KR100818275B1 - 노로바이러스의 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트,노로바이러스의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여노로바이러스의 존재를 검출하는 방법 - Google Patents

노로바이러스의 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트,노로바이러스의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여노로바이러스의 존재를 검출하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 노로바이러스 RNA 게놈의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 노로바이러스 RNA 게놈의 하나 이상의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 노로바이러스의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
Figure R1020060093717
프라이머, 프로브, 노로바이러스

Description

노로바이러스의 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트, 노로바이러스의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 노로바이러스의 존재를 검출하는 방법{Primer set for amplifying target sequences of Norovirus, probe set specifically hybridizable with the target sequences of Norovirus, microarray having the immobilized probe set and method for detecting the presence of Norovirus using the probe set}
도 1은 노로바이러스 RNA 게놈상의 표적 서열의 위치를 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 마이크로어레이 기판 상에 고정화된 올리고뉴클레오티드 프로브의 스팟의 배열을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 마이크로어레이에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드 프로브와 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 혼성화 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명은 노로바이러스 RNA 게놈의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트, 노로바이러스 RNA 게놈의 하나 이상의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브 세트, 상기 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이 및 상기 프로브 세트를 이용하여 노로바이러스의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
노로바이러스는 통상적으로 바이러스성 식중독을 일으키는 바이러스인 것으로 알려져 있다. 노로바이러스는 인간 캘리시바이러스(calicivirus) 과의 멤버이며, 염기수가 약 7000여개인 단일가닥 RNA로 이루어지는 게놈을 갖는다. 노로바이러스는 또한, 소형구형 바이러스(Small Round Structured Virus)로도 불린다.
식중독 사례의 대략 20% 정도가 바이러스에 의해 유발되는 것으로 추산된다. 노로바이러스는 이러한 바이러스성 식중독 사례의 약 80%에서 검출되고 있다. 주요 감염원은 식품이며, 생굴이 빈번하게 문제가 되고 있다. 또한, 노로바이러스는 유아들의 (산재성) 급성 위장염에서도 검출되며, 사람에서 사람으로의 전파 가능성이 시사되었다. 따라서 노로바이러스에 대한 시험은 국민 건강과 식품 품질관리 차원에서 볼 때 중요한 현안이므로, 유전자 증폭 과정을 이용하여, 서브타입의 전부 또는 대부분을 검출할 수 있는 고감도, 고속 시험법의 개발이 필요한 실정이다.
미국 특허 공개공보 2005/0170338에는 노로바이러스 게놈 RNA에 결합할 수 있는 특정 프로브 또는 노로바이러스 게놈 RNA의 특정 서열을 증폭할 수 있는 특정 프라이머가 개시되어 있다. 미국 특허 공개공보 2005/0048475에는 노로바이러스를 검출하기 위해 노로바이러스 게놈 RNA의 특정 서열을 증폭할 수 있는 특정 프라이 머가 개시되어 있다.
상기한 바와 같은 종래 기술에 의하더라도 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역(intergenic region) 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역 중의 하나 이상의 표적 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트는 개시된 바 없다. 또한, 이들 각 표적 서열에 대하여 특이적인 프로브는 개시된 바 없다.
본 발명의 목적은 노로바이러스의 표적 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 표적 서열에 특이적인, 노로바이러스를 검출하기 위한 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 프로브 세트가 고정화되어 있는 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로브 세트를 이용하여 노로바이러스의 존재를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 3의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 노로바이러스 RNA 게놈의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 상기 표적 서열은 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역(intergenic region) 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역 중 하나 이상인 것이다. 노로바이러스는 노르워크 유사 바이러스(Norwalk-like virus) 및 사포로 유사 바이러스(Sapporo-like virus)의 2 그룹으로 나누어진다. 노로바이러스 RNA 게놈은 일반적으로 3개의 ORF(open reading frame)로 이루어지는데, 이는 ORF1, ORF2(캡시드 코딩 영역) 및 ORF3 이다. 3개의 ORF 중에서, 본 발명의 표적 서열은 ORF1과 ORF2의 유전자간 영역 및 ORF2와 ORF3의 유전자간 영역으로 각 ORF가 겹치는 부분이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2 의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 3의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시 작하도록 허용해야 한다. 바람직하게는, 상기 프라이머의 길이는 약 5-50 뉴클레이티드이다. 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명의 프라이머 세트는 바이러스의 다양성(diversity)이 높은 점을 고려하여 노로바이러스의 100개의 분리주(isolate)에서 잘 보존된, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역(intergenic region) 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역으로부터 제작되었다.
