JPH06502298A

JPH06502298A - ポリメラーゼ・チェーン・リアクションを用いたヒト・パピローマウイルス１６型の診断方法

Info

Publication number: JPH06502298A
Application number: JP3512559A
Authority: JP
Inventors: エメリー，ヴィセント　クライヴ; バヴィン，ペギー　ジェーン; ウォーカー，パトリック
Original assignee: ロイヤル　フリー　ホスピタル　スクール　オブ　メディシン
Priority date: 1990-07-19
Filing date: 1991-07-19
Publication date: 1994-03-17
Also published as: DE69126027D1; ATE152779T1; WO1992001815A1; DK0539461T3; EP0539461A1; US5501947A; GR3023820T3; EP0539461B1; GB9015845D0; ES2103819T3; DE69126027T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ポリメラーゼ・チェーン・リアクションを用いたヒト・パピローマウィルス１６型の診断方法本発明は、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いたヒト・パピローマウィルス（ＨＰＶ）、特にＨＰＶ１６の改良された検出方法に関する。

パピローマウィルスはヒトや他の哺乳動物に様々な疾患を起こす密接に関連したウィルスの一群である。現在では５７以上の種々の型のヒト・パピローマウィルスがある。新しい型の定義は、標準プロトコルにより液相でそれが既知の種のＤＮＡと５０％以下の交差ハイブリッド形成を有することである。数々のヒトの疾患は特定のパピローマウィルス型によるものである；例えば足底いぼはパピローマウィルス１型により、また尋常性症贅はパピローマウィルス７型による。

ヒト・パピローマウィルスは子宮頚癌の発生にも関係している（ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ、　１９７７）　ｏこれは、ＨＰＶ感染が子宮頚部上皮内異常増殖（ＣＩＮ）および子宮頚部の侵潤性癌腫を有する患者に高い割合で存在するという観察に基づいていた（Ｗａｌｋｅｒら、　１９８３）。

特定のＨＰＶ型のクローン化ＤＮＡが入手できることにより、一連のハイブリッド形成実験を用いて、疾患組織のＨＰＶ感染の存在を判定することが可能となった。これらの実験は、顕著なＣＩＮ病変および侵潤性癌の６０−９０％がＨＰＶ　ＤＮＡ配列を含むが、正常対照の間でのＨＰＶＤＮＡの感染率は９−２３％であることを示した。ＨＰＶのいくつかの型、例えばＨＰＶ１６．３１．３３および３５は子宮頚部の悪性腫瘍変化により強く関係しており、−次ヒト・ケラチノサイトを不死化し、かつ確立された細胞系をトランスフオームすることが分子分析から明らかである。ＨＰＶ６および１１のようなＨＰＶの他の型は良性病変および尖形コンジロームと関連している。これらのデータは、ＨＰＶ感染、特にＨＰＶ１６が確かに鱗状癌の原因または誘因物質であるという仮説を支持する。

ＰＣＲＣ３ａｉｋｉら、１９８８）は、標的配列の反射路にハイブリッド形成する２つのオリゴヌクレオチドブライマーを用いる、ＤＮＡ標的フラグメントの酵素的増幅に基づいている。プライマーはその３′末端が互いに対向するように方向を定められている。

最近の２つの研究（Ｙｏｕｎｇら、１９８９、Ｔｉｄｙら、１９８９）はＰＣＲを用いて、子宮頚部組織からの特定のＨＰＶ配列を増幅した。これらの研究者により用いられた条件下では、他のハイブリッド形成研究とは対照的に、正常集団におけるＨＰＶ型についての陽性シグナルは７０−８４％であることが示された。最近、ひとつの研究（Ｔｉｄｙら、１９８９）が一部撤回され（ＴｊｄｙおよびＦａｒｒｅｌ　Ｉ、１９８９）、その結果、子宮頚部のＨＰＶの存在を同定するためにＰＣＲを用いることに関連した問題が興味をひくようになった。

Ｔｉ　ｄｙらは、上流調節領域内の配列（ヌクレオチド７７６５−７５）を増幅し、一方Ｙｏｕｎｇらはオリゴヌクレオチドブライマーを用いてＥ６遺伝子内のヌクレオチド４２１−５４０の領域を増幅した。

