CN105675564B - 检测血小板衍生长因子的荧光增强微阵列传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测血小板衍生长因子的荧光增强微阵列传感器及其制备方法，微阵列传感器是在原始96孔板或者384孔板孔内经过原位合成贵金属纳米颗粒‑聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜、混杂膜表面胺基化修饰及表面涂层、结合能够捕获血小板衍生长因子的适配体所得。该微阵列传感器中的金属纳米颗粒引起的表面等离子体荧光增强效应使得表面的荧光信号强度大大增强，从而能够实现对血小板衍生长因子的高灵敏度、高选择性检测。本发明具有操作简单，检测快速准确、特异性强、灵敏度高等优势，具有很好的应用前景。

Description

检测血小板衍生长因子的荧光增强微阵列传感器
技术领域
本发明属于生物技术及临床医学诊断领域，涉及一种新型检测血小板衍生长因子(PDGF-BB)的荧光增强微阵列传感器及应用。基于原位合成的金属纳米颗粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜，作为具有荧光增强效应的生物微阵列传感器基底材料，在这基底上进行表面胺基化修饰及表面涂层并结合适配体捕获目标分析物，可以大大提高表面的荧光信号强度，从而实现对血小板衍生长因子等生物分子的高灵敏、高选择性检测。
背景技术
基于金属表面等离子体荧光增强效应(MEF)的研究最近持续受到关注，当光在金属和电介质面上沿一个方向平行地传播时，金属表面的自由电子在一定频率的外界电磁场作用下规则运动而产生表面等离子体共振，这种共振可极大地增强金属粒子周围的电磁场，这种表面局域电磁场的增强使靠近金属粒子表面的荧光物质的激发效率明显提高，导致荧光增强效应的产生。[参见(a)J.R.Lakowicz，K.Ray，M.Chowdhury，H.Szmacinski，Y.Fu，J.Zhang，K.Nowaczyk，Analyst，2008，133，1308.(b)C.R.Sabanayagam，&J.R.Lakowicz，.Nucleic Acids Res.2006，35，e13.]该荧光增强效应的产生强烈依赖于荧光物质和金属表面之间的距离，若发光物质与产生等离子体的金属表面直接接触，则会导致荧光物质荧光淬灭；如果两者之间的距离太大，则不显示任何相互作用，因此合适的距离是产生这种荧光增强效应的关键，而这种有效距离取决于材料的组成及性质。[参见(a)J.Zhang，Y.Fu，Y.P.Mei，F.Jiang and J.R.Lakowicz，Anal.Chem.2010，82，4464-4471.(b)K.Aslan，I.Gryczynski，J.Malicka，E.Matveeva，J.R Lakowicz，C.D.Geddes..Curr.Opin.Biotechnol.2005，16，55-62.]
适配体(Aptamer)是一种具有三维空间结构、能特异性识别目标蛋白的DNA或RNA分子，具有合成简单、易于修饰且稳定性良好等特点。[参见(a)E.J.Cho，J.-W.Lee，A.D.Ellington，Rev.Annu.，Anal.Chem.2009，2，241-264.(b)T.Nguyen，J.Hilton，Q.Lin.，Microfluid.Nanofluid.2009，6，347-362.]因此可以利用不同的适配体实现对目标生物蛋白的特异性识别。
微阵列生物传感器是一种被广泛应用于基因、蛋白、糖类、细胞以及其他生物组分的高通量分析方法，其原理为在活化的固体基质上利用机械或化学的方法制备各种生物分子包括DNA、糖类、蛋白质等的矩阵排列，然后通过分子间的特异性相互作用对各种生命物质进行分析检测。[参见(a)G.MacBeath，.Nat.Genet.2002，32，526-532.(b).J.Madoz-Gurpide，H.Wang，D.E.Misek，F.Brichory，S.M.Hanash.，Proteomics.2001，1，1279-1287.]微阵列生物传感器虽然在二十世纪末才刚刚起步，但如今已在基因表达、疾病检测、环境监测、预防医学、食品监督等诸多领域均有贡献，具有广阔的应用前景。
