesimde bulunmayan çok sayida LAMP reaktifi, magnezyum, amonyum sülfat ve amonyum karbonattan büyük ölçüde arindirilmis olabilir. Bir yönde, çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifleri, DNA polimeraz, ters transkriptaz, hedef primerler ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, bilesim bir antioksidan ihtiva edebilir. Baska bir yönde, bilesim bundan baska olarak, tasiyici RNA, tasiyici DNA, RNaz inhibitörleri, DNaz inhibitörleri, guanidin hidroklorür ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Bir yönde, bilesim bundan baska olarak bir kati faz ortami ihtiva edebilir. Bir yönde, bilesim, bir seker, bir tampon, bir bloke edici madde ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilen bir renk degistirmeyen katki maddesi ihtiva edebilir. Bir yönde seker, trehaloz, glikoz, sakaroz ya da bunlarin kombinasyonlarindan bir ya da daha fazlasini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, bloke etme maddesi sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Diger açiklama yapilanmalarinda, bir pH'a bagli çikis sinyali ile bir LAMP analizini gerçeklestirmeye yönelik metotlar saglanmakta ve bir kati faz ortami ve bir bilesimin bir birlesiminin saglanmasini, bir biyolojik numunenin kati faz ortami üzerine birakilmasini ve birlesimin bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir izotermal sicakliga isitilmasini ihtiva edebilmektedir. Bir yönde, LAMP analizi RT-LAMP olabilir. Bir yönde, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ve bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da daha fazlasi olabilir. Bir yönde, biyolojik örnek tükürük olabilir. Baska bir yönde, metot bundan baska olarak, bir viral patojenin tespit edilmesini ihtiva edebilir. Daha baska açiklama yapilanmalarinda, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik metotlar, bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk bozulmasini en aza indiren bir reaktif karisiminin saglanmasini ve LAMP reaksiyonunun gerçeklestirilmesini ihtiva edebilir. Bir yönde, metot, LAMP olmayan bir reaksiyondan proton üretiminin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, LAMP olmayan bir reaksiyondan oksidasyonun kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Diger açiklama yapilanmalarinda, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot, bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyon kaynakli renk bozulmasinin büyük ölçüde ortadan kaldirilmasini ihtiva edebilir. Diger açiklama yapilanmalarinda, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir algilama sinirini (LOD) en üst düzeye çikarmaya yönelik metotlar, bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk bozulmasinin büyük ölçüde ortadan kaldirilmasini ihtiva edebilir. Sekillerin Kisa Açiklamasi Bulusun diger özellikleri ve avantajlari, bulusun özelliklerini örnek olarak ekte yer alan sekiller ile birlikte ele alindigi zaman asagidaki ayrintili açiklama ile asikar hale gelecektir. Sekil 1, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir patojen hedefinin döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) tespiti için bir tükürük numunesi hazirlamaya yönelik bir metodu tasvir etmektedir; Sekil 2, bir örnek yapilanmaya uygun olarak LAMP analizine yönelik bir metodu tasvir etmektedir; Sekil 3, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir pH'a bagli LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmak için bir metodu tasvir etmektedir; Sekil 4, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir tükürük numunesinde döngü aracili izotermal amplifikasyonun (LAMP) elde edilebilecegini göstermektedir; Sekil 5A, örnek bir yapilanmaya uygun olarak bir sünger esasli toplama cihazini göstermektedir; Sekil SB, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir pasif salya toplama cihazini göstermektedir; Sekil 6A, bir örnek yapilanmaya uygun olarak çesitli numune konsantrasyonlari ve çesitli toplama cihazlari için tespit sinirini göstermektedir; Sekil SB, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde çesitli sablon konsantrasyonlari için RNaz inhibitörlerinin etkisini göstermektedir; Sekil SC, bir örnek yapilanmaya uygun olarak tükürük isleme tekniginin kolorimetrik LoD üzerindeki etkisini göstermektedir; Sekil 6D, örnek bir yapilanmaya uygun olarak kolorimetrik RT-LAMP yaniti üzerinde tasiyici DNA konsantrasyonunun etkisini göstermektedir; Sekil 6E, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde Guanidin HCl'nin etkisini göstermektedir; Sekil GF, örnek bir yapilanmaya uygun olarak son nokta RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde UDG'nin etkisini göstermektedir; Sekil SG, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kolorimetrik yanit üzerinde tükürük islemenin etkisini göstermektedir; Sekil 7, bir örnek yapilanmaya uygun olarak donmus tükürük örneklerinin stabilitesini gösteren bir grafiktir; Sekil 8, bir örnek yapilanmaya uygun olarak taze tükürük tespit sinirini göstermektedir; Sekil 9, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir sigir burun sürüntüsünde tespit sinirini göstermektedir; Sekil 10, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kagit üzerinde tespit sinirini göstermektedir; Sekil 11, bir örnek yapilanmaya uygun olarak fenol kirmizisi için kolorimetrik geçisi göstermektedir; Sekil 12, örnek bir yapilanmaya uygun olarak kagit bazli tahlil için kullanilan tamponu göstermektedir; Sekil 13A, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kagit LAMP dogrulamasini göstermektedir; Sekil 138, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kagit LAMP dogrulamasini göstermektedir; Sekil 14A, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir 0 dakika zaman noktasinda kagit üzerinde düsük sablon konsantrasyonlu LAMP'i göstermektedir; Sekil 148, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir 60 dakika zaman noktasinda kagit üzerinde düsük sablon konsantrasyonlu LAMP'i göstermektedir; Sekil 15, örnek bir yapilanmaya uygun olarak isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 virüsünün oldugu islenmemis tükürügün tamamini göstermektedir; Sekil 16, örnek bir yapilanmaya uygun olarak kolorimetrik ve florometrik RT-LAMP yanitlarinin bir karsilastirmasini göstermektedir; Sekil 17A, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir LAMP kolorimetrik göstergesi olarak calmagite kullanimini göstermektedir; Sekil 178, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir LAMP göstergesi olarak EBT'nin kullanimini göstermektedir; Sekil 170, bir örnek yapilanmaya göre bir kolorimetrik raportör olarak EBT'yi kullanarak kromatografi kagidi üzerinde LAMP'i göstermektedir; Sekil 17D, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir gösterge olarak EBT kullanarak çesitli kagitlar üzerinde LAMP'in kolorimetrik yanitini göstermektedir; Sekil 17E, bir örnek yapilanmaya uygun olarak bir kolorimetrik gösterge olarak EBT kullanarak biodin A amfoter kagit üzerinde LAMP tespitini göstermektedir; Sekil 17F, örnek bir yapilanmaya uygun olarak LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde kristal viyolet konsantrasyonunun etkisini göstermektedir; Sekil 17G, örnek bir yapilanmaya uygun olarak kagit üzerinde çesitli konsantrasyonlarda kristal viyolet kullanarak kolorimetrik LAMP'i göstermektedir; Sekil 17H, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP için kolorimetrik rapoitörler olarak pH göstergelerini göstermektedir; Sekil 17I, örnek bir yapilanmaya uygun olarak LAMP reaksiyonunun kolorimetrik yaniti üzerinde kresol kirmizisinin etkisini göstermektedir; Sekil 17J örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP reaksiyonu için kolorimetrik yanit üzerinde çesitli pH göstergelerinin konsantrasyonunun etkisini göstermektedir; Sekil 17K örnek bir yapilanmaya uygun olarak pH göstergeleri kullanilarak RT-LAMP ürünlerinin jel elektroforez taramalari; Sekil 17L, örnek bir yapilanmaya uygun olarak Fenol kirmizisi kullanilarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde baslangiç pH degerinin etkisi; Sekil 18, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kurutma isleminin renk stabilitesini göstermektedir; Sekil 19A, bir örnek yapilanmaya uygun olarak kurutulduktan sonra kagidin baslangiç rengi üzerindeki tek reaktantin ortadan kaldirilmasinin etkisini göstermektedir; ve Sekil 198, örnek bir yapilanmaya uygun olarak RT-LAMP kolorimetrik yaniti üzerinde trehaloz ve Tween 20'nin etkisini göstermektedir; Simdi gösterilen örnek niteligindeki yapilanmalara atifta bulunulacak ve burada bunu açiklamak üzere belirli bir dil kullanilacaktir. Bununla birlikte, bu sekilde teknolojinin kapsaminin sinirlandirilmasinin amaçlanmadigi anlasilacaktir. Bulusun Detayli Açiklamasi Bulus yapilandirmalari tarif edilmeden önce, bu açiklamanin burada açiklanan belirli yapilar, islem adimlari ya da malzemeler ile sinirli olmadigi, ancak ilgili tekniklerde siradan uzmanliga sahip olan kisiler tarafindan anlasilacagi gibi bunlarin esdegerlerine genisletildigi anlasilmalidir. Ayni zamanda, burada kullanilan terminolojinin, yalnizca belirli örnekleri ya da yapilanmalari açiklamak amaci ile kullanildigi ve sinirlayici olmasinin amaçlanmadigi da anlasilmalidir. Farkli çizimlerdeki ayni referans numaralari ayni elemani temsil etmektedir. Akis semalarinda ve islemlerde saglanan sayilar, adimlarin ve islemlerin gösterilmesinde açiklik saglamak için verilmistir ve mutlaka belirli bir sirayi ya da diziyi belirtmemektedir. Bundan baska olarak, tarif edilen özellikler, yapilar ya da karakteristikler, bir ya da daha fazla yapilanmada herhangi bir uygun sekilde birlestirilebilirler. Asagida yer alan açiklamada, çesitli bulus yapilanmalarinin tam olarak anlasilmasini saglamak için, örnegin bilesim örnekleri, dozaj formlari, islemler vb. gibi çok sayida spesifik detay saglanmaktadir. Bununla birlikte, ilgili teknikte uzmanliga sahip olan bir kisi, bu tür ayrintili yapilanmalarin burada ifade edilen genel bulus kavramlarini sinirlamadigini, ancak sadece bunlari temsil ettigini kabul edecektir. Tanimlar Burada kullanildigi sekli ile "bir" ve benzeri tekillik ifade eden gramer formlarinin, baglam açikça aksini gerektirmedigi sürece çogul atiflari da kapsadigina dikkat edilmelidir. Dolayisi ile de örnek olarak, "bir yardimci maddeye" yapilan atif, bu tür yardimci maddelerden biri ya da daha fazlasina yapilan atiflari ihtiva etmektedir ve "tasiyiciya" yapilan atif, bu tür tasiyicilardan biri ya da daha fazlasina yapilan atiflari ihtiva etmektedir. Burada kullanildigi sekli ile "formülasyon" ve "bilesim" terimleri birbirinin yerine geçecek bir sekilde kullanilir ve iki ya da daha fazla bilesigin, elementin ya da molekülün bir karisimini ifade eder. Bazi yönlerde, "formülasyon" ve "bilesim" terimleri, bir ya da daha fazla aktif maddenin bir tasiyici ya da baska yardimci maddeler ile karisimini ifade etmek için kullanilabilir. Burada kullanildigi sekli ile, "çözünür" terimi, belirli bir çözücü içinde bu maddenin çözünme kabiliyeti ile ilgili olarak bir maddenin ya da ajanin bir ölçüsü ya da özelligidir. Bilesimin belirli bir bilesenindeki bir maddenin ya da ajanin çözünürlügü, örnegin yaklasik olarak 25 °C ya da yaklasik olarak 37 °C gibi belirli bir sicaklikta gözle görünür sekilde berrak bir çözelti olusturmak üzere çözünen madde ya da ajanin miktarini ifade eder. Burada kullanildigi sekli ile, "Iipofilik" terimi, suda serbestçe çözünmeyen bilesikleri ifade eder. Bunun aksine olarak, "hidrofilik" terimi, suda çözünebilen bilesikleri ifade eder. Burada kullanildigi sekli ile bir "denek" bir hayvani ifade eder. Bir yönde hayvan bir memeli oIabiIir. Baska bir yönde, memeli bir insan olabilir. Burada kullanildigi sekli ile, burada açiklanan bir bilesimin durumuna atifta bulunmak için kullanildigi zaman "sivi olmayan", bilesimin bir yan kati ya da kati olduguna iliskin fiziksel durumu ifade eder. Burada kullanildigi sekli ile, "kati" ve "yari kati", standart sicaklik ve basinçta kendi agirligini destekleyen ve serbest bir biçimde akmamak için yeterli viskoziteye ya da yapiya sahip olan bir bilesimin fiziksel durumunu ifade eder. Yari kati malzemeler, uygulanan basinç altinda bir kabin sekline uyabilir. Burada kullanildigi sekli ile bir "kati faz ortami", "kati faz baz", "kati faz substrati", "kati faz test substrati", "kati faz test etme substrati" ve benzerleri, sivi olmayan bir ortami, cihazi, sistemi ya da çevreyi ifade eder. Bazi yönlerde, sivi olmayan ortam büyük ölçüde sividan ari (arindirilmis) olabilir ya da tamamen sividan ari olabilir. Bir örnekte, sivi olmayan ortam, gözenekli bir malzeme ya da gözenekli bir yüzeye sahip olan bir malzeme olabilir ya da ihtiva edebilir. Baska bir örnekte, sivi olmayan ortam, lifli bir malzeme ya da lifli bir yüzeye sahip olan bir malzeme ihtiva edebilir ya da olabilir. Yine baska bir örnekte, sivi olmayan ortam bir kagit olabilir. Burada kullanildigi sekli ile bir "renk degistirmeyen katki maddesi", üzerinde ya da içinde meydana gelen bir LAMP reaksiyonundan nükleotid amplifikasyonu disindaki nedenler ile kati faz ortaminin renginde, orijinal ya da baslangiç renginden farkli olan bir renge bir renk degisikligini en aza indiren ya da önleyen bir katki maddesini ifade eder. Örnek olarak, bir yapilandirmada, bu tür bir renk degisikligi, renk degistirmeyen katki maddesi mevcut olmadan meydana gelecek bir renk degisikligine kiyasla en aza indirgenebilir ya da azaltilabilir. Burada kullanildigi sekli ile "LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikligi", bir LAMP reaksiyonundan bir nükleotid amplifikasyonunun sonucu olmayan kati faz ortaminin herhangi bir renk degisikligini (örnegin, orijinal renkten baska bir renge renk degisikligi) ifade eder. Bazi örneklerde, LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikligi, asagidakilerden biri ya da birkaçindan kaynaklanan kati faz ortaminin renk degisikligini ifade edebilir: bir uçucu ajan, bir magnezyum engelleyici ajan, bir oksitleyici ajan, bir LAMP reaksiyonundan kaynaklanan amplifikasyon disindaki nedenlerden kaynaklanan bir pH degisikligi, kurutma ya da bunlarin kombinasyonlari. Burada kullanildigi sekli ile bir "uçucu madde", yüksek bir buhar basincina ya da düsük bir kaynama noktasina sahip olan bir bilesimi ihtiva eden bir maddeyi ifade eder. Bir örnekte, amonyum sülfat uçucu bir ajan olabilir, çünkü amonyak uçabilir ve geride sülfürik asit birakabilir. Bir örnekte, bir bilesim, bilesen ya da element, bilesim yaklasik olarak 30 °C'den daha yüksek bir sicaklikta bir gaz fazinda oldugu zaman yüksek bir buhar basincina sahip olabilir. Bir örnekte, bir bilesim yaklasik olarak 80 °C'den daha düsük bir sicaklikta bir gaz fazinda olustugu zaman düsük bir kaynama noktasina sahip olabilir Burada kullanildigi sekli ile, bir "pH ile etkilesen reaktif ", bir LAMP reaksiyonundan amplifikasyon disindaki nedenler ile bir reaksiyonun, sistemin ya da ortamin pH'ini etkileyebilen bir reaktiftir. Bir örnekte, amonyum iyonu, amonyum sülfattan uçabilir ve sülfat iyonu sülfürik asit olusturmak üzere reaksiyona girebilir ve LAMP reaksiyonundan amplifikasyonun yoklugunda reaksiyonun pH'ini etkileyebilir. 11 in 1! n Bu açiklamada, "içerir , ihtiva etmektedir , ihtiva eden" ve "sahip olan" ve benzerleri, ABD Patent yasasinda kendilerine atfedilen anlama sahip olabilir ve "ihtiva eder", "dahil olmak üzere" ve benzerleri anlamina gelebilir ve genel olarak açik uçlu terimler olarak yorumlanir. "Olusan" ya da bilesenleri, yapilari, adimlari ya da benzerlerini ve yani sira ABD Patent yasasina uygun olanlari ihtiva etmektedir. "Esas itibari ile -den olusan" ya da "esas itibari ile -den olusur", genel olarak ABD Patent yasasi tarafindan kendilerine atfedilen anlama sahiptir. Özellikle de bu tür terimler, bunlar ile baglantili olarak kullanilan madde(ler)in temel ve yeni özelliklerini ya da islevini önemli ölçüde etkilemeyen ek maddelerin, malzemelerin, bilesenlerin, adimlarin ya da unsurlarin dahil edilmesine izin vermek disinda, genel olarak kapali terimlerdir. Örnek olarak, bir bilesimde mevcut olan, ancak bilesimin dogasini ya da özelliklerini etkilemeyen eser elementlere, bu tür terminolojiyi takip eden bir maddeler listesinde açik bir biçimde belirtilmese bile, "esas itibari ile - den olusan" dili kapsaminda mevcut bulunuyor ise izin verilebilir. Yazili açiklamada "ihtiva eden" ya "dahil olmak üzere" gibi açik uçlu bir terim kullanildigi zaman, dogrudan destegin ayrica, "esas itibari ile -den olusan" dilinin yani sira açik bir sekilde belirtilmis gibi "-den olusan" dile de verilmesi gerektigi anlasilmaktadir. Açiklamadaki ve istemlerdeki "birinci , ikinci , uçüncü", "dördüncü" ve benzeri terimler, eger varsa, mutlaka belirli bir sirali ya da kronolojik sirayi tarif etmek için degil, benzer ögeler arasinda ayirt etmeyi saglamak için kullanilir. Bu sekilde kullanilan herhangi birterimin, burada tarif edilen yapilanmalarin, örnek olarak, burada gösterilenler ya da baska bir sekilde tarif edilenler disindaki dizilerde çalisabilir nitelikte olabilecegi sekilde uygun kosullar altinda birbiri ile degistirilebilir oldugu anlasilmalidir. Benzer bir sekilde, eger bir metot burada, bir dizi adim ihtiva edecek bir sekilde tarif edilecek olursa, burada sunulan bu tür adimlarin sirasi mutlaka bu tür adimlarin gerçeklestirilebilecegi tek sira degildir ve belirtilen adimlardan bazilari muhtemelen atlanabilir ve/veya burada tarif edilmeyen bazi diger adimlar muhtemelen metoda ilave edilebilir. Burada kullanildigi sekli ile örnegin "artirilmis , azaltilmis", "daha iyi", "daha kötü", "daha yüksek", gibi karsilastirmali terimler, çevreleyen ya da bitisik bir alanda bulunan, benzer bir sekilde konumlandirilmis, tek bir cihaz ya da bilesimde bulunan ya da birden fazla karsilastirilabilir cihaz ya da bilesimde bulunan, bir grup ya da sinifta bulunan, birden fazla grup ya da sinifta bulunan ya da teknigin bilinen durumuna kiyaslandiginda diger cihazlar, bilesenler, bilesimler ya da aktivitelerden ölçülebilir bir sekilde farkli olan bir cihazin, bilesenin, bilesimin ya da aktivitenin bir özelligini ifade eder. Burada kullanildigi sekli ile "birlestirilmis" terimi, kimyasal, mekanik, elektriksel ya da elektriksel olmayan bir sekilde dogrudan ya da dolayli olarak baglanmis olarak tanimlanir. Burada birbirine ile fiziksel temas halinde, birbirine yakin mesafede ya da birbirleri ile ayni genel bölge ya da alanda olabilir. Burada "bir yapilanmada" ya da "bir yönde" ifadesinin ortaya çikmasi, mutlaka ayni yapilanmaya ya da yöne atifta bulunmamaktadir. Burada kullanildigi sekli ile "büyük ölçüde" terimi, bir eylemin, karakteristigin, özelligin, durumun, yapinin, ögenin ya da sonucun tam ya da nerede ise tam kapsamini ya da derecesini ifade eder. Örnek olarak, "büyük ölçüde" kapali olan