KR20060015669A

KR20060015669A - 인유두종바이러스 유형 진단 키트

Info

Publication number: KR20060015669A
Application number: KR1020060004165A
Authority: KR
Inventors: 김연수
Original assignee: 김연수
Priority date: 2006-01-14
Filing date: 2006-01-14
Publication date: 2006-02-17
Also published as: KR100786637B1

Abstract

본 발명에서는 유형 특이적 인유두종바이러스 검출을 위한 프로브 및 이를 이용한 인유두종바이러스 유형 동정용 올리고 DNA 칩과 상기 DNA 칩을 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단용 키트가 제공된다. 본 발명에 따른 인유두종바이러스 유형 진단 키트는 여성의 자궁경부암 생성 및 진행에 있어 밀접한 관련이 있는 종양원성 인유두종바이러스의 E6/E7 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머와 상기 증폭산물과 결합할 수 있는 프로브 및 이를 이용하여 샘플 내에 HPV의 존재여부 및 유형동정을 위한 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.

인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV), 마이크로어레이(microarray)

Description

인유두종바이러스 유형 진단 키트{Kit for Diagnosing HPV Genotypes}

도 1a 내지 도 1c는 각각 본 발명의 일 실시예에 따라 본 발명에서 합성한 총 27조의 프로브를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 Caski, HPV-18 감염 세포주인 HeLa 및 HPV 비감염 세포주인 K562를 대상으로 하여 DNA 칩 분석을 실시한 사진 및 그 해석 도면이다.

도 2a 내지 도 2j는 각각 본 발명의 다른 실시예에 따라 본 발명에서 합성한 총 27조의 프로브를 사용하여 다양한 HPV 유형의 DNA 서열을 함유하는 HPV 플라스미드를 표적 DNA로 하여 DNA 칩 분석을 실시한 사진 및 그 해석 도면이다.

본 발명은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, 이하 "HPV"라 한다.)의 유형을 검출할 수 있는 진단 키트 및 그 키트의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 HPV 유형에 특이적으로 결합될 수 있는 올리고 뉴클레오티드 프로브와 상기 프로브를 이용하여 HPV 유형을 신속 정확하게 검출, 진단할 수 있는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 HPV 유형 진단 키트 및 키트 제조 방법에 관한 것이다.

기존의 DNA 칩들이 그러하듯이, 현재 FDA 승인을 받은 두 종류의 HPV DNA Chip(바이오메드랩사, 마이진사)은 프로브의 말단을 아민기로 변형시킨 뒤 글라스 상의 알데히드기와의 시프염기반응에 따라 고정된 것을 특징으로 하고 있는데 비해 본 발명의 HPV DNA Chip은 다른 작용기가 필요 없기 때문에 9개의 구아닌 염기를 포함한 올리고 DNA가 녹아있는 용액을 칩 base위에 도포하면 구아닌 염기가 자발적으로 칩 위에 고정화되는 것을 특징으로 한다. 이처럼 기존의 칩 base를 변형시킨 본 HPV DNA 칩의 특징은 다음과 같다. 1) 본 발명의 HPV DNA 칩은 guanine을 인식하여 생체분자를 표면에 고정화 하는 기술로 다른 작용기가 필요 없기 때문에 저 비용으로 probe DNA 제조 가능. 2) 종전의 DNA Chip에 비해 10-30분 정도의 짧은 hybridization 시간과 간단한 세척과정만 필요하기 때문에 30단계에 이르는 SNP 판별과정을 5단계로 조정할 수 있음. 3) 기존의 칩에서는 결합과 세척과정에서 정해진 온도를 1??정도만 벗어나도 염기서열이 맞지 않는 DNA는 잘 떨어지지 않아 에러를 얻는데 비해, 본 HPV DNA 칩은 5?? 이상의 온도차에서도 SNP(single nucleotide polymorphism)를 쉽게 확인 할 수 있음. 4) 기존의 칩에서는 결과의 판독을 위해 수십 ng/ml이상의 cDNA를 사용하여 왔지만 BMT Guanine Chip™ 에서는 수십 pg/ml~수십 ng/ml 의 농도에서도 SNP 판독이 가능. 5) 측정점 주변에 배경 형광이 많이 존재하면 판독에 많은 문제가 있지만 BMT Guanine Chip™은 특수한 표면처리 과정과 blocking solution을 제공하여 cDNA가 표면에 부착될 수 없게 하여 배경 형광을 최대한 제거하여 선명한 측정점의 형광만을 관찰할 수 있다.

자궁경부암(cervical cancer)은 자궁경부에서 발생하는 악성종양으로 전체 자궁암 발생빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전세계 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생빈도가 높아 해마다 약 44만 건 정도가 신규로 보고되고 있으며, 개발도상국에서는 가장 흔한 여성암으로 연간 약 30만 명이 자궁경부암으로 사망한다. 우리나라의 경우 2000년도 보건복지부 암 등록 조사통계를 보면 1년에 약 5,000여명의 새로운 환자들이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 이는 여성의 경우 자궁경부암(10.6%)은 3803건으로 10대 암의 장기별 발생 빈도 상 위암(15.8%)과 유방암(15.1%)에 이어 3위를 차지하고 있으며 특히 최근엔 20-30대 젊은 여성의 감염율이 크게 늘어 전체 환자의 32%를 차지하는 등 국민보건상 심각한 문제로 대두되고 있다.

