JP2785164B2 - ヒトパピローマウイルスの検出方法 - Google Patents
ヒトパピローマウイルスの検出方法Info
- Publication number
- JP2785164B2 JP2785164B2 JP3230839A JP23083991A JP2785164B2 JP 2785164 B2 JP2785164 B2 JP 2785164B2 JP 3230839 A JP3230839 A JP 3230839A JP 23083991 A JP23083991 A JP 23083991A JP 2785164 B2 JP2785164 B2 JP 2785164B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- dna
- hpv
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトパピローマウイル
ス（以下ＨＰＶと略記する）の検出方法に関し、更に詳
細には良性型及び／又は悪性型ＨＰＶの特異的な検出方
法に関する。
ス（以下ＨＰＶと略記する）の検出方法に関し、更に詳
細には良性型及び／又は悪性型ＨＰＶの特異的な検出方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＰＶは、パポバウイルス（ｐａｐｏｖ
ａ ｖｉｒｕｓ）科に属する小型ＤＮＡウイルスで、ヒ
トの皮膚のいぼ、口腔、肛門、性器の尖圭コンジローマ
などから分離され、昔からいぼをつくるウイルスとして
知られてきた。ＨＰＶは、現在６０種以上もの異なった
タイプが見つかっている。このうちＨＰＶ６、ＨＰＶ１
１は尖圭コンジローマ等、主に性器に良性の腫瘍を引起
こす良性型ＨＰＶである。またがんに至る悪性腫瘍を引
起こす代表的ＨＰＶとして、以前よりＨＰＶ１６、ＨＰ
Ｖ１８が知られていたが、現在ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３
等の悪性型ＨＰＶの存在が知られている〔デ ビラース
（ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ）、ジャーナルオブ ビロロ
ジー（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６
３巻、第４８９８〜４９０３頁（１９８９）〕。ＨＰＶ
が子宮頸がんを引起こす要因の一つである〔Ｍ．デュル
スト（Ｍ．Ｄｕｅｒｓｔ）ほか、プロシーディングス
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシ
ーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８０巻、第３８１２〜３８１
５頁（１９８３）〕という報告がなされて以来、子宮頸
部組織からＨＰＶを検出する様々な試みが行われてき
た。残念ながら、ＨＰＶはいまだウイルス粒子での存在
が認められず、試験管内増殖系を持たないため、その検
出は抗体による方法とウイルスＤＮＡを検出する方法が
取られている。ＨＰＶ ＤＮＡを検出する代表的方法と
して、従来よりサザンハイブリダイゼーション法がとら
れている。実際、Ｍ．デュルストらはこの方法で、子宮
頸がん組織より約６０％の試料にＨＰＶ１６型あるいは
１８型ＤＮＡを検出している。更に簡便で高感度な検出
方法として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉ
ｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法がある〔メソッズ イン エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）、第１５５巻、第３３５〜３５０頁（１９８
７）〕。ＰＣＲ法は、増幅したいＤＮＡ領域の両端に一
対のオリゴヌクレオチドプライマーを設定し、耐熱性タ
ックポリメラーゼを用いて、目的ＤＮＡを指数的に増幅
させる方法である。ＤＮＡの変性→プライマーＤＮＡの
アニーリング→ＤＮＡ相補鎖の酵素的合成といった温度
サイクルを２５回繰返せば、目的ＤＮＡは約１０万倍に
増幅される。
ａ ｖｉｒｕｓ）科に属する小型ＤＮＡウイルスで、ヒ
トの皮膚のいぼ、口腔、肛門、性器の尖圭コンジローマ
などから分離され、昔からいぼをつくるウイルスとして
知られてきた。ＨＰＶは、現在６０種以上もの異なった
タイプが見つかっている。このうちＨＰＶ６、ＨＰＶ１
１は尖圭コンジローマ等、主に性器に良性の腫瘍を引起
こす良性型ＨＰＶである。またがんに至る悪性腫瘍を引
起こす代表的ＨＰＶとして、以前よりＨＰＶ１６、ＨＰ
Ｖ１８が知られていたが、現在ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３
等の悪性型ＨＰＶの存在が知られている〔デ ビラース
（ｄｅ Ｖｉｌｌｉｅｒｓ）、ジャーナルオブ ビロロ
ジー（Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第６
３巻、第４８９８〜４９０３頁（１９８９）〕。ＨＰＶ
が子宮頸がんを引起こす要因の一つである〔Ｍ．デュル
スト（Ｍ．Ｄｕｅｒｓｔ）ほか、プロシーディングス
オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンシ
ーズ オブ ザ ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８０巻、第３８１２〜３８１
５頁（１９８３）〕という報告がなされて以来、子宮頸
部組織からＨＰＶを検出する様々な試みが行われてき
た。残念ながら、ＨＰＶはいまだウイルス粒子での存在
が認められず、試験管内増殖系を持たないため、その検
出は抗体による方法とウイルスＤＮＡを検出する方法が
取られている。ＨＰＶ ＤＮＡを検出する代表的方法と
して、従来よりサザンハイブリダイゼーション法がとら
れている。実際、Ｍ．デュルストらはこの方法で、子宮
頸がん組織より約６０％の試料にＨＰＶ１６型あるいは
１８型ＤＮＡを検出している。更に簡便で高感度な検出
方法として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉ
ｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法がある〔メソッズ イン エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ）、第１５５巻、第３３５〜３５０頁（１９８
７）〕。ＰＣＲ法は、増幅したいＤＮＡ領域の両端に一
対のオリゴヌクレオチドプライマーを設定し、耐熱性タ
ックポリメラーゼを用いて、目的ＤＮＡを指数的に増幅
させる方法である。ＤＮＡの変性→プライマーＤＮＡの
アニーリング→ＤＮＡ相補鎖の酵素的合成といった温度
サイクルを２５回繰返せば、目的ＤＮＡは約１０万倍に
増幅される。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】前述のＨＰＶ検出方法
のうち、ＨＰＶ抗体を用いる方法は操作が煩雑で、また
感度の点で問題がある。一方、ヒト性器や子宮頸部組織
よりＨＰＶ ＤＮＡを検出する際、従来のサザンハイブ
リダイゼーション法やＰＣＲ法では、一種類のＨＰＶに
限定してプローブやプライマー対を設定するため、特定
の型しか検出できない。このため、複数種のＨＰＶを検
出するにはその都度プローブやプライマー対を設定し別
々の反応系で行わねばならず、操作が煩雑になる。性器
腫瘍に数多くのＨＰＶが関与することが認められている
現状において、一回の反応系でできるだけ多種のＨＰＶ
を検出することが求められている。すなわち、本発明の
目的は、良性型及び／又は悪性型に共通なＨＰＶのＤＮ
Ａ領域を決定し、その配列の検出方法及びキットを提供
することにある。
のうち、ＨＰＶ抗体を用いる方法は操作が煩雑で、また
感度の点で問題がある。一方、ヒト性器や子宮頸部組織
よりＨＰＶ ＤＮＡを検出する際、従来のサザンハイブ
リダイゼーション法やＰＣＲ法では、一種類のＨＰＶに
限定してプローブやプライマー対を設定するため、特定
の型しか検出できない。このため、複数種のＨＰＶを検
出するにはその都度プローブやプライマー対を設定し別
々の反応系で行わねばならず、操作が煩雑になる。性器
腫瘍に数多くのＨＰＶが関与することが認められている
現状において、一回の反応系でできるだけ多種のＨＰＶ
を検出することが求められている。すなわち、本発明の
目的は、良性型及び／又は悪性型に共通なＨＰＶのＤＮ
Ａ領域を決定し、その配列の検出方法及びキットを提供
することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はＨＰＶの検出方法に関し、良性型及
び／又は悪性型ＨＰＶの検出方法において、該ＨＰＶの
ＤＮＡ配列を、配列表の配列番号２６及び／又は配列番
号２７で示される塩基配列のプライマーと、配列表の配
列番号２８で示される塩基配列のプライマーの組合せを
用いて検出することを特徴とする。また、本発明の第２
の発明は第１の発明の方法を用いてＨＰＶの検出を行う
ための検出キットに関し、配列表の配列番号２６及び／
又は配列番号２７で示される塩基配列のプライマーと、
配列表の配列番号２８で示される塩基配列のプライマー
の組合せを含有していることを特徴とする。
発明の第１の発明はＨＰＶの検出方法に関し、良性型及
び／又は悪性型ＨＰＶの検出方法において、該ＨＰＶの
ＤＮＡ配列を、配列表の配列番号２６及び／又は配列番
号２７で示される塩基配列のプライマーと、配列表の配
列番号２８で示される塩基配列のプライマーの組合せを
用いて検出することを特徴とする。また、本発明の第２
の発明は第１の発明の方法を用いてＨＰＶの検出を行う
ための検出キットに関し、配列表の配列番号２６及び／
又は配列番号２７で示される塩基配列のプライマーと、
配列表の配列番号２８で示される塩基配列のプライマー
の組合せを含有していることを特徴とする。
【０００５】子宮頸がん組織中のＨＰＶ ＤＮＡは、エ
ピソーム状態のほかヒトゲノム中に挿入された形で存在
することが明らかとなっており、しかも組込まれたＨＰ
ＶＤＮＡは、通常多くの欠損がみられ、完全に保存され
ているのは初期遺伝子Ｅ６及びＥ７の領域のみである例
が多く見出されている〔Ｅ．シュワルツ（Ｅ．Ｓｃｈｗ
ａｒｚ）ほか、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１４
巻、第１１１〜１１４頁（１９８５）〕。本発明におい
て、良性型及び／又は悪性型のＨＰＶのＤＮＡの検出に
用いる領域は、Ｅ６及び／又はＥ７領域より、そのホモ
ロジーの高い配列を含む領域（高ホモロジー領域）を選
択する。良性型のＨＰＶとしては、例えばＨＰＶ６、Ｈ
ＰＶ１１等が、悪性型のＨＰＶとしては、例えばＨＰＶ
１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰ５２
ｂ及びＨＰＶ５８等があり、その一部については以下の
様にＤＮＡ塩基配列が知られている〔ＨＰＶ６；Ｅ．シ
ユワルツほか、ジエンボ ジャーナル（ｔｈｅ ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．）第２巻、第２３４１頁（１９８３）、ＨＰＶ
１１；Ｋ．ダートマン（Ｋ．Ｄａｒｔｍａｎｎ）ほか、
ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１５１巻、第１２
４頁（１９８６）、ＨＰＶ１６；Ｋ．シードルフ（Ｋ．
Ｓｅｅｄｏｒｆ）ほか、ビロロジー、第１４５巻、第１
８１頁（１９８５）、ＨＰＶ３１；Ｓ．Ｔ．コール
（Ｓ．Ｔ．Ｃｏｌｅ）ほか、ジャーナル オブ モレキ
ュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第
１９３巻、第５９９頁（１９８７）、ＨＰＶ３１；Ｍ．
Ｄ．ゴールズボロー（Ｍ．Ｄ．Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇ
ｈ）ほか、ビロロジー、第１７１巻、第３０６頁（１９
８９）、ＨＰＶ３３；Ｓ．Ｔ．コールほか、ジャーナル
オブ ビロロジー、第５８巻、第９９１頁（１９８
６）〕。
ピソーム状態のほかヒトゲノム中に挿入された形で存在
することが明らかとなっており、しかも組込まれたＨＰ
ＶＤＮＡは、通常多くの欠損がみられ、完全に保存され
ているのは初期遺伝子Ｅ６及びＥ７の領域のみである例
が多く見出されている〔Ｅ．シュワルツ（Ｅ．Ｓｃｈｗ
ａｒｚ）ほか、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１４
巻、第１１１〜１１４頁（１９８５）〕。本発明におい