bir nesne, nesnenin ya tamamen kapali oldugu ya da nerede ise tamamen kapali oldugu anlamina gelir. Mutlak bütünlükten tam olarak izin verilen sapma derecesi bazi durumlarda spesifik baglama bagli olabilir. Bununla birlikte, genel olarak belirtilecek olursa, tamamlamanin yakinligi, mutlak ve toplam tamamlama elde edilmis gibi ayni genel sonuca sahip olacak bir sekilde olacaktir. "Büyük ölçüde" nin kullanimi, bir eylemin, karakteristigin, özelligin, durumun, yapinin, ögenin ya da sonucun tamamen ya da nerede ise tamamen eksikligine atifta bulunmak için olumsuz bir çagrisimda kullanildigi zaman esit derecede geçerlidir. Örnek olarak, paitiküllerden "büyük ölçüde ari olan" bir bilesim, ya tamamen partiküllerden yoksun olacak ya da nerede ise sanki partiküllerden tamamen yoksunmus gibi ayni etkinin olacagi sekilde, partiküllerden nerede ise tamamen yoksun olacaktir. Baska bir ifade ile bir bilesen ya da elementten "büyük ölçüde ari olan" bir bilesim, bunun ölçülebilir bir etkisinin söz konusu olmadigi sürece hala fiilen bu tür bir maddeyi ihtiva edebilir. Burada kullanildigi sekli ile "yaklasik olarak" terimi, belirli bir degerin son noktanin "biraz üstünde" ya da "biraz altinda" olmasini saglamak sureti ile bir sayisal aralik son noktasina esneklik saglamak için kullanilir. Aksi belirtilmedigi sürece, "yaklasik olarak" teriminin belirli bir sayiya ya da sayisal araliga uygun olarak kullanilmasinin ayni zamanda, "yaklasik olarak" terimi olmadan bu tür sayisal terimler ya da araliklar için destek sagladigi da anlasilmalidir. Örnek olarak, kolaylik ve kisalik saglamak adina, "yaklasik olarak 50 angstrom ila yaklasik olarak 80 angstrom" sayisal araliginin ayni zamanda "50 angstrom ila 80 angstrom" araligi için de destek sagladigi anlasilmalidir. Bundan baska olarak, bu tarifnamede "yaklasik olarak" terimi bununla birlikte kullanildigi zaman bile gerçek sayisal degerlere yönelik destegin saglandigi anlasilmalidir. Örnek olarak, "yaklasik olarak" 30 ifadesi sadece 30'un biraz üstünde ve biraz altinda degerler için destek saglamakla kalmayip, ayni zamanda 30'un gerçek sayisal degeri için de destek sagladigi seklinde yorumlanmalidir. Burada kullanildigi sekli ile kolaylik saglamak için çok sayida öge, yapisal eleman, bilesim elemani ve/veya malzeme ortak bir listede sunulabilir. Bununla birlikte, bu listeler, listenin her bir üyesi ayri ve benzersiz bir üye olarak ayri ayri tanimlanmis gibi yorumlanmalidir. Dolayisi ile de bu tür bir listenin hiçbir üyesi, aksine bir gösterge olmaksizin, yalnizca bunlarin ortak bir gruptaki sunulmus olmalarina dayali olarak, ayni listenin baska bir üyesinin fiili bir esdegeri olarak yorumlanmamalidir. Konsantrasyonlar, miktarlar, seviyeler ve diger sayisal veriler burada bir aralik formatinda ifade edilebilir ya da sunulabilir. Bu tür bir aralik formatinin sadece kolaylik ve kisalik saglamak için kullanildigi ve bu nedenle de sadece araligin sinirlari olarak açikça belirtilen sayisal degerleri degil, ayni zamanda sanki her bir sayisal deger ve alt aralik açikça belirtilmis gibi bu aralik içinde kapsanan tüm ayri ayri sayisal degerleri ya da alt araliklari ya da ondalik birimleri ihtiva edecek sekilde esnek bir biçimde yorumlanmasi gerektigi anlasilmalidir. Bir örnek olarak, "yaklasik olarak 1 ila yaklasik olarak 5" seklindeki bir sayisal aralik, sadece açikça belirtilen yaklasik olarak 1 ila yaklasik olarak 5 degerlerini ihtiva edecek bir sekilde degil, ayni zamanda belirtilen aralik içindeki ayri ayri degerleri ve alt araliklari da ihtiva edecek bir sekilde yorumlanmalidir. Dolayisi ile de bu sayisal araliga örnegin 2, 3 ve 4 gibi ayri ayri degerler ve örnegin 1 - 3, 2 - 4 ve 3 - 5 gibi alt araliklar ve yani sira ayri ayri olarak 1, 2, 3, 4 ve 5 dahildir. Ayni ilke, bir minimum ya da bir maksimum olarak yalnizca bir sayisal deger belirten araliklar için de geçerlidir. Bundan baska olarak, bu tür bir yorum, araligin genisligine ya da tarif edilen özelliklere bakilmaksizin uygulanmalidir. Bu tarifname boyunca "bir örnek" e yapilan atif, örnek ile baglantili olarak tarif edilen belirli bir özellik, yapi ya da karakteristigin en az bir yapilanmada yer aldigi anlamina gelmektedir. Dolayisi ile de bu tarifname boyunca çesitli yerlerde "bir örnekte" ifadelerinin bulunmasi, mutlaka hepsinin ayni yapilanmaya atif yapmasini gerektirmemektedir. Yapilanmalar Patojenler için pek çok moleküler test (örnegin, COVID-19'dan sorumlu virüs olan siddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)) laboratuvar ile sinirli olabilir ve dolayisi ile de bunlarin hasta basi ortamlarinda benimsenmelerini önleyerek sonuç elde etmek için önemli gecikme sürelerine (24 saat) sahip olabilir. SARS-CoV -2 için bir hasta basi testi gelistirmeye yönelik çesitli girisimlere ragmen, bazi sinirlamalar devam etmektedir: i) ölçeklenebilirlik (test talebi haftada milyonlar mertebesindedir, ancak bu ölçekte yeni testler üretmek zor olmaktadir), ii) numune isleme (pek çok test hala, tükürük kullanirken bir ekstraksiyon islemi kullanmaktadir) ve iii) okunabilirlik (moleküler testler genellikle floresan kullanir ve dolayisi ile de sonuçlari rapor etmek için bir floresan okuyucu kullanir). Mevcut test metotlari, kagit tabanli cihazlar ve numune olarak seyreltilmis tükürük (örnegin, suda degisikligini bildiren ters transkripsiyon döngü aracili izotermal amplifikasyon (RT-LAMP) kullanilarak bir hasta basi testi kullanilmak sureti ile asilabilir. RT-LAM P, özellikle de enfeksiyonun akut fazinda yeterli tanisal performans ile sabit bir sicaklikta yapilan bir nükleik asit amplifikasyon teknigidir. RT-LAMP sabit bir sicaklikta yapilabildiginden dolayi, pahali termal döngü ekipmani kullanilmamaktadir. Ek olarak, LAMP ürünleri için mevcut kolorimetrik raportörler floresan okuyucular kullanmamaktadir. Sonuç olarak bu test, bakim noktasi ortamlarinda kullanim için uygundur ve onu halk sagligi acil durumlarinda kullanim için uygun hale getirerek hizli gelisim ve ölçek büyütmeye uygundur. RT-LAMP, çesitli patojenleri (örnegin SARS-CoV-2) tespit etmek için, pozitif ve negatif tepkileri ayirt etmek için tasinabilir bir elektronik cihaz kullanilarak görüntü analizinin yapilabilecegi mikro akiskan kagit tabanli analitik cihazlar (pPAD'Ier) üzerinde uygulanabilir. Bir örnekte, kagit üzerinde yüksek kontrastli bir RT-LAMP reaksiyonu, çiplak göz ile görülebilen nitelikte bir renk degisikligi saglayabilir. Ek olarak, - basili alanlarin hassas bir sekilde hizalanmasina ve reaktiflerin dagitilmasina sahip olan - mum baski kullanmak yerine, numuneler arasinda çapraz karismayi önlemek için polistiren ara parçalar kullanilabilir. Polistiren ara parçalar, üretimin ölçeklendirilmesi için rulodan ruloya üretim için uygun olabilir. Nükleik asit bazli COVID-19 tani metotlari, sonuç elde etmek için ön islemeyi kullanir. Burada açiklandigi gibi SARS-CoV-2'nin kâgit üzerinde kolorimetrik tespiti, minimum ön isleme ile gerçeklestirilebilir. Cihaz, ön amplifikasyon olmadan kâgit üzerinde SARS-CoV-Z'yi tespit edebilen bir hassasiyete ve özgüllüge sahip olabilir. Çözeltide yapilan diger miktar tayinleri, üretim sirasinda kâgit bazli miktar tayinleri kadar ölçeklenebilir olmayabilir. Ek olarak, burada açiklanan tahlil, saniyeler içinde tamamlanabilen bir seyreltme islemi kullanirken, diger tahliller SARS-CoV-Z'yi tespit etmek için örnegin proteaz ile muamele, isi inaktivasyonu ve/veya RNA ekstraksiyonu gibi çesitli islemler kullanir (islemler en az 10 dakika içinde tamamlanir ve ek ekipman kullanilir). LAMP Analizi için Numune Toplama ve Özellikleri Tükürük, bir LAMP reaksiyonu baglaminda zorluga neden olabilecek çesitli fiziksel, kimyasal ve antibakteriyel özelliklere sahiptir. Örnek olarak, fiziksel bir özellikte, tükürük, bir LAMP reaksiyonu ile etkilesecek olan dis plagindaki organik asitleri seyreltebilir ve uzaklastirabilir. Kimyasal özelliklerden bazilari - pH'daki degisiklikleri en aza indiren elektrolitler ve tampon moleküller - ayrica bir LAMP reaksiyonu ile de etkilesebilir. Tükürükteki antibakteriyel ajanlar, örnegin müsinler, amilazlar, lizozim ve peroksidaz enzimi de ayrica zorluklar ortaya koymaktadir. Örnek olarak, peroksidaz enzimi bakteri hücrelerinde bunlarin apoptoz benzeri ölüme ugramalarina neden olabilecek olan serbest radikal bilesikleri olusturabilir. Bununla birlikte, bu tür bir reaksiyon ayni zamanda, bir LAMP reaksiyonunu karmasiklastirabilen kararsiz bir redoks ortami da saglayabilir. Yukarida tarif edilenler göz önünde bulundurularak, Sekil 1'deki akis semasinda da gösterildigi gibi, bir patojen hedefinin döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) tespiti için bir tükürük numunesi hazirlamaya yönelik bir metot (100) saglanmaktadir. Bir test sonucunu, örnek olarak optik olarak tespit edilen bir pH bazli renk degisikligini göstermek üzere seçilen nihai sinyal çikisina bagli olarak, numunedeki tükürügün genel numune pH'ini nötrden önemli ölçüde uzaklastirmadigindan emin olmak istenebilir. Numunedeki tükürügün tamponlama kapasitesini ya da etkisini kontrol etmek ya da baska bir sekilde sinirlamak için çesitli teknikler ve islemler uygulanabilir. Asiri bir miktarda tamponlama kapasitesi, pH bazli bir renk degisikligini tespit etmek için kullanilan pH'daki dalgalanmalari önleyebilir. Tükürügün tamponlama kapasitesini azaltmanin bir yolu seyreltmeyi ihtiva edebilir. Bir yapilanmada, bu tür bir metot, blokta (110) da gösterildigi gibi, bir test deneginden bir miktar tükürük saglanmasini (110) ve blokta (120) gösterildigi gibi, tükürügün, patojen hedefinin tespit edilmesine imkan vermek için yeterli olacak bir konsantrasyonu korurken, tükürügün tamponlama kapasitesini azaltacak bir dereceye kadar su içinde seyreltilmesini (120) ihtiva edebilmektedir. Tükürükte bulunan proteinler baska bir zorluk ortaya çikarmaktadir. Örnek olarak, asiri viskoz bir numunenin kati bazli ya da kati fazli bir ortamda test edilmesi zor olabilir. Kati bazli bir ortamda yavas bir akis hizi, reaksiyon süresini artirabilir, yayilma es dagilimin azaltabilir, sonuçlarda degiskenligi artirabilir ve sonuçlarin geçersizligini artirabilir. Örnek olarak, viskoz bir tükürük formu kati bazli bir ortama esit bir sekilde yayilmadigi zaman, renk bazli bir endikasyonun okunmasi zor olabilir. Es dagilimli yayilmadaki azalma ayrica, sonuçlarin okunmasina belirsizlik eklemek sureti ile sonuçlarin degiskenligini de artirabilir. Farkli teknisyenler sonuçlari farkli yorumlayabilir. Bazi durumlarda, belirsiz ya da eksik renk degisiklikleri nedeni ile sonuçlarin okunmasi mümkün olmayabilir. Bu nedenle de tükürügün viskozitesinin kontrol edilmesi, olusabilecek olan çesitli komplikasyonlarin önüne geçebilir. Bu nedenle de baska bir yapilanmada metot bundan baska olarak, tükürügün bir viskozitesinin orijinal bir viskoziteye kiyasla azaltilmasini ihtiva edebilir. Bir yönde tükürük, seyreltme, filtreleme, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan bir ya da daha fazlasi ile azaltilabilir. Bir yönde, tükürügün viskozitesi seyreltme kullanilarak azaltildigi zaman, tükürük suda yaklasik olarak 1:1 ila yaklasik olarak 1:20 arasinda bir tükürük - su oranina seyreltilebilir. Baska bir yönde, tükürügün tükürük - su oraninda seyreltilebilir. Bir yönde tükürük, numuneye 600 nm'de (ODsoo) yaklasik olarak 0,2'den daha az bir optik yogunluk saglayan bir dereceye kadar suda seyreltilebilir. Bir yönde, tükürük yaklasik olarak 50 pl iIa yaklasik olarak 100 ul arasinda degisen bir hacme sahip olabilir. Baska bir yönde, tükürük numunesi yaklasik olarak 100 pl ila yaklasik olarak 1 pl arasinda degisen bir hacme sahip olabilir. Bazi durumlarda, tükürük örneginin seyreltilmesi, tükürügün tamponlama kapasitesinden ve viskozitesinden kaynaklanan etkilerin etkisini azaltabilir. Tükürügün viskozitesinin etkisini azaltmanin bir baska yolu filtrelemeyi ihtiva edebilir. Baska bir yönde, viskozite, yaklasik olarak 2 mikron ile 50 mikron arasinda bir dereceye sahip olan bir filtre kullanilarak azaltilabilir. Bir 40 mikron ya da 50 mikrondan biri ya da birkaçi olabilir. Bir yönde, filtre derecesi, filtrenin belirli bir partikül boyutunun en az yaklasik olarak %98,7'sini çikarabildigi bir mutlak mikron derecesi olabilir. Tükürügün filtrelenmesi, tek basina seyreltme yerine, bir LAMP reaksiyonu iIe etkilesebilecek tükürük proteinlerini (örnegin, müsinler, amiIazIar, lizozim ve peroksidaz enzimi) de ortadan kaldirabilir. Seyreltme, filtreleme ya da her ikisinin bir kombinasyonu yolu ile viskozitenin belirli bir aralik içinde olmasi kontrol edilebilir. Yine baska bir yönde, viskozite, orijinal bir viskoziteye kiyasla bir kati faz ortami boyunca akiciIigi artiran bir dereceye kadar azaltilabilir. Bir örnekte, tükürügün bir viskozitesi, seyreltme ya da filtrelemeden önce yaklasik olarak 1 santipuaz (cP) ve yaklasik olarak 100 cP arasinda bir araliga sahip olabilir. Bir örnekte, tükürügün viskozitesi, seyreltme ya da filtrelemeden sonra yaklasik olarak 1,0 cP iIa yaklasik olarak 50 cP araligina düsürülebilir. Baska bir örnekte, tükürügün viskozitesi, seyreltme ya da filtrelemeden sonra yaklasik olarak 1,0 cP ila yaklasik olarak 10 CP araligina düsürülebilir. Tükürügün filtrelenmesi ayrica pH araligini arzu edilir bir seviyeye ayarlayabilir. Örnek olarak, bazi pH göstergeleri belirli bir pH araligi dahilinde (örnegin, 7,2 ila yaklasik olarak 8,6) bir renk degisikligi gösterebilir. Bu nedenle de tükürük, kullanilacak olan pH göstergesinin türüne bagli olarak bir test numunesi hedef araligina filtrelenebilir. Bununla birlikte, test numunesi hedef araligini fizyolojik kosullar içinde tutmak, LAMP reaksiyonu sonuçlarinin es dagilimliligini artirabilir. Bir yönde tükürük, tükürük numunesinin pH'ini bir test numunesi hedef araligina ayarlayan bir dereceye kadar filtrelenebilmektedir. Bir örnekte, test numunesi hedef araligi yaklasik olarak 7,2 ila yaklasik olarak 8,6 arasinda bir pH araligi ihtiva edebilir. Baska bir örnekte, test numunesi hedef araligi yaklasik olarak 7,6 ila yaklasik olarak 8,2 arasinda bir pH araligi ihtiva Test numunesi hedef araliginin arzu edilen bir seviyeye ayarlanmasi, bir LAMP reaksiyonunda bir pH degisikligini (ya da diger kolorimetrik göstergeyi) tespit etmek için yeterli olmayabilir. Baska bir örnekte tükürük, bir pH göstergesinin tespit edilmesine izin vermek üzere su ile seyreltmeden önceki tamponlama kapasitesine göre bilesimin tamponlama kapasitesinin azaltildigi bir dereceye kadar su ile seyreltilebilir. Bir örnekte, tamponlama kapasitesi, bir çözeltinin (örnegin, tükürük, su ya da su ile seyreltilmis tükürük) asitler ya da bazlar ilave edildigi zaman pH'daki degisikliklere direnme yetenegi olarak tanimlanabilir. Bir örnekte, tamponlama kapasitesi, pH'i bir birim degistirmek üzere çözeltinin 1 Iitresine ilave edilecek olan güçlü asit ya da güçlü baz miktari, gram esdegerleri olarak tanimlanabilir. Bir yönde, tükürügün tamponlama kapasitesi, su ile seyreltilmeden önce 0,03 mg/ml ila yaklasik olarak 0,30 mg/ml arasinda olabilir ve su ile seyreltilmis tükürügün tamponlama kapasitesi, su ile seyreltildikten sonra yaklasik olarak 0,003 mg/ml ila yaklasik olarak 0,03 mg/ml arasinda olabilir. Baska bir örnekte, su ile seyreltilmis tükürügün tamponlama kapasitesi yaklasik olarak 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM ya da 1 mM'den daha az olabilir. Numuneyi seyreltmek için kullanilan su, LAMP reaksiyonu ile etkilesebilecek olan herhangi bir kirletici ya da özellik içermemelidir. Örnek olarak, çok asidik olan bir pH, eger pH, pH tabanli bir gösterge degisikligini engelliyor ise LAMP reaksiyonunun algilanmasini önleyebilir. Bir yönde tükürük su içinde seyreltilebilmekte olup, burada su yaklasik olarak 6,0'dan daha büyük bir pH'a sahip olabilir. Baska bir yönde su yaklasik olarak 8,0'den daha düsük bir pH'a sahip olabilir. Bir örnekte su, örnegin RNaz ve DNaz gibi, kirleticilerden büyük ölçüde arindirilmis (ari) olan moleküler dereceli su olabilir. RNaz, tespit edilecek olan tükürükteki RNA'yi bozabilir ve DNaz, LAMP reaksiyonu sirasinda olusan DNA'yi bozabilir. Diger bir örnekte, tükürük örnegi esas itibari ile tükürük ve sudan olusabilir. Istenmeyen tükürük proteinlerinin varligini en aza indirmek, spesifik bir tükürük toplama metodu kullanilarak gerçeklestirilebilir. Bir yönde tükürük, sünger bazli bir toplama metodu ya da pasif bir salya toplama metodundan biri ya da daha fazlasi kullanilarak toplanabilmektedir. Sünger bazli bir toplama metodu kullanilarak tükürügün toplanmasi, kati bazli bir ortamda kullanildigi zaman, tükürügün viskozitesini azaltabilen ve tükürügün hizliligini, homojenligini ve güvenilirligini artirabilen, bunlar sünger tarafindan emilmeyeceginden, müsinlerin ve yüksek moleküler agirlikli proteinlerin dogal olarak tükürükten filtrelenmesi avantajini saglayabilir. Tükürük bir salya akitma metodu kullanilarak toplandigi zaman, filtrelenmemis tükürük daha büyük bir viskoziteye ve bu nedenle de daha az emilime ve kati bazli bir ortam üzerinde dagilima sahip olabilir. Sonuç olarak, bazi yapilanmalarda tükürük salya yolu ile toplandigi zaman, müsinleri ve diger kalintilari gidermek ve viskozitesini azaltmak için müteakiben filtrelenebilir. Tükürükten seçili bir patojen hedefi tespit edilebilir. Bir yönde, patojen hedefi bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni, bir protozoa patojeni, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan bir ya da birden fazlasi olabilir. Tükürükteki patojen hedefi, patojen hedefinden gelen nükleik asit bir hücre duvarindan, bir hücre zarindan, bir protein tabakasindan ya da benzerlerinden salinabildigi zaman tespit edilebilir. Daha spesifik olarak bir yönde, patojen hedefi viral bir hedef olabilir. Bazi yönlerde, viral hedef siddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS- CoV-2), Orta Dogu solunum sendromu (MERS), grip, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari olabilir. Viral hedef, bir dizi farkli viral türden seçilebilir. Bir örnekte viral hedef insan koronavirüsü 229E, insan koronavirüsü OC43, insan koronavirüsü HKU1, insan koronavirüsü NL63, MERS- koronavirüsü, insan respirovirüsü 1, insan rubulavirüsü 2, insan respirovirüsü 3, insan rubulavirüsü 4, insan enterovirüsü, insan solunum virüsü, rinovirüs A, rinovirüs B, rinovirüs C ya da bunlarin kombinasyonlari olabilir. Viral hedef ayrica bir influenza formu da olabilir. Bir yönde, grip, Influenza A, Influenza B, Influenza C ya da Influenza D'den herhangi biri olabilir. Bir yönde, viral hedef, Nidovirale düzeninden seçilen bir virüs olabilir. Bir yönde, viral hedef, Nidovirale düzeninin alfa, beta, gama ya da delta Cinslerinden seçilebilir. Tespit edilebilecek çesitli virüs aileleri vardir. Bir yönde viral hedef, asagidakileri ihtiva eden aile grubu arasindan seçilen bir DNA virüsü olabilir: Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Anelloviridae, PIeo/ipoviridae, benzerleri ve bunlarin kombinasyonlari. Diger bir yönde viral hedef, asagidakileri ihtiva eden aile grubu arasindan seçilen bir RNA virüsü olabilir: Reoviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Arenaviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Coronaviridae, Astroviridae, Bornaviridae, benzerleri ve bunlarin kombinasyonlari. Diger bir yönde viral hedef, asagidakileri ihtiva eden aile grubu arasindan seçilen bir ters transkripsiyon virüsü olabilir: Retroviridae, Caulimoviridae, Hepadnaviridae, benzerleri ve bunlarin kombinasyonlari. Daha genel olarak, viral hedef Baltimore siniflandirmasina göre kategorize edilmis bir virüs olabilir. Bir yönde, viral hedef bir RNA virüsü (örnegin, influenza A, Zika, Hepatit C) olabilir. Bir yönde viral hedef bir DNA virüsü (örnegin, Epstein Barr, Çiçek hastaligi) olabilir. Bir yönde viral hedef pozitif duyulu bir RNA virüsü (örnegin, HepatitA, kizamikçik) olabilir. Bir yönde viral hedef negatifduyulu bir RNA virüsü (örnegin, Ebola, kizamik, kabakulak) olabilir. Baska bir yönde, viral hedef bir dsDNA virüsü (örnegin, suçiçegi, herpes), bir ssDNA virüsü, bir dsRNA virüsü (örnegin, bir rotavirüs), bir pozitif zincirli ssRNA virüsü, bir negatif zincirli ssRNAvirüsü, bir ssRNA-RT virüsü (örnegin, retrovirüsler) ya da bir ds-DNA-RT virüsü (örnegin, Hepatit B) olabilir. Viral hedeflerin yani sira, diger bir yönde, patojen hedefi bakteriyel bir hedef olabilir. Bazi örneklerde, bakteriyel hedef asagidakileri ihtiva eden bir cinsten seçilebilir: Bacillus, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Bruce/la, Campy/obacter, Chlamydia, Chlamydophi/a, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francise/Ia, Haemophilus, Helicobacter, LegioneI/a, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Sa/monella, ShigeI/a, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Ureaplasma, Vibrio, Yersinia, benzerleri ve bunlarin kombinasyonlari. Diger bir örnekte, bakteriyel hedef asagidakileri ihtiva eden bir cinsten seçilebilir: Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bordete//a pertussis, B. abortus, B. can/s, B. melitensis, B. suis, Corynebacterium diphtheriae, E. coli, Enterotoxigenic E. coli, Enteropathogenic E. coli, Enteroinvasive E. coli, Haemophilus influenzae, He/icobacter pylori, KIebsie/Ia pneumoniae, Legione/Ia pneumophi/a, M. tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, N. meningitidis, S. typhi, S. sonnei, S. dysenteriae, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Vibrio cho/erae, Yersinia pestis, benzerleri ve bunlarin kombinasyonlari. Diger bir yönde, patojen hedef asagidakileri ihtiva eden cinslerden seçilebilir: Klamidya pnömonisi, Pneumocystis jirovecii, Candida a/bicans, Pseudomonas aeruginosa, Stafi/okok epidermidis, Streptokok sa/ivarius, benzerleri ve bunlarin kombinasyonlari. Patojen hedefi ayrica çesitli mantar türlerini de ihtiva edebilir. Bir yönde, patojen hedefi bir mantar hedef olabilir. Bazi örneklerde, mantar hedefi asagidakileri ihtiva eden bir cinsten seçilebilir: Aspergi/Ius, Histop/azma, Pneumocystis, Stachybotrys, benzerleri ve bunlarin kombinasyonlari. Diger bir yönde, patojen hedefi bir protist hedef olabilir. Bazi örneklerde, protist hedef asagidakileri ihtiva eden bir cinsten seçilebilir: plazmodyum, tripanozomlar, benzerleri ve bunlarin kombinasyonlari. Tükürükteki patojen hedefi RNAihtiva ettigi zaman, RNA ters kopyalanabilir. Bu nedenle de baska bir yönde, LAMP tespiti ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) olabilir. Bu örnekte, cDNA, bir ters transkriptaz enzimi ile bir hedef RNA'dan üretilebilir. cDNA, tespit edilebilir bir miktara yükseltilebilir. Patojen hedefi dogrudan DNA'dan tespit edilebildigi zaman, bu durmda LAMP, RNA'yi DNA'ya ters transkripsiyon olmadan DNA'yi tespit edilebilir bir miktara yükseltmek için kullanilabilir. Baska bir yönde, tespit edilecek olan spesifik hedef nükleotit sekanslari, insan biyobelirteçlerine karsilik gelen hedef nükleotitler olabilir. Bir hastalik için bir insan biyobelirteçine karsilik gelen bir hedef nükleotite sahip olan herhangi bir hastalik tespit edilebilir. Meme kanseri, pankreas kanseri, kolorektal kanser, yumurtalik kanseri, gastrointestinal kanser, rahim agzi kanseri, akciger kanseri, mesane kanseri, pek çok karsinom türü, tükürük bezi kanseri, böbrek kanseri, karaciger kanseri, lenfoma, lösemi, melanom, prostat kanseri, tiroid kanseri, mide kanseri, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birden fazlasi dahil olmak üzere çesitli türdeki hastaliklar tespit edilebilir. Örnek olarak, çesitli hastalik türleri için biyobelirteçler, asagidakilerden biri ya da birden fazlasina karsilik gelen hedef nükleotitlerin tespit edilmesi sureti ile belirlenebilir: alfa fetoprotein, membran antijeni, faktör VIII, CD31 FL1, glial fibriler asidik protein, gross kistik hastalik sivi proteini, hPG80, HMB-45, insan koryonik gonadotropini, immünoglobulin, inhibin, keratin, Ienfosit belirteci, MART-1, Myo D1, kas spesifik aktin, nörofilament, nörona özgü enolaz, plasental alkalin fosfataz, prostat spesifik antijen, PTPRC, 8100 proteini, düz kas hareketi, sinaptofizin, timidin kinaz, tiroglobulin, tiroid transkripsiyon faktörü-1, tümör M2-PK, vimentin, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari. Diger bir yapilanmada, döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizi için bir test numunesi bilesimi, tükürügün tamponlama kapasitesini azaltan bir miktarda su ile kombinasyon halinde bir LAMP analizi vasitasi ile bir patojen hedefini tespit etmek için yeterli olan birtest deneginin tükürük miktarini ihtiva edebilir. Bir yönde, bilesimin viskozitesi yaklasik olarak 1,0 CP ila yaklasik olarak 50 cP arasinda olabilir. Baska bir yönde, bilesimin pH'i yaklasik olarak 7,2 ila yaklasik olarak 8,6 arasinda olabilir. Bu ilgili araliklar içinde bir viskozite ve pH seçmek, pH'taki degisikligi ve dolayisi ile de pH bazli bir göstergeden kaynaklanan renk degisikligini artirabilir. Tükürük, viskoziteyi ve pH'i yukarida belirtilmis olan araliklar içine yerlestirmek için su ile seyreltilebilir. Bir yönde, tükürük, yaklasik olarak 1:1 ila yaklasik olarak 1:20 arasindaki birtükürük - su oraninda su miktari ile birlestirilebilir. Baska bir yönde, tükürük - su orani yaklasik olarak 1:1, numuneye 600 nm'de (ODsoo) 0,2'den daha az bir optik yogunluk saglayan bir dereceye kadar bir su miktari ile birlestirilebilir. Tükürük miktarinin tespit edilebilir miktarda virüs ihtiva etmesini temin etmek için, toplanan tükürük miktari bir esik miktarindan daha yüksek olabilir. Bir yönde, tükürük yaklasik olarak 50 pl ila yaklasik olarak 100 pl arasinda degisen bir hacme sahip olabilir. Baska bir yönde, tükürük numunesi yaklasik olarak 100 pl ila yaklasik olarak 1 ml arasinda degisen bir hacme sahip olabilir. Tükürük ayrica LAMP reaksiyonunu kolaylastirabilecek olan çesitli kimyasal özelliklere (örnegin, pH ve tamponlama kapasitesi) sahip olabilir. Bir yönde, su yaklasik olarak 6,0'dan daha büyük bir pH'a sahip olabilir ve örnegin RNaz ve DNaz gibi kirleticilerden büyük ölçüde ari olabilir. Baska bir yönde, su yaklasik olarak 8,0'den daha az bir pH'a sahip olabilir ve büyük ölçüde kirleticilerden arindirilmis olabilir. Diger bir yönde, bilesim esas itibari ile tükürük ve sudan olusabilir. Bir yönde, bilesimin tamponlama kapasitesi yaklasik olarak 0,003 mg/ml ila yaklasik olarak 0,03 mg/ml arasinda olabilir. Baska bir örnekte, bilesimin tamponlama kapasitesi yaklasik olarak 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM ya da 1 mM'den daha az olabilir. Daha önce açiklandigi gibi, patojen hedefi bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojeni ihtiva edebilir. Patojen hedefi bir viral hedef olabilir. Baltimore virüs siniflandirmasina göre, baska bir yönde, viral hedef bir dsDNA virüsü, bir ssDNA virüsü, bir dsRNA virüsü, bir pozitif zincirli ssRNA virüsü, bir negatif zincirli ssRNA virüsü, bir ssRNA-RT virüsü ya da bir ds-DNA-RT virüsü ihtiva edebilir. Yine baska bir yönde, viral hedef H1N1, H2N2, H3N2, H1N1pdm09 ya da SARS-CoV-Z ihtiva edebilir. Reaktif Bilesimleri Test ortamina, okuma tipine ve tasarlanan sistemin genel ortamina bagli olarak bir LAMP analizinde çesitli reaktifler kullanilabilir. Bundan baska olarak, örnegin primerler ve enzimler gibi reaksiyon bilesenleri, tespit edilecek olan spesifik hedef nükleotit sekanslari, tanimlanacak olan organizmalar vb. göz önünde bulundurularak seçilebilir. Ek olarak, örnegin sivi ortami, susuz ortam, muhafaza, substratlar vb. gibi test ortaminin özelliklerinin ve yani sira, örnegin LAMP analizinin altinda yatan reaksiyona dahil olacak belirli reaktifleri seçerken örnegin stabilitede depolama gibi diger ihtiyaçlar da dikkate alinabilir. Bir yapilanmada, bir kati faz ortami üzerinde döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesim, bir ya da daha fazla hedef primer, bir DNA polimeraz ve bir yeniden çözündürme ajani ihtiva edebilir. Bir yönde, bilesim, kati faz ortamini renksizlestirebilen nitelikteki PH'ye duyarli olmayan ajanlardan büyük ölçüde arindirilmis olabilir. Bir kati faz ortami üzerinde LAMP analizi yapildigi zaman, reaktiflerin konsantrasyonu, bir sivi faz ortamindaki bir LAMP analizine kiyasla artirilabilir. Bir yönde, kati faz ortami üzerinde kullanildigi zaman DNA polimeraz konsantrasyonu, bir sivi ortam ile kullanildigi zaman DNA polimeraz konsantrasyonunun en az iki kati olabilir. Baska bir yönde, kati faz ortami üzerinde kullanildigi zaman DNA polimeraz konsantrasyonu, bir sivi ortam ile kullanildigi zaman DNA polimeraz konsantrasyonunun en az üç kati olabilir. Bir örnekte, DNA polimeraz konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 300 U/mL ila yaklasik olarak 1000 U/mL arasinda olabilir. Baska bir örnekte, DNA polimeraz konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 600 U/mL ila yaklasik olarak 1000 U/mL arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, DNA polimeraz konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 620 U/mL ila yaklasik olarak 680 U/mL arasinda olabilir. LAMP analizi ters transkriptaz LAMP (RT-LAMP) ihtiva ettigi zaman, bilesim bundan baska olarak ters transkriptaz içerebilir. Ters transkriptaz, RNA tabanli virüslerin tespitine yardimci olabilir. Bir yönde, kati faz ortami üzerinde kullanildigi zaman ters transkriptaz konsantrasyonu, bir sivi ortam ile kullanildigi zaman ters transkriptaz konsantrasyonunun en az iki kati olabilir. Baska bir yönde, ters transkriptaz konsantrasyonu, bir sivi ortam ile kullanildigi zamanki ters transkriptaz konsantrasyonunun en az üç kati olabilmektedir. Bir örnekte, ters transkriptaz konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 200 U/mL ila yaklasik olarak 600 U/mL arasinda olabilir. Baska bir örnekte, ters transkriptaz konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 250 U/mL ila yaklasik olarak 500 U/mL arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, ters transkriptaz konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 290 U/mL ila yaklasik olarak 310 U/mL arasinda olabilir. Hedef primerler, DNA polimeraz ve ters transkriptazin yani sira, bilesim bir yeniden çözündürme ajani ihtiva edebilir. Bir yeniden çözündürme ajani, bir tükürük numunesi kati bazli ortam üzerine birakildigi zaman, LAMP reaktiflerinin kati bazli ortam üzerinde yeniden sulandirilmasina yardimci olabilir. Bir yönde, yeniden çözündürme maddesi bir yüzey aktif madde olabilir. Örnek olarak yeniden çözündürme maddesi sigir serum albümini (BSA), kazein, polisorbat 20, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. BSA ve kazein, kurutulmus reaktifler yeniden sulandirildigi zaman DNA polimeraz, ters transkriptaz ve diger ilgili enzimlerin yeniden çözünmesini kolaylastirabilir. Polisorbat 20, ayni zamanda kurutulmus reaktiflerin yeniden çözünmesine de yardimci olabilen bir yüzey aktif maddedir. Bir örnekte, yeniden çözündürme maddesinin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman agirlikça yaklasik olarak maddesinin konsantrasyonu agirlikça yaklasik olarak %0,5 ila agirlikça yaklasik olarak %3 arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, yeniden çözündürme maddesinin konsantrasyonu, agirlikça yaklasik olarak %0,5 ila agirlikça yaklasik olarak %1,5 arasinda olabilir. Bilesim bundan baska olarak, reaksiyonu hizlandirabilen, hassasiyeti artirabilen bir madde ya da bunlarin bir kombinasyonunu ihtiva edebilir. Bir örnekte, reaksiyonu hizlandirmak ve hassasiyeti artirmak için BSA dahil edilebilir. Bununla birlikte, BSA'nin dahil edilmesi ayni zamanda, sonuçlarin okunabilirlik ile etkilesebilecek pH varyasyonlarini da ortaya çikarabilir. Bu nedenle de bazi örneklerde, yeniden çözündürme maddesi kazein, polisorbat 20, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Uçucu maddeler LAMP reaksiyonunu ile etkilesebilir. Örnek olarak, uçucu bir bilesik çok sayida iyona iyonize olabilir ve iyonlardan bir tanesi düsük bir kaynama noktasina sahip olabilir. Düsük kaynama noktasina sahip olan iyon buharlastigi zaman, geriye kalan iyon daha fazla reaksiyona girebilir. Diger reaksiyonlardan bazilari redoks reaksiyonlarini, asit- baz reaksiyonlarini ya da pH bazli bir sinyalin yorumlanmasini etkileyebilecek diger reaksiyonlari ihtiva edebilir. Bir yönde, bilesim büyük ölçüde uçucu maddelerden ari olabilir. Bir örnekte, uçucu maddelerin uzaklastirilmasi, uçucu maddeler dahil oldugu zamanki renk kontrasti ve reaksiyon süresi ile karsilastirildigi zaman kati bazli ortamin renk kontrastini artirabilir ve reaksiyon süresini azaltabilir. Bir yönde, bilesim, agirlikça %1,0, agirlikça %0,5, agirlikça %0,1 ya da agirlikça %0,01 uçucu maddelerden bir ya da birkaçindan daha azini ihtiva edebilir. Uçucu maddeler kati bazli ortamda kararsizliga neden olabilir. Bazi örneklerde, örnegin amonyum sülfat gibi uçucu bir bilesik ihtiva eden bir LAMP reaksiyonu, amonyum iyonlari amonyum sülfati, uçucu hale getirebilen ve sülfati geride birakabilen amonyuma kismen dönüstürdügü zaman kati bazli ortamda kararsizliga neden olabilir. Sülfat sülfürik asit haline gelebilir ve pH tabanli göstergenin okunmasini etkileyebilecek sekilde pH'i düsürebilir (örnegin, LAMP reaksiyonu meydana gelmedigi zaman bile fenol kirmizisi göstergesini kirmizidan sariya çevirerek). Amonyum sülfatin, betain ile degistirilmesi, LAMP olmayan reaksiyon bazli renk bozulmasini önleyebilir ve depolama altinda renk bozulmasini önleyerek kati bazli ortami stabilize edebilir. Bu nedenle, bilesim içinde uçucu maddelerin varliginin azaltilmasi, LAMP reaksiyonu ile etkilesim derecesini ve onun pH tabanli gösterge araciligi ile okunmasini azaltabilir. Bir yönde, LAMP bilesimi, düsük moleküler agirlikli nötr yüke sahip olan bir dörtlü amonyum ya da düsük moleküler agirlikli nötr yüke sahip olan bir amid bilesigini, benzerlerini ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva eden uçucu olmayan bir madde ihtiva edebilir. Bir örnekte, uçucu olmayan maddeler arasinda, bunlar ile sinirli olmamak üzere, N-Formilüre, Üre, L- Asparajin, TrimetiIglisin (Betain), 3-(Sikloheksilamino)-1-propansülfonik asit (CAPS), 3-(1-Piridinio)-1-propansülfonat (N BSB-201 ), N-Metilüre, Asetamid, Propiyonamid, Izobütiramid, Pirasetam, 1,3-Dimetilüre, 1,1-Dimetilüre, Glikolamid, 2-Kloroasetamid, Süksinimid, 2-Imidazolidon, Kolin klorür, Asetilkolin klorür, Betanekol klorür, L-Karnitin iç tuzu, O-Asetil-L-karnitin hidroklorür, 4-(Sikloheksilamino)-1- bütansülfonik asit (CABS), Dimetiletilamonyumpropan sülfonat (NDSB-195), 3-(1- Metilpiperidinyum)-1-propan sülfonat (NDSB-221), 3-(Benzildimetilamonyo)propansülfonat (NDSB-, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari yer alabilir. Bir örnekte, düsük moleküler agirlikli nötr yüke sahip olan bir dörtlü amonyum ya da düsük moleküler agirlikli nötr yüke sahip olan amid bilesigini ihtiva eden uçucu olmayan maddeninin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 1 mM ila yaklasik olarak 200 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, uçucu olmayan maddenin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 10 mM ila yaklasik olarak 50 mM arasinda olabilir. Yine baska bir örnekte, uçucu olmayan maddenin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 15 mM ila yaklasik olarak 25 mM arasinda olabilir. Uçucu maddelere ek olarak, higroskopik ajanlar LAMP reaksiyonu ile etkilesebilir. Higroskopik bir ajan, asiri miktarda su tutabilir ve kurumayi yavaslatmak ya da önlemek sureti ile kati bazli ortamdaki reaktifleri destabilize edebilir. Bir yönde, bilesim büyük ölçüde higroskopik maddelerden ari olabilir. Bazi örneklerde, örnegin gliserol gibi bir higroskopik madde ihtiva eden bir LAMP reaksiyonu, kati bazli ortamdaki reaktiflerin kararsizligina katkida bulunabilir, çünkü higroskopik madde çekimi suyu çekebilir. Bir örnekte, bir higroskopik maddeler, 25 C'de yakla sik olarak %40 ila yaklasik olarak %90 bagil nem (RH) arasinda oldugu zaman agirlikça yaklasik olarak %10'dan daha fazlasini emebilir. Bir örnekte, bir higroskopik madde, bunun ile sinirli olmamak üzere, gliserol, etanol, metanol, kalsiyum klorür, potasyum klorür, kalsiyum sülfat, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birkaçini ihtiva edebilir. Bir yönde, bilesim, agirlikça %1,0, agirlikça %0,5, agirlikça %0,1 ya da agirlikça %0,01 higroskopik maddeden bir ya da birkaçindan daha azini ihtiva edebilir. Önceki LAMP reaksiyonlari, primer dimerizasyon, spesifik olmayan amplifikasyon ya da bunlarin bir kombinasyonunun bulasma kirliligini önlemek için bazi ek maddeler dahil edilebilir. Bulasma kirliligi, LAMP reaksiyonuna deoksiüridin trifosfat (dUTP), urasil DNA glikozilaz (UDG) ya da bunlarin bir kombinasyonunu dahil etmek sureti ile önlenebilir. Bu maddeler, urasil ihtiva eden tek zincirli ya da çift zincirli DNA'dan serbest urasil salinimini katalize edebilir. Örnegin fenol kirmizisi gibi antioksidan bir etkiye sahip olan bazi pH bazli indikatörlerin, azalmis bir antioksidan aktiviteye sahip olan diger pH bazli indikatörlere kiyasla daha fazla kontrast ve es dagilimliliga sahip olabilecegi bulunmustur. Bir yönde, bilesim ayrica bir antioksidan ihtiva edebilir. Bir örnekte, antioksidan konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,1 mM ila yaklasik olarak 1 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, antioksidan konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,2 mM ila yaklasik olarak 0,8 mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, antioksidan konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,2 mM ila yaklasik olarak 0,3 mM arasinda olabilir. Antioksidan, oksidasyon - indirgeme reaksiyonlarini önlemek sureti ile kati bazli ortamdaki reaktifleri stabilize edebilir. Asagidakiler dahil olmak üzere, ancak bunlar ile sinirli olmamak üzere çesitli antioksidanlar kullanilabilir: N-asetil-sistein, hidroksitirosol (HXT), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz, Vitamin A, Vitamin C, Vitamin E, koenzim Q10, manganez, iyodür, melatonin, alfa-karoten, astaksantin, beta-karoten, kantaksantin, kriptoksantin, lutein, likopen, zeaksantin, apigenin, Iuteolin, tangeritin, isorhamnetin, kaempferol, mirisetin, proantosiyanidinler, kersetin, eriodiktiol, hesperetin, naringenin, katesin, gallokatesin, epikatesin, epigallokatesin, theaflavin, thearubigins, daidzein, genistein, glisitin, resveratrol, pterostilben, siyanidin, delfinidin, malvidin, pelargonidin, peonidin, petunidin, sikorik asit, kolorojenik asit, sinamik asit, ellagik asit, ellagitanninler, gallik asit, gallotanninler, rosmarinik asit, salisilik asit, kurkumin, flavonolignanlar, ksantonlar, öjenol, kapsaisin, bilirubin, sitrik asit, oksalik asit, fitik asit, R-alfa-Lipoik asit, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari. Her ne kadar simdiye kadar pH tabanli göstergeler tartisilmis olsa da, ayrica diger göstergeler de kullanilabilir. Bir yönde, bilesim bundan baska olarak bir gösterge ihtiva edebilir. Bir örnekte, gösterge, kati bazli bir ortamla kullanildigi zaman örnegin fenol kirmizisi gibi pH bazli bir gösterge olabilir. Fenol kirmizisi, diger bazi boyalarin sahip olmadigi antioksidan özelliklere sahiptir. Fenol kirmizi molekülü, ayni zamanda antioksidan özelliklere katkida da bulunabilecek olan konjuge bir bag sistemidir. Bir örnekte, göstergenin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,1 mM ila yaklasik olarak 1 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, gösterge konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,2 mM ila yaklasik olarak 0,8 mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, gösterge konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,2 mM ila yaklasik olarak 0,3 mM arasinda olabilir. Ayrica diger bazi göstergeler de yeterli bir kolorimetrik sinyal saglayabilir. Baska bir örnekte, gösterge (i) magnezyum kolorimetrik gösterge, (ii) bir pH kolorimetrik gösterge ya da (iii) bir DNA ara katmanli kolorimetrik göstergeden biri ya da birden fazlasi olabilir. Gösterge bir magnezyum kolorimetrik göstergesi oldugu zaman, magnezyumu yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 2 mM araligi içinde muhafaza etmek için magnezyum konsantrasyonu izlenmelidir. Ayrica, DNA polimeraz ile etkilesimi önlemek için magnezyum konsantrasyonu izlenmelidir. Magnezyum - DNA polimerazin bir kofaktörü, magnezyum konsantrasyonu bir hedef araligin disinda oldugu zaman DNA polimeraz ile etkilesime girebilir. LAMP reaksiyonu ayrica çesitli hedef primer türlerini de kullanabilir. Bazi hedef primerler, bir genom içinde sirasiyla 6 ya da 8 bölgeyi hedefleyebilen yaklasik olarak 4 ya da 6 primer ihtiva edebilir. Bir yönde, hedef primerlerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,05 pM ila yaklasik olarak 5uM arasinda bir konsantrasyona sahip olabilir. Baska bir örnekte, hedef primerlerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,1 mM ila yaklasik olarak 3 mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, hedef primerlerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,2 mM ila yaklasik olarak 1,6 mM arasinda olabilir. Hedef primerler, çesitli patojenlerin genomlarini hedef alacak bir sekilde seçilebilir. Bir yönde, hedef primerler, bir viral patojen, bir bakteriyel patojen, bir mantar patojeni ya da bir protozoa patojeni ihtiva edebilen bir patojeni hedefleyebilir. Diger bir yönde, patojen hedefi viral bir hedef olabilir. Baska bir yönde, viral hedef bir dsDNA virüsü, bir ssDNA virüsü, bir dsRNA virüsü, bir pozitif zincirli ssRNA virüsü, bir negatif zincirli ssRNA virüsü, bir ssRNA-RT virüsü ya da bir ds- ya da SARS-CoV-Z ihtiva edebilir. Özetlenecek olursa, hedef primerler hemen hemen her patojen hedefini, özellikle de burada açiklandigi gibi olan bu hedef patojenleri hedefleyebilir. Kati bazli ortam asiri bir miktarda uçucu madde, oksitleyici madde, pH ile etkilesen maddeler, magnezyum ile etkilesen maddeler, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva ettigi zaman, LAMP reaksiyonundan amplifikasyonun yoklugunda kati bazli ortamin rengi etkilenebilir. Bu sorunu ele almak için, baska bir yönde, bilesim, renk degistirmeyen bir katki maddesi ihtiva edebilir. Bir yönde, renk degistirmeyen katki maddesinin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 1 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesinin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 10 mM iIa yaklasik olarak 500 mM arasinda olabilir. Yine diger bir yönde, renk degistirmeyen katki maddesinin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 200 mM ila yaklasik olarak 400 mM arasinda olabilir. LAMP reaksiyon ile üretilen amplifikasyonun yoklugunda kati bazli ortamin rengini koruyabilen ve LAMP reaksiyonu ile üretilen amplifikasyon meydana geldigi zaman kontrasti potansiyel olarak artirabilen çesitli renk degistirmeyen katki maddeleri bulunmaktadir. Bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesi, bir seker, bir tampon, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da daha fazlasini ihtiva edebilir. Bir örnekte, örnegin seker gibi renk degistirmeyen bir katki maddesi, kati bazli ortami stabilize edebilir ve uzun süreli depolama kosullari altinda renk bozulmasini önleyebilir. Örnek olarak, trehaloz, dondurarak kurutma kosullari altinda ya da ortam sicakliklarinda kurutuldugu zaman enzimlerin stabilitesini koruyabilir. Bir yönde seker: glikoz, sükroz, trehaloz, dekstran, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva edebilir. Bir yönde, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 1 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 10 mM ila yaklasik olarak 500 mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 200 mM ila yaklasik olarak 400 mM arasinda olabilir. LAMP reaksiyonu ayni zamanda diger reaktifleri de ihtiva edebilir. Bir yönde, bilesim fazla bir enzim, bir nükleik asit ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden fazlasini ihtiva edebilir. Bir örnekte, enzim bir RNaz inhibitörü ya da bir DNaz inhibitörü olabilir. Bir RNaz inhibitörünün dahil edilmesi, artan birtespit sinirina izin vermek için bir RNA hedefinin bozulmasini yavaslatabilir. Bir DNaz inhibitörünün dahil edilmesi, ayrica artan bir tespit sinirina izin vermek için de bir DNA hedefinin bozulmasini yavaslatabilir. Bir yönde, bilesim tasiyici DNA ya da tasiyici RNAihtiva edebilir. Tasiyici DNAya da tasiyici RNA, sirasi ile DNaz veya RNaz aktivitesini ayiran yalanci substrat saglayabilir. Baska bir örnekte, seçili bir miktarda guanidin hidroklorür, LAMP reaksiyonunu daha da stabilize edebilen sekilde RNA moleküllerinin denatüre edilmesini ve açiga çikarilmasini uyarabilir. Bir yönde, RNaz ya da DNaz inhibitörünün konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman, tükürük örneginin mL'si basina yaklasik olarak 0,01 pL ila tükürük örneginin mL'si basina yaklasik olarak 5 pL arasinda olabilir. Baska bir örnekte, RNaz ya da DNaz inhibitörünün konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman, tükürük örneginin mL'si basina yaklasik olarak 0,1 pL ila tükürük örneginin mL'si basina yaklasik olarak 1 pL arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, RNaz ya da DNaz inhibitörünün konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman, tükürük örneginin mL'si basina yaklasik olarak 0,5 pL ila tükürük örneginin mL'si basina yaklasik olarak 1,5 uL arasinda olabilir. Bir yönde, tasiyici RNA ya da tasiyici DNA'nin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,01 ng/pL iIa yaklasik olarak 10 ng/pL arasinda olabilir. Baska bir örnekte, tasiyici RNA ya da tasiyici DNA'nin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,1 ng/pL ila yaklasik olarak 1 ng/pL arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, tasiyici RNA ya da tasiyici DNA'nin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,2 ng/uL ila yaklasik olarak 0,4 ng/uL arasinda olabilir. Yukaridakilere ek olarak, burada belirtildigi gibi bir LAMP reaksiyonunu gerçeklestirmek için uygun olan bir bilesimde bir dizi baska madde ya da bilesen kullanilabilir. Örnek olarak, baska bir yönde, bilesim bundan baska olarak, bir tonisite ajani, bir pH ayarlayici, bir koruyucu, su, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Buna ilave olarak, bu bilesenler/ ajanlar, spesifik olarak arzu edilen bir dizi özelligi bilesime kazandirmak için kullanilabilir. Bir yönde, bilesimin tonisitesi yaklasik olarak 250 ila yaklasik olarak 350 miliozmoI/Iitre (mOsm/L) olabilir. Baska bir yönde, bilesimin tonisitesi yaklasik 270 ila yaklasik olarak 330 mOsm/L arasinda olabilir. Tonisite ajanlari bilesimde çesitli miktarlarda mevcut olabilir. Bir yönde, tonisite ajani, bilesimde agirlikça yaklasik olarak %O,1, agirlikça yaklasik olarak %0,5 ya da agirlikça yaklasik olarak %1 ila agirlikça yaklasik olarak %2, agirlikça yaklasik olarak %5 ya da agirlikça yaklasik olarak %1 O'Iuk bir konsantrasyona sahip olabilir. Her ne kadar bilesim pH ile etkilesen reaktiflerden büyük ölçüde ari olsa da, bir LAMP reaksiyonundan önce bilesimin bir baslangiç pH'ini seçmek için pH ayarlayicilari kullanilabilir. Bundan baska olarak, LAMP reaksiyonundan kaynaklanan sonuçlari yorumlarken pH ayarlayicilarinin etkileri telafi edilebildigi zaman ayrica pH ayarlayicilari da kullanilabilir. pH ayarlayicilarin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda, örnegin hidroklorik asit, fosforik asit, sitrik asit, sodyum hidroksit, potasyum hidroksit, kalsiyum hidroksit ve benzerleri gibi bir dizi asit, baz ve bunlarin kombinasyonlari yer alabilir. pH ayarlayicilar, bilesim için uygun bir pH saglamak üzere kullanilabilir. Bir yönde, pH yaklasik olarak 5,5 ila yaklasik olarak 8,5 arasinda olabilir. Bir yönde, pH yaklasik olarak 5,8 ila yaklasik olarak 7,8 arasinda olabilir. Bir diger yönde, pH yaklasik olarak 6,5 ila yaklasik olarak 7,8 arasinda olabilir. Yine diger örneklerde, pH yaklasik olarak 7,0 ila yaklasik olarak 7,6 arasinda olabilir. pH ayarlayicilari bilesim içinde çesitli miktarlarda bulunabilir. Bir yönde, pH ayarlayici, bilesim içinde agirlikça yaklasik olarak %0,01, agirlikça yaklasik olarak %0,05, agirlikça yaklasik olarak %01 ya da agirlikça yaklasik olarak %0,5 ila %1 , agirlikça yaklasik olarak %2, agirlikça yaklasik olarak %5 ya da agirlikça yaklasik olarak %10 arasi bir konsantrasyona sahip olabilir. Bilesimin raf ömrü, koruyucular kullanilmak sureti ile artirilabilir. Koruyucularin sinirlayici olmayan örnekleri arasinda benzalkonyum klorür (BAK), setrimonyum, sodyum perborat, etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) ve çesitli tuz formlari, klorobütanol ve benzerleri sayilabilir. Koruyucular bilesim içinde çesitli miktarlarda mevcut olabilirler. Bir yönde, koruyucu, bilesim içinde agirlikça yaklasik olarak %0,001, agirlikça yaklasik olarak %0,005, agirlikça yaklasik olarak %0,01 ya da agirlikça yaklasik olarak %0,05 ila %O,1, agirlikça yaklasik olarak %O,25, agirlikça yaklasik olarak %0,5 ya da agirlikça yaklasik olarak %1 arasi bir konsantrasyona sahip olabilir. Baska bir yapilanmada, Sekil 2'de gösterildigi gibi, bir kati faz ortami üzerinde LAMP analizine yönelik bir metot (200), blokta (210) gösterildigi gibi, burada belirtildigi sekilde örnegin bilesenlerin ya da bilesimlerin herhangi biri gibi, bunun sonucu bir kati faz ortaminin ve bir reaksiyon bilesiminin kombinasyon halinde bir düzeneginin saglanmasini (210) ihtiva edebilir. Bir yönde, metot, blokta (220) gösterildigi gibi, bir biyolojik numunenin kati faz ortami üzerine birakilmasini (220) ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, blokta (230) gösterildigi gibi, birlesimin bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmaya yetecek bir izotermal sicakliga isitilmasini (230) ihtiva edebilir. Bir yönde, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da daha fazlasi olabilir. Diger bir yönde, biyolojik örnek tükürük olabilir. Bir yönde metot bundan baska olarak, bir viral patojenin tespit edilmesini ihtiva edebilir. Bir yönde, viral patojen burada açiklandigi gibi bir patojen olabilir. Diger bir yönde, LAMP analizi ters transkriptaz LAMP (RT-LAMP) olabilir. Baska bir yönde, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan izotermal sicaklik, yaklasik olarak 50 °C ila yaklasik olarak 70 °C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Baska bir yönde, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan izotermal sicaklik, yaklasik olarak 60 °C ila yaklasik olarak 70 °C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Baska bir yönde, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan izotermal sicaklik, yaklasik olarak 60 °C ila yaklasik olarak 65 °C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Izotermal sicaklik, DNA polimeraz, ters transkriptaz ya da bunlarin kombinasyonlarinin birinin ya da birkaçinin aktivitesine dayali olarak seçilebilir. Baska bir örnekte, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan bir sicaklik, yaklasik olarak 60 °C ila yaklasik olarak 70 °C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Baska bir örnekte, izotermal sicaklik, 5 santigrat dereceden daha az farklilik gösteren bir aralik içinde bir sicaklik olabilmektedir. Baska bir yapilanmada, bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir sistem, bu açiklamada belirtildigi gibi bir bilesim ihtiva edebilir. Baska bir yönde, sistem, üzerine bilesimin çökeltildigi bir kati faz ortami ihtiva edebilir. pH'a Duyarli Sinyal Çikisini En Üst Düzeye Çikarma Bir LAMP reaksiyonu yürütüldügü zaman, reaksiyonun sonuçlarini okumak için çesitli göstergeler kullanilabilir. Üç tip kolorimetrik gösterge arasinda, magnezyum kolorimetrik göstergeleri, pH kolorimetrik göstergeleri ve DNA ara katmanli kolorimetrik göstergeleri yer almaktadir. Magnezyum, DNA polimeraz için bir kofaktör olabileceginden ve bunun konsantrasyonunun siki bir sekilde kontrol edilmesi gerektiginden dolayi, magnezyum bazli göstergeler, bir LAMP reaksiyonu baglaminda kullanildigi zaman çesitli sinirlamalarla karsi karsiya kalabilir. DNA ara katmanli göstergeleri ayrica, oyundaki degiskenlerin sayisi nedeni ile sinirlamalarla da karsi karsiya kalabilir. Her ne kadar her üç gösterge de bir LAMP Reaksiyonunda kullanilabilse de pH tabanli göstergeler daha az degiskene tabi olabilir. Bir yapilanmada, pH'a bagli bir çikis sinyalini kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesim, pH'a duyarli bir boya ve çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifini ihtiva edebilir. Bir yönde, LAMP analizi ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) olabilir. pH'a duyarli boyanin seçimi, örnegin pH ile iliskili kolorimetrik aralik, renk degisiklikleri arasindaki kontrast derecesi, bir renk degisikligi için pH seviyesi, renk degisikliginin es dagilimliligi, renk degisikliginin tekrar edilebilirligi ve benzerleri gibi çesitli faktörlere bagli olabilir. Örnek olarak, fenol kirmizisi, yaklasik olarak 6,8 ila yaklasik olarak 7,4 pH arasinda bir kolorimetrik araliga sahip olabilir. Yaklasik olarak 6,8'Iik bir pH'in altinda, fenol kirmizisi sariya dönebilir ve yaklasik olarak 7,4'lük bir pH'in üzerinde, fenoI kirmizisi kirmiziya dönebilir. Sari ve kirmizi arasindaki fark derecesinin okunmasi basit olabilir ve pH degisimi fizyolojik kosullari taklit eden bir pH Bir yönde, pH'a duyarli boya, tutarli ve zit bir renk degisikligi (örnegin, Fenol kirmizisi) elde etmek üzere yaklasik olarak 6,5 pH'Iik bir renk degisikliginin oldugu bir pH göstergesi olabilir. Bir yönde, pH'a duyarli boya, fenol kirmizisi, turnusol, bromtimol mavisi, nitrazin sarisi, kresol kirmizisi, kurkumin, parlak sari, m-kresol moru, oi-naftolftalein, fenolftalein, nötr kirmizi, asit fusin, azolitmin, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan en az bir tanesi olabilir. Bir yönde, pH'a duyarli boyanin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,1 mM ila yaklasik olarak 1 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, pH'a duyarli boya konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,2 mM ila yaklasik olarak 0,8 mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, pH'a duyarli boya konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,2 mM ila yaklasik olarak 0,3 mM arasinda olabilir. pH'a duyarli sinyal çikisini en üst düzeye çikarmak için, LAMP reaksiyonu, LAMP reaksiyonu etkilesmek (örnegin, DNA polimeraz ile etkileserek) ya da LAMP reaksiyonundan gelen sinyal (örnegin, pH sinyali) ile etkilesmek sureti ile sinyale belirsizlik getirecek reaktiflerden büyük ölçüde ari olmalidir. Bir yönde, çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifleri, DNA polimeraz, ters transkriptaz, hedef primerler ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. Baska bir yönde, çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifi, uçucu reaktifler, pH etkilesim reaktifleri, magnezyum etkilesim reaktifleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olabilir. Bir örnekte, etkilesimde bulunmayan çok sayida LAMP reaktifi, magnezyum, amonyum sülfat ya da amonyum karbonattan büyük ölçüde ari olabilir. Magnezyum, DNA polimerazin bir kofaktörü olarak, LAMP reaksiyonunun tasarlandigi gibi ilerleyebilmesini temin etmek için siki bir sekilde izlenmelidir. Amonyum sülfat, ardinda sülfürik asit olusturmak üzere reaksiyona girebilen bir sülfat iyonu birakabilen amonyum iyonu haline iyonlasabilir. Amonyum karbonat ayrica bir amonyum iyonu haline iyonize olabilir ve ardinda karbonik asit olusturmak için reaksiyona girebilen bir karbonat birakabilir. Bu nedenle de çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifi bu maddelerden büyük ölçüde ari olmalidir. Uçucu maddeler, LAMP reaksiyonundan gelen pH'a bagli sinyal ile etkilesimde bulunabilecek bir asit ya da baz olusturmak üzere reaksiyona girebilen bir bilesimi geride birakabileceginden dolayi, uçucu maddeler en aza indirilmelidir. Bir örnekte, etkilesimde bulunmayan çok sayida LAMP reaktifi, bunlar ile sinirli olmamak üzere, amonyum sülfat ve amonyum karbonat, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari dahil olmak üzere büyük ölçüde uçucu reaktiflerden ari olabilir. Bir yönde, bilesim, agirlikça %1,0, agirlikça %0,5, agirlikça %0,1 ya da agirlikça %0,01 uçucu reaktiflerden bir ya da birkaçindan daha azini ihtiva edebilir. Ayrica, herhangi bir pH ile etkilesen reaktif, pH ile etkilesen reaktifler telafi edilmedigi zaman pH'a bagli sinyal