자궁경부암은 일반적으로 HPV가 자궁경부 상피 기저 세포에 감염한 후 저급 상피 이형성증(low squamous intraepithelial lesion, LSIL), 고급 상피 이형성증(high squamous intraepithelial lesion, HSIL) 및 상피내암 등의 오랜 전구 단계를 거쳐 최종 침윤암으로 발전하게 되는데, 이처럼 암으로 발생하기 전 단계인 전암 단계 병변이 존재하기 때문에, 조기에 이들 병변을 조기에 효과적으로 진단, 치 료함으로써, 자궁경부암을 예방할 수 있다.

현재까지의 연구에 따르면, 자궁경부암의 발병원은 성 접촉으로 인해 감염되는 HPV(약 8kb의 이중쇄 환상 DNA 바이러스)가 주요 인자인 것으로 밝혀지고 있다. HPV의 게놈에는 숙주세포에 감염한 후 초기 과정에 관여하는 E1 ~ E7 유전자와 후기 과정에 관연하는 L1, L2 유전자가 존재하며, 특히 HPV의 바이러스성 발암유전자 산물인 E6와 E7 단백질이 각각 세포내의 종양억제 단백질인 p53과 pRb와 결합하여 이들 종양억제 단백질의 기능을 폐기함으로써, 암을 유발시키는 것으로 확인되고 있다.

HPV 게놈 염기서열 중 E6, E7 및 L1 유전자의 열린 해독틀(open reading frame)의 차이를 근거로 하여 현재까지 120 가지 이상의 다른 유형이 발견되었다. 이들 HPV 유형 가운데 생식기(Genital)에 감염하는 HPV 유형으로는 HPV-16, -31, -33, -35, -52, -58, -67, -40, -43, -7, -32, -42, -6, -11, -74, -44, -55, -13, -61, -72, -62, -2, -27, -57, -3, -28, -29, -10, -54, -18, -39, -45, -59, -68, -70, -26, -69, -51, -30, -53, -56, -66, -34, -64 및 -73등의 45 유형으로 이 가운데 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 HPV 유형으로는 고위험군(high-risk group)에 속하는 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -57, -58, -59, -61, -67, -68, -70 및 -73, -74의 22 유형과 저위험군(low-risk group)에 속하는 HPV-2a, -3, -6, -10, -11, -32, -34, -40, -42, -43, -44. -54, -55, -66 및 -69의 15유형 등이 자궁경부암으로의 진행과 밀접한 관련이 있다.

이와 같이, 감염된 HPV 유형의 종류에 따라 암의 향후 진행에 막대한 영향을 초래할 수 있으므로 샘플 내에서 HPV의 존재 여부 및 존재하는 HPV 유형을 정확하게 동정함으로서, 자궁경부암 환자의 예후 및 진단에 중요한 의미를 가질 수 있다.

현재 자궁경부암과 전구 병변의 일차 선별을 위해 자궁경부 세포진의 세포학적 형태에 근거하는 세포진 검사(Papanicolaou(Pap) smear)가 1940년대부터 표준 검사법으로 시행되어 자궁경부암으로 인한 사망률을 크게 감소시키는데 일익을 담당해 왔으나 여전히 30??40%의 높은 위음성율을 나타내는 것으로 보고되고 있다.

한편, 분자 생물학적인 수단을 통하여 HPV의 존재 및 유형을 분석하기 위한 방법은 크게 HPV DNA를 직접적으로 확인하는 방법과 HPV DNA의 증폭을 이용하는 방법이 있을 수 있는데, HPV DNA의 직접 확인방법으로는 서던블롯, 도트 블롯 및 필터 인 시튜 등의 방법이 사용되고 있다. 특히, 미합중국 특허 제 6,221,581호에서는 대상 DNA와 RNA 프로브 사이의 액상 상보 결합을 항체 효소 발색 반응을 통하여 검출하는 액상 하이브리디제이션(liquid hybridization, Hybrid Capture Ⅱ) 방법이 개시되어 있다. 하이브리드 캡처 Ⅱ 방법을 통하여 자궁경부암과 그 전구 병변의 보조적 선별 또는 추적 검사가 가능하다. 그러나 상기 방법은 RNA 프로브를 이용하므로 안정성이 낮고 오염 가능성을 배제할 수 없는 문제점을 안고 있다.

DNA 증폭을 이용하는 방법으로서, PCR 기법은 다양한 HPV 유형의 감염 여부 및 그 유형 동정을 위해 많이 이용되고 있는데 이를 이용한 방법으로는 유형 특이적 PCR(type-specific polymerase chain reaction)과 제너럴 프라이머 PCR (general-primer PCR)등이 있다. 그러나 상기 분석 방법들은 탐지감도와 데이터 해석상에 다소 문제점을 내포하고 있다.

