KR100539342B1 - 이중-중합효소 연쇄반응에 의한 다양한 유형의인유두종바이러스 검출 방법 - Google Patents

이중-중합효소 연쇄반응에 의한 다양한 유형의인유두종바이러스 검출 방법 Download PDF

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Abstract

자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 인유두종바이러스를 포괄적으로 검출할 수 있는 뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트로서 서로 다른 크기의 증폭산물을 형성하는 프라이머 세트를 독립적으로 사용하는 PCR 과정을 연속적으로 수행하여 샘플 내에 존재하는 다양한 HPV 유형을 고감도로 증폭/검출하는 방법이 개시된다.
본 발명에 사용된 방법을 사용함으로써, 종래 PCR 법을 사용하면서 인유두종바이러스 유형에 따라 민감도와 특이성이 떨어지던 문제점을 크게 개선시켰을 뿐 아니라, 자궁경부암과 관련이 높은 모든 유형의 인유두종바이러스 유형을 동시에 검출할 수 있도록 하였다.

Description

이중-중합효소 연쇄반응에 의한 다양한 유형의 인유두종바이러스 검출 방법{ Method for Detecting Diverse Types of Human Papillomavirus by Nested-PCR}
본 발명은 인유두종바이러스(Human Papillomavirus, HPV)를 검출할 수 있는 프라이머를 이용하여 인유두종바이러스를 검출할 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다양한 인유두종바이러스를 포괄적으로 검출할 수 있는 별개의 프라이머 세트를 각각 독립적으로 사용하는 PCR 과정을 통하여 다양한 유형의 HPV DNA를 증폭 또는 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
자궁경부암(Cervical cancer)은 자궁경부암에서 발생하는 악성종양으로 전체 자궁암 발생 빈도의 95% 이상을 차지하고 있으며, 전 세계 여성 암 가운데 유방암 다음으로 발생 빈도가 높아 연간 약 44만 건 정도의 자궁경부암 환자가 신규로 보고되고 있다. 2000년도 보건복지부 암 등록 조사통계에 따르면, 대한민국에서 1년에 약 4,000 여명의 새로운 환자들이 발생하는 것으로 보고되고 있다. 다시 말하면 여성암에 있어서, 자궁경부암 발생빈도는 10.6%로서, 10대 암의 발생 빈도상 위암(15.8%)과 유방암(15.1%)에 이어 3위를 차지하고 있는 실정이다. 특히, 최근에는 20 ~ 30대 젊은 여성의 자궁경부암 감염률이 크게 증가하여 전체 환자의 32%를 차지하는 등 국민 보건상 심각한 문제로 대두되고 있다.
자궁경부암은 일반적으로 인유두종바이러스(HPV)가 자궁경부 상피 기저 세포에 감염한 후 저급상피이형성증(LSIL), 고급상피이형성증(HSIL), 상피내암(CIS) 등의 오랜 전구 단계를 거쳐 최종 침윤암으로 발전한다. 이처럼 최종 암으로 진행되기 전의 전담 단계 병변(pre-stage lesion)이 존재하기 때문에 이들 병변을 효과적으로 치료함으로써 자궁경부암을 조기에 예방할 수 있다.
상기한 바와 같이 자궁경부암의 발병원은 성 접촉으로 인하여 감염되는 HPV가 주요 인자인 것으로 밝혀지고 있다. HPV는 약 8kb의 이중쇄 환상 DNA 바이러스로서, HPV의 게놈에는 감염 후 초기 과정에 관여하는 E1 내지 E7 유전자와 후기 과정에 관여하는 L1, L2 유전자가 존재한다. 최근의 연구에 따르면 HPV가 암을 유발하는 기작은 HPV가 상피 세포에 감염하여 발암유전자 산물인 종양원성 단백질 E6와 E7을 만들고, 이들은 각각 숙주세포의 종양억제 단백질인 p53과 pRb와 결합하여 이들 종양억제 단백질의 기능을 억제한다. 결국, HPV에 감염된 세포는 종양형성 억제 단백질의 기능이 제거됨에 따라 형질전환(transformation)되어 자궁경부 종양형성(cervical neoplasia)으로 발전하는 것으로 규명되고 있다.
현재까지 HPV는 열린 해독틀의 서열차이에 근거하여 120 가지 이상의 다른 유형(genotype)이 발견되었고, 특히 이 가운데 약 37종의 HPV 유형(HPV-2, -3, -6, -7, -10, -11, -16, -18, -26, -30, -31, -32, -33, -35, -39, -40, -42, -43, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -61, -66, -67, -68, -69, -70, -73)이 자궁경부암을 야기하는 것으로 알려져 있다.
현재 자궁경부암과 그 전구 병변의 일차선별을 위한 방법으로는 크게 세포학적 방법과 분자생물학적 방법을 이용한 방법으로 구분될 수 있으며, 분자생물학적 방법은 HPV DNA와 탐침(probe) 사이의 직접적 접촉을 이용하는 방법과 HPV DNA의 증폭을 이용한 PCR 방법이 있다.