て、良性型及び／又は悪性型のＨＰＶのＤＮＡの検出に
用いる領域は、Ｅ６及び／又はＥ７領域より、そのホモ
ロジーの高い配列を含む領域（高ホモロジー領域）を選
択する。良性型のＨＰＶとしては、例えばＨＰＶ６、Ｈ
ＰＶ１１等が、悪性型のＨＰＶとしては、例えばＨＰＶ
１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰ５２
ｂ及びＨＰＶ５８等があり、その一部については以下の
様にＤＮＡ塩基配列が知られている〔ＨＰＶ６；Ｅ．シ
ユワルツほか、ジエンボ ジャーナル（ｔｈｅ ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．）第２巻、第２３４１頁（１９８３）、ＨＰＶ
１１；Ｋ．ダートマン（Ｋ．Ｄａｒｔｍａｎｎ）ほか、
ビロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、第１５１巻、第１２
４頁（１９８６）、ＨＰＶ１６；Ｋ．シードルフ（Ｋ．
Ｓｅｅｄｏｒｆ）ほか、ビロロジー、第１４５巻、第１
８１頁（１９８５）、ＨＰＶ３１；Ｓ．Ｔ．コール
（Ｓ．Ｔ．Ｃｏｌｅ）ほか、ジャーナル オブ モレキ
ュラー バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、第
１９３巻、第５９９頁（１９８７）、ＨＰＶ３１；Ｍ．
Ｄ．ゴールズボロー（Ｍ．Ｄ．Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇ
ｈ）ほか、ビロロジー、第１７１巻、第３０６頁（１９
８９）、ＨＰＶ３３；Ｓ．Ｔ．コールほか、ジャーナル
オブ ビロロジー、第５８巻、第９９１頁（１９８
６）〕。
【０００６】ＨＰＶ６とＨＰＶ１１等のＥ６・Ｅ７領域
中の高ホモロジー領域、あるいはＨＰＶ１６とＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３等のＥ６・Ｅ７領域中の高
ホモロジー領域は、例えばＤＮＡシーケンス入力解析シ
ステムＤＮＡＳＩＳ（宝酒造社）を用いて検索すること
ができる。
中の高ホモロジー領域、あるいはＨＰＶ１６とＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３等のＥ６・Ｅ７領域中の高
ホモロジー領域は、例えばＤＮＡシーケンス入力解析シ
ステムＤＮＡＳＩＳ（宝酒造社）を用いて検索すること
ができる。
【０００７】それぞれのＨＰＶの種類について、これら
の高ホモロジー領域として利用できる塩基配列の例を配
列表の配列番号１〜２３に示す。すなわち、配列表の配
列番号１〜４はＨＰＶ６、配列番号５〜８はＨＰＶ１
１、配列番号９〜１２はＨＰＶ１６、配列番号１３〜１
５はＨＰＶ１８、配列番号１６〜１９はＨＰＶ３１、配
列番号２０〜２３はＨＰＶ３３についてそれぞれ高ホモ
ロジー領域として利用できる塩基配列の例を示すもので
ある。また、これらの塩基配列を、ホモロジーの高い部
分ごとにまとめた例を表１及び表２に示す。なお配列表
の各配列及び表１及び表２において示した塩基番号は前
述の引用文献に記載されたものと一致する。
の高ホモロジー領域として利用できる塩基配列の例を配
列表の配列番号１〜２３に示す。すなわち、配列表の配
列番号１〜４はＨＰＶ６、配列番号５〜８はＨＰＶ１
１、配列番号９〜１２はＨＰＶ１６、配列番号１３〜１
５はＨＰＶ１８、配列番号１６〜１９はＨＰＶ３１、配
列番号２０〜２３はＨＰＶ３３についてそれぞれ高ホモ
ロジー領域として利用できる塩基配列の例を示すもので
ある。また、これらの塩基配列を、ホモロジーの高い部
分ごとにまとめた例を表１及び表２に示す。なお配列表
の各配列及び表１及び表２において示した塩基番号は前
述の引用文献に記載されたものと一致する。
【０００８】
【表１】
【０００９】
【表２】
【００１０】これらのＤＮＡ領域を検出する方法として
は、例えば、ＰＣＲ法を簡便で高感度な方法として用い
ることができる。すなわち、良性型及び／又は悪性型Ｈ
ＰＶの高ホモロジー領域について共通プライマーを選定
し、これを用いてＤＮＡ配列を増幅し、検出すれば良
い。各共通プライマーは、例えばＤＮＡ合成機で合成
し、ＨＰＬＣで精製して、用いることができる。この様
なプライマーの例を配列表の配列番号２４〜２８に示
す。
は、例えば、ＰＣＲ法を簡便で高感度な方法として用い
ることができる。すなわち、良性型及び／又は悪性型Ｈ
ＰＶの高ホモロジー領域について共通プライマーを選定
し、これを用いてＤＮＡ配列を増幅し、検出すれば良
い。各共通プライマーは、例えばＤＮＡ合成機で合成
し、ＨＰＬＣで精製して、用いることができる。この様
なプライマーの例を配列表の配列番号２４〜２８に示
す。
【００１１】すなわち、上記プライマーのうち、配列表
の配列番号２４，２５でそれぞれ表されるｐＵ−Ｏ、ｐ
１６−１は表１及び表２に示した高ホモロジー領域のＩ
の塩基配列に、配列表の配列番号２６で表されるｐＵ−
３１Ｂは領域Ｖの塩基配列に、配列表の配列番号２７で
表されるｐＵ−１Ｍは領域ＩＩＩの塩基配列に、配列表
の配列番号２８で表されるｐＵ−２Ｒは領域ＩＩの塩基
配列の相補的配列にそれぞれ相同性が高い配列を有して
おり、これらのプライマーは共通プライマーとして有効
である。配列表の配列番号２４〜２８に示した５種のプ
ライマーのうち、例えばｐＵ−Ｏ又はｐ１６−１とｐＵ
−２Ｒの対を用いればＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１
６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のＤＮＡ配列
を、ｐＵ−３１ＢとｐＵ−２Ｒの対を用いれば良性型Ｈ
ＰＶであるＨＰＶ６、ＨＰＶ１１のＤＮＡ配列を、ｐＵ
−１ＭとｐＵ−２Ｒの対を用いれば悪性型ＨＰＶである
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のＤ
ＮＡ配列を特異的に増幅させることができる。
の配列番号２４，２５でそれぞれ表されるｐＵ−Ｏ、ｐ
１６−１は表１及び表２に示した高ホモロジー領域のＩ
の塩基配列に、配列表の配列番号２６で表されるｐＵ−
３１Ｂは領域Ｖの塩基配列に、配列表の配列番号２７で
表されるｐＵ−１Ｍは領域ＩＩＩの塩基配列に、配列表
の配列番号２８で表されるｐＵ−２Ｒは領域ＩＩの塩基
配列の相補的配列にそれぞれ相同性が高い配列を有して
おり、これらのプライマーは共通プライマーとして有効
である。配列表の配列番号２４〜２８に示した５種のプ
ライマーのうち、例えばｐＵ−Ｏ又はｐ１６−１とｐＵ
−２Ｒの対を用いればＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１
６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のＤＮＡ配列
を、ｐＵ−３１ＢとｐＵ−２Ｒの対を用いれば良性型Ｈ
ＰＶであるＨＰＶ６、ＨＰＶ１１のＤＮＡ配列を、ｐＵ
−１ＭとｐＵ−２Ｒの対を用いれば悪性型ＨＰＶである
ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のＤ
ＮＡ配列を特異的に増幅させることができる。
【００１２】検出する試料としては、例えばＨＰＶをク
ローニングしたプラスミド、尖圭コンジローマ、子宮頸
がん及び前がん病変等の病理試料等を用いることができ
る。また、細胞、組織からのＤＮＡの調製は、公知の確
立された方法を用いればよい。
ローニングしたプラスミド、尖圭コンジローマ、子宮頸
がん及び前がん病変等の病理試料等を用いることができ
る。また、細胞、組織からのＤＮＡの調製は、公知の確
立された方法を用いればよい。
【００１３】ＰＣＲ法については、タックポリメラーゼ
を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が、宝
酒造社から市販されており、上記のプライマー対を用
い、特定のＤＮＡ領域の増幅反応を行えば良い。増幅後
のＨＰＶ ＤＮＡは、例えばアガロースゲル電気泳動と
エチジウムブロマイド染色にて検出することができる。
アガロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色で
増幅領域を確認できないときは、例えばドットハイブリ
ダイゼーション法を用いて検出することができる。
を含む遺伝子増幅キット及び自動遺伝子増幅装置が、宝
酒造社から市販されており、上記のプライマー対を用
い、特定のＤＮＡ領域の増幅反応を行えば良い。増幅後
のＨＰＶ ＤＮＡは、例えばアガロースゲル電気泳動と
エチジウムブロマイド染色にて検出することができる。
アガロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色で
増幅領域を確認できないときは、例えばドットハイブリ
ダイゼーション法を用いて検出することができる。
【００１４】プライマー対で増幅したサンプルをドット
ハイブリダイゼーションするとき、例えば増幅領域内で
プライマー部位とは別の高いホモロジーを有する部位を
元にデザインした各型共通のオリゴヌクレオチドプロー
ブ（ユニバーサルプローブ）等を用いると便利である。
このプローブはハイブリダイゼーションにおける特異性
を高めるため、ミスマッチの起こりうる箇所に塩基を重
複させたミックスプローブ、あるいはその様な箇所をイ
ノシンに置き換えたプローブにすればよい。その様な配
列の例を配列表の配列番号２９〜３１に示す。
ハイブリダイゼーションするとき、例えば増幅領域内で
プライマー部位とは別の高いホモロジーを有する部位を
元にデザインした各型共通のオリゴヌクレオチドプロー
ブ（ユニバーサルプローブ）等を用いると便利である。
このプローブはハイブリダイゼーションにおける特異性
を高めるため、ミスマッチの起こりうる箇所に塩基を重
複させたミックスプローブ、あるいはその様な箇所をイ
ノシンに置き換えたプローブにすればよい。その様な配
列の例を配列表の配列番号２９〜３１に示す。
【００１５】上記のプローブのうち、配列表の配列番号
２９で表されるｐＢＵ−１は、表２に示した高ホモロジ
ー領域のＩＶの塩基配列部分、配列表の配列番号３１で
表されるｐＢＵ−３はＩＶの塩基配列部分を認識する共
通プローブである。また、配列表の配列番号３０で表さ
れるｐＢＵ−２はＨＰＶ１８の特異的塩基配列であり、
前出の文献記載の塩基番号の６３５〜６６３の部分に相
当する。例えば、悪性型の４種のＨＰＶを同時に検出し
たい場合には、ｐＢＵ−１とｐＢＵ−２を混合して使用
すればよい。
２９で表されるｐＢＵ−１は、表２に示した高ホモロジ
ー領域のＩＶの塩基配列部分、配列表の配列番号３１で
表されるｐＢＵ−３はＩＶの塩基配列部分を認識する共
通プローブである。また、配列表の配列番号３０で表さ
れるｐＢＵ−２はＨＰＶ１８の特異的塩基配列であり、
前出の文献記載の塩基番号の６３５〜６６３の部分に相
当する。例えば、悪性型の４種のＨＰＶを同時に検出し
たい場合には、ｐＢＵ−１とｐＢＵ−２を混合して使用
すればよい。
【００１６】増幅された各ＨＰＶ由来のＤＮＡについ
て、型の同定を行うには、例えば各型に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いればよい。悪性ＨＰＶの各
型に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの例を配列表
の配列番号３２〜３５に示す。配列表の配列番号３２で
表されるｐＳＢ−１６はＨＰＶ１６に、配列表の配列番
号３３で表されるｐＳＢ−１８はＨＰＶ１８に、配列表
の配列番３４で表されるｐＳＢ−３１はＨＰＶ３１に、
配列表の配列番号３５で表されるｐＳＢ−３３はＨＰＶ
３３に、それぞれ特異的なプローブである。
て、型の同定を行うには、例えば各型に特異的なオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いればよい。悪性ＨＰＶの各
型に特異的なオリゴヌクレオチドプローブの例を配列表
の配列番号３２〜３５に示す。配列表の配列番号３２で
表されるｐＳＢ−１６はＨＰＶ１６に、配列表の配列番
号３３で表されるｐＳＢ−１８はＨＰＶ１８に、配列表
の配列番３４で表されるｐＳＢ−３１はＨＰＶ３１に、
配列表の配列番号３５で表されるｐＳＢ−３３はＨＰＶ
３３に、それぞれ特異的なプローブである。
【００１７】また、配列表の配列番号２４〜２８に示し
たプライマー対を用いて、各ＨＰＶＤＮＡをＰＣＲ法で
増幅させたフラグメントを各ＨＰＶに特異的なプローブ
として用いることもできる。
たプライマー対を用いて、各ＨＰＶＤＮＡをＰＣＲ法で
増幅させたフラグメントを各ＨＰＶに特異的なプローブ
として用いることもできる。
【００１８】これらのプローブＤＮＡは、前記プライマ
ーＤＮＡと同様の方法で合成・精製することができる。
