CN104805509A - 一种羧基修饰的基因芯片基片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种羧基修饰的基因芯片基片及其制备方法，以普通玻璃基片为载体，基片表面引入羧基活性官能团，可与氨基修饰的DNA模板进行化学反应共价牢固结合。其制备方法包括玻璃基片表面清洁工艺、玻璃基片表面硅烷化修饰工艺、玻璃基片表面羧基修饰工艺。本发明中制备方法包括清洁活化玻璃芯片基片的表面，并进一步修饰成酰胺键共聚物表面，然后使用自动点样仪点样固定氨基模板。与常规的醛基修饰相比很大程度上提升了芯片基片的品质和修饰工艺。本发明制备的羧基修饰芯片基片具有荧光背景低，信号强度大，固定效率高，制造成本低，步骤简单易行等优点。易于产业化和流程化，可广泛应用于各类基因芯片上。

Description

一种羧基修饰的基因芯片基片及其制备方法

技术领域

本发明属于基因领域，具体涉及一种羧基修饰的基因芯片基片及其制备方法和应用。

背景技术

生物芯片(biochip)技术是80年代发展起来的一门新兴技术，是指利用微细加工技术并结合有关的化学合成技术，将大量探针分子固定于载体即微小的基片（如玻璃、硅片、有机材料薄膜等）上，然后与标记的样品分子进行杂交，通过检测杂交信号的强弱，对靶分子的序列和数量进行分析检验的微型器件。它可以将成千上万乃至几十万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上，对基因、抗原活体细胞和组织等进行测试分析。近年来，以基因芯片为代表的生物芯片技术得到了迅猛发展，目前已有多种芯片出现。基因芯片技术是指将大量靶基因（或基因片段）有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片等载体上所形成的矩阵。将待测样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用荧光扫描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似于传统的点杂交的杂交数据，以达到快速、高效、平行性分析生物信息的目的。基因芯片技术是一种高通量的现代生物检测技术，在功能基因研究、新药筛选、疾病的基因诊断等领域具有广泛的应用。

基因芯片制备是一个非常复杂的过程，制备过程的操作复杂化容易造成检测结果的不稳定，从而影响基因芯片的产业化和流程化过程。常规玻璃芯片基片制备方法多采用醛基或氨基修饰，制备的醛基片或氨基片具有多种缺点，由于修饰方法的不同或钝化反应的效率问题，荧光标记的杂交探针或荧光单体检测时经常出现背景较深，低信噪比问题。在基因芯片的应用过程中，检测的灵敏度和选择性是两个非常重要的考察参数。所以，制作一种理想的，具有高的固定化效率，并且不与反应体系中的其他物质进行非特异性反应的芯片基片成为了基因芯片技术的关键。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术的不足，解决常规芯片制备过程复杂，难以流程化问题；降低常规芯片荧光背景高问题；解决常规芯片核酸固定效率低问题；解决常规芯片核酸信号强度低问题；本发明的第一个目的在于提供了一种羧基修饰的基因芯片基片的制备方法。本发明的第二个目的是提供了上述羧基修饰的基因芯片基片。本发明的第三个目的是提供了上述羧基修饰的基因芯片基片在核酸DNA固定方面的应用。

技术方案：为了解决上述目的，本发明所采用的技术方案为： 一种羧基修饰的基因芯片基片的制备方法，包括以下步骤：1）玻片表面清洗工艺；2）玻片表面通过硅烷化试剂进行硅烷化修饰工艺；3）羧基修饰工艺；所述硅烷化试剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷和质量分数为95%的乙醇以体积比为1：45～49配制而成。采用分子自组装技术将硅烷化试剂组装在羟基化的玻璃基片表面，形成一层氨基结尾的单分子自组装膜。

所述步骤1）玻片表面清洗工艺具体包括以下步骤：

1a）预清洗处理：将玻璃片全部浸入去离子水中，然后在水中轻轻擦拭玻璃表面，玻璃两面都擦拭过后用洗瓶冲洗6-8次，氮气吹干，放入干净培养皿中；

1b）甲醇-盐酸溶液清洗：将预清洗处理好的玻片放入装有甲醇-盐酸培养皿中；用保鲜膜将培养皿封闭，并放到摇床上80rpm清洗30分钟；用镊子将玻片从甲醇-盐酸溶液中取出，用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；

