CN1379810A - 用于将核酸固定在固体支持物上的底物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于将核酸固定在固体支持物上的底物和方法。一种包含活化酯的聚阴离子与固体支持物共价结合。在一个优选实施方案中,所述聚阴离子是聚丙烯酸。

Description

用于将核酸固定在固体支持物上的底物
                       背景
1.发明技术领域
本发明涉及用来生产DNA芯片的固定核酸的底物。此外，本发明涉及将核酸固定在这样的底物上的方法以及检测所述底物上的靶核酸的方法。
2.相关技术
基因组分析技术揭示了若干生物的基因组结构。与同时发展了分析基因组功能的技术。在这种情况下，DNA芯片(DNA微阵列)成为引人注目的技术。DNA芯片是许多不同基因或片段(DNA片段)固定在固体支持物(如玻璃载玻片)表面上的微阵列。DNA芯片(DNA微阵列)可用于分析基因的表达、突变和多态性。
将靶核酸到固定在支持物上的方法是生产DNA芯片需要的核心技术。有两种用于生产DNA芯片的基本方法。一种方法涉及化学合成共价连接到底物上的接头末端核酸，例如见Science，第251卷，第767-773页(1992)以及Nucleic Acid Research，第20卷，第1679-1684页(1992)所述。在这一方法中，DNA限于寡核苷酸并且必须用一个特殊的仪器控制反应。因此，它不是通用方法。
另一种方法是将预先合成的DNA或通过PCR(聚合酶链式反应)制备的DNA(PCR扩增产物)共价或非共价结合到底物上的方法，例如见Science，第270卷，第467-470页(1995)和Nucleic Acid Research，第22卷，第5456-5465页(1994)。
在非共价固定方法中，所述DNA(或RNA)经过或不经过变性程序溶于盐溶液(例如SSC(氯化钠/柠檬酸钠))中。把所述DNA点样在用碱性聚阳离子(例如聚赖氨酸、聚乙烯亚胺)包被的玻璃载玻片上或点样在用含胺的硅烷化合物(例如3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷)硅烷化的玻璃载玻片上，并通过UV照射固定。所有类型的DNA(或RNA)都能通过该方法固定。
然而实际上，寡核苷酸和短DNA(小于0.3kb)很难用这一方法固定。甚至当长DNA(大于0.3kb)非共价结合时，冲洗和杂交过程可从底物上去除DNA，这导致可检测靶核酸减少。
非共价固定方法的另一个缺点是由于支持物表面的残余碱性官能团(阳离子)和探针核酸(阴离子)之间的非特异性结合而增强背景信号。已知残余氨基可经乙酰化封阻(用酸酐例如琥珀酸酐使胺转换成羧酸)。然而所述转换不总是彻底的。
因此需要开发一种底物，它适用于高度灵敏度检测靶核酸，以及适合固定多种类型核酸(包括短核酸和长核酸、单链核酸、双链核酸、DNA和RNA)。[p2-p4]
                           概述
本发明的主要目的是：(1)制备固定核酸的新型底物，该底物能够高效固定核酸；(2)固定核酸的底物(例如制备的DNA微阵列)；(3)固定核酸的生产方法；以及(4)用固定核酸的底物检测核酸的方法。
总之，本发明主要涉及用于固定核酸的底物，尤其是用于固定核酸的聚阴离子型表面。在一个优选实施方案中，所述聚阴离子是聚丙烯酸，但是可以使用任何聚阴离子。
本发明的另一个方面涉及通过共价键使核酸固定到底物上。其优选方法包括将羧酸官能团转换成活化酯。然后活化酯与胺修饰的核酸反应。
在第一和第二实施方案中，所述底物是非孔性表面。优选形式是玻璃。
第三实施方案涉及固定了核酸的底物；即固定了核酸的底物，其中核酸通过活化酯型聚阴离子共价结合到底物上。在第三实施方案中优选型聚阴离子是聚丙烯酸。优选活化酯是由聚阴离子和五氟苯酚通过碳化二亚胺偶联制备的五氟苯酚酯。
第四实施方案涉及将核酸固定在所述底物上的方法；即核酸固定在所述底物上的方法，在该方法中把用聚阴离子的活化酯衍生物包被的所述底物与胺修饰的核酸接触。在第四实施方案中所述聚阴离子是聚丙烯酸，优选型所述底物为非孔性底物；玻璃是最好的非孔性底物。
在第四实施方案中，所述核酸用可与活化酯衍生物反应的官能团修饰，优选用氨基修饰核酸。
第五实施方案涉及检测标本(或样品)中的靶核酸的方法，该方法包括但不限于：
a)其中用于固定核酸的底物是聚阴离子的活化酯衍生物的步骤。所述聚阴离子预先共价结合在玻璃载玻片的表面上。
b)上述活化酯衍生物和用可与所述酯衍生物反应的官能团修饰的核酸之间的反应步骤。