본 발명의 프라이머 세트를 사용하여 PCR하는 경우, 증폭할 수 있는 표적 서열 영역은 노로바이러스의 G1-SO2 영역 (ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역) 및 G2-SO1 영역 (노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역)으로 구성된다. 도 1은 노로바이러스(AY587989) RNA 게놈 상의 표적 서열의 위치를 도식적으로 나타낸 도면이다.
본 발명의 프라이머 세트는 상기 노로바이러스 100개의 분리주의 G1-SO2 영역 (ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역) 및 G2-SO1 영역 (노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역)에 공통적으로 존재하는 서열로 구성된다. 바람직한 프라이머 세트의 일 예는 하기 표 1에 나타내었다.
표 1. 본 발명의 프라이머 세트의 일 예
프라이머 서열번호 비고
G1-SO2-F 1 G1-SO2 증폭용 정방향 프라이머
G1-SO2-R 2 G1-SO2 증폭용 역방향 프라이머
G2-SO1-F 3 G2-SO1 증폭용 정방향 프라이머
G2-SO1-R 4 G2-SO1 증폭용 역방향 프라이머
상기 G1-SO2 증폭용 프라이머 세트인 서열번호 1 및 2는 노로바이러스의 하나의 분리주의 게놈 서열인 AY587989의 각각 184~207 및 340~361에 해당하는 서열이며, G2-SO1 증폭용 프라이머 세트인 서열번호 3 및 4는 AY587989의 각각 452~473 및 775~796에 해당하는 서열이다. 따라서, 상기 G1-SO2 및 G2-SO1 증폭용 프라이머 세트에 의해 증폭되는 유전자 산물의 크기는 각각 178bp 및 345bp 이다.
본 발명은 또한,
서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 9 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어지는 군으로부터 선택된, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역의 하나 이상의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 5 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 9 내지 11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열 내의 10개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드들 및 그의 상보적 올리고뉴클레오티드로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브이다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 프로브 또는 프로브 세트에 있어서 서열번호 5 내지 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 9 내지 11의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이다.
본 발명의 프로브 세트는 각각 본 발명의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR을 통하여 증폭된 PCR 산물 내의 일부 서열에 해당하며, 노로바이러스 RNA 게놈의 G1-SO2 및 G2-SO1 표적 영역에 특이적으로 결합한다. 따라서, 본 발명의 프로브 세트는 상기 노로바이러스를 검출할 수 있다. 본 발명의 프로브 세트는 상기 노로바이러스 100개의 분리주의 RNA 게놈 상의 G1-SO2 및 G2-SO1 표적 영역 중에 존재하는 서열을 상호 비교하여, 모든 분리주에 공통적으로 존재하는 서열을 선발하여 제작하였다.
본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에 있어서, 프라이머 또는 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티 드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 올리고뉴클레오티드 프로브가 커플링될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
시료를 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및
상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 노로바이러스의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 시료는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 노로바이러스로부터 유래된 RNA를 주형으로 한 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 얻어진 PCR 산물을 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, "RT-PCR"이란 역전사 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 특정 부위의 RNA를 주형으로 하여 이에 상응하는 cDNA(complementary DNA)을 합성한 다음 이를 이용하여 PCR 증폭을 수행하는 기술이며, 실험과정은 1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정 및 2) cDNA를 이용하여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 나누어지며, 상기 2) 과정은 게놈 DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다.