1c）硫酸清洗：将甲醇-盐酸溶液清洗好的玻片放入盛有硫酸的干净培养皿中，用保鲜膜将培养皿封闭，并放到摇床上80rpm清洗30分钟后，倒掉硫酸；用镊子将玻片取出，用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；将玻片放入盛有95%乙醇培养皿中80rpm清洗10分钟，结束后取出玻片放入盛有去离子水的培养皿中80rpm清洗5分钟；取出玻片用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；使用超声波清洗仪进行残酸的去除和清洗，去离子水冲洗后，氮气流吹干。

所述步骤2）玻片表面硅烷化修饰工艺具体包括以下步骤：

2a）配制硅烷化试剂，配制全程避光，室温保存；

2b）将表面清洗后的玻片放入盛有硅烷试剂的培养皿内，用锡箔纸遮光，80rpm反应30分钟，取出玻片，去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；

2c）将步骤2b）处理后的玻片放入盛有95%乙醇的培养皿内，80rpm清洗10分钟。取出玻片放入盛有去离子水的培养皿内80rpm清洗5分钟，取出玻片，去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；

2d）将步骤2c）处理后的玻片放入干净的干燥培养皿，放入电热恒温鼓风干燥箱120-125℃避光烘烤45-55分钟；将从烘箱取出的玻片避光放至室温；实现硅烷化试剂与玻璃基片的完全组装。

所述步骤3）羧基修饰工艺具体包括以下步骤：

    3a）配制聚丙烯酸溶液：将超纯水和聚丙烯酸以1000-1200：1的体积比混合，涡旋震荡均匀，用盐酸调pH至8.0；室温保存。聚丙烯酸溶液具有丰富的羧基活性官能团，可制备出带有活性羧基（-COOH）的基因芯片片基，基因芯片片基上的活性羧基（-COOH）可以与5’-端或者3’-端被修饰有活性氨基（-NH2）核酸的氨基反应，生成酰胺共价键（-CO-NH-），从而将核酸通过酰胺键固定在羧基修饰的基因基片表面。

3b）在盛有配制好的聚丙烯酸的培养皿中放入硅烷化后的玻片，保鲜膜密封，锡箔纸避光，80rpm室温反应30分钟，用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；羧基玻片4℃密封真空保存。

由于聚丙烯酸具有丰富的羧基集团，基片表面组装一层高密度的羧基分子层，固定模板效率高。

上述的制备方法制备得到的羧基修饰的基因芯片基片。

上述的羧基修饰的基因芯片基片在核酸DNA固定方面的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明中制备方法包括清洁活化玻璃芯片基片的表面，并进一步修饰成酰胺键共聚物表面，然后使用自动点样仪点样固定氨基模板。与常规的醛基修饰相比很大程度上提升了芯片基片的品质和修饰工艺。本发明制备的羧基修饰芯片基片具有荧光背景低，信号强度大，固定效率高，制造成本低，步骤简单易行等优点。易于产业化和流程化，可广泛应用于各类基因芯片上。

附图说明

图1 为本发明羧基修饰的基因芯片基片表面修饰原理图；

图2 为羧基芯片点样试验中点样矩阵示意图；

图3 为羧基芯片和普通醛基芯片的Cy3荧光扫描背景图片，与醛基片作比较的荧光信号柱形比较图；

图4 为羧基芯片和普通醛基芯片核酸样品固定能力的Cy3荧光扫描图片及柱形对比图；

图5 为羧基修饰基片与普通醛基片固定率的荧光信号扫描图片及柱形对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐释本发明：

实施例1：以羧基修饰芯片为载体基片的基因芯片制备

羧基芯片基片采用的是普通无色玻璃片，其尺寸为长：76mm，宽：25mm，厚：1mm。其制备过程包括玻片表面清洗工艺、玻片表面硅烷化修饰工艺、羧基修饰工艺。该制备过程芯片基片表面的结构变化示意图如图1所示。羧基修饰基因芯片基片制备的具体步骤为：

A）在直径15cm培养皿中倒入加有洗涤液的去离子水，向其中轻轻放入7张玻片，轻轻擦拭玻片表面，玻片两面均擦拭过后用去离子水冲洗两面6-8次，氮气吹干，放入干净的培养皿中（玻片之间不能叠加）；

B）分别量取25ml甲醇与浓盐酸于100ml干净烧杯中，用磁力搅拌器搅匀后倒入装有玻片的培养皿中（此时玻片朝上一面规定为正面，玻片之间不能叠加），用保鲜膜将培养皿密封，放到脱色摇床上80rpm摇动30分钟；

