KR100564215B1

KR100564215B1 - 중합효소연쇄반응에 의한 생식기내 다양한인유두종바이러스를 검출하기 위한 신규한 피씨알 공통프라이머와 이를 이용한 검출 방법

Info

Publication number: KR100564215B1
Application number: KR1020040040822A
Authority: KR
Inventors: 이상화; 김연수; 최경진; 유강열; 김승조; 차광렬; 고정재
Original assignee: (주)차바이오메드
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2004-06-04
Publication date: 2006-03-28
Also published as: KR20050115628A

Abstract

본 발명에서는 다양한 유형의 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)의 특정 염기서열, 특히 HPV의 발암 과정에서 중요한 역할을 수행하는 E1 및 E7 영여과 상보적으로 결합하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 반응을 통하여 상기 염기서열을 검출할 수 있는 PCR 프라이머 및 이를 이용하여 샘플 내에 HPV의 존부를 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 PCR 프라이머는 특히 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 고위험군 HPV 유형을 포함하여 다양한 유형의 HPV 염기 서열과 상보적으로 결합하고 이를 증폭할 수 있으므로, 1회의 PCR 분석으로 샘플내에 다양한 HPV 유형을 검출 또는 그 존부를 확인할 수 있다.

인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV), 자궁경부암(Cervical Cancer), 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), PCR 공통 프라이머(PCR general Primer)

Description

중합효소연쇄반응에 의한 생식기내 다양한 인유두종바이러스를 검출하기 위한 신규한 피씨알 공통 프라이머와 이를 이용한 검출 방법{Novel PCR General Primers and Method for Detecting Diverse Types of Human Papillomavirus by PCR in Genital}

도 1은 본 발명에 따라 합성된 프라이머 세트를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 Caski(ATCC CRL-1550), HPV-18 감염 세포주인 HeLa(ATCC CCL-2) 및 HPV 비감염 세포주인 K562(KCLB-10243, Korean Cell Line Bank)를 표적 DNA로 하여 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다.

도 2는 본 발명에 따라 합성된 프라이머 세트를 사용하여 서로 다른 HPV 유형의 DNA를 함유하고 있는 플라스미드 DNA를 대상으로 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다.

도 3a 내지 도 3t는 각각 본 발명에 따라 합성된 프라이머 세트를 사용하여 자궁경부암과 관련 있는 것으로 진단된 인체로부터 수득된 DNA를 대상으로 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다.

도 4a 내지 도 4t는 각각 본 발명에서 합성된 프라이머 세트를 사용하여 자궁경부암과 관련 없는 것으로 진단된 인체로부터 수득된 DNA를 대상으로 PCR을 실 시한 후 전기영동한 사진이다.

본 발명은 인유두종바이러스를 검출하기 위한 PCR 프라이머 및 이를 이용한 인유두종바이러스의 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 유형의 HPV의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 PCR 프라이머 및 이를 이용하여 샘플 내에서 고위험군 인유두종바이러스 유형을 포함하는 다양한 유형의 인유두종바이러스의 핵산 서열을 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

자궁경부암(Cervical Cancer)은 여성의 자궁경부에서 발생하는 악성 종양으로서 전체 자궁암 발생 빈도의 95 % 이상을 차지하고 있으며, 전세계 여성암 가운데 유방암 다음으로 발생빈도가 높아 매년 약 44만 건 정도의 신규환자가 보고되고 있다.

국내의 경우 2000년도 보건복지부 암 등록 조사통계를 참고하면, 1년에 약 5,000 명 가량의 새로운 환자들이 발생하는 것으로 확인되고 있다. 이는 전체 여성암에 있어서 약 10.6 %를 차지하는 것으로 발생 빈도상 위암(15.7 %)과 유방암(15.1 %)에 이어 3위를 차지하고 있는 것이다. 특히 최근에는 20 ~ 30 대의 젊은 여성의 감염율이 크게 증가하여 전체 자궁경부암 환자의 약 32 %를 차지하는 등 국민보건상 심각한 문제로 대두되고 있다.

자궁경부암은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 즉, HPV가 자궁경부 상피기저 세포에 감염한 후 저급 상피 이형성증(Low-grade SIL), 고급 상피 이형성증(High grade SIL), 상피내암(squamous intraepithelial lesion, SIL) 등의 오랜 전구 단계를 거쳐 최종 침윤암으로 발전하게 되는데, 이처럼 암으로 발전하기 전 단계인 전암 단계 병변이 존재하기 때문에, 이들 병변을 조기에 효과적으로 치료함으로써 자궁경부암을 예방할 수 있다.

인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)는 8kb의 환상의 이중나선 바이러스로서, 모든 유형의 HPV 바이러스는 유사한 성질의 단백질을 합성하는 DNA 부분인 열린해독틀(open reading frames, ORFs)을 가지며, 크게 초기 유전자(early gene)와 후기 유전자(late gene)로 구분된다. 약 4.5kb의 초기 유전자는 바이러스 DNA 복제(E1), 숙주 세포의 악성화 변형(malignant transformation)을 야기하는 단백질을 형성하는 DNA의 작용을 유발하거나 억제(E2), 숙주세포와 바이러스 성장과 관련된 단백질의 합성(E4), EGF(epidermal growth factor)와 CSF(colony stimulator factor) 수용체의 작동유발(E5), 세포의 영구생존 및 암 유전자의 활성과 암 억제인자의 비활성화 기전에 의한 악성화 변형(E7) 등으로 나눌 수 있다. 특히 HPV가 숙주의 상피세포를 감염시킨 후에 발현되는 종양원성(oncogenic) 단백질 인 E6와 E7은 각각 숙주세포의 종양 억제 단백질인 p53과 pRB와 결합하여 이들 종양억제 단백질의 기능을 억제함으로써, 결과적으로 감염 세포의 형질전환에 따른 종양형성으로 발전하는 것으로 규명되고 있다.