通过对表面等离子体荧光增强效应与微阵列生物传感器的完美结合，可以达到显著提高检测灵敏度的目的。其中，构建具有表面等离子体荧光增强效应的贵金属颗粒表面及控制荧光物质和金属颗粒表面之间的距离是其关键所在。已经有包括热蒸发法[参见J.R.Lakowicz，Y.Shena，S.D’Auria，J.Malicka，J.Fang，Z.Gryczynski，I.Gryczynski，Anal.Biochem.2002，301，261]、化学沉积法[参见J.R.Lakowicz，Anal.Biochem.2001，298，1.]、光诱导沉积法[C.D.Geddes，A.Parfenov，D.Roll，J.Fang，J.R.Lakowicz，Langmuir2003，19，6236.]、电化学沉积法等多种制备等离子体荧光增强效应金属表面，但都面临着操作步骤多、重复性不好，操作复杂以及需要昂贵仪器的问题。
血小板衍生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF-BB)是一种人血小板生长因子蛋白，可由多种血细胞、组织细胞和一些肿瘤细胞产生，参与促成纤维细胞、胶质细胞、平滑肌细胞的生长。PDGF-BB是原癌基因c-sis的编码产物，其自分泌活动异常增加可促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡，是一种优良的肿瘤标志物，目前对肿瘤细胞中PDGF表达及在生物体液中检测已成为生物医学研究领域的热点。[参见：(a)R.H.Cao，M.A.P.Religa，S.Clasper，S.Garvin，D.Galter，B.Meister，F.Ikomi，K.Tritsaris，S.Dissing，T.Ohhashi，D.G.Jackson，Y.H.Cao，Cancer Cell.2004，6(4)，333-345；(b)R.H.Cao，E.R.Pawliuk，D.Wariaro，M.J.Post，E.Wahlberg，P.Leboulch，Y.H.Cao，Nature Medicine，2003，9，604-613.]
目前检测血小板衍生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF-BB)主要采用酶联免疫吸附分析法。然而这种方法需要抗体和酶标蛋白，因此价格昂贵；同时操作步骤非常多，非特异性反应严重，检测时间长达3～5小时。因此，发展快速、简单和灵敏的生物检测血小板衍生长因子技术在生物研究和临床诊断上具有重要意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测血小板衍生长因子的荧光增强微阵列传感器，基于原位合成的贵金属纳米颗粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜作为具有荧光增强效应的生物微阵列传感器基底材料，在此基底上进行表面胺基化修饰及表面涂层并结合适配体捕获目标生物大分子，该薄膜中的贵金属纳米颗粒引起的表面等离子体荧光增强效应使得表面的荧光信号强度大大增强，能够实现对生物大分子的高灵敏度、高选择性检测。
采用的技术方案：
一种基于金属纳米颗粒膜的荧光增强微阵列传感器，所述的微阵列传感器包括带有孔道的多孔板、金属纳米颗粒膜及捕获生物大分子功能单元。所述的带有孔道的多孔板可以为市售的96孔板或384孔板，孔管容积为100～400μL，孔板材质为聚烯烃；所述的贵金属纳米颗粒膜为在多孔板孔底部原位共合成的金属纳米颗粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜，功能化的贵金属纳米颗粒分散在膜表面，直径为20～100nm；所述的捕获生物大分子功能单元是通过在贵金属纳米颗粒膜表面包覆(聚赖氨酸/聚丙烯酸)n涂层，涂层厚度n为1～10层，在涂层表面结合能够捕获目标生物大分子的适配体，适配体序列为5′TAMRA-CAG GCTACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TG-3′，其中TAMRA为结合在适配体上的有机荧光染料。
制备所述的基于贵金属纳米颗粒膜的荧光增强微阵列传感器，按以下步骤进行：
(1)、贵金属纳米颗粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜的制备：在多孔板96孔板或者384孔板孔底部加入PDMS单体及相应的固化剂，总体积控制在50～200μL，PDMS单体及固化剂的质量比为20∶1～2∶1，去除气泡后在50～120℃条件下反应30～120min，然后加入50～200μLHAuCl4或者AgNO3水溶液，AgNO3水溶液或者HAuCl4水溶液的质量比为0.2％～2.0％，继续在温度5～40℃条件下反应20～72小时，反应完成后用大量无水乙醇洗去未反应完的AgNO3水溶液或者HAuCl4水溶液，然后在20～60℃下干燥，即可得到Ag或Au金属纳米颗粒聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜。