최근 분자생물학과 전자공학 기술의 접목을 통해 한 장의 현미경용 슬라이드 위에서 수십에서 수만 종류의 유전자를 동시에 검사할 수 있는 유전자 칩(DNA chip, DNA microarray)이 개발되었다. 이러한 DNA 칩은 유전자 발현 해석, 유전자 진단, 유전자 돌연변이, 의약품 스크린 및 질환 진단용 등에 널리 응용될 수 있는 새로운 차원의 분석 시스템이다. 따라서 이를 이용한 HPV 유형 동정은 자궁경부암과 관련된 HPV 유형을 신속하게 검출할 수 있는 HPV DNA 칩의 개발을 가능하게 하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성 인유두종바이러스를 신속하고 간단하게 검출할 수 있는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프로브를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 이용하여 종양원성 인유두종바이러스를 선택적으로 검출할 수 있는 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩(마이크로 어레이) 및 상기 DNA 칩을 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다를 목적은 인유두종바이러스의 존재 및 그 유형을 신속하게 진단할 수 있는 상기 진단 키트를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 관점에서는 서열번호 1 내지 서열번호 27로 구성되는 군으로부터 선택되는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 종양원성 인유두종바이러스 유형을 검출하기 위한 프로브가 제공된다. 상기 프로브는 인유두종바이러스의 발암에 중요한 영향을 미칠 뿐만 아니라 유형 분류의 기준이 되는 E6/E7 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 다른 관점에 따르면 상기 프로브의 5' 말단에 구아닌 염기를 첨가하여 표면의 글라스와의 반응성을 향상시킨 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩; 및 상기 프로브와 시료 DNA의 교잡 반응을 탐지하는 표지수단을 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트를 제공한다.

본 발명에 따르는 상기 키트의 구성을 통하여 자궁경부암과 관련이 있는 종양원성 인유두종바이러스의 감염 여부를 조기에 정확, 신속하게 진단할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 관점에서는 상기 DNA 칩 표면의 글라스와의 반응성을 증가시킬 수 있도록 종양원성 인유두종바이러스와 특이적으로 결합할 수 있는 상기 프로브의 5' 말단에 구아닌 염기를 결합시켜 프로브를 변형시키는 단계; 및 상기 변형된 프로브를 글라스 상에 고정시켜 DNA 칩을 제조하는 단계를 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트의 제조 방법을 제공한다.

더욱이 본 발명의 또 다른 관점에서는 종양원성 인유두종바이러스의 게놈 중 E6/E7 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 프로브와 상기 DNA 프로브의 위치를 알려주는 포지티브 컨트롤을 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단용 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩이 제공된다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

상기에서 설명한 바와 같이, HPV는 현재까지 120여개의 유형이 밝혀졌으며, 특히 자궁경부암의 관련성에 따라서 고위험군 HPV 유형과 저위험군 HPV 유형으로 구분된다. 고위험군 HPV 유형으로는 HPV -16, -18, -26, -30, -31, -33, -34, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, -73, -74 등이 있으며, 저위험군 HPV 유형으로는 HPV -2, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -40, -42, -43, -44, -55, -54 및 -57 등이 있다.

우선, 본 발명에서는 자궁경부암과 관련이 있는 다양한 HPV 유형을 탐지할 수 있는 프로브를 설계하고, 상기 프로브를 이용하여 자궁경부 내 존재하고 있는 다수의 HPV 유형을 검출할 수 있도록 하였다. 이를 위하여 본 발명에서는 총 72가지 HPV 유형의 전 서열 중 자궁경부암과 관련이 높은 HPV DNA 서열을 기준으로 컴 퓨터 프로그램을 이용하여 유형 특이적 프로브를 설계하였다. 상기 설계된 프로브는 다른 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다양한 HPV 유형에 대한 결합능을 확인한 후 최종적으로 27조의 프로브를 선별하였다.

상기에서 선별된 프로브는 핵산자동합성기(ExpediteTM 8909 합성기, ABI 사)를 사용하여 합성되었다. 이와 같이 합성된 총 27조의 프로브 5' 말단에 다수의 구아닌 염기를 추가하는 변형을 실시하여 상기 프로브가 DNA 칩의 표면에 형성된 글라스 슬라이드에 자발적으로 고정될 수 있도록 하였다. 이와 관련하여 상기 DNA 프로브는 바람직하게는 50 ~ 150 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 약 100 pmol/㎕의 농도로 첨가된다.

상기와 같이 변형된 HPV 유형 특이적 프로브가 고정된 DNA 칩에 HPV 감염 여부를 검출할 수 있도록 상기 프로브와 교잡 반응할 수 있는 총괄 프라이머(general primer)에 의하여 증폭된 HPV PCR 산물에 적절한 물질이 표지되어 있는 표지수단을 더욱 포함하는 구성을 취할 수 있다. 본 발명과 관련하여 HPV DNA 증폭 산물에 부착되는 표지 물질은 바람직하게는 형광 물질로서 Cy3와 Cy5가 사용될 수 있다.