한편, 2.5kb의 후기 유전자는 바이러스 주외피 단백질(L1)과 부외피 단백질(L2)의 합성을 담당하는 DNA와 이들의 전사와 번역 기능을 조절하는 비발현 부분(non-coding region)인 1kb 크기의 LCR(long control region)으로 이루어져 있다.

현재까지 HPV는 120 가지 이상의 각각 다른 유형(type)들이 발견되었고, 이 가운데 약 36 종의 HPV 유형(HPV-2, -3, -6, -10, -11, -13, -16, -18, -26, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -39, -40, -42, -43, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, -73)은 자궁경부암을 야기하는 이른바 "종양원성 HPV" 유형으로 밝혀졌다.

그 중에서 HPV-16, -18, -26, -30, -31, -33, -34, -35, -39, -45, -51, -52, -53, -56, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, 및 -73과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 상대적으로 높은 것으로 밝혀져 있어 "고위험군(high-risk)" HPV로 분류되며, HPV -2, -3, -6, -7, -10, -11, -13, -32, -40, -42, -43, -44, -55, -54 및 -57과 같은 유형의 HPV는 자궁경부암으로의 진행률이 낮아 "저위험군(low-risk)" HPV로 분류되고 있다.

현재 자궁경부암과 그 전구 병변의 일차 진단과 관련하여 기본적으로 세포진 검사(Papanicolaou(Pap) Smear)가 1940년대 이후 표준 검사법으로 시행되고 있다. 세포진 검사는 자궁 경부 세포진의 세포학적 형태를 기초로 하여 자궁경부암을 진단하는 것으로 이를 통하여 자궁경부암으로 인한 사망률을 크게 감소시키는데 공헌하였다. 그러나 세포진 검사는 검사자의 주관이 작용하기 때문에 여전히 30 ~ 40 %의 높은 위음성율을 나타내는 것으로 보고되고 있다.

한편, 자궁경부 세포진의 HPV DNA와 RNA 탐침(probe) 간의 액상 상보 결합을 항체 효소 발색에 의하여 검출하는 "HPV hybrid capture Ⅱ" 방법이 1994년 개발된 이후, 자궁경부암과 그 전구 병변의 보조적 선별 또는 추적 검진의 한 방법으로 활용되고 있으며 최근 미국 FDA로부터 자궁경부암의 일차 선별을 위한 사용 승인까지 받은 상태이다. 그러나 hybrid capture Ⅱ를 포함하여 자궁경부암을 진단하기 위한 다양한 분석 방법들이 존재하지만 전 세계적으로 자궁경부암으로 인하여 매년 5 ~ 50만 명의 사망자가 발생하는 것에서 알 수 있듯이 자궁경부암 및 그 전구 병변의 포괄적 조기 검출 또는 진단을 위한 범용적 방법의 개발이 시급한 것이 현실이다.

최근 다양한 HPV 유형의 감염 여부를 검출/진단함에 있어서 특정 염기서열의 DNA 단편을 신속하고 간단하게 증폭할 수 있는 중합효소연쇄반응(PCR) 기법이 보편화되면서 이를 이용하여 지금까지 밝혀진 모든 유형의 HPV를 포괄적으로 검출하고자 하는 노력이 활발하게 시도되고 있다.

PCR 기법은 목적 병원체의 핵산 염기 서열에 특이적으로 결합하는 상보적 핵산 단편 서열(프라이머)을 가하여 온도에 따른 변성(denaturation), 재결합(annealing) 및 중합(polymerization) 과정을 반복하여 미량의 병원체 핵산을 증폭시켜 그 존부를 검출할 수 있는 기술로서(미합중국 특허 제 4,683,195호 및 4,683,202호), 다양한 유형의 HPV 감염 여부를 진단하는 데 사용되는 대표적인 기술 중 하나이다.

이런 PCR 기법은 임상 진단의 실용적 측면에서 세포진 검사(Pap smear)의 세포학적 검사와 달리 객관적인 대규모 검사가 가능하며, 측정원리 상 세포검사나 액상 hybrid capture에 비해 검사비용, 실험 절차, 검출 감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 등에서 상대적 우위를 가지고 있는 것으로 확인되어 있다. 그러나 현재까지 HPV 감염 여부를 조기에 광범위하게 1차적으로 검출/진단하기에 적합한 공통 프라이머(general primer)가 부족하여 PCR을 이용하여 HPV의 감염 여부를 임상적으로 적용하기에는 많은 어려움을 겪고 있다.

현재 전 세계적으로 임상에서 HPV 감염 여부를 검출/진단하기 위하여 널리 사용되는 대표적인 공통 프라이머로는 크게 북아메리카, 남아메리카 및 아시아에서 주로 사용되는 MY09/MY11 프라이머 세트와, 유럽 지역에서 주로 사용되는 GP5⁺/GP6⁺ 프라이머 세트 및 SPF1/SPF2 프라이머 세트로 구분될 수 있다. 이 밖에 최근 새롭게 개발되어 사용되고 있는 FAP59/FAP64 프라이머 세트와 PGMY09/PGMY11 프라이머 세트가 있으며, 일부 연구 목적으로 사용되는 많은 HPV 검출/진단을 위한 공통 프라이머 세트가 있으나, 현재까지 밝혀진 바 있는 다양한 HPV 유형과 비교할 때, 극히 제한된 유형의 HPV 검출/진단에만 국한되어 있을 뿐 아니라 HPV 유형에 따라 검출의 민감도가 크게 떨어지는 등 많은 문제점을 가지고 있는 것으로 판명되었다.