c)固定在底物上的核酸(靶核酸)和互补核酸(探针核酸)之间的杂交步骤。
d)检测杂交核酸的步骤。
第六实施方案涉及在标本中检测核算的方法，该方法包括但不限于：
a)所述底物的活化酯衍生物和用可与活化酯衍生物反应的官能团修饰的核酸之间的反应。
b)固定在底物上的核酸和互补核酸之间的杂交步骤。
c)检测杂交核酸的步骤。
                           详细说明
聚阴离子是包含两个或两个以上负电荷的聚合物。
术语核酸包括以下形式的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)：寡核苷酸、信使RNA、反义核酸、质粒DNA、质粒DNA的组成部分或由病毒(病毒DNA)线性DNA衍生的遗传物质、或染色体DNA。
恒湿仪是任何能够保持固定湿度范围的箱室。
在本发明中，如果所述用于固定核酸的底物适用于DNA芯片或生物传感器，那么不受限制。所述底物由具有无孔光滑表面的固体支持物构成，例如玻璃载玻片或硅胶珠的材料是优选应用材料。
在一个实施方案中，所述底物用3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷处理，以便使所述底物表面具有能与聚阴离子(在这种情况下是氨基)反应的官能团。在本发明中可以使用任何能够在玻璃底物表面导入官能团的硅烷。然后聚阴离子可以通过碳化二亚胺偶联反应共价结合到所述底物硅烷化表面。
聚阴离子包括具有阻止与探针核酸非特异性结合(静电结合)的作用的酸性官能团，例如羧基、磷酸基、硫酸基等等。聚阴离子与所述底物的表面共价结合；聚丙烯酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚磷酸盐是优选聚阴离子。这些聚阴离子与所述底物的硅烷化表面通过碳化二亚胺(或其他活化酯化学)化学结合。
为了使靶核酸固定在聚阴离子包被的底物上，必须活化所述聚阴离子的酸性官能团(形成活化酯)。例如五氟苯酚酯和咪唑酯是分别用于羧基和磷酸基的活化酯衍生物。
对需要固定在所述底物上的核酸没有特殊限制。所有合成的寡核苷酸、多核苷酸以及它们的衍生物都可以用。双链和单链型两种核酸(DNA或RNA)均可使用。如果核酸衍生物存在修饰使得能够固定在所述底物表面上，则不受限制。例如在DNA的5′末端用氨基、巯基、磷酸基以及醛基修饰的衍生物。此外，还可使用以交联剂或接头作为间隔基(例如烷基胺)在5′末端修饰的衍生物。在本发明中，5′末端修饰对短核酸例如寡核苷酸的固定是特别有效的。还可用任何导入各种官能团或信号基团的共价修饰的核酸，可用Mirus′LabelIT试剂修饰核酸。
将前面提到的修饰核酸以0.01-2.0mg/ml、优选0.1-1.0mg/ml浓度溶于适合的固定溶液，例如20mM MOPS(3-吗啉代丙烷硫酸盐)缓冲液(pH7.5)或50mM碳酸盐缓冲液(pH9.5)。经过或不经过变性步骤，所需要的核酸可以通过与其接触而固定到通过表面处理具有活化酯官能团的底物上。即应用微量吸移管或DNA芯片制备仪(DNA阵列仪)，将上述恒量DNA溶液点样在通过所述表面处理具有活化酯官能团的底物上。将其在恒湿仪中保持30-60分钟，分别用2％ SDS(十二烷基硫酸钠)和蒸馏水冲洗。此外，如果需要的话，将固定有核酸的底物浸在0.3M NaOH中在室温下5分钟或浸在沸水中2分钟使核酸变性，用蒸馏水和无水乙醇冲洗并干燥。通过这一处理，其中没与核酸反应的活化酯基团水解为羧酸部分(即负电荷)。所述酸基团阻止探针核酸和底物之间的非特异性静电结合。一般可省去聚赖氨酸载玻片所必须的琥珀酸酐封闭步骤。这些酸基团也可以降低背景信号。
可以通过应用荧光标记核酸来测定固定到底物上的核酸量。可以共价固定标记的靶核酸并检测残留的荧光信号。本发明的固定方法能够高灵敏感度检测基因的表达水平、突变、多态性等，因为该方法提供高效率的固定。此外固定的核酸在杂交条件下不会脱离(因为所述核酸是共价结合到底物上的)。
可应用常规杂交技术检测共价结合到底物上的靶核酸(例如DNA芯片)。所述探针核酸用荧光团(或其他信号基团)标记并用碱或加热变性。将所述标记探针核酸加入杂交溶液。将5μl至20μl的杂交溶液滴加在阵列表面上，用盖玻片覆盖，注意避免在盖玻片下形成气泡。将其在适合温度的恒湿仪中保持适当时间。去除盖玻片，彻底冲洗载玻片，去除水分，最后用荧光扫描器(荧光读数器)检测荧光信号。
本发明特殊的聚阴离子包被的玻璃载玻片能够有效固定核酸。通过共价结合聚阴离子在所述底物表面形成三维基体使得可增加固定核酸量。