(2)、贵金属纳米颗粒混杂膜的表面修饰：在步骤(1)所制得的金属纳米颗粒混杂膜为基底的孔道中加入50～200μL巯基乙胺的乙醇溶液，巯基乙胺溶液浓度为1mM～10mM，在5～40℃下反应10～48小时，用大量无水乙醇冲洗，再换成去离子水冲洗，在20～60℃下烘干。然后在此膜表面包覆(聚赖氨酸/聚丙烯酸)n涂层，以聚丙烯酸作为开始层，再包覆聚赖氨酸涂层，涂层厚度n为1～10层。具体做法如下：在膜表面首先加入50～200μL的聚丙烯酸水溶液，聚丙烯酸水溶液的质量浓度为1mg/ml～10mg/ml，在5～40℃条件下反应5～60分钟，然后用大量去离子水洗涤以及在10～40℃条件下干燥；接着在此表面再加入50～200μL的聚赖氨酸水溶液，聚赖氨酸水溶液的质量浓度为：1mg/ml～10mg/ml，在5～40℃条件下反应5～60分钟，然后用大量去离子水洗涤以及在10～40℃条件下干燥，这样就形成一层(聚赖氨酸/聚丙烯酸)涂层，按照相同的方法就可以制备得到n层(聚赖氨酸/聚丙烯酸)涂层。
(3)、表面修饰后的金属纳米颗粒混杂膜结合能够捕获目标生物大分子的适配体：在步骤(2)修饰后的金属纳米颗粒混杂膜孔道中加入50～200μL适配体水溶液，适配体序列为5′TAMRA-CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCC TG-3′，其中TAMRA为结合在适配体上的有机荧光染料。适配体水溶液浓度为100nM～1000nM，在30～90℃条件下反应30～120min，反应完成后剩余的溶液用移液枪吸取，然后用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤3～6次。
所述基于金属纳米颗粒混杂膜的荧光增强微阵列传感器应用于生物大分子血小板衍生长因子检测的方法步骤包括：50～200μL的样品溶液加入所述的荧光增强微阵列传感器孔道内，在20～50℃条件下孵育30～120分钟，然后用移液枪吸取未反应掉的溶液，加入50～200μL pH7.4的PBS缓冲溶液轻轻地洗涤，吸取洗涤液，最后进行荧光酶标仪定量分析。
与现有的生物大分子酶联免疫吸附分析法相比，本发明所提供的基于金属纳米颗粒膜的荧光增强微阵列传感器具有以下优点：
(1)无需特定的抗体及酶标蛋白，试剂用量少。而酶联免疫分析法需要抗体和酶标蛋白，因此价格昂贵。
(2)操作步骤少，属于“一步法”检测。而酶联免疫分析法需要抗原、抗体的包被、孵育、洗涤及染色，分析步骤多，在此过程中容易出错。
(3)检测时间短，在半小时内就可完成。而酶联免疫分析法分析步骤多，需要长达3～5小时的检测时间。
(3)稳定性好，可以长时间保存，检测性能不下降。
在完成发明的过程中，选择血小板衍生长因子(platelet-derived growthfactor，PDGF-BB)作为检测目标物，对所述的基于金属纳米颗粒膜的荧光增强微阵列传感器的各项性能指标进行了反复测试。结果表明，对于PDGF-BB检测的线性范围为1.25pM～1.25μM，七次测量重复性为3.4％。
附图说明
图1为检测血小板衍生长因子的荧光增强微阵列传感器示意图，图中为：96孔板或者384孔板1、孔内金属纳米颗粒混杂膜生物传感器2、贵金属纳米颗粒-PDMS混杂膜3、膜上聚赖氨酸/聚丙烯酸涂层4、带有荧光分子的适配体5；
图2为合成得到的金属纳米颗粒膜扫描电镜图A和高分辨扫描电镜图B(SEM)；
图3为制备得到的金属纳米颗粒膜荧光增强效应对比图；
图4为制备得到的金属纳米颗粒膜、结合适配体后紫外吸收光谱图；
图5为测量PDGF-BB与VEGF-165、VEGF-121、IgG等别的生物大分子特异性差别图；
图6为测量PDGF-BB的线性关系曲线图。
具体实施方式
以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
下面结合附图，通过具体实施例对本发明进一步详述。
实施例1：96孔板通道内金纳米颗粒-PDMS混杂膜的制备
实验材料：氯金酸，批号为：B00745201，购自上海阿拉丁试剂有限公司；聚二甲基硅氧烷(PDMS)单体及固化剂，批号为0007113256，购自美国道康宁试剂有限公司；荧光96孔板，批号为：3925，购自美国康宁(Corning)有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。
实验仪器及设备：KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：在多孔板96孔板底部加入PDMS单体150μL，及相应的固化剂15μL，去除气泡后放置在烘箱中，在80℃条件下反应90min，然后加入100μL质量浓度0.8％HAuCl4水溶液，继续在温度25℃条件下反应48小时，反应完成后用大量无水乙醇洗去未反应完的HAuCl4水溶液，然后在40℃下干燥，即可得到Au金属纳米颗粒膜。图2为制备得到的Au纳米颗粒膜的SEM图。