상기와 같이 구성되는 DNA 마이크로어레이 기술을 이용한 진단 키트를 이용하여 우선 대표적인 HPV 감염세포주인 CaSki(HPV-16)와 HeLa(HPV-18) 및 HPV 비감염세포주인 K562 DNA를 표적 DNA로 하여 본 발명에서 사용된 프라이머를 이용하여 PCR을 실시한 후 본 발명에서 확인한 27조의 HPV 유형 특이적 프로브와의 하이브리디제이션 실험을 실시하였다.

한편, 본 발명에서 합성한 27조의 HPV 유형 특이적 프로브를 사용하여 다양 한 유형의 HPV 플라스미드 DNA를 표적으로 하여 하이브리디제이션을 수행한 결과 모두 이에 상응하는 특정 유형의 HPV DNA와 선택적으로 결합한다는 사실을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시 예를 통하여 보다 자세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 입증하기 위한 실시예 일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : HPV 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩의 제작

본 발명에 따른 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩(마이크로어레이)은 올리고 뉴클레오티드 프로브의 합성과 상기 프로브를 슬라이드 상에 고정하는 단계로 구성된다.

(1) HPV 올리고 뉴클레오티드 프로브의 설계

자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성(oncogenic) HPV DNA에 선택적으로 결합될 수 있는 유형 특이적 프로브로 사용될 수 있는 올리고 뉴클레오티드를 설계하였다.

우선, 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)와 미국립 로스 알라모스 HPV 데이터베이스로부터 HPV-1a, -2a, -3, -4, -5, -6b, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -15, -16, -16r, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -35h, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -44, -45, -47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -63, -65, -66, -67, -68, -70, -72, -73, -74, -76, -77, -80 의 총 72가지 HPV 유형의 전 DNA 염기서열을 확보하였다. 확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 'DNASTAR(MegAlignTM 5, DNASTAR Inc.)'를 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 실행한 후 분류계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 그룹별 유형 특이적 염기서열을 선별한 다음, 다시 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 유형 특이 프로브를 설계하였다. 이때 프로브의 길이는 30ㅁ3 및 40ㅁ2의 올리고 뉴클레오티드로 설정하여 100조의 유형 특이적 프로브를 설계하였다.

(2) 설계한 프로브의 하이브리디제이션 및 프로브 선별

상기 과정에서 설계한 총 100조의 프로브를 대상으로 컴퓨터 프로그램(Amplify 1.2, University of Wisconsin)을 사용하여 설계 과정에서 이미 확보한 총 72가지의 다른 HPV 유형을 대상으로 가상 결합능을 분석하였다. 본 실시예에서는 자궁경부암과 관련된 HPV-16, -18, -31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -70, -73, -6, -11, -32, -34, -40, -42, -43 및 -44의 종양원성 HPV 유형과 특이적으로 결합할 수 있는 것에 우선순위를 두고 선택하였으며 프로브의 명칭과 서열번호 및 유형은 하기 표 1에 제시하였다. 설명의 편의를 위하여 본 발명에서 사용되는 총 27조의 프로브는 각각 HOP-1 내지 HOP- 27로 명명하였으며, 이들 프로브는 서열번호 1 내지 서열번호 27로 구성된다.