該プローブＤＮＡは標識化することにより、高感度な検
出が可能となる。標識化の方法としては、公知の方法な
らなんでもよいが、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いプローブＤＮＡの５′末端を３２Ｐで標識化す
るアイソトープ標識方法でも良いし、プローブＤＮＡの
酵素標識、ビオチン−アビジン系での標識、またケミプ
ローブのようにプローブＤＮＡにスルホン基を導入し、
それを抗体を用いて認識するような方法での標識方法等
の、非アイソトープ標識方法でも良い。
ーＤＮＡと同様の方法で合成・精製することができる。
該プローブＤＮＡは標識化することにより、高感度な検
出が可能となる。標識化の方法としては、公知の方法な
らなんでもよいが、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いプローブＤＮＡの５′末端を３２Ｐで標識化す
るアイソトープ標識方法でも良いし、プローブＤＮＡの
酵素標識、ビオチン−アビジン系での標識、またケミプ
ローブのようにプローブＤＮＡにスルホン基を導入し、
それを抗体を用いて認識するような方法での標識方法等
の、非アイソトープ標識方法でも良い。
【００１９】更に、これらのプローブＤＮＡを用いて、
従来行われているハイブリダイゼーション法によるＨＰ
Ｖ ＤＮＡ配列の検出を行うこともできる。この場合、
配列表の配列番号２４〜２８に示した各共通プライマー
もプローブとして用いることができる。すなわち、ｐＵ
−Ｏ、ｐ１６−１若しくはｐＵ−２Ｒを用いればＨＰＶ
６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、Ｈ ＰＶ１８、ＨＰＶ３
１、ＨＰＶ３３を、ｐＵ−３１Ｂを用いればＨＰＶ６、
ＨＰＶ１１を、ｐＵ−１Ｍを用いればＨＰＶ１６、ＨＰ
Ｖ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３を検出することができ
る。本発明の方法により検出することができるＨＰＶの
うち、悪性型ＨＰＶとしては、前述のＨＰＶ１６、ＨＰ
Ｖ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のほかに、例えばイト
ウら、又はマツクラらにより報告され、そのＨＰＶ Ｄ
ＮＡがクローニングされている、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ
５８等があり〔キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．）、第４８巻、第７１６４頁（１９８８）、１
９９０年５月３０日、日本癌学会発行、第４９回 日本
癌学会総会記事第１２３頁、講演番号第３７０番〕、こ
れらのＨＰＶＤＮＡも、本発明の方法により効率よく増
幅され、検出されうる。
従来行われているハイブリダイゼーション法によるＨＰ
Ｖ ＤＮＡ配列の検出を行うこともできる。この場合、
配列表の配列番号２４〜２８に示した各共通プライマー
もプローブとして用いることができる。すなわち、ｐＵ
−Ｏ、ｐ１６−１若しくはｐＵ−２Ｒを用いればＨＰＶ
６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、Ｈ ＰＶ１８、ＨＰＶ３
１、ＨＰＶ３３を、ｐＵ−３１Ｂを用いればＨＰＶ６、
ＨＰＶ１１を、ｐＵ−１Ｍを用いればＨＰＶ１６、ＨＰ
Ｖ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３を検出することができ
る。本発明の方法により検出することができるＨＰＶの
うち、悪性型ＨＰＶとしては、前述のＨＰＶ１６、ＨＰ
Ｖ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３のほかに、例えばイト
ウら、又はマツクラらにより報告され、そのＨＰＶ Ｄ
ＮＡがクローニングされている、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ
５８等があり〔キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．）、第４８巻、第７１６４頁（１９８８）、１
９９０年５月３０日、日本癌学会発行、第４９回 日本
癌学会総会記事第１２３頁、講演番号第３７０番〕、こ
れらのＨＰＶＤＮＡも、本発明の方法により効率よく増
幅され、検出されうる。
【００２０】また、通常の方法でＰＣＲを行った（１次
ＰＣＲ）後、更に内側のプライマー対により再びＰＣＲ
を行い（２次ＰＣＲ）、感度よく目的ＤＮＡを検出する
方法すなわち二重ＰＣＲ法を用いて、ＨＰＶ ＤＮＡの
検出の感度をより高めることができる。すなわち、例え
ばプライマーｐＵ−Ｏ又はｐ１６−１と、プライマーｐ
Ｕ−２Ｒを用いて１次ＰＣＲを行い、良性型及び悪性型
ＨＰＶのＤＮＡを増幅し、更に、プライマーｐＵ−３１
Ｂ及びｐＵ−２Ｒを用いた２次ＰＣＲで良性型のＨＰＶ
ＤＮＡを、プライマーｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒを用
いた２次ＰＣＲで良性型のＨＰＶ ＤＮＡを、より効率
よく増幅し、感度よくＨＰＶ ＤＮＡを検出することが
できる。
ＰＣＲ）後、更に内側のプライマー対により再びＰＣＲ
を行い（２次ＰＣＲ）、感度よく目的ＤＮＡを検出する
方法すなわち二重ＰＣＲ法を用いて、ＨＰＶ ＤＮＡの
検出の感度をより高めることができる。すなわち、例え
ばプライマーｐＵ−Ｏ又はｐ１６−１と、プライマーｐ
Ｕ−２Ｒを用いて１次ＰＣＲを行い、良性型及び悪性型
ＨＰＶのＤＮＡを増幅し、更に、プライマーｐＵ−３１
Ｂ及びｐＵ−２Ｒを用いた２次ＰＣＲで良性型のＨＰＶ
ＤＮＡを、プライマーｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒを用
いた２次ＰＣＲで良性型のＨＰＶ ＤＮＡを、より効率
よく増幅し、感度よくＨＰＶ ＤＮＡを検出することが
できる。
【００２１】更に、ＰＣＲで増幅された各ＨＰＶ ＤＮ
Ａを特定の制限酵素で処理した後、その切断パターン
を、例えば、アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロ
マイド染色により解析することにより、各ＨＰＶのタイ
ピングを行うことができる。例えば、ｐ１６−１とｐＵ
−２Ｒの１次ＰＣＲ後にｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒによ
り増幅されたＨＰＶ１６ＤＮＡは、制限酵素ＡｖａＩＩ
により切断され、電気泳動によって１５７ ｂｐ及び８
１ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に検出されて、増幅された
ＨＰＶ ＤＮＡがＨＰＶ１６であることが確認できる。
ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ又はｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−
２Ｒにより増幅された各ＨＰＶ ＤＮＡと制限酵素の組
合せの例及び検出されたＤＮＡ断片の例を表３に示す
（表中−は制限酵素が作用しないことを示す）。
Ａを特定の制限酵素で処理した後、その切断パターン
を、例えば、アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロ
マイド染色により解析することにより、各ＨＰＶのタイ
ピングを行うことができる。例えば、ｐ１６−１とｐＵ
−２Ｒの１次ＰＣＲ後にｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒによ
り増幅されたＨＰＶ１６ＤＮＡは、制限酵素ＡｖａＩＩ
により切断され、電気泳動によって１５７ ｂｐ及び８
１ｂｐのＤＮＡ断片が特異的に検出されて、増幅された
ＨＰＶ ＤＮＡがＨＰＶ１６であることが確認できる。
ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ又はｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−
２Ｒにより増幅された各ＨＰＶ ＤＮＡと制限酵素の組
合せの例及び検出されたＤＮＡ断片の例を表３に示す
（表中−は制限酵素が作用しないことを示す）。
【００２２】
【表３】
【００２３】ＰＣＲで増幅され、増幅ＤＮＡの制限酵素
による切断パターンにより同定されなかったＨＰＶは、
例えば、その未同定ＨＰＶが検出された試料より、ヒト
ゲノムＤＮＡを調製し、好適なベクターを用いライブラ
リーを作成し、クローニングし、目的のＤＮＡの塩基配
列を決定する。
による切断パターンにより同定されなかったＨＰＶは、
例えば、その未同定ＨＰＶが検出された試料より、ヒト
ゲノムＤＮＡを調製し、好適なベクターを用いライブラ
リーを作成し、クローニングし、目的のＤＮＡの塩基配
列を決定する。
【００２４】 また本発明の良性型及び／又は悪性型ＨＰ
ＶのＤＮＡを増幅させるためのプライマー対をそろえて
キットとしておくことで、各型のＨＰＶＤＮＡを効率よ
く検出することができる。また、キット中にはユニバー
サルプローブ、各ＨＰＶ型特異的プローブ、制限酵素等
を含有させておいても良い。なお、キットに用いる試薬
は溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
ＶのＤＮＡを増幅させるためのプライマー対をそろえて
キットとしておくことで、各型のＨＰＶＤＮＡを効率よ
く検出することができる。また、キット中にはユニバー
サルプローブ、各ＨＰＶ型特異的プローブ、制限酵素等
を含有させておいても良い。なお、キットに用いる試薬
は溶液状でも良いし、凍結乾燥物でも良い。
【００２５】 以上詳細に述べた様に、本発明の方法によ
れば試料中に存在する複数種のＨＰＶ ＤＮＡを一回の
反応で検出することができ、また、特定の制限酵素の切
断パターンや、型特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、各ＨＰＶ型の簡便なタイピングが可能とな
る。更に、本発明のキットは新種のＨＰＶのスクリーニ
ングにおいても有力な手段となる。
れば試料中に存在する複数種のＨＰＶ ＤＮＡを一回の
反応で検出することができ、また、特定の制限酵素の切
断パターンや、型特異的なオリゴヌクレオチドプローブ
を用いて、各ＨＰＶ型の簡便なタイピングが可能とな
る。更に、本発明のキットは新種のＨＰＶのスクリーニ
ングにおいても有力な手段となる。
【００２６】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００２７】 実施例１ 共通プライマーを用いた、ＰＣ
Ｒ法によるＨＰＶ ＤＮＡ特定領域の増幅
Ｒ法によるＨＰＶ ＤＮＡ特定領域の増幅
【００２８】 （１−１） オリゴヌクレオチドプライマ
ーＤＮＡ及びプローブＤＮＡの合成及び精製 ＰＣＲ法により特定のＤＮＡ配列を増幅させるには、そ
の領域の５′末端より約２０塩基のセンス配列及び３′
末端より約２０塩基のアンチセンス配列のオリゴヌクレ
オチドプライマーＤＮＡが必要である。またドットハイ
ブリダイゼーション法により感度良くＨＰＶ ＤＮＡを
検出する共通のオリゴヌクレオチドプローブＤＮＡや、
タイピング用の型特異的オリゴヌクレオチドプローブＤ
ＮＡが必要である。配列表の配列番号２４〜３５でそれ
ぞれ表されるプライマーＤＮＡ及びプローブＤＮＡをア
プライドバイオシステムズ社のＤＮＡ合成機を用いて合
成し、脱保護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、
ＤＥＡＥ−２ＳＷカラム）で精製し、セプ パク（Ｓｅ
ｐ−ｐａｋ）Ｃ１８（ウォーターズ社）で脱塩し、各Ｄ
ＮＡ約５０μｇを得た。
ーＤＮＡ及びプローブＤＮＡの合成及び精製 ＰＣＲ法により特定のＤＮＡ配列を増幅させるには、そ
の領域の５′末端より約２０塩基のセンス配列及び３′
末端より約２０塩基のアンチセンス配列のオリゴヌクレ
オチドプライマーＤＮＡが必要である。またドットハイ
ブリダイゼーション法により感度良くＨＰＶ ＤＮＡを
検出する共通のオリゴヌクレオチドプローブＤＮＡや、
タイピング用の型特異的オリゴヌクレオチドプローブＤ
ＮＡが必要である。配列表の配列番号２４〜３５でそれ
ぞれ表されるプライマーＤＮＡ及びプローブＤＮＡをア
プライドバイオシステムズ社のＤＮＡ合成機を用いて合
成し、脱保護の後、イオン交換ＨＰＬＣ（ＴＳＫゲル、
ＤＥＡＥ−２ＳＷカラム）で精製し、セプ パク（Ｓｅ
ｐ−ｐａｋ）Ｃ１８（ウォーターズ社）で脱塩し、各Ｄ
ＮＡ約５０μｇを得た。
【００２９】 （１−２） ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒを
用いたＨＰＶ ＤＮＡ特定領域のＰＣＲ法による増幅 それぞれＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５
８ＤＮＡの全長が挿入されているプラスミド８種類を入
手した。なお、例えばＨＰＶ６ ＤＮＡ全長が挿入され
たプラスミドは、ｐＨＰＶ６というように命名した〔ｐ
ＨＰＶ６；ジャーナル オブ ビロロジー、第４０巻、
第９３２頁（１９８１）、ｐＨＰＶ１１；ジャーナル
オブ ビロロジー、第４４巻、第３９３頁（１９８
２）、ｐＨＰＶ１６；プロシーディングス オブ ザナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ ＵＳＡ、第８０巻、第３８１２頁 （１９８
４）、ｐＨＰＶ１８；ジ エンボ ジャーナル、第３
巻、第１１５１頁（１９８４）、ｐＨＰＶ３１；ジャー
ナル オブ ビロロジー、第５８巻、第２２５頁（１９
８６）、ｐＨＰＶ３３；ネーチャー、第３２１巻、第２
４６頁 （１９８６）、ｐＨＰＶ５２ｂ；キャンサー
リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第４８巻、第７
１６４頁（１９８８）、ｐＨＰＶ５８；１９９０年５月
３０日、日本癌学会発行、第４９回 日本癌学会総会記
事第１２３頁、講演番号第３７０番、及び同年７月３日
に行われた同総会での講演参照〕。これらプラスミドＤ
ＮＡ１ｎｇを、０．５ｍｌ用チューブ（バイオビック
社）に取り、９４℃、１０分加熱処理した後、ジーン
アンプ キット （ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＫｉｔ）（宝酒
造社）中の１０μｌの１０×増幅用バッファー〔１００
ｍＭ トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣ
ｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチ
ン〕、１０μｌの１．２５ｍＭ ｄＮＴＰの混合液（ｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、１μｌの２
０μＭ ｐＵ−１Ｍプライマー、１μｌの２０μＭ ｐ
Ｕ−２Ｒプライマー、０．５μｌの５ユニット／μｌの
タックポリメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００
μｌの溶液にした。この反応液は上層に１００μｌのミ
ネラルオイル（シグマ社）を加えた後、自動遺伝子増幅
装置サーマルサイクラー（宝酒造社）により増幅反応を
行った。反応条件は９４℃、１分の変性→５５℃、２分
間のプライマーのアニーリング→７２℃、２分間の合成
反応のサイクルを３０サイクル行った。反応後上層のミ
ネラルオイルを除去した後、反応液の１０μｌを取り、
３％ヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）ＧＴＧアガロース−１
％シーケム（ＳｅａＫｅｍ）アガロース（ＦＭＣ社）ゲ
ル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染
色し、増幅されたＤＮＡを確認した。前記８種類のＨＰ
ＶプラスミドＤＮＡを鋳型とした場合、ｐＨＰＶ１６、
ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３、ｐＨＰＶ
５２ｂ、ｐＨＰＶ５８からそれぞれ２３８ｂｐ、２６８
ｂｐ、２３２ｂｐ、２４４ｂｐ、２３１ｂｐ、２４４ｂ
ｐのバンドが検出された。ｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１か
らはバンドが検出されなかった。すなわちプライマー対
ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒは、悪性腫瘍で広く見出され
ている悪性型ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、Ｈ
ＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５８ＤＮＡを特異的に
増幅していた。
用いたＨＰＶ ＤＮＡ特定領域のＰＣＲ法による増幅 それぞれＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５
８ＤＮＡの全長が挿入されているプラスミド８種類を入
手した。なお、例えばＨＰＶ６ ＤＮＡ全長が挿入され
たプラスミドは、ｐＨＰＶ６というように命名した〔ｐ
ＨＰＶ６；ジャーナル オブ ビロロジー、第４０巻、
第９３２頁（１９８１）、ｐＨＰＶ１１；ジャーナル
オブ ビロロジー、第４４巻、第３９３頁（１９８
２）、ｐＨＰＶ１６；プロシーディングス オブ ザナ
ショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ ＵＳＡ、第８０巻、第３８１２頁 （１９８
４）、ｐＨＰＶ１８；ジ エンボ ジャーナル、第３
巻、第１１５１頁（１９８４）、ｐＨＰＶ３１；ジャー
ナル オブ ビロロジー、第５８巻、第２２５頁（１９
８６）、ｐＨＰＶ３３；ネーチャー、第３２１巻、第２
４６頁 （１９８６）、ｐＨＰＶ５２ｂ；キャンサー
リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）、第４８巻、第７
１６４頁（１９８８）、ｐＨＰＶ５８；１９９０年５月
３０日、日本癌学会発行、第４９回 日本癌学会総会記
事第１２３頁、講演番号第３７０番、及び同年７月３日
に行われた同総会での講演参照〕。これらプラスミドＤ
ＮＡ１ｎｇを、０．５ｍｌ用チューブ（バイオビック
社）に取り、９４℃、１０分加熱処理した後、ジーン
アンプ キット （ＧｅｎｅＡｍｐＴＭＫｉｔ）（宝酒
造社）中の１０μｌの１０×増幅用バッファー〔１００
ｍＭ トリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣ
ｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチ
ン〕、１０μｌの１．２５ｍＭ ｄＮＴＰの混合液（ｄ
ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）、１μｌの２
０μＭ ｐＵ−１Ｍプライマー、１μｌの２０μＭ ｐ
Ｕ−２Ｒプライマー、０．５μｌの５ユニット／μｌの
タックポリメラーゼを加え、更に滅菌水を加えて１００
μｌの溶液にした。この反応液は上層に１００μｌのミ
ネラルオイル（シグマ社）を加えた後、自動遺伝子増幅
装置サーマルサイクラー（宝酒造社）により増幅反応を
行った。反応条件は９４℃、１分の変性→５５℃、２分
間のプライマーのアニーリング→７２℃、２分間の合成
反応のサイクルを３０サイクル行った。反応後上層のミ
ネラルオイルを除去した後、反応液の１０μｌを取り、
３％ヌシーブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）ＧＴＧアガロース−１
％シーケム（ＳｅａＫｅｍ）アガロース（ＦＭＣ社）ゲ
ル電気泳動を行い、エチジウムブロマイドでＤＮＡを染
色し、増幅されたＤＮＡを確認した。前記８種類のＨＰ
ＶプラスミドＤＮＡを鋳型とした場合、ｐＨＰＶ１６、
ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３、ｐＨＰＶ
５２ｂ、ｐＨＰＶ５８からそれぞれ２３８ｂｐ、２６８
ｂｐ、２３２ｂｐ、２４４ｂｐ、２３１ｂｐ、２４４ｂ
ｐのバンドが検出された。ｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１か
らはバンドが検出されなかった。すなわちプライマー対
ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒは、悪性腫瘍で広く見出され
ている悪性型ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、Ｈ
ＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５８ＤＮＡを特異的に
増幅していた。
【００３０】 （１−３） 制限酵素切断パターンによる
タイピング （１−２）で増幅したＤＮＡ断片を含む反応液９０μｌ
に、フェノールとクロロホルムの等量混合液９０μｌを
加え、静かにかくはんし、１２０００ｒｐｍ、５分間遠
心後、水層を分離した。この水層に９０μｌのクロロホ
ルムを加え、静かにかくはんし、同様に遠心して水層を
分離した。この水層に９μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、２
００μｌのエタノールを加え、充分かくはんし、−７０
℃、１５分間放置後、１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心
し、ＤＮＡ断片を精製、回収した。沈殿は８０％エタノ
ールでリンスした後、乾燥させ、３４μｌの滅菌水に溶
解した。このＤＮＡ溶液８．５μｌに１０×ＡｖａＩＩ
反応用バッファー〔１００ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、７０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、７０ｍＭ２−メルカプトエタノール〕１μｌ、制限
酵素ＡｖａＩＩ０．５μｌを加え、全量を１０μｌの溶
液にした。この液を３７℃、２時間反応させた後、反応
液全量を前記の３％ヌシーブＧＴＧアガロース−１％シ
ーケムアガロース電気泳動し、エチジウムブロマイド染
色後、ＤＮＡの切断パターンを観察した。その結果、ｐ
ＨＰＶ１６由来の断片は、１５７ｂｐと８１ｂｐに、ｐ
ＨＰＶ１８由来の断片は１７２ｂｐと９６ｂｐに、ｐＨ
ＰＶ３３由来の断片は、１３６ｂｐと１０８ｂｐに切断
され、３者の切断パターンははっきりと区別された。ｐ
ＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８由来の断片
は切断されなかった。次にこれら６種類をＲｓａＩで反
応させたところ、ｐＨＰＶ３１由来の断片のみが１１８
ｂｐと１１４ｂｐに切断された。同様にこれら６種類を
ＢｇｌＩＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ５２ｂ由来の
断片のみが１７６ｂｐと５５ｂｐに切断された。最後に
これら６種類をＡｃｃＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ
５８由来の断片のみが１２６ｂｐと１１８ｂｐに切断さ
れた。したがってＡｖａＩＩ、ＲｓａＩ、ＢｇｌＩＩ、
ＡｃｃＩの４種類の制限酵素を組合せることにより、プ
ライマー対ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ由来の６種のＤＮ
Ａ断片は、すべてタイピングできることが確認された。
タイピング （１−２）で増幅したＤＮＡ断片を含む反応液９０μｌ
に、フェノールとクロロホルムの等量混合液９０μｌを
加え、静かにかくはんし、１２０００ｒｐｍ、５分間遠
心後、水層を分離した。この水層に９０μｌのクロロホ
ルムを加え、静かにかくはんし、同様に遠心して水層を
分離した。この水層に９μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、２
００μｌのエタノールを加え、充分かくはんし、−７０
℃、１５分間放置後、１２０００ｒｐｍ、１０分間遠心
し、ＤＮＡ断片を精製、回収した。沈殿は８０％エタノ
ールでリンスした後、乾燥させ、３４μｌの滅菌水に溶
解した。このＤＮＡ溶液８．５μｌに１０×ＡｖａＩＩ
反応用バッファー〔１００ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、７０ｍＭ ＭｇＣｌ２、６００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、７０ｍＭ２−メルカプトエタノール〕１μｌ、制限
酵素ＡｖａＩＩ０．５μｌを加え、全量を１０μｌの溶
液にした。この液を３７℃、２時間反応させた後、反応
液全量を前記の３％ヌシーブＧＴＧアガロース−１％シ
ーケムアガロース電気泳動し、エチジウムブロマイド染
色後、ＤＮＡの切断パターンを観察した。その結果、ｐ
ＨＰＶ１６由来の断片は、１５７ｂｐと８１ｂｐに、ｐ
ＨＰＶ１８由来の断片は１７２ｂｐと９６ｂｐに、ｐＨ
ＰＶ３３由来の断片は、１３６ｂｐと１０８ｂｐに切断
され、３者の切断パターンははっきりと区別された。ｐ
ＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８由来の断片