本发明的所述底物和固定的核酸提供核酸超敏检测信号和低背景检测信号。因为当活化酯水解时，没与靶核酸反应的聚阴离子活化酯衍生物回复为聚阴离子，抑制负电荷探针核酸与所述底物的非特异性结合。
应用本发明可以提高检测靶核酸的敏感性是由于下列原因：(1)靶核酸(包括寡核苷酸)与底物高效结合，(2)固定后可省去封闭步骤，(3)靶核酸和底物之间的非特异性结合保持最小，以及(4)聚阴离子处理的3维效应提供高杂交效率。
                           实施例
我们应用以下实施例精确解释本发明，但是不能本发明不限于这些具体实施例。
实施例(例证)#1
(1)用PCR制备分别为序列表序列#1和#2所示的两种噬菌体DNA片段(分别是1.0Kb和0.3Kb，后者是前者的一部分)作为标准DNA。
应用噬菌体DNA作为模板和下列两种组合引物进行PCR：在序列表中，分别以序列#3和#4所示的引物S和引物A1000，以及引物S和序列#5的引物A300。然后，用Qiaquick PCR纯化试剂盒96(Qiagen)按照说明书手册纯化每一个扩增片段。用蒸馏水从柱上洗脱DNA。冻干浓缩DNA。
将各DNA片段溶于20mM MOPS缓冲液(pH7.5)中，通过GMS417阵列仪(Genetic MicroSystems)在玻璃载玻片上制备阵列，所述载玻片是市售获得的表面具有氨基的载玻片。所用的玻璃载玻片是聚-L-赖氨酸包被的POLY-PREP-SLIDES(Sigma：简称PLL包被载玻片)和MAS氨基烷基硅烷类包被载玻片(Matsunami Glass Ind.：简称MAS包被载玻片)，这些载玻片广泛用于制备DNA芯片。点样的大小和间隔分别为150rn和375rn。同一DNA成排点五个样点。
DNA点样后，各载玻片保持在37℃和90％湿度的培养箱内1小时，然后用60mJ/cm2 UV交联。载玻片用0.2％ SDS冲洗一次，用蒸馏水冲洗两次，通过低速离心去除水分(大约1,000rpm)，然后风干。上述预处理的载玻片用蒸馏水彻底冲洗，在水浴中煮沸3分钟，暴露于冰冷的乙醇中以使DNA变性。低速离心去除乙醇。然后，风干载玻片并储存于干燥器中。
一部分载玻片用无水琥珀酸酐处理以便通过琥珀酰化封闭所述底物表面上的游离氨基。将1.5g琥珀酸酐溶于89.5ml的N-甲基-2-吡咯烷酮和9ml的1M硼酸盐缓冲液(pH8.0)混合配制成封闭溶液，将所述载玻片在室温浸于封闭缓冲液20分钟。用蒸馏水彻底冲洗所述处理的载玻片，在水浴中煮沸3分钟，并暴露于冰冷的乙醇中以使DNA变性。低速离心去除乙醇。然后，风干载玻片并储存于干燥器中。
(2)将市售获得的氨基烷基硅烷玻璃载玻片(原位PCR玻璃载玻片，PE Biosystems：简称AAS载玻片)浸于2.5％戊二醛溶液中1小时，用蒸馏水冲洗3次，然后风干。得到醛基包被的载玻片。
序列表序列#6所示的24聚体寡核苷酸与5＇末端的在DNA合成仪上制备的链长度为6(PE Biosystems)的烷基氨基接头结合(简称NH2-F寡聚体)。然后，将其溶于20mM MOSP缓冲液(pH7.5)至最终浓度为10mM。该合成DNA以实施例例证#1-(1)中提到的相同方法用GMS417阵列仪点样在戊二醛处理的载玻片上。然后，用0.2％SDS冲洗载玻片2分钟，接着用蒸馏水冲洗。为减少通过所述底物上的醛基和DNA上的氨基之间形成希夫氏碱稳定胺，将所述载玻片浸于含0.25％硼氢化钠(Wako Pure Chemical Industries)的PBS-100％乙醇(体积比3∶1)中5分钟，并风干。
(3)聚阴离子与固体支持物的共价结合。
在2M硝酸、2M氢氧化钠、纯水以及丙酮中超声清洗显微镜玻璃载玻片各10分钟。所述清洁的载玻片在溶于95％乙醇的4％ 3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷中氨基硅烷化2分钟，然后在100℃温育10分钟，以便氨基硅烷化其表面。把聚丙烯酸溶于二甲基甲酰胺至最终浓度为5mg/ml，此外，加入1-[(3-二甲基氨基)丙基-3-乙基碳化二亚胺氢氯化物(简称EDC)至最终浓度为4.0g/100ml。将氨基硅烷化载玻片浸于该溶液过夜，用二甲基甲酰胺、甲醇、纯水、以及丙酮漂洗。真空干燥聚丙烯酸包被的载玻片。
(4)活化聚阴离子包被的固体支持物。
通过以下方法将聚丙烯酸包被的载玻片转化成活化酯包被的载玻片。将1.8g五氟苯酚、2.0g EDC和13mg二甲基氨基-吡啶溶于50ml二甲基甲酰胺中。将实施例例证#1-(3)制备的聚丙烯酸包被的玻璃载玻片浸于该溶液中5小时，用二甲基甲酰胺和二氯甲烷漂洗，真空干燥，最后储存于干燥器内。