자궁경부 세포진의 세포학적 형태에 근거하는 세포진 검사(pap smear)를 포함하는 세포학적 방법은 1940년대 이후로 자궁경부암 선별 방법으로 사용되고 있으나 검진 결과가 주관적이고, 특히 30 ~ 40%의 높은 위음성율을 보이는 단점이 있다.
최근 HPV DNA와 탐침 사이의 직접 접촉을 이용하는 방법으로서 자궁경부 세포진의 HPV DNA와 RNA 탐침 사이의 액상 상보 결합을 효소 발색에 의하여 검출하는 'Hybrid capture Ⅱ" 방법이 개발된 바 있다. 그러나, 상기 'hybrid capture Ⅱ' 방법을 포함하는 HPV DNA와 탐침 사이의 직접 접촉을 이용하는 검진 방법에는 다량의 DNA 시료가 요구되고, 특히 RNA 탐침을 사용하는 경우 반응 산물이 불안정해지기 때문에 자궁경부암 및 그 전구 병변의 포괄적 조기 검색에 많은 한계를 가지고 있다.
특정 염기서열의 DNA 단편을 신속하고 간단하게 증폭시킬 수 있는 PCR 기법이 보편화되면서, PCR 방법을 이용하여 많은 유형의 HPV DNA를 포괄적으로 검출함으로써, HPV 감염 여부를 조기에 진단할 수 있는 많은 노력이 시도되고 있다.
PCR 기법은 목적 병원체의 특정 핵산 염기서열(target sequence)에 특이적으로 결합하는 상보적 DNA 단편(올리고머 프라이머)을 가하여 온도 변화에 따른 변성, 재결합 및 중합과정을 반복함으로써 미량의 특정 핵산을 증폭시켜 그 존부를 검출할 수 있는 방법으로, 미합중국 특허 제 4,683,195 및 4,683, 202 (본 발명에서는 참고로 제시됨)에 개시되어 있다. PCR은 세포학적 검사와 달리 대규모, 객관적 검사가 가능하며, 측정원리 상 세포검사 또는 액상 'hybrid capture'에 비하여 검사 비용, 절차, 감도(sensitivity) 및 특이도(specificity) 등에서 상대적으로 우위를 갖고 있다.
그러나, HPV 핵산을 포괄적으로 검출하기 위하여 현재까지 개발된 프라이머들은 다수의 HPV 유형에 비하면 제한된 수의 유형 검출에만 국한되어 있고 HPV 유형에 따라 민감도가 크게 떨어지는 등의 문제점을 내포하고 있다. 더욱이, 미량의 HPV 핵산을 검출하기 위해서는 PCR 사이클의 횟수가 증가되는데, PCR 사이클이 증가됨에 따라 프라이머와 상보적으로 결합하는 목적 핵산 서열 외에 다른 서열에 대해서 증폭이 일어날 수 있다.
결국, 현재 사용되고 있는 HPV 핵산 검출용 프라이머와 비교하여 보다 많은 유형의 HPV DNA를 동시에 고감도로 증폭 또는 검출할 수 있고, HPV 유형에 따른 민감도 및 특이도를 극대화시킬 수 있는 프라이머 및 PCR 기법의 필요성이 제기되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 일 목적은 다양한 인유두종바이러스의 핵산과 상보적으로 결합하여 증폭산물을 생성하는 프라이머 세트를 사용하여 샘플 내의 인유두종바이러스의 핵산을 증폭 또는 검출하는 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인유두종바이러스 유형에 따른 민감도와 미량의 인유두종바이러스 핵산에 대한 민감도를 크게 개선하여 샘플 내의 인유두종바이러스의 핵산을 증폭/검출할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 데 있다.
상기한 목적을 위하여, 본 발명의 일 관점에 따르면 다양한 인유두종바이러스 유형 DNA의 특정 서열과 특이적으로 결합되는 프라이머 세트를 사용하여 샘플 내의 인유두종바이러스의 핵산을 증폭할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서는 인유두종바이러스의 특정 서열에 상보적으로 결합될 수 있는 제 1 프라이머 세트를 사용하여 제 1 핵산 증폭과정을 수행하고, 상기 제 1 핵산 증폭 과정 결과 형성된 제 1 증폭산물 내의 특정 서열과 상보적으로 결합되며 상기 제 1 증폭산물보다 작은 제 2 증폭산물을 형성하는 제 2 프라이머 세트를 사용하여 제 2 핵산 증폭과정이 수행되어 샘플 내에 HPV 핵산이 미량으로 존재하는 경우에도 증폭산물을 확인할 수 있어 민감도 및 특이도를 크게 향상시킬 수 있다.
