CN112442101A - 寡核苷酸的合成方法、合成装置 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种寡核苷酸的合成方法、合成装置。该方法包括：在第一微阵列底板的亲水区加入第一化合物，通过亲水区中的羟基和第一化合物的羧基进行反应，得到包括羧基的第二化合物，并在该亲水区通过第二化合物和带有羟基的胸苷进行反应，在该亲水区得到合成的寡核苷酸。上述技术方案可以仅对底板进行一次修饰，即可合成寡核苷酸，能够提高寡核苷酸的合成效率，降低寡核苷酸的制作成本，使得整个操作流程耗时较短。
Description
技术领域
本申请涉及生物技术领域，并且更具体地，涉及寡核苷酸的合成方法、合成装置。
背景技术
寡核苷酸是近年来研究和了解新基因功能的重要载体物质，实现寡核苷酸合成具有重要意义及良好的市场前景。固相合成法是一种将反应物连接在一个不溶性的固相载体上的一种合成方法。
目前，亚磷酰胺单体固相合成法是主流的一种合成寡核苷酸的方法。现有的亚磷酰胺单体固相合成法中，需要对合成寡核苷酸的固相载体进行修饰，同时，还需要对亚磷酰胺单体进行琥珀酸修饰。现有技术中，需要进行两次修饰，使得整个操作流程耗时较长，制作成本较高，合成效率较低。
因此，如何更高效的合成寡核苷酸，提高寡核苷酸的合成效率成为当前亟需要解决的问题。
发明内容
本申请提供一种寡核苷酸的合成方法、合成装置，能够提高寡核苷酸的合成效率，降低寡核苷酸的制作成本，使得整个操作流程耗时较短。
第一方面，提供了一种寡核苷酸的合成方法，该方法包括：对底板进行处理，得到第一微阵列底板，该底板包括亲水区，在该亲水区加入第一化合物，通过亲水区中的羟基和第一化合物的羧基进行反应，得到包括羧基的第二化合物，并在该亲水区通过第二化合物和带有羟基的胸苷进行反应，在该亲水区得到合成的寡核苷酸。
应理解，该亲水区中包括羟基，该第一化合物和第二化合物均为包括羧基的化合物。
上述技术方案中，通过在第一微阵列底板的亲水区加入第一化合物对该底板进行修饰，使得该第一微阵列底板上暴露出羧基，从而可以通过该羧基直接与胸苷中的羟基进行反应，合成寡核苷酸。本申请中仅对底板进行一次修饰，即可合成寡核苷酸，能够提高寡核苷酸的合成效率，降低寡核苷酸的制作成本，使得整个操作流程耗时较短。
在一种可能的实现方式中，所述方法还包括：在所述第一微阵列底板的亲水区加入溴异丁酰溴BIBB溶液，并在所述亲水区中与所述第一化合物发生原子转移自由基聚合ATRP反应，生成所述第二化合物。
上述技术方案中，通过ATRP反应实现亲水区的一个羟基上可以枝接多个羧基，该多个羧基可以合成多个寡核苷酸，从而提高寡核苷酸的合成效率。
在另一种可能的实现方式中，所述第一化合物为聚丙烯酸。
上述技术方案中，聚丙烯酸的结构较简单，从而可以更容易实现寡核苷酸的合成。
在另一种可能的实现方式中，所述方法还包括：对所述第二微阵列底板的亲水区进行氨水解处理，得到寡核苷酸和带有氨基的第三微阵列底板。
上述技术方案中，可以通过氨水解的方式将寡核苷酸从底板的亲水区中剥离，得到寡核苷酸。
在另一种可能的实现方式中，所述方法还包括：在所述带有氨基的第三微阵列底板上加入碳酸钠-甲醇溶液，得到所述第一微阵列底板。
上述技术方案中，可以通过加入碳酸钠-甲醇溶液得到第一微阵列底板，在下一次合成寡核苷酸的过程中，可以直接使用第一微阵列底板中亲水区中包括的羟基进行合成，避免制作包括亲水区的第一微阵列底板，实现第一微阵列底板的重复利用。
在另一种可能的实现方式中，所述第一微阵列底板还包括疏水区，对所述底板表面进行疏水处理，使得所述底板表面具有疏水区；对所述疏水层表面进行亲水处理，使得所述疏水层的表面具有亲水区；将模具覆盖在所述底板的亲水区的表面，所述模具为带有凸起的微阵列，所述模具的凸起与所述亲水区的部分接触；将所述模具从所述亲水区剥离，使得所述底板上与所述模具的凸起接触的部分暴露出所述疏水区，形成所述第一微阵列底板。
在另一种可能的实现方式中，所述第一微阵列底板还包括疏水区，将模具与所述底板接触，所述模具为带有凸起的微阵列，所述模具的凸起为亲水区，所述模具的凸起与所述底板接触；对所述底板中未与所述模具的凸起接触的部分进行疏水处理；将所述模具从所述底板剥离，形成所述第一微阵列底板，其中，所述第一微阵列底板上与所述模具的凸起接触的部分为所述亲水区，所述第一微阵列底板上未与所述模具的凸起接触的部分为所述疏水区。
在另一种可能的实现方式中，所述模具为聚二甲基硅氧烷PDMS模具。
在另一种可能的实现方式中，所述方法还包括：通过光刻法在器皿上制备微阵列区域；将聚二甲基硅氧烷PDMS倒在所述微阵列区域上进行固化；将固化的所述PDMS从所述器皿上剥离，得到所述PDMS模具。
上述技术方案中，PDMS是一种疏水类的有机硅聚合物，其分子量极高具有弹性，通过PDMS制作的PDMS模具可以与底板之间的粘粘性较好，较容易制作亲疏水相间的微阵列底板。
在另一种可能的实现方式中，对所述模具进行等离子处理，使得所述模具的凸起为亲水区。
上述技术方案中，等离子体处理技术是采用等离子表面处理机对模具凸起的表面进行一定的物理化学改性，提高表面附着力，使它能和普通纸张一样容易粘结。
在另一种可能的实现方式中，将所述底板和疏水剂接触，并进行蒸镀处理，使得所述底板表面具有疏水区。
上述技术方案中，蒸镀，是使用较早、用途较广泛的气相沉积技术，具有成膜方法简单、薄膜纯度和致密性高、膜结构和性能独特等优点。
在另一种可能的实现方式中，通过多巴胺溶液对所述疏水层表面进行处理，使得所述疏水层表面具有亲水区。
上述技术方案中，多巴胺溶液稳定性好，水分散性强，生物相容性优秀。常温下即可生成。多巴胺溶液含有大量的羟基基团，较容易形成包括羟基基团的亲水区。
第二方面，提供了一种寡核苷酸的合成装置，包括处理器和存储器，其中该存储器用于存储计算机程序，该处理器用于从存储器中调用并运行该计算机程序，使得该寡核苷酸的合成装置执行第一方面或第一方面任意一种可能的实现方式中的方法。
可选地，该处理器可以是通用处理器，可以通过硬件来实现也可以通过软件来实现。当通过硬件实现时，该处理器可以是逻辑电路、集成电路等；当通过软件来实现时，该处理器可以是一个通用处理器，通过读取存储器中存储的软件代码来实现，该存储器可以集成在处理器中，可以位于该处理器之外，独立存在。
第三方面，提供了一种计算机程序产品，该计算机程序产品包括：计算机程序和/或代码，当该计算机程序和/或代码在计算机上运行时，使得计算机执行上述第一方面或第一方面任意一种可能的实现方式中的方法。
第四方面，提供了一种计算机可读介质，该计算机可读介质存储有程序和/或代码，当该计算机程序和/或代码在计算机上运行时，使得计算机执行上述执行第一方面或第一方面任意一种可能的实现方式中的方法。
附图说明
图1是本申请实施例提供的一种寡核苷酸的合成方法的示意性流程图。
图2是本申请提供的一种制备模具的方法的示意性流程图。
图3是本申请提供的一种制备亲水点大小可控的亲疏水相间的微阵列底板的方法的示意性流程图。
图4是本申请提供的一种亲疏水相间的微阵列底板的示意性结构图。
图5是本申请提供的另一种制备亲水点大小可控的亲疏水相间的微阵列底板的方法的示意性流程图。
图6是本申请提供的另一种亲疏水相间的微阵列底板的示意性结构图。
图7是本申请实施例提供的一种合成寡核苷酸的方法的示意性流程图。
图8是本申请实施例提供的另一种合成寡核苷酸的方法的示意性流程图。
图9是本申请实施例提供的一种寡核苷酸的合成装置的硬件结构示意图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本申请中的技术方案进行描述。
脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)是一种生物大分子，可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。寡核苷酸是一段较短的DNA链，寡核苷酸是近年来研究和了解新基因功能的重要载体物质，寡核苷酸的合成技术已成为分子生物学研究必不可少的手段。合成的产物可作为探针、引物、连接子和接头等用途，或用于制造基因芯片。基因芯片现已经成为一种有效的基础及临床医学研究办法，可以支持一次性检测几万种基因表达水平或者百万个DNA遗传标记，为科研和临床工作者提供了强大的技术平台。广泛用于药物筛选，药物代谢与毒理，细菌基因组研究以及植物基因调控等各个方向。因此，实现高通量的寡核苷酸合成具有重要意义及良好的市场前景。
本申请实施例提供的寡核苷酸的合成方法，可以能够提高寡核苷酸的合成效率。降低寡核苷酸的制作成本，使得整个操作流程耗时较短。下面结合图1，对寡核苷酸的合成方法进行详细描述。
图1是本申请实施例提供的一种寡核苷酸的合成方法的示意性流程图，该方法包括步骤110-120，下面分别对步骤110-120进行详细描述。
步骤110：在第一微阵列底板的亲水区加入第一化合物，该第一微阵列底板的亲水区中的羟基和所述第一化合物反应，在所述亲水区中生成第二化合物，所述第一化合物和所述第二化合物为包括羧基的化合物。
在合成寡核苷酸的过程中，需要带有羟基的化合物和带有羧基的化合物进行反应。本申请实施例中可以对第一微阵列底板中包括羟基的亲水区进行修饰，使得该亲水区暴露羧基，从而可以直接和包括羟基的胸苷进行反应，在该第一微阵列底板的亲水区中合成寡核苷酸。
有关实现该亲水区暴露羧基的方式有多种，本申请实施例对此不做具体限定。作为一个示例，可以在第一微阵列底板的亲水区加入包括羧基的第一化合物，使得在该亲水区生成包括羧基的第二化合物。作为另一个示例，还可以在第一微阵列底板的亲水区中选用溴异丁酰溴BIBB溶液作为大分子引发剂，在通过该亲水区中的羟基和包括羧基的第一化合物发生原子转移自由基聚合(atom transfer radical polymerization，ATRP)反应，使得在该亲水区生成包括羧基的第二化合物。
本申请实施例对第一化合物不做具体限定，该第一化合物需要包括一个羧基基团即可。作为一个示例，该第一化合物为聚丙烯酸。作为另一个示例，该第一化合物为甲基丙烯酸或2-(三氟甲基)丙烯酸。