は切断されなかった。次にこれら６種類をＲｓａＩで反
応させたところ、ｐＨＰＶ３１由来の断片のみが１１８
ｂｐと１１４ｂｐに切断された。同様にこれら６種類を
ＢｇｌＩＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ５２ｂ由来の
断片のみが１７６ｂｐと５５ｂｐに切断された。最後に
これら６種類をＡｃｃＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ
５８由来の断片のみが１２６ｂｐと１１８ｂｐに切断さ
れた。したがってＡｖａＩＩ、ＲｓａＩ、ＢｇｌＩＩ、
ＡｃｃＩの４種類の制限酵素を組合せることにより、プ
ライマー対ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ由来の６種のＤＮ
Ａ断片は、すべてタイピングできることが確認された。
【００３１】 （１−４） ｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒ
を用いたＨＰＶ ＤＮＡ特定領域のＰＣＲ法による増幅
とタイピング （１−２）に記したＨＰＶ ＤＮＡ全長が挿入されたプ
ラスミド８種類を鋳型に、プライマー対ｐＵ−３１Ｂ及
びｐＵ−２Ｒを用いてＰＣＲを行った。反応液の組成、
温度サイクル、電気泳動法等は、（１−２）と全く同様
に行った。その結果、ｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１を鋳型
にしたときに、両者とも２３０ｂｐのバンドが検出され
た。ｐＨＰＶ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨ
ＰＶ３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８からはいずれ
もバンドは検出されなかった。すなわちプライマー対ｐ
Ｕ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒは、良性腫瘍で広く見出され
る良性型ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１ＤＮＡを特異的に増幅し
ていた。更にｐＨＰＶ６、１１由来の増幅ＤＮＡ断片を
制限酵素ＲｓａＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ６由来
の断片は１３４ｂｐと９６ｂｐに、ｐＨＰＶ１１由来の
断片は１６６ｂｐと６４ｂｐに切断され、両者の切断パ
ターンは、はっきり区別された。これによりｐＵ−３１
Ｂ及びｐＵ−２Ｒ由来の２種類のＤＮＡ断片は、制限酵
素ＲｓａＩでタイピングできることが確認された。
を用いたＨＰＶ ＤＮＡ特定領域のＰＣＲ法による増幅
とタイピング （１−２）に記したＨＰＶ ＤＮＡ全長が挿入されたプ
ラスミド８種類を鋳型に、プライマー対ｐＵ−３１Ｂ及
びｐＵ−２Ｒを用いてＰＣＲを行った。反応液の組成、
温度サイクル、電気泳動法等は、（１−２）と全く同様
に行った。その結果、ｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１を鋳型
にしたときに、両者とも２３０ｂｐのバンドが検出され
た。ｐＨＰＶ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨ
ＰＶ３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８からはいずれ
もバンドは検出されなかった。すなわちプライマー対ｐ
Ｕ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒは、良性腫瘍で広く見出され
る良性型ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１ＤＮＡを特異的に増幅し
ていた。更にｐＨＰＶ６、１１由来の増幅ＤＮＡ断片を
制限酵素ＲｓａＩで反応させたところ、ｐＨＰＶ６由来
の断片は１３４ｂｐと９６ｂｐに、ｐＨＰＶ１１由来の
断片は１６６ｂｐと６４ｂｐに切断され、両者の切断パ
ターンは、はっきり区別された。これによりｐＵ−３１
Ｂ及びｐＵ−２Ｒ由来の２種類のＤＮＡ断片は、制限酵
素ＲｓａＩでタイピングできることが確認された。
【００３２】 （１−５） 型共通オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いたｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片の
高感度検出 ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片がアガロースゲル電
気泳動とエチジウムブロマイド染色で確認できないと
き、検出感度を上げるため、配列表の配列番号２９〜３
１に示した型共通オリゴヌクレオチドプローブを用い
て、ドットハイブリダイゼーションを行った。まず型共
通プローブが、ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片との
み特異的にハイブリダイズすることを検討した。子宮筋
腫患者より得た健常な子宮頸部組織片１００ｍｇを解剖
はさみで充分細かく切った後、ポリスチレン製チューブ
に回収した。このチューブに１００μｇ／ｍｌになるよ
うにプロテネースＫを加えたＴＥバッファー５ｍｌを加
え、７０℃、２時間処理した。この後（１−３）で示し
たようなフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈
殿を行い、約１００μｇのゲノムＤＮＡを回収し、１μ
ｇ／１μｌとなるようにＴＥバッファーに溶かした。こ
の健常組織ＤＮＡ液と、（１−２）、（１−４）で得た
ＰＣＲ反応液を９４℃、１０分間処理し、氷中で急冷し
てＤＮＡを変性させた。これらＤＮＡ液１μｌ分をナイ
ロンメンブラン（シュライヘルウントシュエル）上にス
ポットし、紫外線トランスイルミネーター（２５４ｎ
ｍ）に１０分照射し、ＤＮＡをメンブランに固定した。
このメンブランは、プレハイブリダイゼーションバッフ
ァー（５×デンハーツ液、５×ＳＳＣ、１００μｇ／ｍ
ｌサケ精子ＤＮＡ）１０ｍｌ中で５０℃、４時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。次に３２Ｐにて５′末
端をラベルしたプローブＤＮＡｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２
を加え、５０℃、２時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブの３２Ｐラベルはメガラベルキット（宝酒
造社）を用いて次のように行った。１０ｐｍｏｌ／μｌ
のプローブＤＮＡ１μｌ、１μｌの×１０リン酸化バッ
ファー、１０μＣｉ／μｌの〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（ア
マシャム）５μｌ、１０ユニットのＴ４−ポリヌクレオ
チドキナーゼ１μｌを含む反応液に滅菌水２μｌを加え
て１０μｌにし、３７℃、３０分間反応させた。反応後
６５℃、１０分間処理し、この反応液の２μｌ（約１０
８ｃｐｍ）をハイブリダイゼーションに用いた。ハイブ
リダイゼーション後メンブランを６×ＳＳＣ、０．５％
ＳＤＳを含む洗浄液１で室温で数分洗浄し、続いて、２
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液２で５０℃、１
０分間で２回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ
線フィルム（富士フィルム）を入れたカセット内で−７
０℃、１時間感光させ、オートラジオグラフをとった。
この結果、ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒで増幅したｐＨＰ
Ｖ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３、
ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８由来のＤＮＡ断片はｐＢ
Ｕ−１、ｐＢＵ−２混合プローブとハイブリダイズし、
ドットが現れた。その他ｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒで
増幅したｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１由来のＤＮＡ断片
や、健常子宮頸部組織ＤＮＡからは、ハイブリダイゼー
ションは全く認められなった。この結果は、混合プロー
ブｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２により、悪性腫瘍で広く見出
されるＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３
３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５８ＤＮＡが特異的に検出で
きることを示すものである。そこで、このプローブのド
ットハイブリダイゼーションによる検出限界を、ｐＨＰ
Ｖ１６を用いたモデル実験系をつくり、検定した。ヒト
の全ゲノムＤＮＡの鎖長を３×１０９ｂｐとして、ｐＨ
ＰＶ１６が１０コピー／ゲノムＤＮＡとなるように、ｐ
ＨＰＶ１６を健常な子宮頸部から上述で得たゲノムＤＮ
Ａにて希釈した。すなわち、４０６ｐｇのｐＨＰＶ１６
を１０μｇの健常なゲノムＤＮＡで希釈した。これを健
常なゲノムＤＮＡで順次１０倍希釈し、ｐＨＰＶ１６の
１０〜１０−６コピー／ゲノムＤＮＡのモデルテンプレ
ートＤＮＡを段階的に調製した。各モデルテンプレート
ＤＮＡ１μｇを用いて、（１−２）に示した方法でＰＣ
ＲによりＤＮＡ断片を増幅させた。更に上述に示した方
法で、ドットハイブリダイゼーションを行った。この結
果１０−６コピー／ゲノムＤＮＡまでドットが検出され
た。ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３、ｐＨ
ＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８についても同様のモデル実験
を行ったが、同じ結果を得た。すなわち、ｐＢＵ−１、
ｐＢＵ−２の混合プローブを用いれば、ＰＣＲ後のドッ
トハイブリダイゼーションにより、細胞当り１０−６コ
ピーのＨＰＶ ＤＮＡの検出が可能であることが確認さ
れた。
ライマーを用いたｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片の
高感度検出 ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片がアガロースゲル電
気泳動とエチジウムブロマイド染色で確認できないと
き、検出感度を上げるため、配列表の配列番号２９〜３
１に示した型共通オリゴヌクレオチドプローブを用い
て、ドットハイブリダイゼーションを行った。まず型共
通プローブが、ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒ増幅断片との
み特異的にハイブリダイズすることを検討した。子宮筋
腫患者より得た健常な子宮頸部組織片１００ｍｇを解剖
はさみで充分細かく切った後、ポリスチレン製チューブ
に回収した。このチューブに１００μｇ／ｍｌになるよ
うにプロテネースＫを加えたＴＥバッファー５ｍｌを加
え、７０℃、２時間処理した。この後（１−３）で示し
たようなフェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈
殿を行い、約１００μｇのゲノムＤＮＡを回収し、１μ
ｇ／１μｌとなるようにＴＥバッファーに溶かした。こ
の健常組織ＤＮＡ液と、（１−２）、（１−４）で得た
ＰＣＲ反応液を９４℃、１０分間処理し、氷中で急冷し
てＤＮＡを変性させた。これらＤＮＡ液１μｌ分をナイ
ロンメンブラン（シュライヘルウントシュエル）上にス
ポットし、紫外線トランスイルミネーター（２５４ｎ
ｍ）に１０分照射し、ＤＮＡをメンブランに固定した。
このメンブランは、プレハイブリダイゼーションバッフ
ァー（５×デンハーツ液、５×ＳＳＣ、１００μｇ／ｍ
ｌサケ精子ＤＮＡ）１０ｍｌ中で５０℃、４時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。次に３２Ｐにて５′末
端をラベルしたプローブＤＮＡｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２