특히, 본 발명에서 사용되는 프라이머 세트는 인유두종바이러스의 L1 영역에 특이적으로 결합되며, 제 1 증폭과정에서 사용되는 프라이머 세트의 농도는 제 2 증폭과정에서 사용되는 프라이머의 농도보다 낮은 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 프라이머 세트를 이용하여 샘플 내의 인유두종바이러스의 핵산을 증폭시키고, 증폭 산물의 존재에 따라 샘플 내에 인유두종바이러스의 존재여부를 알 수 있는 분석 방법이 제공된다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기한 것과 같이, 종래 인유두종바이러스 검출을 위하여 사용되는 공통 프라이머는 검출될 수 있는 유형이 제한적일 뿐 아니라, 샘플 내에 존재하는 HPV의 유형 또는 미량의 HPV 핵산에 대한 민감도가 크게 떨어지는 문제가 있다. 본 발명에서는 다수의 HPV 유형, 특히 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 종양원성 HPV 유형의 핵산에 상보적으로 혼성화(hybridization) 될 수 있는 프라이머를 설계함과 동시에 상기 프라이머에 의하여 증폭될 수 있는 증폭산물의 크기가 차이가 나는 점을 이용하여 다단계에 걸친 핵산 증폭 과정을 통하여 다양한 HPV 유형을 고감도록 검출할 수 있도록 하였다.
우선, 지금까지 서열이 밝혀진 HPV 유형의 전 서열을 기준으로 많은 유형의 HPV 핵산에 결합될 수 있는 공통 프라이머 세트를 설계하였다. 설계된 공통 프라이머 세트는 서로 독립적인 1회의 PCR을 통하여 많은 유형의 HPV 핵산의 특정 서열에 대해서 증폭 산물을 생성할 수 있다. 특히, 바람직하게는 본 발명에 따라 설계된 2조의 프라이머 세트는 HPV 게놈의 특정 서열에 대해서 서로 다른 크기의 증폭산물을 형성한다는 점을 이용하여 각각의 프라이머 세트에 대한 PCR 과정을 연속적으로 수행함으로써, 미량의 HPV 핵산에 대해서도 증폭산물을 판별할 수 있었다.
본 발명에서 2 단계로 수행되는 PCR은 이른바 이중 PCR(Nested PCR)로서, 이를 도 1을 참조하여 설명한다.
도 1에 제시된 것과 같이, 우선 최종 목적 DNA(Target DNA) 서열의 외부에 위치하는 특정 DNA 서열과 상보적으로 결합함으로써, 최종 목적 DNA보다 큰 증폭산물(제 1 증폭산물)을 형성하는 프라이머 세트(제 1 프라이머 세트, outer primer)를 사용하여 제 1 핵산 증폭을 수행한다. 상기 제 1 프라이머 세트를 이용하여 생성된 제 1 증폭산물을 대상으로 하여 상기 제 1 증폭산물의 내부에 위치하는 특정 서열과 상보적으로 결합함으로써, 최종 목적 DNA인 제 2 증폭 산물을 형성하는 프라이머 세트(제 2 프라이머 세트, inner primer)를 사용하여 제 2 핵산 증폭을 수행한다. 이 경우, 상기 제 2 프라이머 세트를 이루는 프라이머(5' 프라이머 및 3' 프라이머)는 각각 최종 목적 DNA의 양 말단 또는 그 인근에 각각 특이적으로 결합한다.
즉, 본 발명에서 사용된 이중 PCR은 최종 목적 DNA의 외부에 존재하는 특정 서열과 상보적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하는 제 1 증폭을 수행하여 제 1 증폭산물을 형성하고, 제 1 증폭산물의 내부에 존재하는 특정 서열과 상보적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하는 제 2 증폭을 연속적으로 수행하는 것으로서, 제 1 프라이머 세트에 의한 제 1 증폭산물은 제 2 프라이머 세트에 의한 제 2 증폭산물을 포함한다. 이와 같은 이중 PCR을 이용하는 경우, 제 1 증폭과정에 의하여 다량 형성된 제 1 증폭산물에 대해서 연속적으로 제 2 증폭과정을 수행하기 때문에, 미량의 HPV 핵산이 샘플 내에 포함되는 경우에도 PCR 사이클을 무한정 반복할 필요는 없다. 따라서, PCR 사이클의 증가에 부수하여 야기될 수 있는 목적 핵산 이외의 다른 핵산 서열이 증폭되는 것을 방지할 수 있기 때문에, 최종 형성된 증폭 산물의 민감도와 특이도를 크게 개선시킬 수 있다.
이와 관련하여 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 인유두종바이러스의 L1 영역에 상보적으로 결합되며, 서열번호 1(또는 서열번호 1에 상보적인 서열)의 올리고뉴클레오티드와 서열번호 3(또는 서열번호 3에 상보적인 서열)의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 1 프라이머 세트를 사용하여 제 1 증폭산물을 형성한 뒤, 상기 제 1 증폭산물의 내부에 위치하는 특정 서열과 상보적으로 결합되며, 서열번호 2 (또는 서열번호 2에 상보적인 서열)의 올리고뉴클레오티드와 서열번호 3 (또는 서열번호 3에 상보적인 서열)의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제 2 프라이머 세트를 사용함으로써, 종래 PCR 방법에 따른 인유두종바이러스 핵산 검출 방법과 비교하여 민감도를 약 100 ~ 1000 배 개선시켰다.