본 발명의 노로바이러스가 RNA 바이러스이며, RNA 게놈의 3'말단에 poly(A)tail을 가지고 있으므로, oligo d(T) 프라이머 및 본 발명의 프라이머 중의 하나 및 역전사효소를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성한 후, 일반적인 PCR 합성을 통해 해당 영역을 증폭할 수 있다. "PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 상기 PCR 외에도, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당 업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 본 구체예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 프로브 또는 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화될 수 있다. 마이크로어레이 기판 상에 고정화되는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행될 수 있다. 본 구체예에서, 상기 높은 엄격도 혼성화 조건은 바람직하게는 65℃에서 동일한 몰의 Na2HPO4 및 NaH2PO4, 1mM EDTA 및 0.02% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 0.12 M 포스페이트 버퍼를 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, "혼성화"란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다.
또한, 본 명세서에 있어서, "엄격도 (stringency)"란 혼성화 및 그 후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성을 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 높은 엄격도 조건하에서는 매우 상동성인 핵산 혼성체가 형성될 것이다. 즉, 충분한 정도의 상보성이 없는 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서, 분석 조건의 엄격도는 혼성체를 형성하는 2 핵산 가닥 사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 표적 및 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 노로바이러스의 검출은 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 상기 PCR 산물을 표지하고, 이를 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화시키고, 그로부터 발생하는 신호를 검출하여 이루어질 수 있다. 상기 검출가능한 신호는 예를 들면, 광학적 신호 또는 전기적 신호가 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오레신(fluorescein), Cy-5, Cy-3 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 PCR 산물은 혼성화 전 또는 후에 검출가능한 신호를 발생시키는 물질로 표지되거나, 표지되어 있지 않을 수 있다. 표지되어 있지 않은 경우의 상기 PCR 산물과 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화 결과는 예를 들면, 전기적 신호를 통하여 검출할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실 시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 노로바이러스 분리주에 공통적인 표적 서열을 증폭하기 위한 프라이머의 선발
본 실시예에서는 노로바이러스 100개의 분리주의 RNA 게놈에 공통적인 표적 서열의 선발 및 그를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 설계하였다.
먼저, Genbank로부터 노로바이러스 분리주의 서열을 입수하고 DNASTAR 프로그램을 이용하여 이들로부터 노로바이러스 분리주 RNA 게놈의 각각 보존된 영역을 선발하였다. 분석에 사용된 노로바이러스는 100개 분리주이었다. 그 결과, 서열번호 1 및 2, 및 서열번호 3 및 4의 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 설계하였다. 이들 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 각각 상기 노로바이러스 RNA 게놈의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역(intergenic region) 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역을 증폭할 수 있다.
실시예 2: 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 노로바이러스 RNA 게놈의 증폭
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여, 노로바이러스 RNA 게놈의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역(intergenic region) 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역을 증폭하였다.
먼저, 노로바이러스 분리주 (I) 및 (II)의 게놈 RNA를 주형으로 하고, 실시 예 1에서 제작된 2개의 프라이머 세트 중 각 세트를 프라이머로 하여 RT-PCR을 수행하여 각 표적 서열을 특이적으로 증폭하는지를 확인하였다.
1. RNA 추출
먼저 1.5 ml 튜브에 버퍼 AVL 560㎕를 넣었다. 노로바이러스 시료 140 ㎕(고체일 경우 PBS 녹여 v/v 10%)넣고 15초간 볼텍싱하였다. 실온(15~25℃)에 10분간 방치 후 원심분리하여 560㎕의 에탄올(96-100%)을 첨가하여 15초간 볼텍싱하여 잘 혼합한 후 원심분리하였다. 상기 용액을 칼럼에 630㎕ 옮기고, 8,000rpm에서 1분간 원심분리하고, 수집(collection) 튜브를 교체하는 과정을 두 번 반복하였다. 500㎕의 세정 버퍼를 첨가하고, 8,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 500㎕의 버퍼 AW2를 첨가하고 12,000rpm에서 3분간 원심분리하고 용출액이 담겨진 수집 튜브를 제거하였다. 칼럼을 새로운 1.5 ml 튜브로 옮기고 용출 버퍼 60㎕를 첨가하고 1분간 방치 후, 8,000rpm에서 1분간 원심분리하여 용출하였다.
