CN114904595A - 基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于金纳米棒‑刷双层纳米结构基底的微阵列芯片及其制备方法。该芯片是在金纳米棒自组装形成的金纳米棒基底上修饰有聚合物刷，在所述聚合物刷上固定有多肽底物。本发明提供的金纳米棒‑刷双层结构基底上固定多肽底物形成多肽微阵列芯片能够检测到荧光多肽底物浓度最低为0.05mg/mL，并且可以实现对基质金属蛋白酶活性的高灵敏度检测，对于基质金属蛋白酶‑1，基质金属蛋白酶‑2，基质金属蛋白酶‑3，基质金属蛋白酶‑7，基质金属蛋白酶‑9和基质金属蛋白酶‑13的检测限分别为1.7fg/mL,0.3fg/mL,2.0fg/mL,1.8fg/mL,2.2fg/mL和14.0fg/mL。

Description

基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片及其制备 方法

技术领域

本发明属于生物医疗领域，尤其涉及一种基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片及其制备方法。

背景技术

微阵列生物芯片因其小型化，高通量等优势广泛应用于生物医药及生物分析领域。目前常用的微阵列芯片基底主要是表面修饰有氨基、醛基、环氧基或多聚赖氨酸等活性基团的二维平面玻片，但是二维芯片很大程度上容易受到玻片表面积的限制，探针分子固定量小，并且平铺于基底表面，无法较好接触靶标分析物。在蛋白质和多肽微阵列芯片上，非特异性蛋白吸附较高，方法灵敏度受到了很大的限制。

基于微阵列分析方法灵敏度的提高主要可以通过以下两种方式实现：(1)使用三维基底增加表面固定的探针密度；(2)通过表面增强的策略提高荧光信号。聚合物涂覆是一种简便的制备三维微阵列基底的方法，易于原位合成，有较高的生物分子固定量和抗污能力。金属纳米结构(如金和银)的局域表面等离子体共振和表面荧光基团相互作用增强荧光信号。然而，目前对于同时使用金纳米和聚合物分子刷制备的微阵列芯片基底还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片及其制备方法，该芯片能够检测到荧光多肽底物浓度最低为0.05mg/mL，并且可以实现对基质金属蛋白酶活性的高灵敏度检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供一种基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片，该芯片是在金纳米棒自组装形成的金纳米棒基底上修饰有聚合物刷，在所述聚合物刷上固定有多肽底物。

优选的是，所述的聚合物刷为聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷，多肽底物优选为FAM修饰多肽底物、TAMRA修饰多肽底物、Cy5修饰多肽底物、基质金属蛋白酶-1特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-2特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-3特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-7特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-9特异性识别多肽底物或基质金属蛋白酶-13特异性识别多肽底物。

本发明还提出了一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：采用金纳米棒自组装方法制备金纳米棒基底；

步骤二：在步骤一的金纳米棒基底依次进行氨基化和引发剂修饰；

步骤三：利用表面引发原子转移自由基聚合法，在步骤二得到的经氨基化修饰和引发剂修饰的金纳米棒基底修饰聚合物刷；

步骤四：在步骤三得到的聚合物刷修饰的金纳米棒基底上固定多肽底物，形成微阵列芯片。

优选的是，所述的步骤一具体为：

1)对光学级玻璃片进行羟基化修饰；

2)对羟基化玻璃片进行氨基化修饰；

3)将NaBH₄溶液加入到包含CTAB和HAuCl₄的混合溶液中，室温下搅拌后，静置得到种子溶液；

4)将CTAB溶液、HAuCl₄溶液和AgNO₃溶液混合均匀后，加入抗坏血酸，混合均匀后，加入步骤3)的种子溶液，静置反应后，得到金纳米棒溶液；

5)将金纳米棒溶液与步骤2)中得到的氨基化修饰玻璃片在25～35℃下反应6h，获得金纳米棒修饰的基底。

优选的是，所述的步骤二具体为：

1)将金纳米棒修饰的基底浸泡在2-氨基乙硫醇的无水乙醇溶液中反应，得到氨基化修饰金纳米棒基底；

2)将氨基化修饰金纳米棒基底放入α-溴异丁酰溴和三乙胺的无水二氯甲烷溶液中反应，得到引发剂修饰的金纳米棒基底。

优选的是，所述的步骤三具体为：

将引发剂修饰的金纳米棒基底放入含有甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙酯、溴化亚铜和2,2′-联吡啶的水/甲醇溶液中反应，得到聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底。