实施例(例证)#2
(1)应用实施例#1-(1)同样方法制备两种大小的λ噬菌体DNA片段(1.0Kb和0.3Kb)。在该合成中，应用在5＇末端与链长度为6的烷基氨基接头(PE Biosystems)结合的含胺引物S扩增在末端具有氨基的DNA片段。纯化后，将各含胺DNA片段溶于20mM MOPS缓冲液(pH7.5)至最终浓度为0.5mg/ml，然后一式三份点样在通过实施例#1-(4)的方法活化的活化酯包被的玻璃载玻片上。作为对照，在PLL包被的载玻片上制备相同的阵列。
点有DNA的活化酯包被的玻璃载玻片在控制于37℃和90％湿度的培养箱(Tokyo Rikakikai：KC-1000型Eyela)中保持30分钟，然后，在0.2％ SDS中于室温温育以洗出过量的盐，接着用蒸馏水冲洗。之后，将所述载玻片浸于0.3N NaOH中5分钟以使DNA变性，用蒸馏水彻底冲洗，于大约1,000rpm离心干燥，并储存于干燥器内。
(2)杂交
在各玻璃载玻片上制备的核酸阵列与用荧光团标记的核酸探针杂交，并进行观测。各DNA阵列在50％甲酰胺、0.2％ SDS、5x Denhardt′溶液、0.1mg/ml鲑精DNA以及6x SSC组成的预杂交缓冲液中于42℃预杂交1小时。
应用LabelITCy5TM标记试剂盒(Mirus)按照说明书手册用Cy5TM标记实施例#1-(1)制备的1.0Kbλ噬菌体DNA片段。通过乙醇沉淀纯化所述标记核酸。该Cy5TM标记的核酸探针用预杂交缓冲液稀释至最终浓度为20、2和0.2ng/ml，95℃加热2分钟，冷却至室温。离心去除不溶物质。将大约5μl的杂交溶液滴加在所述核酸阵列上。将其用玻璃盖玻片覆盖，注意避免形成气泡。在42℃恒湿仪中温育20小时，室温下在2x SSC溶液中去除盖玻片，用含0.2％ SDS的2x SSC冲洗两次：于65℃下冲洗5分钟以及于55℃下冲洗30分钟。然后室温下用0.05x SSC冲洗10分钟，通过大约1,000rpm离心去除水分，并风干。
杂交后用GMS418阵列扫描仪(GMS)以发射波长为635nm、激发波长为660nm读取所述核酸阵列。用图象分析软件ImaGene(Biodiscovery)分析检测到的信号强度。所获得的结果归纳于表1。
表1探针          固定DNA片段           用于固定DNA的底物浓度          大小(bp)         活化酯包被的       PLL包被的(ng/ml)                        载玻片             载玻片0.2           1000             1484               889
          300              988                8562             1000             6640               2702
          300              2635               107720            1000             27383              14310
          300              7099               3824
如表1所示，在所有探针浓度下，固定在活化酯包被的玻璃载玻片上的每种大小的DNA的信号都高于PLL包被的玻璃载玻片上的信号。也就是说，证明在检测PCR扩增的靶核酸片段中，用活化酯包被的玻璃载玻片制备的DNA芯片比在常规(PLL)包被的玻璃载玻片上制备的DNA芯片得到更高的信号。
实施例(例证)#3
(1)用寡核苷酸-DNA阵列构建DNA芯片
在DNA合成仪上制备两种长度为24个核苷酸的寡核苷酸；序列表序列#6所示的寡核苷酸，一种寡核苷酸用链长为6的烷基氨基接头(PE Biosystems)于5′末端进行修饰(简称NH2-F寡聚体)，另一种于5′末端进行修饰使其含有羟基(简称OH-F寡聚体)。同时合成另外两种长度为24个核苷酸的寡核苷酸；一种寡核苷酸具有与序列#7所示的第一寡核苷酸互补的序列，在5′末端具有Cy3TM(Cy3-R寡聚体)；另一种寡核苷酸具有序列#14所示的非相关序列，在5′末端具有烷基氨基接头(NH2-N寡聚体)。