を加え、５０℃、２時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。プローブの３２Ｐラベルはメガラベルキット（宝酒
造社）を用いて次のように行った。１０ｐｍｏｌ／μｌ
のプローブＤＮＡ１μｌ、１μｌの×１０リン酸化バッ
ファー、１０μＣｉ／μｌの〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰ（ア
マシャム）５μｌ、１０ユニットのＴ４−ポリヌクレオ
チドキナーゼ１μｌを含む反応液に滅菌水２μｌを加え
て１０μｌにし、３７℃、３０分間反応させた。反応後
６５℃、１０分間処理し、この反応液の２μｌ（約１０
８ｃｐｍ）をハイブリダイゼーションに用いた。ハイブ
リダイゼーション後メンブランを６×ＳＳＣ、０．５％
ＳＤＳを含む洗浄液１で室温で数分洗浄し、続いて、２
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む洗浄液２で５０℃、１
０分間で２回洗浄した。メンブランは乾燥させた後、Ｘ
線フィルム（富士フィルム）を入れたカセット内で−７
０℃、１時間感光させ、オートラジオグラフをとった。
この結果、ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２Ｒで増幅したｐＨＰ
Ｖ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３、
ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８由来のＤＮＡ断片はｐＢ
Ｕ−１、ｐＢＵ−２混合プローブとハイブリダイズし、
ドットが現れた。その他ｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒで
増幅したｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１由来のＤＮＡ断片
や、健常子宮頸部組織ＤＮＡからは、ハイブリダイゼー
ションは全く認められなった。この結果は、混合プロー
ブｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２により、悪性腫瘍で広く見出
されるＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３
３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５８ＤＮＡが特異的に検出で
きることを示すものである。そこで、このプローブのド
ットハイブリダイゼーションによる検出限界を、ｐＨＰ
Ｖ１６を用いたモデル実験系をつくり、検定した。ヒト
の全ゲノムＤＮＡの鎖長を３×１０９ｂｐとして、ｐＨ
ＰＶ１６が１０コピー／ゲノムＤＮＡとなるように、ｐ
ＨＰＶ１６を健常な子宮頸部から上述で得たゲノムＤＮ
Ａにて希釈した。すなわち、４０６ｐｇのｐＨＰＶ１６
を１０μｇの健常なゲノムＤＮＡで希釈した。これを健
常なゲノムＤＮＡで順次１０倍希釈し、ｐＨＰＶ１６の
１０〜１０−６コピー／ゲノムＤＮＡのモデルテンプレ
ートＤＮＡを段階的に調製した。各モデルテンプレート
ＤＮＡ１μｇを用いて、（１−２）に示した方法でＰＣ
ＲによりＤＮＡ断片を増幅させた。更に上述に示した方
法で、ドットハイブリダイゼーションを行った。この結
果１０−６コピー／ゲノムＤＮＡまでドットが検出され
た。ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３、ｐＨ
ＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８についても同様のモデル実験
を行ったが、同じ結果を得た。すなわち、ｐＢＵ−１、
ｐＢＵ−２の混合プローブを用いれば、ＰＣＲ後のドッ
トハイブリダイゼーションにより、細胞当り１０−６コ
ピーのＨＰＶ ＤＮＡの検出が可能であることが確認さ
れた。
【００３３】 （１−６） 特異的オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いたドットハイブリダイゼーションによる
タイピング ｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２混合プローブにより型に関係な
く検出してきた試料をタイピングするため、配列表の配
列番号３２〜３５に示した型特異的オリゴヌクレオチド
プローブを用いた。上述のｐＨＰＶ ＤＮＡ８種類各１
ｎｇを鋳型として、（１−２）で示した方法でプライマ
ー対ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２ＲによりＰＣＲを行った。
この反応液及び（１−５）で調製した健常子宮頸部組織
ＤＮＡ各１μｌをナイロンメンブランにスポットした。
同じメンブランを４枚準備し、配列表の配列番号３２〜
３５に示すプローブｐＳＢ−１６、ｐＳＢ−１８、ｐＳ
Ｂ−３１、ｐＳＢ−３３を、順に各メンブランと別々に
ハイブリダイズさせた。この結果、順にｐＨＰＶ１６、
ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３由来増幅断
片をスポットした箇所にのみ強いドットが現れ、他の箇
所には全くハイブリダイゼーションは認められなかっ
た。これらより、配列表の配列番号３２〜３５の型特異
的オリゴヌクレオチドプローブ群は、配列表の配列番号
２９〜３１のユニバーサルプローブでの検出後のタイピ
ングに有効であることが確認された。
ライマーを用いたドットハイブリダイゼーションによる
タイピング ｐＢＵ−１、ｐＢＵ−２混合プローブにより型に関係な
く検出してきた試料をタイピングするため、配列表の配
列番号３２〜３５に示した型特異的オリゴヌクレオチド
プローブを用いた。上述のｐＨＰＶ ＤＮＡ８種類各１
ｎｇを鋳型として、（１−２）で示した方法でプライマ
ー対ｐＵ−１Ｍ及びｐＵ−２ＲによりＰＣＲを行った。
この反応液及び（１−５）で調製した健常子宮頸部組織
ＤＮＡ各１μｌをナイロンメンブランにスポットした。
同じメンブランを４枚準備し、配列表の配列番号３２〜
３５に示すプローブｐＳＢ−１６、ｐＳＢ−１８、ｐＳ
Ｂ−３１、ｐＳＢ−３３を、順に各メンブランと別々に
ハイブリダイズさせた。この結果、順にｐＨＰＶ１６、
ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ３３由来増幅断
片をスポットした箇所にのみ強いドットが現れ、他の箇
所には全くハイブリダイゼーションは認められなかっ
た。これらより、配列表の配列番号３２〜３５の型特異
的オリゴヌクレオチドプローブ群は、配列表の配列番号
２９〜３１のユニバーサルプローブでの検出後のタイピ
ングに有効であることが確認された。
【００３４】 （１−７） 二重ＰＣＲ法による増幅 １対のプライマーを用いて通常の方法でＰＣＲを行った
（１次ＰＣＲ）後、更に内側のプライマー対により再び
ＰＣＲを行い（２次ＰＣＲ）、感度よく目的ＤＮＡを検
出する方法、すなわち二重ＰＣＲ法が知られている。二
重ＰＣＲ法によるＨＰＶの検出を行うために、（１−
２）で示したプラスミド ｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１、
ｐＨＰＶ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ
３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８それぞれ１ｎｇを
プライマーｐ１６−１及びｐＵ−２Ｒを１次ＰＣＲ用プ
ライマーとして用いて（１−２）に示した方法で３０サ
イクルＰＣＲを行った。次に、１次ＰＣＲの反応液０．
５μｌを新しい０．５ｍｌ用チューブ（バイオビック
社）により、（１−２）と同様にプライマーｐＵ−１
Ｍ、ｐＵ−２Ｒを用いて、１５サイクル２次ＰＣＲを行
った。その結果、ｐＨＰＶ１６、１８、３１、３３、５
２ｂ及び５８からそれぞれ増幅ＤＮＡが認められた。更
に、それぞれのウイルス型は（１−３）と同様に制限酵
素、ＡｖａＩＩ、ＲｓａＩ、Ｂｇｌ ＩＩ及びＡｃｃＩ
の切断パターンにより同定できた。また、２次ＰＣＲに
おいて、プライマーとしてｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒ
を用い、（１−４）と同様に１５サイクル２次ＰＣＲを
行った結果、ｐＨＰＶ６及びｐＨＰＶ１１のみに増幅が
認められ、更に、ＲｓａＩの切断パターンによりＨＰＶ
６とＨＰＶ１１が識別できた。また、ｐ１６−１のかわ
りにｐＵ−Ｏを用いた場合、その検出感度は１０倍に上
昇した。
（１次ＰＣＲ）後、更に内側のプライマー対により再び
ＰＣＲを行い（２次ＰＣＲ）、感度よく目的ＤＮＡを検
出する方法、すなわち二重ＰＣＲ法が知られている。二
重ＰＣＲ法によるＨＰＶの検出を行うために、（１−
２）で示したプラスミド ｐＨＰＶ６、ｐＨＰＶ１１、
ｐＨＰＶ１６、ｐＨＰＶ１８、ｐＨＰＶ３１、ｐＨＰＶ
３３、ｐＨＰＶ５２ｂ、ｐＨＰＶ５８それぞれ１ｎｇを
プライマーｐ１６−１及びｐＵ−２Ｒを１次ＰＣＲ用プ
ライマーとして用いて（１−２）に示した方法で３０サ
イクルＰＣＲを行った。次に、１次ＰＣＲの反応液０．
５μｌを新しい０．５ｍｌ用チューブ（バイオビック
社）により、（１−２）と同様にプライマーｐＵ−１
Ｍ、ｐＵ−２Ｒを用いて、１５サイクル２次ＰＣＲを行
った。その結果、ｐＨＰＶ１６、１８、３１、３３、５
２ｂ及び５８からそれぞれ増幅ＤＮＡが認められた。更
に、それぞれのウイルス型は（１−３）と同様に制限酵
素、ＡｖａＩＩ、ＲｓａＩ、Ｂｇｌ ＩＩ及びＡｃｃＩ
の切断パターンにより同定できた。また、２次ＰＣＲに
おいて、プライマーとしてｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒ
を用い、（１−４）と同様に１５サイクル２次ＰＣＲを
行った結果、ｐＨＰＶ６及びｐＨＰＶ１１のみに増幅が
認められ、更に、ＲｓａＩの切断パターンによりＨＰＶ
６とＨＰＶ１１が識別できた。また、ｐ１６−１のかわ
りにｐＵ−Ｏを用いた場合、その検出感度は１０倍に上
昇した。
【００３５】 実施例２ 子宮頸がん組織におけるＨＰＶ
ＤＭＡの検出 ３９例の子宮頸がん摘出組織約１００ｍｇより（１−
５）の方法により、ゲノムＤＮＡを約１００μｇ得た。
これらのゲノムＤＮＡ１ｇを９４℃、１０分間熱変性さ
せた後、ジーン アンプ キット中の１０μｌの×１０
バッファー、１６μｌの１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合
液、０．５μｌの５ユニット／μｌタックポリメラー
ゼ、及びセンスプライマーｐＵ−１Ｍ １μｌ、アンチ
センスプライマーｐＵ−２Ｒ １μｌを加え、滅菌水を
加えて１００μｌの液を調製した。（１−２）の方法に
よりＰＣＲとその後のアガロースゲル電気泳動、制限酵
素によるタイピングを行った。
ＤＭＡの検出 ３９例の子宮頸がん摘出組織約１００ｍｇより（１−
５）の方法により、ゲノムＤＮＡを約１００μｇ得た。
これらのゲノムＤＮＡ１ｇを９４℃、１０分間熱変性さ
せた後、ジーン アンプ キット中の１０μｌの×１０
バッファー、１６μｌの１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合
液、０．５μｌの５ユニット／μｌタックポリメラー
ゼ、及びセンスプライマーｐＵ−１Ｍ １μｌ、アンチ
センスプライマーｐＵ−２Ｒ １μｌを加え、滅菌水を
加えて１００μｌの液を調製した。（１−２）の方法に
よりＰＣＲとその後のアガロースゲル電気泳動、制限酵
素によるタイピングを行った。
【００３６】 表４に示すように子宮頸がん組織３９例よ
り、全体で３３例（８４．６％）にＨＰＶ ＤＮＡを検
出した。
り、全体で３３例（８４．６％）にＨＰＶ ＤＮＡを検
出した。
【００３７】
【表４】
【００３８】なお表中３試料が複合感染（ＨＰＶ１６＋
ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１８＋ＨＰＶ３３、ＨＰＶ１８＋Ｈ
ＰＶ５８）であり、４試料中からＨＰＶ１６、ＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５
８以外の悪性型ＨＰＶが検出された。
ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１８＋ＨＰＶ３３、ＨＰＶ１８＋Ｈ
ＰＶ５８）であり、４試料中からＨＰＶ１６、ＨＰＶ１
８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５
８以外の悪性型ＨＰＶが検出された。
【００３９】 また表５に示すように、前がん病変組織２
５例中より、全体で１３例（５２．０％）ＨＰＶＤＮＡ