优选的是，所述的步骤三中，甲基丙烯酸缩水甘油酯的体积分数为0.5～7.5％，甲基丙烯酸羟乙酯的体积分数为5～20％。

优选的是，所述的步骤三中，溴化亚铜的浓度为2～8mg/mL，2,2′-联吡啶的浓度为5～20mg/mL。

优选的是，所述的步骤三的反应温度为30℃，反应时间为6～15h。

优选的是，所述的步骤四具体为：

步骤a:配置点样液：含有0.05～4mg/mL多肽底物、体积分数为35％甘油、20μg/mL牛血清白蛋白和0.1M且pH＝4醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

步骤b：点样：用步骤a中的点样液对聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底进行点样，点样后在30℃，真空干燥12h；

步骤c：封闭未反应的环氧基团：点样反应后，选用含有1％牛血清白蛋白，1％乙醇胺，0.15M氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05M的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到多肽微阵列芯片。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供一种基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片及其制备方法，该芯片是在金纳米棒自组装形成的金纳米棒基底上修饰有聚合物刷，在所述聚合物刷上固定有多肽底物。本发明通过自组装在氨基化玻璃片表面连接金纳米棒，再经表面引发原子转移自由基聚合反应在金纳米棒表面生长聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷，能够提供一种负载能力高，能信号放大，抗污的三维结构金纳米棒-刷双层纳米结构基底，有效提高探针分子的固定量和识别靶标分子的易接近性，同时在基底表面的荧光分子被金纳米棒的局域表面等离子体共振场增强荧光信号，聚合物分子刷中甲基丙烯酸羟乙酯能有效减轻非特异性蛋白吸附。

本发明中提供的金纳米棒-刷双层结构基底上固定多肽底物形成多肽微阵列芯片能够检测到荧光多肽底物浓度最低为0.05mg/mL，并且可以实现对基质金属蛋白酶活性的高灵敏度检测，对于基质金属蛋白酶-1，基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-13的检测限分别为1.7fg/mL,0.3fg/mL,2.0fg/mL,1.8fg/mL,2.2fg/mL和14.0fg/mL。本发明的方法具有通用性，简便性，可以进行大批量生产。

附图说明

图1为本发明提供的基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底的制备示意图；

图2为不同染料的多肽底物在金纳米棒-刷双层结构基底上的荧光增强效果；

图3为本发明中对于基质金属蛋白酶-1(a)，基质金属蛋白酶-2(b)，基质金属蛋白酶-3(c)，基质金属蛋白酶-7(d)，基质金属蛋白酶-9(e)和基质金属蛋白酶-13(f)的检测分析结果图，图表下面为相应的荧光扫描图。

具体实施方式

本发明首先提供一种基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片，该芯片是在金纳米棒自组装形成的金纳米棒基底上修饰有聚合物刷，在所述聚合物刷上固定有多肽底物。所述的聚合物刷优选为聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷，多肽底物优选为FAM修饰多肽底物、TAMRA修饰多肽底物、Cy5修饰多肽底物、基质金属蛋白酶-1特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-2特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-3特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-7特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-9特异性识别多肽底物或基质金属蛋白酶-13特异性识别多肽底物。

本发明还提出了一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：采用金纳米棒自组装方法制备金纳米棒基底；