특히, 본 발명의 2 단계 PCR 과정에서 제 1 증폭과정에 사용되는 프라이머(제 1 프라이머 세트)는 제 2 증폭과정에서 사용되는 프라이머 (제 2 프라이머 세트)와 비교할 때, 보다 적은 농도를 사용할 수 있다. 즉, 통상적인 1회의 PCR 과정에서 사용되는 프라이머 세트의 농도보다 5 ~ 1000 배 낮은 농도의 제 1 프라이머 세트를 사용한다. 이와 관련하여 상기 제 1 프라이머 세트는 제 2 프라이머 세트와 비교할 때 바람직하게는 5 ~ 100 배 낮은 농도를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 5 ~ 20 배 낮은 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 제 1 프라이머는 약 2 ~ 8 pM의 농도로 사용하고, 상기 제 2 프라이는 약 30 ~ 80 pM의 농도로 사용하면 최선의 결과가 도출될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
본 실시예에서는 컴퓨터 시뮬레이션을 통하여 다양한 유형의 HPV 유형과 상보적으로 결합하여 증폭산물을 형성할 수 있는 확인된 2조의 프라이머를 합성하였다.
(1) PCR 프라이머의 설계
우선, 미국 NCBI와 미국립 알라모스 HPV 데이터베이스로부터 현재까지 서열이 확인된 총 72가지의 HPV 유형의 전 DNA 염기 서열을 확보하였다. 확보된 DNA 서열을 컴퓨터 프로그램 'DNASTAR (MegAlign™5, DNASTAR Inc.)'를 활용하여 ClustaW 방법으로 쌍정렬(pairwise alignment) 및 다중서열정렬(multiple sequence alignment)을 실행한 후, 분류계통도(Phylogenetic tree)를 작성하고 각 그룹을 대표하는 유형의 염기서열을 선별하였다. 이어서 선별된 염기 서열에 대해사 다른 컴퓨터 프로그램(primer premier 5, PREMIER Biosoft International Co.)를 활용하여 PCR 공통 프라이머를 설계하였다. 이 때, 프라이머의 길이는 29 ±3 및 35 ±2 가량의 올리고뉴클레오티드로 설정하였으며, PCR 증폭 산물의 크기는 320 ~ 330bp와 150 ~ 170bp로 각각 다르게 제한하여, 이중 PCR 과정에서 서로 독립적인 증폭 단계에서 개별적으로 사용될 수 있도록 하였다.
(2) 설계된 PCR 공통 프라이머의 가상 증폭 및 선별
설계된 올리고뉴클레오티드를 대상으로 컴퓨터 프로그램 (Amplify 1.2, University of Wisconsin)을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 조합에 따른 증폭도를 확인하였다. 설계 과정에서 확보된 총 72 유형의 HPV DNA를 대상으로 하였으며, 특히 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 HPV-2a, -3, -6b, -7, 10, -11, -13, -16, -18, -26, -30, -31, -32, -33, -34, -35, -39, -40, -42, -44, -45, -51, -52, -53, -54, -55, -56, -57, -58, -59, -60, -66, -67, -68, -70, -73의 36종의 HPV 유형을 증폭할 수 있는 것에 우선 순위를 두고 프라이머 세트에 대한 가상 증폭도를 확인하였다. 또한, 각각의 프라이머 세트가 이중 PCR 과정에서 사용될 수 있도록 한 프라이머 세트에 의한 증폭위치가 다른 프라이머 세트에 의한 증폭위치 내부에 포함될 수 있도록 조정하였다.
가상 증폭에 따라 2 프라이머 세트가 선택되었으며, 각 프라이머 세트의 올리고뉴클레오티드 서열, 서열번호, 증폭유형, 증폭산물의 크기, 증폭위치는 하기 표 1에 표시하였다. 본 발명과 관련하여 선별된 2 프라이머 세트에 대해서는 설명의 편의를 위하여 이하에서는 각각 "AlbioNP1"과 "AlbioNP2"로 명명하기로 한다.
표 1. 선별된 공통 프라이머의 증폭
프라이머 세트 염기서열 서열번호 증폭 HPV 유형 증폭산물크기(bp) 증폭위치(HPV 16)
AlbioNP1 5`-GATGGTGATATGGTAGATACAGGATTTGG-3` 서열번호 1 2a, 3, 6b, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 65, 66, 67, 68, 70, 72, 73, 74, 77 322 ~ 334 6226 ~ 6548(L1)
5`-GCGTCAGAGGTTACCATAGAGCCACTAGG-3` 서열번호 3
AlbioNP2 5`-TTCTTCTTACGAAGGGAACAACTGTTTGTTAGACA-3` 서열번호 2 1a, 2a, 3, 6b, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 65, 66, 67, 68, 70, 73, 74, 77 165~170 6375~6548(L1)
5`-GCGTCAGAGGTTACCATAGAGCCACTAGG-3` 서열번호 3
아울러, 컴퓨터 프로그램을 통하여 대표적인 자궁경부암 관련 HPV 유형인 HPV 상기 선별된 AlbioNP1 프라이머 세트와 AlbioNP2 프라이머 세트 사용하여 대표적인 자궁경부암 관련 HPV 유형을 가상 증폭시킨 경우의 증폭산물의 크기는 하기 표 2에 표시하였다.