步骤120：通过所述第二化合物和胸苷发生反应，在所述第一微阵列底板的亲水区合成寡核苷酸，得到第二微阵列底板，其中，所述胸苷带有羟基，所述第二微阵列底板的亲水区中包括所述寡核苷酸。
在第一微阵列底板的亲水区，该亲水区中暴露的羧基基团可以直接和包括羟基的胸苷进行反应，从而在该第一微阵列底板的亲水区合成寡核苷酸。具体的合成过程，下面会结合具体的反应过程进行描述，此处不再赘述。
本申请实施例中，通过在第一微阵列底板的亲水区加入第一化合物对该底板进行修饰，使得该第一微阵列底板上暴露出羧基，从而可以通过该羧基直接与胸苷中的羟基进行反应，合成寡核苷酸。本申请中仅对底板进行一次修饰，即可合成寡核苷酸，能够提高寡核苷酸的合成效率，降低寡核苷酸的制作成本，使得整个操作流程耗时较短。
可选的，本申请实施例中还包括对底板进行处理，得到上述第一微阵列底板。
本申请实施例中的底板是可以合成寡核苷酸的固相载体，该固相载体可以包括但不限于：硅片、玻璃。
可选地，在一些实施例中，为了避免第一微阵列底板的亲水区上的多个寡核苷酸之间的交叉感染，该第一微阵列底板可以是一种亲疏水相间的微阵列底板。也就是说，在第一微阵列底板的各个亲水区之间可以通过疏水区相隔开。具体的，可以制备一种微阵列模具，通过该模具和底板进行亲水和/或疏水处理，得到亲疏水相间的微阵列底板。该亲疏水相间的微阵列底板进行寡核苷酸的合成，可以避免亲水区上的多个寡核苷酸之间的交叉感染。
本申请实施例提供的一种亲疏水相间的微阵列底板，其亲疏水分区明确。且亲水区的亲水点大小可控，亲水点直径可微缩至微米级，单位面积内合成的寡核苷酸数量较多，从而可以增加合成密度，提高反应效率。
制备亲水点大小可控的亲疏水相间的微阵列底板的具体实现方式有多种，本申请实施例对此不做具体限定。下面会分别通过图3-图6，对本申请实施例中制备亲水点大小可控的亲疏水相间的微阵列底板的过程进行详细描述。
应理解，图3-图6所示的例子仅仅是为了帮助本领域技术人员理解本申请实施例，而非要将申请实施例限制于所示例的具体数值或具体场景。本领域技术人员根据所给出的图3-图6的例子，显然可以进行各种等价的修改或变化，这样的修改和变化也落入本申请实施例的范围内。
需要说明的是，图3-图6的方法均是通过模具和底板制备亲水点大小可控的亲疏水相间的微阵列底板。为了便于描述，下面先结合图2，对制备模具的方法进行详细描述。
图2是本申请提供的一种制备模具的方法的示意性流程图。该方法可以包括步骤210-240，下面分别对步骤210-240进行详细描述。
应理解，为了便于说明，图2中以模具为聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)模具为了进行描述。
步骤210：在器皿上进行光刻处理形成微坑阵列。
具体地，可以将光刻胶涂覆在器皿表面，利用曝光显影工艺将掩膜版上的图形复制到光刻胶上，暴露出需要被刻蚀的部分。最后利用刻蚀技术在硅片上刻蚀出微坑阵列，用等离子去胶工艺去除残胶。应理解，微坑阵列的排布可以是相同或不同直径微坑呈周期性排布。
可选地，在一些实施例中，该器皿为硅片。
本申请实施例中，通过光刻技术得到微阵列模具，阵列尺寸可以到微米级，具有高密度和高精度而且尺度可控。
步骤220：聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)模具的制备。
本申请实施例中可以将PDMS倒在步骤210中制备的微坑阵列上，并进行固化，将固化之后的PDMS从微坑阵列上器皿上剥离，得到PDMS模具。
具体的，可以通过使用某种液态硅氧烷与固化剂按照一定比例混合得到PDMS。作为一个示例，可以使用Sylgard 184硅氧烷和固化剂重量比为10：1制备PDMS。之后，可以将制备的PDMS倒在器皿(例如，硅片)上，使得PDMS填充微坑并将硅片覆盖，并放入烘箱中在一定条件下加热一段时间使其固化。作为一个示例，可以放入65℃烘箱中加热2h使其固化。
可选地，在一些实施例中，还可以通过真空处理消除PDMS中以及PDMS和硅片接触界面的气泡。
应理解，固化剂是一类增进或控制固化反应的物质或混合物，在本申请中可使用一种或多种固化剂，对种类不做具体限定。
还应理解，在烘箱中的加热温度和固化时间，视实际固化情况而定，在此不做限定。
本申请实施例中，聚二甲基硅氧PDMS是有机硅的一种，因其成本低，使用简单，同硅片之间具有良好的粘附性，因此，可以较好的与底板粘粘。
步骤230：将固化后的PDMS从器皿上剥离得到PDMS模具。
从器皿上剥离得到的PDMS模具为包括多个凸起的微阵列。
可选地，在一些实施例中，图2所示的方法还可以包括步骤240。
步骤240：对PDMS模具进行表面处理，使得PDMS模具凸起的表面暴露羟基。
本申请实施例中还可以对PDMS模具的凸起表面进行处理，使得该凸起表面为亲水区。也就是说，对PDMS模具的凸起表面进行处理之后，该凸起表面可以暴露出羟基。具体的实现方式有多种，一种可能的实现方式中，对PDMS模具的凸起表面进行等离子体(plasma)处理，使得PDMS模具的凸起表面为亲水区。具体的，可以将制备好的PDMS模具放入等离子体仪器中进行2min等离子体处理。
应理解，等离子体(plasma)是一种由自由电子和带电离子为主要成分的物质形态，采用等离子表面处理机对PDMS模具进行一定的物理化学改性，提高表面附着能力。
图3是本申请提供的一种制备亲水点大小可控的亲疏水相间的微阵列底板的方法的示意性流程图。该方法可以包括步骤310-340，下面分别对步骤310-340进行详细描述。
可选地，在一些实施例中，图3所示的方法可以包括步骤310。
步骤310：对底板进行清洗。
本申请实施例中，为避免操作过程中引入杂物，可以对底板进行清洗。
可选的，作为一个实施例，利用超声波的方法对底板进行清洗。具体的，可以先用去离子水超声30min，再用酒精超声30min，最后再用去离子水超声30min，将底板放入烘箱中烘干。
步骤320：将制备好的PDMS模具覆盖在底板上，并对覆盖PDMS模具的底板进行疏水处理。
本申请实施例中可以施加一定压力将图2中制备好的PDMS模具紧贴于底板上，使得PDMS模具的凸起部分与底板接触。
本申请实施例中由于PDMS模具的凸起部分与底板接触，可以对底板中未与PDMS模具的凸起接触的部分进行疏水处理，使得底板中未与PDMS模具的凸起接触的部分为疏水区。
疏水处理的方法有多种，本申请实施例对此不做具体限定。作为一个示例，可以通过蒸镀的方法使得底板中未与PDMS模具的凸起接触的部分形成疏水区。作为另一个示例，可以将疏水剂通过压力浸渍的方式附着在底板中未与PDMS模具的凸起接触的部分，使得该未与PDMS模具的凸起接触的部分形成疏水区。
以进行蒸镀处理从而形成疏水区为例。作为一个示例，可以将被PDMS模具覆盖的底板和疏水溶液放入同一个密封的器皿中加热至完全挥发，在底板表面蒸镀。使得底板中未与PDMS模具的凸起接触的部分形成疏水区。
本申请实施例对进行蒸镀的疏水溶液不做不做具体限定，可以包括但不限于：二氯甲烷溶解的1H,1H,2H,2H,-全氟癸基三乙氧基硅烷、六甲基二硅氮烷、十八烷基三氯硅烷、二甲基二氯硅烷等。
具体的，以疏水溶液为二氯甲烷溶解的1H,1H,2H,2H,-全氟癸基三乙氧基硅烷为例。可以将5mL二氯甲烷和占总体积1％的1H,1H,2H,2H,-全氟癸基三乙氧基硅烷混合于10mL离心管中，振荡，混匀。并将混合液和被PDMS模具覆盖的底板放入同一个密封的器皿中，放到65℃烘箱中加热2h，直到混合液完全挥发。应理解，所使用有机物的含量以及蒸镀温度和蒸镀时间视情况而定，在此不做限定。
应理解，蒸镀也可以称为真空蒸镀，指在真空条件下，采用一定的加热蒸发方式蒸发镀膜材料(或称膜料)并使之气化，粒子飞至基片表面凝聚成膜的工艺方法。蒸镀是使用较早、用途较广泛的气相沉积技术，具有成膜方法简单、薄膜纯度和致密性高、膜结构和性能独特等优点。
以通过压力浸渍的方式形成疏水区为例。作为一个示例，可以将疏水剂与有机溶剂按一定比例的混合液通过压力浸渍法附在底板中未与PDMS模具的凸起接触的部分，使得底板中未与PDMS模具的凸起接触的部分形成疏水区。其中，疏水剂可以是全氟类基兰甲氧基硅皖、十八皖基兰氯硅皖、十八皖基兰甲氧基硅皖、十六皖基兰乙氧基硅皖、己基兰乙氧基硅院或辛基兰氯硅院中的一种或多种以任意比例混合。有机溶剂可以是二氯甲烷、三氯乙烯、乙醇、异丙醇、正己烷、丙酮、四氢呋喃中的一种或多种以任意比例进行混合。
具体的，以疏水剂为十八皖基兰氯硅皖，有机溶剂为三氯乙烯为例。可以将5mL三氯乙烯和占总体积1％的十八皖基兰氯硅皖混合于10mL离心管中，振荡，混匀。并可以将混合液和被PDMS模具覆盖的底板放入同一个密封的器皿中，放到65℃烘箱中加热2h，直到混合液完全挥发。
步骤330：将PDMS模具从底板上剥离。
本申请实施例中，在对底板中未与PDMS模具的凸起接触的部分进行处理，使得该未与PDMS模具的凸起接触的部分形成疏水区之后，可以将PDMS模具从底板上剥离。由于PDMS模具的凸起部分为亲水区，底板中与PDMS模具的凸起接触的部分未被疏水处理，因此，该底板中凸起的部分(区域1)为疏水区。
PDMS模具的凸起部分为亲水区，PDMS模具的凸起部分暴露的羟基附着在底板中与PDMS模具的凸起接触的部分，因此，该底板中与PDMS模具的凸起接触的部分为亲水区。
可选地，在一些实施例中，图3所示的方法还可以包括步骤340。
步骤340：对底板中与PDMS模具的凸起接触的微坑区域进行亲水处理，形成亲疏水相间的微阵列底板。
可选地，在一些实施例中，由于PDMS模具的凸起部分暴露的羟基附着在底板的部分较少，因此，还需要对底板中的微坑区域(区域2)做进一步的亲水处理。
具体的，作为一个实施例，可以吸取一定量的3％的氢氧化钠溶液，通过刮膜的方法将氢氧化钠均匀覆盖在底板上。由于疏水层的存在，氢氧化钠会在底板上形成的液滴阵列只在亲水区停留，使得底板中的微坑区域(区域2)为亲水区，该亲水区暴露羟基，从而获得亲疏水相间的微阵列底板。
可选地，在一些实施例中，还可以通过滴加矿物油至底板表面防止液滴挥发。微坑区域(区域2)中的每个液滴皆可作为独立的微反应器，可以同时对多个核酸序列进行合成和高通量平行分析。