표 1. 다양한 유형의 HPV DNA와 결합할 수 있는 유형 특이적 프로브

프로브	서열 (5' ??3')	서열번호	HPV 유형
HOP1	CGGATGCATGGAGATACACCTACATTGCAT	서열번호 1	HPV-16
HOP2	CAACATTGCAAGACATTGTATTGCATTTAGAG	서열번호 2	HPV-18
HOP3	CTGACCTCCACTGTTATGAGCAATTACCC	서열번호 3	HPV-31
HOP4	ACGTAGAGAAACTGCACTGTGACGTGTAAA	서열번호 4	HPV-33
HOP5	TGTATTACATGTCAAAAACCGCTGTGTCCAGTT	서열번호 5	HPV-35
HOP6	AAGAGAAACCCAAGTATAACATCAGATATGCG	서열번호 6	HPV-39
HOP7	TGCATTTGGAACCTCAGAATGAATTAGATCCT	서열번호 7	HPV-45
HOP8	ATGTACCACAATTAAAAGATGTAGTATTGCAT	서열번호 8	HPV-51
HOP9	ACCCCGACCTGTGACCCAAGTGTAAC	서열번호 9	HPV-52
HOP10	CACTTCCACAATATATTATAGAACTTATACCA	서열번호 10	HPV-53
HOP11	CTGCAAGACGTTGTATTAGAACTAACACCT	서열번호 11	HPV-56
HOP12	CCATGAGAGGAAACAACCCAACGCTAAG	서열번호 12	HPV-58
HOP13	AACAATGCATGGACCAAAAGCAACACTTTG	서열번호 13	HPV-59
HOP14	AACCATAAAGGACATAGTCCTTGAAGAGCG	서열번호 14	HPV-61
HOP15	CAACGTTGCAAGAGGTTATATTAGAACTTGC	서열번호 15	HPV-66
HOP16	AGTGTGTTGGAGACCTCAACGAACGCA	서열번호 16	HPV-67
HOP17	ACTAACTATGCATGGACCAAAGCCCACCG	서열번호 17	HPV-68
HOP18	CGGTCGACCTTGTATGTCACGAGCAATTAGA	서열번호 18	HPV-70
HOP19	AGGCGATATAGACAATCAGTATATGGCACT	서열번호 19	HPV-73
HOP20	AGGTAAAACATATACTAACCAAGGCGCGG	서열번호 20	HPV-6b
HOP21	TTACCTGTGTCACAAGCCGTTGTGTGAAA	서열번호 21	HPV-11
HOP22	CGACAACGTGCGACACACCGCCGGTT	서열번호 22	HPV-32
HOP23	TAGAAGATATAACCAATCAGTGTATGGACGG	서열번호 23	HPV-34
HOP24	CTGCACCCTGAACCTGTATGTCTAAACT	서열번호 24	HPV-40
HOP25	CTACCCTAAAGGACATTGTTTTGTTTGACATA	서열번호 25	HPV-42
HOP26	CATGGAAAAAAGCCGACGATCAGAGACTATG	서열번호 26	HPV-43
HOP27	GAAACAAATAAGTCAATTCTGGACGTGCTG	서열번호 27	HPV-44
PC	AACCTGCCAATATGATAACATCAAGAAGG	서열번호 28	GAPDH

(3) 선별된 유형 특이적 프로브 합성

상기 과정에서 선별된 27조의 유형 특이적 프로브들은 5` 말단에 9개의 구아닌기를 포함하여 하기와 같은 과정을 통하여 합성되었다.

상기 프로브는 올리고 뉴클레오티드 포스포르아미다이트 합성화학에 근거한 고체상 합성기법을 탑재하고 있는 ExpediteTM 8909 핵산 합성기(ABI 사)를 이용하 여 합성하였다. 우선, 합성반응은 올리고뉴클레오티드 3' 말단에 위치한 뉴클레오사이드를 고정시킨 CPG 컬럼에서 수행하였으며, 기본적으로 디트리틸레이션(detritylation), 커플링(coupling), 캡핑(capping) 및 산화(oxidation) 반응을 반복주기로 하여 선별된 프라이머의 올리고뉴클레오티드 중합반응을 행하였다. 합성 종료 후 30% 암모니아수를 CPG 컬럼에 가하여 상기 올리고머를 격리시킨 다음 55??에서 12시간 이상 탈보호(deprotection)시켜 고속진공(Speed Vac.)으로 농축 건조하였으며 다시 역상액체크로마토그래피 및 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 순수 정제하였다. 최종 정제된 올리고머는 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

(4) HPV 올리고뉴클레오티드의 고정

상기에서 합성된 올리고뉴클레오티드 프로브는 하기 방법을 이용하여 DNA 칩 상에 고정하였다. 우선, 5' 말단이 다수의 구아닌 염기로 변형된 채로 합성된 올리고 뉴클레오티드 프로브를 2X SSC(0.05M sodium citrate, 0.45M NaCl)에 100pmol/ul이 되도록 녹인 후 5' 말단에 첨가된 구아닌 염기와 반응되는 DNA 칩의 글라스 상에 1ul (54ug/ml)씩 스포팅(spotting)하였다.

한편, 본 실시예에서는 상기 프로브와 대상 DNA의 증폭 산물과의 위치를 확인할 수 있도록 포지티브 컨트롤(positive control)로서, 서열번호 28(5'-AACCTGCCAATATGATAACA TCAAGAAGG-3')로 구성되는 올리고 뉴클레오티드를 기술한 것과 같이 5' 말단에 구아닌 염기를 첨가하여 변형시킨 후에 동일한 절차에 따라 글라스 상에 스포팅 하였다. 이어서, 상기 스포팅한 것을 습식 반응용기 (humid chamber)에 넣고 상온에서 2시간동안 반응시켜 고정하였다.

상기 반응종료 후 슬라이드를 0.2% 소디움 도데실설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액에서 1분간 힘차게 세척한 후 3차 증류수로 옮겨 1분간 세척하고 NaBH₄ 용액(0.1g NaBH4, 30ml phosphate buffered saline (PBS), 10ml ethanol)에서 5분간 환원시킨 후 다시 3차 증류수에 1분간 세척하고 건조 후 사용할 때까지 상온의 암실에 보관하였다.

실시예 2

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조된 키트를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 CaSki(ATCC CRL-1550), HPV-18 감염 세포주인 HeLa(ATCC CCL-2) 및 HPV 비감염 세포주인 K562(KCLB-10243, Korean Cell Line Bank)를 대상으로 하이브리디제이션 여부를 실시하였다.