C）用镊子将玻片从甲醇-盐酸溶液中取出，用去离子水冲洗玻片的两面6-8次，氮气吹干，正面朝上放入干净的培养皿中；

D）向装有玻片的培养皿内倒入50ml浓硫酸，用保鲜膜将培养皿密封，放到脱色摇床上80rpm摇动30分钟，之后用镊子从中取出玻片，用去离子水冲洗玻片两面6-8次，氮气吹干，放入干净的染色缸内；

E）向装有玻片的染色缸中倒入100ml 95%乙醇，将染色缸放入超声波清洗仪超声清洗10分钟，之后倒出乙醇，加入100ml去离子水，将染色缸放入超声仪超声清洗5分钟，用镊子取出玻片，用去离子水冲洗其两面6-8次，氮气吹干，正面朝上放入干净的培养皿内；

F）分别量取49ml 95%乙醇和1ml 硅烷试剂APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷，A3648，Sigma-Aldrich)，倒入100ml干净烧杯中，用磁力搅拌器搅匀后倒入装有玻片的培养皿中，用保鲜膜将培养皿密封，避光，放到脱色摇床上80rpm摇动30分钟。用镊子夹取玻片一角将其取出，用去离子水冲洗玻片两面6-8次，氮气吹干；

G）将玻片放入盛有50ml 95%乙醇的培养皿内，80rpm清洗10分钟。取出玻片放入盛有去离子水的培养皿内80rpm清洗5分钟，取出玻片，去离子水冲洗6-8次，氮气吹干。将玻片放到干净的芯片架上，120℃烘烤50分钟。将玻片从烘箱中取出避光放置，冷却至室温；

H）将玻片放入干净的培养皿内，之后分别量取60ml去离子水和500μl聚丙烯酸，倒入100ml干净的烧杯内搅匀，用2M盐酸调节pH至8.0后倒入装有玻片的培养皿内，用保鲜膜将培养皿密封，避光，放到脱色摇床上80rpm摇动20分钟；

I）用镊子夹取玻片一角将其取出，用去离子水冲洗两面6-8次，氮气吹干，放入干净的芯片盒内抽真空4℃保存。

实施例2   羧基修饰芯片基片的荧光背景检测

将实施例1中制备好的羧基芯片基片进行Cy3荧光背景检测，本实施例中所用的普通醛基芯片是根据文献（《Colloids and Surfaces B：Biointerfaces》Volume 36, Issues 3-4, 1 August 2004, Pages 178）中提到的方法制备的，即玻片先进行氨基硅烷化后，然后进行戊二醛反应制备的。将二种玻片插入微阵列扫描仪（LuxScan 10k-A，博奥生物），采用532nm波长检测，在扫描参数设置为Power80，PMT700的条件下对羧基片和醛基片的全部点样区域进行扫描，如图3所示。然后使用微阵列扫描仪自带软件对图像进行处理提取荧光背景值。结果表明，羧基芯片荧光背景值均小于200。说明荧光背景值很低，可以满足实验要求。

实施例3  羧基修饰芯片基片的核酸DNA固定能力检测

本实施例中使用的羧基芯片是通过实施例1中所述方法制备的。

固定氨基修饰的寡核苷酸探针：使用微阵列点样仪（SmartArrayer-48，博奥晶芯）在羧基芯片基片上设定的10个点样小区内点样（如图2所示），在每个小区均匀的点制4X4的矩阵，共16X10个点。将5’-端带有氨基且3’-端带有Cy3荧光基团修饰的寡核苷酸（结构式为5’-NH2-TTTTTTTTTTCCTACGCCAACAGCTCCAACTACCACAACTT-Cy3-3’，上海生工生物科技有限公司，将序列TTTTTTTTTTCCTACGCCAACAGCTCCAACTACCACAACTT命名为SEQ NO：1），配制成浓度为20μM的点样液，取出20μl样品转移至384孔板。用点样仪吸取上述点样液，在实施例1中制备好的羧基芯片基片上设定的矩阵上点样，点样后的基片在温度为37℃相对湿度为75％的恒温恒湿箱中避光固定12小时，清洗甩干，即固定好核酸样品。将已固定好寡核苷酸的羧基芯片插入扫描仪（LuxScan 10k-A，博奥生物），采用532nm波长检测，在Power为50，PMT为700扫描参数条件下对基片的全部点样区域进行扫描，其中的一个点阵扫描图片如图4所示。然后使用微阵列扫描仪自带软件对图像进行处理提取荧光信号值。结果表明，羧基修饰芯片荧光值高出普通醛基修饰芯片40%左右。说明羧基芯片固定氨基修饰DNA能力较强，可以满足实验要求。