표 2. 선별된 공통 프라이머의 증폭 산물의 크기
프라이머세트 증폭산물의 크기 (bp)
HPV-16 HPV-18 HPV-31 HPV-35 HPV-56 HPV-2a HPV-6b HPV-11 HPV-1a
AlbioNP1 325 325 325 325 325 322 323 325 -*
AlbioNP2 170 170 170 170 170 165 170 165 170
* : 증폭산물 없음
(3) PCR 프라이머의 합성
선별된 AlbioNP1 및 AlbioNP 2 세트의 공통 프라이머가 핵산 합성기(Expedite™8909 핵산 합성기, ABI 사)를 이용하여 합성되었다. 우선, 합성반응은 올리고뉴클레오티드 3' 말단에 위치한 뉴클레오사이드를 고정시킨 CPG 컬럼에서 수행하였으며, 기본적으로 디트리틸레이션(detritylation), 커플링(coupling), 캡핑(capping) 및 산화(oxidation) 반응을 반복주기로 하여 선별된 프라이머 세트의 올리고뉴클레오티드 중합반응을 수행하였다. 합성 종료 후 30% 암모니아수를 CPG 컬럼에 가하여 상기 올리고뉴클레오티드를 격리시킨 다음 55 ℃에서 12시간 탈보호(deprotection)시켜 고속 진공(Seppd Vac.)으로 농축 건조하였다. 이어서 액상액체크로마토그래피 및 음이온교환크로마토그래피를 행하여 순수 정제하였다. 최종 정제된 올리고뉴클레오티드는 260 ㎚에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
실시예 2 : 합성된 공통 프라이머에 의한 이중 PCR 증폭 시험
본 실시예에서는 HPV-16 감염 세포주인 CaSki (기탁번호: ATCC CRL-1550)와 HPV-18 감염 세포주인 HeLa (기탁번호: ATCC CCL-2) 및 HPV 비감염 세포주인 K-562 (기탁번호 KCLB-10243, Korean Cell Line Bank)를 대상으로 상기 합성된 2 프라이머 세트를 독립적으로 사용하는 이중 PCR을 수행하였다.
(1) 주형 DNA의 추출
우선 CaSki와 HeLa는 제조사의 지시에 따라 배양한 다음 0.25% 트립신 용액을 가하여 배양 플라스크로부터 탈락시켜 원심 채집하였다. K-562는 제조사의 지시에 따라 배양하였다. 이어서 채집된 CaSki, HeLa 및 K-562를 'Dulbecco's phosphate-buffered saline (Gibco 사)로 1회 세척한 후 현미경상에서 그 세포 수를 계측한 다음 2 ×106 세포를 'Genomic DNA isolation Kit (Cat. No. K-3032, Bioneer사)'를 이용하여 분리 정제하고 최종적으로 200 ㎕의 증류수(DW)에 녹여 주형 DNA 용액으로 활용하였다.
(2) 제 1 중합효소연쇄 반응 (Primary PCR)
HPV 감염 여부 및 존재 확인을 위한 PCR 반응 조성은 수퍼 바이오(Super Bio)사로부터 구입한 PCR 반응 용액을 사용하였으며, 실시예 1에 따라 합성된 2 프라이머 세트를 포함한 조성은 다음과 같다.
10×buffer 2.5㎕, 10 mM MgCl2 3.75㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, Taq 중합효소 0.5㎕(1unit), AlbioNP1 프라이머 세트를 이루는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 각각 1㎕ (4 pmoles), 증류수 2.75㎕ 그리고 상기에서 형성된 주형 DNA 각 8.0㎕로 구성된 반응액을 총 20㎕로 조정하였다.
PCR 반응은 최초 94 ℃에서 5분간 예비 가열 후, 94 ℃에서 분리(denaturation) 1분, 50 ℃에서 결합(annealing) 1분, 그리고 72 ℃에서 연장(extension, polymerization) 1분의 사이클을 총 15회 반복한 후, 최종적으로 72 ℃에서 5분간 가열한 후 종료하였다.
(3) 제 2 중합효소연쇄 반응 (Nested PCR)
제 1 중합효소연쇄반응이 종료된 후, 생성된 제 1 증폭산물이 포함된 PCR 반응 용액을 사용하여 제 2 중합효소연쇄 반응을 수행하였다.
본 과정에서 사용된 PCR 반응 조성은 다음과 같다.
슈퍼바이오(Super Bio)사로부터 구입한 10 ×buffer 2.5㎕, 10 mM MgCl2 3.75㎕, 10 mM dNTP 0.5㎕, Taq 중합효소 0.5㎕(1unit)와 프라이머는 AlbioNP2 프라이머를 이루는 서열번호 2로 구성되는 올리고뉴클레오티드, 서열번호 3으로 구성되는 올리고뉴클레오티드 각각 1㎕ (40 pmoles), 증류수 9.75㎕ 그리고 100배 희석한 1차 PCR 반응산물 1.0㎕로 구성된 반응액을 총 20㎕로 조정하였다.