(1) 세포주 정제

Caski와 HeLa는 제조사의 지시에 따라 배양한 다음 Dulbecco's phosphate-buffered saline(Gibco 사)로 1회 세척한 후, 현미경상에서 세포수를 계측한 다음 2 ㅧ10⁶ 세포를 게놈 DNA 분리 키트(Genomic DNA isolation Kit, Cat. No. K-3032, Bioneer 사)를 이용하여 분리 정제하고 최종적으로 200 ㎕의 증류수(DW)에 녹여 주 형 DNA 용액으로 활용하였다.

(2) 중합효소연쇄반응

HPV 감염 여부를 검출하기 위한 PCR 반응 용액의 조성은 슈퍼바이오(SuperBio) 사로부터 구입한 10 ㅧ버퍼 2.5 ㎕, 10 mM MgCl₂ 3.75 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, Taq 중합효소 0.5 ㎕(1 unti)를 사용하였으며, 사용되는 프라이머는 Cy3가 결합되어 있는 하기 프라이머 세트를 각각 1 ㎕(40 pmoles), 증류수 5.2 ㎕, 및 상기에서 정제된 Caski, HeLa 및 K562 세포주의 주형 DNA 각각 8.0 ㎕로 구성된 반응액을 총 50 ㎕로 조정하였다.

표 1. 설계된 프라이머 서열

프라이머	서열	서열번호
HPC-F1^*	5'- TAA GGG AGT AAC CGA AAA CGG -3'	서열번호 1
HPC-F2^*	5'- AGA CTG TAC GAC CGA AAA CGG -3'	서열번호 2
HPC-F3^*	5'- GTA GGG TAA GAC CGA AAA CGG -3'	서열번호 3
HPC-R1^**	5'- TCC TCC TCA TCC TCT GAG CTG T -3'	서열번호 4
HPC-R2^**	5'- TCA CAA CAT TGT GTG ACG CTG T -3'	서열번호 5
HPC-R3^**	5'- TCA TCA TCT TCA TCT GAG GTG T -3'	서열번호 6

^*: 정방향 프라이머

^**: 역방향 프라이머

PCR 사이클은 최초 94℃에서 5분간 예비 가열한 후 94℃에서 1분, 53℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분간의 사이클을 총 40회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 5분간 가열한 후 종료하였으며, 최종 반응액 5 ㎕를 DNA 사이즈 스탠더드 마커와 합게 2% 아가로스 겔에 부과하여 전기영동하였다.

(3) 하이브리디제이션(Hybridization)

본 실시예에서 사용된 세포주 DNA와 합성된 총 27조의 올리고 뉴클레오티드 프로브를 고정시킨 슬라이드 기판에 PCR에 의하여 증폭된 PCR 증폭 산물을 이용하여 교잡반응을 실시하였다. 교잡 반응실(Hybridization reaction chamber)은 100 ㎕ 용량의 커버슬립(GRACE Bio-Labs, USA)을 사용하였다.

상기에서 얻어진 5 ㎕의 증폭산물을 95℃에서 5분간 변성시킨 후 즉시 얼음에 3분간 방치한 다음 교잡 반응 용액으로 20X SSC 18 ㎕, 90% 글리세롤 50 ㎕, 50 mM 인산 버퍼 15.65 ㎕, 0.1% SDS 1.35 ㎕를 첨가하여 최종 용량을 90 ㎕로 조정한 후에 51℃에서 슬라이드 상에 고정된 프로브와 10분간 반응시켰다.

교잡반응 종료 후 chip을 2X SSC/0.1% SDS 용액에 담근 후 30℃에서 2분간 세척한 후 4X SSC 용액으로 상온에서 1분간 세척한 다음 well을 제거하고 EtOH로 상온에서 짧게 세척한 다음 0.1X SSC 용액으로 한번 더 세척 후 건조시켰다. 건조된 슬라이드는 콘포칼 레이저 스캐너(confocal laser scanner, GMS 418 Array Scanner TaKaRa)를 이용하여 형광신호를 분석하였다.

도 1a 내지 도 1c는 각각 본 실시예에 따라 HPV-16 감염 세포주인 Caski, HPV-18 감염 세포주인 HeLa 및 HPV 비감염 세포주인 K562를 대상으로 본 발명에서 합성된 총 27조의 프로브를 이용하여 DNA 칩 분석을 실시한 사진 및 그 해석 결과이다. 각각의 도면에서 원은 프로브의 종류에 따른 위치를 나타내며, 각각의 숫자는 본 발명에서 사용된 5' 말단에 구아닌 염기가 추가된 프로브의 종류에 따라 증폭되는 HPV 유형을 표시한 것이다. 즉, 16은 HOP1 프로브, 18은 HOP2 프로브, 31은 HOP3 프로브, 33은 HOP4 프로브, 35는 HOP5 프로브, 39는 HOP6 프로브, 45는 HOP7 프로브, 51은 HOP8 프로브의 각 5' 말단을 구아닌으로 변형시킨 프로브를 사용하였음을 표시한 것이다. 한편, PC는 각각의 변형된 프로브의 위치를 확인하기 위하여 사용된 포지티브 컨트롤(positive control)이다.

도면에서 알 수 있는 바와 같이, HPV-16 감염 세포주인 CaSki를 표적 DNA로 사용하면 본 발명에서 합성된 HOP1 프로브가 스포팅 된 영역에서만 특이적으로 교차-하이브리디제이션 반응이 일어났고(도 1a), HPV-18 감염 세포주인 HeLa를 표적 DNA로 사용하면 본 발명에서 합성된 HOP2 프로브가 스포팅 된 영역에 대해서만 특이적으로 교차-하이브리디제이션 반응이 일어났으며(도 1b), HPV 비감염 세포주인 K-562에 대해서는 본 발명에서 합성된 프로브와 아무런 교차-하이브리디제이션 반응이 일어나지 않았음을 확인하였다. 즉, HPV-16 감염 세포주와 HPV-18 감염 세포주에 대해서 특이적으로 결합하는 것으로 확인된 프로브의 5' 말단을 변형시킨 프로브에 대해서만 하이브리디제이션 반응이 일어났다.

실시예 3

본 실시예에서는 상기 실시예 2를 통하여 확인된 HPV 특이적 프로브가 고정된 진단 키트를 사용하여 보다 다양한 유형의 HPV 세포주를 대상으로 하이브리디제이션 여부를 확인하였다. 즉, 본 실시에에서는 종양원성 HPV 유형의 플라스미드를 포함하고 있는 E.coli 균주는 물론이고 비종양원성 HPV 유형의 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 E.coli 균주를 대상으로 DNA 칩을 이용한 키트에서의 하이브리디제이션 여부를 확인하였다.

본 실시예에서 사용된 E.coli 균주는 다음과 같다.

HPV-2a (ATCC 45022);

HPV-6b (ATCC 45150);

HPV-11 (ATCC 45151);

HPV-16 (ATCC 45113);

HPV-18 (ATCC 45152);

HPV-31 (ATCC 65446);

HPV-35 (ATCC 40331);

HPV-43 (ATCC 40338);

HPV-44 (ATCC 40353);

HPV-56 (ATCC 40549)

각각의 E. coli 균주는 37℃ LB 액체 배지에서 16 시간 동안 진탕 배양한 후 Qiafilter Plasmid Maxi Kit(Cat. No. 12263, QIAGEN 사)로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정하여 주형 DNA 용액으로 활용하였다. 이어서, 상기 실시예 2에서와 동일한 절차에 따라 본 실시예에서 사용된 균주의 DNA를 PCR 증폭한 뒤, 하이브리디제이션 여부를 확인하였다.

도 2a 내지 도 2j는 각각 본 실시예에서 사용된 HPV 감염 플라스미드 DNA를 주형 DNA를 대상으로 본 발명에서 합성한 27조의 변형된 프로브를 사용하여 하이브리디제이션 반응을 실시한 사진 및 그 해석 결과이다. 각각의 도면에서 원은 프로브의 종류에 따른 위치를 나타내며, 각각의 숫자는 본 발명에서 사용된 5' 말단에 구아닌 염기가 추가된 프로브의 종류에 따라 증폭되는 HPV 유형을 표시한 것이고, PC는 변형된 프로브의 위치를 확인하기 위하여 사용된 포지티브 컨트롤(positive control)이다.

도 2a는 HPV-16 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45113 균주, 도 2b는 HPV-18 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45152 균주, 도 2c는 HPV-31 DNA를 함유하고 있는 ATCC 65446 균주, 도 2d는 HPV-35 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40331 균주, 도 2e는 HPV-43 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40338 균주, 도 2f는 HPV-44 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40353 균주, 도 2g는 HPV-56 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40549 균주, 도 2h는 HPV-6b DNA를 함유하고 있는 ATCC 45150 균주, 도 2i는 HPV 11 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45151 균주, 도 2j는 HPV 2a DNA를 함유하고 있는 ATCC 45202 균주로부터 얻어진 DNA를 대상 DNA로 한 것이다.

도면에서 분명히 알 수 있는 것과 같이, HPV-16 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45113 균주에 대해서는 HPV-16 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP1 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2a), HPV-18 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45152 균주에 대해서는 HPV-18 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP2 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2b), HPV-31 DNA를 함유하고 있는 ATCC 65446 균주에 대해서는 HPV-31 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP3 프로브가 스포팅된 영역에서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2c), HPV-35 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40331 균주에 대해서는 HPV-35 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP5 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2d), HPV-44 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40353 균주에 대해서는 HPV-44 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP27 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션이 일어났으며(도 2f), HPV-56 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40549 균주에 대해서는 HPV-56 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP11 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션 반응이 일어났으며(도 2g), HPV-6b DNA를 함유하고 있는 ATCC 45150 균주에 대해서는 HPV-6 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP18 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션 반응이 일어났고(도 2h), HPV-11 DNA를 함유하고 있는 ATCC 45151 균주에 대해서는 HPV-11 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP19 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션이 일어났고(도 2i), HPV43 DNA를 함유하고 있는 ATCC 40338 균주에 대해서는 HPV-43 DNA와 특이적으로 결합하는 HOP26 프로브가 스포팅된 영역에 대해서만 하이브리디제이션이 일어났고(도 2j), HPV-2a DNA를 함유하고 있는 ATCC 45202 균주에 대해서는 아무런 교차-하이브리디제이션 반응이 일어나지 않았음을 확인하였다.

이러한 결과는 상기 실시예 1에 제시된 표 1의 결과와 일치하는 것임을 확인할 수 있었으며, 본 실시예에서 확인하지 못한 다른 많은 종양원성 HPV 유형에 대해서도 표 1에서와 동일한 결과가 도출될 수 있을 것으로 기대되었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 기술하였으나, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게는 자명한 사실이라 할 것이다. 또한 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.

본 발명에서는 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성 인유두종바이러스 유형에 특이적으로 결합할 수 있는 유형 특이적 올리고 뉴클레오티드를 변형시킨 프로브를 포함하고 있는 DNA 칩, 즉 올리고 뉴클레오티드 마이크로어레이와 증폭산물에 형광물질이 표지되어 있는 표지수단으로 구성되는 진단키트를 통하여 종양원성 HPV 유형에 감염 여부를 정확하고 신속하게 다량으로 진단할 수 있다.

더불어, 프로브와 슬라이드 글래스의 결합 및 결합과정을 개선함하여 제조공 정을 단축하고 에러발생을 줄임으로서 HPV 존재여부를 정확하게 검출하고 자궁경부암과의 관련성을 신속하게 예측하여 진단할 수 있는 효과가 있다.

Claims

인유두종바이러스의 유형을 검출하기 위한 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프로브로서, 서열번호 1 내지 서열번호 27로 구성되는 군에서 적어도 하나 이상 선택되는 올리고 뉴클레오티드로 구성되는 프로브.
제 1항에 있어서,

상기 프로브는 자궁경부암의 발병에 관련성이 있는 종양원성 인유두종바이러스의 유형의 DNA와 특이적으로 교잡(Hybridization)되는 것을 특징으로 하는 프로브.
제 1항에 있어서,

상기 프로브는 인유두종바이러스의 게놈 서열 중 E6/E7 영역의 DNA 서열에 특이적으로 교잡되는 것을 특징으로 하는 프로브.
제 1항에 기재되어 있는 프로브를 포함하는 인유두종바이러스 유형 분석을 위한 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩; 및 상기 프로브와 시료 DNA의 교잡(hybridization) 반응을 탐지하는 표지수단을 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트.
제 4항에 있어서,

상기 DNA 칩은 5' 말단에 구아닌 염기가 포함되어 있는 DNA 서열을 갖는 프로브와 상기 DNA 칩 표면에 슬라이드 글라스 사이의 반응을 통하여 고정된 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트.
제 4항 또는 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 DNA 프로브의 농도는 50 ~ 150 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트.
제 4항에 있어서,

상기 시료 DNA를 증폭시킬 수 있는 증폭수단을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트.
제 7항에 있어서,

상기 증폭수단은 NGP-F/R 각각 3개씩을 혼합한 프라이머 시스템과 500bp 증폭기를 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트.
제 8항에 있어서,

상기 증폭을 위한 표지수단은 Cy3가 결합된 형광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트.
제 4항에 있어서,

상기 DNA 칩은 DNA 프로브의 위치를 알려주는 포지트브 컨트롤(Positive control)을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트.
제 1항 기재의 DNA 프로브의 5' 말단에 다수의 구아닌 염기를 결합시켜 상기 프로브를 변형시키는 단계와; 상기 변형된 프로브를 글라스 상에 고정시켜 DNA 칩을 제조하는 단계를 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트의 제조 방법.
제 11항에 있어서,

상기 DNA 프로브는 인유두종바이러스 게놈의 E6/E7 영역의 올리고 뉴클레오티드로서 종양원성 HPV DNA와 특이적으로 교잡 반응하는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트의 제조 방법.
제 11항 또는 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 DNA 프로브의 농도는 50 ~ 150 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단 키트의 제조 방법.
인유두종바이러스 게놈 중 E6/E7 영역의 DNA 서열과 특이적으로 결합하는 제 1항 기재된 올리고 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 프로브와 상기 DNA 프로브의 위치를 알려주는 포지티브 컨트롤을 포함하는 인유두종바이러스 유형 진단용 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩.
제 14항에 있어서,

상기 DNA 프로브의 5' 말단은 다수의 구아닌 염기를 더욱 포함하는 것을 특 징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단용 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩.
제 14항에 있어서,

상기 DNA 프로브의 농도는 50 ~ 150 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형 진단용 올리고 뉴클레오티드 DNA 칩.