实施例4   羧基修饰芯片基片的核酸DNA固定率检测

本实施例中使用的羧基芯片是通过实施例1中所述方法制备的。采用实施例3方法固定核酸DNA，每一个点阵均点制4X4的矩阵，每个点阵第一行为阴性空白对照行，量取20μl去离子水作为空白对照。扫描参数设置如实施例3，扫描强度记为P1。将扫描后的二种基因芯片置于含0.1％ SDS的SSC溶液中漂洗15分钟，然后在去离子水中漂洗5分钟，氮气吹干。然后扫描芯片，读取荧光信号强度P2。每个点样点的固定率＝P2/P1×100%。其中的一个点阵扫描图片和核酸固定率对比柱状图如图5所示。结果表明：羧基修饰芯片单个点样点的固定率均大于85%，而醛基芯片固定率均在65%左右。表明羧基修饰芯片对氨基修饰核酸具有更强的固定率，结合强度高。

Claims (5)

1.一种羧基修饰的基因芯片基片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）玻片表面清洗工艺；2）玻片表面通过硅烷化试剂进行硅烷化修饰工艺；3）羧基修饰工艺；所述硅烷化试剂，所述硅烷化试剂包括3-氨丙基三乙氧基硅烷和质量分数为95%的乙醇以体积比为1：45～49配制而成。

2.根据权利要求1所述的羧基修饰的基因芯片基片的制备方法，其特征在于：所述步骤1）玻片表面清洗工艺具体包括以下步骤：

1a）预清洗处理：将玻璃片全部浸入去离子水中，然后在水中轻轻擦拭玻璃表面，玻璃两面都擦拭过后用洗瓶冲洗6-8次，氮气吹干，放入干净培养皿中；

1b）甲醇-盐酸溶液清洗：将预清洗处理好的玻片放入装有甲醇-盐酸培养皿中；用保鲜膜将培养皿封闭，并放到摇床上80rpm清洗30分钟；用镊子将玻片从甲醇-盐酸溶液中取出，用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；

1c）硫酸清洗：将甲醇-盐酸溶液清洗好的玻片放入盛有硫酸的干净培养皿中，用保鲜膜将培养皿封闭，并放到摇床上80rpm清洗30分钟后，倒掉硫酸；用镊子将玻片取出，用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；将玻片放入盛有95%乙醇培养皿中80rpm清洗10分钟，结束后取出玻片放入盛有去离子水的培养皿中80rpm清洗5分钟；取出玻片用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；使用超声波清洗仪进行残酸的去除和清洗，去离子水冲洗后，氮气流吹干。

3.根据权利要求1所述的羧基修饰的基因芯片基片的制备方法，其特征在于：所述步骤2）玻片表面硅烷化修饰工艺具体包括以下步骤：

2a）配制硅烷化试剂，配制全程避光，室温保存；

2b）将表面清洗后的玻片放入盛有硅烷试剂的培养皿内，用锡箔纸遮光，80rpm反应30分钟，取出玻片，去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；

2c）将步骤2b）处理后的玻片放入盛有95%乙醇的培养皿内，80rpm清洗10分钟；取出玻片放入盛有去离子水的培养皿内80rpm清洗5分钟，取出玻片，去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；

2d）将步骤2c）处理后的玻片放入干净的干燥培养皿，放入电热恒温鼓风干燥箱120-125℃避光烘烤45-55分钟；将从烘箱取出的玻片避光放至室温；实现硅烷化试剂与玻璃基片的完全组装。

4.根据权利要求1所述的羧基修饰的基因芯片基片的制备方法，其特征在于：所述步骤3）羧基修饰工艺具体包括以下步骤：

3a）配制聚丙烯酸溶液：将超纯水和聚丙烯酸以1000-1200：1的体积比混合，涡旋震荡均匀，用盐酸调pH至8.0；室温保存；

3b）在盛有配制好的聚丙烯酸的培养皿中放入硅烷化后的玻片，保鲜膜密封，锡箔纸避光，80rpm室温反应30分钟，用去离子水冲洗6-8次，氮气吹干；羧基玻片4℃密封真空保存。

5.权利要求1~4任一项所述的制备方法制备得到的羧基修饰的基因芯片基片。