이에 따라 HPV 검출을 위하여 제안된 공통 프라이머가 내재적으로 지니고 있는 가치와 필요성이 있음에도 불구하고 실제 임상 목적에서의 활용에 큰 제약이 있다. 특히 새롭게 동정, 분류된 HPV 유형이 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성의 HPV 유형인지 또한 고위험군인지에 대해서는 단서를 찾을 수 없기 때문에 HPV 검출/진단과 관련하여 많은 혼란을 야기하고 있다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 다양한 유형의 HPV DNA 검출/진단을 위하여 자궁경부암의 진행과 관련하여 밀접한 관련이 있는 HPV의 특정 서열 또는 HPV DNA를 복제에 있어 필수적인 HPV 특정 서열과 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 공통 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기한 공통 프라이머를 사용하여 샘플 내에 HPV DNA를 증폭시키고, 증폭 여부에 따라 샘플 내에 HPV 유형의 존부를 분석할 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6 또는 상기 서열번호 1 내지 상기 서열번호 6에 각각 상보적인 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 제 1 프라이머 세트와; 서열번호 7 내지 서열번호 16 또는 상기 서열번호 7 내지 상기 서열번호 16에 각각 상보적인 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함하는 제 2 프라이머 세트를 포함하는 인유두종바이러스의 핵산을 증폭할 수 있는 합성된 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 인유두종바이러스의 E1 영역 또는 E7 영역을 특히 증폭할 수 있으며, 상기 프라이머 세트에 의하여 증폭되는 인유두종바이러스는 종양원성 인유두종바이러스, 예컨대 HPV-2a, 6b, 11, 13, 16, 18, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 44, 45, 51, 52, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 66, 67, 68, 70, 72, 73 및 74 유형이다.

한편, 본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 프라이머 세트를 사용하고, 생물학적 샘플로부터 얻어진 핵산을 표적 DNA로 하는 핵산 증폭 반응을 수행하여 인유두종바이러스의 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 관점에 따르면 상기 프라이머 세트를 사용하고 생물학적 샘플로부터 얻어진 핵산을 표적 DNA로 하여 상기 표적 DNA를 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭 단계에서 증폭 산물이 존재하는 경우 상기 샘플 내에 인유두종바이러스의 핵산이 존재하는 것으로 판단하는 단계를 포함하는 인유두종바이러스 유형의 존재를 분석하는 방법이 제공된다.

더욱이, 본 발명의 또 다른 관점에서는 상기 프라이머 세트; dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP); 내열성 중합효소; 및 PCR 완충 용액을 포함하는 인유두종바이러스의 유형을 검출하는 키트가 제공된다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

종래 PCR 기법을 활용하여 샘플 내에 존재하는 여러 유형의 HPV DNA와 혼성화(hybridization) 또는 상보적 결합(complementary binding)할 수 있는 공통적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 현재까지 발견된 HPV 유형의 수와 비교할 때, 검출/진단할 수 있는 유형의 수가 크게 제한될 뿐 아니라 HPV 유형에 따라 민감도가 크게 떨어진다. 이와 같이 현존하는 HPV 검출/진단을 위한 PCR 공통 프라이머는 HPV 게놈 중 L1 영역과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 대상으로 한 것이었기 때문이었다.

상기한 것과 같이 HPV 게놈을 구성하는 E6 유전자 및 E7 유전자는 각각 숙주 세포의 종양 억제 단백질 중의 하나인 p53 또는 pRb와의 결합부위를 암호화(encoding)하는 특정 핵산 서열을 가지고 있는데, 자궁경부암의 진행과 밀접한 관련이 있는 종양원성 HPV 유형, 예컨대 고위험군의 HPV 유형에서는 p53 또는 pRb와의 결합부위를 암호화하는 핵산 서열이 잘 보전되어 있다. 또한, HPV 게놈의 E1 유전자는 HPV 게놈의 복제를 개시하는 단백질을 암호화하고 있으므로, HPV가 숙주 세포에서 생장하기 위한 필수적인 서열이다.

본 발명자들은 이와 같은 발견을 토대로 종양원성 HPV 유형을 포함하는 다양한 HPV 유형의 핵산 서열과 상보적으로 결합할 수 있고, 이에 따라 해당 HPV 유형의 핵산 서열을 증폭시킬 수 있는 공통 프라이머를 설계하였다. 본 발명에 따라 합성된 공통 프라이머는 특히 HPV 게놈 중의 E6 영역 및 E7 영역과 상보적으로 결합할 수 있기 때문에, 샘플 내의 이들 유전자의 증폭 여부를 통하여 샘플 내에 HPV DNA의 존부를 확인할 수 있다. 따라서 본 발명에 따라 합성된 공통 프라이머를 사용하면 1회의 PCR 과정을 통하여 종양원성 HPV 유형을 포함하여 다양한 유형의 HPV 유형의 존재 여부를 분석/검출할 수 있다.

이를 위하여 본 발명에서는 총 72가지 HPV 유형의 전 서열을 기준으로 컴퓨터 프로그램을 이용하여 대표적인 PCR 공통 프라이머를 설계하였다. 상기 설계된 공통 프라이머는 다른 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다양한 HPV 유형에 대한 증폭도를 확인하고, 그 중 최종적으로 6개의 정방향 프라이머(순상 프라이머, forward primer)와 10개의 역방향 프라이머(역상 프라이머, reverse primer)를 선별하여 이를 조합하였다.

이어서 선별된 프라이머는 핵산자동합성기(Expediete™ 8909 합성기, ABI 사)를 사용하여 합성되었다. 합성된 프라이머는 먼저 대표적인 HPV 감염 세포주의 DNA를 표적 핵산으로 하여 PCR을 실시하여 세포주 내의 HPV 핵산의 감염 여부를 확인하였다.

또한 본 발명에서 합성된 프라이머를 사용하여 인체에서 수득한 샘플 DNA를 대상으로 PCR 증폭 과정을 수행하여 증폭 여부에 따라 샘플의 HPV 감염 여부를 조기에 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에서는 질확대경진(colposcopy) 등의 임상 병리 검진을 통하여 자궁경부암과 관련이 있는 것으로 판정된 환자 20명과 자궁경부암과 관련이 없는 정상으로 판정된 환자 20명으로부터 수득한 샘플을 대상으로 DNA 칩 검사(biomedlab 사)를 수행하고, 본 발명에서 합성된 공통 프라이머에 의하여 PCR 증폭 과정을 수행하면 세포학적 검진법과 DNA칩에 의한 진단법과 동일한 진단 결과를 얻을 수 있었다. 이에 따라 본 발명에 따라 합성된 공통 프라이머를 사용하여 HPV DNA의 감염 여부 및 자궁경부암의 조기 진단 여부를 조기에 진단할 수 있음을 확인하였다.

이하, 예증적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

본 실시예에서는 컴퓨터 시뮬레이션을 통하여 HPV 유형의 핵산을 증폭할 수 있는 공통 프라이머를 설계하였으며, 설계된 공통 프라이머를 대상으로 가상 증폭을 수행하였다.

(1) PCR 프라이머의 설계

본 발명의 목적인 다양한 유형의 HPV의 핵산 서열과 상보적으로 결합하여 이를 증폭시킬 수 있는 PCR 공통 프라이머로서의 뉴클레오티드를 설계하였다.

우선, 미국 NCBI(National Center for Biotechnology Information)과 미국립 로스 알라모스 HPV 데이터베이스로부터 HPV-1a, -2a, -3, -4, -5, -6b, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -15, -16, -16r, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, 28, -29, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -35h, -36, -37, -38, -39, -40, -41, -42, -44, -45, -47, -48, -49, -50, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -61, -63, -65, -66, -67, -68, -70, -72, -73, -74, -75, -76, -77, -80의 총 72가지 HPV 유형의 전 DNA 염기 서열을 확보하였다.

확보한 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 'DNASTAR(MegAlign™ 5, DNASTAR In.)'를 활용하여 ClustalW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)를 실행한 후 분류계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 그룹을 대표하는 유형의 염기서열을 선별한 다음, 다시 컴퓨터 프로그램 프라이머 프리미어 5(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 PCR 공통 프라이머를 설계하였다. 이때 프라이머의 길이는 24± 3 및 33±2 크기의 올리고뉴클레오티드로 설정하였으며 PCR 산물의 크기는 110bp ~ 320 bp로 제한하였다. 설계된 프라이머의 서열은 하기 표 1에 도시하였다. 설명의 편의를 위하여 본 발명에서 합성된 프라이머에 대해서는 HECP 순서에 따라 명명하였다.

표 1. 설계된 프라이머 서열

프라이머	서열	서열번호
HECP-F1^*	5'-CCTTCTATGTCACGAGCAATTAAGCGACTCAGA-3'	서열번호 1
HECP-F2^*	5'-CCTTCTATGTCACGAGCAATAAAGCGGCTCAGA-3'	서열번호 2
HECP-F3^*	5'-CCTGCATTGCTATGAGCAATTGAACAGCTCAGA-3'	서열번호 3
HECP-F4^*	5'-CCTTACATGTTACGAGTCATTAGACAACTCAGA-3'	서열번호 4
HECP-F5^*	5'-CCTGTATTGTTATGAACAATTTGACACCTCAGA-3'	서열번호 5
HECP-F6^*	5'-ACATTGCAATGAGCAGTTATTAGACAGCTCAGA-3'	서열번호 6
HECP-R1^**	5'-TTACTGCTTCTACATAAAACCATCCATTACATCCC-3'	서열번호 7
HECP-R2^**	5'-CTATTGCCTGTACTAGAAACCATCCGTTACACCCC-3'	서열번호 8
HECP-R3^**	5'-CTATAGCTTCTACTGAAAACCACCCTGTACACCCC-3'	서열번호 9
HECP-R4^**	5'-CAATGGCTTCTACATTAAACCATCCCGTACACCAC-3'	서열번호 10
HECP-R5^**	5'-CTACAGCCTCTACTAAAAACCATCCTGAGCATCCC-3'	서열번호 11
HECP-R6^**	5'-AAAAAACCATCCATTACACCCCGTCCCCTCCTC-3'	서열번호 12
HECP-R7^**	5'-CAGGTAGTAACCACCCCGTAGGCCTGCTGTGCT-3'	서열번호 13
HECP-R8^**	5'-TCACTCCACGCAGGCACACAATGGACACACAAT-3'	서열번호 14
HECP-R9^**	5'-CGTCCTCCTCGGTCCCGTCGGTACCTTCGGAAT-3'	서열번호 15
HECP-R10^**	5'-GTTTAGTGTTCCCAACAGAAGCTGTTGCACTTC-3'	서열번호 16

^*: 정방향 프라이머

^**: 역방향 프라이머

(2) 설계한 프라이머의 가상 증폭

상기 과정에서 설계한 HECP 프라이머를 대상으로 컴퓨터 프로그램(Apmlify 1.2, University of Wisconsin)을 사용하여 HPV 유형에 대한 가상 증폭도를 수행하였다. 특히, 본 과정에서는 자궁경부암과 관련이 높은 HPV-2a, -3, -6b, -7, -10, -11, -13, -16, -18, -26, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -39, -40, -42, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -70, -73 의 종양원성 HPV 유형을 증폭할 수 있는 것에 우선순위를 두었다.

위에서 설계된 HECP 프라이머를 조합하여 가상 증폭을 수행한 결과는 하기 표 2에 표시되어 있다.

표 2 설계된 프라이머의 가상 증폭

프라이머	증폭 HPV 유형	증폭산물 크기(bp)	증폭 위치 (HPV 16)
HECP 프라이머^*	2a, 6b, 11, 13, 16, 18, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 66, 67, 68, 70, 72, 73, 74	110 ~ 320	627 ~ 904

^*: 정방향 프라이머로서 상기 HECP-F1 내지 HECP-F6를 혼합하고, 역방향 프라이머로서 상기 HECP-R1 내지 HECP-R10을 혼합한 것임.

실시예 2

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 설계, 선별된 HECP 프라이머를 합성하고, 대표적인 HPV 감염 세포주와 HPV 비감염 세포주를 대상으로 PCR 증폭 시험을 수행하였다.

(1) HECP PCR 공통 프라이머의 합성

위 실시예에서 합성된 HECP 프라이머를 합성하였다. 상기 프라이머는 올리고뉴클레오티드 포스포르아미다이트 합성화학에 근거한 고체상 합성기법을 탑재하고 있는 Expedite™ 8909 핵산 합성기(ABI 사)를 이용하여 합성되었다.

우선, 프라이머 합성 반응은 올리고뉴클레오티드 3' 말단에 위치한 뉴클레오 사이드를 고정시킨 CPG 컬럼에서 되었으며, 기본적으로 디트리틸레이션(detritylation), 커플링(coupling), 캡핑(capping) 및 산화(oxidation) 반응을 반복주기로 하여 상기 실시예 1을 통하여 선별된 프라이머의 올리고뉴클레오티드 중합반응을 수행하였다.

합성 종료 후 30 % 암모니아수를 CPG 컬럼에 가하여 상기 올리고머를 격리시킨 다음 55 ℃에서 12 시간 이상 탈보호(deprotection)시켜 고속진공(Speed Vac.)으로 농축 건조하였으며 다시 역상액체크로마토그래피 및 음이온교환 크로마토그래피를 행하여 순수 정제하였다. 최종 정제된 올리고머는 260 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

(2) 선별된 프라이머의 HPV 유형에 따른 가상 증폭

상기 실시예 1에서 선별되어 조합된 공통 프라이머의 HPV 유형에 대하여 상기 실시예 1의 컴퓨터 프로그램((Apmlify 1.2, University of Wisconsin)을 사용하여 가상 증폭을 실시하였다. HPV 유형에 따른 가상 증폭 결과는 하기 표 3에 표시하였다.

표 3. 선별된 프라이머 조합의 HPV 유형에 따른 가상 증폭

프라이머	증폭 산물의 예상 크기(bp)
프라이머	HPV-16	HPV-18	HPV-31	HPV-43	HPV-2a	HPV-6b	HPV-11	HPV-1a	HPV-44
HECP	314	328	310	310	258	310	310	-^*	301

^*: 증폭이 일어나지 않음

(3) 합성된 PCR 공통 프라이머에 의한 PCR 증폭 시험

상기 합성과정을 통하여 합성된 HECP 공통 프라이머를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 Caski(ATCC CRL-1550), HPV-18 감염 세포주인 HeLa(ATCC CCL-2) 및 HPV 비감염 세포주인 K562(KCLB-10243, Korean Cell Line Bank)를 대상으로 PCR 증폭 시험을 수행하였다.

우선, Caski와 HeLa는 제조사의 지시에 따라 배양한 다음 0.25 % 트립신 용액을 가하여 배양 플라스크로부터 탈락시켜 원심 채집하였으며, K562 역시 제조사의 지시에 따라 배양한 다음 이들을 Dulbecco's phosphate buffered saline (Gibco 사)로 1회 세척하였다. 세척된 세포주를 현미경상에서 그 세포수를 계측한 다음 2 × 10⁶ 세포를 Genomic DNA isolation Kit (Cat. No. K-3032, Bioneer 사)를 이용하여 분리 정제하고 최종적으로 200 ㎕의 증류수(DW)에 용해시켜 주형 DNA 용액으로 활용하였다.

PCR 실험을 위한 반응물의 조성은 슈퍼바이오(Super Bio)사로부터 구입한 10 × 버퍼 2.5 ㎕, 10 mM MgCl₂ 3.75 ㎕, 10 mM dNTP 0.5 ㎕, Taq 중합효소 0.5 ㎕ (1 unit)와 상기에서 합성된 HECP 프라이머 각각 1 ㎕ (20 pmole), 증류수 5.2 ㎕, 상기에서 얻은 주형 DNA 8.0 ㎕로 구성된 반응액을 총 20 ㎕로 조정하였다.

PCR 사이클은 최초 94 ℃에서 5분간 예비 가열 후, 94 ℃에서 1분, 50 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분간의 사이클을 총 35회 반복하였으며, 최종적으로 72 ℃에서 5분간 가열한 후 반응을 종료하였다.

반응 종료 후 최종 용액 5 ㎕를 DNA 사이즈 스탠더드 마커(size standard marker)와 함께 2% 아가로스 겔(agarose gel)에 부과하여 전기영동하였다. 이 때, 전기영동 겔의 염색은 0.00005% 에티디움 브로마이드(ethidium bromide) 용액으로 행하였으며, 겔의 각 경로 상에서 출현 밴드의 유효 여부는 상기 표 3의 가상 증폭 실험에서 예측된 PCR 산물의 예상 크기와 비교하여 판정하였다.

도 1은 본 실시예에 따라 합성된 프라이머를 사용하여 HPV-16 감염 세포주인 Caski, HPV-18 감염 세포주인 HeLa 및 HPV 비감염 세포주인 K562를 대상으로 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 도 1에서 M은 스탠더드 마커이고, 레인 1은 Caski, 레인 2는 HeLa, 그리고 레인 3은 K562를 대상으로 한 것이다. 또한 측면의 숫자는 사이즈 마커의 크기를 나타낸다. 도면에서 볼 수 있는 것과 같이 본 실시예에 따라 합성된 HECP 프라이머를 사용하여 PCR 시험을 수행한 결과, HPV-16 감염 세포주인 Caski와 HPV-18 감염 세포주인 HeLa에 대해서는 상기 표 3에서 예측한 증폭산물의 크기와 동일한 크기의 증폭산물이 형성되었다. 반면에 HPV 비감염 세포주인 K562에 대해서는 증폭이 일어나지 않았음을 확인하였다.

실시예 3

본 실시예에서는 보다 다양한 유형의 HPV 핵산을 포함하고 있는 E.coli 균주를 대상으로 상기 실시예 2와 동일한 절차에 따라 HECP 프라이머 합성, PCR 증폭 및 전기영동을 실시하였다.

본 실시예에서 사용된 서로 다른 유형의 HPV 플라스미드 DNA를 함유하는 E.coli 균주는 다음과 같다:

HPV-16 (ATCC 45113);

HPV-18 (ATCC 45152);

HPV-31 (ATCC 65446);

HPV-43 (ATCC 40338);

HPV-2a (ATCC 45022)

HPV-6b (ATCC 45150);

HPV-11 (ATCC 45151);

HPV-1a (ATCC 45021); 및

HPV-44 (ATCC 40353).

각 유형의 HPV 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 E.coli 균주는 37 ℃ LB 액체 배지에서 16 시간 동안 진탕 배양한 다음 "Qiafilter Plasmid Maxi Kit (Cat. No. 12263, QIAGEN 사)"로 분리 정제하여 10 ng/㎕로 농도 조정하였으며, 이를 주형 DNA 용액으로 활용하였다.

도 2는 본 실시예에 따라 합성된 HECP 프라이머를 사용하여 여러 유형의 HPV 플라스미드 DNA를 함유하고 있는 E.coli 균주를 대상으로 PCR을 실시한 후 전기영 동한 사진이다. 도 2에서 M은 스탠더드 마커이고, 레인 1은 HPV-16 E.coli 균주 (ATCC 45113), 레인 2는 HPV-18 E.coli 균주(ATCC 45152), 레인 3은 HPV-31 E.coli 균주 (ATCC 65446), 레인 4는 HPV-43 E.coli 균주 (ATCC 40338), 레인 5는 HPV-2a E.coli 균주 (ATCC 45022), 레인 6은 HPV-6b E.coli 균주 (ATCC 45150), 레인 7은 HPV-11 E.coli 균주 (ATCC 45151), 레인 8은 HPV-1a E.coli 균주 (ATCC 45021), 레인 9는 HPV-44 E.coli 균주 (ATCC 40353)를 대상으로 한 것이다. 한편, 측면의 숫자는 사이즈 마커의 크기를 표시한 것이다.

도시된 것과 같이, HPV-1a (레인 8)를 제외한 모든 E.coli 균주에서 증폭산물이 형성되었으며, 그 증폭 산물의 크기는 상기 표 3의 가상 증폭 실험에서 예측한 것과 동일하였다. 특히, 모든 전기영동의 각 경로에선느 유효 밴드와 구분이 곤란한 어떤 밴드도 나타나지 않았으며, 이러한 사실은 본 발명에 따라 합성된 HECP 프라이머 세트가 HPV 유형에 따라 민감도가 전혀 떨어지지 않는다는 사실을 확인할 수 있었다.

즉, 본 발명에 따라 합성된 HECP 프라이머 세트는 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-43, HPV-2a, HPV-6b, HPV-11 및 HPV-44 유형의 DNA에 대한 PCR 증폭 능력이 인정되며 비 선택적 증폭이 없는 것으로 판단되었다.

비교실시예 1

본 비교실시예에서는 임상시료를 대상으로 종래의 세포 검사법에 따른 HPV 감염 여부 및 자궁경부암 관련 여부를 검진하였다.

이를 위하여 포천중문의과대학 차병원 부인암센터 외래 진료소를 내원한 여성 중 40명을 대상으로 담당 임상의의 책임 하에 질확대경진(colposcopy) 검사, 자궁경부촬영진(cervicography) 검사, 조직생검(biopsy) 및 세포진도말(pap-smear) 검사 등의 전문적 검진을 수행하였다. 본 비교실시예에 따른 세포 검사법에 따른 검진 결과는 하기 표 4에 표시하였다.

검진 결과 표 4에 도시된 것과 같이, 피검자 1, 2, 3, 6, 7, 8 및 10은 저급 상피 이형성증(Low-grade SIL), 피검자 4, 5, 9, 11, 12, 15, 18 및 20은 고급 상피 이형성증(High-grade SIL), 피검자 13, 14, 16, 17 및 19는 상피내암(squamous intraepithelial lesion, SIL) 환자로 진단되었다. 나머지 피검자(피검자 21 내지 피검자 40)는 본 비교실시예에 따른 자궁경부암 세포진 도말 검사에서 정상 세포를 가지는 자궁경부암 비관련 환자로 진단되었다.

표 4. 세포 검진에 따른 임상 시험 결과

피검자 NO.	병리성적	피검자 NO.	병리성적	피검자 NO.	병리성적	피검자 No.	병리성적
1	LSIL^*	11	HSIL	21	Squamous^****	31	Squamous
2	LSIL^**	12	HSIL	22	Squamous	32	Squamous
3	LSIL	13	SCC^***	23	Squamous	33	Squamous
4	HSIL	14	SCC	24	Squamous	34	Squamous
5	HSIL	15	HSIL	25	Squamous	35	Squamous
6	LSIL	16	SCC	26	Squamous	36	Squamous
7	LSIL	17	SCC	27	Squamous	37	Squamous
8	LSIL	18	HSIL	28	Squamous	38	Squamous
9	HSIL	19	SCC	29	Squamous	39	Squamous
10	LSIL	20	HSIL	30	Squamous	40	Squamous

^*: 저급 상피 이형성증 (Low-grade SIL);

^**: 고급 상피 이형성증 (High-grade SIL);

^***: 상피내암(Squamous intraepithelial lesion)

^****: 편평 세포

비교실시예 2

본 비교실시예에서는 상기 비교실시예 1의 피검자들로부터 얻은 임상시료를 대상으로 HPV DNA의 존재 여부를 선별(screening)하였다. 이를 위해서 HPV DNA와 상보적으로 결합하는 종래 알려진 탐침(probe)을 사용하였으며, 그 결과는 하기 표 5에 표시하였다.

본 비교실시예에 따른 HPV DNA 검사에서 상기 비교실시예 1에서의 검진 결과 자궁경부암과 관련 있는 피검자(피검자 1 내지 피검자 20)로부터 얻은 시료에서는 모두 HPV DNA가 선별되었으며, 자궁경부암과 관련이 없는 피검자(피검자 21 내지 피검자 40)로부터 얻은 시료에서는 모두 HPV DNA가 선별되지 않았다.

표 5. HPV Screening 검진 결과

피검자 NO.	DNA 검사	피검자 NO.	DNA 검사	피검자 NO.	DNA 검사	피검자 No.	DNA 검사
1	+	11	+	21	-	31	-
2	+	12	+	22	-	32	-
3	+	13	+	23	-	33	-
4	+	14	+	24	-	34	-
5	+	15	+	25	-	35	-
6	+	16	+	26	-	36	-
7	+	17	+	27	-	37	-
8	+	18	+	28	-	38	-
9	+	19	+	29	-	39	-
10	+	20	+	30	-	40	-

비교실시예 3

본 비교실시예에서는 상기 비교실시예 1 및 비교실시예 2를 통하여 HPV DNA로 감염 또는 자궁경부암과 관련된 것으로 검증된 피검자(피검자 1 내지 피검자 20)로부터 얻은 임상 시료를 대상으로 DNA 칩(Komed 사) 검사를 수행하였다. 본 비교실시예에서의 DNA 칩 검사에 따른 검진 결과는 하기 표 6에 표시하였다.

표 6에 표시한 것과 같이, 피검자 1은 HPV-56에, 피검자 2는 HPV-33에, 피검자 3은 HPV-58에, 피검자 4는 HPV-16에, 피검자 5는 HPV-18에, 피검자 6은 HPV-16에, 피검자 7은 HPV-16 및 HPV-66에, 피검자 8은 HPV-16 및 HPV-58에, 피검자 9는 HPV-58에, 피검자 10은 HPV-58 및 HPV-70에, 피검자 11은 HPV-52에, 피검자 12는 HPV-35에, 피검자 13은 HPV-16에, 피검자 14는 HPV-18에, 피검자 15는 HPV-16에, 피검자 16은 HPV-26에, 피검자 17은 HPV-16에, 피검자 18은 HPV-18에, 피검자 19는 HPV-56 및 HPV-68에, 그리고 피검자 20은 HPV-58에 각각 감염된 것을 검진되었다.

표 6. 임상 시료에 대한 DNA칩 검진 결과

피검자 NO.	DNA 칩	피검자 NO.	DNA 칩
1	HPV-56	11	HPV-52
2	HPV-33	12	HPV-35
3	HPV-58	13	HPV-16
4	HPV-16	14	HPV-18
5	HPV-18	15	HPV-16
6	HPV-16	16	HPV-26
7	HPV-16, 66	17	HPV-16
8	HPV-16, 58	18	HPV-18
9	HPV-58	19	HPV-56, 68
10	HPV-58, 70	20	HPV-58

실시예 4

본 실시예에서는 상기 비교예 1 내지 비교예 3을 통하여 HPV DNA에 감염 또는 자궁경부암과 관련이 있는 것으로 검진된 피검자(피검자 1 내지 피검자 20)로부터 통상의 방법에 따라 얻은 임상 시료를 대상으로 상기 실시예 2에서 합성된 HECP 프라이머를 사용하여 동일한 절차에 따라 PCR 시험 및 전기영동을 수행하였다.

도 3a 내지 도 3t는 각각 피검자 1 내지 피검자 20으로부터 얻은 DNA 시료를 대상으로 본 실시예에 따라 합성된 HECP 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 각각의 도면에서 M은 스탠더드 마커이고, 레인 1은 본 실시예에 따라 합성된 HECP 프라이머 세트를 나타낸 것이다. 한편, 측면의 숫자는 스탠더드 마커의 크기를 표시한 것이다.

도시된 것과 같이 본 실시예에 따른 HECP 프라이머 세트를 사용한 결과 자궁경부암과 관련이 있는 것으로 판정된 피검자(피검자 1 내지 피검자 20)로부터 얻은 DNA 샘플에 대해서는 모두 증폭 산물이 얻어졌다. 또한, 그 증폭 산물의 크기는 대략 300 bp 전후로서 이는 상기 표 3의 예측 결과와 일치하였다.

이런 결과는 자궁경부암 관련 피검자 20명에 대한 세포학적 검진(비교실시예 1), DNA 선별(비교실시예 2) 및 DNA 칩(비교실시예 3)의 결과와 일치하는 것임을 확인하였다.

실시예 5

본 실시예예서는 상기 비교예 1 내지 비교예 2를 통하여 HPV DNA에 감염되지 않거나 자궁경부암과 관련이 없는 것으로 검진된 피검자(피검자 21 내지 피검자 40)로부터 통상의 방법에 따라 얻은 임상 시료를 대상으로 상기 실시예 4와 동일한 절차에 따라 PCR 시험 및 전기영동을 실시하였다.

도 4a 내지 도 4t는 각각 피검자 21 내지 피검자 40으로부터 얻은 DNA 시료를 대상으로 본 실시예에 따라 합성된 HECP 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고 전기영동한 결과를 나타낸 사진이다. 각각의 도면에서 M은 스탠더드 마커이고, 레인 1은 본 실시예에 따라 합성된 HECP 프라이머 세트를 나타낸 것이다. 한편, 측면의 숫자는 스탠더드 마커의 크기를 표시한 것이다.