使OH-F寡聚体、NH2-F寡聚体、以及NH2-N寡聚体溶于20mMMOPS缓冲液(pH7.5)中至最终浓度为5、50、以及500□M，然后使其排列在用实施例#1-(4)的方法活化的活化酯包被的玻璃载玻片上。此时，每种DNA序列排列7个点。点样后，如实施例#2所述冲洗并干燥所述载玻片，最后将其处理为寡核苷酸芯片。作为对照，按照实施例#1-(2)所述在戊二醛处理的载玻片上制备相同的寡核苷酸阵列。
(2)寡核苷酸芯片的杂交
在各载玻片上制备的寡核苷酸芯片与分别制备的Cy3-R寡聚体探针杂交，观察产生的荧光信号。简单地说，向寡核苷酸阵列加入大约5μl含有1mM Cy3-R寡聚体、0.2％ SDS、5x Denhardts溶液、0.1mg/ml鲑精DNA以及6x SSC的杂交溶液。将其用玻璃盖玻片覆盖，注意避免形成气泡，在恒湿仪中于42℃温育20小时。室温下在2x SSC溶液中去除盖玻片，室温下用2x SSC冲洗两次10分钟。然后通过大约1,000rpm低速离心去除水分并风干。杂交后用GMS418阵列扫描仪以发射波长为635nm、激发波长为660nm测定所述寡聚体-DNA芯片上的总荧光。用图象分析软件ImaGene分析检测的信号强度。所获得的结果归纳于表2。
表2寡核苷酸点样                  活化酯包被的  戊二醛处理的溶液的浓度    寡聚体-DNA      玻璃载玻片    玻璃载玻片(μm)5             OH-F寡聚体      19.8          0.0
          NH2-F寡聚体    5516.7        0.9
          NH2-N寡聚体    0.0           0.050            OH-F寡聚体      2067.0        0.0
          NH2-F寡聚体    12104.1       0.0
          NH2-N寡聚体    0.0           0.0500           OH-F寡聚体      4385.8        1113.5
          NH2-F寡聚体    14828.7       201.9
          NH2-N寡聚体    0.0           8.5
如表2所示，在活化酯包被的玻璃载玻片上，在5′末端具有氨基的寡核苷酸点比没有氨基的寡核苷酸点的信号更强。这说明玻璃载玻片上的活化酯基团与寡核苷酸的氨基已经发生了反应。在所有寡核苷酸中，活化酯包被的玻璃载玻片上的寡核苷酸点信号比戊二醛处理的玻璃载玻片上的信号更强。
实施例(例证)#4
聚丙烯酸的三维作用
按信号/固定核酸长度计算不同长度的荧光标记核酸点样在其上的核酸阵列杂交信号。通过以下方法制备人转铁蛋白受体(简称TFR)的cDNA片段。按照常规方法从人类细胞系K562(DainipponPharmaceutical)提取mRNA和制备TFR的cDNA。用上述cDNA作模板，用TFR(基因文库第X01060号)特异性引物，即分别为序列表序列#8和#9所示的引物S7和引物AS7，制备4,738bp的PCR产物。通过连接以上PCR片段和pT7Blue载体(Novagen)获得重组质粒pT7TFR。分别用若丹明X(PE Biosystems；简称ROX)5′末端标记的引物对中的一个引物和pT7TFR作为引物和模板通过PCR制备不同长度的荧光标记PCR片段；即用ROX标记的S7(序列#8)和AS4(序列#10)、AS3(序列#11)、AS2(序列#12)或AS1(序列#13)的引物对进行PCR。分别获得制备的1.0、0.5、0.2、0.1kb的片段。
纯化后，每种DNA片段溶于20mM MOPS缓冲液(pH7.5)并用Amino Label IT试剂胺化；即将Amino Label IT试剂溶于二甲基亚砜并以1/5的比例(W/W)加入到纯化的DNA溶液中，在37℃温育1小时。通过乙醇沉淀法纯化每种胺化DNA。
按照专利申请WO 98/52961中所述用荧光基团替代氨基制备所述氨基Label IT试剂。
将所述胺化TFR片段溶于20mM MOPS缓冲液(pH7.5)中至最终浓度为0.5mg/ml，然后将实施例#1-(1)的方法获得的各序列在如实施例#1-(4)活化的活化酯包被的玻璃载玻片上点7个点。点样后，将其按实施例#3所述冲洗和干燥。作为对照，如实施例#1-(1)在MAS包被的玻璃载玻片上制备相同的阵列，固定后用或不用封闭游离氨基的琥珀酸酐处理。
在各载玻片玻璃上制备的DNA芯片与Cy5标记的DNA探针杂交，所述探针具有与ROX不同的荧光波长，观测其信号。也就是说，将上述制备的1.0Kb TFR片段用Cy5 Label IT试剂盒(Mirus)按照使用说明书用Cy5TM标记。