çikisi ile etkilesime girebilir. Bir örnekte, çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifi, bunlar ile sinirli olmamak üzere bir dizi asit, baz ve bunlarin kombinasyonlari dahil olmak üzere pH ile etkilesen reaktiflerden büyük ölçüde ari olabilir. Bir yönde, bilesim, agirlikça %1,0, agirlikça %O,5, agirlikça %0,1 ya da agirlikça %0,01 pH ile etkilesen reaktiflerden bir ya da birkaçindan daha azini ihtiva edebilir. pH izlendigi zaman bile, LAMP reaksiyonu ile etkilesim oldugu zaman pH'a bagli sinyal çikisi olumsuz etkilenebilir. Örnek olarak, DNA polimerazin bir kofaktörü olarak magnezyum, konsantrasyon seçilen bir araligin disinda oldugu zaman LAMP reaksiyonundan kaynaklanan amplifikasyon ile etkilesebilir. Bir örnekte, etkilesimde bulunmayan çok sayida LAMP reaktifi, magnezyum ile etkilesime giren maddelerden büyük ölçüde ari olabilir. Magnezyum ile etkilesime giren ajanlar, bunlar ile sinirli olmamak üzere asagidakileri dahil olmak üzere magnezyum içeren ajanlari ihtiva edebilir: Mg2+, Mg", magnezyum karbonat, magnezyum klorür, magnezyum sitrat, magnezyum hidroksit, magnezyum oksit, magnezyum sülfat, magnezyum sülfat heptahidrat, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlari. Bir yönde, bilesim, agirlikça %1,0, agirlikça %O,5, agirlikça %0,1 ya da agirlikça %0,01 magnezyumdan bir ya da birkaçindan daha azini ihtiva edebilir. Baska bir örnekte, magnezyum ile etkilesime giren ajanlar, magnezyum ile etkilesime giren selatlama ajanlarini ihtiva edebilir. pH izlendigi ve LAMP reaksiyonu düzgün bir sekilde çalistigi zaman bile, kati faz ortaminin renk degisikligi uzun süreli depolama gibi diger faktörlerden kaynaklanabilir. Bir yönde, bilesim, renk degistirmeyen bir katki maddesi ihtiva edebilir. Bir örnekte, renk degistirmeyen katki maddesi, bir seker, bir tampon, bir bloke etme maddesi benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da daha fazlasini ihtiva edebilir. Bir örnekte, seker, kati bazli ortami stabilize edebilir ve uzun süreli depolama kosullari altinda renk bozulmasini önleyebilir. Bir yönde seker: glikoz, sükroz, trehaloz, dekstran, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva Bir yönde, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 0,01 mM ila yaklasik olarak 1 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 10 mM ila yaklasik olarak 500 mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, sekerin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 200 mM ila yaklasik olarak 400 mM arasinda olabilir. Bir tampon, tükürük örneginden degiskenligi gidermek sureti ile LAMP reaksiyonunun stabilizasyonunu kolaylastirabilir. Bir örnekte, bir tampon, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), Dulbecco PBS, Alsever çözeltisi, Tris tamponlu tuzlu su (TBS), HEPES, BICINE, su, örnegin Hank BSS, Earle BSS, Grey BSS, Puck BSS, Simm BSSI, Tyrode BSS, BSS Plus gibi dengeli tuz çözeltileri (BSS), Ringer Iaktat çözeltisi, normal tuzlu su (diger bir deyis ile %0,9 tuzlu su), normal tuzlu su, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden daha fazlasini ihtiva edebilir. Bir yönde, tamponun konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 10 uM ila yaklasik olarak 20 uM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, tamponun konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 100 uM ila yaklasik olarak mM arasinda olabilir. Yine diger bir örnekte, tamponun konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 100 uM ila yaklasik olarak 500 uM arasinda olabilir. Bir bloke edici ajan, RNaz bazli bozunma, DNaz bazli bozunma ya da diger enzimatik bozunma miktarini azaltabilir. Bir örnekte, bir bloke edici ajan, sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden daha fazlasini ihtiva edebilir. Bir yönde, bloke etme maddesinin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman agirlikça yaklasik olarak konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman agirlikça yaklasik olarak %0,01 ila agirlikça yaklasik olarak %1 arasinda olabilir. Yine diger bir yönde, bloke etme maddesinin konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman agirlikça yaklasik olarak %0,02 ila agirlikça yaklasik olarak %0,06 arasinda olabilir. Bir antioksidan, oksidasyon reaksiyonlari ile iliskili degiskenleri ortadan kaldirmak sureti ile kati faz ortami üzerindeki pH'a bagli sinyalin tekdüzeligini ve kontrastini artirabilir. Bir örnekte, bilesim bundan baska olarak burada açiklandigi gibi bir antioksidan ihtiva edebilir. Diger bir örnekte, bilesim bundan baska olarak bir kati faz ortami ihtiva edebilir. Kati faz ortami, bunlar ile sinirli olmamak üzere, cam elyafi, naylon, selüloz, polisülfon, polietersülfon, selüloz asetat, nitroselüloz, polyester, hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE) ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden daha fazlasini ihtiva edebilir. Belirli katki maddeleri, LAMP reaksiyonunun stabilitesini ve es dagilimliligini artirabilir. Bir yönde, bilesim, bir enzim, bir nükleik asit ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birden fazlasini ihtiva edebilir. Bir örnekte, enzim bir RNaz inhibitörü ya da bir DNaz inhibitörü olabilir. Diger bir yönde, bilesim tasiyici DNA ya da tasiyici RNA ihtiva edebilir. Tasiyici DNA ya da tasiyici RNA, sirasi ile DNaz veya RNaz aktivitesini ayiran yalanci substrat saglayabilir. Baska bir örnekte, seçili bir miktarda guanidin hidroklorür, RNA moleküllerinin denatüre edilmesini ve açiga çikarilmasini uyarabilir. Bir yönde, guanidin hidroklorürün konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 1 mM ila yaklasik olarak 200 mM arasinda olabilir. Baska bir örnekte, guanidin hidroklorürün konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 10 mM ila yaklasik olarak 100 mM arasinda olabilir. Yine diger bir yönde, guanidin hidroklorürün konsantrasyonu, kati faz ortaminda kullanildigi zaman yaklasik olarak 20 mM ila yaklasik olarak 60 mM arasinda olabilir. pH'a bagli çikis sinyalinin en üst seviyeye çikarilmasi ayrica, burada açiklanan diger yapilanmalar ile birlikte de kullanilabilir. Bir yapilanmada, pH'a bagli bir çikis sinyali ile bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir metot, burada belirtildigi gibi bir kati faz ortaminin ve bir bilesimin bir birlesiminin saglanmasini ihtiva edebilir. Metot bundan baska olarak, bir biyolojik numunenin kati faz ortami üzerine biriktirilmesini ihtiva edebilir. Metot bundan baska olarak, birlesimin bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir izotermal sicakliga isitilmasini ihtiva edebilir. Burada açiklandigi üzere, bir yönde, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati, benzerleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birden daha fazlasi olabilir. Diger bir yönde, biyolojik örnek tükürük olabilir. Bir yönde metot bundan baska olarak, bir viral patojenin tespit edilmesini ihtiva edebilir. Bir yönde, viral patojen bun u disindaki durumda burada açiklandigi gibi bir patojen olabilir. Bir örnekte, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan bir sicaklik, yaklasik olarak 60 °C ile yaklasik olarak 70 °C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Baska bir örnekte, izotermal sicaklik, 5 santigrat dereceden daha az farklilik gösteren bir aralik içinde bir sicaklik olabilmektedir. Baska bir yönde, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan izotermal sicaklik, yaklasik olarak 50 °C ila yaklasik olarak 70 °C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Baska bir yönde, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan izotermal sicaklik, yaklasik olarak 60 °C ila yaklasik olarak 70 °C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Baska bir yönde, bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak için yeterli olan izotermal sicaklik, yaklasik olarak 60 °C ila yaklasik olarak 65 °C arasindaki bir sicaklik araliginda olabilmektedir. Izotermal sicaklik, DNA polimeraz, ters transkriptaz ya da bunlarin kombinasyonlarinin birinin ya da birkaçinin aktivitesine dayali olarak seçilebilir. Diger bir yapilanmada, Sekil 3'te de tasvir edildigi gibi, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot (300), blokta (310) oldugu gibi, bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degisikligini en az düzeye indiren bir reaktif karisiminin saglanmasini (310) ihtiva edebilir. Metot bundan baska olarak, blokta (320) gösterildigi gibi LAMP reaksiyonunun gerçeklestirilmesini (320) içerebilmektedir. Bir yönde, metot, LAMP olmayan bir reaksiyondan proton üretiminin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Baska bir yönde metot, LAMP olmayan bir reaksiyondan oksidasyonun kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Diger bir yapilanmada, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot, bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyon kaynakli renk bozulmasinin büyük ölçüde ortadan kaldirilmasini ihtiva edebilir. Diger bir yapilanmada, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir tespit sinirinin (LOD) en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot, bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyon kaynakli renk bozulmasinin büyük ölçüde ortadan kaldirilmasini ihtiva edebilir. Bir yönde, renk kontrasti arttirilabilir ve numune degiskenligi, tükürügün su ile %5 - 10'a seyreltilmesi sureti ile tespit sinirini etkilemeden azaltilabilir. Baska bir örnekte, renk kontrasti aitirilabilir ve numune degiskenligi, baska bir durumda burada açiklandigi gibi tükürügün bir filtre ile filtrelenmesi sureti ile tespit sinirini etkilemeden azaltilabilir. ÖRNEKLER Asagida yer alan örnekler, mevcut bulusa ait belli bazi yapilanmalarin daha net bir sekilde anlasilmasini desteklemek üzere saglanmaktadir ve hiçbir sekilde bunun üzerinde bir sinirlama anlamina gelmemektedir. Seyre/tilmis Tükürük Örnekler/nde Viral Hedefler için Kagit LAMPAna/izi ÖRNEK 1 - DNaz / RNaz'dan Ari Damitilmis (Distile) Su DNaz / RNaz içermeyen damitik su, 0,1 um membran ile filtrasyon yolu ile hazirlanir ve DNaz ve RNaz aktivitesi için test edilir. DNaz ve RNaz aktivitesi, Enjeksiyonluk Su (WFI) için mevcut ABD Farmakopesi (USP) monograf test standartlarina uygun olarak test edilmistir. DNaz, RNaz ya da proteaz aktivitesinin olmadigi onaylandiktan sonra, suyun kirletici içermedigi ve tükürük numunelerinin hazirlanmasinda kullanim için hazir oldugu kabul edilir. ÖRNEK 2 - Tükürükte Amplifikasyon Sekil 4'te de gösterildigi gibi bir tükürük örneginden nükleotid amplifikasyonunu dogrulamak için pozitif bir kontrol olarak tükürükteki RNaseP'yi hedeflemek üzere bir nükleik asit sekans primeri tasarlanmistir. Sekil 4A, 105 genom esdegeri / isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 reaksiyonu eklenmis %18 tükürükte RNaseP POP7'yi hedefleyen primer setleri için florometrik RT-qLAMP sonuçlarini göstermektedir. Sekil 48, 0,2 ng sentetik RNaseP POP7 RNA ile su içinde RNaseP POP7'yi hedefleyen primer setleri için florometrik RT-qLAMP sonuçlarini göstermektedir. Sekil 4A'da da gösterildigi gibi, isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 reaksiyonu basina 105 genom esdegeri eklenmis %18 tükürük analiz edilmistir. Soldaki sekilde, RNaseP'nin p20 alt birimini kodlayan POP7 geni için mRNA sekansini kullanarak RNaseP'yi hedeflemek üzere tasarlanmis olan primer (RNaseP.I), RNaseP'nin düsük seviyelerini yeterince tespit etmediginden dolayi amplifikasyon meydana gelmemistir. Oitadaki sekilde, primer (RNaseP.II) sablonsuz kontrolü güçlendirmeden RNaseP seviyelerini tespit edebildiginden dolayi siyah çizgiler ile örtüsme olmadan mavi çizgilerde gösterildigi gibi, amplifikasyon meydana gelmistir. Sagdaki sekilde, primer (RNaseP.III) dimerize oldugundan (örnegin, sablon kontrolü olmayan siyah çizgilerde amplifikasyon göstermistir) dolayi hem siyah çizgiler hem de mavi çizgiler için amplifikasyon meydana gelmistir. Sekil 4B'de de gösterildigi gibi, 0,2 ng sentetik RNaseP POP7 RNA içeren su analiz edilmistir. Soldaki sekilde, primer (RNaseP.I) dimerize oldugundan (örnegin, sablon yok kontrolü güçlendirilmistir) dolayi siyah çizgilerde ve mavi çizgilerde amplifikasyon meydana gelmistir. Oitadaki sekilde, primer (RNaseP.II) sablon yok kontrolünü güçlendirmeden RNaseP seviyelerini tespit edebildiginden dolayi siyah çizgiler ile örtüsme olmadan mavi çizgilerde gösterildigi gibi, amplifikasyon meydana gelmistir. Sagdaki sekilde, primer (RNaseP.III) sablon yok kontrolünü güçlendirmeden RNaseP'yi güçlendirdigi için mavi çizgiler için amplifikasyon meydana geldi, ancak siyah çizgiler için amplifikasyon meydana gelmedi. ÖRNEK 3 - Tükürük Toplama Cihazlari Tükürük toplama cihazinin tipi, bir LAMP reaksiyonunda bir tükürük örnegini kolaylastirabilir. Bazi durumlarda, bir operatör havada tasinan damlaciklar (örnegin bir aerosol virüsü) yolu ile yayilabilen bir patojenden korunmak için koruyucu ekipman kullanabilir. Bu nedenle de operatörler aerosol virüs ile kazara temasa karsi korunmak için kisisel koruyucu ekipman giyebilirler. Spesifik tükürük toplama cihazi, bir saglik hizmeti uzmaninin rehberligi altinda denek tarafindan kendi kendine uygulanabilir. Tükürük toplama cihazi kanitlanmis bir etkinlige sahiptir ve iki kategori halinde ayrilabilir: Sekil 5A ve 5B'de de gösterildigi gibi sünger bazli toplama ve pasif salya toplama. Bir sünger toplama cihazi (500a), tükürügü emmek üzere sünger benzeri bir toplama pedi (504) kullanmaktadir ve yeterli hacmin ne zaman toplandigini belirtmek üzere bir numune hacmi yeterlilik göstergesi (512) ihtiva etmektedir. Doyurulduktan sonra, sünger bir sikistirma borusu (506) içine yerlestirilir ve tükürügü bir toplama borusu içine süzen bir filtreye dogru sikistirilir. Bu filtrasyon isleminin bir nedeni, müsinleri ve yüksek molekül agirlikli proteinleri tükürükten süzerek çikarmasi ve örneklerin viskozitesini önemli ölçüde azaltmasidir. Sonuç olarak da kati faz ortami tükürügü daha hizli, düzgün ve güvenilir bir sekilde alabilir ve dagitabilir. Sünger toplama cihazi (500a) ayrica: sikistirma borusu (506) ile bir sizdirmazlik olusturmak üzere sikistirma borusu (508) üzerinde bir sikistirma contasi (508); sikistirma borusunu (506) sikistirmak için bir sap (510); ve yeterli tükürügün ne zaman toplandigini tanimlamak üzere bir numune hacmi yeterlilik göstergesi (512) ihtiva edebilir. Bir pasif salya cihazi (500b), numunenin emilimini ve dagilimini yavaslatan viskoziteye sahip filtrelenmemis tükürük saglayabilmektedir. Pasif salya cihazi (500b): tükürük toplamak için bir toplama hunisi (522); yeterli tükürügün ne zaman toplandigini göstermek için bir gösterge çizgisi (528); tükürügü toplamak için bir toplama tüpü (524); bir tüp kapagi (526); bir hacim göstergesi (530); ve bir tüp kapagi deposu (532) ihtiva edebilir. Her iki toplama cihazi türü için, operatör bakimindan artik maruz kalma riski en aza indirilir. Sünger esasli cihazlar ile, özellikle de eger bir kullanici sikistirma isleminde bilhassa ani ise, sikistirma islemi sirasinda varsayimsal bir aerosol salimi riski söz konusu olmaktadir. Saglik hizmeti operatörü, maruz kalma riskini kontrol etmek için bu islemi gerçeklestirebilir. Toplama cihazi, aerosol geri akisini önlemek için bir sikistirma contasi ihtiva edebilir. Pasif salya toplama ile, cihazin disini kontrolsüz tükürük ile kontamine etme riski söz konusu olabilir, bu da daha sonra eger düzgün bir sekilde idare edilmez ise operatöre çapraz kontaminasyon bulastirabilir. Her iki durumda da, maruz kalma riskleri tükürük örneginin hastanin kendi kendine toplanmasi sureti ile azaltilir. Bunlarin tükürükteki RT-LAMP reaksiyonu üzerindeki etkilerini degerlendirmek için üç ticari tükürük toplama cihazi seçilmistir. Üç cihaz StatSure Diagnostic Systems, Inc. sirketi tarafindan üretilen "Saliva SamplerT'V'", Oasis Diagnostics sirketi tarafindan üretilen" Pure-SALT'V'" ve yine Oasis Diagnostics sirketi tarafindan üretilen "SuperoSALT'V'" idi. StatSure Saliva Sampler TM, bir hastadan tükürük toplamak için kullanilan bir tampon (örnegin, Tampon 2000) ihtiva eden bir tüp saglamaktadir. SüperoSAL, herhangi bir kati kirleticiyi ve müsinöz materyali uzaklastirmak sureti ile tükürük toplanmasini standartlastirmak için silindirik bir emici ped ve bir toplama tüpü kullanir. Pure-SAL benzer bir mekanizma ile çalismaktadir, ancak kirleticileri gidermek için toplama tüpünde ek bir filtre ihtiva etmektedir. Tükürük pH'i, islenmis tükürük örneklerinden ölçüldü ve daha sonra kolorimetrik ve floresan RT- LAMP LOD analizleri, islenmis tükürük örnekleri kullanilarak çalistirildi. Bu veriler Sekil 6A'da sunulmustur. Bu veriler, farkli tükürük toplama cihazlari (Pure-Sal, Super-Sal, Stat-sure) kullanilarak islenen tükürükteki LoD'yi göstermektedir. Ana karisim 0,6 mikrolitre HCI ile muamele edildi. Pure-SALT'V' ve Super-SAL tükürük toplama cihazlari, daha genis bir konsantrasyon araligi için daha genis bir kolorimetrik yanit araligi göstermektedir (isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 reaksiyonu basina 1 ila 10k genom esdegeri). ÖRNEK 4 - Tükürük Toplama Islemi Eger bir denek kendi kendini test ediyor ise, denek, saglik hizmeti uzmaninin rehberligi altinda, hiçbir katki maddesi ihtiva etmeyen ve bu nedenle de toplama için denegin kullanmasi bakimindan güvenli olan özel bir toplama kabi içine bir tükürük örnegi toplar. Toplanan tükürük hacmi yaklasik olarak 100 uL'dir. Örnek olarak sünger örnekleyici, denegin agzi içine yerlestirilir ve sünger örnekleyici üzerindeki gösterge renk degistirene kadar tükürük toplanir. Sünger örnekleyici daha sonra bir toplama tüpü içine yerlestirilir. Sünger daha sonra tükürügü seyreltmek için içinde bir miktar su ihtiva eden bir toplama tüpü içine tükürügü (yaklasik olarak sikmak üzere sikistirilir. Tükürük suda yaklasik olarak 121 ila yaklasik olarak 1:20 arasinda bir tükürük - su oranina seyreltilir. Tükürük, toplama tüpünden bir test bölgesine aktarilir. ÖRNEK 5 - Tükürük Üzerinde RNaz Inhibitör Etkisi Bir RNaz inhibitörü ilavesinin RT-LAMP reaksiyonu üzerindeki etkisini belirlemek için mL tükürük basina 1 uL bir konsantrasyonda islem görmemis tükürüge bir RNaz inhibitörü ilave edilmistir. RNAsecureT'V" ün (AM7006, InvitrogenT'V') yeni toplanmis olan tükürük (%5) üzerindeki etkisi, bakim noktasi RT-LAMP reaksiyonu için tek bir islem süreci olarak uygunlugunu belirlemek için test edilmistir. 1X RNAsecureT'V', 1 ml tükürük kullanilarak 25X stoktan seyreltilmistir. islenmis tükürük, 40 mM guanidin hidroklorür ve 7,6 pH'a sahip olan 0,3 ng/ul tasiyici DNA ile birlikte WarmstartT'V' kolorimetrik ana karisimi içine 1000 kopya ila 62,5 kopya /reaksiyon bir konsantrasyon araliginda isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-Z'yi eklemek için bir matris olarak kullanilmistir. RNAsecureT'V' ile islemden geçirilen RT-LAMP, reaksiyonu baslatmak için 65 °C'de inkübe edildi. Bu kosullar altinda taze tükürük, bir kontrol olarak RNAsecureT'V' olmadan test konsantrasyonu) içinde seyreltilmis ve 25 uL'Iik bir nihai reaksiyon hacmi için belirtilen konsantrasyonu saglamak üzere RT-LAMP reaksiyonuna ilave edilmistir. Negatif reaksiyonlar için, 25 uL'Iik ayni reaksiyon hacmini saglamak üzere seyreltilmis isi ile inaktive edilmis virüs yerine 5 uL islenmis tükürük (%5 nihai reaksiyon konsantrasyonu) ilave edilmistir. Isitma, 65 C'de 60 dakika boyunca inkübatörde gerçeklestirilmistir. Kolorimetrik taramalar, RT-LAMP reaksiyonundan önce ve sonra düz yatakli tarayici kullanilarak alinmistir. 1250 uL NEB kolorimetrik ana karisimi, 0,5 uL Antarktika Termolabil, 3,5 uL dUTP ile takviye edilmistir. 25X RNaz Inhibitörü (RNASecureT'V'), %5 tükürüge seyreltilen reaksiyona eklenmeden önce 1X konsantrasyon iIe sonuçlanmak üzere tüm tükürükte seyreltilmistir. RNAsecureT'V', Sekil GB'de de gösterildigi gibi reaksiyonun LoD'sinde önemli bir artis göstermemistir. Yani, RNaz inhibitörünün ilave edilmesi, RT-LAMP reaksiyonunun ölçülen parametrelerinde (örnegin, reaksiyon hizi, yanlis pozitif oran ya da tespit siniri) kayda deger bir artisa neden olmamistir. ÖRNEK 6 - Donmus Tükürük Örnekleri Bazi durumlarda, lojistik, nakliye ihtiyaci vb. nedeni ile bir tükürük numunesinin analizinden önce bir süre dondurulmasi istenebilmektedir. Bu tür durumlar, burada belirtildigi gibi bir LAMP analizi gerçeklestirirken özel bir dikkat gerektirebilir. Sekil 7'de de gösterildigi gibi, donmus bir tükürük numunesinin pH'i, tükürük numunesi çözülmeden ve test edilmeden önce -20 Santigrat derecede kaldigi gün sayisina bagli olarak degisebilir. Bir örnekte, Donör 1'den alinan tükürük örneginin pH'i, toplama ve test arasinda herhangi bir gün olmaksizin 7,21'Iik bir pH degerinden, toplama/ dondurma ve test arasinda 6 gün sonra 7,46 'lik bir pH degerine kadar degismistir. Baska bir örnekte, Donör 2'den alinan tükürük örneginin pH degeri, toplama ve test arasinda herhangi bir gün olmaksizin 7,00 pH degerinden, toplama / dondurma ve test arasinda 6 gün sonra 6,98 pH degerine kadar degismistir. Bir örnekte, Donör 3'den alinan tükürük örneginin pH'i, toplama ve test arasinda herhangi bir gün olmaksizin 7,18'Iik bir pH degerinden, toplama /dondurma ve test arasinda 6 gün sonra 7,18 'lik bir pH degerine kadar degismistir. Bir örnekte, Donör 4'den alinan tükürük örneginin pH'i, toplama ve test arasinda herhangi bir gün olmaksizin 7,35'lik bir pH degerinden, toplama / dondurma ve test arasinda 6 gün sonra 7,47'Iik bir pH degerine kadar degismistir. Bir örnekte, Donör 1'den alinan tükürük örneginin pH'i, toplama ve test arasinda herhangi bir gün olmaksizin 7,22'Iik bir pH degerinden, toplama / dondurma ve test arasinda 6 gün sonra 7,24'lük bir pH degerine kadar degismistir. ÖRNEK 7 - Taze Tükürükte Tespit Siniri Sekil 8, taze tükürügün tespit sinirini göstermektedir. Taze tükürük, salya akitma metodu kullanilarak toplanmis ve %25 tükürük ve %75 su elde etmek için 1:3'Iük bir oranda suda seyreltilmistir. Isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2, bir kontrol olarak seri seyreltmeler ile %25 tükürük içine eklenmistir. 20 pL RT-LAMP reaktifine 5 pL %25'Iik tükürük ilave edilmistir, böylece tükürügün nihai konsantrasyonu %5 olmustur. 65 °C'de 1 saat süre ile inkübe edildikten sonra renk degismistir. Y eksenindeki kopya sayisi, orijinal %100'Iük tükürük konsantrasyonunun seyreltilme olmadan ne olacagini temsil eder. Primer için tespit siniri (LOD), yaklasik olarak 200k kopya/mL tükürüge esdeger olan 25 pL'Iik bir hacimde 250 kopya/reaksiyon idi. Dolayisi ile de tükürügün nükleaz içermeyen su ile %25 'e seyreltilmesi ve RT-LAMP reaksiyonuna ekleme sonrasi %5'Iik bir nihai tükürük konsantrasyonuna daha fazla seyreltilmesinin 60 dakika içinde sonuç alabilecegi belirlenmistir. Seyreltme, tükürügün tamponlama kapasitesini azaltmis ve inhibitör bilesenlerin konsantrasyonunu azaltmis olup, her ikisi de kolorimetrik raporlamayi geciktirecektir. Seyreltme, ön isleme tabi tutulma tükürügün inhibe edici bilesenlerini inaktive etmek için proteazlar ile ön islem, Chelex® 100 ya da RNA ekstraksiyon islemleri gibi çesitli çalismalarda bulunan diger ön islem islem islemlerine kiyasla son kullanici için daha az karmasiktir. Pure-SALT'V'< kullanilarak islenmis olan %5 tükürükteki kolorimetrik tahlilin LoD'si, seyreltme hesaba katildiktan sonra 800 kopya/uL hasta tükürügüne karsilik gelen 1000 kopya/reaksiyondur (reaksiyon hacmi 25 pL) (Sekil GC). Sekil 6C'de de gösterildigi gibi, farkli tükürük toplama cihazlari (Pure-SALT'V', Super-Saim', Stat- sureT'V') degisen LoD ile sonuçlanabilir. Tüm isleme teknikleri için su ile %5 seyreltilmis tükürük test edilmistir. Primer set orf1ab.2 kullanilmistir. %5 islenmis tükürük (nihai reaksiyon konsantrasyon) içinde seyreltilmis olan isi ile inaktive edilmis 5 pL virüs, belirtilen konsantrasyon ve 25 pL'Iik bir nihai reaksiyon hacmi ile sonuçlanmak üzere RT-LAMP reaksiyonuna ilave edilmistir. Negatif reaksiyonlar için, 25 pL'Iik ayni reaksiyon hacmini saglamak üzere seyreltilmis isi ile inaktive edilmis virüs yerine 5 pL islenmis tükürük (%5 nihai reaksiyon konsantrasyonu) ilave edilmistir. Isitma, 65 °C'de 60 dakika boyunca bir inkübatörde gerçeklestirilmistir. Kolorimetrik taramalar, RT-LAMP reaksiyonundan önce ve sonra düz yatakli tarayici kullanilarak alinmistir. Reaksiyonlar 12,5 uL NEB 2X kolorimetrik ana karisim, 2,5 uL primer karisim, 5 uL su ve 5 uL numuneden olusmustur. Bu LoD, RT-PCR testlerinden ya da RNA ekstraksiyonunu kullanan diger testlerden (1 kopya/reaksiyon mertebesine) muhtelif sayida mertebe daha yüksektir. Bununla birlikte, bu diger tahlillere, bildirilen LoD'yi elde etmek için ön islem protokolleri ve/veya RNA ekstraksiyon islemleri eslik etmistir. Bu LoD'yi arttirmak için RNaz inhibitörleri, Guanidin HCI ve tasiyici DNA kullanimini arastirdik. RNaz inhibitörlerinin ilave edilmesi %5 tükürükteki (Sekil GB) LoD'yi düsürmüs olup, bu da tükürükte RT-LAMP analizlerinin RNaz inhibitörlerini kullandigi literatür raporlari ile çelismekte olup; bu tutarsizlik, kullanilan RNaz inhibitörünün türünden kaynaklaniyor olabilir. Hem Guanidin HCI ve hem de tasiyici DNA, LoD'yi arttirdi (Sekil 6D ve Sekil 6E) ve kolorimetrik çözelti reaksiyonlari için bizim RT-LAMP reaksiyon formülasyonumuza ilave edildi. Bu bilesenler, kagit üzerinde kurutuldugu zaman renk degisikligi nedeni ile dahil edilmemistir. Sekil 6D'de de gösterildigi gibi, %5 islenmis tükürük (nihai reaksiyon konsantrasyon) içinde seyreltilmis olan isi ile inaktive edilmis 5 uL virüs, belirtilen konsantrasyon ve 25 uL'Iik bir nihai reaksiyon hacmi ile sonuçlanmak üzere RT-LAMP reaksiyonuna ilave edilmistir. Negatif reaksiyonlar için, 25 uL'lik ayni reaksiyon hacmi ile sonuçlanmak üzere seyreltilmis isi ile inaktive edilmis virüs yerine 5 uL islenmis tükürük (%5 nihai reaksiyon konsantrasyonu) ilave edilmistir. Primer set orf1ab.2 kullanildi. Isitma, 65 °C'de 60 dakika boyunca bir inkübatörde (Fisherbrand T'V' Isotemp TM) gerçeklestirilmistir. Kolorimetrik taramalar, RT-LAMP reaksiyonundan önce ve sonra düz yatakli tarayici kullanilarak alinmistir. 1250 uL NEB kolorimetrik ana karisimi, belirtildigi gibi bir nihai konsantrasyon ile sonuçlanmak üzere 0,5 uL Antarktika Termolabil UDG, 3,5 uL dUTP ve tasiyici DNA ile takviye edilmistir. Sekil 6E'de de gösterildigi gibi, %5 islenmis tükürük (nihai reaksiyon konsantrasyon) içinde seyreltilmis olan isi ile inaktive edilmis 5 uL virüs, belirtilen konsantrasyon ve 25 uL'Iik bir nihai reaksiyon hacmi ile sonuçlanmak üzere RT-LAMP reaksiyonuna ilave edilmistir. Negatif reaksiyonlar için, 25 uL'lik ayni reaksiyon hacmi ile sonuçlanmak üzere seyreltilmis isi ile inaktive edilmis virüs yerine 5 uL islenmis tükürük (%5 nihai reaksiyon konsantrasyonu) ilave edilmistir. Primer set orf1ab.2 kullanildi. Isitma, 65 °C'de 60 dakika boyunca bir inkübatörde (Fisherbrand T'V' Isotemp TM) gerçeklestirilmistir. Kolorimetrik taramalar, RT-LAMP reaksiyonundan önce ve sonra düz yatakli tarayici kullanilarak alinmistir. 1250 uL NEB kolorimetrik ana karisimi, 0,5 uL Antarktika Termolabil UDG, ile takviye edilmistir. Son olarak, tasima kontaminasyonunu azaltmak için urasil-DNA glikozilaz (UDG) ve deoksiüridin trifosfat (dUTP) (Sekil 6F) dahil edilmistir. Sekil 6F'de de gösterildigi gibi, UDG'Ier ve dUTP ilave edilerek ve ilave etmeden termomikser ve inkübatör üzerinde 25 uL reaksiyonlari için 65 °C'de 60 dakikalik inkübasyondan sonra kolorimetriktaramalar. Kullanilan Primer set, orf1ab.ll idi. Sablon, belirtilen konsantrasyonda isi ile inaktive edilmis virüs idi. UDG ile reaksiyonlar için 1250 uL NEB 2x kolorimetrik ana karisim, 0,5 uLAntarktika Termolabil UDG, 3,5 uL dUTP ile takviye edilmistir. Diger tüm reaksiyonlar için NEB 2x kolorimetrik ana karisim kullanilmistir. Guanidin HCI, tasiyici DNA ve UDG dahil edildigi zaman, çözeltideki %5 islenmis tükürükte RT- LAMP kolorimetrik miktar tayininin LoD degeri 250 kopya/reaksiyona yükselmistir (Sekil GG). Sekil SG'de de gösterildigi gibi, Pure-SALT'V' ile islenmis tükürük ve islenmemis olan tükürük kullanilarak RT-LAMP kolorimetrik LoD. Plakalar 65 °C'ye ayarlanmis olan bir inkübatörde 60 dakika boyunca isitilmistir. Kullanilan primer seti orf1ab.ll idi ve sablon, belirtilen konsantrasyonda (pozitif reaksiyonlar) ya da nükleaz içermeyen suda (negatif reaksiyonlar) isi ile inaktive edilmis virüs idi. Isitma, 65 °C'de 60 dakika boyunca bir inkübatörde (Fisherbrand TM lsotemp TM) gerçeklestirilmistir. Kolorimetrik taramalar, RT-LAMP reaksiyonundan önce ve sonra düz yatakli tarayici kullanilarak alinmistir. 1250 uL NEB kolorimetrik ana karisimi, 0,5 uL Antarktika Termolabil UDG, ile takviye edilmistir. ÖRNEK 8 - Hayvan Burun Sürüntüsünde Tespit Siniri Sekil 9, yaklasik olarak 1 mL su içinde yeniden süspanse edilen bir sigir burun sürüntüsünde tespit sinirini göstermektedir. Isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2, tükürük ile önceki örnekte oldugu gibi ayni sayida kopya/reaksiyon elde etmek için yeniden süspanse edilmis arka plan mukusu ve mikrobiyomu ile suya eklenmistir. 20 uL RT-LAMP'ye 5 uL numune ilave edilmistir. 65 °C'de yaklasik olarak 1 saat süre ile inkübe edildikten sonra renk degismistir. Primer için LOD, yaklasik olarak 5k kopya/mL burun sürüntüsü yeniden süspansiyonuna esdeger olan 25 uL'Iik bir hacimde yaklasik 250 kopya/reaksiyon idi. ÖRNEK 9 - Kagit Üzerinde Tespit Siniri Sekil 10, kagit üzerinde tespit sinirini göstermektedir. 1. Derece kromatografi kagidina 20 uL RT- LAMP reaktifleri ilave edilmistir. Isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2, virüsün seri seyreltmeleri ile edilmistir. 65 °C'de 90 dakika süre ile inkübe edildikten sonra renk degismistir. Primer için LOD, yaklasik olarak 20k kopya/mL tükürüge esdeger olan 15 pL'lik bir hacimde yaklasik olarak 3k kopya/reaksiyon idi. Kagit Üzerinde LAMP Ana/izini Kolay/astiran Reaktif Bilesim/eri ÖRNEK 10 - Numune Reaktifleri Bir örnekte, reaktifler Tablo A1'de gösterildigi gibi dahil edilmistir. Baska bir örnekte, reaktifler Tablo A2'de gösterildigi gibi dahil edilmistir. Tablo A-1 Reaktifler Deoksinükleotit (dNTP) Çözelti Seti (her bir dATP, dCTP, dGiTP ve dTTP'den ayri ayri Deoksinükleotit (dNTP) Çözelti Karisimi Bst 2.0 WarmStart® DNA Polimeraz Bst 3.0 DNA Polimeraz WarmStart® RTX Ters Transkriptaz Tris-HCI Primer setleri QA testi için hedef DNA Tablo A-2 Reaktifler Potasyum Klorür Magnezyum sülfat Deoksinükleotit trifosfat (dNTP) Bst 2.0 DNA Polimeraz WarmStart® RTX Ters Transkriptaz Fenol kirmizisi Antarktika Termolabile urasil DNA glikozilaz (UDG) Polisorbat 20 Betain Sigir Serum Albumin Trehaloz Nükleaz içermeyen su RNase AWAY ÖRNEK 11 - Tampon Seçimi ve Konsantrasyonu Tükürügün pH'i numuneden numuneye degisebildiginden dolayi, tutarli bir baslangiç pH'ini korumak için kagit bazli cihazda birtampon kullanilmistir. Fenol kirmizisi için, 7,6'Iik bir pH, Sekil 11'de de gösterildigi gibi kolorimetrik geçisi arttirmak için uygun bir baslangiç noktasi idi. Amplifikasyon gerçeklestigi zaman bir renk degisikligine izin vermek için 7,6 baslangiç pH'i tamponlama araliginin sinirlarina yakin oldugundan dolayi, yaklasik olarak 8 pKa'ya sahip olan birkaç tampon taranmistir. Sekil 12'de de gösterildigi gibi kagit bazli analiz için 10 mM BICINE tamponu kullanilmistir. ÖRNEK 12 - Primerlerin Reaksiyon Hizi Üzerindeki Etkisi RT-LAMP reaksiyonunun hizini artirmak amaci ile floresan RT-LAMP reaksiyon karisimina birden fazla primer setinin dahil edilmesi arastirilmistir. Inceleme, bir florometrik gösterge olarak NEB LAMP floresan boyasi kullanilarak su içinde gerçeklestirilmistir. Birden fazla primer setinin dahil edilmesinin reaksiyon hizini önemli ölçüde artirdigi görülmemistir. Aksine, reaksiyon temel olarak izolasyonda kullanildigi zaman en hizli reaksiyon süresine sahip olan primer setinin hizinda ÖRNEK 13 - Numune LAMP Protokolü, Reaktifler, Dogrulama ve Sorun Giderme Numune Lamp Protokolü 13-A: Primer Karisimi 1. NEB Bst 2.0 Warmstart kitini ve primer karisimini elde edin; 2. Reaktifler çözülürken ve DNAway'i en az 5 dakika püskürttükten sonra, yüzeyleri bir Kimwipe 3. Kullanilacak olan DNA numunesi ve primerler ile ihtiyaç duyulan tüm PCR tüplerini etiketleyin. Ilave edilmis DNA'nin olmayacagi negatif bir kontrol ilave ettiginizden emin olun; 4. Reaksiyon basina 5 ul PCR kalitesinde su (ya da boya), 12,5 ul NEB Bst 2.0 Warmstart kiti ve 2,5 pl primer karisimi ilave edin. Kaç reaksiyon çalistirilacak ise ona göre bir ana karisim yapilabilir; . Eger 5 ul EBT boyasi ilave edilir ise, nihai konsantrasyon 300 uM olacak bir sekilde 1500 uM konsantrasyonunda olmalidir; 6. DNA içermeyen reaksiyonlara fazladan 5ul PCR sinifi su ilave edilmeli ve bunlar bir jele yüklenene kadar tekrar açilmamalidir; 7. Hazir oldugunda, PCR tüpleri daha önce geçis bölmesinde birakilan PCR tepsisine konulmali ve BRK 2037 ye tasinmalidir; 8. BRK 2037'ye girdikten sonra, -20 °C'Iik dondurucudan numune DNA'sini elde edin; 9. Ellerinize DNAway spreyi sikin ve ayrica sprey ile kaplanacak sekilde ellerinizi DNA numune tüpünün etrafina sürün; . Uygun olan yerlerde DNA örneginden 5 ul ilave edildin ve tüpleri kapatin. 2 DNA tüpünü asla ayni anda açmayin ve DNA'yi ekledikten hemen sonra PCR tüplerini kapatin; 11. Numuneleri 1 saat boyunca 65 °C'ye ayarlanmis ve 5 dakika boyunca 80 °C'ye ayarlanmis bir isi döngüleyiciye koyun (numuneler bu islemden sonra bir gece boyu -20 °C'de tutulabilir). Numune Reaktif Konsantrasyonlari 13-B: Kolorimetrik RT-LAMP ana karisimi sunlar olabilir: KCI (50 mM), MgSO4 (8 mM), dNTP karisimi (her biri , WarmStart ® RTx Ters Transkriptaz (, Antarktika Termolabile UDG Bu bilesenlerin her biri, kagit LAMP tahlili için 0,25X sivi konsantrasyonundan 5X ya da daha yüksek bir degere titre edilmistir. Konsantrasyon, LAMP reaksiyonunun hizi, 60 dakikalik reaksiyon süresinde pozitif ve negatif LAMP sonuçlari arasindaki kontrast ve spesifik olmayan amplifikasyonun azaltilmis miktari ile belirlendi. Protein stabilize edici katki maddelerinin konsantrasyonunu belirlemek için, D-(+)- trehaloz dihidrat, %5'Iik artislar kullanilarak %0 ila %15 a/h arasinda titre edildi ve Iiyofilize BSA, 0,2 mg/mL'Iik artislar kullanilarak 0 ila 1,25 mg/mL arasinda titre edildi. Trehaloz ve BSA için konsantrasyonlari sirasi ile %10 alti ve 0,626 mg/mL idi. Numune Lamp Protokolü 13-C: Reaktifler Reaktifler Örnek 10'un Tablo A -2'de gösterilmektedir. Ekipman Munksjö Grade 222, pH probu, 65 °C'ye ulasabilen bir isi kaynagi (örnegin, inkübatör, su banyosu), PCR basligi. Sanitizasyon: Pipetlere ve tüm çalisma tezgahi (PCR basligi) yüzeylerine RNase AWAY püskürtün. RNase AWAY'i uyguladiktan sonra düzgün bir biçimde silin. RNase AWAY, eger kalan var ise, reaksiyon ile etkilesebilir. Çapraz kontaminasyonun önlenmesine yardimci olmak için kagit bazli cihazi üretmek ve numuneleri yüklemek için ayri odalar kullanin. 5 mm x 6 mm kromatografi kagidini önceden kesin. LAMP Hazirligi.' 1. Bir PCR basligi içinde Tablo 138-1'de belirtildigi gibi 2X LAMP karisimi hazirlayin. 2. 1M KOH (yaklasik olarak 1 - 2 uL) ile pH'i ~ 7,5 - 8,0'a (kirmizi ancak pembe olmayan bir renk) ayarlayin. Kesin olmasina gerek yoktur. PH ayarlandiktan sonra, 2X LAMP Karisimi -20 C'de saklanabilir. Tablo 13B-1 2X LAMP Karisimi Stok Nihai Bilesenler Hacim Birim konsantrasyonu Birim konsantrasyon Birim MgSO4 160 uL 100 mM 16 mM dNTP'Ier 280 uL 10 mM 2,8 mM RTxTers transkriptaz 40 pL 15 U/pL 0,6 U/pL Fenol kirmizisi 20 pL 25 mM 0,2 mM Antarktika Termolabil UDGi 0,4 pL 1 U/pL 0,0004 U/pL Polisorbat 20 100 pL 20 % 2 % Nükleaz içermeyen su 286 pL - - - - Toplam 1000 pL 3. Tablo 13B-2'ye göre bir ana karisim hazirlayin. Tablo 13B-2 Kagit LAMP için karisimi tamamlayin Bilesenler Hacim Birim Stok Birim Nihai Birim konsantrasyonu konsantrasyon 2X LAMP Karisimi 125 pL - - - - 10X Primer Karisimi a 25 pL - - - _ Betain 1 pL 5 M 20 mM Trehaloz 36 pL 689 mg/mL - - Su 9,2 iJL Toplam 200 pL a LAMP primerlerinin stoklari, kurulum kolayligi için suda uygulanabilir bir konsantrasyonda yapilabilir. 6 LAMP primerlerinin tümünü ihtiva eden 10X Primer Karisimi. 10X Primer karisimi: 16 uM FlP/BIP, 2 uM F3/BS, 4 uM Loop F/B yapilabilir. 4. 0,1M Koh ile pH'i 8,0'a ayarlayin. Bir mikro - pH elektrot kullanin. . Iyice karistirin. Kagit pedleri PCR basliginin içindeki temiz bir yüzey üzerine yerlestirin. Önceden kesilmis 222 kalite kagit pedlere 30 uL tam karisim ilave edin. 6. PCR basligi altinda oda sicakliginda 60 dakika boyunca kurutun. 7. Kuruduktan sonra, kagit pedleri temiz bir santrifüj tüpü içine ya da temiz bir yeniden kapatilabilir plastik torbaya toplayin. Numune Yükleme 1. Çalisma tezgahina RNase AWAY'i püskürtün ve silecekler ile temizleyin. 2. Dondurucudan sablonlari (DNA, RNA, isi ile inaktive edilmis virüs) çikarin. 3. Reaksiyon pedlerini temiz bir yüzey üzerine yerlestirin. Pedlerinizi yeni bir seffaf film üzerine koyabilir ve kullandiktan sonra onu atabilirsiniz. 4. Önce negatif kontrol pedlerini hazirlayin. Pedleri 25 uL sablon olmayan çözücü (su, tükürük) ile sulandirin. Sulandirma islemi nazik olmalidir, reaktifleri pedden yikamaktan kaçinin. . Negatif kontrol pedlerini forseps kullanarak temiz bir kap (örnegin, 1" x 1" yeniden kapatilabilir plastik torba, santrifüj tüpü) içine yerlestirin. 6. Sablonu çözücü ile arzu edilen konsantrasyona seyreltin. 7. Daha fazla reaksiyon pedini yerlestirin ve pedleri 25 uL seyreltilmis sablon ile sulandirin. 8. Pozitif kontrol pedlerini forseps kullanarak temiz bir kap (örnegin, 1" x 1" yeniden kapatilabilir plastik torba, santrifüj tüpü) içine yerlestirin. 9. Çalisma alanini temizleyin ve görüntüleme ve inkübasyon için pedleri getirin. Görüntüleme ve inkübasyon: Not: Birden fazla görüntüleme metodu (örnegin, hizlandirilmis Video, tarama) ve isi kaynaklari (örnegin, inkübatör, su banyosu) bulunmaktadir. Bu protokolde bir masaüstü tarayici ve bir mikrobiyolojik inkübatör kullanilabilir. 1. Pedleri tarayicinin üstüne yerlestirin. Reaksiyondan önce pedleri tarayin (0 dk). 2. Inkübatörü 65 CC'ye önceden isitin. 3. Pedleri inkübatör içine yerlestirin. Pedleri ayirin. Isitma homojenligi sonuç tutarliligini etkileyebilir. 4. Pedleri çikarin ve taramayi farkli zaman noktalarinda (genellikle her 30 dakikada bir) tekrar . Son taramadan sonra, reaksiyon pedlerini biyolojik tehlike çöpünün içine atin. Dogrulama LAMP amplifikasyonunun meydana geldigini dogrulamak için, her bir reaksiyon pedi temiz 1,5 mL'Iik bir mikro santrifüj tüpüne aktarildi. Her bir tüpe 100 pL Tampon EB ilave edildi. Reaksiyon pedleri, nükleik asitleri ayristirmak için gece boyunca Tampon EB'ye batirilmistir. LAMP amplifikasyonunun meydana geldigini dogrulamak için eluent ile jel elektroforezi (%2 agaroz jel) yapildi. Her bir pozitif ped seridinde merdiven benzeri bir desen (tipik LAMP ürün deseni) gösterilirken, her bir negatif seritte belirgin bir bant yoktu (Sekil 13A ve 138). Sekil 13A ve 1SB'de de gösterildigi gibi, kagit LAMP dogrulamasi gerçeklestirilmistir. Sekil 13A'da da gösterildigi gibi, iki kosullu (reaksiyon karisiminda BSA içeren ve içermeyen) kagit üzerinde LAMP gerçeklestirilmistir. Sekil 1SB'de de gösterildigi gibi, iliskili jel elektroforezi (%2 agaroz) gerçeklestirilmistir. SARS-CoV-2 'yi hedefleyen orf7ab.1 primer seti kullanilmistir. Negatif reaksiyon pedleri, 25 uL nükleaz içermeyen su ile sulandirilmistir. Pozitif reaksiyon pedleri, 25 pL 400 kopya/uL isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 virüsü ile sulandirilmistir. Isitma, 65 (Üye ayarlanmis olan bir inkübatörde gerçeklestirildi ve düz yatakli bir tarayicida tarandi. BSA, LAMP karisimi içinde kullanilabilen bir reaktiftir. BSA'nin ilave edilmesi, Sekil 14A ve Sekil 14B'de de gösterildigi gibi reaksiyonlari hizlandirabilir ve hassasiyeti aitirabilir. Bu reaksiyonlarda, iki kosula maruz olarak (reaksiyon karisiminda BSA ile ve BSA olmadan) kagit üzerinde bir düsük sablon konsantrasyon LAMP gerçeklestirilmistir. Sekil 14A, bir 0 dakika zaman noktasini göstermektedir. Sekil 148, bir 60 dakika zaman noktasini göstermektedir. Bu deneyde orf7ab.1 primeri kullanilmistir. Negatif reaksiyon pedleri, 25 pL nükleaz içermeyen su ile sulandirilmistir. Pozitif reaksiyon pedleri, sirasi ile 25 uL 8 kopya/uL ve 16 kopya/uL isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 virüsü (200 kopya/reaksiyon ve 400 kopya/reaksiyon'luk bir nihai konsantrasyonu ulasmak için) ile sulandirilmistir. Bununla birlikte, BSA ayrica cihaza pH varyasyonlari da ekleyebilir. Sekil 13A ve Sekil 14B, inkübasyondan (60 dakika) sonra BSA ihtiva eden negatif kagit pedlerin sarimsi bir kenara sahip oldugunu göstermektedir. Elüsyondan ve elüentin jel elektroforezi ile çalistirilmasindan sonra, Sekil 1SB'de de gösterildigi gibi, jel üzerinde görünür bir DNA ürünü yoktu, bu da kenardaki sari rengin hedef disi amplifikasyon ya da kontaminasyondan kaynaklanmadigini göstermektedir. BSA'nin heterojen bir dagilimi, isi uygulanmasindan sonra kenarlarda sari renge yol açabilir. Sorun Giderme: Kagit pedler üzerinde olagandisi pembe renk: LAMP kagit pedlerin hazirlanmasi islemi sirasinda, dogrudan pedlerin üzerine püskürtülen ve/veya forseps yolu ile aktarilan kalinti RNase AWAY'in neden olabilecegi, çevresel renkten farkli olagandisi pembe lekeler olabilir. RNase AWAY, ilave edilen herhangi bir RNA/DNA sablonunu bozabilir. Eger bu olursa, tüm ekipmani ve yüzeyleri düzgün bir biçimde kurulayin, yeni 5 x 6 mm kagit pedler kesin ve Islem 5'ten 'LAMP hazirlama' bölümünü yeniden baslatin. Ped sulandirmasindan sonra reaktiflerin tasmasi: Numune yükleme islemi sirasinda ped, sulandirma için kendisine ilave edilen numune hacminin tamamini ememeyebilir. Sablon konsantrasyonu, tasan pedler ile dogru bir sekilde temsil edilemeyebilir. Tasma, pedlerin yeterince kurumamasindan kaynaklanabilir. Eger bu gerçeklesecek olursa: 1) daha uzun bir süre kurutun, 2) örnegin isi ile kurutma (37 °C'de temiz bir mikrobiyolojik inkübatöre yerlestirin; Bst2.0 WarmStart ® polimerazin aktivasyonunu önlemek için sicakligi 45 "C'den daha yüksek ayarlamayin) ya da konvektif kurutma (kurutma sirasinda hava akisini artirmak için küçük fanlar kullanin) ya da 3) sulandirma hacmini 20 uL'ye düsürün. Negatif kontroller renk degisikligi gösterir: Görüntüleme ve inkübasyon operasyonu sirasinda, negatif pedler ayni anda ya da numune içeren pedlerden kisa bir süre sonra degisebilir. Bu, ya primer dimerizasyon / spesifik olmayan amplifikasyon ya da önceki LAMP reaksiyonlarinin tasinan kirleticilerinden kaynaklanabilir. Çözmek için, onlari kagit üzerinde kullanmadan önce primeri sivi bazli LAMP'de dogrulayin. Tasinma kontaminasyonlarini kontrol etmek için, 1) tüm LAMP reaksiyonlarinda dUTP'Ieri ve UDG'yi uygulayin, 2) LAMP karisimi hazirlama ve numune ekleme için ayri çalisma istasyonlari bulundurun ve 3) eger kontaminasyonun meydana geldiginden süpheleniliyor ise reaktif stoklarini alikotlayin ve yeni alikotlar kullanin. Ayrica reaksiyonun asiri inkübe edilmesi de spesifik olmayan amplifikasyonu indükleyebilir. 75 dakikalik inkübasyon süresini asmayin. Numune pH'i ve tamponlama kapasitesi kolorimetrik okumalari etkileyecektir: Fenol kirmizisi bir pH göstergesi oldugundan dolayi, numunenin pH'i ve onun tamponlama kapasitesi tahlil üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. %5 - 10 h/h (su ile seyreltilmis) tükürük konsantrasyonlarinin burada sunulan reaktif bilesimi ile çalistigi dogrulanmistir. %5 tükürük seçilmistir çünkü bu konsantrasyon daha hizli bir tepki süresine sahiptir ve tutarli sonuçlar vermektedir. Insan tükürügü, yüksek tükürük konsantrasyonunda pH degisimini (ve dolayisi ile de renk degisimini) önleyen bikarbonat, fosfat ve proteinleri ihtiva eden sofistike bir tamponlama sistemine sahiptir. Su içinde yeniden süspanse edilmis burun sürüntüsü olan kagit LAMP cihazi test edildi ve numune matrisinden herhangi bir inhibisyon göstermedi. Kolorimetrik okumalar ayrica, tamponlanmis tuz çözeltisi (örnegin, tasima ortami) tarafindan da engellenebilir. ÖRNEK 14 - Inaktive virüs ile islenmemis tükürügün Kagit Üzerinde Tespit Siniri. Sekil 15'te de gösterildigi gibi, isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 virüsü ile islenmemis tükürügün tamami, uL tükürük basina yaklasik olarak 20 kopya tespit sinirini dogrulamistir. Negatif kopya/uL (2 numune), 1.000.000 kopya/uL (2 numune) dahil olmak üzere çesitli numune konsantrasyonlari, havuzlanmis tükürük alikotlari (30 alikot) kullanilarak olusturulmustur. Sonuçlar görüntü isleme kullanilarak dogrulandi. pH Duyar/i Sinyal Çik/sini En Üst Düzeye Çikaran Reaktif Bilesim/eri ÖRNEK 15 - Numune LAMP Boyalari Tablo B Fenol kirmizisi çözeltisi Turnusol Bromtimol mavisi Nitrazin Sarisi Kresol Kirmizisi, Sodyum tuzu Kurkumin Parlak Sari m-Kresol Moru d-Naftolftalein Nötr kirmizi Asit fusin Asit fusin, Kalsiyum tuzu Floresan raportörleri, özel aletler olmadan okunmak için ek bir ultraviyole (UV) isik kaynagi kullanacaktir. Bununla birlikte, bir gösterge olarak fenol kirmizisini kullanan bir kolorimetrik tahlil UV isigi kullanmaz ve çiplak göz ile yorumlanabilir. DNA'nin polimerizasyonu protonlar üretir ve fenol kirmizisi pH'a duyarlidir. PH'daki degisiklikleri ölçmek üzere tükürügün tamponlama kapasitesinin üstesinden gelmek seyreltilmis tükürük (%5 nihai konsantrasyon) kullanilmistir. Tükürügün %5'Iik bir nihai konsantrasyona seyreltilmesi ayrica, etkilesenlerin (örnegin, RNaz) konsantrasyonunu da azaltmistir. Ayrica, tasiyici DNA ve guanidin hidroklorürün dahil edilmesi de LoD'yi arttirdi ve su ve tükürükte karsilastirilabilir bir kolorimetrik yanit sagladi. Tasiyici DNA'nin LAMP sonuçlarini arttirdigi mekanizma belirsizdi. Bu mekanizma, NEB 1kb DNA merdiveni (NEB-N3232L) kullanilmak sureti ile arastirilmistir. LoD üzerindeki etkiyi incelemek için farkli tasiyici DNA konsantrasyonlari (0,3 ng/ul ve 0,75 ng/ul) kullanilmistir. Ayrica guanidin klorür (40 mM) de kullanilmistir. Tam ana karisimin pH'i 7,6'da tutuldu ve ayni durum tasiyici DNA olmadan da test edildi. 1000 kopya ila 62,5 kopya/reaksiyon konsantrasyon araliginda isi ile inaktive edilmis SARS-CoV-2 ile guanidin klorür ile birlikte tasiyici DNA'nin etkisini test etmek için pH 6,5'a sahip olan taze tükürük (%5) kullanilmistir (Sekil 6D). Guanidin hidroklorürün LAMP duyarliligini arttirdigi bildirilmistir. Primer setimiz ile performansi, 7,6 pH'a sahip olan NEB WarmstartT'V' kolorimetrik ana karisimina 40 mM guanidin hidroklorür ilave edilmesi sureti ile test edilmistir. 1000 kopya ila 62,5 kopya/reaksiyon konsantrasyon araligi ile isiyla inaktive edilmis SARS-CoV-2 ile guanidin klorürün etkisini test etmek için pH 6,5'a sahip olan havuzlanmis tükürük (%5) kullanilmistir. Ayni bilesim ayrica, bir kontrol olarak guanidin klorür ilave edilmeden de test edilmistir. Guanidin klorür kopya duyarliligini arttirmistir ve kopya boyunca tutarli bir amplifikasyona sahiptir (Sekil GE). Fenol kirmizisi ve floresan boyanin LAMP tabanli nükleik asit amplifikasyonunu bildirdigi farkli mekanizmalar nedeni ile zaman içinde sinyal ölçümündeki bu farkliliklar arastirilmistir. Reaksiyonlar, WarmstartT'VI Kolorimetrik LAMP 2x Ana Karisim ve LAMP Floresan Boyanin bir kombinasyonu ile FrameStar 96 kuyucuklu etekli optik tabanli plakalari üzerine hazirlandi, Thermo ScientificT'VI Yapiskan Plaka Contalari ile kapatildi ve inkübasyonu ve absorbans ile floresan yogunlugunun ölçümü için ClariostarT'V' Plus Mikro Plaka Okuyucuya (BMG) yerlestirildi. Zaman içinde renk degisimi A432 nm /A560 nm orani olarak ifade edildi. Absorbans degerleri, A432nm ve A560nm'den A620 nm nin çikarilmasi ile referans hatti düzeltilmis sekildedir. Sekil 16'ya göre, reaksiyonlardaki renk degisiklikleri, floresan degisikliklerine kiyasla daha sonra meydana gelmistir. Kolorimetrik ve florometrik veriler BMG CLARIOstar ® Plus plaka okuyucusunda toplanmistir. Reaksiyon bazli karisim, NEB 2x Kolorimetrik LAMP ana karisimi, olusuyordu. Plaka okuyucunun hazne sicakliginin, plakayi yerlestirmeden önce 65 °C'ye dengelenmesine izin verilmistir. Su içinde seyreltilmis 5 uL isi ile inaktive edilmis virüs, belirtildigi gibi nihai reaksiyon konsantrasyonlari ile sonuçlanmak üzere reaksiyon baz karisimina ilave edilmistir (pozitif reaksiyonlar). NTC reaksiyonlari için reaksiyon baz karisimina 5 uL nükleaz içermeyen su ilave edilmistir. Degisimdeki bu fark, pH tabanli raportörlerin LAMP tabanli DNA amplifikasyonuna floresan raportörlere göre daha yavas yanit verdigini göstermistir. Kagit milyonlarca cihaza kadar ölçeklendirilebilir, ancak RT-LAMP reaktifleri kagit üzerine yerlestirildigi zaman, amplifikasyon olmamasina ragmen negatif bir kontrol kullanildigi zaman bile kagit renk degistirir. Bu renk degisikligi için bir olasilik, isinin ve RT-LAMP karisiminda mevcut bulunan amonyum sülfatin oksitleyici dogasinin neden oldugu selüloz oksidasyonudur. Bu renk degisikligi için bir baska olasilik, RT-LAMP karisimindan amonyagin gazdan arindirilmasi nedeni ile reaktiflerin asitlestirilmesidir. Amonyum sülfatin ortadan kaldirilmasi, negatif bir kontrol için rengi korumustur. Bir antioksidan görevi gören fenol kirmizisinin konsantrasyonunun arttirilmasi da ayrica, Sekil 11'de gösterildigi gibi negatif kontrol için rengi korumustur. ÖRNEK 18 - Kolorimetrik Boyalarin Taranmasi Kagit bazli bir analiz için üç kolorimetrik gösterge sinifi degerlendirilmistir: (i) magnezyum kolorimetrik göstergeler, (ii) pH kolorimetrik göstergeler ve (iii) DNA ara katmanli kolorimetrik göstergeler. Magnezyum göstergeleri için Calmagite (CAS# , Klorofosfonazo III (CAS# , 4) tarandi. pH göstergeleri için Bromtimol Mavisi (CAS# 76 -59 -5), Asit Fusin (CAS# , Nitrazin sarisi (CAS# , Kresol kirmizisi sodyum tuzu (CAS# sodyum tuzu (CAS# , o - Kresolftalein (CAS# 596-27 Naftolftalein (CAS# taranmistir. DNA ara katman boyalari için Kristal viyolet (CAS# 548-62-9) tarandi. Pek çok magnezyum göstergesi kagit üzerinde tutarli bir renk degisikligi üretmedi. Metal iyon göstergeleri (calmagite ve EBT), polimeraz reaksiyonunun bir yan ürünü olan magnezyum pirofosfat olusumu nedeni ile RT-LAMP deneyi boyunca konsantrasyonu azalan çözelti içindeki magnezyum (II) iyonlari ile etkilesime girmistir. Sekil 17A, sablon olarak genomik DNA kullanilarak LAMP reaksiyonu boyunca degisen konsantrasyonlarda calmagit'in kolorimetrik tepkisini göstermektedir. Artan calmagit (magnezyum indikatörü) konsantrasyonlari ile LAMP tespiti yapildi. Histophilus somni genomik DNA'sini hedefleyen IoIB.3 primer seti kullanildi. Pozitif reaksiyonlara 0,2 ng/uL bir konsantrasyonda 5 uL HS gDNA eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 uL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Toplam reaksiyon hacmi 25 uL idi. Reaksiyonlar, belirtildigi gibi nihai bir konsantrasyon üretmek için 12,5 uL NEB Warmstart 2x ana karisimi, 2,5 uL ya da primer karisimi ve yukaridaki gibi ya 5 uL sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve su içinde hazirlanan 5 pL Calmagite kullanilarak hazirlanmistir. Test edilen konsantrasyonlarda, LAMP reaksiyonu sirasinda görsel bir degisiklik tespit edilmemistir. EBT, LAMP reaksiyonunun 0 dakika ve 60 dakika zaman noktalari arasinda mordan koyu bir maviye dogru tespit edilebilir bir renk degisikligi gösterdi; bununla birlikte, renk degisikligi net degildi, bu da klinik ortamlarda yorumlari etkileyebilir. Sekil 17B'de de gösterildigi gibi, artan Eriochrome® Black T (magnezyum göstergesi) konsantrasyonlari ile LAMP tespiti gerçeklestirilmistir. Histophilus somni genomik DNA'sini (gDNA) hedefleyen lolB.3 primer seti kullanildi. Pozitif reaksiyonlara 0,2 ng/uL bir konsantrasyonda 5 pL HS gDNA eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 pL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Toplam reaksiyon hacmi 25 pL'dir. Reaksiyonlar, belirtildigi gibi nihai bir konsantrasyon üretmek için 12,5 pL NEB Warmstart 2x ana karisimi, 2,5 pL ya da primer karisimi ve yukaridaki gibi ya 5 pL sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve su içinde hazirlanan uL EBT kullanilarak hazirlanmistir. Ek olarak, EBT kullanarak kagit üzerinde LAMP kullanilmasi, tespit edilebilir bir renk degisikligine neden olmamistir. Sekil 17C'de de gösterildigi gibi, PCR tüpleri içinde kromatografi kagitlari üzerinde artan Eriochrome® Black T konsantrasyonlari ile LAMP tespiti gerçeklestirilmistir. Histophilus somni genomik DNA'sini hedefleyen lolB.3 primer seti kullanildi. Pozitif reaksiyonlara 0,2 ng/pL bir konsantrasyonda 5 uL H. somni gDNA eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 uL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Toplam reaksiyon hacmi 25 pL idi. Reaksiyonlar, yukaridaki gibi 12,5 uL NEB Warmstart 2x ana karisimi, 2,5 pL ya da primer karisimi ve yukaridaki gibi ya 5 uL sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve nükleaz içermeyen su içinde hazirlanan 5 pL EBT ( kullanilarak hazirlanmistir. EBT reaksiyonlari için, reaksiyon nükleaz içermeyen su içinde hazirlanan 25 pL EBT'den ( olusmustur. Muhtelif sayida farkli kagit türünü taramak ve jel elektroforezi yolu ile PES ve polisülfon BTS 0.8 üzerinde amplifikasyonun meydana geldigini dogrulamak sureti ile herhangi bir kagit üzerinde kolorimetrik bir degisiklik tespit edilememistir (Sekil 17D ve Sekil 17E). Sekil 17D'de de gösterildigi gibi, birden fazla kagit üzerinde LAMP tespiti gerçeklestirilmistir: kromatografi derecesi 1, anyonik degisim naylonu, katyonik degisim naylonu, polieter sülfon membrani, asimetrik mikron alti polisülfon (BTS ve hidroksillenmis naylon 1.2.b) 60 dakikada panel a'daki kagitlarin son nokta taramalari ve c) ekstrakte edilen LAMP ürünlerinin 60 dakikada jel elektroforezi (%2 agaroz) taramasi. Histophilus somni (HS) genomik DNA'sini hedefleyen IoIB.3 primer seti kullanildi. Pozitif reaksiyonlara 0,2 ng/uL bir konsantrasyonda 5 pL H. somni gDNA eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 pL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Toplam reaksiyon hacmi 25 uL'dir. Reaksiyonlar, yukaridaki gibi 12,5 uL NEB Warmstart 2x ana karisimi, 2,5 uL ya da primer karisimi ve yukaridaki gibi ya 5 uL sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve nükleaz içermeyen su içinde hazirlanan 5 pL EBT ( 25 pL reaksiyon ihtiva eden bir PCR tüpü içine yerlestirildi ve reaksiyonun devami sirasinda kagit tarafindan kurutuldu. 60 dakika sonra kagitlar çikarildi ve tarandi. Jel, 30 kullanilarak ekstrakte edilmistir. Sekil 17E'de de gösterildigi gibi, a) PCR tüplerinde, b) 60 dakikada kagitlardan ekstrakte edilen DNA'nin jel elektroforezinde (%2 agaroz) ve c) 60 dakikada taranan kagitlarda zaman içinde sonuçlar üretilmistir. Histophilus somni (HS) genomik DNA'sini hedefleyen IoIB.3 primer seti kullanildi. Pozitif reaksiyonlara 0,2 ng/uL bir konsantrasyonda 5 pL H. somni gDNA eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 pL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Toplam reaksiyon hacmi 25 uL'dir. Reaksiyonlar, yukaridaki gibi 12,5 uL NEB Warmstait 2x ana karisimi, 2,5 uL ya da primer karisimi ve yukaridaki gibi ya 5 (L sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve nükleaz içermeyen su içinde hazirlanan 5 uL EBT ( kullanilarak hazirlanmistir. BiodyneAamfoter kagit 25 pL reaksiyon ihtiva eden bir PCR tüpü içine yerlestirildi ve reaksiyonun devami sirasinda kagit tarafindan kurutuldu. 60 dakika sonra kagitlar çikarildi ve tarandi. Ek olarak, RT-LAMP reaksiyonu için çözeltideki Kristal viyolet göstergeyi stabilize etmek zordu. Kristal viyoletin kararsiz bir türevi olan Leuco kristal viyolet (LCV) için, çözeltide kararliligi renksizligi korumak için fazla sodyum sülfit kullanilmistir. Suda çözündürmek için, LCV sodyum sülfit (SS) ve beta-sikloDekstrin (BCD) kullanmistir. DsDNA'ya baglandiktan sonra, LCV tekrar kristal viyolete (örnegin, çözeltideki viyolet) dönüstürülmüstür. Sonuç olarak, amplifikasyonun bir sonucu olarak daha fazla dsDNA üretildiginden dolayi, RT-LAMP reaksiyonu boyunca çözeltinin renksizden viyolet (menekse) rengine dogru renk degistirmesi bekleniyordu. Bununla birlikte, degisen CV konsantrasyonlarinda LAMP reaksiyonlari gerçeklestirildigi zaman, hem pozitif ve hem de negatif reaksiyonlarda renk degisiklikleri meydana gelmistir. Sekil 17F'de de gösterildigi gibi, LAMP tespiti, ara katmanli boya, çözelti içinde Kristal viyolet ve b) 60 dakikada ürünlerin iliskili jel elektroforezi (%2 agaroz) taramasi ile gerçeklestirilmistir. H. somni gDNA'yi hedefleyen IoIB.3 primer seti kullanildi. Pozitif reaksiyonlara 0,2 ng/uL bir konsantrasyonda 5 pL H. somni gDNA eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 uL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Toplam reaksiyon hacmi 25 pL idi. Reaksiyonlar, belirtildigi gibi nihai bir konsantrasyon üretmek için 12,5 pL NEB Warmstait 2x ana karisimi, 2,5 uL ya da primer karisimi ve yukaridaki gibi 5 uL ya sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve nükleaz içermeyen su içinde hazirlanan 5 uL Kristal viyolet kullanilarak hazirlanmistir. Kagitlar 25 uL reaksiyon ihtiva eden bir PCR tüpü içine yerlestirildi ve reaksiyonun devami sirasinda kagit tarafindan kurutuldu. 