步骤二：在步骤一的金纳米棒基底依次进行氨基化和引发剂修饰；

步骤三：利用表面引发原子转移自由基聚合法，在步骤二得到的经氨基化修饰和引发剂修饰的金纳米棒基底修饰聚合物刷；

步骤四：在步骤三得到的聚合物刷修饰的金纳米棒基底上固定多肽底物，形成微阵列芯片。

按照本发明，所述的步骤一优选具体为：

1)对光学级玻璃片进行羟基化修饰；所述羟基化修饰采用KOH，对光学玻璃片的羟基化修饰为将光学玻璃片浸泡在1～5M KOH溶液中，室温下浸泡1～5h；

2)对羟基化玻璃片进行氨基化修饰；所述氨基化修饰采用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，对所述羟基化基底的氨基化修饰为将羟基化基底浸泡在含有体积分数为0.5～7.5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中常温下反应1～8h；

3)将NaBH₄溶液加入到包含CTAB和HAuCl₄的混合溶液中，室温下搅拌后，静置得到种子溶液；NaBH₄溶液的浓度优选为10mM，CTAB的浓度优选为0.2M，HAuCl₄的浓度优选为0.5mM，NaBH₄溶液、CTAB和HAuCl₄的体积比优选为0.4～1：2～8：2～7。

4)将CTAB溶液、HAuCl₄溶液和AgNO₃溶液混合均匀后，加入抗坏血酸，混合均匀后，加入步骤3)的种子溶液，27～30℃恒温静置反应24h后，10000rpm离心洗涤3次，分散于去离子水中，得到金纳米棒溶液；所述的CTAB溶液、HAuCl₄溶液、AgNO₃溶液、抗坏血酸和种子溶液的体积比优选为30～70：30～70：0.5～3：0.3～1：0.1～0.5；CTAB溶液的浓度优选为0.2M，HAuCl₄溶液的浓度优选为1mM，AgNO₃溶液的浓度优选为4mM，抗坏血酸的浓度优选为0.1M。

5)将金纳米棒溶液与步骤2)中得到的氨基化修饰玻璃片在25～35℃下反应6h，获得金纳米棒修饰的基底。金纳米棒溶液的浓度优选为0.01～0.50nM。

按照本发明，所述的步骤二具体优选为：

1)将金纳米棒修饰的基底浸泡在2-氨基乙硫醇的无水乙醇溶液中反应，得到氨基化修饰金纳米棒基底；2-氨基乙硫醇的无水乙醇溶液的质量分数优选为1～5mg/mL，所述的反应温度优选为常温，反应时间优选为12～24h。

2)引发剂采用α-溴异丁酰溴；对所述金纳米棒基底的引发剂修饰方式为将氨基化修饰金纳米棒基底放入α-溴异丁酰溴和三乙胺的无水二氯甲烷溶液中优选是先在-5～5℃下反应10～30min，然后在25℃下反应1～3h，得到引发剂修饰的金纳米棒基底。其中，α-溴异丁酰溴和三乙胺的无水二氯甲烷溶液中，α-溴异丁酰溴的体积分数优选为0.5～7.5％，三乙胺的体积分数优选为0.5～7.5％。

按照本发明，所述的步骤三具体优选为：

所述聚合物刷为聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷；在金纳米棒基底表面修饰聚合物刷的方式为：将引发剂修饰的金纳米棒基底放入含有甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙酯、溴化亚铜和2,2′-联吡啶的水/甲醇溶液中反应，得到聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底。所述的含有甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙酯、溴化亚铜和2,2′-联吡啶的水/甲醇溶液中，甲基丙烯酸缩水甘油酯的体积分数优选为0.5～7.5％，甲基丙烯酸羟乙酯的体积分数优选为5～20％，溴化亚铜的浓度优选为2～8mg/mL，2,2′-联吡啶的浓度优选为5～20mg/mL；所述的反应温度优选为30℃，反应时间优选为6～15h。

按照本发明，所述的步骤四具体优选为：

步骤a:配置点样液：含有0.05～4mg/mL多肽底物、体积分数为35％甘油、20μg/mL牛血清白蛋白和0.1M且pH＝4醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

步骤b：点样：用步骤a中的点样液对聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底进行点样，点样后在30℃，真空干燥12h；