将大约5μl含有20ng/ml的Cy5标记的DNA探针、0.2％ SDS、5x Denhardts溶液、0.1mg/ml鲑精DNA、以及6x SSC的杂交溶液加入到固定在芯片上的DNA区域。将其用玻璃盖玻片覆盖并在恒湿仪中于65℃温育20小时。室温下在2x SSC溶液中去除盖玻片，用含0.2％SDS的2x SSC冲洗两次：在65℃冲洗5分钟以及在55℃冲洗30分钟。然后室温下用0.05x SSC冲洗10分钟，通过大约1,000rpm低速离心去除水分，并风干。
杂交后用GMS418阵列扫描仪测定阵列DNA末端标记的ROX荧光信号和在DNA芯片上杂交探针的Cy5标记的荧光信号。用图象分析软件ImaGene分析所得图象并将所述荧光信号转换成数字数据。Cy5信号强度除以各种大小DNA的ROX信号强度的数值为信号强度/DNA。获得的结果归纳于表3。由于背景高，因此不能测定没有封闭游离氨基在MAS包被的玻璃载玻片上制备的DNA芯片信号。
表3
                 信号强度/DNA
          活化酯包被的  MAS包被的玻DNA大小(bp)                              (A)/(B)
          玻璃载玻片    璃载玻片(B)
          (A)1000          26.77         9.09          2.9500           9.61          4.17          2.3200           0.46          0.43          1.1100           0.30          0.18          1.7
如表3所示，在所有DNA片段长度中，在活化酯包被的玻璃载玻片上的点信号强度/DNA比在MAS包被的玻璃载玻片高。这一结果表明活化酯包被的玻璃载玻片提供更有效的杂交。通过共价结合聚阴离子形成的三维点阵可结合更多靶核酸。
实施例(例证)#5
通过实施例#2-(1)中相同的方法制备两种末端具有氨基的1.0Kb和0.3Kbλ噬菌体DNA片段。如实施例#4所述用Amino Label IT试剂胺化部分所述DNA。将各DNA片段溶于20mM MOPS缓冲液(pH7.5)中至最终浓度为0.5mg/ml，在活化酯包被的玻璃载玻片和MAS包被的载玻片上的7个不同位置点样。
将在各玻璃载玻片上制备的核酸阵列与荧光Cy3-标记的DNA探针杂交，分析产生的信号。也就是说，将上述制备的1.0Kb λ噬菌体DNA片段用Label ITCy3标记试剂盒(Mirus)按照使用说明书用Cy3标记。应用该Cy3标记的DNA探针，如实施例#4所述进行杂交和冲洗。
杂交后用GMS418阵列扫描仪以发射波长为532nm、激发波长为570nm测定DNA芯片荧光(即信号强度)。分析所得图象，用图象分析软件ImaGene将信号强度值转换成数字数据。按照MAS包被的玻璃载玻片上的点的荧光强度为100来计算相对荧光强度。所获得的结果归纳于表4。
表4靶DNA                    相对信号强度大小(bp)   用Label IT修  MAS包被的玻  活化酯包被的
       饰氨基        璃载玻片     玻璃载玻片1000       -             100          1831000       +             100          276300        -             100          945300        +             100          2492
如表4所示，在所有DNA片段点中，活化酯包被的玻璃载玻片的信号强度比MAS包被的玻璃载玻片的信号强度更高。特别是300bp的短DNA片段的信号比MAS载玻片的信号高得多。
当在活化酯包被的玻璃载玻片上点样时，氨基修饰的靶产生的信号比没有氨基修饰的强。这说明用Amino Label IT修饰氨基有效提高靶和活化酯包被的玻璃载玻片的结合。
以上实施例仅仅用来阐明本发明的原理。此外，由于本领域技术人员可很容易地对本发明进行各种改进和改变，所以不希望将本发明限于所示和所述准确构建和操作。因此，所有合适的改进和等同实施方案均在本发明范围内。

Claims (19)

1.一种用于固定核酸的底物，该底物包括具有用可共价结合的聚阴离子包被的表面的固体支持物，该固体支持物用于检测样品核酸。
2.权利要求1的底物，其中所述聚阴离子包括聚丙烯酸。