これらの研究で報告されているＨＰＶ１６感染の発生率は、サザンプロット、フィルター１ｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成、ドットブロット研究およびイ＜ツかのＰＣＲ研究（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｒｕｔｅ、　１９８９）からのデータと比較した場合、驚く程高い。これらＰＣＲ研究で同定された高い感染率は、オリゴヌクレオチドブライマーが対象の標的ＤＮＡ配列に対して特異性を示す能力がなく、試料中に存在する他のパピローマウィルス型の増幅ＤＮＡフラグメントをもたらした結果であると説明できる。

ＰＣＲ反応の基本的必要事項はＤＮＡ配列（この配列に対してプライマーは相補的である）に特異的で、標的配列の効率的増幅を可能にするオリゴヌクレオチドブライマーを入手できることである。“特異的″とは、オリゴヌクレオチドの配列が標的配列の１、末端の一方または他方以外に、ＰＣＲ反応で分析しようとする試料中に存在するどのＤＮＡ配列とも、有意な度合でハイブリッド形成しないことを意味する。

他の密接に関連したパピローマウィルス型、特に６、ｌ１１８および３Ｉ型とＨＰＶＩ　６ＤＮＡ配列を比較した広範囲にわたる、コンピューターによる相同性と配列整合性調査の結果、我々はパピローマ・ウィルスの１６型に特有のＨＰＶ１６ゲノムの領域を同定した。これらの領域は本発明で用いられる好適な標的を提供する。

ＨＰＶＩ６ＤＮＡは顕著な子宮頚部疾患の宿主細胞ＤＮＡにＥ６とＥ７遺伝子だけが転写されるように組み込まれることが知られている。組み込みは、オーブン・リーディング・フレームＥｌおよびＥ２を破壊するように起こる。この情報を用いて、我々はＨＰＶＩ６のＥ６遺伝子の遠位領域およびＥ７遺伝子の基部領域にハイブリッド形成する２つのプライマーを選択した。Ｅ６遺伝子の翻訳停止コドンとＥ７タンパク質のメチオニン開始コドンとの間の距離は２ヌクレオチドであるが、密接に関連したＨＰＶ６および１１において、Ｅ６タンパク質の終止コドンはＥ７タンパク質のメチオニン開始コドンと２４ヌクレオチド重複腰その結果プライマーとＨＰＶ６および１１との間のどのようなミスマツチプライマー結合も種々の大きさの増幅体（ａｍｐｌ　ｉｍａｒ）のためにすぐにわかるだろう。従って、この領域にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを利用して、ＨＰＶ１６標的ＤＮＡの増幅領域を特異的に同定できる。

従って本発明はオリゴヌクレオチドＡ：５’　ＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＣＧＡＴＧＴＡ　３’およびその誘導体を提供する。

本発明はまたオリゴヌクレオチドＢ：５’　ＧＧＧＣＴＣＴＧＴＣＣＧＧＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣ３’およびその誘導体を提供する。

完全長の配列ＡおよびＢは、ＨＰＶＩ６ゲノムのそれぞれ４８９−５１２位および６８９−７１２位でハイブリッド形成する。

ＡおよびＢの誘導体には少なくともＩＯヌクレオチド長のＡおよびＢのフラグメントおよびそのようなフラグメントを含むオリゴヌクレオチドが含まれる。そのようなフラグメントを含むオリゴヌクレオチドは例えば１０−４０、好ましくは１２−２４ヌクレオチド長のＰＣＲプライマーとして用いるのに好適な大きさである。望ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドはＡおよびＢが誘導される領域に隣接する天然ＨＰＶ１６配列から得られる。通常、そのようなオリゴヌクレオチドはＡについては４７７−５２４位から、そしてＢについては６７７−７２４位から得られるだろう。

少なくともＩＯｌ例えば１２．１５．１８または２１ヌクレオチド長のＡおよびＢのフラグメントは２４ヌクレオチド長の配列ＡおよびＢから得られる連続配列に相当する。好ましくは、ＡおよびＢのフラグメントおよびこのようなフラグメントを含むオリゴヌクレオチドは、例えば５０％以上の、高いＧＣ含有量を有する。

特にことわらない限り、以後オリゴヌクレオチドＡおよびＢと記載するものは、上で定義したようなＡおよびＢの誘導体も含む。

本発明はまた試料中のＨＰＶｌ　６ＤＮＡの存在を検出するための一対のＰＣＲプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドＡとＢを提供する。