通过上述图3所示的方法对底板进行处理，得到亲疏水相间的微阵列底板如图4所示。参见图4，亲疏水相间的微阵列底板上凸起的部分为疏水区，微阵列底板上的微坑部分(凹下去的部分)为亲水区。
图5是本申请提供的另一种制备亲水点大小可控的亲疏水相间的微阵列底板的方法的示意性流程图。该方法可以包括步骤510-540，下面分别对步骤510-540进行详细描述。
步骤510：对底板表面进行疏水处理，使得该底板表面为疏水区。
本申请实施例中对底板表面进行疏水处理的方法有多种，作为一个示例，可以通过蒸镀的方法使得底板表面形成疏水区。作为另一个示例，可以将疏水剂通过压力浸渍的方式附着在底板上，使得底板表面形成疏水区。上述进行疏水处理的方法与步骤330中对覆盖PDMS模具的底板进行疏水处理的过程类似，具体的请参考步骤330中的描述，此处不再赘述。
步骤520：对底板上的疏水区进行处理，使得该疏水区的表面为亲水区。
本申请实施例中通过多巴胺溶液对疏水区的表面进行处理，使得该疏水区的表面为亲水区。具体的，作为示例，可以将底板上的疏水区浸没至2mg/mL的多巴胺溶液中沉积数小时。多巴胺可以沉积在底板上的疏水区表面，从而完成该表面的改性，使得该疏水区的表面为亲水区。
可选地，作为示例，本申请实施例还可以通过如下步骤制备多巴胺溶液：通过配制pH＝8.6的Tris-HCl缓冲液，使用该缓冲液配制2mg/mL的多巴胺溶液。
本申请实施例中通过多巴胺进行亲水处理，多巴胺稳定性好，水分散性强，生物相容性优秀，常温下即可生成。
步骤530：将制备好的PDMS模具覆盖在底板上的亲水区。
本申请实施例中可以施加一定压力将图2中制备好的PDMS模具紧贴于底板上，使得PDMS模具的凸起部分与底板上的亲水区接触。
步骤540：移除PDMS模具，形成亲疏水相间的微阵列底板。
移除PDMS模具，会移除底板的亲水区上与该PDMS模具的凸起接触的多巴胺，使得PDMS模具的凸起接触的部分暴露出下面的疏水区(区域1)，PDMS模具与底板未接触的部分仍然留有多巴胺，这部分为亲水区(区域2)，从而形成亲疏水相间的微阵列底板。该亲疏水相间的微阵列底板上呈现出周期性排列的亲水点阵列。
通过上述图5所示的方法对底板进行处理，得到亲疏水相间的微阵列底板如图6所示。参见图6，亲疏水相间的微阵列底板上凸起的部分为亲水区，微阵列底板上的微坑部分(凹下去的部分)为疏水区。
在寡核苷酸的合成过程中，可以通过微阵列底板的亲水区暴露的羟基进行合成。为了便于描述，下面以图4或图6所示的微阵列底板为例，结合图7-图8对合成寡核苷酸的过程进行详细描述。
图7是本申请实施例提供的一种合成寡核苷酸的方法的示意性流程图，如图7所示，该合成寡核苷酸的方法可以包括步骤710-760，下面分别对步骤710-760进行详细描述。
步骤710：通过3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)对微阵列底板的亲水区进行处理。
本申请实施例中可以选用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)对微阵列底板的亲水区进行处理，使得微阵列底板的亲水区中暴露的羟基(-OH)和加入的APTES(H2N(CH2)3Si(OC2H5)3)进行反应，得到末端为氨基的微阵列底板。
具体的，作为示例，可以将微阵列底板置于2％的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，室温浸泡过夜。并用大量乙醇冲洗底板，通过氮气吹干，得到末端为氨基的微阵列底板。
需要说明的是，本申请实施例对微阵列底板暴露的羟基(-OH)的个数不做具体限制。为了便于说明，图7中以微阵列底板上暴露出六个羟基(-OH)为例进行描述。
步骤720：通过丁二酸酐甲苯溶液对末端为氨基的微阵列底板进行处理。
本申请实施例中可以选用丁二酸酐(C4H4O3)甲苯溶液对末端为氨基的微阵列底板进行处理，得到末端为羧基(-COOH)的微阵列底板。具体的，作为示例，可以将末端为氨基的微阵列底板置于100微摩尔的丁二酸酐甲苯溶液中，室温浸泡24小时。并依次通过甲苯和乙醇冲洗微阵列底板。最后用氮气吹干，得到末端为羧基(-COOH)的微阵列底板。
应理解，丁二酸酐(C4H4O3)甲苯溶液可以对应于上文中的第一化合物，通过第一化合物对微阵列底板进行处理，得到末端为羧基(-COOH)的化合物可以对应于上文中的第二化合物。并可以通过微阵列底板上暴露出的羧基(-COOH)与胸苷中的羟基(-OH)发生反应。
步骤730：在末端为羧基(-COOH)的微阵列底板上加入胸苷，得到末端为5端带DMT基团的脱氧核苷酸底板。
本申请实施例中可以在步骤720中得到的末端为羧基(-COOH)的微阵列底板的亲水区加入胸苷，微阵列底板中的羧基(-COOH)与胸苷中的羟基(-OH)发生缩合反应，得到末端为5端带DMT基团的脱氧核苷酸底板。
步骤740：寡核苷酸的合成，得到带有寡核苷酸的微阵列底板。
本申请实施例中通过寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)，使得步730中得到的微阵列底板的亲水区中合成寡核苷酸，此时，微阵列底板为带有寡核苷酸的微阵列底板。
步骤750：对带有寡核苷酸的微阵列底板进行氨水解处理，得到寡核苷酸产物和带有氨基的微阵列底板。
本申请实施例中可以对步骤740中的带有寡核苷酸的微阵列底板的亲水区加入氨水，得到带有氨基的微阵列底板以及寡核苷酸产物。具体的，作为示例，可以在步骤740中的微阵列底板的亲水区加入30％的氨水，使得合成的寡核苷酸从微阵列底板上脱落，得到寡核苷酸产物。
可选地，通过图7所示的步骤710-750，得到寡核苷酸产物和带有氨基的微阵列底板之后，还可以通过步骤760对带有氨基的微阵列底板进行回收，使得微阵列底板的亲水区包括羟基(-OH)。在下一次合成寡核苷酸的过程中，可以直接在包括羟基(-OH)的微阵列底板的亲水区中合成寡核苷酸，而不需要再一次制作包括亲水区的微阵列底板。下面结合步骤760对微阵列底板的回收过程进行详细描述。
步骤760：在带有氨基的微阵列底板上加入碳酸钠-甲醇溶液，得到包括羟基(-OH)的微阵列底板。
本申请实施例中可以在带有氨基的微阵列底板上加入碳酸钠-甲醇溶液，得到包括羟基(-OH)的微阵列底板。具体的，作为示例，可以将带有氨基的微阵列底板浸于碳酸钾—甲醇溶液中充分搅拌，而后用甲醇冲洗。可选地，最后还可以进一步通过高温热解去除杂质，得到原始的微阵列底板，该微阵列底板包括亲水区，该亲水区中包括羟基(-OH)。
上述微阵列底板回收的过程，可以实现对固相载体的回重复利用，显著降低有机物合成的成本。
图8是本申请实施例提供的另一种合成寡核苷酸的方法的示意性流程图，如图8所示，该合成寡核苷酸的方法可以包括步骤810-860，下面分别对步骤810-860进行详细描述。
步骤810：对微阵列底板的亲水区进行BIBB处理。
本申请实施例中可以选用2-溴异丁酰溴(BIBB)用于大分子引发剂的合成，将微阵列底板置于四氢呋喃和三乙胺混合液中，并加入2-溴异丁酰溴(BIBB)。具体的，作为示例，可以在四氢呋喃和三乙胺混合液中加入1mL BIBB常温搅拌2小时后，将微阵列底板拿出，并通过氮气吹干。
经过2-溴异丁酰溴(BIBB)处理之后，该微阵列底板的亲水区中暴露的羟基(-OH)和加入的2-溴异丁酰溴(BIBB)进行反应，使得微阵列底板为固定了烷基溴引发基团的微阵列底板。应理解，一个亲水点可以理解为一个羟基(-OH)，一个羟基(-OH)可以和2-溴异丁酰溴(BIBB)反应生成一个烷基溴引发基团。
需要说明的是，本申请实施例对微阵列底板暴露的羟基(-OH)的个数不做具体限制。为了便于说明，图8中以微阵列底板上暴露出两个羟基(-OH)为例进行描述。
应理解，步骤810得到的固定了烷基溴引发基团的微阵列底板为可用于后续表面引发的原子转移自由基聚合ATRP的BIBB固定化微阵列底板。
步骤820：通过ATRP反应在微阵列底板的亲水区枝接聚丙烯酸。
本申请实施例中可以在步骤810中得到的固定了烷基溴引发基团的微阵列底板上通过ATRP枝接聚丙烯酸。具体的，作为示例，可以将聚丙烯酸单体用NaOH溶液中和至PH＝10.4，加入适量NaCl，并将CuBr2和联吡啶混合。并将步骤810中得到的微阵列底板放置于上述混合液中，室温聚合2-6小时。
聚丙烯酸经过ATRP反应之后，步骤810中得到的固定了烷基溴引发基团的微阵列底板和加入的聚丙烯酸的混合液反应之后，使得微阵列底板变成了末端为聚丙烯酸分子刷的微阵列底板。该末端为聚丙烯酸分子刷的微阵列底板中可以包括至少一个羧基(-COOH)。
上述通过ATRP反应，可以在微阵列底板的一个亲水点上生成多个羧基(-COOH)，每个羧基(-COOH)均可以合成一个寡核苷酸，从而提高合成寡核苷酸的效率，增大产量。
应理解，通过对微阵列底板进行BIBB处理，再通过ATRP反应枝接聚丙烯酸，可以得到末端为聚丙烯酸分子刷的化合物。其中，聚丙烯酸可以对应于上文中的第一化合物，末端为聚丙烯酸分子刷的化合物可以对应于上文中反应得到的第二化合物。并可以通过微阵列底板上暴露出的羧基(-COOH)与胸苷中的羟基(-OH)发生反应。
步骤830：末端为聚丙烯酸分子刷的微阵列底板和胸苷发生缩合反应。
本申请实施例中可以在步骤820中得到的末端为聚丙烯酸分子刷的微阵列底板的亲水区加入胸苷，聚丙烯酸分子刷的微阵列底板中包括的多个羧基(-COOH)分别与胸苷中的羟基(-OH)发生缩合反应。
上述缩合反应中，末端为聚丙烯酸分子刷的微阵列底板和加入的胸苷中的羟基(-OH)反应之后，使得微阵列底板变为末端为5端带有对苯二甲酸二甲酯(dimethylterephthalate，DMT)基团的脱氧核苷酸底板。
步骤840：寡核苷酸的合成，得到带有寡核苷酸的微阵列底板。
本申请实施例中通过寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)，使得步骤830中得到的微阵列底板的亲水区中合成寡核苷酸，此时，微阵列底板为带有寡核苷酸的微阵列底板。
步骤850：对带有寡核苷酸的微阵列底板进行氨水解处理，得到寡核苷酸产物和带有氨基的微阵列底板。
本申请实施例中可以对步骤840中的带有寡核苷酸的微阵列底板的亲水区加入氨水，得到带有氨基的微阵列底板以及寡核苷酸产物。具体的，作为示例，可以在步骤840中的微阵列底板的亲水区加入30％的氨水，使得合成的寡核苷酸从微阵列底板上脱落，得到寡核苷酸产物。
可选地，通过图8所示的步骤810-850，得到寡核苷酸产物和带有氨基的微阵列底板之后，还可以通过步骤860对带有氨基的微阵列底板进行回收，使得微阵列底板的亲水区包括羟基(-OH)。在下一次合成寡核苷酸的过程中，可以直接在包括羟基(-OH)的微阵列底板的亲水区中合成寡核苷酸，而不需要再一次制作包括亲水区的微阵列底板。下面结合步骤860对微阵列底板的回收过程进行详细描述。
步骤860：在带有氨基的微阵列底板上加入碳酸钠-甲醇溶液，得到包括羟基(-OH)的微阵列底板。
本申请实施例中可以在带有氨基的微阵列底板上加入碳酸钠-甲醇溶液，得到包括羟基(-OH)的微阵列底板。具体的，作为示例，可以将带有氨基的微阵列底板浸于碳酸钾—甲醇溶液中充分搅拌，而后用甲醇冲洗。可选地，最后还可以进一步通过高温热解去除杂质，得到原始的微阵列底板，该微阵列底板包括亲水区，该亲水区中包括羟基(-OH)。
上述微阵列底板回收的过程，可以实现对固相载体的回重复利用，显著降低有机物合成的成本。
图9是本申请实施例提供的一种寡核苷酸的合成装置900的硬件结构示意图。如图9所示，所述寡核苷酸的合成装置900包括处理器901、存储器902和总线903。上述处理器901、存储器902通过总线903连接。
存储器902还可以包括操作系统和应用程序，用于存储程序、代码或指令，当处理器执行这些程序、代码或指令时可以完成方法实施例中涉及寡核苷酸的合成装置的处理过程。可选的，所述存储器902可以包括只读存储器(read-only memory，ROM)和随机存取存储器(random access memory，RAM)。其中，所述ROM包括基本输入/输出系统(basic input/output system，BIOS)或嵌入式系统；所述RAM包括应用程序和操作系统。当需要运行寡核苷酸的合成装置900时，通过固化在ROM中的BIOS或者嵌入式系统中的bootloader引导系统进行启动，引导寡核苷酸的合成装置900进入正常运行状态。在寡核苷酸的合成装置900进入正常运行状态后，运行在RAM中的应用程序和操作系统，从而，完成方法实施例中涉及寡核苷酸的合成装置900的处理过程。
可以理解的是，图9仅仅示出了寡核苷酸的合成装置900的简化设计。在实际应用中，寡核苷酸的合成装置也可以包含任意数量的处理器或者存储器。应理解，方法实施例的描述与装置实施例的描述相互对应，因此，未详细描述的部分可以参见前面方法实施例。
本申请实施例还提供了计算机可读介质，用于存储计算机程序，该计算机程序包括用于执行上述任一方面的任意可能的实现方式中的方法的指令。该可读介质可以是只读存储器(read-only memory，ROM)或随机存取存储器(random access memory，RAM)，本申请实施例对此不做限制。
本申请实施例还提供了一种计算机程序产品，应用于寡核苷酸的合成装置中，该计算机程序产品包括：计算机程序代码，当该计算机程序代码被计算机运行时，使得该计算机执行上述任一方面的任意可能的实现方式中的方法。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
本领域普通技术人员可以意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的模块及步骤，能够以电子硬件、或者计算机软件和电子硬件的结合来实现。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本申请的范围。
所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为描述的方便和简洁，上述描述的装置和模块的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。
寡核苷酸的合成装置中的功能如果以软件功能单元的形式实现并作为独立的产品销售或使用时，可以存储在一个计算机可读取存储介质中。基于这样的理解，本申请的技术方案本质上或者说对现有技术做出贡献的部分或者该技术方案的部分可以以软件产品的形式体现出来，该计算机软件产品存储在一个存储介质中，包括若干指令用以使得一台计算机设备(可以是个人计算机，服务器，或者网络设备等)执行本申请各个实施例所述方法的全部或部分步骤。而前述的存储介质包括：U盘、移动硬盘、只读存储器(read-onlymemory，ROM)、随机存取存储器(random access memory，RAM)、磁碟或者光盘等各种可以存储程序代码的介质。
本领域技术人员应当了解，在不违背本申请的真正精神和范围的情况下可以做出各种变化且可以取代等效方案。另外，可以做出许多修改以使特定的情况，材料，物质组合物，工艺，一个或多个工艺步骤适应本申请的目的，精神和范围。所有这些修改意图在本申请所附权利要求的范围内。