3.权利要求1的底物，其中所述聚阴离子包含活化酯。
4.权利要求3的底物，其中所述活化酯选自五氟苯酚和N-羟基琥珀酰亚胺。
5.权利要求1的底物，其中所述固体支持物是非孔性的。
6.权利要求5的底物，其中所述固体支持物包括玻璃。
7.一种用于检测核酸的底物，该底物包括具有用共价结合的聚阴离子包被的表面的固体支持物，所述聚阴子可结合核酸。
8.权利要求7的底物，其中所述聚阴离子包括聚丙烯酸。
9.权利要求7的底物，其中所述聚阴离子包含活化酯。
10.权利要求7的底物，其中所述固体支持物是非孔性的。
11.权利要求10的底物，其中所述固体支持物包括玻璃。
12.一种用于将核酸固定在底物上的方法，该方法包括：
(a)用包含活化酯的可共价结合的聚阴离子包被固体支持物；
(b)使所述核酸与所述聚阴离子接触以便进行检测。
13.权利要求12的方法，其中所述聚阴离子包括聚丙烯酸。
14.权利要求12的方法，其中所述固体支持物是非孔性的。
15.权利要求14的方法，其中所述固体支持物包括玻璃。
16.权利要求12的方法，该方法还包括使所述核酸与所述活化酯反应。
17.权利要求16的方法，其中所述核酸包含与所述活化酯反应的氨基。
18.权利要求12的方法，该方法还包括封闭步骤。
19.一种用于检测标本中的样品核酸的方法，该方法包括：
(a)固定含有权利要求4活化酯的所述聚阴离子；
(b)使所述聚阴离子与包含可与所述酯反应的官能团的可固定核酸反应，从而固定所述核酸；
(c)使固定核酸与和所述固定核酸互补的样品核酸杂交；
(d)检测杂交的样品核酸。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005059553A1 (fr) * 2003-12-19 2005-06-30 Chengdu Kuachang Medical Industrial Limited Essai biologique par puce a adn et equipement correspondant
CN101696449A (zh) * 2009-11-10 2010-04-21 北京大学 核酸芯片、其制备方法及用途
CN101738425A (zh) * 2010-01-06 2010-06-16 天津科技大学 用于抗生素和心脏病标记物快速检测的适配子生物传感器的制作方法
CN1839317B (zh) * 2003-05-19 2012-05-30 东丽株式会社 选择结合性物质固定化载体
CN104805509A (zh) * 2015-04-08 2015-07-29 南京普东兴生物科技有限公司 一种羧基修饰的基因芯片基片及其制备方法
CN105220237A (zh) * 2015-10-29 2016-01-06 昆明寰基生物芯片产业有限公司 一种微阵列用活性醛基修饰基片及其制备方法
CN105219836A (zh) * 2014-05-27 2016-01-06 昆明寰基生物芯片产业有限公司 一种微阵列用活性醛基修饰基片
CN112442101A (zh) * 2019-09-05 2021-03-05 华为技术有限公司 寡核苷酸的合成方法、合成装置
CN113272445A (zh) * 2019-01-08 2021-08-17 康特姆斯集团有限公司 寡核苷酸在聚丙烯基底上的沉积

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003027674A1 (fr) * 2001-09-21 2003-04-03 Takara Bio Inc. Support pour l'immobilisation des ligands
JP2004097173A (ja) * 2002-07-17 2004-04-02 Toyo Kohan Co Ltd 静電層を有する固体支持体及びその用途
US8048377B1 (en) 2004-03-08 2011-11-01 Hewlett-Packard Development Company, L.P. Immobilizing chemical or biological sensing molecules on semi-conducting nanowires
EP2476759B1 (en) * 2009-09-10 2018-04-04 Toyo Kohan Co., Ltd. Carrier for holding nucleic acids