步骤c：封闭未反应的环氧基团：点样反应后，选用含有1％牛血清白蛋白，1％乙醇胺，0.15M氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05M的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到多肽微阵列芯片。

为了克服背景技术现有技术中微阵列芯片的缺点，本发明采用金纳米棒自组装到玻片表面构建纳米结构；利用表面引发原子转移自由基聚合法在金纳米棒表面修饰密集的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷，得到含有大量环氧基的三维聚合物刷层；利用此方法构建的基底为载体制备微阵列芯片，用于分析检测多种分子相互作用。在本发明中将多肽底物固定到上述微阵列芯片制备多肽微阵列芯片来检测基质金属蛋白酶活性。金纳米棒-刷双层纳米结构基底的制备过程如图1所示。

以下将对本发明的具体实施方式进行详细的描述。实施例中涉及到的原料均为商购获得。具体为：三水合氯金酸(HAuCl₄·3H₂O)，α-胰凝乳蛋白酶，苯甲基磺酰氟(PMSF，≥98.5％)，购于Sigma-Aldrich公司(美国)。三乙胺(TEA，>99.0％)和2-溴异丁酰溴(BIB，>98.0％)购于TCI公司(上海，中国)。3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，98％)，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，≥97％)，甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA，97％)，溴化亚铜(CuBr，99.0％)和2,2’-联吡啶(bipy，≥99.0％)购于Aladdin公司(上海，中国)。基质金属蛋白酶-7(MMP-7，对应多肽底物序号为S7)，人重组基质金属蛋白酶-1，2，3(proMMP-1，proMMP-2和proMMP-3，对应多肽底物序号为S1、S2和S3)购于ProSpec-Tany公司(以色列)。人重组基质金属蛋白酶-9，-13(proMMP-9和proMMP-13，对应多肽底物序号为S9、S13)购于R&D Systems公司(美国)。乙酸-4-氨基苯汞(APMA)购于上海杰美基因医药科技有限公司(上海，中国)。牛血清白蛋白(BSA)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购于北京鼎国昌盛生物科技有限公司(北京，中国)。多肽是由上海杰肽生物科技有限公司合成(上海，中国)。光学玻片购于博奥生物有限公司(北京，中国)。其它分析纯试剂均购于北京试剂公司(北京，中国)，实验用水均为Milli-Q超纯水(18.2MΩ·cm)。

实施例1

步骤1：金纳米棒自组装方法制备金纳米棒基底

1)：羟基化修饰：光学玻璃片浸泡在3M KOH溶液中，室温下浸泡2h得到羟基化修饰基底。

2)：氨基化修饰：将羟基化基底浸泡在含有体积分数为5％(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷的无水乙醇溶液中常温下反应4h。

3)：制备种子溶液：将0℃的0.6mL 10mM NaBH₄溶液加入到包含5mL 0.2M CTAB和5mL 0.5mM HAuCl₄的混合溶液中，室温下快速搅拌2min后，静置2h得到种子溶液；

4)：合成金纳米棒：将50mL 0.2M CTAB溶液，50mL 1mM HAuCl₄溶液，1mL 4mMAgNO₃溶液在室温下混合均匀后，加入0.7mL 0.1M的抗坏血酸。混合均匀后，加入0.24mL所述种子溶液，28℃恒温静置反应24h后，10000rpm离心洗涤3次，分散于去离子水中，得到金纳米棒溶液；

5)：制备金纳米棒基底：将0.15nM金纳米棒溶液与步骤2)中得到的氨基化修饰玻璃片在28℃下反应6h，获得金纳米棒修饰的基底。

步骤2：在获得金纳米棒基底上依次进行氨基化修饰和引发剂修饰

1)：氨基化修饰：将步骤1制备的金纳米棒基底浸泡在有质量分数为2mg/mL 2-氨基乙硫醇的无水乙醇溶液中常温下反应24h得到氨基化修饰金纳米棒基底；

2)：引发剂修饰：氨基修饰的金纳米棒基底放入含有体积分数为1％α-溴异丁酰溴，1％三乙胺的无水二氯甲烷溶液中，先在0℃下反应15min，然后在25℃下反应2h得到引发剂固定的金纳米棒基底。