2. 역전사 반응(Reverse Transcription)
PCR 튜브에 DMSO 2.5㎕와 시료로부터 추출한 RNA 5㎕를 넣고 잘 혼합하여, 원심분리하였다. 50℃에서 3분 후에 바로 얼음에 넣어 변성(denaturation)시켰다. 이때 PCR 기기를 이용하여 온도를 일정하게 유지할 수 있게 하였다. 2㎕ 10X RT 버퍼(FINZYME 사), 4㎕ dNTP(10mM), 2.5㎕ 랜덤 헥사머(N6) 프라이머 10pmole, 0.2㎕ M-MuLV 역전사효소(FINZYME 사), 11.8㎕ DEPC 처리된 증류수를 잘 혼합하여 25㎕의 역전사 반응 혼합물을 제조하고, TMC 1000 기기를 이용하여 60℃에서 15분 동안 cDNA를 합성하였다.
3. PCR
위에서 얻은 5.0㎕의 cDNA를 주형으로 하고, 5.0㎕ 5X Taq 폴리머라제 버퍼, 10mM dNTP 믹스 0.3 ㎕, 5pmole 프라이머 4.0㎕, Taq 폴리머라제 1.0㎕, 및 10㎕의 멸균된 증류수를 포함한 PCR 반응액을 만들었다. 이것을 95℃에서 15초 변성, 42℃에서 15초 어닐링 및 68℃에서 15초 연장을 25회 반복하였다.
얻어진 PCR 산물을 전기영동에 의하여 확인한 결과, 원하는 PCR 산물을 얻을 수 있었다(데이타 미제시).
실시예 3 : 노로바이러스의 마이크로어레이 상에서의 검출
본 실시예에서는 실시예 2에서 증폭된 PCR 산물을 마이크로어레상에 고정화되어 있는 프로브와 혼성화시키고, 그 혼성화 정도를 검출함으로써 노로바이러스로부터 증폭된 PCR 산물이 존재하는지를 확인하였다.
모든 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머에는 5' 말단이 Cy-3로 표지된 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 2의 시료 준비 및 PCR과 동일하게 수행하였다. 증폭 산물을 하기와 같이 마이크로어레이 상에서 검출하였다.
실험에 사용된 노로바이러스 분리주는 총 2개이며, 이는 국립보건원의 노로바이러스 시료를 입수한 것으로, 노로바이러스 분리주(I) 및 분리주(II)이다.
(1) 프로브의 설계
DNAstar 프로그램을 이용하여 노로바이러스 게놈의 증폭된 영역으로부터 프 로브를 선발하였다.
표 2.
서열번호 프로브 표적 영역
5 G1-SO2-pr1 G1-SO2
6 G1-SO2-pr2 G1-SO2
7 G1-SO2-pr3 G1-SO2
8 G1-SO2-pr4 G1-SO2
9 G2-SO1-pr1 G2-SO1
10 G2-SO1-pr2 G2-SO1
11 G2-SO1-pr3 G2-SO1
(2) 상기 프로브가 고정화된 마이크로어레이의 제조
에탄올 중의 GAPTES (감마-아미노프로필트리에톡시 실란)(γ-aminopropyltriethoxy silane) 용액 (농도 20%(v/v)) 또는 GAPDES (감마-아미노프로필디에톡시 실란) 용액 (농도 20%(v/v))을 스핀 코팅하였다. 스핀 코팅은 CEE 사의 스핀 코터 모델 CEE 70을 이용하였다. 스핀 코팅은 초기 코팅 500 rpm/10 sec과 주코팅 2000 rpm/10 sec에 의하여 수행되었다. 스핀 코팅이 완료된 다음, 기판을 테플론 웨이퍼 캐리어에 고정하여 120℃에서 40 분 동안 경화시켰다. 경화된 기판은 물에 10 분 동안 침지시킨 후 15 분 동안 초음파 세척, 다시 물에서 10 분 동안 침지한 후 건조하였다. 건조는 스핀 드라이를 통하여 수행하였다. 모든 실험은 대부분의 먼지 입자들이 충분히 제거된 클린룸-클라스 1000에서 수행하였다.