PCR 반응은 최초 94 ℃에서 5분간 예비 가열 후, 94 ℃에서 분리 30초, 50 ℃에서 결합 30초, 그리고 72 ℃에서 연장 1분의 사이클을 총 30회 반복한 후 최종적으로 72 ℃에서 5분간 가열한 후 종료하였다.
최종 반응액 5 ㎕를 DNA 사이즈 스탠더드 마커와 함RP 2% 아가로스 겔에 부과하여 전기영동하였다. 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효여부는 상기 실시예 1의 표 2에 제시되어 있는 가상 증폭 실험에서 얻어진 PCR 산물의 크기와 비교하여 판정하였다.
도 2는 본 실시예에 따라 CaSki, HeLa 및 K-562를 대상으로 AlbioNP1 프라이머 세트와 AlbioNP2 프라이머 세트를 각각 독립적인 PCR 과정에 사용하는 2 단계 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 도면에서 상단의 M은 사용된 스탠더드 마커를 의미하고, 레인 1은 HPV-16 감염 세포주인 CaSki, 레인 2는 HPV-18 감염 세포주인 HeLa, 레인 3은 HPV 비감염 세포주인 K-562를 대상으로 하였음을 표시한 것이다. 또한 측면의 숫자는 마커의 크기를 나타낸다.
도면에서 볼 수 있는 것과 같이, 본 실시예에 따라 2중 PCR을 실시한 결과 HPV 감염 세포주인 CaSki와 HeLa에 대해서는 상기 표 2에서 예측한 것과 동일한 크기의 증폭이 일어났다. 즉, 본 실시예에 의하여 2단계 PCR을 실행하게 되면 최종적으로 AlbioNP2에 의한 증폭산물이 얻어질 수 있는데, HPV-16 감염세포주인 CaSki 및 HPV-18 감염 세포주인 HeLa에 대해서는 표 2에서 예측한 증폭산물의 크기(170bp)와 동일한 크기의 증폭산물이 얻어졌다. (레인 1 및 레인 2) 그러나, HPV 비감염 세포주인 K-562에 대해서는 아무런 증폭 산물이 형성되지 않았다. (레인 3)
실시예 3 : 다양한 HPV 균주를 대상으로 한 이중 PCR 증폭 시험
본 실시예에서는 보다 다양한 HPV DNA가 삽입되어 있는 균주를 대상으로 상기 실시예 1에서 합성된 2 프라이머 세트를 연속적으로 사용하는 2단계 PCR 증폭을 수행하였다.
본 실시예에서 사용된 E. coli 균주는 다음과 같다.
ATCC 45153 (HPV-16), ATCC 45152 (HPV-18), ATCC 65446 (HPV-31), ATCC 40331 (HPV-35), ATCC 40549 (HPV-56), ATCC 45022 (HPV-2a), ATCC 45150 (HPV-6b), ATCC 45151 (HPV-11), 및 ATCC 45021 (HPV-1a)
각 HPV 유형의 플라스미드 DNA를 함유하는 E. coli 균주는 37 ℃ LB 액체 q1배지에서 16시간 동안 진탕 배양한 다음 'Qiafilter Plasmid Maxi Kit (Cat. No. 12263, QIAGEN 사)'로 분리 정제하여 10 pg/㎕로 농도 조정되었으며, 이를 주형 DNA 용액으로 활용하였다.
제 1 중합효소연쇄 반응과 제 2 중합효소연쇄반응은 상기 실시예 2와 동일한 조건과 절차에 따라 진행되었으며, 각각의 균주로부터 얻은 HPV 유형이 각각 포함된 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효여부는 표 2의 가상 예측결과와 비교하여 판정하였다.
도 3은 본 실시예에 따라 ATCC 45153 (HPV-16), ATCC 45152 (HPV-18), ATCC 65446 (HPV-31), ATCC 40331 (HPV-35), ATCC 40549 (HPV-56), ATCC 45022 (HPV-2a), ATCC 45150 (HPV-6b), ATCC 45151 (HPV-11), 및 ATCC 45021 (HPV-1a)로부터 수득된 HPV DNA를 대상으로 AlbioNP1 프라이머 세트와 AlbioNP2 프라이머 세트를 각각 독립적인 PCR 과정에 사용하는 2 단계 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 도면에서 상단의 M은 사용된 스탠더드 마커를 의미하고 측면의 숫자는 마커를 의미한다. 한편, 상단의 레인 1 내지 레인 9는 각각 ATCC 45153, ATCC 45152, ATCC 65446, ATCC 40331, ATCC 40549, ATCC 45022, ATCC 45150, ATCC 45151 및 ATCC 45021로부터 수득된 DNA를 대상으로 하였음을 표시한 것이며, 레인 10은 증류수를 사용한 네거티브 컨트롤이다.