JP6127520B2 (ja) * 2013-01-09 2017-05-17 日本軽金属株式会社 バイオチップ用基板及びその製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE462454B (sv) * 1988-11-10 1990-06-25 Pharmacia Ab Maetyta foer anvaendning i biosensorer
SE8804074D0 (sv) * 1988-11-10 1988-11-10 Pharmacia Ab Sensorenhet och dess anvaendning i biosensorsystem
EP0543831B1 (en) * 1990-08-17 1995-12-13 FISONS plc Analytical device
JPH06507709A (ja) * 1991-06-04 1994-09-01 ファイスンズ　ピーエルシー 分析装置
DE19626750A1 (de) * 1996-07-03 1998-01-08 Franz Dr Herbst Vorrichtung zur Isolierung von Biomolekülen im präparativen Maßstab
JP2002521666A (ja) * 1998-07-21 2002-07-16 バースタイン テクノロジーズ，インコーポレイティド 光ディスクをベースとするアッセイ装置および方法
WO2000043539A2 (en) * 1999-01-25 2000-07-27 Biochip Technologies Gmbh Immobilization of molecules on surfaces via polymer brushes

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1839317B (zh) * 2003-05-19 2012-05-30 东丽株式会社 选择结合性物质固定化载体
WO2005059553A1 (fr) * 2003-12-19 2005-06-30 Chengdu Kuachang Medical Industrial Limited Essai biologique par puce a adn et equipement correspondant
CN101696449A (zh) * 2009-11-10 2010-04-21 北京大学 核酸芯片、其制备方法及用途
WO2011057467A1 (zh) * 2009-11-10 2011-05-19 Xi Jianzhong 核酸芯片、其制备方法及用途
CN101738425A (zh) * 2010-01-06 2010-06-16 天津科技大学 用于抗生素和心脏病标记物快速检测的适配子生物传感器的制作方法
CN101738425B (zh) * 2010-01-06 2013-03-13 天津科技大学 用于抗生素和心脏病标记物快速检测的适配子生物传感器的制作方法
CN105219836A (zh) * 2014-05-27 2016-01-06 昆明寰基生物芯片产业有限公司 一种微阵列用活性醛基修饰基片
CN104805509A (zh) * 2015-04-08 2015-07-29 南京普东兴生物科技有限公司 一种羧基修饰的基因芯片基片及其制备方法
CN105220237A (zh) * 2015-10-29 2016-01-06 昆明寰基生物芯片产业有限公司 一种微阵列用活性醛基修饰基片及其制备方法
CN113272445A (zh) * 2019-01-08 2021-08-17 康特姆斯集团有限公司 寡核苷酸在聚丙烯基底上的沉积
CN112442101A (zh) * 2019-09-05 2021-03-05 华为技术有限公司 寡核苷酸的合成方法、合成装置

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Publication number Publication date
KR20020026473A (ko) 2002-04-10
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KR100608152B1 (ko) 2006-08-04

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