60 dakika sonra kagitlar çikarildi ve tarandi. Kristal viyoleti çözündürmek için sodyum sülfit ve siklodekstrin kullanilmistir. Amplifikasyonun pozitif reaksiyonlarda meydana geldigini ancak negatif reaksiyonlarda meydana gelmedigini dogrulamak için, RT-LAMP çözeltisi %2 'lik bir agarozjelde çalistirilmistir, bu da pozitif reaksiyonlarin test edilen tüm CV konsantrasyonlarinda amplifikasyon gösterdigini, negatif reaksiyonlarin ise test edilen herhangi bir CV konsantrasyonunda amplifikasyon göstermedigini göstermistir. Dolayisi ile de negatif reaksiyonlardaki renk degisikligi, amplifiye DNA'nin baglanmasindan degil, LCV'nin CV'ye bozunmasindan kaynaklanmistir. Farkli CV, 88 ve BCD konsantrasyonlarinda kagit üzerinde CV için daha fazla test yapilmasi, negatif ve pozitif reaksiyonlar arasinda ayirt edilemeyen sonuçlar saglamistir. Sekil 17G'de de gösterildigi gibi, kagit üzerinde Kristal viyolet (CV) ara katman boyasi ile LAMP tespiti için son nokta kolorimetrik taramalari gerçeklestirilmistir. CV'yi çözündürmek için, sodyum sülfit (88) ve beta-siklodekstrin (BCD) kullanmistir. Kagitlar, belirtilen konsantrasyonlarda 12,5 uL NEB WarmstartT'V' 2x ana karisimi, 2,5 uL ya da primer karisimi ve yukaridaki gibi 5 uL ya sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve nükleaz içermeyen su içinde hazirlanan 5 uL CV kullanilarak hazirlanan 2 pl LAMP reaksiyonu ile yüklenmistir. Son olarak, yaklasik olarak 7,0'Iik bir renk geçisi pH degerine sahip olan yaklasik olarak 2 pH birimi bir araligi kapsayan muhtelif sayida kolorimetrik pH göstergesi, bir RT-LAMP reaksiyonunun beklenen pH araligi degisikligi ve geçis noktasina uyacak bir sekilde test edilmistir. Bu araliklar, LAMP kolorimetrik ana karisimimizin baslangiç pH'ina göre ve ayrica tükürügün tamponlama kapasitesinin üstesinden gelmek için seçilmistir. Bu seçim isleminin bir istisnasi, 3,0 pH'Iik bir araligi kapsayan ve 5,0'Iik bir renk geçisi pH'ina sahip olan Asit fusin olmustur. Sekil 17H - 17K, 60 dakikada LAMP reaksiyonunun iliskili jel elektroforez sonuçlari ile birlikte seçilen pH göstergelerinin degisen konsantrasyonlarini göstermektedir. Sekil 17H'de de gösterildigi gibi, RT-LAMP tespiti, çözelti içinde (pH göstergesi) artan kresol kirmizisi sodyum tuzu, Nötr kirmizi, Fenol kirmizisi sodyum tuzu, m-kresol moru ve m-kresol moru sodyum tuzu konsantrasyonlari ile gerçeklestirilmistir. SARS-CoV-2'nin N genini hedefleyen N.1O primer seti kullanilmistir. Pozitif reaksiyonlara, 0,2 ng/uL bir konsantrasyonda 5 uL in vitro kopyalanmis N gen RNA'si eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 uL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Toplam reaksiyon hacmi 25 uL idi. Reaksiyonlar, yukarida belirtildigi gibi 12,5 uL NEB WarmstartT'V' 2x ana karisimi, 2,5 pL ya da primer karisimi ve 5 pL ya sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve nükleaz içermeyen su içinde belirtilen konsantrasyonda 5 uL belirtilen pH göstergesi kullanilarak hazirlanmistir. Reaksiyonlar bir inkübatörde gerçeklestirildi ve düz yatakli bir tarayici kullanilarak her 20 dakikada bir tarandi. Sekil 17I'da da gösterildigi gibi, artan Cresol kirmizisi (pH göstergesi) konsantrasyonlari ile LAMP tespiti gerçeklestirilmistir. H. somni gDNA'yi hedefleyen IoIB.3 primer seti kullanildi. Pozitif reaksiyonlara 0,2 ng/pL bir konsantrasyonda 5 pL H. somni gDNA eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 pL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Toplam reaksiyon hacmi 25 pL'dir. Reaksiyonlar, belirtildigi gibi nihai reaksiyon konsantrasyonu ile sonuçlanan 12,5 pL NEB WarmstartT'V' 2x ana karisimi, 2,5 pL ya da primer karisimi ve yukaridaki gibi ya 5 pL sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) kullanilarak hazirlanmistir. Sekil 17J'de de gösterildigi gibi, RT-LAMP tespiti, çözeltideki artan Kresol kirmizisi, sodyum tuzu, m-kresol moru, Bromtimol mavisi ve Asit fusin konsantrasyonlari ve b) 60 dakikada ürünlerin iliskili jel elektroforezi (%2 agaroz) taramasi ile gerçeklestirilmistir. SARS-CoV-2'nin N genini hedefleyen N.10 primer seti kullanilmistir. Pozitif reaksiyonlara, 0,2 ng/pL bir konsantrasyonda 5 pL in vitro kopyalanmis N gen RNA'si eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 pL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Reaksiyonlar, belirtildigi gibi nihai bir konsantrasyon üretmek için yukaridaki gibi 12,5 pL NEB Warmstart 2x ana karisimi, 2,5 pL ya da primer karisimi ve ya 5 pL sablon (pozitif reaksiyonlar) ya da su (negatif) ve 5 pL belirtilen pH göstergesi kullanilarak hazirlanmistir. Isitma, 65 °C'ye ayarlanmis olan bir inkübatörde gerçeklestirildi ve her 20 dakikada bir düz yatakli bir tarayicida tarandi. Sekil 17K'da da gösterildigi gibi, RT-LAMP ürünlerinin (60 dakika) son nokta jel elektroforez taramalari %2 'lik bir Agaroz jel üzerinde gerçeklestirilmistir. Gösterildigi gibi, pozitif ve negatif reaksiyonlar arasinda ayri bir kolorimetrik tepki üreten bir pH göstergesi kresol kirmizisi olmustur. Ek olarak, fenol kirmizisi (NEB kolorimetrik RT-LAMP kitinde kullanilan pH göstergesi) ayrica, belirtilen baslangiç pH degerini saglamak için çözeltiye HCI ve KOH ilave edilmesinden kaynaklanan degisen baslangiç pH degerleri açisindan da degerlendirilmistir. Sekil 17L'de de gösterildigi gibi, çözeltide (pH göstergesi) pH 8,1, 8,5 ve 8,8'de Fenol kirmizisi ile RT-LAMP tespiti gerçeklestirilmistir. Sablon RNA ilave edilmeden önce HCI ve KOHoh ile ayarlamalar yapildi. SARS-CoV-2'nin N genini hedefleyen N.10 primer seti kullanilmistir. Pozitif reaksiyonlara, 0,2 ng/pL bir konsantrasyonda 5 pL in vitro kopyalanmis N gen RNA'si eklenmistir. Negatif reaksiyonlarda 5 uL nükleaz içermeyen su kullanilmistir. Reaksiyonlar, yukarida açiklandigi gibi 20 uL ana karisim ve 5 (L sablondan (pozitif) ya da nükleaz içermeyen sudan (negatif) olusmustur. 10 mL ana karisim, (NH, dNTP karisimi (28 mM her bir dNTP), tween 20 (%0,2 h/h) ile yapilmistir. Bu nedenle de fenol kirmizisi, kresol kirmizisi ile kiyaslandiginda pozitif ve negatif reaksiyonlar arasinda daha yüksek bir kontrast seviyesi ile sonuçlanmistir. Sonuç olarak, pH 6,5 civarinda bir renk degisikligine sahip olan pH göstergeleri en tutarli ve en kontrastli renk degisikligine (örnegin, Fenol kirmizisi) sahipti. ÖRNEK 19 - Baslangiç pH'inin kagit üzerindeki etkisi Kurutma isleminin prosesimize dahil edilmesinin renk stabilitesini degerlendirmek için, LAMP ana karisiminin pH'i 8,0, 8,5'e ayarlandi ya da ayarlanmamis olarak kaldi (örnegin, 7,6) ve yeniden sulandirma için kullanilan su ya da sentetik RNA (N geni, 0,2 ng/uL) da ayrica 8,0, 8,5'e ayarlandi ya da ayarlanmamis olarak kaldi (örnegin, 5,5). Sekil 18'de de gösterildigi gibi, pH 7,6, RT-LAMP reaksiyon karisiminin ayarlanmamis pH'idir. sentetik RNA(N geni, 0,2 ng/uL, '+') ya da su ('-') eklendigini göstermektedir. Kurutulmus kurulum, kagit seritlerin 20 uL LAMP ana karisimi uygulandiktan sonra oda sicakliginda 30 dakika süre ile kurumaya birakildigini ve daha sonra 25 uL sentetik RNA ('+') ya da su ('-') ile yeniden sulandirildigini göstermektedir. PH'in 8,0'a ayarlanmasi, negatif kontrollerde daha iyi bir renk stabilitesi ile sonuçlanirken, 8,5'Iik bir pH, 120 dakikalik inkübasyondan sonra standart ve kuru kurulumlarin fark edilebilir renk degisimine izin vermeyecek kadar yüksekti. pH ayarlanmadan birakildigi zaman, bir kontrol yüklendigi zaman bile renk degismistir. ÖRNEK 20 - Trehaloz ve Tween 20'nin RT-LAMP Kolorimetrik Yaniti Üzerindeki Etkisi Sekil 198, verili konsantrasyonda Trehaloz ya da Tween 20'nin dahil edildigi kolorimetrik RT- LAMP sonuçlarini göstermektedir. orf1ab.ll primer seti kullanilmistir. KCI (50 mM), MgSO4 (8 mM), esmolar dNTP karisimi (, WarmStart RTx (, Tween (%1 h/h, eger belirtilmis ise), Betain (20 mM), BSA (40 mg/mL) ve Trehaloz'dan (%10 a/h, eger belirtilmis ise) olusan baz formülasyonu ihtiva eden 20 uL RT-LAMP ana karisimi, Kalite 1 kromatografi kagidina (5 mm x 20 mm) ilave edilmistir ve 60 dakika boyunca bir PCR hazirlama basliginin içinde kurumaya birakilmistir. %25 islenmis tükürükte (pozitif reaksiyonlar) ya da nükleaz içermeyen suda (negatif reaksiyonlar) reaksiyon basina 1 x 105 kopya son konsantrasyonda 25 uL isi ile inaktive SARS-CoV-2 kuru reaksiyon pedlerine ilave edilmistir. Pedler, 65 °C'ye ayarlanmis olan bir inkübatörde 60 dakika boyunca isitilmis ve daha sonra bir düz yatakli tarayici kullanilarak taranmistir. Amonyum sülfatin dahil edilmesi, hiç sablon mevcut olmadigi zaman RT-LAMP reaktiflerinin kurutulmasi üzerine kirmizidan sariya bir renge neden olmustur. Bu renk degisikligi, fenol kirmizisi konsantrasyonunun arttirilmasi ve amonyum sülfatin betain ile degistirilmesi ile önlenmistir (Sekil 19A). Bundan baska olarak, trehaloz ve sigir serum albümini (BSA) ilavesi reaksiyon hizini artirmis ve LoD'yi arttirmistir (Sekil 198). Örnek Yapilanmalar Bir örnekte, pH'a duyarli bir boya ihtiva eden, pH'a bagli bir çikis sinyalini kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesim ve çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifi saglanmaktadir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, pH'a duyarli boya, fenol kirmizisi, fenolftalein, azolitmin, bromtimol mavisi, naftolftalein, kresol kirmizisi ya da bunlarin kombinasyonlarindan en az bir tanesi olabilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifleri, uçucu reaktifler, pH ile etkilesen reaktifler, magnezyum ile etkilesen reaktifler ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde ari olabilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifleri magnezyum, amonyum sülfat ya da amonyum karbonattan büyük ölçüde ari olabilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifi, DNA polimeraz, ters transkriptaz, hedef primerler ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva edebilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, bilesim ayrica bir antioksidan ihtiva edebilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, bilesim bundan baska olarak, tasiyici RNA, tasiyici DNA, RNaz inhibitörleri, DNaz inhibitörleri, guanidin hidroklorür ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, LAMP analizi ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) olabilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, bilesim bundan baska olarak, bir kati faz ortami ihtiva edebilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, bilesim bundan baska olarak, bir seker, bir tampon, bir bloke edici ajan ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva eden bir renk degistirmeyen katki maddesi içerebilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, bilesim bundan baska olarak, trehaloz, glikoz, sükroz, dekstran ya da bunlarin kombinasyonlarindan birini ya da birkaçini ihtiva eden bir seker içerebilir. pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesimin bir örneginde, bilesim bundan baska olarak, sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini ihtiva eden bir bloke edici ajan ihtiva edebilir. Bir örnekte, pH'a bagli bir çikis sinyali ile bir LAMP analizini gerçeklestirmeye yönelik asagidakileri ihtiva eden bir metot saglanmaktadir: bir kati faz ortami ve burada belirtildigi gibi bir bilesimin bir birlesiminin saglanmasi, bir biyolojik numunenin kati faz ortami üzerine birakilmasini ve birlesimin bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir izotermal sicakliga isitilmasi. Bir örnekte, pH'a bagli bir çikis sinyali ile bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik metot olup, biyolojik numune tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birkaçi olabilir. Bir örnekte, pH'a bagli bir çikis sinyali ile bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik metot olup, biyolojik numune tükürük olabilir. Bir örnekte, pH'a bagli bir çikis sinyali ile bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik metot olup, metot ayrica bir viral patojenin tespit edilmesini ihtiva edebilir. pH'a bagli bir çikis sinyali ile bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik metot olup, LAMP analizi ters transkripsiyon LAMP (RT-LAMP) olabilir. Bir örnekte, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik asagidakileri ihtiva eden bir metot saglanmaktadir: bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk bozulmasini en aza indiren bir reaktif karisiminin saglanmasi; ve LAMP reaksiyonunun gerçeklestirilmesi. Baska bir örnekte, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot olup, metot, LAMP olmayan bir reaksiyondan proton üretiminin kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Bir örnekte, pH'a bagli bir LAMBA analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot olup, metot, LAMP olmayan bir reaksiyondan oksidasyonun kontrol edilmesini ihtiva edebilir. Bir örnekte, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik, bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk bozulmasinin büyük ölçüde ortadan kaldirmasini ihtiva eden bir metot saglanmaktadir. Bir örnekte, pH'a bagli bir LAMP analizinde bir tespit sinirinin (LOD) en üst düzeye çikarilmasina yönelik, bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk bozulmasinin büyük ölçüde ortadan kaldirmasini ihtiva eden bir metot saglanmaktadir. Yukarida tarif edilen metotlarin sadece, mevcut bulusa ait yapilanmalari açiklamaya yönelik oldugu anlasilmalidir. Mevcut bulusun özünden ve kapsamindan ayrilmaksizin teknikte uzmanliga sahip olan kisiler tarafindan çok sayida modifikasyon ve alternatif düzenleme tasarlanabilmektedir ve ekte yer alan istemlerin bu tür modifikasyonlari ve düzenlemeleri kapsamasi amaçlanmaktadir. Dolayisi ile de mevcut bulus, halihazirda bulusun en fazla pratik ve en çok tercih edilen yapilanmalari olarak kabul edilenler ile baglantili olarak yukarida özellikle ve ayrintili bir sekilde tarif edilmis olsa da, teknikte siradan uzmanliga sahip olan kisiler için, burada ortaya konulan ilke ve kavramlardan ayrilmaksizin dahil olmak üzere varyasyonlarin yapilabilecegi anlasilacaktir. TR TR

Claims (22)

STEMLER pH'a bagli bir çikis sinyali kullanan döngü aracili izotermal amplifikasyon (LAMP) analizine yönelik bir bilesim olup, özelligi: pH'a duyarli bir boya; ve çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifi içermesidir.
1. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; pH'a duyarli boyanin, fenol kirmizisi, fenolftalein, azolitmin, bromtimol mavisi, naftolftalein, kresol kirmizisi ya da bunlarin kombinasyonlarindan en az bir tanesi olmasidir.
2. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifinin, uçucu reaktifler, pH ile etkilesen reaktifler, magnezyum ile etkilesen reaktifleri ya da bunlarin kombinasyonlarindan büyük ölçüde arindirilmis olmasidir.
3. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifinin, magnezyum, amonyum sülfat ya da amonyum karbonattan büyük ölçüde arindirilmis olmasidir.
4. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; çok sayida etkilesimde bulunmayan LAMP reaktifinin, DNA polimeraz, ters transkriptaz, hedef primerler ya da bunlarin kombinasyonlarini içermesidir.
5. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; ayrica bir antioksidan içermesidir.
6. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; ayrica tasiyici RNA, tasiyici DNA, RNaz inhibitörleri, DNaz inhibitörleri, guanidin hidroklorür ya da bunlarin kombinasyonlarini içermesidir.
7. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; LAMP analizinin ters transkripsiyon LAMP (RT-
8. LAMP) olmasidir.
9. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; ayrica bir kati faz ortamini içermesidir.
10. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; ayrica: bir seker, bir tampon, bir bloke etme maddesi ya da bunlarin kombinasyonlarini içeren bir renk degistirmeyen katki maddesi içermesidir.
11. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; sekerin; trehaloz, glikoz, sükroz, dekstran ya da bunlarin kombinasyonlarini içermesidir.
12. Istem 1'e göre bilesim olup, özelligi; bloke edici maddenin; sigir serum albümini, kazein ya da bunlarin kombinasyonlarini içermesidir. pH'a bagli bir çikis sinyali ile bir LAMP analizi gerçeklestirmeye yönelik bir metot olup, özelligi; bir kati faz ortaminin ve istem 1'de belirtildigi gibi bir bilesimin bir birlesiminin saglanmasini; bir biyolojik numunenin kati faz ortami üzerine birakilmasini; ve birlesimin bir LAMP reaksiyonunu kolaylastirmak üzere yeterli olan bir izotermal sicakliga isitilmasini içermesidir.
13. Istem 13'e göre metot olup, özelligi; biyolojik numunenin tükürük, mukus, kan, idrar, diski, ter, soluk verilen nefes kondensati ya da bunlarin kombinasyonlarindan biri ya da birkaçi olmasidir.
14. Istem 13'e göre metot olup, özelligi; burada biyolojik numunenin tükürük olmasidir.
15. Istem 13'e göre metot olup, özelligi; ayrica: viral bir patojen tespit edilmesini içermesidir.
16. Istem 13'e göre metot olup, özelligi; LAMP analizinin ters transkripsiyon LAMP (RT-
17. LAMP) olmasidir.
18. 18. pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot olup, özelligi; bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk degistirmeyi en aza indiren bir reaktif karisiminin saglanmasi; ve LAMP reaksiyonunun gerçeklestirilmesini içermesidir.
19. 19. Istem 18'e göre metot olup, özelligi; ayrica: LAMP disi bir reaksiyondan proton üretiminin kontrol edilmesini içermesidir.
20. 20. Istem 18'e göre metot olup, özelligi; ayrica: LAMP disi bir reaksiyondan oksidasyonun kontrol edilmesini içermesidir.
21. 21. pH'a bagli bir LAMP analizinde bir çikis sinyalinin dogrulugunu en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot olup, özelligi; bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk bozulmasinin büyük ölçüde ortadan kaldirilmasini içermesidir.
22. 22. pH'a bagli bir LAMP analizinde bir tespit seviyesini (LOD) en üst düzeye çikarmaya yönelik bir metot olup, özelligi: bir sinyal çikis ortamindan LAMP disi reaksiyonla üretilen renk bozulmasinin büyük ölçüde ortadan kaldirilmasini içermesidir.