도면에서 볼 수 있는 것과 같이 본 실시예에 따라 2중 PCR을 실시한 결과 모든 감염 세포주에 대하여 상기 표 2에서 예측한 것과 동일한 크기의 증폭이 일어났다. 즉, 본 실시예에 의하여 2단계 PCR을 실행하게 되면 최종적으로 AlbioNP2에 의한 증폭산물이 얻어질 수 있는데, 본 실시예에서 사용된 HPV 유형의 DNA가 삽입되어 있는 균주로부터 수득된 HPV DNA에 대해서는 표 2에서 예측한 증폭산물의 크기(170bp)와 동일한 크기의 증폭산물이 얻어졌다. (레인 1 내지 레인 9) 또한, 네거티브 컨트롤에서는 아무런 증폭 산물이 형성되지 않았다. (레인 10)
실시예 4 : 대상 시료의 농도 변화에 따른 2단계 PCR 증폭
본 실시예에서는 농도에 변화가 있는 CaSki, HeLa 및 K-562 세포주를 대상으로 상기 실시예 1에서 합성된 2 프라이머 세트를 연속적으로 사용하는 2단계 PCR 증폭을 수행하였다.
CaSki, HeLa, K-562로부터의 주형 DNA 추출과 2 단계 PCR은 상기 실시예 2와 동일한 조성과 절차에 따라 행하였으며, 겔의 각 경로 상에서 출현한 밴드의 유효여부는 컴퓨터 가상증폭 실험에서 얻어진 PCR 산물의 예상 크기 (표 2)와 비교하여 판정하였다.
도 4a 내지 도 c는 각각 본 실시예에 따라 농도를 달리하는 CaSki, HeLa 및 K-562를 대상으로 AlbioNP1 프라이머 세트와 AlbioNP2 프라이머 세트를 각각 독립적인 PCR 과정에 사용하는 2 단계 PCR을 실시한 후 전기영동한 사진이다. 도면에서 상단의 M은 사용된 스탠더드 마커를 의미하고, 측면의 숫자는 마커의 크기를 나타낸다. 또한 레인 1 내지 레인 7은 각각 대상 세포주가 104 cell, 103 cell, 10 2 cell, 101 cell, 100 cell, 10-1 cell, 10-2 cell로 사용되었음을 표시한 것이다. 한편 레인 8 및 레인 9는 증류수가 포함되어 있는 네거티브 컨트롤이다.
도면에서 볼 수 있는 것과 같이, 본 실시예에 따라 2중 PCR을 실시한 결과 HPV 감염 세포주인 CaSki와 HeLa에 대해서는 상기 표 2에서 예측한 것과 동일한 크기의 증폭이 일어났다. 즉, 본 실시예에 의하여 2단계 PCR을 실행하게 되면 최종적으로 AlbioNP2에 의한 증폭산물이 얻어질 수 있는데, HPV-16 감염세포주인 CaSki 및 HPV-18 감염 세포주인 HeLa에 대해서는 사용된 세포주의 양에 비례하여 증폭 강도가 어느 정도 감소하였으나, 모두 동일한 크기의 증폭산물을 형성하였으며, 이는 표 2에서 예측한 증폭산물의 크기(170bp)와 동일한 크기의 증폭산물이 얻어졌다. (도 4a 및 도 4b) 그러나, HPV 비감염 세포주인 K-562에 대해서는 사용되는 세포주의 양에 무관하게 아무런 증폭 산물이 형성되지 않았다. (도 4c)
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 기술하였으나, 이는 어디까지나 예시일 뿐, 본 발명의 정신을 훼손하지 않는 범위 내에서 다양한 변형과 변경이 가능하다는 사실은 당업자에게는 자명한 사실이다. 또한, 그와 같은 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은 첨부된 청구의 범위를 통하여 보다 분명해질 것이다.
본 발명에 따라 합성된 프라이머는 자궁경부암과 밀접한 관련이 있는 모든 유형의 HPV DNA를 포괄적으로 검출할 수 있기 때문에, 1회의 PCR 과정을 통하여 샘플 내에 존재하는 자궁경부암 관련 HPV DNA의 존재 여부를 손쉽게 알 수 있다.
특히 본 발명에서는 서로 다른 증폭산물을 생성하는 2조의 프라이머를 연속적으로 수행하는 이중 PCR 과정을 통하여 종래 PCR 법을 사용하여 HPV DNA를 검출하는 방법과 비교할 때 민감도를 100 ~ 1000 배 가량 향상시켰다.