应理解，本申请实施例中“至少一个”可理解为一个或多个，例如理解为一个、两个或更多个。例如，包括至少一个，是指包括一个、两个或更多个，而且不限制包括的是哪几个，例如，包括A、B和C中的至少一个，那么包括的可以是A、B、C、A和B、A和C、B和C、或A和B和C。本申请实施例提及“第一”、“第二”等序数词用于对多个对象进行区分，不用于限定多个对象的顺序、时序、优先级或者重要程度。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (14)
1.一种寡核苷酸的合成方法，其特征在于，包括：
在第一微阵列底板的亲水区加入第一化合物，其中，所述第一微阵列底板的亲水区中包括羟基，所述第一微阵列底板的亲水区中的羟基和所述第一化合物反应，在所述第一微阵列底板的亲水区中生成第二化合物，所述第一化合物和所述第二化合物为包括羧基的化合物；
通过所述第二化合物和胸苷发生反应，在所述第一微阵列底板的亲水区合成寡核苷酸，得到第二微阵列底板，其中，所述胸苷带有羟基，所述第二微阵列底板的亲水区中包括所述寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在所述第一微阵列底板的亲水区加入溴异丁酰溴BIBB溶液，并通过所述第一微阵列底板的亲水区中的羟基与所述第一化合物发生原子转移自由基聚合ATRP反应，生成所述第二化合物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一化合物为聚丙烯酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
对所述第二微阵列底板的亲水区进行氨水解处理，得到寡核苷酸和带有氨基的第三微阵列底板。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
在所述带有氨基的第三微阵列底板上加入碳酸钠-甲醇溶液，得到所述第一微阵列底板。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
对底板进行处理，得到所述第一微阵列底板。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一微阵列底板还包括疏水区，
所述对底板进行处理，得到所述第一微阵列底板，包括：
对所述底板表面进行疏水处理，使得所述底板表面具有疏水区；
对所述疏水区的表面进行亲水处理，使得所述疏水区的表面具有亲水区；
将模具覆盖在所述底板的亲水区，所述模具为带有凸起的微阵列，所述模具的凸起与所述底板的亲水区接触；
将所述模具从所述底板的亲水区剥离，使得所述底板上与所述模具的凸起接触的部分暴露出所述疏水区，形成所述第一微阵列底板。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一微阵列底板还包括疏水区，
所述对底板进行处理，得到所述第一微阵列底板，包括：
将模具与所述底板接触，所述模具为带有凸起的微阵列，所述模具的凸起为亲水区，所述模具的凸起与所述底板接触；
对所述底板中未与所述模具的凸起接触的部分进行疏水处理；
将所述模具从所述底板剥离，形成所述第一微阵列底板，其中，所述第一微阵列底板上与所述模具的凸起接触的部分为所述第一微阵列底板的亲水区，所述第一微阵列底板上未与所述模具的凸起接触的部分为所述第一微阵列底板的疏水区。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述模具为聚二甲基硅氧烷PDMS模具。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括：
通过光刻法在器皿上制备微阵列区域；
将聚二甲基硅氧烷PDMS倒在所述微阵列区域上进行固化；
将固化的所述PDMS从所述器皿上剥离，得到所述PDMS模具。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
对所述模具进行等离子处理，使得所述模具的凸起为亲水区。
12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述疏水处理包括：
将所述底板和疏水剂接触，并进行蒸镀处理，使得所述底板表面具有疏水区。
13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对所述疏水区的表面进行亲水处理，包括：
通过多巴胺溶液对所述疏水区的表面进行处理，使得所述疏水区的表面具有亲水区。
14.一种寡核苷酸的合成装置，其特征在于，包括：存储器和处理器，
所述处理器连接所述存储器并用于执行所述存储器中存储的计算机程序，以使得所述寡核苷酸的合成装置执行如权利要求1至5中任一项所述的方法。
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