步骤3：在金纳米棒基底表面修饰聚合物刷

将步骤2中引发剂修饰的金纳米棒基底放入含有体积分数为1％甲基丙烯酸缩水甘油酯和10％甲基丙烯酸羟乙酯，5mg/mL溴化亚铜和10.4mg/mL 2,2′-联吡啶的水/甲醇溶液中，在30℃反应9h，得到聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底。

步骤4：制备多肽微阵列芯片

选用步骤3制备的聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底和SmartArrayer 136生物芯片点样系统制作多肽微阵列芯片：

1)：点样：点样量为1nL/点；为了获得良好均匀的阵列点及保持生物分子的活性，选用的点样液组成为：含有不同浓度的荧光多肽底物或带荧光共振能量转移染料对的多肽底物(序列和浓度如表1所示)、体积分数为35％甘油、20μg/mL牛血清白蛋白和0.1M且pH＝4醋酸-醋酸钠缓冲溶液；用该点样液对聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底进行点样，点样后在30℃，真空干燥12h，完成多肽底物在聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底上的固定。

3)：封闭未反应的环氧基团：点样反应后，选用含有1％牛血清白蛋白，1％乙醇胺，0.15M氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05M的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到多肽微阵列芯片。

表1研究中使用的多肽序列

将上述制备得到的多肽微阵列芯片进行效果检测

1)：对上述所获得的封闭后的荧光多肽底物修饰多肽微阵列芯片，依次使用磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干。将荧光标记的多肽微阵列芯片放入微阵列扫描仪(如：北京博奥生物技术有限公司生产的LuxScan-10K/A型微阵列扫描仪检测)，得到多肽微阵列芯片的荧光检测信号。

按照上述实验步骤，本发明得到的结果如图2所示。图2(a)，2(b)，2(c)分别为本发明获得的荧光信号随FAM修饰的多肽底物(Peptide-FAM)浓度，TAMRA修饰的多肽底物(Peptide-TAMRA)浓度和Cy5修饰的多肽底物(Peptide-Cy5)浓度变化而变化的相应的数据提取图，图2(d)，2(e)，2(f)为相应的点阵荧光图片，其中横坐标为多肽底物浓度，纵坐标为荧光信号强度，使用该方法最低能检测到0.05mg/mL的荧光修饰多肽底物浓度。

2)：对上述所获得的封闭后的含荧光共振能量转移染料对多肽底物修饰多肽微阵列芯片，依次使用磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干。用聚四氟乙烯围栏将封闭，清洗后的多肽微阵列芯片分为12个阵。分别往其中加入30μL溶于缓冲液，细胞培养基DMEM，5％血清，DMEM和5％血清溶液中不同浓度的基质金属蛋白酶-1，基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-13，上述六种基质金属蛋白酶的浓度为0.001pg/mL-100ng/mL。在37℃，湿度为80％环境下反应4h。依次使用磷酸盐缓冲溶液，去离子水清洗干净并离心甩干。将荧光标记的多肽微阵列芯片放入微阵列扫描仪(如：北京博奥生物技术有限公司生产的LuxScan-10K/A型微阵列扫描仪检测)，得到多肽微阵列芯片的荧光检测信号。

荧光恢复率：加入基质金属蛋白酶的荧光信号值/未加基质金属蛋白酶荧光信号值-1。

按照上述实验步骤，本发明得到的结果如图3所示。图3是本发明获得的荧光恢复率随基质金属蛋白酶的浓度变化而变化检测线性图及相应的点阵荧光图片。它们分别表示在多肽微阵列芯片上，荧光信号恢复率随基质金属蛋白酶浓度的变化而变化以及相应的荧光图像，其中图中横坐标为基质金属蛋白酶浓度，纵坐标为荧光恢复率。利用本方法对基质金属蛋白酶-1，基质金属蛋白酶-2，基质金属蛋白酶-3，基质金属蛋白酶-7，基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶-13的检测限分别为1.7fg/mL,0.3fg/mL,2.0fg/mL,1.8fg/mL,2.2fg/mL和14.0fg/mL，并且在不同的介质中，其检测限及检测范围受到影响较小，说明该方法具有较好的抗干扰能力。

Claims (10)

1.一种基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片，其特征在于，该芯片是在金纳米棒自组装形成的金纳米棒基底上修饰有聚合物刷，在所述聚合物刷上固定有多肽底物。

2.根据权利要求1所述的一种基于金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片，其特征在于，所述的聚合物刷为聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷，多肽底物优选为FAM修饰多肽底物、TAMRA修饰多肽底物、Cy5修饰多肽底物、基质金属蛋白酶-1特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-2特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-3特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-7特异性识别多肽底物、基质金属蛋白酶-9特异性识别多肽底物或基质金属蛋白酶-13特异性识别多肽底物。

3.根据权利要求1所述的一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：采用金纳米棒自组装方法制备金纳米棒基底；

步骤二：在步骤一的金纳米棒基底依次进行氨基化和引发剂修饰；

步骤三：利用表面引发原子转移自由基聚合法，在步骤二得到的经氨基化修饰和引发剂修饰的金纳米棒基底修饰聚合物刷；

步骤四：在步骤三得到的聚合物刷修饰的金纳米棒基底上固定多肽底物，形成微阵列芯片。

4.根据权利要求3所述的一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的步骤一具体为：

1)对光学级玻璃片进行羟基化修饰；

2)对羟基化玻璃片进行氨基化修饰；

3)将NaBH₄溶液加入到包含CTAB和HAuCl₄的混合溶液中，室温下搅拌后，静置得到种子溶液；

4)将CTAB溶液、HAuCl₄溶液和AgNO₃溶液混合均匀后，加入抗坏血酸，混合均匀后，加入步骤3)的种子溶液，静置反应后，得到金纳米棒溶液；

5)将金纳米棒溶液与步骤2)中得到的氨基化修饰玻璃片在25～35℃下反应6h，获得金纳米棒修饰的基底。

5.根据权利要求3所述的一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的步骤二具体为：

1)将金纳米棒修饰的基底浸泡在2-氨基乙硫醇的无水乙醇溶液中反应，得到氨基化修饰金纳米棒基底；

2)将氨基化修饰金纳米棒基底放入α-溴异丁酰溴和三乙胺的无水二氯甲烷溶液中反应，得到引发剂修饰的金纳米棒基底。

6.根据权利要求3所述的一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的步骤三具体为：

将引发剂修饰的金纳米棒基底放入含有甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸羟乙酯、溴化亚铜和2,2′-联吡啶的水/甲醇溶液中反应，得到聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底。

7.根据权利要求6所述的一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的步骤三中，甲基丙烯酸缩水甘油酯的体积分数为0.5～7.5％，甲基丙烯酸羟乙酯的体积分数为5～20％。

8.根据权利要求3所述的一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的步骤三中，溴化亚铜的浓度为2～8mg/mL，2,2′-联吡啶的浓度为5～20mg/mL。

9.根据权利要求3所述的一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的步骤三的反应温度为30℃，反应时间为6～15h。

10.根据权利要求3所述的一种基于上述金纳米棒-刷双层纳米结构基底微阵列芯片的制备方法，其特征在于，所述的步骤四具体为：

步骤a:配置点样液：含有0.05～4mg/mL多肽底物、体积分数为35％甘油、20μg/mL牛血清白蛋白和0.1M且pH＝4醋酸-醋酸钠缓冲溶液；

步骤b：点样：用步骤a中的点样液对聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-co-甲基丙烯酸羟乙酯)刷修饰的金纳米棒基底进行点样，点样后在30℃，真空干燥12h；

步骤c：封闭未反应的环氧基团：点样反应后，选用含有1％牛血清白蛋白，1％乙醇胺，0.15M氯化钠的pH＝7.4且浓度为0.05M的磷酸盐缓冲溶液对未反应的环氧基团进行封闭后得到多肽微阵列芯片。

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