도시된 것과 같이 본 실시예에 따른 HECP 프라이머 세트를 사용한 결과 자궁경부암과 관련이 없는 것으로 판정된 피검자(피검자 21 내지 피검자 40)로부터 얻은 DNA 샘플에 대해서는 모두 증폭 산물이 형성되지 않았다.

이런 결과는 자궁경부암 관련 피검자 20명에 대한 세포학적 검진(비교실시예 1), DNA 선별(비교실시예 2)의 결과와 일치하는 것임을 확인하였다.

상기에서 본 발명의 바람직한 실시예를 기술하였으나, 이는 어디까지나 예시 일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 당업자라면 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 점은 자명하다. 그러나, 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.

본 발명에서 합성된 올리고뉴클레오티드는 종양원성 HPV 유형을 포함하는 다양한 유형의 HPV 핵산과 상보적으로 결합하여 상기 HPV 유형의 핵산을 포괄적으로 증폭할 수 있는 신규한 PCR 공통 프라이머로 사용될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 프라이머는 직접적으로 다양한 HPV 핵산을 검출할 수 있는 프로브로서도 활용될 수 있으며, 이를 이용하여 PCR을 실시하고 증폭 여부를 확인하여 샘플 내에 HPV 핵산의 존재 여부를 검출/진단하는데 활용될 수 있으므로 HPV에 의하여 야기되는 자궁경부암 등의 조기 검진에 활용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전체(genome)를 이용한 유전자 접근 방법을 통하여 조기에 HPV 감염 여부를 진단할 수 있기 때문에 추후 지속적이고 장기적으로 정확한 검진을 실시할 수 있어 자궁경부암의 예방효과가 기대된다.

또한 비교적 저렴한 비용으로 HPV 진단을 수행할 수 있을 뿐 아니라 검진 대상자에게 첨단결과를 조기에 알려줄 수 있으므로 신뢰도 및 만족감을 줄 수 있고, 국가적 차원에서 큰 문제가 되고 있는 자궁경부암과 같은 국민 건강에 일익을 담당할 수 있을 것으로 생각된다.

<110> Chawellbeings Co., Ltd. <120> Novel PCR General Primers and Method for Detecting Diverse Types of Human Papillomavirus by PCR in Genital <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 1 ccttctatgt cacgagcaat taagcgactc aga 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 2 ccttctatgt cacgagcaat aaagcggctc aga 33 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 3 cctgcattgc tatgagcaat tgaacagctc aga 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 4 ccttacatgt tacgagtcat tagacaactc aga 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 5 cctgtattgt tatgaacaat ttgacacctc aga 33 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 6 acattgcaat gagcagttat tagacagctc aga 33 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 7 ttactgcttc tacataaaac catccattac atccc 35 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 8 ctattgcctg tactagaaac catccgttac acccc 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 9 ctatagcttc tactgaaaac caccctgtac acccc 35 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 10 caatggcttc tacattaaac catcccgtac accac 35 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 11 ctacagcctc tactaaaaac catcctgagc atccc 35 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 12 aaaaaaccat ccattacacc ccgtcccctc ctc 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 13 caggtagtaa ccaccccgta ggcctgctgt gct 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 14 tcactccacg caggcacaca atggacacac aat 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 15 cgtcctcctc ggtcccgtcg gtaccttcgg aat 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer of Detecting HPV Nucleic Acid <400> 16 gtttagtgtt cccaacagaa gctgttgcac ttc 33

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 6 또는 상기 서열번호 1 내지 상기 서열번호 6에 각각 상보적인 핵산 서열을 포함하는 제 1 프라이머 세트와;

서열번호 7 내지 서열번호 16 또는 상기 서열번호 7 내지 상기 서열번호 16에 각각 상보적인 핵산 서열을 포함하는 제 2 프라이머 세트

를 포함하는 인유두종바이러스의 핵산을 증폭할 수 있는 합성된 프라이머 세트.
제 1항에 있어서,

상기 프라이머 세트는 인유두종바이러스의 E1 영역 또는 E7 영역을 증폭할 수 있는 합성된 프라이머 세트.
제 1항에 있어서,

상기 프라이머 세트에 의하여 증폭되는 상기 인유두종바이러스는 종양원성 인유두종바이러스인 것을 특징으로 하는 합성된 프라이머 세트.
제 1항에 있어서,

상기 프라이머 세트에 의하여 증폭되는 상기 인유두종바이러스는 HPV-2a, 6b, 11, 13, 16, 18, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 44, 45, 51, 52, 53, 55, 56, 57, 58, 59, 61, 66, 67, 68, 70, 72, 73 및 74 유형인 것을 특징으로 하는 합성된 프라이머 세트.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 사용하고, 생물학적 샘플로부터 얻어진 핵산을 표적 DNA로 하는 중합효소연쇄(PCR) 반응을 수행하여 인유두종바이러스의 핵산을 증폭하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트를 사용하고 생물학적 샘플로부터 얻어진 핵산을 표적 DNA로 하여 상기 표적 DNA를 증폭시키는 단계; 및

상기 증폭 단계에서 증폭 산물이 존재하는 경우 상기 샘플 내에 인유두종바이러스의 핵산이 존재하는 것으로 판단하는 단계

를 포함하는 인유두종바이러스 유형의 존재를 분석하는 방법.
제 6항에 있어서,

상기 생물학적 샘플은 인간으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 유형의 존재를 분석하는 방법.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 프라이머 세트;

dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP);

내열성 중합효소; 및

PCR 완충 용액을 포함하는 인유두종바이러스의 유형을 검출하는 키트.