本発明はさらに、ＨＰＶＩ６に特異的な上で定義しているオリゴヌクレオチドを作製し、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）により試料中のＨＰＶ１６ＤＮＡを検出するためにこれらのオリゴヌクレオチドを用いることからなる、試料中のＨＰＶ１６ＤＮＡの存在を検出する改良された方法を提供する。

本発明のオリゴヌクレオチドは標準ＰＣＲ条件下（Ｓａｉｋｉら、１９８８）で用いられる。分析されるＤＮＡの試料をオリゴヌクレオチドＡおよびＢと共に反応混合物に加え、試料中のＤ　Ｎ　Ａを変性するために加熱し、オリゴヌクレオチドＡおよびＢがその標的配列とアニーリングするように冷やし、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼを加えることによりＰＣＲ反応を開始させる。

反復サイクルにより、例えば加熱およびアニーリングを２０−４０サイクル繰り返し、必要に応じて各サイクル中に新しいポリメラーゼを添加することにより標的ＤＮＡの増幅が得られる。通常、各サイクルにおいて混合物を約９５℃で約１分間にわたり加熱し、約４０℃で１−３分間アニーリングし、約７２℃で１−２分間反応させる。

一般に、ＰＣＲ緩衝液は、１０−５０１０−５Ｏ、好ましく　ハ２０−３０ｍＭノＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　１０−２５ｍＭの、好ましくは１５−２０ｍＭの硫酸アンモニウム、１−１０ｍＭの、好ましくは２−５　ｍＭの塩化マグネシウム、５ −１３ｍＭの、例えば８−１２ｍＭノ２−ノル−プトエタノール、０．００１− ０．００４％のゼラチン、１００−３００ｍＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む。望ましくは、１５ μＭ以下、例えば１−１０または１−５μＭ　（最終濃度）のプライマーＡおよびＢを反応に（有利には等モル量で）用い、そして０．５−５単位のＴａｑポリメラーゼを用いて反応を開始させる。

ＰＣＲ反応は、９０−９８℃で１−１０分間の変性、続ｔ、１テ２０−４０、例えば３０〜３５サイクルの増幅により行われることが好ましく、ｌサイクルは、９０−９８°Ｃで１−３分間の変性、５０−７０℃で１−３分間のプライマー・アニーリング、そして６０−８０℃で１−４分間のＤＮＡ重合を意味する。

本発明のオリゴヌクレオチドは下記の条件下で用いることが最も好ましい：反応緩衝液は、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ／ｐＨ８，４，１７ｍＭの硫酸アンモニウム、３ｍＭの塩化マグネシウム、ｌ０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．００２％のゼラチン、１μＭのＨＰＶ１６プライマー、】単位のＴａｑポリメラーゼ、２００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（デオキシアデノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシグアノンン三リン酸、およびデオキシチミジン三リン酸）である。ＰＣＲは下記のように行うこともできる。

９５℃で６分間の変性、続いて３５サイクルの増幅を行い、ｌサイクルは、９４ ℃で１分３０秒間の変性、６０℃で１分３０秒間のプライマー・アニーリングそして７２℃で２分間のＤＮＡ重合を意味する。

３５回目のサイクルの後、試料は７２℃でさらに１０分間インキュベートすることが好ましい。

上記反応は、３ｍＭの塩化マグネシウムを用いること、Ｔａｑ緩衝混合液中に最終濃度ｌμＭの濃度で各プライマーが存在すること、そしてアニーリング温度６０℃を用いる点で、５ａｉｋｉら（１９８８）により詳述された方法とは異なっている。これらの変更によりプライマーＨＰＶ１６ＡおよびＢとの反応の忠実度が高められる。

図面の説明図１は、上記のプライマーＡおよびＢを用いたＰＣＲによる、異種ＤＮＡおよび他のＨＰＶ型のＤＮＡの存在下におけるＨＰＶ１６ＤＮＡの同定を示す。上記の最適反応条件下においてＨＰＶ１６は増幅されるが、関連するパピローマウィルスの増幅へ導く交差反応は全く見られない。

図２は、ＨＰＶ１６検出の感度が５ゲノム当量であったことを示す。感度の低下なしに特異性を維持することは、本発明で記載された条件およびプライマーの重要な一面であり、正常な女性および疾患を有する女性からの子宮頚部塗抹標本中のＨＰＶ１６の正確な検出に役立つ。

図３および４は、実施例１で記載された実験の結果を示す。

図５は、ＨＰＶ１６のヌクレオチドｌ−１０００の配列を示す。記載された配列はＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌデータベース人力ＰＡ１６を示す。

下記の実施例に記載されているように、プライマーＡおよびＢを用いたＨＰＶ１６の診断は、ＨＰＶ１６の感染率が、例えばＹｏｕｎｇら、１９８９およびＴｉｄｙら、１９８９他で測定されたものよりも低いことを示している。これは、少なくとも５ゲノム当量のＨＰＶ１６を含む全ての試料を正確に同定しながらも、我々のプライマーの高い特異性が以前に達成されたものよりもはるかに少ない偽陽性をもたらすためである。

子宮頚部の病変に関しては“正常”であると予想された一般集団の試料からと、顕著な子宮頚部疾患を有していると同定されたこれら同じ女性の部分集団からの、子宮頚部塗抹標本から抽出されたＤＮＡ中の）（ＰＶ１６ＤＮＡを検出するための本発明に記載された診断方法の有用性が、それぞれ実施例１および２に記載されている。ＰＣＲ反応にオリゴヌクレオチドＡおよびＢを用いて、我々は一般集団中のＨＰＶ１６感染率が他のＰＣＲによる研究で測定されたそれよりも低く、１８．９％であるらしいことを明示する。

さらに、実施例２が示すように、我々のプライマ一対を用−いた子宮頚部塗抹標本のＨＰＶ１６の検出は、疾患の現状と相関しているように思える。従って、細胞学のような既存の方法と共に用いる場合、本発明は顕著な子宮頚部疾患を有する患者を同定する診断方法として用いられ、子宮頚癌へと進行する高い危険性を有する患者を識別することにも用いられる。

実施例１１９８７年５月−９月に、細胞学および膣鏡検査と合せて子宮頚部スクリーニング・サービスを、ロンドンとハートフォードシャーの境界に近い一般診療所の全ての成人女性患者に（彼等が最後に子宮頚部塗抹標本検査を行った時期に関係なく）提供した。その診療所は圧倒的に中産階級地区にあった。２１才以上の２８７９人の全女性患者のうち２４９人の女性がこのサービスに進んで参加した。

実験群の２４９人の女性は細胞学、膣鏡検査、そしてＧ１１ｅｓら（１９８８）に記載されているような特定生検の組織学的分析により調へた。各患者から２つの子宮頚部塗抹標本を採取した：ひとつは標準細胞学的検査のためてあり、他のひとつはあとに続く、ウィルス学的分析に用いるために冷たいリン酸緩衝溶液１０ｍ１に入れた。

これらの細胞を遠心により集め、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に記載されているように５ＤＳ−プロテイナーゼに溶解およびフェノール／クロロホルム精製、その後のエタノール沈澱によりＤＮＡを抽出した。

このように単離されたＤＮＡ　１μｇをＰＣＲ分析にかけた。ＰＣＲ反応緩衝液は、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ／ｐＨ８，４，１７ｍＭの硫酸アンモニウム、３０１Ｍの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．００２％のゼラチン、ｌμＭのＨＰＶ１６プライマー、１単位のＴａｑポリメラーゼ、２００ＭＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（デオキシアデノシン三リン酸、デオキシンチジン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、およびデオキシチミジン三リン酸）を含有していた。ＰＣＲは９５℃で６分間の変性、続いて３５サイクルの増幅により行い、ｌサイクルは９４℃で１分３０秒間の変性、６０℃ で１分３０秒間のプライマー・アニーリングそして７２℃で２分間のＤＮＡ重合を意味する。１５試料から得られた結果を図３および４に示す。全ての試料は、コード化された子宮頚部塗抹標本試料から抽出したＤＮＡを用いて、別々に２回分析された。矛盾した結果が得られた試料をさらに２回のＰＣＲ分析にかけ、最初の陽性シグナルの原因となるＨＰＶ１６ＤＮＡの混入を除外した。各分析において、それぞれクローン化ＨＰＶ１６ＤＮＡおよび水からなる陽性および陰性対照を用いて、結果を確認し、混入による偽陽性シグナルを避けた。