따라서, 여성의 경부상피 세로로부터 수득된 미량의 DNA 샘플을 대상으로 종래 PCR 법과 비교하여 보다 정확하게 HPV의 감염 여부 및 HPV 감염으로 야기되는 자궁경부암 등을 조기 검출/진단에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이중-중합효소연쇄반응을 간략하게 설명하는 개념도;
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 HPV 감염 세포주 및 HPV 비감염 세포주를 대상으로 본 발명에서 합성된 2조의 프라이머를 각각 사용한 PCR 과정을 연속적으로 실시하고 전기영동한 사진;
도 3은 본 발명의 다른 실시예에 따라 다양한 HPV DNA를 함유하고 있는 균주를 대상으로 본 발명에서 합성된 2조의 프라이머를 각각 사용한 PCR 과정을 연속적으로 실시하고 전기영동한 사진;
도 4a 내지 도 4c는 각각 본 발명의 또 다른 실시예에 따라 HPV 감염 세포주 및 HPV 비감 염세포즐 대상으로 본 발명에서 합성된 2조의 프라이머의 농도를 달리하면서 독립된 PCR 과정을 연속적으로 실시하고 전기영동한 사진이다.
<110> ALBIOMED Co., LTD. <120> METHOD FOR DETECTING DIVERSE TYPES OF HUMAN PAPILLOMAVIRS BY NESTED-PCR <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Detecting HPV Types <400> 1 gatggtgata tggtagatac aggatttgg 29 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Detecting HPV Types <400> 2 ttcttcttac gaagggaaca actgtttgtt agaca 35 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Detecting HPV Types <400> 3 gcgtcagagg ttaccataga gccactagg 29

Claims (11)

  1. 인유두종바이러스의 특정 서열에 상보적으로 결합될 수 있는 제 1 프라이머 세트로서, 서열번호 1 또는 서열번호 1에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 3 또는 서열번호 3에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제 1 프라이머 세트를 사용하여 제 1 핵산 증폭과정을 수행하는 단계; 및
    상기 제 1 핵산 증폭 과정 결과 형성된 제 1 증폭산물 내의 특정 서열과 상보적으로 결합되며 상기 제 1 증폭산물보다 작은 제 2 증폭산물을 형성하는 제 2 프라이머 세트로서, 서열번호 2 또는 서열번호 2에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 3 또는 서열번호 3에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제 2 프라이머 세트를 사용하여 제 2 핵산 증폭과정을 수행하는 단계를 포함하는 인유두종바이러스 DNA의 증폭 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머 세트 및 상기 제 2 프라이머 세트는 인유두종바이러스 게놈의 L1 영역과 상보적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 DNA의 증폭 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머 세트는 인유두종바이러스 유형 2a, 3, 6b, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 65, 66, 67, 68, 70, 72, 73, 74, 77의 DNA를 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 DNA의 증폭 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 제 1 핵산 증폭과정에서 사용되는 상기 제 1 프라이머 세트의 농도는 상기 제 2 핵산 증폭과정에서 사용되는 제 2 프라이머 세트의 농도보다 낮은 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 DNA의 증폭 방법.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 제 2 프라이머 세트는 인유두종바이러스 유형 1a, 2a, 3, 6b, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 65, 66, 67, 68, 70, 73, 74, 77의 DNA를 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 DNA의 증폭 방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 인유두종바이러스는 10-2 이상의 세포수로 사용되는 것을 특징으로 하는 인유두종바이러스 DNA의 증폭 방법.
  7. 인유두종바이러스의 특정 서열에 상보적으로 결합될 수 있는 제 1 프라이머 세트로서 서열번호 1 또는 서열번호 1에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 3 또는 서열번호 3에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제 1 프라이머 세트를 사용하는 제 1 핵산 증폭 과정과, 상기 제 1 핵산 증폭 과정 결과 형성된 제 1 증폭산물 내의 특정 서열과 상보적으로 결합되며 상기 제 1 증폭산물보다 작은 제 2 증폭산물을 형성하는 제 2 프라이머 세트로서, 서열번호 2 또는 서열번호 2에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드와, 서열번호 3 또는 서열번호 3에 상보적인 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 제 2 프라이머 세트를 사용하는 제 2 핵산 증폭과정을 포함하는 증폭 단계와;
    상기 증폭 단계를 통하여 증폭산물이 존재하면 상기 샘플 내에 인유두종바이러스가 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 샘플 내에 인유두종바이러스의 존재를 분석하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머 세트 및 상기 제 2 프라이머 세트는 HPV 게놈의 L1 영역과 상보적으로 결합되는 것을 특징으로 하는 샘플 내에 인유두종바이러스의 존재를 분석하는 방법.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머 세트는 인유두종바이러스 유형 2a, 3, 6b, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 26, 27, 28, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 65, 66, 67, 68, 70, 72, 73, 74, 77의 DNA를 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 샘플 내에 인유두종바이러스의 존재를 분석하는 방법.
  10. 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
    상기 제 2 프라이머 세트는 인유두종바이러스 유형 1a, 2a, 3, 6b, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 60, 61, 65, 66, 67, 68, 70, 73, 74, 77의 DNA를 증폭할 수 있는 것을 특징으로 하는 샘플 내에 인유두종바이러스의 존재를 분석하는 방법.
  11. 제 7항 또는 제 8항에 있어서,
    상기 증폭 단계에 사용되는 상기 인유두종바이러스의 세포 수는 10-2 이상인 것을 특징으로 하는 샘플 내에 인유두종바이러스의 존재를 분석하는 방법.
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