を検出することができた。
５例中より、全体で１３例（５２．０％）ＨＰＶＤＮＡ
を検出することができた。
【００４０】
【表５】
【００４１】なお表中２試料が復合感染（ＨＰＶ１６＋
ＨＰＶ５８、ＨＰＶ１６＋ＨＰＶ３１）であり、１試料
中からＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３
３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５８以外の悪性型ＨＰＶが検
出された。
ＨＰＶ５８、ＨＰＶ１６＋ＨＰＶ３１）であり、１試料
中からＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３
３、ＨＰＶ５２ｂ、ＨＰＶ５８以外の悪性型ＨＰＶが検
出された。
【００４２】 実施例３ ＨＰＶ増幅・検出用キットの作
成 試料中のＨＰＶを増幅、検出するためのキットを作成し
た（表６及び表７）。１次ＰＣＲ増幅用プライマーとし
てｐＵ−Ｏ及びｐＵ−２Ｒが各２０μＭ溶液となるよう
にＴＥバッファーに溶解し、１次ＰＣＲプライマー液
（Ａ剤）とした。同様に、プライマーｐＵ−１Ｍ及びｐ
Ｕ−２Ｒを含む２次ＰＣＲ悪性型ＨＰＶプライマー液
（Ｂ剤）、プライマーｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒを含
む２次ＰＣＲ良性型ＨＰＶプライマー液（Ｃ剤）を作成
した。ＤＮＡ検出用プローブとして、ｐＢＵ−１及びｐ
ＢＵ−２が各１０μＭ溶液となるようにＴＥバッファー
に溶解し、悪性型ＨＰＶ検出用プローブ液（Ｄ剤）とし
た。同様に、プローブｐＢＵ−３を含む良性型ＨＰＶ検
出用プローブ液（Ｅ剤）、ｐＳＢ−１６を含む悪性型Ｈ
ＰＶ１６型特異的プローブ液（Ｆ剤）、ｐＳＢ−１８を
含む悪性型ＨＰＶ１８型特異的プローブ液（Ｇ剤）、ｐ
ＳＢ−３１を含む悪性型ＨＰＶ３１型特異的プローブ液
（Ｈ剤）、ｐＳＢ−３３を含む悪性型ＨＰＶ３３型特異
的プローブ液（Ｉ剤）を作成した。また、増幅断片を制
限酵素の切断パターンによりＨＰＶのタイピングを行う
ために、タイピング用制限酵素ＡｖａＩＩ液（Ｊ剤）、
ＲｓａＩ液（Ｋ剤）、ＢｇｌＩＩ液（Ｌ剤）、ＡｃｃＩ
液（Ｍ剤）、ＡｖａＩ液（Ｎ剤）を作成した。本キット
を用いて、実施例１、２と同様にＨＰＶを増幅・検出す
ることができた。
成 試料中のＨＰＶを増幅、検出するためのキットを作成し
た（表６及び表７）。１次ＰＣＲ増幅用プライマーとし
てｐＵ−Ｏ及びｐＵ−２Ｒが各２０μＭ溶液となるよう
にＴＥバッファーに溶解し、１次ＰＣＲプライマー液
（Ａ剤）とした。同様に、プライマーｐＵ−１Ｍ及びｐ
Ｕ−２Ｒを含む２次ＰＣＲ悪性型ＨＰＶプライマー液
（Ｂ剤）、プライマーｐＵ−３１Ｂ及びｐＵ−２Ｒを含
む２次ＰＣＲ良性型ＨＰＶプライマー液（Ｃ剤）を作成
した。ＤＮＡ検出用プローブとして、ｐＢＵ−１及びｐ
ＢＵ−２が各１０μＭ溶液となるようにＴＥバッファー
に溶解し、悪性型ＨＰＶ検出用プローブ液（Ｄ剤）とし
た。同様に、プローブｐＢＵ−３を含む良性型ＨＰＶ検
出用プローブ液（Ｅ剤）、ｐＳＢ−１６を含む悪性型Ｈ
ＰＶ１６型特異的プローブ液（Ｆ剤）、ｐＳＢ−１８を
含む悪性型ＨＰＶ１８型特異的プローブ液（Ｇ剤）、ｐ
ＳＢ−３１を含む悪性型ＨＰＶ３１型特異的プローブ液
（Ｈ剤）、ｐＳＢ−３３を含む悪性型ＨＰＶ３３型特異
的プローブ液（Ｉ剤）を作成した。また、増幅断片を制
限酵素の切断パターンによりＨＰＶのタイピングを行う
ために、タイピング用制限酵素ＡｖａＩＩ液（Ｊ剤）、
ＲｓａＩ液（Ｋ剤）、ＢｇｌＩＩ液（Ｌ剤）、ＡｃｃＩ
液（Ｍ剤）、ＡｖａＩ液（Ｎ剤）を作成した。本キット
を用いて、実施例１、２と同様にＨＰＶを増幅・検出す
ることができた。
【００４３】
【表６】
【００４４】
【表７】
【００４５】
【発明の効果】以上詳細に説明した様に、本発明によ
り、良性型及び／又は悪性型ＨＰＶに共通な遺伝子領域
が見出され、この領域の遺伝子配列を検出することによ
り、試料中の良性型及び／又は悪性型ＨＰＶの簡便かつ
高感度な検出方法が提供された。また、各ＨＰＶ型に特
異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションや制限
酵素処理によって、各ＨＰＶのタイピングを簡便に行う
ことが可能となった。
り、良性型及び／又は悪性型ＨＰＶに共通な遺伝子領域
が見出され、この領域の遺伝子配列を検出することによ
り、試料中の良性型及び／又は悪性型ＨＰＶの簡便かつ
高感度な検出方法が提供された。また、各ＨＰＶ型に特
異的なプローブを用いるハイブリダイゼーションや制限
酵素処理によって、各ＨＰＶのタイピングを簡便に行う
ことが可能となった。
【００４６】
【００４７】 配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＡＴＡＧＧＡＧＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴ ２１
【００４８】 配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＧＣＴＡＡＴＴＣＧＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧ ２０
【００４９】 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＣＣＴＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴ ２０
【００５０】 配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＣＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣ ２０
【００５１】 配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴ ２１
【００５２】 配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＧＴＴＡＡＴＴＣＧＴＴＧＴＴＡＣＣＴＧ ２０
【００５３】 配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＣＴＴＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴ ２０
【００５４】 配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＣＡＡＴＴＡＧＡＡＧＡＣＡＧＣＴＣ ２０
【００５５】 配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴ ２１
【００５６】 配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＧＴＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＴＧＴＧＴＣＣ ２０
【００５７】 配列番号：１１ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴ ２９
【００５８】 配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣＴＣ２０
【００５９】 配列番号：１３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＡＡＧＧＧＡＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴ ２１
【００６０】 配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＧＴＴＧＡＡＴＣＣ ２０
【００６１】 配列番号：１５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＡＧＡ ２０
【００６２】 配列番号：１６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＡＧＧＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＡＡＧＴＧＧＴ ２１
【００６３】 配列番号：１７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＣＣ ２０
【００６４】 配列番号：１８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＧＣＡＡＣＴＧＡＣＣＴ ２９
【００６５】 配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＣＡＡＴＴＡＣＣＣＧＡＣＡＧＣＴＣ ２０
【００６６】 配列番号：２０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＡＧＧＧＴＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＧＣＧＧＴ ２１
【００６７】 配列番号：２１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＧＴＣＡＡＡＧＡＣＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣ ２０
【００６８】 配列番号：２２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＴＡＧＡＴＴＴＡＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＡＣＴＧＡＣＣＴ ２９
【００６９】 配列番号：２３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＣＡＡＴＴＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＣ ２０
【００７０】 配列番号：２４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＡＧＧＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＡＡＡＣＧＧＴ ２０
【００７１】 配列番号：２５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧＴ ２１
【００７２】 配列番号：２６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＧＣＴＡＡＴＴＣＧＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧ ２０
【００７３】 配列番号：２７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＴＧＴＣＡＡＡＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＴＣＣ ２０
【００７４】 配列番号：２８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＣＴＧＴＣＧＣＴＴＡＡＴＴＧＣＴＣ ２０
【００７５】 配列番号：２９ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列の特徴：１９番目のＮはｉ（イノシン） 配列：ＴＴＡＧＡＴＴＴＲＣＡＷＣＣＴＧＡＲＮＣＡＡＣＴＧＡＣＣＴ ２９
【００７６】 配列番号：３０ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＣＣＣＣＡＡＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＣＣＴ ２９
【００７７】 配列番号：３１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＣＣＴＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴ ２０
【００７８】 配列番号：３２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＴＡ ２０
【００７９】 配列番号：３３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＡＡＣＣＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＧＧＡＡＣＧ ２０
【００８０】 配列番号：３４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴＣＧＴＡＣＴＧＡＡＡ ２０