累積的分析により、これら女性において、１８．９％（４７／２４９）のＨＰＶ１６の感染率が得られた。

実施例２実施例１で検査された２４９人の女性の膣鏡検査は２９人の女性が実際に子宮頚部異常を有し、これらは子宮頚部疾患の下記の段階に段階針けし得ることを示した。

ＣＩＮ　Ｉ　ｎ＝１６ＣＩＮ２　ｎ＝８ＣＩＮ３ｎ＝５この出願に記載された我々のＰＣＲを用いた場合、これらの患者のＨＰＶ１６の感染率は下記のようであった。

疾患の段階　ＨＰＶ陽性の数　患者の数　ＨＰＶ陽性の％ＣｌＮ３　４　５　８０ＣＩＮ２　４　８　５０ＣＩＮＩ　２　１６　１２．５正常　３７　２２０　１６．８合計　４７　２４９　１８．９従って、上記の方法を用いて、ＨＰＶＩ６が顕著な子宮頚部疾患（ＣＩＮ３）を有する５人の女性のうち４人に、中程度の疾患（］ＩＮ）を有する８人の女性のうち４人に、軽症／境界線上の疾患（ＣＩＮＩ）を存する１４人の女性のうち２人に検出された。

子宮ｗｉ部異常のない女性において、３７／２２０の女性はＨＰＶＩ６陽性であり、細胞学的に正常な女性集団において１６．８％のＨＰＶ感染率であった。軽症または全く疾患のない女性と顕著な疾患（ＣＩＮ２または３）を有する女性のＨＰＶＩ６保持状態の全体的比較により、ＨＰＶＩ６は子宮頚部疾患と関連していることが示された。

ｏｐｖｉｓ保持状態　ＣＩ　Ｎ　２／３　グループの全数なし　あり陽性　３９　８　４７これらの結果は、下に示すように感度、特異性、陽性予想値および陰性予想値および相対的危険度について評価するために用いられる。

感　度　８／１３　（０，６２）特　異　性　１９７／２３７　（０，８３）陽性予想値　８／４７　（０，１７）陰性予想値　１９７／２０２　（０，９８）相対的危険度　６．９この診断検査の陰性予想値および特異性は高いが、顕著な子宮頚部疾患を有する女性を同定するためにＨＰＶＩ６のみを用いる陽性予想値は低い。すなわち多くの正常な女性がＨＰＶＩ６を有している。しかしながら、顕著な子宮頭部疾患を有する女性は、その塗抹標本に６．９倍も多くＨＰＶＩ６を有する。

これらのデータを基にして、本発明に記載された方法は顕著な子宮頚部疾患の危険のある女性を同定できる可能性があり、子宮頚癌に進行する女性を同定するための診断的価値を有する。

実施例３この実験群（実験群Ｂ）は・軽度の子宮頚部異常の塗抹標本レポートにより継続的にＲｏｙａｌ　Ｆｒｅｅ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌの膣鏡検査クリニックに通院している２００人の患者から成っていた。この集団の臨床的詳細はＧｉ　Ｉｅｓら（１９８８）に記載されている。最終的な診断はこの群の２１人の女性には行なわれず、これらはＰＣＲ分析がら除外された。この集団の平均年令は２９才であった（ＩＮを有する女性の平均年令は２６．９才；病理学的に正常な子宮頚部を有する女性の平均年令は３３．５才）。各患者から２つの子宮頚部掻き取り試料を採取した；ひとっは標準細胞学分析に用い、他のひとつは冷たいリン酸緩衝溶液１０ｍ１に入れた。後者の試料の細胞を遠心によりベレット化し、ＤＮＡを５ＤＳ−ブロティナーゼに溶解で抽出し、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈澱により精製した。

ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（Ｐ　ＣＲ）を実施例１に記載したように行った。

結果の分布の統計的分析はＮ２または適宜にフィッシャーの正確なテストを用いて決定した。重い疾患とＨＰＶＩ６を有する相対的危険は、ＨＰＶ１６陽性群の疾患の発生率をＨＰＶ１６陰性群の疾患の発生率で割ることにより計算した。

実施例１−３の考察本発明のＰＣＲアッセイを用いて、軽度の疾患を示す塗抹標本で膣鏡検査クリニックに照会された１７９人の女性から得られた子宮頚部掻き取り試料中のＨＰＶｌ　６ＤＮＡを検査した。この実験集団中のＨＰＶＩ６の全体的感染率は表１に示す。さらに、実施例１ににおける女性（実験群Ａ）のＨＰＶＩ６の感染率も示す。

２つの実験集団では、ＨＰＶＩ６の感染率において有意差があった。ＨＰＶＩ６を実験群Ａの３３人の女性（１８％）から、また実験群Ｂの１０９人の女性（６１％；　ｐ　＜０．０００１）から検出した。

全ての患者の膣鏡検査および適宜に生検試料の組織検査の後に、両実験集団の女性は次のグループに分けられた：正常、いぼウィルス感染（ＷＶＩ）　、ＣＩＮＩ、（、ＩＮ２、ＣｌＮ３゜実験群Ａ（実施例１）およびＢ（実施例３）の各グループのＨＰＶ１６感染率は表２に示す。ＨＰＶＩ６は両実験群において高い等級のＣＩＮ、特にＣｌＮ３を有する患者に感染率が高かった（実験群Ａては７５％、実験群Ｂでは７４．３％）。各実験集団中のＣＩ　Ｎ　２とＣｌＮ３グループ両方のＨＰＶｌＧの感染率は有意差がなかった。

しかしながら、実験群ＢのＣＩＮＩを有する女性は実験群ＡのＣＴＮを有する女性よりもＨＰＶ１６陽性が多いようであった（ｐ＜　０．０３）。さらに、両実験集団の子宮頚部異常の徴候が全くない女性のＨＰＶ１６保持状態の分析は２つの実験集団間で有意差を示した（　ｐ　＜　０．０００１）。

子宮頚部疾患を全く持ったことのない女性と組織学的に子宮頚部異常と示された女性とのＨＰＶＩ　６！＠染率の比較を表３に示す。

これらのデータは２つの実験集団を一緒にすることにより得られ、ＨＰＶＩ６が子宮頚部疾患をもった女性により多く存在しているらしい（ｐ　＜　０．０００１）ことを示す。異常な子宮頚部病変を有する女性を軽症段階（ＷＶＩとＣＩＮＩ）または重症段階（ＣＩＮ２とＣｌＮ５）疾患に従って段階分けした場合、後者のグループはＨＰＶＩ６を保持している可能性が高いようである（表４；ｐく０、０００２）。

ＨＰＶＩ６を有することと重症の子宮頚部疾患（ＣＩＮ２とＣｌＮ５）とに関連した相対的危険度を両実験集団について計算し、表５に示す。実験群ＡではＨＰＶＩ６に関連した相対的危険度が５．６８であるのに対し、実験群Ｂでは相対的危険度が１．４８である。

体的発生率（本頁以下余白）表２．実験集団ＡとＢにおける病理学的に正常な子宮頚部、イホウイルス感染（ＷＶＩ）、ＣＩＮＩ、ＣｌＮ２およびＣＴＮ３と最終診断された女性のＨＰＶ　１６ＤＮＡの発生率。各グループの２つの実験集団間の統計的有意差も示す（ｎ、　ｓ、　＝有意差なし）。

表３．病理学的に正常な子宮頚部を有する女性（すなわち子宮頚部異常の病歴なし）と任意の程度の異常子宮頚部病変を有する女性とのＨＰＶ１６ＤＮＡ感染率の比較。異常子宮頚部病変グループは実験群ＡとＢの女性から成っていた。

Ｘ’＝４］、４　：　ｐ＜０．０００１表４．軽症の子宮頚部疾患（ＣＩＮＩ）および重症の子宮頚部疾患（ＣｌＮ２とＣｒＮ５）の女性のＨＰＶ１６ＤＮＡの感染率。分析は実験群ＡとＢの結果を合せることにより得たデータに対して行った。

Ｘ　２＝１４．３；　ｐ＜０．０００２表５．実験集団ＡとＢにおけるＨＰＶ１６ＤＮＡの存在と重症子宮頚部疾患とに関連した相対的危険度匁壓ｖａｎ　Ｂｒｕｔｅ、　ＡＪＣ，Ｃ１ａａｓ　ＥＣＪ、　ｄｕ　Ｍａｉｎｅ　Ｍ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）、ｒ子宮頚部掻き取りおよび生検試料中のヒト・／ぐピローマウイルス遺伝子型を検出するためのポリメラーゼ・チェーン・リアクションテノ非汚染プライマーノ使用Ｊ　Ｊ、Ｍｅｄ、　Ｖｉｒｏｌ、　２９．２０−２７゜Ｇ１１ｅｓ　ＪＡ、　Ｈｕｄｓｏｎ　Ｅ、　Ｃｒｏｗ　Ｊ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄ　ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ、　Ｐ（１９８８）。

「子宮頚部細胞スクリーニングの精度の膣鏡評価Ｊ　ＢｒｉｔｉＳｈＭｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　２９６．　ｉ：３１１．１０９９−１１０２゜５ａｉｋｉ　ＲＫ、　Ｇｏｌｆａｎｄ　ＤＨ，５ｔｏｆｆｅｌ　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８８）　ｒ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー誘導酵素的増幅Ｊ　５ｃｉｅｎｃｅ２３９．４８７−４９１゜Ｔｉｄｙ　ＪＡ、　Ｐａｒｒｙ　ＧＣＮ、　Ｗａｒｄ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）　ｒ細胞学的に正常な子宮頚部における高割合のヒト・パピローマウィルス１６型感染」Ｌａｎｃｅｔ　ｉ：　４３４゜Ｔｉｄｙ　Ｊ　ａｎｄ　Ｆａｒｒｅｌｌ　ＰＪ　（１９８９）、　ｒ撤回：ヒト・ノ＜ビローマウイルス　１６ｂ亜型Ｊ　Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ、　１５３５゜Ｗａｌｋｅｒ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ　（１９８３）　ｒ子宮頚部上皮的腫瘍を有する患者におけるヒト・パピローマウィルス抗原の保有率Ｊ　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ４８、９９−１−１゜Ｙｏｕｎｇ　ＬＳ、　Ｒｅｖａｎ　Ｉｓ、　Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＭＡ　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）　ｒポリメラーゼ・チェーン・リアクション・　子宮頚部のヒト・パピローマウィルス感染を検査するための新しい疫学的手段Ｊ　Ｂｒ、　Ｍｅｄ、　Ｊ。

２９８、１４−１８゜Ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ　Ｈ，（１９７７）　ｒヒト・パピローマウィルス：　扁平上皮細胞癌における役割Ｊ　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７８．　ｌ。

ＨＰＶ　１６　ＤＮＡの量ＰＶ１６プライマーで増幅した子宮頚部塗抹標本試料１　２３　Ａｓ　６７８９ ’、０７１１２２１ム１５−−。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）に用いるオリゴヌクレオチドプライマーがオリゴヌクレオチドＡ：【配列があります】およびその誘導体と、オリゴヌクレオチドＢ：【配列があります】およびその誘導体であることを特徴とする、ＰＣＲを用いて試料中のＨＰＶｌ６ＤＮＡを検出することを含んでなる、試料中のＨＰＶｌ６の存在を検出する方法。
２．プライマーがオリゴヌクレオチドＡ：【配列があります】およびＢ：【配列があります】である、請求の範囲１記載の方法。
３．プライマーが１μＭの濃度でＰＣＲに用いられる、請求の範囲１または２記載の方法。
４．試料が子宮頸部塗抹標本である、請求の範囲１−３のいずれか１つに記載の方法。
５．プライマ−Ａ：【配列があります】またはその誘導体およびプライマ−Ｂ：【配列があります】またはその誘導体である一対のＰＣＲプライマーと、場合によりＰＣＲに好適な緩衝液とを含んでなる、試料中のＨＰＶｌ６ＤＮＡの存在を検出するキット。
６．プライマーがＡ【配列があります】およびＢ：【配列があります】である、請求の範囲５記載のキット。
７．オリゴヌクレオチドＡ：【配列があります】またはその誘導体。
８．オリゴヌクレオチドＢ：【配列があります】またはその誘導体。
９．集団からの試料を請求の範囲１−４のいずれか１つに記載の方法により、または請求の範囲５または６記載のキットを用いて分析することを含んでなる、ＨＰＶｌ６の存在について集団をスクリーニングする方法。
１０．集団が成人女性集団である、請求の範囲９記載の方法。