实施例2：96孔板通道内银纳米颗粒-PDMS混杂膜的制备
实验材料：硝酸银，批号为：L1309063，购自上海阿拉丁试剂有限公司；聚二甲基硅氧烷(PDMS)单体及固化剂，批号为0007113256，购自美国道康宁试剂有限公司；荧光96孔板，批号为：3925，购自美国康宁(Corning)有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司。
实验仪器及设备：KQ-S00DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：在多孔板96孔板底部加入PDMS单体150μL，及相应的固化剂15μL，去除气泡后放置在烘箱中，在80℃条件下反应90min，然后加入100μL质量浓度0.8％AgNO3水溶液，继续在温度25℃条件下反应48小时，反应完成后用大量无水乙醇洗去未反应完的AgNO3水溶液，然后在40℃下干燥，即可得到Ag金属纳米颗粒膜。
实施例3：贵金属纳米颗粒-PDMS混杂膜的表面修饰及结合能够捕获目标生物大分子的适配体
实验材料：氯金酸，批号为：B00745201，购自上海阿拉丁试剂有限公司；硝酸银，批号为：L1309063，购自上海阿拉丁试剂有限公司；聚二甲基硅氧烷(PDMS)单体及固化剂，批号为0007113256，购自美国道康宁试剂有限公司；荧光96孔板，批号为：3925，购自美国康宁(Corning)有限公司；乙醇，批号为：14021710247，购自南京化学试剂有限公司；β-巯基乙胺，批号为：11325054，购自上海阿拉丁试剂有限公司；聚丙烯酸，批号为：J1225008，购自南京化学试剂有限公司；聚赖氨酸，批号为：B302BA0012，购自上海阿拉丁试剂有限公司；适配体(Aptamer)，适配体序列为5′TAMRA-CAG GCT ACG GCA CGT AGA GCA TCA CCA TGA TCCTG-3′，批号为：9300693481，购自上海生工生物工程有限公司。
实验仪器及设备：KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：在制得的96孔板贵金属纳米颗粒-PDMS膜孔道中加入100μL巯基乙胺的乙醇溶液，巯基乙胺溶液浓度为5mM，在25℃下反应24小时，然后用大量无水乙醇冲洗，再换成去离子水冲洗，在40℃下烘干。然后在此膜表面包覆(聚赖氨酸/聚丙烯酸)n涂层，以聚丙烯酸作为开始层，再包覆聚赖氨酸涂层，涂层厚度n为4层。具体做法如下：在膜表面首先加入100μL的聚丙烯酸水溶液，聚丙烯酸水溶液的质量浓度为5mg/ml，在25℃条件下反应30分钟，然后用大量去离子水洗涤以及在25℃条件下干燥；接着在此表面再加入100μL的聚赖氨酸水溶液，聚赖氨酸水溶液的质量浓度为5mg/ml，在25℃条件下反应30分钟，然后用大量去离子水洗涤以及在25℃条件下真空干燥，这样就形成一层(聚赖氨酸/聚丙烯酸)涂层，按照相同的方法就可以制备得到4层(聚赖氨酸/聚丙烯酸)涂层。在修饰后的金属纳米颗粒-PDMS混杂膜孔道中加入100μL适配体水溶液，适配体水溶液浓度为500nM，在70℃条件下反应60min，反应完成后剩余的溶液用移液枪吸取，然后用pH 7.4的PBS缓冲溶液洗涤3次，然后在室温下自然晾干。图3为表面修饰有(聚赖氨酸/聚丙烯酸)涂层后荧光强度与无金属纳米颗粒膜荧光强度对比图，图4为结合适配体的贵金属纳米颗粒膜的紫外吸收图。
实施例4：选择血小板衍生长因子(PDGF-BB)作为检测目标物，对所述的基于金属纳米颗粒膜的荧光增强微阵列传感器的各项性能指标进行测试。
实验材料：血小板衍生长因子(PDGF-BB)，批号为：C600154-0002，购自上海生工生物工程有限公司；
实验仪器和设备：Thermo Fisher Scientific公司Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪、KQ-500DE超声波清洗器、DHG-9143BS电热鼓风干燥箱、AY120电子分析天平、TGL-16C离心机。
实验过程：取100μL的样品溶液加入于所述的荧光增强微阵列传感器孔道内，在25℃条件下孵育50分钟，然后用移液枪吸取未反应掉的溶液，加入100μL pH 7.4的PBS缓冲溶液轻轻地洗涤，吸取洗涤液，最后用荧光酶标仪测量其荧光强度定量分析。
荧光测量条件为：
激发波长：553nm；发射波长：585nm.
得到的定量关系图如图5、图6。结果表明，对于PDGF-BB检测的线性范围为1.25pM～1.25μM，7次测量重复性为3.4％。
以上实施例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代和改进等，其均应在本发明请求保护的技术方案范围之内。

Claims (3)

1.一种检测血小板衍生长因子的荧光增强微阵列传感器，其特征在于基底为功能化的贵金属纳米颗粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜，混杂膜表面经胺基化修饰及表面包覆厚度为n层的聚赖氨酸和聚丙烯酸涂层，以聚丙烯酸作为开始层，涂层厚度n为1～10层，贵金属纳米颗粒为金或银纳米颗粒，金属纳米颗粒直径为20～100nm，所述的微阵列传感器建立在96孔板或者384孔板孔道内，孔管容积为100～400μL，空管材质为聚烯烃。
2.一种制备检测血小板衍生长因子的荧光增强微阵列传感器的方法，其特征在于由原始96孔板或者384孔板孔内原位合成的金属纳米颗粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜表面胺基化修饰及表面涂层、结合能够捕获血小板衍生长因子的适配体所得，按以下步骤进行：
(1)混杂膜表面胺基化修饰及表面涂层：在制得的贵金属纳米颗粒-聚二甲基硅氧烷(PDMS)混杂膜孔道中加入50～200μL巯基乙胺的乙醇溶液，在5～40℃下反应10～48小时，巯基乙胺溶液浓度为1mM～10mM，然后用无水乙醇冲洗，再换成去离子水冲洗，在20～60℃下烘干，然后在此膜表面包覆厚度为n层的聚赖氨酸和聚丙烯酸涂层，以聚丙烯酸作为开始层，涂层厚度n为1～10层，具体做法如下：在膜表面首先加入50～200μL的聚丙烯酸水溶液，聚丙烯酸水溶液的质量浓度为1mg/ml～10mg/ml，在5～40℃条件下反应5～60分钟，然后用去离子水洗涤以及在10～40℃条件下干燥；接着在此表面再加入50～200μL的聚赖氨酸水溶液，聚赖氨酸水溶液的质量浓度为：1mg/ml～10mg/ml，在5～40℃条件下反应5～60分钟，然后用去离子水洗涤以及在10～40℃条件下干燥，这样就形成一层聚赖氨酸和聚丙烯酸涂层，按照相同的方法就可以制备得到n层聚赖氨酸和聚丙烯酸涂层；
(2)结合能够捕获血小板衍生长因子的适配体：在步骤(1)修饰后的金属纳米颗粒混杂膜孔道中加入50～200μL适配体水溶液，适配体序列为5′TAMRA-CAG GCT ACG GCA CGTAGAGCA TCA CCA TGA TCC TG-3′，其中TAMRA为结合在适配体上的有机荧光分子，适配体水溶液浓度为100nM～1000nM，在30～90℃条件下反应30～120min，反应完成后剩余的溶液用移液器吸取，然后用pH7.4的PBS缓冲溶液洗涤3～6次。
3.根据权利要求2的方法制备的微阵列传感器检测血小板衍生长因子含量的方法，使用不同浓度的血小板衍生长因子样品溶液50～200μL加入所述的荧光增强微阵列传感器孔道内，在20～50℃条件下孵育30～120分钟，然后用移液器吸取未反应掉的溶液，加入50～200μLpH7.4的PBS缓冲溶液轻轻地洗涤，吸取洗涤液，最后用荧光酶标仪定量。
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