위와 같이 제조된 아미노 기로 활성화된 기판 상에 서열번호 5 내지 11의 프로브 세트를 기판 상에 스폿팅하여 고정화하여, 마이크로어레이를 제작하였다.
(3) 검출
얻어진 마이크로어레이에 상기 PCR 산물을 첨가하고 42℃에서 1시간 동안 혼성화하였다. 세정 버퍼로 세척한 다음, GenePix Scanner (Molecular Device 사, 미 국)를 이용하여 형광을 측정하였다.
도 2는 마이크로어레이 기판 상에 고정화된 올리고뉴클레오티드 프로브의 스팟의 배열을 나타낸 도면이다. 도 2에서, 서열번호 5 내지 8의 프로브는 G1-SO2-pr1, G1-SO2-pr2, G1-SO2-pr3 및 G1-SO2-pr4로 표시된 위치에 스팟팅하였으며, 서열번호 9 내지 11의 프로브는 G2-SO1-pr1, G2-SO1-pr2 및 G2-SO1-pr3로 표시된 위치에 스팟팅하였다. 또한, G1-SO2 영역 및 G2-SO1 영역과 전혀 핵산 서열 상동성이 없는 각종 음성 대조군 프로브인 G1-SO1-pr1, G1-SO1-pr2, G1-SO1-pr3, G1-SO1-pr4, G1-SO3-pr1, G1-SO3-pr2 및 G1-SO1-pr3는 각각 해당 위치에 고정화하였다.
도 3은 본 발명의 마이크로어레이에 고정화되어 있는 올리고뉴클레오티드 프로브와 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물의 혼성화 결과를 나타내는 도면이다. 도 3에서 상단 패널은 노로바이러스 분리주(I)을 나타내며, 하단 패널은 노로바이러스 분리주(II)를 나타낸다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 G2-SO1 영역을 증폭하므로, 본 발명의 G2-SO1 영역에 특이적인 프로브가 고정화된 마이크로어레이의 위치에서 양성 혼성화 반응을 관찰할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 프로브는 높은 민감도를 가지고, 100%의 특이성으로 노로바이러스를 검출할 수 있었다.
본 발명의 프라이머 세트에 의하면, 다양한 분리주의 노로바이러스로부터 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 PCR 산물에 존재하는 표적 서열에 특이적으로 혼성화하므로, 다양한 분리주의 노로바이러스를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 의하면, 다양한 분리주의 노로바이러스를 검출하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 의하면, 다양한 분리주의 노로바이러스를 높은 특이성을 가지고 효율적으로 검출할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드 세트로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 세트를 포함하는, 노로바이러스 RNA 게놈의 하나 이상의 표적 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로서,
    상기 표적 서열은 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역(intergenic region) 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역 중 하나 이상인 것인 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트.
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  11. 시료를 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및
    상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는, 노로바이러스의 존재를 검출하는 방법으로서,
    상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트는 서열번호 5 내지 8의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 9 내지 11의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는, 노로바이러스의 ORF1과 ORF2(캡시드 코딩 영역)의 유전자간 영역 및 노로바이러스의 ORF2(캡시드 코딩 영역)와 ORF3의 유전자간 영역에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트이고,
    상기 시료는 제1항에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 하고, 노로바이러스로부터 유래된 RNA를 주형으로 한 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 얻어진 PCR 산물을 포함하는 것이고,
    상기 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화되어 있는 것인 방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질인 방법.
  15. 삭제
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