【００８１】 配列番号：３５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列：ＣＴＧＣＡＣＴＧＴＧＡＣＧＴＧＴＡＡＡＡ ２０
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 福島 道夫 北海道札幌市中央区円山西町１−１−１ −510 (72)発明者 藤永 ▲ケイ▲ 北海道札幌市中央区旭ケ丘５丁目６−25 (56)参考文献 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣ ＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，27 （12）（1989）Ｐ．2660−2665 ＩＮＴ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ．，45 （1990）Ｐ．990−992 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/70 C12N 15/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】 良性型及び／又は悪性型ヒトパピローマ
ウイルスの検出方法において、該ヒトパピローマウイル
スのＤＮＡ配列を、配列表の配列番号２６及び／又は配
列番号２７で示される塩基配列のプライマーと、配列表
の配列番号２８で示される塩基配列のプライマーの組合
せを用いて検出することを特徴とするヒトパピローマウ
イルスの検出方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法を用いてヒトパピロ
ーマウイルスの検出を行うための検出キットであって、
配列表の配列番号２６及び／又は配列番号２７で示され
る塩基配列のプライマーと、配列表の配列番号２８で示
される塩基配列のプライマーの組合せを含有しているこ
とを特徴とするヒトパピローマウイルスの検出キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3230839A JP2785164B2 (ja) | 1990-08-20 | 1991-08-19 | ヒトパピローマウイルスの検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-217067 | 1990-08-20 | ||
| JP21706790 | 1990-08-20 | ||
| JP3230839A JP2785164B2 (ja) | 1990-08-20 | 1991-08-19 | ヒトパピローマウイルスの検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05192200A JPH05192200A (ja) | 1993-08-03 |
| JP2785164B2 true JP2785164B2 (ja) | 1998-08-13 |
Family
ID=26521792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3230839A Expired - Fee Related JP2785164B2 (ja) | 1990-08-20 | 1991-08-19 | ヒトパピローマウイルスの検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2785164B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000500342A (ja) | 1995-11-15 | 2000-01-18 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | ヒトパピローマウイルス核酸に相補的な核酸プローブおよび関連する方法およびキット |
| IT1316070B1 (it) * | 2000-05-05 | 2003-03-28 | Bioanalisi Ct Sud Snc Di Perse | Metodo e mezzi per l'identificazione di virus hpv |
| US6884605B2 (en) * | 2001-08-09 | 2005-04-26 | Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Compositions, methods and products comprising human papillomavirus for detecting and treating a cancer |
| DE602005022759D1 (de) | 2004-12-08 | 2010-09-16 | Gen Probe Inc | Nukleinsäuredetektion aus verschiedenen typen des humanen papillomavirus |
| JP5902517B2 (ja) * | 2012-03-13 | 2016-04-13 | ハウス食品グループ本社株式会社 | 小麦の検出方法 |
-
1991
- 1991-08-19 JP JP3230839A patent/JP2785164B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＩＮＴ．Ｊ．ＣＡＮＣＥＲ．，４５（１９９０）Ｐ．９９０−９９２ |
| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，２７（１２）（１９８９）Ｐ．２６６０−２６６５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05192200A (ja) | 1993-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| de Roda Husman et al. | Processing of long-stored archival cervical smears for human papillomavirus detection by the polymerase chain reaction | |
| Maitland et al. | Detection of human papillomavirus genes in human oral tissue biopsies and cultures by polymerase chain reaction | |
| JP2791685B2 (ja) | パピローマウイルスの検出方法 | |
| CA2074069C (en) | Primers and process for detecting human papillomavirus genotypes by pcr | |
| EP0746627B1 (en) | Human papilloma virus detection in a nucleic acid amplification process using general primers | |
| Kalantari et al. | Physical state of HPV16 and chromosomal mapping of the integrated form in cervical carcinomas | |
| JP2651483B2 (ja) | ポリメラーゼ連鎖反応によるヒト乳頭腫ウイルスの検出 | |
| US5501947A (en) | PCR diagnosis of human papilloma virus type 16 | |
| US5643715A (en) | Human papillomavirus type 52 DNA sequences and methods for employing the same | |
| JP2905283B2 (ja) | ヒトパピロマウイルスの検出方法およびそれに用いるオリゴヌクレオチド | |
| EP1060271B1 (en) | Amplification and detection of ebv-barf1 expression for diagnosis of nasopharyngeal carcinoma | |
| Surentheran et al. | Detection and typing of human papillomaviruses in mucosal and cutaneous biopsies from immunosuppressed and immunocompetent patients and patients with epidermodysplasia verruciformis: a unified diagnostic approach. | |
| Das et al. | Human papillomavirus DNA sequences in adenocarcinoma of the uterine cervix in Indian women | |
| JP2785164B2 (ja) | ヒトパピローマウイルスの検出方法 | |
| Anderson et al. | Analysis of prostate tissue DNA for the presence of human papillomavirus by polymerase chain reaction, cloning, and automated sequencing | |
| Bauer-Hofmann et al. | Genomic cloning and characterization of the nonoccupied allele corresponding to the integration site of human papillomavirus type 16 DNA in the cervical cancer cell line SiHa | |
| Geisbill et al. | Detection and characterization of human papillomavirus type 45 DNA in the cervical carcinoma cell line MS751. | |
| PT1694870E (pt) | Iniciadores e sondas para a detecção de genótipos de vph genital | |
| Gazit et al. | Molecular evidence for a type C retrovirus etiology of the lymphoproliferative disease of turkeys | |
| Kristiansen et al. | Human papillomavirus infection in Norwegian women with cervical cancer | |
| Gopalkrishna et al. | A simple and rapid method of high quantity DNA isolation from cervical scrapes for detection of human papillomavirus infection | |
| Chow et al. | Thermus aquaticus DNA polymerase-catalysed chain reaction for the detection of human papillomaviruses | |
| Wickenden et al. | DNA hybridization of cervical tissues | |
| JP3038433B2 (ja) | ヤマノイモえそモザイクウイルスの精製法及びその遺伝子 | |
| JP2001321168A (ja) | Ｈｐｖ感染型の同定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090529 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090529 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100529 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110529 Year of fee payment: 13 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |